CN110366422A - 包含其中细胞穿透肽与ctctla4肽融合的融合蛋白作为活性成分的用于预防或治疗炎性呼吸系统疾病的药物组合物 - Google Patents
包含其中细胞穿透肽与ctctla4肽融合的融合蛋白作为活性成分的用于预防或治疗炎性呼吸系统疾病的药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包含融合蛋白作为有效成分用于预防或治疗炎性呼吸系统疾病的药物组合物，其中所述融合蛋白具有与ctCTLA4肽融合的细胞穿透肽。在尚未常规实现有效治疗或预防作用的呼吸途径施用方式中，与用于炎性呼吸系统疾病(尤其是变应性哮喘)的常规治疗剂相比，本发明对支气管和肺细胞具有显著突出的渗透性和效率，并显著改善了抑制细胞因子表达和气道炎症的活性，减轻了气道对变应原的超敏应答和TH2炎症等。因此，本发明可带来立即、迅速且有效的治疗或预防作用。
Description
技术领域
本公开内容涉及用于预防或治疗炎性呼吸系统疾病的药物组合物，其包含其中细胞穿透肽与ctCTLA4肽融合的融合蛋白作为活性成分，更具体地，本公开内容涉及药物组合物，由于通过将dNP2肽与ctCTLA4肽融合而改善了细胞渗透性并且增强了针对炎性呼吸系统疾病的靶向作用，其能够显示出通过鼻黏膜预防或治疗炎性呼吸系统疾病而不必直接施用到肺或支气管中的优异效果。
背景技术
炎性呼吸系统疾病是由尘螨、花粉、蟑螂等引起的致命性慢性肺疾病，并造成严重的健康问题，例如口臭、呼吸困难、咳嗽、喘息、胸部紧迫感和疼痛。
德国蟑螂是变应性疾病的主要原因之一。已知通过诱导敏感的T细胞应答以引起炎性变应性气道疾病。德国蟑螂提取物(German cockroach extract，GCE)已被广泛用于构建变应性炎症模型。
为了治疗变应性反应，已提出将多种免疫调节生物分子(例如介导变应性反应的抗体)作为治疗剂。其中，T细胞特异性免疫调节剂的问题在于用于治疗哮喘的局部施用(例如鼻内施用)是困难的，并且只有全身施用是可能的。
同时，开发的用于治疗哮喘的单克隆抗体，例如抗IgE(奥马珠单抗)、抗IL-5(美泊珠单抗)、抗IL-13(安芦珠单抗)和抗TGF-β(达克珠单抗)也具有局限性，即只有全身施用是可能的，并且具有与全身施用相关的问题，例如副作用、易受感染和高成本。
另外，抗体的问题在于，由于其在呼吸系统中的紧密结合和生物学尺寸的限制，只有全身施用是可能的。
本公开内容的发明人已经研究了鼻内施用融合蛋白而不是直接施用于支气管或全身施用，并且已经完成了本公开内容。
专利文献1：韩国专利公开No.10-2008-0066962。
发明内容
技术问题
本公开内容旨在提供药物组合物，与现有的施用途径不同，其通过经由鼻内途径施用融合蛋白，针对支气管和肺细胞显示出优异的递送和靶向效率，并且具有显著改善的抑制细胞因子表达、抑制气道炎症、减轻对变应原的气道高反应性、减轻Th2炎症等的活性。
技术方案
本公开内容提供了用于预防或治疗变应性疾病的药物组合物，其包含其中将SEQID NO 1的细胞穿透肽与SEQ ID NO 2的ctCTLA4肽融合的融合蛋白作为活性成分。
有利效果
与现有的治疗剂相比，在不能实现有效的治疗或预防作用的情况下，本公开内容可以通过经由呼吸系统施用针对炎性呼吸系统疾病(特别是变应性哮喘)提供迅速、快速且有效的治疗或预防作用，其提供针对支气管和肺细胞的优异的递送和靶向效率以及显著改善的抑制细胞因子表达、抑制气道炎症、减轻对变应原的气道高反应性、减轻Th2炎症等的活性。
另外，本公开内容可适用于新治疗和处方，因为与现有的治疗剂不同，该治疗剂可以在高浓度下局部施用而具有降低的副作用。
附图说明
图1示出了测试实施例1的实验条件(每组的施用时间、施用剂量和施用途径)。
图2示出了从测试实施例1的每个对照组和测试组制备冷冻肺组织切片(8μm)、用Hoechst对细胞核进行染色并通过荧光显微术进行观察的结果。
图3示出了来自测试实施例1的每个对照组和测试组的支气管肺泡灌洗液的荧光信号的流式细胞术结果。示出了红色荧光直方图和平均荧光强度(mean fluorescenceintensities，MFI)。
图4示出了测试实施例2的实验条件(每组的施用时间、施用剂量和施用途径)。
图5和图6示出了针对测试实施例2的每个测试组和对照组，分析对乙酰甲胆碱的气道高反应性(Airway hyper-responsiveness，AHR)的结果。图5示出了根据针对测试实施例2的每个测试组和对照组的乙酰甲胆碱浓度测量气道阻力的结果。图6示出了根据针对测试实施例2的每个测试组和对照组的乙酰甲胆碱浓度测量气道弹性阻力的结果。对于每组(n＝5)的代表性结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。**p＜0.01，***p＜0.001。
图7示出了针对测试实施例3的每个测试组和对照组观察肺组织的结果。在用PAS进行染色之后，对测试实施例3的每个测试组和对照组的肺组织进行成像。红色区域表示分泌黏液的杯状细胞。
图8示出了使用ImageJ 1.50i软件分析图7中分泌黏液的杯状细胞数目的结果。
图9示出了针对测试实施例3的每个测试组和对照组观察肺组织的结果。在用马森三色染色剂进行染色之后，对测试实施例3每个测试组和对照组的肺组织进行成像。蓝色区域表示胶原蛋白沉积和纤维化。
图10示出了使用ImageJ 1.50i软件分析图9的纤维化区域的结果。对于每组(n＝5)的代表性结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。***p＜0.001。
图11示出了对回收自载玻片上的测试实施例4的每个测试组和对照组的支气管肺泡灌洗液进行细胞离心并在使用Hemacolor染色试剂盒进行染色之后对总细胞(a)、巨噬细胞(b)和嗜酸性粒细胞(c)的数目进行计数的结果。
图12示出了使用ELISA试剂盒(顶部)分析支气管肺泡灌洗(BAL)上清液中IL-5、IL-13和IFN-γ的表达水平的结果和使用ELISA试剂盒(底部)分析冷冻肺组织中IL-5、IL-13、IL-4和IFN-γ的表达水平的结果。用ELSISA试剂盒分析IL-5、IL-13、IL-4和IFN-γ的浓度，并将结果以组织的总蛋白浓度进行归一化。通过Bradford测定对蛋白浓度进行量化。每组n＝5且结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。*p＜0.05，**p＜0.01。
