KR20190003698A - 키메라 신경독소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 증진된 특성을 갖는 키메라 신경독소 및 요법에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

키메라 신경독소
본 발명은 증진된 특성을 갖는 키메라 신경독소 및 요법에서의 그의 용도에 관한 것이다.
클로스트리디아(Clostridia) 속의 박테리아는 독소가 전달되는 뉴런 및 다른 세포를 중독시킬 수 있는 매우 강력하고 특이적인 단백질 독소를 생산한다. 이러한 클로스트리디움 독소의 예는 씨. 테타니(C. tetani) (TeNT)에 의해 및 씨. 보툴리눔(C. botulinum) (BoNT) 혈청형 A-G에 의해 생산된 신경독소, 뿐만 아니라 씨. 바라티이(C. baratii) 및 씨. 부티리쿰(C. butyricum)에 의해 생산된 것들을 포함한다.
클로스트리디움 신경독소 중에서 가장 강력한 독소의 일부가 알려져 있다. 예로서, 보툴리눔 신경독소는 혈청형에 따라, 0.5 내지 5 ng/kg 범위의 마우스에 대한 중앙 치사 용량 (LD50) 값을 갖는다. 테타누스 및 보툴리눔 독소 둘 다는 이환된 뉴런의 기능, 구체적으로 신경전달물질의 방출을 억제함으로써 작용한다. 보툴리눔 독소는 신경근 접합부에서 작용하고 말초 신경계에서 콜린성 전달을 억제하는 반면에, 테타누스 독소는 중추 신경계에서 작용한다.
사실상, 클로스트리디움 신경독소는 단일-쇄 폴리펩티드로서 합성되며, 이는 단백질분해적 절단 사건에 의해 번역후 변형되어 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄를 형성한다. 절단은 쇄간 디술피드 결합을 제공하는 시스테인 잔기 사이에 위치된, 종종 활성화 부위로서 지칭되는, 특이적 절단 부위에서 발생한다. 독소의 활성 형태는 이러한 이중-쇄 형태이다. 2개의 쇄는 대략 100 kDa의 분자 질량을 갖는 중쇄 (H-쇄), 및 대략 50 kDa의 분자 질량을 갖는 경쇄 (L-쇄)로 칭해진다. H-쇄는 N-말단 전위 구성성분 (HN 도메인) 및 C-말단 표적화 구성성분 (HC 도메인)을 포함한다. 절단 부위는 L-쇄 및 전위 도메인 구성성분 사이에 위치된다. HC 도메인의 그의 표적 뉴런에의 결합 및 결합된 독소의 엔도솜을 통한 세포 내로의 내재화 후, HN 도메인은 엔도솜 막을 거쳐 및 시토졸 내로 L-쇄를 전위시키고, L-쇄는 프로테아제 기능 (또한 비-세포독성 프로테아제로도 알려짐)을 제공한다.
비-세포독성 프로테아제는 SNARE 단백질 (예를 들어 SNAP-25, VAMP, 또는 신탁신(Syntaxin))로서 알려진 세포내 수송 단백질을 단백질분해적으로 절단함으로써 작용한다 - 문헌 [Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.] 참조. 두문자어 SNARE는 용어 가용성 NSF 부착 수용체 (Soluble NSF Attachment Receptor)로부터 유래되며, 여기서 NSF는 N-에틸말레이미드-감수성 인자 (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)를 의미한다. SNARE 단백질은 세포내 소포 융합에 필수적이고, 따라서 세포로부터의 소포 수송을 통한 분자의 분비에 필수적이다. 프로테아제 기능은 아연-의존성 엔도펩티다제 활성이고 SNARE 단백질에 대한 높은 기질 특이성을 나타낸다. 따라서, 일단 목적되는 표적 세포로 전달되면, 비-세포독성 프로테아제는 표적 세포로부터의 세포 분비를 억제할 수 있다. 클로스트리디움 신경독소의 L-쇄 프로테아제는 SNARE 단백질을 절단하는 비-세포독성 프로테아제이다.
SNARE 단백질의 편재적 성질의 관점에서, 클로스트리디움 신경독소 예컨대 보툴리눔 독소는 광범위한 요법에 성공적으로 이용된 바 있다.
예로서, 본 발명자들은 문헌 [William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004)]을 언급하며, 이 문헌은 다수의 요법적 및 미용적 또는 미적 적용에서의 뉴런 전달을 억제하기 위해 클로스트리디움 신경독소, 예컨대 보툴리눔 신경독소 (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 파상풍 신경독소 (TeNT)의 용도를 기재하며 - 예를 들어, 시판 보툴리눔 독소 제품은 현재 초점성 경직, 상지 경직, 하지 경직, 경부 이상긴장증, 안검연축, 편측안면 연축, 액와 다한증, 만성 편두통, 신경성 배뇨근 과다활동, 미간 주름, 및 중증 외안각 주름을 포함한 적응증에 대한 치료제로서 승인되어 있다. 게다가, 신경근 장애를 치료하기 위한 (US 6,872,397 참조); 자궁 장애를 치료하기 위한 (US 2004/0175399 참조); 궤양 및 위식도 역류 질환을 치료하기 위한 (US 2004/0086531 참조); 이상긴장증을 치료하기 위한 (US 6,319,505 참조); 눈 장애를 치료하기 위한 (US 2004/0234532 참조); 안검연축을 치료하기 위한 (US 2004/0151740 참조); 사시를 치료하기 위한 (US 2004/0126396 참조); 통증을 치료하기 위한 (US 6,869,610, US 6,641,820, US 6,464,986, 및 US 6,113,915 참조); 섬유근통을 치료하기 위한 (US 6,623,742, US 2004/0062776 참조); 하배부통을 치료하기 위한 (US 2004/0037852 참조); 근육 손상을 치료하기 위한 (US 6,423,319 참조); 부비동 두통을 치료하기 위한 (US 6,838,434 참조); 긴장 두통을 치료하기 위한 (US 6,776,992 참조); 두통을 치료하기 위한 (US 6,458,365 참조); 편두통 통증의 감소를 위한 (US 5,714,469 참조); 심혈관 질환을 치료하기 위한 (US 6,767,544 참조); 신경계 장애 예컨대 파킨슨병을 치료하기 위한 (US 6,620,415, US 6,306,403 참조); 신경정신병적 장애를 치료하기 위한 (US 2004/0180061, US 2003/0211121 참조); 내분비 장애를 치료하기 위한 (US 6,827,931 참조); 갑상선 장애를 치료하기 위한 (US 6,740,321 참조); 콜린 영향 한선 장애를 치료하기 위한 (US 6,683,049 참조); 당뇨병을 치료하기 위한 (US 6,337,075, US 6,416,765 참조); 췌장 장애를 치료하기 위한 (US 6,261,572, US 6,143,306 참조); 암 예컨대 골 종양을 치료하기 위한 (US 6,565,870, US 6,368,605, US 6,139,845, US 2005/0031648 참조); 귀 장애를 치료하기 위한 (US 6,358,926, US 6,265,379 참조); 자율신경성 장애 예컨대 위장 근육 장애 및 다른 평활근 기능이상을 치료하기 위한 (US 5,437,291 참조); 피부 세포-증식성 장애와 연관된 피부 병변의 치료를 위한 (US 5,670,484 참조); 신경성 염증 장애의 관리를 위한 (US 6,063,768 참조); 탈모를 감소시키고 모발 성장을 자극하기 위한 (US 6,299,893 참조); 처진 입을 치료하기 위한 (US 6,358,917 참조); 식욕을 감소시키기 위한 (US 2004/40253274 참조); 치과 요법 및 시술을 위한 (US 2004/0115139 참조); 신경근 장애 및 병태를 치료하기 위한 (US 2002/0010138 참조); 다양한 장애 및 병태 및 연관된 통증을 치료하기 위한 (US 2004/0013692 참조); 점액 과다분비로 인한 병태 예컨대 천식 및 COPD를 치료하기 위한 (WO 00/10598 참조); 및 비-뉴런 병태 예컨대 염증, 내분비 병태, 외분비 병태, 면역학적 병태, 심혈관 병태, 골 병태를 치료하기 위한 (WO 01/21213 참조) 클로스트리디움 신경독소 요법이 기재되어 있다. 상기 공개 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간 및 다른 포유동물의 요법적 및 미용적 치료에서의 비-세포독성 프로테아제 예컨대 클로스트리디움 신경독소 (예를 들어 BoNT 및 TeNT)의 용도는 이들 독소의 특성으로부터 이익을 얻을 수 있는 계속 넓어지는 범위의 질환 및 질병으로 확대되는 것으로 예상된다.
BoNT를 포함하는 현재 모든 승인된 약물/화장품 제제는 클로스트리디움 균주로부터 정제된 자연 발생 신경독소 (디스포르트(DYSPORT)®, 보톡스(BOTOX)® 또는 제오민(XEOMIN)®의 경우에 BoNT/A, 및 미오블록(MYOBLOC)®의 경우에 BoNT/B)를 함유한다.
재조합 기술은 그의 서열 및/또는 구조에 대한 변형의 도입을 통해 신경독소의 특성을 변화시키거나 또는 최적화하는 가능성을 제공한다. 특히, HC 도메인 또는 HCC 서브도메인이 상이한 신경독소로부터의 HC 도메인 또는 HCC 서브도메인에 의해 대체되어 있는 키메라 신경독소가 생산된 바 있다.
문헌 [Rummel et al., 2011 (Exchange of the HCC domain mediating double receptor recognition improves the pharmacodynamic properties of botulinum neurotoxin. FEBS Journal, 278(23), 4506-4515)]에서는 AABB, AACC 및 BBAA 키메라 (문자는 4개의 도메인: L, HN, HCN, HCC 각각의 혈청형 기원을 나타냄)를 포함한 다양한 활성 전장 하이브리드 신경독소를 생성하였다. AABB 키메라는 마우스 횡격 신경 편측횡격막 검정에서 BoNT/A보다 더 강력한 것으로 발견된 반면에, AACC는 단지 BoNT/A의 효력의 10%를 보유하였다. BBAA 키메라는 BoNT/A의 효력의 85%를 보유하고 BoNT/B와 동등효력이었다.
문헌 [Wang et al., 2008 (Novel chimeras of botulinum neurotoxins A and E unveil contributions from the binding, translocation, and protease domains to their functional characteristics. Journal of Biological Chemistry, 283(25), 16993-17002)]에서는 AE (BoNT/A로부터의 LHN 및 BoNT/E로부터의 HC) 및 EA (BoNT/E로부터의 LHN 및 BoNT/A로부터의 HC) 키메라 신경독소를 생성하였으며, AE 키메라의 경우에 가요성을 증가시키기 위해 LHN 및 HC 도메인 사이에 링커를 첨가하였다. 둘 다가 마우스 횡격 신경 편측횡격막 검정에서 뿐만 아니라 생체내에서 마비를 야기할 수 있었다.
문헌 [Wang et al., 2012a (Longer-acting and highly potent chimaeric inhibitors of excessive exocytosis created with domains from botulinum neurotoxin A and B. Biochemical Journal, 444(1), 59-67)]에서는 AB (폴딩을 개선시키기 위한 링커의 존재 하에, BoNT/A로부터의 LHN 및 BoNT/B로부터의 HC) 및 BA (BoNT/B로부터의 LHN 및 BoNT/A로부터의 HC) 키메라 신경독소를 생성하였다. AB 키메라는 마우스에서 BoNT/A보다 더 지속된 신경근육 마비를 유도하였다. BA 키메라는 비-뉴런 세포로부터의 세포외유출을 감소시킬 수 있었다.
