CN108295242A - 用于预防和/或治疗银屑病药物组合物、cd317胞外段蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于预防和/或治疗银屑病药物组合物、及一种CD317胞外段蛋白在制备预防和/或治疗银屑病的药物中的应用。针对银屑病，现有的治疗策略多为TLR7/9的广谱抑制剂、或者IFN‑α中和抗体，不管是理论还是实践都证实这些方法确实可以发挥治疗自身免疫性银屑病的作用。但是，这些治疗手段的作用范围太广，对机体正常免疫功能有较大的抑制作用，导致这些药物使用范围受限，只能短期内用来控制急性过敏性反应。本发明涉及的CD317胞外段蛋白，以特异表达于人pDC细胞上的ILT‑7作为靶点，通过其抑制IFN‑α的产生，在早期阻断银屑病发展。特异性好，对机体正常免疫功能的影响也远比广谱TLR7/9抑制剂或者IFN‑α中和抗体小得多。

Description

用于预防和/或治疗银屑病药物组合物、CD317胞外段蛋白的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于预防和/或治疗银屑病药物组合物以及一种CD317胞外段蛋白的应用。

背景技术

银屑病是影响最为广泛的3大自身免疫病之一，其全球发病率约为3％，其中三分之一的患者达到中度至重度的程度。银屑病病征表现为皮肤增厚和广泛性损害，可引起瘙痒、鳞屑和疼痛，并严重影响患者的生活质量、心理健康以及社会关系。此外，病症较重者易患合并症，如关节炎、心脏病和糖尿病，具有死亡风险。

现在，对银屑病的治疗主要按照疾病的严重程度予以分类治疗。对于轻中度银屑病常局部予以外用药物来治疗，如糖皮质激素、维生素D3类似物、维A酸、蒽林、焦油类等。外用药物无效或者重度银屑病，尤其是红皮病型银屑病、泛发性脓疱型银屑病及关节病型银屑病等，常采用系统给药疗法，如肌肉或静脉滴注甲氨蝶呤、环孢素等小分子免疫抑制剂。近几年，一些生物制剂也被FDA批准用于治疗重度银屑病，如以T细胞CD2或CD11a、TNF-α、IL-12和IL-23为靶点的单抗(表1)。这些生物制剂疗效惊人，但安全性不明确，有待临床的长期考证。此外，各大医药公司还正积极开发以IL-23、IL-17或IL-17受体等为靶点的单抗药物，其中诺华公司研发的Secukinumab在2015年年初获欧盟批准，系全球首个IL-17单抗。遗憾的是，出于安全性考虑，中轻度患者在短期内不能享用这些单抗药物。除大分子单抗药物外，一些小分子抑制剂也被FDA批准用于治疗银屑病，如以PDE4为靶点的口服小分子抑制剂，以TLR7&9、JAK为靶点的小分子抑制剂也在进行临床试验。

表1.近几年银屑病药物研发进展

现有的治疗策略多为TLR7/9的广谱抑制剂、或者IFN-α中和抗体，不管是理论还是实践都证实这些方法确实可以发挥治疗自身免疫性银屑病的作用。但是，这些治疗手段的作用范围太广，对机体正常免疫功能有较大的抑制作用，导致这些药物使用范围受限，只能短期内用来控制急性过敏性反应。

浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)是最近发现的树突状细胞的一个亚类，研究表明pDC在自身免疫性银屑病发病早期发病过程中发挥了巨大的促进作用【参见：Nestle FO,Conrad C,Tun-Kyi A,Homey B,Gombert M,Boyman O,Burg G,Liu YJ,Gilliet M.Plasmacytoid predendritic cells initiate psoriasis throughinterferon-a production.J Exp Med 2005；202:135–143.】。在驱化素chemerin作用下，pDC被募集到银屑病发病部位。在皮损部位大量内源性TLR7/9诱导剂的刺激下产生大量IFN-α。IFN-α一方面激活髓样树突状细胞(myeloid DC)和角质细胞，促使naive CD4+T细胞向Th17分化，另一方面，通过诱导IL-15表达促进自身反应性T细胞的存活，推动银屑病发展【Albanesi,C.,et al.(2010)."Immune functions and recruitment of plasmacytoiddendritic cells in psoriasis."Autoimmunity 43(3):215-219.】。

