CN1239516C

CN1239516C - 肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体胞外区突变多肽及其制法与用途

Info

Publication number: CN1239516C
Application number: CN 02104519
Authority: CN
Inventors: 郑德先; 刘彦信; 史娟
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2022-02-08
Also published as: CN1436792A

Abstract

本发明提供一种人TRAIL胞外区突变的95～281重组可溶性多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)，其第95位氨基酸从天然的苏氨酸(Thr)突变为甘氨酸(Gly)；还提供该重组可溶性多肽的制备方法以及它的抗肿瘤的用途。

Description

肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体胞外区突变多肽及其制法与用途

技术领域

本发明涉及一种人肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体胞外区突变了的多肽，及其制备方法与用途，特别是由185个氨基酸残基组成的人肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL，tumor necrosisfactor-related apoptosis inducing ligand)突变了的胞外区(即rsTRAIL_Thr95Gly-281)在大肠杆菌胞浆中表达的制备方法及其用途。本发明的rsTRAIL_Thr95Gly-281可单独或与其它抗癌药物联用，对肺癌和肝癌具有特别显著的治疗作用，也可用于其它肿瘤的抗癌治疗。

技术背景

近年来，随着细胞凋亡(apoptosis)规律的研究与发现，一些能诱导细胞凋亡的物质及其作用机制逐步得到阐明。其中肿瘤坏死因子(TNF，tumor necrosis factor)家族成员，如Fas(CD95)、TRAIL等的生物学功能引起了生命科学界的普遍关注。Fas与其配体FasL结合后，能迅速诱导Fas⁺细胞的凋亡，但在动物实验中显示出致死性的毒副作用。TRAIL是由美国Wiley等(Wiley SR，Schooley K，Smolak P，et al.，Identification and characterization of a new member of the TNF family that inducesapoptosis，Immunity，1995，3：673-682)于1995年发现并命名。人TRAIL基因可编码281个氨基酸残基组成的II型膜蛋白(分子量为32.5kDa)，且在体内多种组织中广泛表达，如脾、肺、前列腺、肝、肾、心脏、骨骼肌、小肠、结肠和外周血淋巴细胞等，其中在脾、肺和前列腺中表达量最高，但在脑组织中未见表达。TRAIL与其受体结合后，能选择性地杀死肿瘤细胞，显示了潜在的临床应用前景。1999年，美国由两家公司开始合作进行TRAIL抗肿瘤的开发研究，目前处于临床前动物研究阶段(Walczak H，Miller RE，Ariall K et al.，Tumoricidal activity of tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo，Nature Med.，1999，5(2)：157-163)。

但现有技术中使用的天然的TRAIL胞外区114～281重组多肽，在原核表达载体pET和PBV220中只以非溶解性的包含体形式表达，且杀死肿瘤细胞的活性及抑瘤效果尚不如人意。

发明内容

为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种人TRAIL胞外区突变的95～28l重组可溶性多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)，其第95位氨基酸从天然的苏氨酸(Thr)突变为甘氨酸(Gly)，该多肽具有如序列表中所述的序列。

本发明的第二个目的在于提供一种人TRAIL胞外区突变的95～281重组可溶性多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种用于人TRAIL胞外区突变的95～281重组可溶性多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)的大肠杆菌，该细菌已经于2001年12月5日保存在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”的编号为：CGMCC No.0659。

本发明的第四个目的在于提供一种所述的重组多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)三聚体形式的制备，不需补充外源性锌离子。

本发明的第五个目的在于提供一种所述的重组多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)在抗肺癌和肝癌等肿瘤的新型药物中的应用。

在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和方法，提供人TRAIL胞外区突变了的95～281重组可溶性多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)的制备及分离纯化方法，首次证明rsTRAIL_Thr95Gly-281三聚体形式的制备，不需要补充外源性锌离子。rsTRAIL_Thr95Gly-281在体外具有特异性地诱导肺癌和肝癌等肿瘤细胞凋亡，在小鼠体内具有抑制人肺癌细胞生长和肝癌细胞形成肿瘤的生物学活性，首次证明rsTRAIL_Thr95Gly-281可单独或与其它抗癌药物联用，在体内外杀死肺癌和肝癌细胞，可用于治疗人类肺癌和肝癌等肿瘤。

