CN108342405A

CN108342405A - Il21融合蛋白及其制备方法和在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途

Info

Publication number: CN108342405A
Application number: CN201710051169.3A
Authority: CN
Inventors: 冯美卿; 施思; 王鑫; 于晓晨; 王欢; 鞠佃文; 叶丽
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2018-07-31

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及IL21融合蛋白及其制备方法和制药中的用途，本发明通过基因工程技术构建出表达IL21‑ApoA1融合蛋白的质粒，转入相应表达载体中，表达IL21‑ApoA1融合蛋白，其ApoA1部分可将白细胞介素21选择性地运输到肾、肝等器官，促进T淋巴细胞、NK细胞杀伤肿瘤细胞，且提高白细胞介素21在体内的半衰期，延长其作用。本发明在体内、外均表现出良好的生物活性和稳定性，能有效抑制肿瘤生长，同时延长白细胞介素21的血浆半衰期。所述IL21‑ApoA1融合蛋白可制备靶向免疫治疗肿瘤药物。

Description

IL21融合蛋白及其制备方法和在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及IL21融合蛋白及其制备方法和在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途，具体涉及一种IL21-ApoA1融合蛋白（基因）、其编码核苷酸序列以及融合蛋白（基因）及其制备方法和在制备靶向免疫治疗肿瘤药物中的用途。

背景技术

资料显示了恶性肿瘤严重影响人类健康甚至威胁生命，中国恶性肿瘤的发生率和死亡率逐年上升。临床实践中通常采用外科手术、放化疗等干预方式，由于肿瘤具有难以根治、易复发和易浸润转移的特点，传统治疗手段效果差强人意，因此新型肿瘤治疗方法亟需出现。自上个世纪五十年代开始，肿瘤免疫学进入公众视野，其通过外源性药物激发体内免疫系统，刺激和调节体内免疫细胞，进而改善机体肿瘤微环境，从而控制并杀伤肿瘤细胞；肿瘤免疫疗法包括若干治疗手段，其中细胞因子治疗是研究相对成熟的一类肿瘤免疫疗法。

研究报道白细胞介素是调节机体免疫系统最重要的一大类细胞因子，目前已发现38种白细胞介素，其中白细胞介素2家族在免疫生理、病理，尤其是肿瘤免疫应答方面发挥极其重要的作用。研究显示，白细胞介素2家族中白细胞介素21由CD4+T细胞和NKT细胞产生，其可促进CD4+T细胞分化成T17细胞，后者会引起炎症；白细胞介素21还可以通过抗CD4抗体共刺激促进成熟B细胞的增殖，进而分化为浆细胞（PC），合成和分泌各类抗体；也可促进CD8+T细胞和NK细胞的产生，产生直接的细胞毒性，后者还可产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）；还可促进补体激活后产生的膜攻击复合物，发挥抗体依赖的细胞毒性作用；另外，白细胞介素21能使γ/δ T细胞分化为中心记忆细胞，与肠道炎症有关；促使骨髓单个核细胞向树突状细胞（DC）分化，但其抑制成熟DC的功能，等。Sondergaard H等研究发现IL-21在治疗小鼠B16黑色素瘤和RenCa肾癌过程中，通过增加肿瘤中CD8⁺T淋巴细胞密度从而抑制肿瘤生长。实践显示，目前白介素-21血浆半衰期为2-4h，在临床应用中存在不足，部分研究表明融合蛋白可弥补这一缺陷，Gassen RB等构建表达了融合蛋白IL-21/免疫球蛋白，以延长IL-21体内半衰期，但其构建的融合蛋白缺乏靶向性。