图13示出了测试实施例5的实验条件(每组的施用时间、施用剂量和施用途径)。
图14示出了使用ELISA试剂盒(顶部)分析支气管肺泡灌洗(BAL)上清液中IL-13和IFN-γ的表达水平的结果和使用ELISA试剂盒(底部)在冷冻肺组织中分析IL-13、IL-4和IFN-γ的表达水平的结果。用ELSISA试剂盒分析IL-13、IL-4和IFN-γ的浓度，并将结果以组织的总蛋白浓度进行归一化。通过Bradford测定对蛋白浓度进行量化。每组n＝5且结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。*p＜0.05，**p＜0.01。
图15示出了回收自用H&E(苏木精和伊红)进行染色之后成像的测试实施例5的每个测试组和对照组的肺组织的显微图像。示出了对于每组(n＝5)的代表性图像。
图16示出了使用ImageJ 1.50i软件测量图15的气道上皮厚度的结果。结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。*p＜0.05，**p＜0.01。
图17示出了分析通过非活化的、+PBS、+dNP2-EGFP和+dNP2-ctCTLA-4对Th2细胞的分化作用的结果。
图18示出了计算在CD4+IL-4+分化的Th2细胞中产生的细胞因子的百分比(％)的结果。结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)(n＝3)。**p＜0.01。NA(非活化的)表示阴性对照组，其不受细胞因子或抗TcR抗体的刺激。
具体实施方式
在下文中，对本公开内容的多个方面和示例性实施方案进行更详细地描述。
本公开内容的一个方面涉及用于预防或治疗变应性疾病的药物组合物，其包含其中SEQ ID NO 1的细胞穿透肽与SEQ ID NO 2的ctCTLA4肽融合的融合蛋白作为活性成分。
[SEQ ID NO 1]
[SEQ ID NO 2]
在本公开内容中，“融合蛋白”是指通过遗传融合或化学键合形成的包含SEQ IDNO 1的细胞穿透肽和SEQ ID NO 2的ctCTLA4肽的共价键合的复合物。
“遗传融合”是指通过经由编码蛋白质的DNA序列的遗传表达之线性共价键合的键联。
CTLA4，通常被称为细胞毒性T淋巴细胞抗原-4，其是抑制T细胞活化的重要的免疫蛋白。CTLA-4与其中存在抗原(例如CD80和CD86)的细胞表面上的共刺激分子形成结合，这比与T细胞的共刺激受体CD28的结合更有效。这种相互作用导致负信号并抑制T细胞。阿巴西普是由与CTLA-4的胞外结构域融合的免疫球蛋白G恒定区CTLA-4-Ig构成的重组蛋白。经由静脉内或腹腔内注射，通过嗜酸性粒细胞浸润、Th2细胞因子表达和降低的血清IgE可有效抑制OVA(卵清蛋白)诱导的哮喘动物模型中的变应性气道炎症。
最近，已经开发了新人源细胞穿透肽，其能够通过有效地绕过血管来接近包括脑组织在内的多种组织的驻留细胞。一个实例是由dNP2肽与CTLA-4的胞质结构域构成的重组蛋白dNP2-ctCTLA4。
然而，在脊髓中的Th1和Th17细胞减少的小鼠中仅发现对自身免疫性脑炎的预防或治疗作用。通过发现与现有方法相比，通过经由完全不同的途径(鼻内途径)施用dNP2-ctCTLA-4融合蛋白，可以实现对于完全不同的疾病的治疗或预防作用，从而完成了本公开内容。通过鼻内途径施用dNP2-ctCTLA-4融合蛋白为与中枢神经系统不相关的炎性呼吸系统疾病(特别是变应性哮喘)提供了治疗或预防作用。当dNP2-ctCTLA-4融合蛋白以喷雾剂或粉末形式通过鼻内途径吸入时，蛋白质可以有效地递送给肺驻留细胞，并且递送的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白通过有效控制Th2炎症而对炎性呼吸系统疾病发挥预防或治疗作用。
发现，如果dNP2-ctCTLA-4融合蛋白中的dNP2肽被其他细胞穿透肽替代，则该蛋白质在通过鼻内途径施用时不能有效地递送到气道、支气管或肺内从而不能有效地靶向肺驻留细胞。
也就是说，与现有的CTLA-4-Ig相比，通过鼻内途径施用dNP2-ctCTLA-4融合蛋白针对变应性哮喘提供了显著优异的药理学作用(2至3倍或更高)，并且还提供了与现有dNP2-ctCTLA-4不同的药理学作用。
通过本公开内容的测试实施例，确认了向GCE(德国蟑螂提取物)诱导的变应性哮喘动物模型施用dNP2-ctCTLA-4融合蛋白提供了对抑制高反应性和Th2炎症的作用。
本发明人研究了dNP2-ctCTLA-4融合蛋白对蟑螂诱导的气道炎症的抑制作用。发现dNP2-ctCTLA-4融合蛋白通过经由鼻内途径施用到气道或支气管中而有效地递送至肺细胞。另外，确认了dNP2-ctCTLA-4融合蛋白可以经由通过呼吸上皮有效地递送至驻留细胞。换句话说，根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白可以通过当通过鼻内途径施用时直接抑制Th2分化以及减轻气道高反应性、Th2炎症和气道重塑来有效地控制变应性哮喘。另外，发现与现有CTLA-4-Ig相比，根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白实现了2至3倍或更高的药理学作用。
当通过除鼻内途径以外的途径施用根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白时，不能获得针对本公开内容的炎性呼吸系统疾病的药理学作用。
具有本公开内容中使用的由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的IL-2抑制活性的肽是来源于CTLA-4蛋白的胞质结构域的序列，其通过编码从人或小鼠获得的全长CTLA-4蛋白的外显子4的一部分而获得。其是对应于人和小鼠CTLA-4蛋白的氨基酸序列中的100％对应性的氨基酸序列。当应用于人体时其不太可能引起副作用(例如免疫应答)。
具有由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的IL-2抑制活性的肽是表现出IL-2表达抑制活性的CTLA-4蛋白的片段。其可以高效地通过中枢神经系统(即，血脑屏障或血脊髓屏障)并且可以用于人和非人动物(小鼠)二者，因为其具有100％相同的氨基酸序列。