本发明涉及一种人TRAIL胞外区的95～281位氨基酸残基组成的重组可溶性多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)，该多肽具有如序列表中所述的序列。该重组多肽氨基酸序列中，原天然的TRAIL第95位的苏氨酸(Thr)突变为甘氨酸(Gly)。对应于原天然的TRAIL第95位的氨基酸是本发明序列表中所述多肽序列的第1位。

本发明还涉及一种人TRAIL胞外区的95～281重组可溶性多肽的制备方法，它包括以下步骤：

以人，特别是中国正常人外周血淋巴细胞mRNA为模板，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增人TRAIL的全长cDNA；

再以全长TRAIL的cDNA为模板，扩增了人TRAIL胞外区的编码95～281氨基酸残基的cDNA，同时使其第95位苏氨酸突变为甘氨酸，并克隆入原核表达载体，得到rsTRAIL_Thr95Gly-281的表达质粒；

重组表达质粒DNA转染大肠杆菌后，经诱导和筛选，获得表达95～281氨基酸残基多肽(rsTRAIL_Thr95Gly-281)的工程菌。

该方法中所述的表达质粒是pET15b。所述的大肠杆菌是BL21(DE3)，获得的基因工程菌是于2001年12月5日保存在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”的大肠杆菌，编号为：CGMCC No.0659。

本发明还涉及该重组多肽在制备抗肺癌和肝癌药物中的应用。该重组多肽可以用于治疗癌症，特别是肺癌和肝癌。

换言之，本发明以中国正常人外周血淋巴细胞mRNA为模板，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增人TRAIL的全长cDNA。再以全长TRAIL的cDNA为模板，扩增了人TRAIL胞外区的编码95～281氨基酸残基的cDNA，同时使其第95位苏氨酸突变为甘氨酸，并克隆入原核表达载体pET15b，从而获得rsTRAIL_Thr95Gly-281的表达质粒。转化大肠杆菌并获得阳性克隆后，制备质粒DNA，酶切和序列分析证明，获得的rsTRAIL_Thr95Gly-281与文献报道的TRAIL胞外区95～281氨基酸残基的氨基酸序列有一个氨基酸发生了突变，即第95位的Thr突变为Gly。重组表达质粒转染大肠杆菌后，经诱导和筛选，获得了稳定表达rsTRAIL_Thr95Gly-281的工程菌，命名为rsTRAIL96-281-pET15b-BL21(DE3)。

该工程菌已于2001年12月5日保存在”中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，编号为：CGMCC No.0659.

本发明的rsTRAIL_Thr95Gly-281主要以可溶形式在大肠杆菌胞浆中表达，其产量可达菌体总蛋白的30％左右。采用公知的柱层析、离子交换法分离纯化重组蛋白，在SDS-PAGE胶上显示为一条带，HPLC层析显示其纯度达95％以上，等电点为7.2，在凝胶过滤层析和非还原凝胶电泳中显示的分子量在60kDa，在SDS-PAGE胶上显示的分子量在21kDa。

体外的生物学活性分析表明，rsTRAIL_Thr95Gly-281可杀死肝癌7402细胞和肺癌SCLC细胞，并呈剂量依赖关系。体内活性分析表明，rsTRAIL_Thr95Gly-281在使用剂量为15mg/kg时，就能强烈抑制人肺癌细胞SCLC在裸鼠体内生长，与对照相比，抑制率可达80％左右；且抑瘤期长，停药后未见明显的反弹现象。此外，rsTRAIL_Thr95Gly-281在使用剂量为15mg/kg时，也能显著抑制小鼠肝癌细胞H22形成肝癌，与对照相比，抑制率可达30％左右。

本发明之rsTRAIL_Thr95Gly-281的毒性试验结果表明，以浓度为500ng/mL和2μg/mL的rsTRAIL_Thr95Gly-281分别处理胎龄大于6个月的正常胎儿肝细胞和人肝癌细胞株(7402)8小时，能显著杀死人肝癌细胞株，但对原代人胎肝细胞没有毒性。以100mg/kg和50mg/kg体重的给药剂量分别给小鼠腹腔注射，未见动物死亡。继续观察一周后，未见小鼠食欲、皮毛、活动等异常。体重增加3～4g/只，表明rsTRAIL_Thr95Gly-281安全、有效、无毒副作用。