研究还公开了血清载脂蛋白A1是人高密度脂蛋白（HDL）的重要组成部分，血清载脂蛋白中高密度脂蛋白体积最小、密度最高，具有促进胆固醇的代谢的作用；通过HDL介导的胆固醇逆向转运，可减少脂质在血管壁的沉积，降低血浆和血管壁中的胆固醇水平；血清载脂蛋白A1占HDL的70%，由肝脏或小肠分泌的血清载脂蛋白A1和内皮细胞表明的三磷酸腺苷结合转运体A1结合后，逐步形成成熟的HDL；在机体中，肾脏、肝脏等器官均存在血清载脂蛋白A1受体，肿瘤细胞表面大多存在ApoAI受体。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟供新的IL21融合蛋白及其制备方法和用途；尤其提供一种IL21-ApoA1融合蛋白及其在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途。

发明内容

本发明的目的是克服普通重组人白细胞介素21在体内半衰期短的不足之处，提供白细胞介素21的新用途，具体涉及IL21融合蛋白及其制备方法和用途；尤其提供一种IL21-ApoA1融合蛋白及其在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途。

本发明中基于HDL类似于天然的脂质体，将其作为载体运载药物，通过制备ApoAI、卵磷脂、小分子药物制备重组HDL-药物复合物，进行肝癌靶向治疗；更具体的，本发明中通过基因工程的手段构建出表达IL21-ApoA1融合蛋白的质粒，表达IL21-ApoA1融合蛋白，利用肝脏、肾脏上有ApoA1受体的生理特点，将白细胞介素21选择性地运输到肾、肝等器官，促进T淋巴细胞、NK细胞杀伤肿瘤细胞，且提高白细胞介素21在体内的半衰期，延长其作用。

本发明所述IL21-ApoA1融合蛋白不仅有肝靶向作用，还可增强IL-21体内抗肿瘤作用，且该融合蛋白的两部分均为人源蛋白，具有极高的生物安全性。

具体的，本发明提供了一种融合基因，所述的融合基因包括白细胞介素21及血清载脂蛋白A1编码基因，所述的白细胞介素21及血清载脂蛋白A1编码基因之间通过n个编码氨基酸的基因连接，其核苷酸序列如SEQ ID.1；

本发明提供了一种新型的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白的由白细胞介素21及血清载脂蛋白A1融合基因所表达的，所述的白细胞介素21及血清载脂蛋白A1之间通过n个柔性氨基酸组成的连接肽段连接（n≥0）。

本发明提供了IL21-ApoA1融合蛋白（基因），所述的融合蛋白为白细胞介素21和血清载脂蛋白A1的二聚体融合蛋白（基因），所述的白细胞介素21和血清载脂蛋白A1之间通过柔性连接肽段连接；

所述的白细胞介素21选自人白细胞介素21；所述的血清载脂蛋白A1选自人血清载脂蛋白A1，所述连接肽段是GGGGSGGGGS；

所述的白细胞介素21为人白细胞介素21，其氨基酸序列如 SEQ ID. 2所示；所述的血清载脂蛋白A1为人血清载脂蛋白A1，其氨基酸序列如SEQ ID.3；所述的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID.4所示，第132-141位氨基酸残基为连接肽段。

本发明提供了编码融合蛋白的DNA分子，所述的DNA核苷酸序列如SEQ ID.5所示。

本发明提供了含有DNA分子的重组载体，包括原核动物细胞表达载体以及真核动物细胞表达载体，如pET28a、、pGEX-6P-1、pGEX-4T-1、pUC57、pPIC9K、pCMVp-NEO-BAN、pcDNA3.1(+)、pVAX1等。

本发明提供了含有重组载体的宿主细胞，原核动物表达细胞，如E.coli BL21、Top10、Rosetta菌株等；真核动物表达细胞，如P.pastoris GS115等。

本发明进一步提供了一种融合基因IL21-ApoA1在制备基因治疗药物中的应用，如抗肿瘤药物。

本发明提供了融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其在制备肿瘤靶向基因治疗药物中的应用，优选的所述肿瘤为黑色素瘤、肾癌及肝癌。

本发明提供了一种长效的IL21-ApoA1融合蛋白，该重组融合蛋白，在体内、外均可表现出良好的生物活性和稳定性，能有效抑制肿瘤生长，同时延长白细胞介素21的血浆半衰期；本发明的一个实施例中，所述的融合蛋白IL21-ApoA1延长IL-21半衰期，IL21-ApoA1半衰期为IL-21的3倍左右，还具有明显的肝靶向作用，明显优于现有技术的融合蛋白体系。