具体地，具有由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的IL-2抑制活性的肽包含来自细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)蛋白的第188位氨基酸残基至第213位氨基酸残基的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)并且其在下文中也被称为“ctCTLA-4”。其是具有N-末端和C-末端部分缺失的多肽，以在通过鼻内途径施用时为鼻黏膜、支气管黏膜或肺上皮细胞提供渗透活性，从而为炎性呼吸系统疾病提供预防或治疗作用。
ctCTLA4肽可从天然产物中提取、通过基于DNA序列的遗传重组方法合成或制备。
炎性呼吸系统疾病可选自：哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性肺损伤、脓胸、肺脓肿、肺炎、肺结核、咳嗽、痰、支气管炎、咽痛、扁桃体炎、副鼻窦炎、鼻炎、缩窄性细支气管炎和喉炎。
哮喘的实例可包括支气管哮喘、特应性哮喘、特应性支气管IgE介导的哮喘、非特应性哮喘、变应性哮喘、非变应性哮喘等，并且支气管炎的实例可包括急性支气管炎、慢性支气管炎、细支气管炎、卡他性支气管炎等。
变应性哮喘可以是由以下引起的变应性哮喘：尘螨、花粉、动物毛皮或皮屑、蟑螂、食物、药物、流感、卷烟烟雾、室内污染、空气污染、食品添加剂、运动、气候变化、黄尘或应激。更具体地，其可以是由蟑螂引起的变应性哮喘。
具体地，本公开内容的药物组合物可仅通过鼻内途径注射。当其通过其他施用途径(例如静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射或透皮施用)施用时，不能实现针对炎性呼吸系统疾病(特别是变应性哮喘)的药理学作用。
本公开内容的组合物还可包含通常用于制备药物组合物的适当载体、赋形剂和稀释剂。根据本公开内容的药物组合物的制剂没有特别限制，只要其可以通过鼻内途径施用即可。在本公开内容中，“通过鼻内途径施用”包括允许药物组合物通过经由以溶液、粉末、气雾剂或可喷雾溶液剂或粉末形式吸入鼻腔以施用于气道、气管、支气管或肺泡的任何施用方式，无论是否添加稳定剂或其他赋形剂。
具体地，作为本领域已知的合适制剂，可使用Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company，Easton PA)中公开的那些。
具体地，对于通过鼻内途径施用，可使用应用压缩空气/氧气混合物的加压喷雾器、超声喷雾器、电动微泵喷雾器、计量吸入器(MDI)或干粉吸入器(DPI)。气雾剂可通过机械通气或通过插入患者体内的气管导管递送。
可包含在本公开内容的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。对于制剂，使用通常使用的稀释剂或赋形剂，例如填充剂、增量剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。
本公开内容中使用的术语“施用”是指通过任何适当的方法向对象提供本公开内容的组合物。
本公开内容的药物组合物的具体施用剂量根据对象的状况和体重、疾病的严重程度、药物类型、施用途径和施用时间而变化，但可由本领域技术人员充分选择。为了实现期望的效果，本公开内容的组合物可以以每天0.001mg/kg至1000mg/kg的剂量施用。施用可每天一次或数次地进行。施用剂量不以任何方式限制本公开内容的范围。
本公开内容的另一方面涉及用于通过经由鼻内途径向对象施用药物组合物来预防或治疗除人以外的动物的炎性呼吸系统疾病的方法。
可通过经由鼻、黏膜或吸入途径注射实现向对象或细胞施用药物组合物。递送方法不仅可扩展到培养的细胞，还可以扩展到一般性的体内递送，即递送到动物细胞、动物组织和动物体。
因为药物组合物是非免疫原性和不可传播的，并且DNA不包装在生物载体(例如逆转录病毒或腺病毒)中，所以其不受质粒尺寸的限制。因此，其可用于任何实际尺寸的重组基因表达构建体。
发明模式
在下文中，将通过实施例详细描述本公开内容。然而，本公开内容的范围和内容不应被解释为通过以下实施例而减少或限制。另外，明显的是，本领域普通技术人员可基于包括实施例的本公开内容的教导而容易地实施本公开内容(其中没有提供特定的实验数据)，并且这样的改变和修改属于所附权利要求的范围。
<实验方法>
1)小鼠
8周龄BALB/c小鼠购自Orient Bio(Daejon，Korea)。将所有小鼠圈养在无特定病原体的动物设施中。在具有常规饲料和高压灭菌的水的情况下将小鼠维持在12小时光-暗循环中。
德国蟑螂提取物(在下文中被称为GCE)诱导的哮喘动物模型是在延世大学动物研究伦理委员会(Animal Research Ethics Board of Yonsei University)的批准下构建的，并且鼻内蛋白质递送效率实验是在汉阳大学动物护理与使用委员会和动物研究伦理委员会(Animal Care and Use Committees and Ethics Board for Animal Research ofHanyang University)的批准下进行的。
2)德国蟑螂提取物(GCE)
如下制备德国蟑螂提取物。将粉碎的德国蟑螂(Blattella germanica)在200mL乙醚/乙酸乙酯中脱脂，并在具有6mM β-巯基乙醇和1mg/mL 1-苯基-3-(2-噻唑基)-2-硫脲的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在4℃下缓慢搅拌过夜。通过经由0.22-μm滤器过滤由离心混合物而获得的上清液之后然后将其冻干来获得德国蟑螂提取物(在下文中被称为GCE)。
3)GCE诱导的变应性哮喘动物模型
使用根据1)的方法饲养的小鼠。具体地，通过每周两次鼻内施用PBS(假饲(sham))或120μg根据2)的方法制备的GCE，持续三周而使8周龄BALB/c小鼠致敏。