문헌 [Wang et al., 2012b (Novel chimeras of botulinum and tetanus neurotoxins yield insights into their distinct sites of neuroparalysis. The FASEB Journal, 26(12), 5035-5048)]에서는 ATx (BoNT/A로부터의 LHN 및 TeNT로부터의 HC), TxA (TeNT로부터의 LHN 및 BoNT/A로부터의 HC), ETx (BoNT/E로부터의 LHN 및 TeNT로부터의 HC) 및 TxE (TeNT로부터의 LHN 및 BoNT/E로부터의 HC) 키메라를 생성하였다. 이들 선행 기술 키메라 신경독소의 단백질 서열에 대하여 제공된 정보는 하기 표 1에 요약된다:
표 1 - 선행 기술 키메라 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인
Figure pct00001
그러나, 개선된 치료 특성을 가능하게 하는 키메라 신경독소의 최적화된 디자인에 대한 필요가 여전히 존재한다.
본 발명은, 청구범위에서 구체화된 바와 같은, 키메라 신경독소를 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.
한 측면에서, 본 발명은 제2 신경독소로부터의 HC 도메인에 공유 연결된 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인을 포함하는 키메라 신경독소를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 신경독소는 상이하고, 여기서 LHN 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 제1 신경독소 내 LHN 및 HC를 분리하는 310 헬릭스의 제1 아미노산 잔기에 상응하고, 여기서 HC 도메인의 N-말단 아미노산 잔기는 제2 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 제2 아미노산 잔기에 상응한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 신경독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 신경독소를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 키메라 신경독소를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 미적 또는 미용적 병태를 치료하기 위한 본 발명에 따른 키메라 신경독소의 비-요법적 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 제2 신경독소로부터의 HC 도메인에 공유 연결된 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인을 포함하는 키메라 신경독소를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 신경독소는 상이하고,
ㆍ 여기서 LHN 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 제1 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 제1 아미노산 잔기에 상응하고,
ㆍ 여기서 HC 도메인의 N-말단 아미노산 잔기는 제2 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 제2 아미노산 잔기에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같은 단수형 용어는 하나 이상을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "신경독소"는 뉴런에 진입하고 신경전달물질 방출을 억제하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 프로세스는 저 또는 고 친화도 수용체에 대한 신경독소의 결합, 신경독소의 내재화, 신경독소의 엔도펩티다제 부분의 세포질 내로의 전위 및 신경독소 기질의 효소적 변형을 포괄한다. 보다 구체적으로, 용어 "신경독소"는 뉴런에 진입하고 신경전달물질 방출을 억제하는 클로스트리디움 박테리아에 의해 생산된 임의의 폴리펩티드 (클로스트리디움 신경독소)를 포괄하며, 이러한 폴리펩티드는 재조합 기술 또는 화학적 기술에 의해 생산된다. 독소의 활성 형태는 이러한 이중-쇄 형태이다. 2개의 쇄는 대략 100 kDa의 분자 질량을 갖는 중쇄 (H-쇄), 및 대략 50 kDa의 분자 질량을 갖는 경쇄 (L-쇄)로 칭해진다. 바람직하게는, 제1 및 제2 신경독소는 클로스트리디움 신경독소이다.
BoNT/A 신경독소 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 1 (유니프롯 수탁 번호 A5HZZ9)로서 제공된다. BoNT/B 신경독소 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 2 (유니프롯 수탁 번호 B1INP5)로서 제공된다. BoNT/C 신경독소 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 3 (유니프롯 수탁 번호 P18640)으로서 제공된다. BoNT/D 신경독소 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 4 (유니프롯 수탁 번호 P19321)로서 제공된다. BoNT/E 신경독소 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 5 (유니프롯 수탁 번호 Q00496)로서 제공된다. BoNT/F 신경독소 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 6 (유니프롯 수탁 번호 Q57236)으로서 제공된다. BoNT/G 신경독소 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 7 (유니프롯 수탁 번호 Q60393)로서 제공된다. TeNT 신경독소 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 8 (유니프롯 수탁 번호 P04958)로서 제공된다. 상기 신경독소의 아미노산 서열은, 다른 신경독소의 서열 (즉, 서열식별번호: 58 내지 91)과 함께, 하기 도 1의 정렬에서 제시된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 신경독소"는 제1 신경독소로부터 기원하는 LHN 도메인 및 제2 신경독소로부터 기원하는 HC 도메인을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 신경독소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "HC 도메인"은 표적 세포의 표면 상에 위치된 수용체에 대한 신경독소의 결합을 가능하게 하는 대략 50 kDa의 분자량을 갖는 신경독소 중쇄의 기능상 별개 영역을 의미한다. HC 도메인은 2개의 구조상 별개 서브도메인, "HCN 서브도메인" (HC 도메인의 N-말단 부분) 및 "HCC 서브도메인" (HC 도메인의 C-말단 부분)으로 이루어지며, 이들 각각은 대략 25 kDa의 분자량을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "LHN 도메인"은 HC 도메인이 결여되어 있고 엔도펩티다제 도메인 ("L" 또는 "경쇄") 및 세포질 내로의 엔도펩티다제의 전위를 담당하는 도메인 (중쇄의 HN 도메인)으로 이루어진 신경독소를 의미한다.
"제1 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 제1 아미노산 잔기"에 대한 본원에서의 지칭은 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 N-말단 잔기를 의미한다.
"제2 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 제2 아미노산 잔기"에 대한 본원에서의 지칭은 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 N-말단 잔기에 따른 아미노산 잔기를 의미한다.
"310 헬릭스"는 α-헬릭스, β-시트 및 역방향 턴과 함께, 단백질 및 폴리펩티드에서 발견된 2차 구조의 유형이다. 310 헬릭스 내 아미노산은 각각의 전체 턴이 3개의 잔기 및 그들 사이의 분자간 수소 결합을 분리하는 10개의 원자에 의해 완료되는 경우에 우측 헬릭스 구조에 배열된다. 각각의 아미노산은 헬릭스 내 120° 턴 (즉, 헬릭스는 턴당 3개의 잔기를 가짐), 및 헬릭스 축을 따른 2.0 Å (= 0.2 nm)의 전위에 상응하고, 수소 결합을 만듦으로써 형성된 고리에 10개 원자를 갖는다. 가장 중요하게는, 아미노산의 N-H 기는 앞선 아미노산 3개의 잔기의 C = O 기와의 수소 결합을 형성하며; 이러한 반복된 i + 3 → i 수소 결합은 310 헬릭스를 정의한다. 310 헬릭스는 통상의 기술자에게 친숙한 구조 생물학에서의 표준 개념이다.
이러한 310 헬릭스는 실제 헬릭스를 형성하는 4개의 잔기 및 이들 4개의 잔기의 각각의 단부에 하나씩 있는 2개의 캡 (또는 이행) 잔기에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스"는 그러한 6개의 잔기로 이루어진다.
구조적 분석 및 서열 정렬을 수행하는 것을 통해, 본 발명자들은 파상풍 및 보툴리눔 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스를 확인하였다. 이러한 310 헬릭스는 그의 N-말단에서 (즉, LHN 도메인의 C-말단 부분에서) α-헬릭스에 의해 및 그의 C-말단에서 (즉, HC 도메인의 N-말단 부분에서) β-가닥에 의해 둘러싸인다. 310 헬릭스의 제1 (N-말단) 잔기 (캡 또는 이행 잔기)는 또한 이러한 α-헬릭스의 C-말단 잔기에 상응한다.
LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스는 예를 들어 보툴리눔 신경독소의 공개적으로 이용가능한 결정 구조, 예를 들어 각각 보툴리눔 신경독소 A1 및 B1에 대한 3BTA (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA) 및 1EPW (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW)로부터 결정될 수 있다.
공개적으로 이용가능한 인 실리코 모델링 및 정렬 도구, 예를 들어 상동성 모델링 서버 LOOPP (Learning, Observing and Outputting Protein Patterns, http://loopp.org), PHYRE (Protein Homology/analogY Recognition Engine, http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) 및 로제타(Rosetta) (https://www.rosettacommons.org/), 단백질 중첩 서버 슈퍼포즈(SuperPose) (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/), 정렬 프로그램 클러스탈 오메가(Clustal Omega) (http://www.clustal.org/omega/), 및 분자 및 세포 생물학자를 위한 인터넷 자원에서 열거된 다수의 다른 도구/서비스 (http://molbiol-tools.ca/)를 또한 사용하여 다른 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 위치를 결정할 수 있다. 본 발명자들은 "HN/HCN" 접합부 주위의 영역이 상이한 혈청형을 중첩하기 위한 이상적인 영역을 제공하는 구조적으로 고도로 보존된다는 것을 특히 발견하였다.
예를 들어, 본 발명자들은 하기 방법론을 사용하여 다른 신경독소 내 이러한 310 헬릭스의 서열을 결정하였다:
1. 구조적 상동성 모델링 도구 LOOPP (http://loopp.org)를 사용하여 BoNT/A1 결정 구조를 기반으로 한 모든 BoNT 혈청형 및 TeNT의 예측된 구조 (3BTA.pdb)를 수득하였다;
2. 이에 따라 수득된 구조적 (pdb) 파일을 단지 HCN 도메인의 N-말단 단부 및 그 앞의 약 80개 잔기 (이는 HN 도메인의 부분임)만을 포함하여, 그에 의해 구조적으로 고도로 보존된 "HN/HCN" 영역을 보유하도록 편집하였다;
3. 단백질 중첩 서버 슈퍼포즈 (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)를 사용하여 3BTA.pdb 구조 상에 각각의 혈청형을 중첩시켰다;
4. 중첩된 pdb 파일을 검사하여 BoNT/A1의 HC 도메인의 개시부에 310 헬릭스를 위치시키고, 이어서 다른 혈청 내 상응하는 잔기를 확인하였다.
5. 상응하는 잔기가 정확하였는지 체크하기 위해 모든 BoNT 혈청형 서열을 클러스탈 오메가로 정렬시켰다.
이러한 방법에 의해 결정된 LHN, HC 및 310 헬릭스 도메인의 예는 표 2에 제시된다.
표 2 - LHN, HC 및 310 헬릭스 도메인
Figure pct00002
Figure pct00003
구조적 분석 및 서열 정렬을 사용하여, 본 발명자들은 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스에 따른 β-가닥이 모든 보툴리눔 및 파상풍 신경독소에서의 보존된 구조이고, LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 제1 잔기로부터 출발할 때 제8 잔기에서 (예를 들어, BoNT/A1의 경우에 잔기 879에서) 출발한다는 것을 발견하였다.
대안적인 정의에 따르면, 본 발명의 제1 측면은 제2 신경독소로부터의 HC 도메인에 공유 연결된 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인을 포함하는 키메라 신경독소를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 신경독소는 상이하고,
ㆍ 여기서 LHN 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 제1 신경독소 내 HC 도메인의 개시부 (N-말단)에 위치된 β-가닥에 대해 N-말단으로 제8 잔기에 상응하고,
ㆍ 여기서 HC 도메인의 N-말단 아미노산 잔기는 제2 신경독소 내 HC 도메인의 개시부 (N-말단)에 위치된 β-가닥에 대해 N-말단으로 제7 아미노산 잔기에 상응한다.
또 다른 정의에 따르면, 본 발명의 제1 측면은 제2 신경독소로부터의 HC 도메인에 공유 연결된 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인을 포함하는 키메라 신경독소를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 신경독소는 상이하고,
ㆍ 여기서 LHN 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 제1 신경독소 내 LHN 도메인의 단부 (C-말단)에 위치된 α-헬릭스의 C-말단 아미노산 잔기에 상응하고,
ㆍ 여기서 HC 도메인의 N-말단 아미노산 잔기는 제2 신경독소 내 LHN 도메인의 단부 (C-말단)에 위치된 α-헬릭스의 C-말단 아미노산 잔기에 대해 바로 C-말단인 아미노산 잔기에 상응한다.