附图说明

图1是含有编码IL21-ApoA1融合蛋白的核苷酸序列的重组载体结构图。

图2是含有融合基因IL21-ApoA1的核苷酸序列的重组载体结构图。

图3是IL21-ApoA1融合蛋白重组表达质粒的PCR产物电泳图，其中Lane1 DL2000DNA marker（2000,1000,750，500，250，100bp），Lane2 IL21-ApoA1融合蛋白重组表达质粒的PCR产物。

图4是纯化后的IL21-ApoA1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中Lane1 蛋白marker（120，90，60，40，30，20，14KD）；Lane2纯化的融合蛋白。

图5是IL21-ApoA1融合蛋白的血浆半衰期测定结果。

图6是IL21-ApoA1融合蛋白促进人外周血单核细胞增殖曲线。

图7是IL21-ApoA1融合蛋白促进人外周血单核细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用曲线。

具体实施方式

实施例1 IL21-ApoA1融合蛋白重组表达质粒的构建

编码白细胞介素21及血清载脂蛋白A1基因片段可从pUC57/IL21（①质粒）、pUC57/ApoA1 （②质粒）E.coli（于南京金斯瑞生物科技有限公司购买）经双酶切法获得；将上述两种大肠杆菌划含氨苄霉素抗性的LB平板活化，挑选阳性菌落进行扩增，并抽提质粒，①质粒经过NdeⅠ和BamHⅠ的双酶切，DNA凝胶验证正确后DNA凝胶回收，得到白细胞介素21目的基因，以②质粒为模板PCR扩增血清载脂蛋白A1基因，所用引物序列（下游引物含连接肽段核苷酸序列）如下

上游引物：5’-CGCGGATCC GAAGGTGAAGGTAGTGACGAACCACCTCAAT

下游引物：5’-CGCCTCGAG TTGTGTGTTCAATTTC

用50μl的PCR反应体系，其中premix Taq酶加25μl；ddH₂O加22μl；20mM的引物各加1μl；②质粒加1μl，应条件为94℃预变性5min；94℃ 45s、50℃ 45s、72℃ 90s，30个循环；72℃退火10min，4℃终止。PCR产物DNA凝胶验证正确后DNA凝胶回收，得到血清载脂蛋白A1目的基因（含连接肽段）；将含pET28a质粒的E.coli菌株活化后抽提质粒，经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后，与白细胞介素21目的基因经T4 DNA连接酶连接，并转化Top10 E.coli菌株，筛选抗卡那霉素的阳性菌落并进行PCR验证，验证正确的菌株扩增抽提质粒，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，与血清载脂蛋白A1目的基因（含连接肽段）经T4 DNA连接酶连接，并转化Top10 E.coli菌株，筛选抗卡那霉素的阳性菌落经测序比对，与预期序列完全一致，将含pET28a/IL21-ApoA1质粒(含连接肽段)的菌株25%甘油，-70℃保存。

实施例2 融合基因重组质粒的构建

将pUC57/IL21-ApoA1质粒(含连接肽段)经过BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，DNA凝胶验证正确后DNA凝胶回收，得到IL21-ApoA1序列（含连接肽段），将pcDNA3.1(+)质粒经BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ双酶切后，与IL21-ApoA1目的基因（含连接肽段）经T4 DNA连接酶连接，并转化Top10 E.coli菌株，筛选抗G418的阳性菌落并经测序验证，与预期序列完全一致，将含pcDNA3.1(+)/IL21-ApoA1质粒（含连接肽段）的菌株25%甘油，-70℃保存。