为了确认根据本公开内容的融合蛋白(dNP2-ctCTLA-4)在GCE诱导的慢性变应性哮喘动物模型中的治疗作用，当向小鼠施用GCE时，将10μg的dNP2-ctCTLA-4(实施例1)、dNP2-EGFP(比较例1)、CTLA4-Ig(比较例2)或PBS(对照组)一起鼻内施用(参见测试实施例2)。
为了确认到肺的鼻内递送效率，在第21天鼻内施用100μg的dTomato、Hph-1-dTomato、dNP2-dTomato或PBS 15分钟。处死小鼠并分析蛋白质的递送效率和肺中的病理学变化(参见图1至3和测试实施例1)。
4)针对乙酰甲胆碱的气道高反应性(AHR)分析
使用flexiVent 5.1小动物呼吸机(SCIREQ，Montreal，PQ，Canada)在最后一次GCE施用之后4天测量AHR。将小鼠置于全身体积描记器(Buxco，USA)中，并通过吸入施用气雾剂中多种浓度(3.1、6.25、12.5、25或50mg/mL)的0.4mL乙酰甲胆碱溶液10秒。在施用之后1分钟和2分钟测量Penh，并将平均值确定为用于相应的乙酰甲胆碱施用剂量的Penh(增强呼气间歇)值。
5)支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中细胞数目和免疫细胞分布的分析
为了收集支气管肺泡灌洗液，用1mL具有插管管液的HBSS(汉克平衡盐溶液)洗涤小鼠肺。用血细胞计数器对灌洗液中的总细胞进行计数。然后，将灌洗液离心，并在1000rpm下离心3分钟之后在载玻片上制备细胞。用Hemacolor染色试剂盒(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)对载玻片进行染色。根据标准血细胞学程序对细胞进行差异计数，直至总计数达到至少200，以计数巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。
6)支气管肺泡灌洗液中细胞因子表达的分析
使用T-PER组织蛋白提取试剂(Thermo Fisher Scientific，MA，US)将通过5)的方法获得的灌洗液(BALF)均质化以制备混悬液。将混悬液在4℃下孵育30分钟，然后在2500rpm下离心10分钟。用0.45-μm滤器过滤上清液以分析细胞因子表达水平。
7)观察肺组织
将肺在10％福尔马林溶液中固定一天，并将组织制备为石蜡块并使用切片机切成3至4-μm厚。将制备的载玻片用PAS(高碘酸-希夫)染色剂或马森三色染色剂进行染色。用显微镜(Olympus BX40)观察染色的组织。
8)Th2分化测定
通过磁性活化的细胞分选(MACS，初始CD4 T细胞分离试剂盒，小鼠，Miltenyi，Bergisch Gladbach，Germany)从8周龄BALB/c小鼠分离小鼠初始CD4 T细胞。
然后，将2.5×105个分离的细胞接种到抗CD3/抗CD28抗体(0.1μg/mL)包被的96孔板上。在抗-IFN-γ中和抗体(5μg/mL)、IL-2(50U/mL)、IL-4(30ng/mL)和PBS的存在下孵育细胞。向每个孔添加1μM的dNP2-EGFP(比较例3)或1μM的dNP2-ctCTLA-4(实施例2)6天之后，在再刺激、蛋白质转运抑制剂处理和用抗小鼠IFN-γ-FITC和抗小鼠IL-4-PE FACS抗体进行胞内染色之后通过流式细胞术分析细胞。
9)统计分析
使用Prism 6软件(GraphPad)通过单因素方差分析(单因素ANOVA)对所有数据进行统计分析。P值＜0.05被认为统计显著。
<制备实施例1>dNP2、ctCTLA-4和Hph-1肽的合成和纯化
合成了具有SEQ ID NO 1至3的氨基酸序列的肽。
具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的细胞穿透肽被命名为‘dNP2’，具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的肽被命名为‘ctCTLA-4’并且具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的细胞穿透肽被命名为‘Hph-1’。
在合成氨基酸序列的正义和反义寡脱氧核苷酸之后，将其在95℃下保持3分钟以去除任何形成的二级或三级结构(变性)。然后，通过将温度改变到50℃然后改变到72℃来制备双链DNA。为了插入pRSET-b载体，除正义和反义寡脱氧核苷酸外，还将限制酶特异性序列插入5’和3’端。然后，用编码每种肽的pRSET-b质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)Star pLysS。将菌落在包含氨苄青霉素的卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani)培养基中在37℃下培养，并通过1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导蛋白质表达。通过Ni-NTA亲和色谱法(Qiagen)纯化蛋白质，并使用PD-10柱(GE Healthcare)脱盐。所有蛋白质都储存在-80℃下。
SEQ ID NO 1
SEQ ID NO 2(ctCTLA-4)
SEQ ID NO 3(Hph-1)
<实施例1>dNP2-ctCTLA-4融合蛋白的制备
为了将在制备实施例1中制备的具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的细胞穿透肽与具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的ctCTLA-4肽融合，制备允许将由SEQ ID NO 1表示的细胞穿透肽与ctCTLA-4肽的N-末端连接的引物。通过PCR反应产生dNP2-ctCTLA-4基因之后，将其插入载体(pRSET-b)中。在纯化在大肠杆菌(E.coli)中表达的蛋白质之后，研究胞内递送效率。详细的实验程序如下所述。
1)编码基因的制备
通过将编码在制备实施例1中制备的具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的细胞穿透肽的DNA碱基序列插入到编码具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的ctCTLA-4肽N-末端的一部分的DNA碱基序列中来制备正向引物。各引物的SEQ ID NO和限制酶识别位点总结于表1中。