ILT-7,又名LILRA4、CD85g，特异性表达在pDC上，在外周血B、T以及NK细胞上不表达，是一个独特的pDC细胞表面受体。ILT-7活化后可以抑制TLR7/TLR9介导的I型干扰素以及TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的产生【Cao,W.and L.Bover(2010)."Signaling andligand interaction of ILT7:receptor-mediated regulatory mechanisms forplasmacytoid dendritic cells."Immunol Rev 234(1):163-176.】。CD317是ILT-7的配体，其与ILT-7相互作用显著抑制pDC细胞I型干扰素以及促炎细胞因子的产生，在机体免疫自稳过程中发挥重要的作用【Cao,W.,et al.(2009)."Regulation of TLR7/9responsesin plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction."J ExpMed 206(7):1603-1614.】。尽管目前尚没有CD317-ILT7参与银屑病发病过程的相关报道，但是从已知的线索可以推测，CD317蛋白极可能通过与ILT7相互作用抑制pDC细胞分泌IFN-α及其他炎性因子，延缓甚至阻断自身免疫性银屑病的发展。

在本发明之前，还未有研究报道CD317胞外段蛋白在阻断银屑病发展中的应用。

发明内容

第一方面，本发明提供了一种CD317胞外段蛋白在制备预防和/或治疗银屑病的药物中的应用。

在本发明一些实施例中，本发明提供了一种CD317胞外段蛋白在制备预防和/或治疗早期自身免疫性银屑病的药物中的应用。

在本发明一些实施例中，将如第一方面所述的CD317胞外段蛋白按下述一种或多种方法进行应用：

(1)将所述CD317胞外段蛋白单独进行应用；

(2)将所述CD317胞外段蛋白与手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用；

在本发明一些实施例中，应用(1)中，采用体内投递的方式将所述CD317胞外段蛋白直接投递到患者体内进行治疗。

在本发明一些实施例中，应用(1)或(2)中，向患者施用如上所述的CD317胞外段蛋白或含CD317胞外段蛋白的药物组合物，可向患者施用多于一次。

在本发明一些实施例中，应用(1)或(2)中，所述的投递的方式为靶向投递，包括但不限于采用可靶向投递的liposome脂质体(或其多聚体)等行业常用载体进行投递。

通过向包括人的哺乳动物施用本发明第一方面提供的CD317胞外段蛋白，可预防或治疗自身免疫性银屑病。

第二方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗银屑病药物组合物，包括CD317胞外段蛋白，及可药用的载剂、赋形剂或稀释剂。

本发明提供的药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中，优选将抗体与载体混合或用载体稀释，或装入容器形式的载体中。当载体作为稀释剂时，其可以为固体、半固体或液体，用作用于抗体的囊泡、赋形剂或培养基。因此，制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、袋装剂、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软和硬明胶胶囊、注射用无菌溶液、无菌粉剂等形式。合适的载体、赋形剂或稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。制剂还可以包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。

在本发明一些实施例中，所述的药物组合物还包括第二治疗剂，第二治疗剂为任何有利地与所述的CD317胞外段蛋白组合的抑制剂。包括但不限于其他ILT-7活化剂、TLR7/9抑制剂、或者IFN-α中和抗体，和/或不直接与ILT-7结合，但却抑制IFN-α产生的抑制。

在本发明一些实施例中，所述的第二治疗剂包括与CD317胞外段蛋白组合协同作用的干扰剂、抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA制剂、细胞因子、毒素、化学治疗剂、放射治疗剂、激素、Fc片段等。

第三方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗银屑病药物组合物，按下述一种或多种方法进行应用：