본 발명에 따른 키메라 신경독소의 디자인 프로세스의 근거는 2차 구조가 손상되지 않았고 그에 의해 3차 구조 및 각각의 도메인의 기능에 대한 임의의 변화를 최소화하는 것을 보장하려고 하는 것이었다.
일부 선행 기술 키메라 신경독소에서, 링커는 아마도 허용가능한 발현 및 정제를 보장하기 위해, LHN 및 HC 도메인 사이에 요구된다 (표 1 참조).
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 키메라 신경독소를 천연 신경독소의 3차 구조를 밀접하게 모방하는 3차 구조를 갖는 단백질의 형태로 구조화하는 것은 그의 가용성을 용이하게 할 것으로 가설화된다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 키메라 신경독소 내 310 헬릭스의 4개의 중심 아미노산 잔기를 파괴하지 않는다는 사실은 키메라 신경독소에 대한 최적의 입체형태를 보증하며, 그에 의해 키메라 신경독소가 그의 기능을 그들의 전체 용량에 대해 발휘하는 것을 가능하게 한다는 것으로 추가로 가설화된다.
실제로, 본 발명자들은 놀랍게도 제1 신경독소의 310 헬릭스의 제1 아미노산 잔기 및 제2 신경독소의 310 헬릭스 이후의 제2 아미노산 잔기를 단독으로 보유하는 것이 가용성 및 기능적 키메라 신경독소의 생산을 가능하게 할 뿐만 아니라, 다른 키메라 신경독소에 비해 개선된 특성, 특히 증가된 효력, 증가된 안전성 비 및/또는 더 긴 작용 지속기간으로 이어진다는 것을 발견하였다.
신경독소의 목적되지 않은 효과 (투여 부위로부터 떨어져 신경독소의 확산에 의해 야기됨)는 관련 동물 모델 (예를 들어, 체중 손실이 투여 7일 이내에 검출된 마우스)에서 백분율 체중 손실을 측정함으로써 실험적으로 평가될 수 있다. 반대로, 신경독소의 목적되는 온-타켓 효과는 근육 마비의 측정인 발가락 외전 점수 (Digital Abduction Score: DAS) 검정에 의해 실험적으로 평가될 수 있다. DAS 검정은 젤라틴 인산염 완충제 중에 제제화된 신경독소 20 μL의 마우스 비복근/가자미근 복합체 내로의 주사, 이어서 아오키(Aoki)의 방법 (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001)을 사용한 발가락 외전 점수의 평가에 의해 수행될 수 있다. DAS 검정에서, 마우스는, 그의 뒷다리를 연장하고 그의 뒷발가락을 외전시키는 특징적인 놀람 반응을 도출하기 위해 꼬리로 잠시 매달린다. 신경독소 주사 후, 발가락 외전의 변화 정도는 5-포인트 스케일로 점수화된다 (0=정상 내지 4=발가락 외전 및 하지 연장에서의 최대 감소).
이어서 신경독소의 안전성 비는 마우스의 체중에서의 10% 감소를 위해 요구되는 신경독소의 양 (마우스에서 투약 후 처음 7일 이내의 피크 효과에서 측정됨) 및 2의 DAS 점수를 위해 요구되는 신경독소의 양 사이의 비로서 표현될 수 있다. 따라서 높은 안전성 비 점수가 목적되고, 이는 목적되지 않은 오프-타켓 효과를 거의 갖지 않으면서 표적 근육을 효과적으로 마비시킬 수 있는 신경독소를 나타낸다.
높은 안전성 비는 치료 지수에서의 증가를 나타내기 때문에 요법에서 특히 유리하다. 다시 말해서, 이는 알려진 클로스트리디움 독소 치료제와 비교하여 감소된 투여량이 사용될 수 있고/거나 증가된 투여량이 어떠한 추가적인 효과 없이 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 추가적인 효과 없이 신경독소의 더 높은 용량을 사용할 가능성은 더 높은 용량이 통상적으로 신경독소의 더 긴 작용 지속기간으로 이어지므로 특히 유리하다.
신경독소의 효력은 마우스 비복근/가자미근 복합체에 투여되었을 때 주어진 DAS 점수, 예를 들어 2의 DAS 점수 (ED50 용량) 또는 4의 DAS 점수로 이어지는 신경독소의 최소 용량으로서 표현될 수 있다. 신경독소의 효력은 또한 신경독소에 의한 SNARE 절단을 측정하는 세포 검정에서의 EC50 용량, 예를 들어 키메라 BoNT/AB 신경독소에 의한 SNAP-25 절단을 측정하는 세포 검정에서의 EC50 용량으로서 표현될 수 있다.
신경독소의 작용 지속기간은 마우스 비복근/가자미근 복합체에의, 신경독소의 주어진 용량, 예를 들어, 4의 DAS 점수로 이어지는 신경독소의 최소 용량의 투여 후 0의 DAS 점수를 회수하기 위해 요구되는 시간으로서 표현될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 신경독소는 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 혈청형 A, 혈청형 B, 혈청형 C, 혈청형 D, 혈청형 E, 혈청형 F 또는 혈청형 G 또는 파상풍 신경독소 (TeNT)이고, 제2 신경독소는 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 혈청형 A, 혈청형 B, 혈청형 C, 혈청형 D, 혈청형 E, 혈청형 F 또는 혈청형 G 또는 파상풍 신경독소 (TeNT)이다. 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소는 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 혈청형 A, 혈청형 B 또는 혈청형 C이고, 제2 신경독소는 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 혈청형 A, 혈청형 B 또는 혈청형 C이다.
상이한 BoNT 혈청형은 아미노산 수준에서의 백분율 서열 동일성과 상관관계가 있는 혈청형에 의한 이러한 분류와 함께, 특이적 중화 항-혈청에 의한 불활성화를 기반으로 구별될 수 있다. 주어진 혈청형의 BoNT 단백질은 아미노산 백분율 서열 동일성에 기초하여 상이한 하위유형으로 추가로 나누어진다.
바람직하게는, 제1 및 제2 신경독소는 상이한 혈청형으로부터의 보툴리눔 신경독소이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소 중 어느 하나는 보툴리눔 신경독소이고 다른 신경독소는 파상풍 신경독소이다.
X는 LHN 도메인이고 Y는 HC 도메인인 것에 따른 "XY" 표현을 사용하면, 하기 키메라 신경독소가 본 발명의 실시양태이다:
AB, AC, AD, AE, AF, AG, ATx,
BA, BC, BD, BE, BF, BG, BTx,
CA, CB, CD, CE, CF, CG, CTx,
DA, DB, DC, DE, DF, DG, DTx,
EA, EB, EC, ED, EF, EG, ETx,
FA, FB, FC, FD, FE, FG, FTx,
GA, GB, GC, GD, GE, GF, FTx,
TxA, TxB, TxC, TxD, TxE, TxF, TxG,
여기서 A, B, C, D, E, F, G 및 Tx는 각각 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 혈청형 A, 혈청형 B, 혈청형 C, 혈청형 D, 혈청형 E, 혈청형 F, 혈청형 G 및 파상풍 신경독소 (TeNT)이다.
하지만, 상기 기재된 바와 동일한 "XY" 표현을 사용하면, 하기 키메라 신경독소가 본 발명의 바람직한 실시양태이다:
AB, AC,
BA, BC,
CA, CB,
여기서 A, B, C는 각각 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 혈청형 A, 혈청형 B, 및 혈청형 C이다.
한 실시양태에서, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은
- 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 872, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 1 내지 859, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 3의 아미노산 잔기 1 내지 867, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 4의 아미노산 잔기 1 내지 863, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 5의 아미노산 잔기 1 내지 846, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 6의 아미노산 잔기 1 내지 865, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 7의 아미노산 잔기 1 내지 864, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열 G, 또는
- 서열식별번호: 8의 아미노산 잔기 1 내지 880, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열
에 상응하고;
제2 신경독소로부터의 HC 도메인은
- 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 873 내지 1296, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 860 내지 1291, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 3의 아미노산 잔기 868 내지 1291, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 4의 아미노산 잔기 864 내지 1276, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 5의 아미노산 잔기 847 내지 1251, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 6의 아미노산 잔기 866 내지 1275, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열,
- 서열식별번호: 7의 아미노산 잔기 865 내지 1297, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열, 또는
- 서열식별번호: 8의 아미노산 잔기 881 내지 1315, 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열
에 상응한다.
2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "퍼센트 서열 동일성"은 정렬된 서열에 의해 공유된 동일한 위치에서의 동일한 뉴클레오티드 / 아미노산의 수의 함수이다. 따라서, % 동일성은 정렬 시 각각의 위치에서의 동일한 뉴클레오티드 / 아미노산의 수를 정렬된 서열에서의 뉴클레오티드 / 아미노산의 총 수로 나누고, 100을 곱하여 계산될 수 있다. % 서열 동일성의 계산은 또한 갭의 수, 및 2개 이상의 서열의 정렬을 최적화하도록 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이를 고려할 수 있다. 2개 이상의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 특정한 수학적 알고리즘, 특히 전체 정렬 수학적 알고리즘 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48(3), 443-453, 1972) 예컨대 BLAST를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 통상의 기술자에게 친숙할 것이다.
제1 또는 제2 신경독소는 모자이크 신경독소일 수 있다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "모자이크 신경독소"는 또 다른 유형의 클로스트리디움 신경독소 (예를 들어 상이한 혈청형의 클로스트리디움 신경독소)로부터의 적어도 1개의 기능적 도메인을 포함하는 자연 발생 클로스트리디움 신경독소를 지칭하며, 상기 클로스트리디움 신경독소는 통상적으로 상기 적어도 1개의 기능적 도메인을 포함하지 않는다. 모자이크 신경독소의 예는 자연 발생 BoNT/DC 및 BoNT/CD이다. BoNT/DC는 혈청형 D의 L 쇄 및 HN 도메인 및 혈청형 C의 HC 도메인을 포함하는 반면에, BoNT/CD는 혈청형 C의 L 쇄 및 HN 도메인 및 혈청형 D의 HC 도메인으로 이루어진다.
제1 및 제2 신경독소는 하기 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 변형된 신경독소 및 그의 유도체일 수 있다. 변형된 신경독소 또는 유도체는 신경독소의 천연 (비변형된) 형태와 비교하여 변형되어 있는 1개 이상의 아미노산을 함유할 수 있거나, 또는 독소의 천연 (비변형된) 형태에 존재하지 않는 1개 이상의 삽입된 아미노산을 함유할 수 있다. 예로서, 변형된 클로스트리디움 신경독소는 천연 (비변형된) 클로스트리디움 신경독소 서열에 대비하여 1개 이상의 도메인에서의 변형된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 변형은 신경독소의 기능적 측면, 예를 들어 생물학적 활성 또는 지속성을 변형시킬 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 제1 신경독소 및/또는 제2 신경독소는 변형된 신경독소, 또는 변형된 신경독소 유도체이다.
변형된 신경독소는 표적 세포 상에서 저 또는 고 친화도 신경독소 수용체에 결합하는 능력, 신경독소의 엔도펩티다제 부분 (경쇄)을 세포 세포질 내로 전위시키는 능력 및 SNARE 단백질을 절단하는 능력으로부터 선택된, 신경독소의 기능 중 적어도 1종을 보유한다. 바람직하게는, 변형된 신경독소는 이들 기능 중 적어도 2종을 보유한다. 보다 바람직하게는 변형된 신경독소는 이들 3종의 기능을 보유한다.