使用SEQ ID NO 4的引物和包含编码SEQ ID NO 2的肽作为模板的基因的pRSETb载体进行PCR反应。
使用PCR反应器(Bio-Rad)进行以下过程：在95℃下初始热变性3分钟之后，使模板在95℃下热变性30个循环20秒，将引物与模板在50℃下聚合20秒并在72℃下延伸30秒。
表1
对于dNP2-ctCTLA-4正向引物，PCR分两个阶段进行，因为dNP2(KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK)的序列太长。
2)重组表达载体的制备
为了表达dNP2-ctCTLA-4融合蛋白，将在实施例1的1)中制备的基因(DNA)片段用限制酶进行切割，然后使用连接酶将其插入蛋白质表达载体pRSETb中。
用NheI和HindIII(NEB)酶处理实施例1的1)中扩增的DNA片段以使DNA的5’-和3’-端具有黏性。同时，用相同的限制酶处理pRSETb以制备具有NheI和HindIII插入位点的线性pRSETb载体。在每次酶促反应之后，使用PCR纯化试剂盒(Cosmo Genetech)分离产物。
将分离的dNP2-ctCTLA-4双链DNA片段和pRSET-b载体在25℃下用T4连接酶(NEB)处理2小时。
将其中插入了dNP2-ctCTLA-4的所得环状pRSETb载体转化到DH5α大肠杆菌中。选择在包含50μg/mL氨苄青霉素作为抗生素的平板LB培养基上培养时形成菌落的转化大肠杆菌。将选择的大肠杆菌菌落在包含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中再次培养，然后使用质粒小量制备试剂盒(Cosmo Genetech)分离质粒载体。
为了确认分离的质粒载体是其中插入了dNP2-ctCTLA-4的pRSETb载体，将其用NheI和HindIII限制酶处理，然后通过DNA碱基测序(Bionics)进行分析。
3)蛋白质的分离和纯化
将在实施例1的2)中制备的其中插入了dNP2-ctCTLA-4的pRSETb载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)star pLysS中。将在包含34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄青霉素作为抗生素的平板LB培养基上形成的菌落在50mL液体LB培养基中在37℃下培养10小时，然后转移到500mL新鲜液体LB培养基中。在相同温度下培养直至用分光光度计测量的大肠杆菌量达到O.D.0.5之后，添加IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)至1mM的浓度，并且在设定为20℃和150rpm的振荡培养箱中进一步培养大肠杆菌14小时。由大肠杆菌表达的蛋白质包含位于pRSET-b载体上游的6X-His标签。蛋白质如下进行纯化。
将培养物离心，然后在天然条件下在裂解缓冲液(0.5M NaCl，5mM咪唑，20mMTris-HCl，pH 8.0)中重悬。使大肠杆菌悬浮在裂解缓冲液中10分钟，以破坏细胞壁和细胞膜。然后，使用超声细胞破碎机VCX-130(Sonics&Materials)破碎细胞然后离心。将分离的上清液通过0.45-μm滤器(Advantec)过滤一次，并允许其在室温下结合至Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)1小时。然后，仅使结合至Ni-NTA琼脂糖的蛋白质产物与组氨酸柱(His-column，Bio-Rad)结合。用20mM和250mM咪唑溶液洗涤之后，使用3M咪唑溶液洗脱蛋白质。最后，使用PD-10脱盐柱(Amersham Biosciences)从洗脱的蛋白质产物纯化dNP2-ctCTLA-4融合蛋白。
<比较例1>dTomato的合成
使用红色荧光蛋白dTomato。
<比较例2>Hph-1-dTomato的合成
通过Cosmo Genetech合成其中将在制备实施例1中制备的SEQ ID NO 3的细胞穿透肽与红色荧光蛋白dTomato融合的融合蛋白。
<比较例3>dNP2-EGFP的合成和纯化
为了将在制备实施例1中制备的SEQ ID NO 1的细胞穿透肽与增强的绿色荧光蛋白(EGFP)融合，构建了允许在dNP2的N-末端连接EGFP的引物。在通过PCR产生dNP2-EGFP基因之后，将其插入载体(pRSET-b)中。该蛋白在大肠杆菌中表达，然后将其以与实施例1中除引物之外相同的方式纯化。使用以下引物。
[SEQ ID NO 6](第1正向引物)
[SEQ ID NO 7](第2正向引物)
<比较例4>ctCTLA-4-Ig
使用阿巴西普，其是由与免疫球蛋白G恒定区缀合的CTLA-4胞外结构域组成的重组蛋白(CTLA-4-Ig)，并且已知作为针对类风湿性关节炎的治疗剂。
<测试实施例1>通过鼻内施用将dNP2肽递送到肺驻留细胞中的蛋白质递送效率
1)实验设计
因为dNP2肽可以更有效地将蛋白质递送到活化的免疫细胞或记忆样免疫细胞而不是静息细胞，所以假设dNP2肽可以比在没有任何处理的假饲小鼠中更有效地向炎性肺驻留细胞递送蛋白质。具体的实验条件示于图1中。
<对照组>
每周两次(每次120μg)向未经处理的动物模型(8周龄雌性BALB/c小鼠，参见实验方法的1))鼻内施用PBS，持续3周。在第21天，通过鼻腔施用100μg载剂(PBS)或蛋白质(dTomato，Hph-1-dTomato或dNP2-dTomato)。
根据在第21天施用的载剂或蛋白质，将对照组表示为dTomato对照组、Hph-1-dTomato对照组、dNP2-dTomato对照组或PBS对照组。
<测试组>
为了在动物模型的肺中诱导慢性变应性炎症，每周两次(每次120μg)向8周龄雌性BALB/c小鼠鼻内施用GCE，持续3周(见实验方法的3))。在第21天，通过鼻腔施用100μg载剂(PBS)或蛋白质(dTomato，Hph-1-dTomato或dNP2-dTomato)。
根据在第21天施用的载剂或蛋白质，将测试组表示为dTomato测试组、Hph-1-dTomato测试组、dNP2-dTomato测试组或PBS测试组。