(1)将所述CD317胞外段蛋白单独进行应用；

(2)将所述CD317胞外段蛋白与手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用

在本发明一些实施例中，应用(1)中，采用体内投递的方式将所述CD317胞外段蛋白直接投递到患者体内进行治疗。

在本发明一些实施例中，应用(1)或(2)中，向患者施用如上所述的CD317胞外段蛋白或含CD317胞外段蛋白的药物组合物，可向患者施用多于一次。

在本发明一些实施例中，应用(1)或(2)中，所述的投递的方式为靶向投递，包括但不限于采用可靶向投递的liposome脂质体(或其多聚体)等行业常用载体进行投递。

通过向包括人的哺乳动物施用本发明第一方面提供的CD317胞外段蛋白，可预防或治疗自身免疫性银屑病。

第四方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗银屑病药物组合物，为将CD317胞外段蛋白，与人pDC细胞上的ILT-7结合并于体外抑制促炎细胞因子产生。

在本发明一些实施例中，所述的促炎细胞因子包括但不限于TLR7/TLR9介导的I型干扰素以及TNF-α、IL-6等促炎细胞因子。

第五方面，本发明还提供了一种CD317胞外段蛋白的制备方法，该方法包括：将包含编码CD317胞外段蛋白的核苷酸序列用于构建表达所述的CD317胞外段蛋白的重组表达载体；导入宿主细胞；在表达条件下，培养宿主细胞，表达，分离纯化，获得所述CD317胞外段蛋白。

在本发明一些实施例中，所述包含编码第一方面所述的CD317胞外段蛋白的核苷酸序列还包括Kozak序列、信号肽、蛋白标签序列中的一种或多种。

常见地，可在CD317胞外段蛋白的N端加上人PLAT(NM_000930)基因信号肽核苷酸序列的分泌信号肽，从而保证抗体的表达并分泌到宿主细胞外。

常见地，所述蛋白标签序列可任选His标签、GST标签等蛋白标签中的一种或多种。

如本发明所述的，在第一、第二、第三、第四或第五方面中，编码所述“CD317胞外段蛋白”的核苷酸序列为SEQUENCE NO.1所示或为与SEQUENCE NO.1所示序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

可以理解的，由于“核苷酸序列”具有碱基简并、突变等情况，行业内普通技术人员可调整某些碱基的种类，所述的碱基变化虽然导致了密码子的变化，但不会引起密码子翻译的氨基酸的变化，很常见的，亮氨酸的密码子就具有多种密码子，比如：UUA、UUG、CUU。

如本发明所述的，在第一、第二、第三、第四或第五方面中，所述“CD317胞外段蛋白”的氨基酸序列为SEQUENCE NO.2所示或为与SEQUENCE NO.2所示序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

本发明提供的技术方案的有益效果：

现有的治疗策略多为TLR7/9的广谱抑制剂、或者IFN-α中和抗体，不管是理论还是实践都证实这些方法确实可以发挥治疗自身免疫性银屑病的作用。但是，这些治疗手段的作用范围太广，对机体正常免疫功能有较大的抑制作用，导致这些药物使用范围受限，只能短期内用来控制急性过敏性反应。

本发明涉及的CD317胞外段蛋白，以特异表达于人pDC细胞上的ILT-7作为靶点，通过其抑制IFN-α的产生，在早期阻断银屑病发展。特异性好，对机体正常免疫功能的影响也远比广谱TLR7/9抑制剂或者IFN-α中和抗体小得多。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的CD317ECD重组蛋白真核表达质粒图谱；

图2为本发明实施例1提供的CD317胞外段琼脂糖凝胶电泳结果；

图3为本发明实施例1提供的双酶切鉴定的结果；

图4为本发明实施例2提供的CD317-ECD重组蛋白表达鉴定结果；其中，A：细胞裂解液，B：细胞培养上清；从左往右依次是考马斯染色、CD317抗体以及His抗体检测结果；

图5本发明实施例2提供的考马斯染色鉴定纯化结果；其中，1.Marker；2.穿透液，2. 20mM洗涤液；3. 80mM洗涤液；4. 250mM洗脱液；5. 500mM洗涤液；从左往右依次是考马斯染色、CD317抗体以及His抗体检测结果。