변형된 신경독소는 중쇄의 아미노산 서열에서의 1개 이상의 변형 (예컨대 변형된 HC 도메인)을 가질 수 있으며, 여기서 상기 변형된 중쇄는 천연 (비변형된) 신경독소보다 더 높거나 또는 더 낮은 친화도를 갖는 표적 신경 세포에 결합한다. HC 도메인에서의 이러한 변형은 표적 신경 세포의 강글리오시드 수용체 및/또는 단백질 수용체에 대한 결합을 변경시키는 HC 도메인의 강글리오시드 결합 부위 내 잔기 또는 단백질 (SV2 또는 시냅토타그민) 결합 부위 내 잔기를 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변형된 신경독소의 예는 WO 2006/027207 및 WO 2006/114308에 기재되어 있으며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
변형된 신경독소는 경쇄의 아미노산 서열에서의 1개 이상의 변형, 예를 들어 변형된 LC의 SNARE 단백질 특이성을 변경시키거나 또는 변형시킬 수 있는 기질 결합 또는 촉매 도메인에서의 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형된 신경독소의 예는 WO 2010/120766 및 US 2011/0318385에 기재되어 있으며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
변형된 신경독소는 변형된 신경독소의 생물학적 활성 및/또는 생물학적 지속성을 증가시키거나 또는 감소시키는 1개 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 신경독소는 류신- 또는 티로신-기반 모티프를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 모티프는 변형된 신경독소의 생물학적 활성 및/또는 생물학적 지속성을 증가시키거나 또는 감소시킨다. 적합한 류신-기반 모티프는 xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL, 및 xExxxLM (여기서 x는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 적합한 티로신-기반 모티프는 Y-x-x-Hy (여기서 Hy는 소수성 아미노산임)를 포함한다. 류신- 및 티로신-기반 모티프를 포함하는 변형된 신경독소의 예는 WO 2002/08268에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변형된 BoNT/A이다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변형된 BoNT/B이다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소는 서열식별번호: 3에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변형된 BoNT/C이다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소는 서열식별번호: 4에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변형된 BoNT/D이다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소는 서열식별번호: 5에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변형된 BoNT/E이다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소는 서열식별번호: 6에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변형된 BoNT/F이다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소는 서열식별번호: 7에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변형된 BoNT/G이다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 신경독소는 서열식별번호: 8에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변형된 TeNT이다.
한 실시양태에서, 제2 신경독소는 BoNT/B이다. 이러한 키메라 신경독소는 "BoNT/XB 신경독소"로서 본원에 지칭된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소는 BoNT/A이고 제2 신경독소는 BoNT/B이다. 이러한 키메라 신경독소는 "BoNT/AB 신경독소"로서 본원에 지칭된다. 보다 바람직하게는, 제1 신경독소는 BoNT/A1이고 제2 신경독소는 BoNT/B1이다. 보다 더 바람직하게는, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 BoNT/A1의 아미노산 잔기 1 내지 872에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 BoNT/B1의 아미노산 잔기 860 내지 1291에 상응한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 872에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 860 내지 1291에 상응한다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 바람직한 키메라 신경독소는 아미노산 서열 서열식별번호: 13을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
BoNT/A 혈청형과 비교하여, 천연 BoNT/B는 시냅스 소포 상에서 그의 수용체의 비교적 더 큰 존재비에도 불구하고 훨씬 덜 강력하다. 이는 설치류 (래트/마우스) Syt II와 비교하여 인간 시냅토태그민 II (Syt II)에서의 독소 결합 부위 내의 고유한 아미노산 변화로 인한 것이다 (Peng, L., et al., J Cell Sci, 125(Pt 13):3233-42 (2012); Rummel, A. et al., FEBS J 278:4506-4515 (2011).13,22. 이러한 잔기 변화의 결과로서, 인간 Syt II는 천연 BoNT/B, 뿐만 아니라 천연 BoNT/D-C, 및 /G에 대한 결합을 크게 감소시켰다. 이들 발견은 BoNT/A (이는 상이한 수용체에 결합함)보다 BoNT/B의 훨씬 더 높은 용량이 환자에서 동일한 수준의 치료 효과를 달성하는데 필요하다는 임상 관찰에 대한 설명을 제공한다. 본 발명에 따른 BoNT/XB 또는 BoNT/AB 신경독소의 바람직한 실시양태에서, BoNT/B 신경독소로부터의 HC 도메인은 천연 BoNT/B 서열과 비교하여 인간 Syt II에 대한 BoNT/B 신경독소의 결합 친화도를 증가시키는 효과를 갖는 HCC 서브도메인에서의 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 WO2013/180799 및 아직 공개되지 않은 PCT/US2016/024211에 개시되어 있다 (둘 다 본원에 참조로 포함됨).
BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함한다.
BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 E1191M 및 S1199L, E1191M 및 S1199Y, E1191M 및 S1199F, E1191Q 및 S1199L, E1191Q 및 S1199Y, E1191Q 및 S1199F, E1191M 및 S1199W, E1191M 및 W1178Q, E1191C 및 S1199W, E1191C 및 S1199Y, E1191C 및 W1178Q, E1191Q 및 S1199W, E1191V 및 S1199W, E1191V 및 S1199Y, 또는 E1191V 및 W1178Q로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 치환 돌연변이의 조합을 추가로 포함한다.
BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 또한 E1191M, S1199W 및 W1178Q인 3개의 치환 돌연변이의 조합을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 E1191M 및 S1199Y인 2개의 치환 돌연변이의 조합을 포함한다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 바람직한 키메라 신경독소는 아미노산 서열 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소는 BoNT/C이고 제2 신경독소는 BoNT/B이다. 이러한 키메라 신경독소는 "BoNT/CB 신경독소"로서 본원에 지칭된다. 보다 바람직하게는, 제1 신경독소는 BoNT/C1이고 제2 신경독소는 BoNT/B1이다. 보다 더 바람직하게는, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 BoNT/C1의 아미노산 잔기 1 내지 867에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 BoNT/B1의 아미노산 잔기 860 내지 1291에 상응한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 서열식별번호: 3의 아미노산 잔기 1 내지 867에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 860 내지 1291에 상응한다. 바람직한 실시양태에서, BoNT/B 신경독소로부터의 Hc 도메인은 천연 BoNT/B 서열과 비교하여 인간 Syt II에 대한 BoNT/B 신경독소의 결합 친화도를 증가시키는 효과를 갖는 HCC 서브도메인에서의 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명에 따른 BoNT/XDC 신경독소 (제2 신경독소가 모자이크 BoNT/DC인 키메라 신경독소)의 바람직한 실시양태에서, 모자이크 BoNT/DC 신경독소로부터의 HC 도메인은 천연 모자이크 BoNT/DC 서열과 비교하여 인간 Syt II에 대한 모자이크 BoNT/DC 신경독소의 결합 친화도를 증가시키는 효과를 갖는 HCC 서브도메인에서의 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
본 발명에 따른 BoNT/XG 신경독소의 바람직한 실시양태에서, BoNT/G 신경독소로부터의 HC 도메인은 천연 BoNT/G 서열과 비교하여 인간 Syt II에 대한 BoNT/G 신경독소의 결합 친화도를 증가시키는 효과를 갖는 HCC 서브도메인에서의 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 신경독소는 하기와 같다.
바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소는 BoNT/A이고 제2 신경독소는 BoNT/C이다. 이러한 키메라 신경독소는 "BoNT/AC 신경독소"로서 본원에 지칭된다. 보다 바람직하게는, 제1 신경독소는 BoNT/A1이고 제2 신경독소는 BoNT/C1이다. 보다 더 바람직하게는, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 BoNT/A1의 아미노산 잔기 1 내지 872에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 BoNT/C1의 아미노산 잔기 868 내지 1291에 상응한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 872에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 3의 아미노산 잔기 868 내지 1291에 상응한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소는 BoNT/B이고 제2 신경독소는 BoNT/A이다. 이러한 키메라 신경독소는 "BoNT/BA 신경독소"로서 본원에 지칭된다. 보다 바람직하게는, 제1 신경독소는 BoNT/B1이고 제2 신경독소는 BoNT/A1이다. 보다 더 바람직하게는, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 BoNT/B1의 아미노산 잔기 1 내지 859에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 BoNT/A1의 아미노산 잔기 873 내지 1296에 상응한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 1 내지 859에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 873 내지 1293에 상응한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소는 BoNT/B이고 제2 신경독소는 BoNT/C이다. 이러한 키메라 신경독소는 "BoNT/BC 신경독소"로서 본원에 지칭된다. 보다 바람직하게는, 제1 신경독소는 BoNT/B1이고 제2 신경독소는 BoNT/C1이다. 보다 더 바람직하게는, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 BoNT/B1의 아미노산 잔기 1 내지 859에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 BoNT/C1의 아미노산 잔기 868 내지 1291에 상응한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 1 내지 859에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 3의 아미노산 잔기 868 내지 1291에 상응한다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 바람직한 키메라 신경독소는 아미노산 서열 서열식별번호: 56을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소는 BoNT/C이고 제2 신경독소는 BoNT/A이다. 이러한 키메라 신경독소는 "BoNT/CA 신경독소"로서 본원에 지칭된다. 보다 바람직하게는, 제1 신경독소는 BoNT/C1이고 제2 신경독소는 BoNT/A1이다. 보다 더 바람직하게는, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 BoNT/C1의 아미노산 잔기 1 내지 867에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 BoNT/A1의 아미노산 잔기 873 내지 1296에 상응한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인은 서열식별번호: 3의 아미노산 잔기 1 내지 867에 상응하고 제2 신경독소로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 873 내지 1296에 상응한다.
본 발명의 키메라 신경독소는 재조합 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 키메라 신경독소는 재조합 키메라 신경독소이다. 이러한 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 재조합 키메라 신경독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 세포는, 하기 추가로 기재된 바와 같이, 필요한 변경을 가하여 재조합인 것으로서 지칭될 수 있는 것으로 용이하게 이해될 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 신경독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 DNA 또는 RNA 서열을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열이다.
본 발명의 핵산 분자는 관련 기술분야에 알려진 임의의 적합한 프로세스를 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 핵산 분자는 화학적 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 핵산 분자는 분자 생물학 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 DNA 서열은 바람직하게는 인 실리코 디자인되고, 이어서 통상적인 DNA 합성 기술에 의해 합성된다.
상기 언급된 핵산 서열 정보는 이용되어야 할 궁극적인 숙주 세포 (예를 들어 이. 콜라이(E. coli)) 발현 시스템에 따른 코돈-바이어싱을 위해 임의적으로 변형된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 DNA 벡터의 부분이다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 Tac, AraBAD, T7-Lac, 또는 T5-Lac로부터 선택된 프로모터를 갖는다.
벡터는 상기 언급된 핵산 서열의 시험관내 및/또는 생체내 발현에 적합할 수 있다. 벡터는 일시적 및/또는 안정한 유전자 발현을 위한 벡터일 수 있다. 벡터는 추가적으로 조절 요소 및/또는 선택 마커를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 기원의, 파지 기원의, 또는 박테리아 기원의 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 pET, pJ401, pGEX 벡터 또는 그의 유도체일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 용어 "세포"는 용어 "숙주 세포" 또는 "세포주"와 상호교환가능하게 본원에 사용될 수 있다. 적합한 세포 유형은 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이, 및 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포 등을 포함한다. 바람직하게는, 세포는 이. 콜라이이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 신경독소를 생산하는 방법이며, 상기 기재된 바와 같은 세포를 상기 키메라 신경독소가 생산되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 조건은 숙련된 진료의에게 널리 알려져 있고 따라서 본원에 추가로 상술될 필요가 없다. 바람직하게는, 상기 방법은 배양물로부터 키메라 신경독소를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 신경독소를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체, 부형제, 아주반트, 추진제 및/또는 염으로부터 선택된 적어도 1종의 구성성분과 함께 키메라 신경독소를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 키메라 신경독소 또는 제약 조성물을 제공한다. 보다 정확히, 본 발명은 의약을 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 신경독소 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다. 다시 말해서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 키메라 신경독소 또는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. "유효량"이란, 키메라 신경독소 또는 제약 조성물은 그것이 지시되는 효과를 제공하기에 충분한 양으로 투여된다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 바람직하게는 인간 또는 동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭한다.