2)结果
在实验完成之后15分钟，通过向每只动物两次注射1mL PBS获得支气管肺泡灌洗液(BALF)。安乐死之后，收获肺组织，用PBS洗涤并用4％多聚甲醛固定。使用O.C.T.化合物(Wako Chemical)对所有组织进行冷冻。使用低温恒温器(Thermo Scientific)将冷冻块切成8μm厚。
图2示出了从测试实施例1的每个对照组和测试组制备冷冻肺组织切片(8μm)，用Hoechst对细胞核进行染色并通过荧光显微术进行观察的结果。
如图2所示，当在第21天施用载剂或蛋白质之后15分钟观察来自每种动物模型(假饲小鼠或GCE诱导的变应性哮喘动物模型)的肺组织的蛋白信号时，在气道上皮和一些驻留细胞中观察到dNP2-dTomato。然而，对于Hph-1-dTomato对照组和dTomato对照组显示出与PBS对照组相当的水平，表明dNP2肽的蛋白质递送效率在未经处理的动物模型(假饲小鼠)中是最优的。
测试组的结果显示出与对照组相似的趋势。但是，与炎性肺驻留细胞中的dTomato测试组、Hph-1-d Tomato测试组和PBS测试组相比，dNP2-dTomato测试组显示出最亮的信号。
正如预期的那样，dNP2肽对于施用长时间PBS的假饲小鼠和GCE诱导的变应性哮喘动物模型二者中的肺驻留细胞均显示出优异的蛋白质递送效率。
图3示出了来自测试实施例1的每个对照组和测试组的支气管肺泡灌洗液的荧光信号的流式细胞术结果。示出了红色荧光直方图和平均荧光强度(MFI)。
如图3所示，当通过流式细胞术分析从每只动物回收的支气管肺泡灌洗液(BALF)时，dNP2-dTomato测试组和对照组显示出比Hph-1-dTomato测试组和对照组高10倍的平均荧光强度(MFI)。这表明与Hph-1肽相比，dNP2肽通过鼻内施用显示出对肺细胞高得多的蛋白质递送效率。
<测试实施例2>dNP2-ctCTLA-4融合蛋白在GCE诱导的变应性哮喘动物模型中的治疗作用分析
1)实验设计
接下来，如下设计实验以确定根据本公开内容的融合蛋白(dNP2-ctCTLA-4)在GCE诱导的变应性哮喘动物模型(参见实验方法的3))中的治疗作用。具体的实验条件示于图4中。
使用根据实验方法的1)饲养的小鼠。具体地，每周两次向8周龄BALB/c小鼠鼻内施用PBS(假饲)或120μg根据实验方法的2)制备的GCE，持续3周。当向小鼠施用GCE时，将10μg的dNP2-ctCTLA-4(实施例1)、dNP2-EGFP(比较例3)、CTLA4-Ig(比较例2)或载剂(PBS)一起鼻内施用。在第21天，将小鼠麻醉并测量对乙酰甲胆碱(MeCh)的高反应性(参见实验方法的4))。
<对照组>
每周两次(每次120μg)向根据实验方法的1)饲养的8周龄雌性BALB/c小鼠鼻内施用PBS，持续3周。当向小鼠施用PBS时，将10μg载剂(PBS)一起鼻内施用。该组被表示为假饲对照组。
<测试组>
使用根据实验方法的1)饲养的小鼠。具体地，每周两次向8周龄BALB/c小鼠鼻内施用120μg根据实验方法的2)制备的GCE，持续3周。当向小鼠施用GCE时，将10μg的dNP2-ctCTLA-4(实施例2)、dNP2-EGFP(比较例3)或载体(PBS)一起鼻内施用。
根据施用的蛋白质或载剂，将测试组表示为dNP2-ctCTLA-4测试组、dNP2-EGFP测试组或PBS测试组。
2)结果
在第21天，将动物麻醉并测量对乙酰甲胆碱(MeCh)的高反应性(参见实验方法的4))。
图5和图6示出了针对测试实施例2的每个测试组和对照组分析对乙酰甲胆碱的气道高反应性(AHR)的结果。图5示出了根据乙酰甲胆碱浓度测量的测试实施例2的每个测试组和对照组的气道阻力。图6示出了根据乙酰甲胆碱浓度测量的测试实施例2的每个测试组和对照组的气道弹性阻力。每组n＝5且结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。**p＜0.01，***p＜0.001。
如图5和图6所示，PBS测试组和dNP2-EGFP测试组显示出显著提高的气道阻力和气道弹性阻力，表明由于气道空间降低导致显著的气道高反应性。用10μg的dNP2-ctCTLA-4处理的dNP2-ctCTLA-4测试组显示出显著降低的气道高反应性，表明通过鼻内施用dNP2-ctCTLA-4改善了由多次暴露于GCE而诱导的气道高反应性。也就是说，确认了dNP2-ctCTLA-4对GCE诱导的变应性哮喘具有治疗或预防作用。
<测试实施例3>dNP2-ctCTLA-4融合蛋白在GCE诱导的变应性哮喘动物模型中的气道炎症改善作用
为了评价dNP2-ctCTLA-4融合蛋白对GCE诱导的变应性哮喘动物模型中肺的病理生理学的抑制作用，根据实验方法的7)观察测试实施例2的每个测试组和对照组的肺组织。
图7示出了针对测试实施例3的每个测试组和对照组观察肺组织的结果。在用PAS进行染色之后，对测试实施例3的每个测试组和对照组的肺组织进行成像。红色区域表示分泌黏液的杯状细胞。图8示出了使用ImageJ 1.50i软件分析图7中分泌黏液的杯状细胞数目的结果。
如图7和图8所示，鼻内GCE施用显著提高了血管周围的浸润单核细胞以及气道上皮中的杯状细胞化生。然而，鼻内施用根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白显著减少了肺中的炎性细胞和杯状细胞。
图9示出了针对测试实施例3的每个测试组和对照组观察肺组织的结果。在用马森三色染色剂进行染色之后，对测试实施例3的每个测试组和对照组的肺组织进行成像。蓝色区域表示胶原蛋白沉积和纤维化。
图10示出了使用ImageJ 1.50i软件分析图9的纤维化区域的结果。每组(n＝5)的代表性结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。***p＜0.001。
在图9和图10中，通过用马森三色染色剂对每个测试组和对照组进行染色来测量纤维化区域。与对照组(假饲)相比，针对测试组(PBS测试组)观察到肺中的高水平的支气管周纤维化。同时，鼻内施用dNP2-ctCTLA-4融合蛋白的dNP2-ctCTLA-4测试组显示出支气管区域周围的纤维化面积显著减少。
根据这些结果，确认了鼻内施用根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白显著改善了气道炎症和纤维化。