本发明的优点与效果是从中国正常人外周血淋巴细胞扩增了全长TRAIL cDNA，构建了胞外区突变了的95～281氨基酸残基的原核表达质粒，并在大肠杆菌的胞浆中稳定高效表达；所获得的工程菌易于大规模生产，成本低廉；该重组多肽在体外可诱导多种肿瘤细胞凋亡，但对正常人肝细胞、淋巴细胞及胎儿脐带血单核细胞无任何杀伤作用。该重组多肽与天然的TRAIL胞外区95～281氨基酸残基相比只有一个氨基酸不同，但在体内具有很强的抑制人肺癌细胞生长和形成肿瘤的生物学活性，对小鼠肝癌细胞的生长有显著抑制作用，对正常小鼠任何无毒副作用。显示了该发明可发展为安全、有效的新一代抗肺癌和肝癌等肿瘤的基因工程药物。

经过本发明方法生成的对肿瘤坏死因子相关细胞调亡诱导配体胞外区突变多肽与现有技术的多肽相比，增强其抗肿瘤的效果，而且大大增加了此突变多肽的可溶性。这种结果是本领域技术人员所意想不到的。

附图说明

图1是显示rsTRAIL_{Thr950Gly-281}的表达、纯化和SDS-PAGE。1，未诱导的菌体总蛋白；2，诱导的菌体总蛋白；3，超声上清；4，超声后沉淀；5，金属鳌合柱层析后纯化蛋白；6，离子交换柱纯化后蛋白；7，蛋白分子量标准。

图2是显示rsTRAIL_Thr95Gly-281在体外可抑制多种肿瘤细胞生长，但对正常细胞的生长没有影响的图表。

图3是显示rsTRAIL_Thr95Gly-281对人肺癌细胞SCLC在裸鼠体内生长的影响的图表。

图4是显示rsTRAIL_Thr95Gly-281对小鼠肝癌细胞H22形成肿瘤的影响图表。

具体实施方式

实验例1

用公知的异硫氰酸胍法提取中国正常人外周血淋巴细胞的总mRNA，然后以其为模板，以5’-ATAGGATCCGCTGCCTGGCTGACTTACA-3’为上游引物；5’-CGCGAATTCTTTGGTTGTGGCTGCTCTAC-3’为下游引物，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，获得由1063个碱基组成的人TRAIL全长cDNA。以TRAIL全长cDNA为模板，设计上游引物为5’-GGCATGCCATGGGGTCTGAGGAAACCATT-3’，下游引物为5’-GCGGATCCTTAGCCAACTAAAAAGGC-3’，进行PCR扩增，获得编码人TRAIL胞外区95-281位氨基酸序列的cDNA，其第95位苏氨酸突变为甘氨酸。PCR产物经NcoI和BamHI双酶切后，获得长度为560bp cDNA片段，定向克隆入经同样酶切的原核表达载体pET15b，再将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3⁺)，获得表达rsTRAIL_Thr95Gly-281的工程菌，经诱导和筛选，获得了稳定表达95～281氨基酸残基的基因工程菌，命名为rsTRAIL_95-281-pET15b-BL21(DE3)。该工程菌已于2001年12月5日保存在”中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，编号为：CGMCC No.0659。

rsTRAIL_Thr95Gly-281主要以可溶形式在于大肠杆菌胞浆中表达，其产量可达菌体总蛋白的30％左右。采用柱层析、离子交换法分离纯化重组蛋白，经SD S-PAGE鉴定显示为一条蛋白区带。在HPLC中也表现为一个主要蛋白峰，其纯度达95％以上。rsTRAIL_Thr95Gly-281单体形式的分子量为21kDa，等电点为7.2。重组多肽的N-末端分析表明，其第95位的氨基酸残基从Thr变为了Gly，其氨基酸序列如图1所示。