본 발명에 따른 키메라 신경독소는 바람직하게는 치료를 필요로 하는 대상체에서 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 병태, 예를 들어 연축성 발성장애, 연축성 사경, 후두 이상긴장증, 구강하악 발성장애, 설측 이상긴장증, 경부 이상긴장증, 초점성 수부 이상긴장증, 안검연축, 사시, 편측안면 연축, 안검 장애, 뇌성 마비, 초점성 경직 및 다른 음성 장애, 연축성 결장염, 신경원성 방광, 항문연축증, 사지 경직, 틱, 진전, 이갈기, 치열, 무이완증, 연하곤란 및 다른 근긴장도 장애 및 근육군의 불수의 운동을 특징으로 하는 다른 장애, 누루, 다한증, 과도한 타액분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 연축으로부터의 통증, 두통 통증, 편두통 및 피부과적 병태로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 치료하는데 사용하기에 적합하다. 보다 정확히, 본 발명은, 상기 기재된 바와 같이, 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 병태를 치료하도록 의도된 의약을 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 신경독소 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다. 다시 말해서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에서, 상기 기재된 바와 같이, 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 병태를 치료하는 방법이며, 상기 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 키메라 신경독소 또는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에서, 미적 또는 미용적 병태를 치료하기 위한 본 발명에 따른 키메라 신경독소의 비-요법적 용도를 제공한다. 다시 말해서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 신경독소 또는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 미적 또는 미용적 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 치료될 대상체는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 병태를 앓고 있지 않다. 보다 바람직하게는, 상기 대상체는 건강한 대상체, 즉 임의의 질환을 앓고 있지 않은 대상체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 기재된 바와 같이, 요법적 또는 비-요법적 (미용적 또는 미적) 방법에 사용하기 위한, 또는 요법적 또는 비-요법적 (미용적 또는 미적) 용도를 위한 키트이며, 본 발명의 제약 조성물 및 상기 방법 또는 용도를 수행하는 것에 대한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 보다 정확히, 본 발명은 제약 조성물을 필요로 하는 대상체에게의 본 발명의 제약 조성물 및 상기 조성물의 요법적 또는 미용적 투여에 대한 지침서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "지침서"는 본 발명의 방법 또는 용도, 예컨대 상기 조성물을 필요로 하는 대상체에게 상기 조성물의 요법적 또는 미용적 투여를 어떻게 수행하는지 소통하기 위해 사용될 수 있는 표현의 공개, 기록, 다이어그램, 또는 임의의 다른 매체를 지칭한다. 상기 지침서는, 예를 들어, 상기 조성물 또는 상기 키트를 포함하는 용기에 부착되어 있을 수 있다.
본 발명의 조작된 키메라 신경독소는 경구, 비경구, 연속 주입, 흡입 또는 국소 적용을 위해 제제화될 수 있다. 주사에 적합한 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 전에 적합한 비히클에 용해 또는 현탁되는 건조 분말의 형태일 수 있다.
국부로 전달되어야 하는 키메라 신경독소의 경우에, 키메라 신경독소는 크림 (예를 들어 국소 적용을 위함)으로서, 또는 피하 주사를 위해 제제화될 수 있다.
국부 전달 수단은 에어로졸, 또는 다른 스프레이 (예를 들어 네뷸라이저)를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 키메라 신경독소의 에어로졸 제제는 폐 및/또는 다른 코 및/또는 기관지 또는 기도 통로로의 전달을 가능하게 한다.
본 발명의 키메라 신경독소는 이환된 기관의 신경지배에 수반된 척수 분절의 수준에서 척주에의 척수강내 또는 경막외 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
바람직한 투여 경로는 복강경 및/또는 국부화된, 특히 근육내 주사를 통해서이다.
본 발명의 키메라 신경독소의 투여를 위한 투여량 범위는 목적되는 치료 효과를 생산하기 위한 것들이다. 요구되는 투여량 범위가 키메라 신경독소 또는 조성물의 정확한 성질, 투여 경로, 제제의 성질, 환자의 연령, 환자 병태의 성질, 정도 또는 중증도, 존재할 경우, 금기, 및 주치의의 판단에 따른다는 것이 이해될 것이다. 이들 투여량 수준에서의 변경은 최적화를 위한 표준 경험적 루틴을 사용하여 조정될 수 있다.
유체 투여 형태는 전형적으로 키메라 신경독소 및 발열원 무함유 멸균 비히클을 활용하여 제조된다. 조작된 클로스트리디움 독소는, 사용된 비히클 및 농도에 따라, 비히클에 용해 또는 현탁될 수 있다. 키메라 신경독소가 비히클에 용해될 수 있는 용액을 제조하는데 있어서, 용액은 필요한 경우에 염화나트륨의 첨가에 의해 등장성인 것으로 제조되고 적합한 멸균 바이알 또는 앰플 내로 충전하고 밀봉하기 전에 무균 기술을 사용한 멸균 필터를 통한 여과에 의해 멸균된다. 대안적으로, 용액 안정성이 충분한 경우에, 그의 밀봉된 용기 내의 용액은 오토클레이빙에 의해 멸균될 수 있다. 유리하게는 첨가제 예컨대 완충제, 가용화제, 안정화제, 보존제 또는 살박테리아제, 현탁화제 또는 유화제 및 또는 국소 마취제가 비히클에 용해될 수 있다.
사용 전에 적합한 비히클에 용해 또는 현탁되는 건조 분말은 예비-멸균된 성분을 멸균 분야의 무균 기술을 사용하여 멸균 용기 내로 충전함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 성분은 멸균 분야의 무균 기술을 사용하여 적합한 용기 내로 용해될 수 있다. 이어서 생성물은 동결 건조되고, 용기는 무균적으로 밀봉된다.
근육내, 피하 또는 피내 주사에 적합한 비경구 현탁액은, 멸균 구성성분이 용해되는 대신에 멸균 비히클에 현탁되고 멸균이 여과에 의해 달성될 수 없다는 것을 제외하고는, 실질적으로 동일한 방식으로 제조된다. 구성성분은 멸균 상태로 단리될 수 있거나 또는 대안적으로는 이는 단리 후, 예를 들어 감마 조사에 의해 멸균될 수 있다.
본 발명에 따른 투여는 마이크로입자 캡슐화, 바이러스 전달 시스템 또는 고압 에어로졸 충돌을 포함한 다양한 전달 기술의 이점을 취할 수 있다.
본 개시내용은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지 않고, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질은 본 개시내용의 실시양태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 각각, 임의의 핵산 서열은 5'에서 3' 배향으로 좌측에서 우측으로 기입되고; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 기입된다.
값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한치와 하한치 사이에서 하한치의 단위의 1/10까지의 각각의 중간 값이 또한 구체적으로 개시된다는 것이 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 언급된 값 또는 중간 값 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 개시내용 내에 포괄된다. 이들 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 범위 내에 포함되거나 또는 배제될 수 있고, 더 작은 범위 내에 한계 중 어느 하나, 둘 다가 아니거나 또는 둘 다의 한계치가 더 작은 범위에 포함되어 있는 각각의 범위는 또한 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계치를 적용하는 본 개시내용 내에 포괄된다. 언급된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 한계치가 포함된 것들 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "클로스트리디움 신경독소"에 대한 지칭은 복수의 이러한 후보 작용제를 포함하고 "클로스트리디움 신경독소"에 대한 지칭은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 1종 이상의 클로스트리디움 신경독소 및 그의 등가물 등에 대한 지칭을 포함한다.
본 발명은 이제 단지 예로서 하기 도면 및 실시예를 참조하여 기재될 것이다.
도면의 설명
도 1 - 클러스탈 오메가 (1.2.1) 다중 서열 정렬 도구를 사용한 BoNT/A1-8, /B1-8, /C, /D, /E1-12, /F1-7, /G, /"H", 및 TeNT의 서열 정렬. LHN 및 HC 도메인을 분리하는 추정 310 헬릭스의 위치는 볼드체 및 밑줄표시된 글자이다.
도 2 - 정제된 재조합 BoNT/AB 키메라 1, 2 및 3A (각각 서열식별번호: 9, 10 및 11)의 SDS PAGE. 레인은 "마커" (분자량 마커), "-DTT" (산화된 BoNT/AB 키메라 샘플), 및 "+DTT" (감소된 BoNT/AB 키메라 샘플)로 라벨링된다.
도 3 - 재조합 BoNT/AB 키메라 1, 2 및 3A (각각 서열식별번호: 9, 10 및 11)에 의한 래트 척수 뉴런에서의 SNAP-25의 절단. 배양된 래트 1차 척수 뉴런 (SCN)을 10% CO2를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서, 24시간 동안 다양한 농도의 재조합 BoNT/AB 키메라 1, 2 또는 3A에 노출시켰다. 이어서 세포를 DTT 및 벤조나제로 보충된 1x NuPAGE 완충제로 용해시켰다. 샘플을 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 가열 블록 상에서 90℃에서 5분 동안 가열하고, -20℃에서 저장한 후, 웨스턴 블롯에 의해 SNAP-25 절단을 분석하였다. SNAP-25를 SNAP-25 (시그마(Sigma) #S9684)의 전장 및 절단된 형태 둘 다를 검출하는 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 항-토끼 HRP (시그마 #A6154)를 2차 항체로서 사용하였다.
도 4 - 마우스 발가락 외전 점수화 검정. 마우스는 단기 전신 마취 하에, 한쪽 뒷다리의 비복근-가자미근 복합체 근육 내로 주사받았고; 근육 약화를 발가락 외전 점수 (DAS)를 사용하여 0-4 스케일에 대해 측정하였다. DAS 최대 값을 각각의 용량에 대해 결정하고 용량에 대해 플롯팅하고 데이터를 4-파라미터 로지스틱 방정식에 피팅하고, ED50 및 DAS 4로 이어지는 용량 (DAS 4 용량) 값을 결정하였다.
도 5 - 정제된 재조합 BoNT/AB 키메라 3B 및 3C (각각 서열식별번호: 12 및 13)의 SDS PAGE. 레인은 "마커" (분자량 마커), "-DTT" (산화된 BoNT/AB 키메라 샘플), 및 "+DTT" (감소된 BoNT/AB 키메라 샘플)로 라벨링된다.
도 6 - 인간 유도된 만능 줄기 세포 유래된 말초 뉴런 (PERI.4U - 악시오제네시스(Axiogenesis), 독일)에서의 재조합 BoNT/A 및 BoNT/AB 키메라 3B 및 3C (각각 서열식별번호: 1, 12 및 13)에 의한 SNAP-25의 절단. PERI.4U 세포를 5% CO2를 함유하는 가습 CO2 분위기 하에 37℃에서, 24시간 동안 다양한 농도의 재조합 BoNT/A, 또는 BoNT/AB 키메라 3B 또는 3C에 노출시켰다. 이어서 세포를 DTT 및 벤조나제로 보충된 1x NuPAGE 완충제로 용해시켰다. 샘플을 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 가열 블록 상에서 90℃에서 5분 가열하고, -20℃에서 저장한 후, 웨스턴 블롯에 의해 SNAP-25 절단을 분석하였다. SNAP-25를 SNAP-25 (시그마 #S9684)의 전장 및 절단된 형태 둘 다를 검출하는 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 항-토끼 HRP (시그마 #A6154)를 2차 항체로서 사용하였다.