<测试实施例4>dNP2-ctCTLA-4融合蛋白在GCE诱导的变应性哮喘动物模型中对嗜酸性粒细胞浸润和Th2细胞因子产生的抑制作用
1)实验设计
如测试实施例2中那样设计实验条件。从测试实施例2的每个测试组和对照组获得支气管肺泡灌洗液，并研究嗜酸性粒细胞浸润和Th2细胞因子产生的抑制作用。实验设计的细节如下。
<对照组>
每周两次(每次120μg)向根据实验方法的1)饲养的8周龄雌性BALB/c小鼠鼻内施用PBS，持续3周。当向小鼠施用PBS时，将10μg载剂(PBS)一起鼻内施用。该组被表示为假饲对照组。
<测试组>
使用根据实验方法的1)饲养的小鼠。具体地，每周两次向8周龄BALB/c小鼠鼻内施用120μg根据实验方法的2)制备的GCE，持续3周。当向小鼠施用GCE时，将10μg的dNP2-ctCTLA-4(实施例2)、dNP2-EGFP(比较例3)或载剂(PBS)一起鼻内施用。
根据施用的蛋白质或载剂，将测试组表示为dNP2-ctCTLA-4测试组、dNP2-EGFP测试组或PBS测试组。
2)结果
在实验完成之后15分钟，通过向每只动物两次注射1mL PBS获得支气管肺泡灌洗液(BALF)(参见实验方法的5))。
图11示出了对回收自载玻片上的测试实施例4的每个测试组和对照组的支气管肺泡灌洗液进行细胞离心并使用Hemacolor染色试剂盒进行染色之后对总细胞(a)、巨噬细胞(b)和嗜酸性粒细胞(c)的数目进行计数的结果。
如图11所示，与对照组(假饲)相比，施用GCE的PBS测试组显示出支气管肺泡灌洗(BAL)中总细胞(a)、巨噬细胞(b)和嗜酸性粒细胞(c)的数目提高。
相比之下，dNP2-ctCTLA-4融合蛋白与GCE一起鼻内施用的dNP2-ctCTLA-4测试组显示出支气管肺泡灌洗(BAL)中总细胞(a)、巨噬细胞(b)和嗜酸性粒细胞(c)的数目减少3倍或更多。因此，确认了用根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白的处理在GCE诱导的变应性哮喘动物模型中提供了治疗和预防作用。
图12示出了使用ELISA试剂盒(顶部)分析支气管肺泡灌洗(BAL)上清液中IL-5、IL-13和IFN-γ的表达水平的结果和使用ELISA试剂盒(底部)分析冷冻肺组织中IL-5、IL-13、IL-4和IFN-γ的表达水平的结果。用ELSISA试剂盒分析IL-5、IL-13、IL-4和IFN-γ的浓度，并将结果以组织的总蛋白浓度进行归一化。通过Bradford测定对蛋白浓度进行量化。每组n＝5且结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。*p＜0.05，**p＜0.01。
在该实验中，从每个测试组和对照组回收支气管肺泡灌洗(BAL)和肺组织，并比较IL-13、IL-4和Th2细胞因子的表达水平。
如图12所示，与对照组(假饲)相比，施用GCE的PBS测试组显示出支气管肺泡灌洗(BAL)和肺组织中IL-5、IL-13、IL-4和IFN-γ的表达显著提高。
然而，用根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白处理的dNP2-ctCTLA-4测试组显示出在支气管肺泡灌洗(BAL)和肺组织二者中IL-5、IL-13、IL-4和IFN-γ的表达水平降低多于3倍和2倍。因为IL-5对于嗜酸性粒细胞活化是关键的，所以可以看出根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白抑制嗜酸性粒细胞活化。
还发现用dNP2-ctCTLA-4融合蛋白处理的dNP2-ctCTLA-4测试组显示出IFN-γ水平降低，表明鼻内施用dNP2-ctCTLA-4显著降低Th2炎症，所述Th2炎症与嗜酸性粒细胞募集和细胞因子产生有关。
<测试实施例5>dNP2-ctCTLA-4融合蛋白在GCE诱导的变应性哮喘动物模型中对气道炎症的抑制作用
1)实验设计
阿巴西普是由CTLA-4的胞外结构域和免疫球蛋白的Fc区构成的重组蛋白(CTLA4-Ig)。其是目前最广为人知的免疫调节药物。已知全身施用CTLA4-Ig可抑制实验哮喘模型中的T细胞活化和气道炎症。
然而，根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白通过鼻内施用可以获得显著优异的肺细胞渗透性以及对气道炎症的治疗和预防作用，而CTLA4-Ig在通过鼻内途径注射时由于组织渗透性低不能抑制气道炎症。这通过以下实验证明。实验条件如图13中所示。
<对照组>
每周两次(每次120μg)向根据实验方法的1)饲养的8周龄雌性BALB/c小鼠鼻内施用PBS，持续3周。当向小鼠施用PBS时，将10μg载剂(PBS)一起鼻内施用。该组被表示为假饲对照组。
<测试组>
使用根据实验方法的1)饲养的小鼠。具体地，每周两次向8周龄BALB/c小鼠鼻内施用120μg根据实验方法的2)制备的GCE，持续3周。当向小鼠施用GCE时，将10μg的dNP2-ctCTLA-4(实施例2)、CTLA4-Ig(比较例4)或载剂(PBS)一起鼻内施用。
根据施用的蛋白质或载剂，将测试组表示为dNP2-ctCTLA-4测试组、CTLA4-Ig测试组或PBS测试组。
2)结果
实验完成之后15分钟，通过向每只动物两次注射1mL PBS获得支气管肺泡灌洗液(BALF)(参见实验方法的5))。
图14示出了使用ELISA试剂盒(顶部)分析支气管肺泡灌洗(BAL)上清液中IL-13和IFN-γ的表达水平的结果和使用ELISA试剂盒(底部)分析冷冻肺组织中IL-13、IL-4和IFN-γ的表达水平的结果。用ELSISA试剂盒分析IL-13、IL-4和IFN-γ的浓度，并将结果以组织的总蛋白浓度进行归一化。通过Bradford测定对蛋白浓度进行量化。每组n＝5且结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。*p＜0.05，**p＜0.01。
如图14所示，鼻内施用根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白的dNP2-ctCTLA-4测试组显示支气管肺泡灌洗(BAL)和肺组织中IL-13和IFN-γ的水平显著降低。然而，与对照组(假饲)相比，鼻内施用CTLA4-Ig的CTLA4-Ig测试组显示细胞因子产生高3倍，表明当通过鼻腔施用时CTLA4-Ig不能有效抑制气道炎症。