实施例3 IL21-ApoA1融合蛋白表达和纯化

将构建成功的pET28a/IL21-ApoA1质粒(含连接肽段)转化至不同的感受态E.coli表达宿主（BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）PLySs、Rosetta菌株），采用卡那霉素和氯霉素双抗性筛选，筛选阳性菌落经PCR验证，验证正确的菌株进行诱导表达，取阳性菌落于3ml LB培养基，37℃、200rpm培养，至OD_600nm值为0.6左右，加入1mM IPTG，16℃、200rpm培养12h，经SDS-PAGE分析挑选高表达菌株，于5L摇瓶中扩大培养，诱导条件如上，收集菌体，加入适量PB重悬，冰浴超声破碎菌体，收集上清，用Ni-NTX亲和层析柱纯化，用0.5mM NaOH清洗纯化柱，上样速度2ml/min，过5倍柱体积；用0.2M PB（pH8.0）清洗和平衡纯化柱，上样速度2ml/min,过10-15倍柱体积；上样，上样速度1ml/min；上样结束后，用0.2M PB（pH8.0）清洗纯化柱，上样速度1ml/min，过10-15倍柱体积；A泵进0.2M PB（pH8.0），B泵进200mM咪唑，洗脱速度2ml/min，过10倍柱体积梯度洗脱，收集与洗脱峰对应的洗脱液；纯化后的融合蛋白溶液经Sephadex-G25柱脱盐，SDS-PAGE分析（如图4所示），脱盐后的融合蛋白溶液使用透析袋透析浓缩，-20℃保存。

实施例4 IL21-ApoA1融合蛋白的血浆半衰期测定

7只 BALB/c小鼠（4-6周）皮内注射IL21-ApoA1融合蛋白，每只给药75μg，在30min、1h、2h、5h、12h、18h、24h、48h眼眶取血，血样用特异性ELISA检测IL21-ApoA1融合蛋白的浓度，结果显示，IL21-ApoA1融合蛋白的血浆半衰期为30h，结果如图5所示。

实施例4 IL21-ApoA1融合蛋白促进人外周血单核细胞（PBMC）增殖

从人外周血中分离得到人外周血单核细胞，分为3组：（1）空白对照组；（2）IL21组；（3）IL21-ApoA1组，于96孔板内接种细胞悬液200μl，每组设3个复孔，每孔5×10⁶个细胞，IL21浓度为50ng/ml，IL21-ApoA1浓度为150ng/ml，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱分别培养24h、48h、72h，CCK8试剂盒测定细胞增殖情况，结果显示IL21-ApoA1融合蛋白可促进人外周血单核细胞增殖，与IL21无显著性差异如图6所示（）。

实施例5 IL21-ApoA1融合蛋白促进人外周血单核细胞（PBMC）对肿瘤细胞的杀伤

将K562细胞分为3组：（1）人外周血单核细胞+K562细胞；（2）IL21+人外周血单核细胞+K562细胞；（3）IL21-ApoA1+人外周血单核细胞+K562细胞；LDH法检测杀伤率：靶细胞浓度为1x10^5/ml，每孔加入细胞悬液50μL，置于37℃、5%CO2培养箱培养12h，细胞贴壁完全后，将效靶比为50:1的人外周血单核细胞加入上述2个实验组中，IL21浓度为50ng/mL，IL21-ApoA1浓度为150ng/ml；另外每组细胞设置3个复孔，且分别设置最低控制孔（50μL靶细胞+50μL培养液），最高控制孔（50μL NK细胞+50μL培养液），各组细胞混合4h后，最高控制孔加入5μL Lysis solution，37℃孵育15min，每孔加入100μL reaction mixture，室温孵育30min，每孔加入50μL stop solution，摇晃10s，酶标仪490nm处测吸光度；

细胞毒性%=（（效-靶细胞混合孔OD值–效应细胞孔OD值）-最低控制孔OD值/（最高控制孔OD值-最低控制孔OD值））x100%

结果显示，IL21-ApoA1融合蛋白可刺激人外周血单核细胞对K562细胞产生杀伤作用（如图7所示）。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> IL21融合蛋白及其制备方法和在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途