도 7 - 마우스 발가락 외전 점수화 검정에서의 시간에 따른 근육 약화의 지속기간. 마우스는 단기 전신 마취 하에, 한쪽 뒷다리의 비복근-가자미근 복합체 근육 내로 주사받았고; 근육 약화를 발가락 외전 점수 (DAS)를 사용하여 0-4 스케일에 대해 측정하였다. 주사의 처음 4일 동안 4의 DAS를 유도한 최저 용량으로 주사된 군의 동물을 0의 DAS (근육 약화 관찰되지 않음)로의 근육 약화의 회복이 완료될 때까지 모니터링하였다.
도 8 - 정제된 재조합 BoNT/BC (서열식별번호: 56)의 SDS PAGE. 레인은 "마커" (분자량 마커), "-DTT" (산화된 BoNT/BC 키메라 샘플), 및 "+DTT" (감소된 BoNT/BC 키메라 샘플)로 라벨링된다.
도 9 - 래트 피질 뉴런에서의 천연 BoNT/B, BoNT/BC 키메라, 및 불활성 재조합 BoNT/B (각각 서열식별번호: 2, 56 및 57)에 의한 VAMP-2의 절단. 세포를 5% CO2를 함유하는 가습 CO2 분위기 하에 37℃에서, 24시간 동안 다양한 농도의 BoNT에 노출시켰다. 세포를 DTT 및 벤조나제로 보충된 1x NuPAGE 완충제로 용해시키고, 90℃에서 5분 동안 가열한 후, -20℃에서 저장하였다. 샘플을 폴리클로날 토끼 항-VAMP-2 (압캠(Abcam) ab3347, 1:1000) 1차 항체, 및 HRP-접합된 항-토끼 2차 항체 (시그마 #A6154)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 VAMP-2 절단에 대해 분석하였다.
도 10 - BoTest® 키트 (바이오센티넬(BioSentinel))를 사용한 천연 BoNT/B 및 BoNT/BC 키메라 (각각 서열식별번호: 2 및 56)에 의한 VAMP-2 펩티드 리포터의 절단. 다양한 농도의 BoNT를 리포터로서의 CFP-YFP FRET 쌍을 갖는 VAMP-2 펩티드와 함께 18시간 동안 30℃에서 인큐베이션하고, 비절단된:절단된 리포터 기질의 비율을 528 nm에서의 YFP 형광 강도의 손실 및 440 nm에서의 여기 후 485 nm에서의 CFP 형광의 획득으로서 측정하였다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정한 실시양태를 예시하는 역할을 하며, 청구범위에 정의된 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
실시예 1 - 클로스트리디움 신경독소 내 3 10 헬릭스의 맵핑
모든 BoNT 혈청형 및 TeNT의 아미노산 서열을 공중 데이터베이스 (예를 들어, www.uniprot.org 또는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 수득하고, 이어서 www.loopp.org를 사용하여 BoNT/A1의 알려진 결정 구조 (3BTA.pdb) 상에 모델링하였다. 이는 단지 HCN 도메인의 N-말단 부분 및 그 앞의 ~80개 잔기 (HN 도메인의 C-말단 부분)만을 보유하도록 편집된 예측된 단백질 구조를 산출하였다 - 이러한 도메인 ("HN/HCN")은 구조적으로 고도로 보존되며, 따라서, 상이한 혈청형을 중첩시키기 위한 최고의 영역을 이룬다. 이어서 각각의 편집된 구조를 http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/를 사용하여 3BTA.pdb 상에 중첩시키고, 이어서 BoNT/A1의 HC의 개시부에 뚜렷한 310 헬릭스에 상응하는 잔기 (872NIINTS876) 및 다른 혈청형 내 상응하는 잔기를 확인하였다. 이들을 클러스탈 오메가 (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 모든 BoNT 혈청형의 서열 정렬로 교차-체크하였다 (도 1).
상이한 신경독소 사이의 구조적 동등성의 이러한 영역을 확인함으로써, 하나의 신경독소의 C-말단 절반이 전체 분자의 2차 구조를 방해하지 않으면서 또 다른 신경독소의 N-말단 절반에 걸쳐 이행할 수 있는 특정한 포인트를 확인하는 것이 가능하였다. 이러한 포인트를 310 헬릭스의 개시부이도록 선택하였다.
결과는 상기에 표 2에 제시된다.
실시예 2 - BoNT/AB 키메라의 클로닝, 발현 및 정제
BoNT/AB 키메라 구축물 1, 2, 3A, 3B, 및 3C (서열식별번호: 9 내지 13)를 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 모 혈청형 분자 및 적절한 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 DNA로부터 구축하였다. 이어서 이들을 C-말단 His10-태그의 존재 또는 부재 하에 pJ401 발현 벡터 내로 클로닝하고, 과다-발현을 위해 BLR (DE3) 이. 콜라이 세포 내로 형질전환하였다. 이들 세포를 적절한 항생제로 보충된 1 L 변형된 테리픽 브로쓰 (mTB)를 함유하는 2 L 배플형 원추형 플라스크에서 37℃에서 및 225 RPM 진탕하여 성장시켰다. 일단 A600이 >0.5에 도달하면, 인큐베이터 온도를 16℃로 감소시키고, 이어서 1 mM IPTG로 유도하고 1시간 후에 20시간 동안 225 RPM 진탕하여 재조합 BoNT/AB 구축물을 발현시켰다.
수확된 세포를 초음파처리에 의해 용해시키고, 4℃에서 1시간 동안 4500 RPM으로 원심분리에 의해 정화하였다. 이어서 재조합 BoNT/AB 키메라 분자를 황산암모늄에서 추출하고, 표준 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 기술에 의해 정제하였다. 이는 포획을 위한 소수성 상호작용 수지 및 중간 정제 단계를 위한 음이온-교환 수지를 사용하는 것을 수반하였다. 이어서 부분적으로 정제된 분자를 엔도프로테이나제 Lys-C로 단백질가수분해적으로 절단하여 활성 이중-쇄를 수득하였다. 이를 제2 소수성 상호작용 수지로 추가로 정제하여 최종 BoNT/AB 키메라를 수득하였다.
데카히스타딘 태그 (H10)를 갖는 BoNT/AB 키메라 분자 (키메라 1, 2, 3A)의 경우에, 포획 단계는 소수성 상호작용 수지 대신에 고정화된 니켈 수지의 사용을 이용하였다.
각각의 키메라의 서열은 표 3에 제시된다.
표 3 - 키메라 BoNT/AB 구축물
Figure pct00004
실시예 3 - BoNT/AB 키메라 1, 2 및 3A의 비교
C-말단 His10 태그 및 E1191M/S1199Y 이중 돌연변이를 갖는 BoNT/AB 키메라 1, 2 및 3A를 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제하고 (도 2), 기능적 활성에 대해 시험하였다.
래트 척수 뉴런 SNAP-25 절단 검정
래트 척수 뉴런 (SCN)의 1차 배양물을 96 웰 조직 배양 플레이트에서 제조하고 3주 동안 성장시켰다 (문헌 [Masuyer et al., 2011, J. Struct. Biol. Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B; 및 Chaddock et al., 2002, Protein Expr. Purif. Expression and purification of catalytically active, non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A]에 기재된 바와 같음). BoNT/AB의 연속 희석물을 SCN 공급 배지에서 제조하였다. 처리될 웰로부터의 성장 배지를 수집하고 여과하였다 (0.2 μm 필터). 여과된 배지 125 μL를 각각의 시험 웰에 다시 첨가하였다. 이어서 희석된 독소 125 μL를 플레이트 (삼중 웰)에 첨가하였다. 처리된 세포를 24 ± 1시간 동안, 37℃, 10% CO2에서 인큐베이션하였다.
SNAP-25 절단 검정을 사용한 BoNT 활성의 분석
처리 후에, BoNT를 제거하고, 세포를 PBS (깁코(Gibco), 영국)에서 1회 세척하였다. 세포를 0.1 M 디티오트레이톨 (DTT) 및 250 유닛/mL 벤조나제 (시그마)로 보충된 1x NuPAGE 용해 완충제 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에 용해시켰다. 용해물 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 비절단된 SNAP-25 뿐만 아니라 BoNT/A 엔도펩티다제에 의해 절단된 SNAP-25를 인식하는 SNAP-25에 특이적인 1차 항체 (시그마 #S9684)로 프로빙하였다. 사용된 2차 항체는 HRP-접합된 항-토끼 IgG (시그마 #A6154)였다. 밴드를 증진된 화학발광에 의해 검출하고, pXi6 액세스 (시놉틱스(Synoptics), 영국)를 사용하여 영상화하였다. 밴드의 강도를 진툴스(GeneTools) 소프트웨어 (신젠(Syngene), 영국 캠브리지) 및 계산된 BoNT의 각각의 농도에서 절단된 SNAP-25의 백분율을 사용하여 결정하였다. 데이터를 4-파라미터 로지스틱 방정식 및 그래프패드 프리즘 버전 6 (그래프패드(GraphPad))을 사용하여 계산된 pEC50에 피팅하였다.
하기 표 4는 래트 SCN SNAP-25 절단 검정에서 키메라 1, 2 및 3A에 대해 결정된 pEC50 값을 제공한다. 이들 결과는 3종의 BoNT/AB 키메라가 래트 척수 뉴런에 진입하고 그의 표적 기질을 절단하는 능력을 보유하였다는 것을 제시한다. 그러나, 키메라 3A는 이러한 검정에서 키메라 1 및 2보다 더 강력하였다 (또한 도 3 참조).
표 4
Figure pct00005
발가락 외전 점수화 (DAS) 검정
DAS 검정에서 BoNT/AB 키메라 1, 2 및 3A의 활성을 측정하는 방법은, 꼬리로 잠시 매달릴 때, 마우스의 놀람 반응 발가락 펴짐 반사를 기반으로 한다. 이러한 반사는 발가락 외전 점수 (DAS)로서 점수화되고, 뒷발의 비복근-가자미근 근육 내로 BoNT의 투여 후에 억제된다. 마우스는 동물이 그의 뒷발을 연장하고 그의 뒷발가락을 외전시키는 특징적인 놀람 반응을 도출하도록 꼬리로 잠시 매달린다. (Aoki et al. 1999, Eur. J. Neurol.; 6 (suppl. 4) S3-S10).
주사 당일에, 마우스를 산소 중 이소플루란 3%를 수용하는 유도 챔버에서 마취시켰다. 각각의 마우스는 우측 뒷발의 비복근-가자미근 근육에 BoNT/AB 키메라 또는 비히클 (0.2% 젤라틴을 함유하는 포스페이트 완충제)의 근육내 주사를 제공받았다.
신경독소 주사 후에, 발가락 외전의 다양한 정도를 0 내지 4의 스케일로 점수화하였으며, 여기서 0= 정상 및 4= 발가락 외전 및 하지 연장에서의 최대 감소. ED50을 각각의 용량에서의 최대 효과의 평균을 사용하여 비선형 조정 분석에 의해 결정하였다. 사용된 수학적 모델은 4 파라미터 로지스틱 모델이었다.
DAS를 투약 후에 제1일 동안 2시간마다 수행하였으며; 그 후에 이를 4일 동안 하루에 3회 수행하였다.
도 4는 키메라 1, 2 및 3A (각각 서열식별번호: 9, 10 및 11)에 대한 피팅된 곡선을 제시한다. 키메라 3A 곡선은 좌측으로 이동하며, 이는 더 낮은 용량의 키메라 3A가 키메라 1 및 2와 비교하여 유사한 DAS 반응을 달성하였다는 것을 의미하며, 따라서 키메라 3A는 마우스 DAS 검정에서 다른 것보다 더 강력하다는 것을 제시하며; 또한 각각의 키메라에 대하여 계산된 ED50 및 DAS 4 (최고 점수)로 이어지는 용량에 대한 값을 제공하는 하기 표 (표 5)를 참조한다.