图15示出了从用H&E(苏木精和伊红)进行染色之后成像的测试实施例5的每个测试组和对照组回收的肺组织的显微图像。示出了每组(n＝5)的代表性图像。图16示出了使用ImageJ 1.50i软件测量图15的气道上皮厚度的结果。结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。*p＜0.05，**p＜0.01。
参照图15和图16，其是通过用苏木精伊红(H&E)对从每个测试组和对照组获得的肺组织进行染色获得的，可以看出鼻内施用dNP2-ctCTLA-4的dNP2-ctCTLA-4测试组显示出改善的呼吸系统上皮的生理学特征，而CTLA4-Ig测试组未显示对细胞浸润和气道上皮增厚的抑制。根据这些结果，确认了鼻内施用根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白在GCE诱导的变应性哮喘动物模型中提供比现有CTLA4-Ig高2至3倍的药理学作用。
<测试实施例6>dNP2-ctCTLA-4融合蛋白在GCE诱导的变应性哮喘动物模型中对Th2细胞分化的抑制作用
研究了dNP2-ctCTLA-4融合蛋白是否可以直接抑制GCE诱导的变应性哮喘动物模型中Th2细胞的分化。该实验根据实验方法的8)进行。
使用从8周龄BALB/c小鼠分离的MACS分选的CD4+CD62LhiCD44-初始CD4 T细胞。通过在用抗CD3/CD28抗体活化期间添加IL-4持续6天，使其分化成Th2细胞。
图17示出了分析通过非活化的、+PBS、+dNP2-EGFP和+dNP2-ctCTLA-4对Th2细胞的分化作用的结果。图18示出了计算在CD4+IL-4+分化的Th2细胞中产生的细胞因子的百分比(％)的结果。结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)(n＝3)。**p＜0.01。NA(非活化的)表示阴性对照组，其不受细胞因子或抗TcR抗体的刺激。
如图17和18所示，通过流式细胞术分析Th2细胞以产生IL-4和IL-13。分化的Th2细胞具有显著比例的产生IL-4(和/或IL-13)的CD4T细胞，而dNP2-ctCTLA-4组显示出显著降低的细胞因子产生，表明Th2细胞的分化受dNP2-ctCTLA-4抑制。这些结果表明，根据本公开内容的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白直接抑制Th2细胞分化，从而有助于其对GCE诱导的动物模型的肺中Th2炎症的抑制作用。
工业实用性
与现有的治疗剂相比，在不能实现有效的治疗或预防作用的情况下，本公开内容的其中将细胞穿透肽与ctCTLA4肽融合的融合蛋白可以通过经由呼吸系统的施用对炎性呼吸系统疾病(特别是变应性哮喘)提供迅速、快速且有效的治疗或预防作用，其提供针对支气管和肺细胞优异的递送和靶向效率以及显著改善的抑制细胞因子表达、抑制气道炎症、减轻对变应原的气道高反应性、减轻Th2炎症等的活性。
Claims (8)
1.用于预防或治疗炎性呼吸系统疾病的药物组合物，其包含其中SEQ ID NO 1的细胞穿透肽与SEQ ID NO 2的ctCTLA4肽融合的融合蛋白作为活性成分，
[SEQ ID NO 1]
KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK
[SEQ ID NO 2]
KMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物通过鼻内途径施用到气道、支气管或肺中。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物通过以喷雾剂或粉末的形式吸入来施用。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物对于鼻黏膜、支气管黏膜或肺上皮细胞具有渗透活性。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述炎性呼吸系统疾病选自：哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性肺损伤、脓胸、肺脓肿、肺炎、肺结核、咳嗽、痰、支气管炎、咽痛、扁桃体炎、副鼻窦炎、鼻炎、缩窄性细支气管炎和喉炎。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述哮喘是由以下引起的变应性哮喘：尘螨、花粉、动物毛皮或皮屑、蟑螂、食物、药物、流感、卷烟烟雾、室内污染、空气污染、食品添加剂、运动、气候变化、黄尘或应激。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述哮喘是由蟑螂引起的变应性哮喘。
8.用于预防或治疗除人以外的动物的炎性呼吸系统疾病的方法，其通过经由鼻内途径向对象施用根据权利要求1所述的药物组合物来实施。
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101355957A (zh) * | 2005-11-04 | 2009-01-28 | 为人技术株式会社 | 将融合多肽递送入细胞的方法 |
| WO2017034244A1 (ko) * | 2015-08-21 | 2017-03-02 | 한양대학교 산학협력단 | 중추신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHOI JE-MIN ET AL: "Intranasal delivery of the cytoplasmic domain of CTLA-4 using a novel protein transduction domain prevents allergic inflammation", 《NATURE MEDICINE》 * |
Also Published As
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