<130> 20170123

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atgagatcca gtcctggcaa catggagagg attgtcatct gtctgatggt catcttcttg 60

gggacactgg tccacaaatc aagctcccaa ggtcaagatc gccacatgat tagaatgcgt 120

caacttatag atattgttga tcagctgaaa aattatgtga atgacttggt ccctgaattt 180

ctgccagctc cagaagatgt agagacaaac tgtgagtggt cagctttttc ctgctttcag 240

aaggcccaac taaagtcagc aaatacagga aacaatgaaa ggataatcaa tgtatcaatt 300

aaaaagctga agaggaaacc accttccaca aatgcaggga gaagacagaa acacagacta 360

acatgccctt catgtgattc ttatgagaaa aaaccaccca aagaattcct agaaagattc 420

aaatcacttc tccaaaaggt atctacctta agtttcattt gaggaggtgg aggtagtatg 480

aaagctgcgg tgctgacctt ggccgtgctc ttcctgacgg ggagccaggc tcggcatttc 540

tggcagcaag atgaaccccc ccagagcccc tgggatcgag tgaaggacct ggccactgtg 600

tacgtggatg tgctcaaaga cagcggcaga gactatgtgt cccagtttga aggctccgcc 660

ttgggaaaac agctaaacct aaagctcctt gacaactggg acagcgtgac ctccaccttc 720

agcaagctgc gcgaacagct cggccctgtg acccaggagt tctgggataa cctggaaaag 780

gagacagagg gcctgaggca ggagatgagc aaggatctgg aggaggtgaa ggccaaggtg 840

cagccctacc tggacgactt ccagaagaag tggcaggagg agatggagct ctaccgccag 900

aaggtggagc cgctgcgcgc agagctccaa gagggcgcgc gccagaagct gcacgagctg 960

caagagaagc tgagcccact gggcgaggag atgcgcgacc gcgcgcgcgc ccatgtggac 1020

gcgctgcgca cgcatctggc cccctacagc gacgagctgc gccagcgctt ggccgcgcgc 1080

cttgaggctc tcaaggagaa cggcggcgcc agactggccg agtaccacgc caaggccacc 1140

gagcatctga gcacgctcag cgagaaggcc aagcccgcgc tcgaggacct ccgccaaggc 1200

ctgctgcccg tgctggagag cttcaaggtc agcttcctga gcgctctcga ggagtacact 1260

aagaagctca acacccagtg a 1281

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 人白细胞介素21

<400> 2

Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile

1 5 10 15

Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu

20 25 30

Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser

35 40 45

Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu

50 55 60

Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser

65 70 75 80

Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys

85 90 95

Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys

100 105 110

Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His

115 120 125

Gly Ser Glu Asp Ser

130

<210> 3

<211> 243

<212> PRT

<213> 人血清载脂蛋白A1

<400> 3

Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr

1 5 10 15

Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln

20 25 30

Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp

35 40 45

Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu

50 55 60

Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu

65 70 75 80

Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys

85 90 95

Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met

100 105 110

Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu

115 120 125

Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu

130 135 140

Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg

145 150 155 160

Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala

165 170 175

Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr

180 185 190

His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys

195 200 205

Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser

210 215 220

Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu

225 230 235 240

Asn Thr Gln

<210> 4

<211> 386

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 4

Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile

1 5 10 15

Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu

20 25 30

Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser

35 40 45

Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu

50 55 60

Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser

65 70 75 80

Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys

85 90 95

Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys

100 105 110

Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His

115 120 125

Gly Ser Glu Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

130 135 140

Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val

145 150 155 160

Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe

165 170 175

Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn

180 185 190

Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly

195 200 205

Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly

210 215 220

Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val

225 230 235 240

Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu

245 250 255

Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly

260 265 270

Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly

275 280 285

Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr

290 295 300

His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg

305 310 315 320

Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His

325 330 335

Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro

340 345 350

Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe

355 360 365

Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn

370 375 380

Thr Gln

385

<210> 5

<211> 1245

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

atggagcgca tcgtcatttg cctcatggtc atctttctcg gaacactggt gcacaagtct 60

tcttcacagg gccaggatag acacatgatc cgaatgcggc agctgattga cattgtcgat 120

cagctcaaga actatgttaa cgacctggtg cccgagttcc tccctgctcc cgaggatgtg 180

gagacaaatt gtgagtggtc cgcattctct tgtttccaga aggctcagct caagtccgcc 240

aataccggaa acaatgagcg cattattaat gtgtctatta agaagctcaa gcgcaagcct 300

ccatcaacta acgccggacg ccgccagaag caccgcctga cttgcccatc atgcgattct 360

tacgagaaga agcctccaaa ggagttcctt gagcggttta agtcactctt gcagaagatg 420

attcaccagc acctctcttc gcggacccac gggtctgagg attccggcgg cggcggttca 480

ggcggcggcg ggtccgatga gcctcctcag tctccttggg atcgcgtcaa ggatctggca 540

accgtttacg ttgatgtgct caaggatagc ggacgcgact atgtatcaca gtttgagggc 600

tcagccctcg gaaagcagct gaatctcaag ctgctcgata attgggatag cgtgacttct 660

acgtttagca agctgcgcga gcagctggga cccgtgaccc aagagttctg ggataatctt 720

gagaaagaga cagagggact gcgccaggaa atgtctaagg accttgaaga agtgaaggct 780

aaggtgcagc catacctgga cgactttcag aagaagtggc aggaagagat ggagctgtac 840

cggcagaagg tcgagcctct ccgggccgag cttcaggaag gcgcacggca gaagctccac 900

gagctgcaag agaagctgtc tccactcggc gaagaaatgc gcgatcgcgc tagggcacat 960

gtagacgcac tgcggacaca cctggctcct tactctgatg aactgagaca gagactggcc 1020

gctagactgg aggcactgaa agagaatggc ggcgctaggc tcgccgagta ccacgctaag 1080

gctacagagc acctgtctac tctgtcagag aaggcaaagc ccgcactgga ggatctgaga 1140

cagggcctgc tgccagtgct ggagtccttt aaggtgtcct tcctgtctgc cttggaggaa 1200

tacacaaaga agctgaatac ccagcaccac caccaccacc actaa 1245

Claims

1.一种融合基因，其特征在于：所述的融合基因包括白细胞介素21及血清载脂蛋白A1编码基因，所述的白细胞介素21及血清载脂蛋白A1编码基因之间通过n个编码氨基酸的基因连接，其核苷酸序列如SEQ ID.1。

2.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白由白细胞介素21及血清载脂蛋白A1融合基因所表达，所述的白细胞介素21及血清载脂蛋白A1之间通过n个柔性氨基酸组成的连接肽段连接，n≥0。

3.一种IL21融合蛋白，其特征在于，其包含权利要求1所述的融合基因和权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述白细胞介素21选自人白细胞介素21；所述血清载脂蛋白A1选自血清载脂蛋白A1；所述连接肽段是GGGGSGGGGS。

4.根据权利要求3所述的IL21融合蛋白，其特征在于：所述的白细胞介素21为人白细胞介素21，其氨基酸序列如 SEQ ID.2所示；所述的血清载脂蛋白A1为人血清载脂蛋白A1，其氨基酸序列如SEQ ID. 3所示；所述的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID.4所示，第132-141位氨基酸残基为连接肽段。

5.编码如权利要求4所述的融合蛋白的DNA分子，其特征在于：所述的DNA的核苷酸序列如SEQ ID.5所示。

6.含有如权利要求1所述的融合基因权利要求2所述的融合蛋白的核苷酸序列的重组载体pET28a、pET32a、pET41a、pGEX-6P-1、pGEX-4T-1、pUC57、pPIC9K、pCMVp-NEO-BAN、pcDNA3.1(+)或pVAX1。

7.含有如权利要求6所述重组载体的宿主细胞E.coli BL21、E.coli Top10、E.coliRosetta或P.pastoris GS115。

8.权利要求3或4所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.按权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤为黑色素瘤、肾癌或肝癌。

10.权利要求1所述的融合基因在制备肿瘤靶向基因治疗药物中的用途。