图6为本发明效果实施例提供的CD317-ECD治疗银屑病效果图；图6A为模型构建以及治疗策略，图6B显示的是第8天处死时小鼠银屑病表型，图6C为两组小鼠鳞屑评分统计图；图6D显示治疗组与对照组小鼠皮肤切片H&E染色结果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。

实施例1人CD317胞外段重组蛋白真核表达载体构备

本发明实施例1提供了一种人CD317胞外段重组蛋白真核表达载体构建方法，质粒结构如附图1所示。包括：

1、人CD317胞外段编码基因来源于其基因转录本(NM_004335.3)，通过PCR扩增方法获得，从211到558共计348个碱基(序列信息)。所用引物序列如下：

上游引物(如SEQUENCE NO.3所示序列)：包含酶切位点、Kozak序列，信号肽(humantissue-type plasminogen activator，tPA，NM_000930，258-323)以及扩增引物等元素。

具体地，SEQUENCE NO.3为：

5′-CGGAATTCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCTCCTTCACCATCAAGGCCAAC-3′。

下游引物(如SEQUENCE NO.4所示序列)：包含酶切位点、6×His标签以及互补引物等元素

具体地，SEQUENCE NO.4为：

5′-GCCTCGAGTCAATGGTGATGGTGATGATGGTCCTGGGAGCTGGGGTAG-3′。

2、PCR扩增，获得CD317-ECD片段：

1)PCR反应体系如下所示

2)PCR条件

3)1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如附图2所示；

4)胶回收后，分别对PCR片段以及pCDNA3.1(+)载体进行EcoR I×Xho I双酶切，体系如下所示：

5)酶切片段琼脂糖凝胶电泳(如附图3所示)，回收片段，利用T4DNA连接酶将CD317胞外段碱基片段与线性化pCDNA3.1(+)载体连接(22℃×1h)；连接体系如下所示：

6)连接产物转化DH5α感受态；

7)10μL连接产物加入到50μL DH5α感受态，冰上孵育30min(每10min混匀一次)，42℃水浴90s后迅速冰水浴5min，然后加入0.5mL LB培养液，37℃，220rpm振荡培养1h(使感受态大肠杆菌恢复正常状态)；

8)涂氨苄抗性LB平板，37℃培养过夜；

9)8000rpm离心1min，去上清，用100μL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基重悬，取50μL在氨苄抗性平板上涂匀，晾干后倒置放于37℃恒温培养箱培养过夜；

10)挑单克隆，送样测序验证，保存BLAST比对100％的阳性克隆。

实施例2人CD317胞外段重组蛋白表达纯化

本发明实施例2提供了一种人CD317胞外段重组蛋白表达纯化的方法，包括：

(1)PEI法将pCDNA3.1(+)-CD317ECD表达载体转入HEK293F细胞，具体实施方案如下：

1)将30mL HEK293F细胞悬液(1×10⁶细胞/mL)接种于125mL细胞摇瓶中，37℃，8％CO2,120rpm振荡培养过夜；

2)PEI转染

取30μg质粒以及30μL PEI25000(2mg/mL)加入到3mL PBS(pH 7.4)中，轻轻混匀后室温静置15min,然后逐滴加入到细胞中，边加边晃动培养瓶；

(2)培养细胞72h后收集细胞培养上清(500g×5min后吸取上清到新的离心管，然后4℃，10000g×5min去除碎片)；

(3)取200μL上清加入蛋白Loading Buffer至1×,100℃变性5min；SDS-PAGE后通过考马斯染色、westen blot对CD317-ECD表达情况进行检测，结果如附图4所示；