实验例2

表达rsTRAIL_Thr95Gly-281的菌株接种於LB培养基，置37℃摇床生长至OD600＝0.6，以0.1mmol/L IPTG诱导10小时，离心收获菌体。菌体超声破碎后，取上清部分经金属螯合柱亲和层析，以含50mmol/L咪唑的20mmol/L Tris-HCl，pH8.0缓冲液洗脱，透析后溶液再经阴离子交换树脂分离，获得纯化的rsTRAIL蛋白，进行SDS-PAGE(图2)和HPLC鉴定。

实验例3

16种肿瘤细胞株(包括肝、乳腺、肾、卵巢、胃、肺、中枢神经系统和白血病细胞)和正常细胞按每孔1×10⁶个细胞的浓度接种至6孔细胞培养板，于37℃和5％CO₂培养箱中培养24小时后，加入终浓度分别为0、0.5、1.0μg/ml的rsTRAIL_Thr95Gly-281，继续培养6～8小时后，采用碘化丙啶染色和流式细胞仪法测定细胞凋亡率(图3)。表明rsTRAIL_Thr95Gly-281对肝癌和白血病等5种肿瘤细胞敏感，细胞生长受到显著抑制，抑制率可达50％以上。其它肿瘤细胞株、中枢神经系统的肿瘤细胞株以及具有正常细胞特性的NIH3T3和LLCPK细胞对rsTRAIL_Thr95Gly-281均不敏感。

实验例4

选择BALB/C-nu裸鼠，经适当照射后，皮下接种人肺癌细胞(5×10⁶/只)，待肺癌细胞长成合适大小的实体瘤后，分别按每公斤体重3mg、15mg和30mg的剂量腹腔注射rsTRAIL_Thr95Gly-281，共注射5天。停药后，继续观察至第23天，处死动物，剥瘤称重；并从给药之日起，动态测量瘤块直径，计算瘤块体积(mm³)。对照1组注射生理盐水，对照2组(阳性对照)按每公斤体重60mg的剂量腹腔注射环磷酰胺一次。

结果表明，实验组瘤重明显小于对照组，rsTRAIL_Thr95Gly-281可明显抑制小鼠肺癌细胞在动物体内的生长(图4)。

实验例5

选择雌性昆明小鼠，分成3组，每组10只，皮下接种小鼠肝癌细胞H22(5×10⁶细胞/只)，24小时后，分别按每公斤体重5mg和10mg的剂量腹腔注射rsTRAIL_Thr95Gly-281，对照组注射等体积的PBS，共给药8次(先每天给药1次，共4次，停药2天后，再给药4次)。最后一次给药24小时后处死动物，剥瘤称重。

实验结果表明，实验组瘤体重量明显小于对照组，rsTRAIL_Thr95Gly-281可明显抑制小鼠肝癌细胞H22形成肿瘤(图5)。

实验例6

以100mg/kg和50mg/kg体重的给药剂量分别注射小鼠腹腔，未见动物死亡。继续观察一周后，未见小鼠食欲、皮毛、活动等异常。体重增加3～4g/只，表明rsTRAIL_Thr95Gly-281安全、无毒副作用。

新鲜分离的正常人6～8月龄胎儿肝细胞(n＝3)、人脐带血单核细胞、正常人外周血淋巴细胞和10周龄昆明小鼠肝细胞(n＝5)，分别经浓度为0、0.5、1.0μg/ml的rsTRAIL_Thr95Gly-281处理后，测定其细胞凋亡率，表明rsTRAIL_Thr95Gly-281在体外对人和小鼠的正常肝细胞、人脐带血单核细胞和正常人外周血淋巴细胞均没有毒性。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>肿瘤坏死因子相关细胞调亡诱导配体胞外区突变多肽

及其制法与用途

<130>CGCNC20074

<160>187

<210>1

<211>187

<212>氨基酸

<213>人淋巴细胞

Gly Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn

1 5 10 15

Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala

16 20 25 30

His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro

31 35 40 45

Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp

46 50 55 60

Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu

61 65 70 75

Arg Asn Glu Gly Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile

76 80 85 90

Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn

91 95 100 105

Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr

106 110 115 120

Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser

121 125 130 135

Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln

136 140 145 150

Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser

151 155 160 165

Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe

166 170 175 180

Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

181 185 187

Claims

1一种多肽，是：