하기 표 5는 마우스 DAS 검정에서 재조합 BoNT/A1 (rBoNT/A1) 및 키메라 1, 2 및 3A에 대해 결정된 ED50 및 DAS 4 용량을 제공한다. 이들 결과는, 3종의 키메라 중에서, 키메라 3A가 근육 약화를 유도하는데 있어서 최고 생체내 효력을 갖는다는 것을 제시한다. 표 4 및 표 5에 제시된 연구는 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River laboratories)로부터 수득된 마우스에서 수행하였다.
표 5
Figure pct00006
실시예 4 - BoNT/AB 키메라 3B, 3C 및 BoNT/A1의 비교
태그부착되지 않은 BoNT/AB 키메라 3B 및 3C (서열식별번호: 12 및 13)를 각각 E1191M/S1199Y 이중 돌연변이의 존재 및 부재 하에 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제하고 (도 5), 참조로서 재조합 BoNT/A1 (서열식별번호: 1)을 사용하여 기능적 활성에 대해 시험하였다.
인간 만능 줄기 세포 SNAP-25 절단 검정
동결보존된 PERI.4U-세포를 악시오제네시스 (독일 쾰른)로부터 구입하였다. 세포의 해동 및 플레이팅을 제조업체에 의해 권장된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 세포를 함유하는 크리오바이알을 2분 동안 37℃에서 수조에서 해동시켰다. 완만한 재현탁 후에 세포를 50 mL 튜브로 옮겼다. 크리오바이알을 제조업체에 의해 공급된 Peri.4U® 해동 배지 1 mL로 세척하고, 배지를 세포 현탁액에 적가하여 50 mL 튜브로 옮긴 후, 추가의 Peri.4U® 해동 배지 2 mL를 50 mL 튜브에 적가하였다. 이어서 세포를 혈구계를 사용하여 카운팅하였다. 그후에, 추가의 Peri.4U® 해동 배지 6 mL를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포 펠릿을 실온에서 6분 동안 260 xg (예를 들어 1,100 RPM)으로 원심분리에 의해 수득하였다. 이어서 세포를 제조업체에 의해 공급된 완전 Peri.4U® 배양 배지에 재현탁하였다. 세포를 폴리-L-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 cm2당 50,000 내지 150,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 가습 CO2 분위기 하에 37℃에서 배양하고, 배지를 배양 동안 2-3일마다 완전히 교체하였다.
독소 처리를 위해, BoNT의 연속 희석물을 Peri.4U® 배양 배지에서 제조하였다. 처리될 웰로부터의 배지를 수집하고 여과하였다 (0.2 μm 필터). 여과된 배지 125 μL를 각각의 시험 웰에 다시 첨가하였다. 이어서 희석된 독소 125 μL를 플레이트 (삼중 웰)에 첨가하였다. 처리된 세포를 48 ± 1시간 동안, 37℃, 10% CO2에서 인큐베이션하였다.
SNAP-25 절단 검정을 사용한 BoNT 활성의 분석
처리 후에, BoNT를 제거하고, 세포를 PBS (깁코, 영국)에서 1회 세척하였다. 세포를 0.1 M 디티오트레이톨 (DTT) 및 250 유닛/mL 벤조나제 (시그마)로 보충된 1x NuPAGE 용해 완충제 (라이프 테크놀로지스)에 용해시켰다. 용해물 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 비절단된 SNAP-25 뿐만 아니라 BoNT/A 엔도펩티다제에 의해 절단된 SNAP-25를 인식하는 SNAP-25에 특이적인 1차 항체 (시그마 #S9684)로 프로빙하였다. 사용된 2차 항체는 HRP-접합된 항-토끼 IgG (시그마 #A6154)였다. 밴드를 증진된 화학발광에 의해 검출하고, pXi6 액세스 (시놉틱스, 영국)를 사용하여 영상화하였다. 밴드의 강도를 진툴스 소프트웨어 (신젠, 영국 캠브리지) 및 계산된 BoNT의 각각의 농도에서 절단된 SNAP-25의 백분율을 사용하여 결정하였다. 데이터를 4-파라미터 로지스틱 방정식 및 그래프패드 프리즘 버전 6 (그래프패드)을 사용하여 계산된 pEC50에 피팅하였다.
도 6은 키메라 3B 및 3C가 유도된 인간 만능 줄기 세포에서 SNAP-25를 절단하는데 있어서 rBoNT/A1보다 더 큰 효력을 나타내었지만 전자가 상당히 더 그렇다는 것을 제시한다. 이는 이들 세포에 존재하는 인간 시냅토태그민 II 단백질 수용체에 대한 키메라 3B의 친화도를 증가시키는 이중 돌연변이에 의해 설명될 수 있다 (도 6, 표 6).
표 6
Figure pct00007
발가락 외전 점수화 (DAS) 검정 - 안전성 비
DAS 검정에서 BoNT의 활성을 측정하는 방법은, 꼬리로 잠시 매달릴 때, 마우스의 놀람 반응 발가락 펴짐 반사를 기반으로 한다. 이러한 반사는 발가락 외전 점수 (DAS)로서 점수화되고, 뒷발의 비복근-가자미근 근육 내로 BoNT의 투여 후에 억제된다. 마우스는 동물이 그의 뒷다리를 연장하고 그의 뒷발가락을 외전시키는 특징적인 놀람 반응을 도출하도록 꼬리로 잠시 매달린다. (Aoki et al. 1999, Eur. J. Neurol.; 6 (suppl. 4) S3-S10)
주사 당일에, 마우스를 산소 중 이소플루란 3%를 수용하는 유도 챔버에서 마취시켰다. 각각의 마우스는 우측 뒷발의 비복근-가자미근 근육에 BoNT 또는 비히클 (0.2% 젤라틴을 함유하는 포스페이트 완충제)의 근육내 주사를 제공받았다.
신경독소 주사 후에, 발가락 외전의 다양한 정도를 0 내지 4의 스케일로 점수화하였으며, 여기서 0= 정상 및 4= 발가락 외전 및 하지 연장에서의 최대 감소. ED50을 각각의 용량에서 최대 효과의 평균을 사용하여 비선형 조정 분석에 의해 결정하였다. 사용된 수학적 모델은 4 파라미터 로지스틱 모델이었다.
DAS를 투약 후에 제1일 동안 2시간마다 수행하였으며, 그후에 이를 모든 용량에 대해 4일 동안 하루에 3회 수행하였다. 그후에 비히클 및 주사의 처음 4일 동안 4의 DAS를 유도한 최저 용량으로 주사된 군의 동물을 0의 DAS (근육 약화 관찰되지 않음)로의 근육 약화의 회복이 완료될 때까지 모니터링하였다.
안전성 비의 계산을 위해 모든 동물을 독소 주사 전날 (D0) 및 그후에 연구의 지속기간 전반에 걸쳐 매일 1회 칭량하였다. 평균 체중, 그의 표준 편차, 및 표준 오차 평균을 각각의 용량-군에 대해 매일 계산하였다. BoNT에 대한 안전성 비 (-10%ΔBW/ED50)를 수득하기 위해, 연구 동안 임의의 시간에서 용량-군의 평균 체중이 동일한 용량-군의 D0에서 평균 체중의 10% 미만이었던 용량을 연구된 BoNT에 대한 ED50으로 나누었다. 치사 용량은 해당 용량-군 내의 1종 이상의 동물이 사망한 용량으로 정의하였다.
도 7은 rBoNT/A1, 키메라 3B 및 키메라 3C (서열식별번호: 1, 12 및 13)에 대한 마우스 발가락 외전 점수화 검정에서의 시간 경과에 따른 근육 약화의 지속기간을 제시하며, 이는 키메라가 더 긴 작용 지속기간을 갖는다는 것을 제시한다.
하기 표 7은 마우스 DAS 검정에서 rBoNT/A1 및 키메라 3B 및 3C에 대해 결정된 ED50 및 DAS 4 용량을 제공한다. 표는 또한 0의 DAS (근육 약화 관찰되지 않음)로의 근육 약화의 회복이 완료될 때까지 DAS 4 용량에 대한 총 작용 지속기간을 제공한다. 게다가 표는 상기 텍스트에 정의된 바와 같은, 마우스 치사 용량 및 안전성 비 (-10%ΔBW/ED50)를 제시한다. rBoNT/A1과 비교하여, 키메라 3B 및 3C는 더 긴 작용 지속기간, 더 우수한 안전성 비, 및 더 높은 치사 용량을 갖는다. 도 7 및 표 7에 제시된 연구는 장비에 래보러토리즈(Janvier laboratories)로부터 수득된 마우스에서 수행하였다.
표 7
Figure pct00008
실시예 5 - BoNT/BC 키메라의 발현 및 정제 및 기능적 활성의 확증
BoNT/BC 키메라 4 (서열식별번호: 56)를 상이한 발현 세포주 (BL21)의 사용 및 엔도프로테이나제 Lys-C 대신에 트립신으로의 단백질분해적 절단을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같이 클로닝하고 발현시키고 정제하였다 (도 8).
표 8 - 키메라 BoNT/BC 구축물
Figure pct00009
이러한 키메라를 VAMP-2 절단 검정에서의 기능적 활성에 대해 시험하였다.
래트 피질 뉴런 VAMP-2 절단 검정
래트 피질 뉴런을 5% CO2를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서, 2% B27 보충물, 0.5 mM 글루타맥스, 1% 태아 소 혈청 (FBS) 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 125 μL 뉴로베이슬 배지에서 20000개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트를 코팅된 폴리-L-오르니틴 (PLO) 상에서 제조하고 유지하였다. 2% B27, 0.5 mM 글루타맥스를 함유하는 추가의 뉴로베이슬 배지 125 μL를 DIV 4에 첨가하였다. 세포는 배지의 절반을 3-4일마다 교체함으로써 유지하였다. DIV 11에, 1.5 μM 시토신 β-D-아라비노푸라노시드 (AraC)를 배지에 첨가하여 비-뉴런 세포의 증식을 방지하였다. DIV 19-21에서의 피질 뉴런을 37℃에서 24시간 동안 BoNT의 농도 범위 (30 fM - 3 nM)로 처리하였다.
VAMP-2 절단 검정을 사용한 BoNT 활성의 분석
세포를 간략하게 검정 배지 (100 μL 용해 완충제 (NuPage LDS 샘플 완충제, 1mM DTT 및 1:500 벤조나제)에서 용해 전에, 뉴로베이슬 w/o 페놀 레드, 2% B27, 0.5 mM 글루타맥스, 10 μM TFB-TBOA ((3S)-3-[[3-[[4-(트리플루오로메틸) 벤조일] 아미노] 페닐] 메톡시]-L-아스파르트산)에서 세척하고, 5분 동안 90℃에서 가열하였다. 15 μL 용해물을 MES 완충제과 함께 50분 동안 200 V에서 12% 비스-트리스 겔에서 실시하였다. 단백질을 저 MW 프로그램을 사용한 트랜스블롯 터보 (바이오라드(Biorad))를 통해 니트로셀룰로스 막 상에 옮겼다. 막을 PBST 중 5% 저지방 우유로 차단하고, 이어서 토끼 항-VAMP-2 (압캠 ab3347, 1:1000) 1차 항체 및 이어서 HRP-접합된 항-토끼 2차 항체 (시그마 #A6154)로 프로빙하였다. 막을 슈퍼시그널 웨스트 듀라 화학발광 기질로 현상하고, 신젠 PXi 시스템을 사용하여 가시화하였다. 밴드 밀도측정법을 진툴스 소프트웨어 (신젠)를 사용하여 분석하고, BoNT의 각각의 농도에서의 VAMP-2 백분율 절단을 대조군 웰에 대비하여 결정하였다. 데이터를 4-파라미터 로지스틱 방정식 및 프리즘 소프트웨어 (그래프패드)를 사용하여 계산된 pEC50에 피팅하였다.