(4)Ni琼脂纯化CD317-ECD蛋白；

1)取1mL Ni琼脂(Ni-Sepharose)用PBS(pH7.4)洗涤3遍，4℃，500g×5min后去上清，再用5mM咪唑洗涤1遍；

2)细胞培养上清经0.45μm过滤后，与5mM咪唑溶液1:1混匀，然后加入到Ni琼脂中，4℃翻转1h；

3)将细胞上清与Ni琼脂的混合液转移到Bio-Rad poly-Prep Chromatographycolumns中，4℃自然穿透，收集穿透液；

4)5mM咪唑洗涤3次，每次10倍琼脂体积；然后分别用20mM,80mM洗涤，每个浓度各3次；

5)最后加入适量250mM咪唑洗脱；

6)各穿透液、洗脱液分别取样，用考马斯染色、western等方法进行检测，结果附图5所示。

7)洗脱液透析后，用BCA法测浓度、-80℃保存备用。

效果实施例

为说明本发明提供的CD317胞外段重组蛋白在抑制pDC细胞TLR7/9介导的I型干扰素产生效果；本发明还提供了效果实施例，包括：

1、IMQ诱导银屑病模型的构建

BALB/c小鼠经10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射进行麻醉后，脱去其背部毛，形成约2cm×3cm的裸露区。每日涂抹IMQ(day0-3：65mg/day；day4-day5：80mg/day；day6-day7：100mg/day；)，并且每天观察小鼠皮肤并对鳞屑的形成进行打分，评分标准为：0，无；1，轻度；2，中度；3，重度；4，极重度。

2、CD317-ECD治疗小鼠轻度银屑病

IMQ处理24h后，将银屑病模型小鼠随机分为对照组(PBS)和治疗组(ECD)，于第1、2、3、5、7天分别给予对照组和实验组小鼠尾静脉注射PBS和CD317-ECD蛋白溶液，其CD317-ECD剂量为5mg/kg体重。每天观察小鼠皮肤并对鳞屑的形成进行打分，于第8天取小鼠皮肤，按照九格法剪取各组小鼠相同部位皮损处组织，固定于4％多聚甲醛。OCT包埋后，以7μm的厚度进行冰冻切片。而后进行H&E染色，观察各组小鼠表皮厚度变化。

图5显示采用CD317-ECD体内治疗轻度银屑病效果。其中，图6A为模型构建以及治疗策略，图6B显示的是第8天处死时小鼠银屑病表型，图6C为两组小鼠鳞屑评分统计图，显示CD317-ECD对早期银屑病具有很好的抑制作用；图6D显示治疗组与对照组小鼠皮肤切片H&E染色结果，可观察到治疗组小鼠皮肤表皮较对照组薄，且皮肤内浸润的炎性细胞明显减少。这些数据表明，CD317-ECD能有效控制小鼠轻度自身免疫性银屑病的发展。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种CD317胞外段蛋白在制备预防和/或治疗银屑病的药物中的应用。

2.一种用于预防和/或治疗银屑病药物组合物，其特征在于，包括CD317胞外段蛋白，及诊断剂、可药用的载剂、赋形剂或稀释剂。

3.一种用于预防和/或治疗银屑病药物组合物，其特征在于，按下述一种或多种方法进行应用：

(1)将所述CD317胞外段蛋白单独进行应用；

(2)将所述CD317胞外段蛋白与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用。

4.如权利要求3所述的用于预防和/或治疗银屑病药物组合物，其特征在于，所述第一种应用方法中，为采用体内投递的方式将所述CD317胞外段蛋白直接投递到患者体内进行应用。

5.一种用于预防和/或治疗银屑病蛋白药物，其特征在于，为将CD317胞外段蛋白与人pDC细胞上的ILT-7结合并于体外抑制促炎细胞因子产生。

6.如权利要求5所述的用于预防和/或治疗银屑病蛋白药物，其特征在于，所述的促炎细胞因子为I型干扰素、TNF-α、IL-6。

7.一种CD317胞外段蛋白的制备方法，其特征在于，包括：将包含编码CD317胞外段蛋白的核苷酸序列，用于构建表达所述的CD317胞外段蛋白的重组表达载体；导入宿主细胞；在表达条件下，培养宿主细胞，表达，分离纯化，获得所述CD317胞外段蛋白。

8.如权利要求7所述的CD317胞外段蛋白的制备方法，其特征在于，所述的包含编码CD317胞外段蛋白的核苷酸序列还包括Kozak序列、信号肽、蛋白标签序列中的一种或多种。