도 9는 키메라 4가 래트 척수 뉴런에 결합하고, 세포질로 전위시키고, 그의 기질 VAMP-2를 특이적으로 절단할 수 있다는 것을 제시한다. 참조의 포인트로서, 이러한 키메라는 불활성 재조합 BoNT/B1 분자 (E231Q 및 H234Y에서의 이중 돌연변이를 갖고, 또한 BoNT/B1(0)으로서 본원에 지칭됨) (서열식별번호: 57)와 비교하여 명백하게 기능적이고, 거의 천연 BoNT/B1분자 (서열식별번호: 2)만큼 활성이다 (표 9). 이는 래트 세포 표면 상에 존재하는 시냅토태그민 및 다양한 강글리오시드에 대한 BoNT/B의 고친화도 결합에 의해 설명될 수 있는 반면에, 키메라 4에서의 C의 결합 도메인은 단지 강글리오시드에 대한 더 낮은 친화도를 결합하는 것으로 알려져 있다. 이는, 하기에 추가로 제시된 바와 같이, 경쇄 프로테아제 활성 검정으로부터의 데이터에 의해 지지된다.
표 9
Figure pct00010
경쇄 프로테아제 활성 검정
혈청형 B의 경쇄 활성을 제조업체의 지침서에 따라 BoTest® (바이오센티넬 A1009) 무세포 검정을 사용하여 평가하였다. 예를 들어, BoNT를 BoTest 반응 완충제 (50 mM HEPES-NaOH, 5 mM NaCl, 10 μM ZnCl2, 0.1% 트윈-20, 0.1 mg/ml BSA, pH 7.1)에 1.39 nM로 희석하고, 실온에서 30분 동안 5 mM DTT로 환원시켰다. 200 nM의 최종 농도에서의 VAMP-2 펩티드 리포터 (50 mM HEPES-NaOH, 10 mM NaCl, 15% 글리세롤 중 CFP-VAMP-2 (33-94)-YFP)를 100 μL/웰의 최종 검정 부피로 흑색 맥시소르프 플레이트 (눈크(Nunc))에서 BoNT의 농도 범위 (500 fM - 1.25 nM, 최종)로 조합하였다. 플레이트를 광으로부터 떨어져 밀봉하고 18시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 528 nm에서의 YFP FRET 형광에 대한 CFP의 손실 및 440 nm에서의 여기 후 485 nm에서의 GFP 형광의 획득을 바이오텍 시너지 HT 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 각각의 BoNT 농도에서 비절단된:절단된 리포터 기질의 형광 방출 비를 4-파라미터 로지스틱 방정식 및 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 계산된 pEC50에 피팅하였다.
경쇄 프로테아제 활성 검정은 키메라 4의 경쇄가 천연 BoNT/B1 중 하나만큼 활성이고 (도 10, 및 표 10 참조), 따라서, 상기 설명된 바와 같이, VAMP-2 절단 검정의 결과는 BoNT/B가 단지 강글리오시드에만 결합하는 키메라 4에서의 C의 결합 도메인과 비교하여, 래트 세포 표면 상에 존재하는 시냅토태그민 및 다양한 강글리오시드에 대한 더 높은 친화도를 갖는다는 사실에 의해 설명될 수 있다는 것을 확증할 수 있다.
표 10
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> IPSEN BIOPHARM LTD <120> CHIMERIC NEUROTOXINS <130> IBL 003-WO <150> GB 1607901.4 <151> 2016-05-05 <160> 91 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1296 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 545 550 555 560 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 565 570 575 Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys 580 585 590 Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu 595 600 605 Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 610 615 620 Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 625 630 635 640 Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu 645 650 655 Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 660 665 670 Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 675 680 685 Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 690 695 700 Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys 705 710 715 720 Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 725 730 735 Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn 740 745 750 Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 755 760 765 Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 770 775 780 Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 785 790 795 800 Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 805 810 815 Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 820 825 830 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 835 840 845 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg 1010 1015 1020 Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln 1025 1030 1035 Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile 1040 1045 1050 Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp 1055 1060 1065 Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu 1070 1075 1080 Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys 1085 1090 1095 Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met 1100 1105 1110 Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val 1115 1120 1125 Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val 1130 1135 1140 Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr 1145 1150 1155 Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile 1160 1165 1170 Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn 1175 1180 1185 Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu 1190 1195 1200 Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser 1205 1210 1215 Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn 1220 1225 1230 Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245 Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala 1250 1255 1260 Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu 1265 1270 1275 Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu 1280 1285 1290 Arg Pro Leu 1295 <210> 2 <211> 1291 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 2 Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn 1 5 10 15 Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg 20 25 30 Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu 35 40 45 Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly 50 55 60 Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn 65 70 75 80 Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe 85 90 95 Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile 100 105 110 Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu 115 120 125 Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn 130 135 140 Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile 145 150 155 160 Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly 165 170 175 Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln 180 185 190 Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu 195 200 205 Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro 210 215 220 Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe 245 250 255 Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe 260 265 270 Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile 275 280 285 Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn 290 295 300 Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr 305 310 315 320 Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly 325 330 335 Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu 340 345 350 Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys 355 360 365 Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys 370 375 380 Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile 385 390 395 400 Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile 405 410 415 Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr 420 425 430 Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp 435 440 445 Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser 450 455 460 Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn 465 470 475 480 Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp 485 490 495 Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr 500 505 510 Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys 515 520 525 Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln 530 535 540 Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp 545 550 555 560 Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp 565 570 575 Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly 580 585 590 Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser 595 600 605 Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile 610 615 620 Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu 625 630 635 640 Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro 645 650 655 Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile 660 665 670 Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys 675 680 685 Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp 690 695 700 Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr 705 710 715 720 Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr 725 730 735 Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp 740 745 750 Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile 755 760 765 Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met 770 775 780 Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn 785 790 795 800 Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr 805 810 815 Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu 820 825 830 Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile 835 840 845 Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile 850 855 860 Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly 865 870 875 880 Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys 885 890 895 Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr 900 905 910 Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val 915 920 925 Ser Phe Trp Ile 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Gly Asn Leu Ala Val Asn 385 390 395 400 Asn Arg Gly Gln Asn Ile Asn Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile 405 410 415 Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Ile Lys Phe Cys Lys Ser Ile 420 425 430 Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Gln Ser Pro Ser Leu Cys Ile Arg Val 435 440 445 Asn Asn Arg Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu 450 455 460 Ser Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn 465 470 475 480 Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser 485 490 495 Glu Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Arg Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln 500 505 510 Asp Asn Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Tyr Asp Val Val Asp Phe Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala 530 535 540 Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile 545 550 555 560 Asp Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ser Lys Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser 565 570 575 Glu Phe Ile Asp Thr Ile Asn Lys Pro Val Asn Ala Ala Leu Phe Ile 580 585 590 Asp Trp Ile Ser Lys Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln 595 600 605 Lys Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr 610 615 620 Val Gly Leu Ala Leu Asn Ile Val Ile Glu Ala Glu Lys Gly Asn Phe 625 630 635 640 Glu Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val 645 650 655 Pro Glu Leu Thr Ile Pro Val Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Tyr 660 665 670 Ile Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Asn Lys Ala Ile Lys Ala Ile Asn Asn 675 680 685 Ser Leu Ile Glu Arg Glu Ala Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile 690 695 700 Val Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys 705 710 715 720 Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr 725 730 735 Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Lys Asn Arg 740 745 750 Leu Glu Ser Lys Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Glu Glu Glu Leu Asn Lys 755 760 765 Lys Val Ser Leu Ala Met Lys Asn Ile Glu Arg Phe Met Thr Glu Ser 770 775 780 Ser Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Glu Val Gly Lys 785 790 795 800 Leu Lys Glu Tyr Asp Lys His Val Lys Ser Asp Leu Leu Asp Tyr Ile 805 810 815 Leu Tyr His Lys Leu Ile Leu Gly Glu Gln Thr Lys Glu Leu Ile Asp 820 825 830 Leu Val Thr Ser Thr Leu Asn Ser Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser 835 840 845 Tyr Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Phe Asn Arg Leu Tyr Lys 850 855 860 Lys Ile Lys Asp Ser Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys 865 870 875 880 Phe Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asn 885 890 895 Val Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Ser Gly 900 905 910 Arg Leu Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn 915 920 925 Ser Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys 930 935 940 His Tyr Arg Pro Met Asn Arg Asn Arg Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys 945 950 955 960 Met Gly Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg 965 970 975 Asp Cys Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Gly Asn Lys Glu 980 985 990 Lys Leu Ile Phe Arg Tyr Glu Glu Leu Ala Ser Ile Ser Asp Tyr Ile 995 1000 1005 Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Val Glu Lys Ser Ile 1025 1030 1035 Ser Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys 1040 1045 1050 Ile Val Gly Cys Asp Asp Glu Thr Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe 1055 1060 1065 Lys Val Phe Asn Thr Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu 1070 1075 1080 Tyr Ser Asn Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asp Tyr Trp Gly 1085 1090 1095 Asn Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu 1100 1105 1110 Arg Lys Asp Lys Tyr Ile Thr Arg Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile 1115 1120 1125 Asn Gln Gln Arg Gly Val Thr Gly Gly Ile Ser Val Phe Leu Asn 1130 1135 1140 Tyr Lys Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala 1145 1150 1155 Pro Ile Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp 1160 1165 1170 Leu Ala Tyr Ile Asn Val Val Asp His Gly Val Glu Tyr Arg Leu 1175 1180 1185 Tyr Ala Asp Ile Ser Ile Thr Lys Ser Glu Lys Ile Ile Lys Leu 1190 1195 1200 Ile Arg Thr Ser Asn Pro Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val 1205 1210 1215 Met Asp Ser Ile Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn 1220 1225 1230 Asp Gly Ser Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe His Ser Asp Asp Leu 1235 1240 1245 Val Ala Ser Ser Trp Tyr Tyr Asn His Ile Arg Arg Asn Thr Ser 1250 1255 1260 Ser Asn Gly Cys Phe Trp Ser Phe Ile Ser Lys Glu His Gly Trp 1265 1270 1275 Lys Glu 1280 <210> 90 <211> 1279 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 90 Met Pro Val Val Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Thr Ile Leu Tyr Met Gln Lys Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Lys 20 25 30 Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Pro Asn Val Trp Ile Met Pro Glu 35 40 45 Arg Asp Thr Ile Gly Thr Lys Pro Asp Asp Phe Gln Val Pro Asp Ser 50 55 60 Leu Lys Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr 65 70 75 80 Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe Asn 85 90 95 Arg Ile Asn Ser Asn Pro Thr Gly Lys Val Leu Leu Glu Glu Val Ser 100 105 110 Asn Ala Arg Pro Tyr Leu Gly Asp Asp Asp Thr Leu Ile Asn Glu Phe 115 120 125 Phe Pro Val Asn Val Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Phe Ser Thr Asp 130 135 140 Val Glu Ser Ser Ile Ile Ser Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro 145 150 155 160 Asp Ile Phe Lys Ala Tyr Cys Thr Pro Leu Val Arg Phe Asn Lys Ser 165 170 175 Asp Lys Leu Ile Glu Pro Ser Asn His Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile 180 185 190 Leu Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu His Ile Phe Asn Asp Ile Ser Gly 195 200 205 Gly Asp His Asn Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser 210 215 220 Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Lys 225 230 235 240 Ala Val Thr His Lys Glu Thr Ile Glu Val Lys Arg Gly Pro Leu Met 245 250 255 Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly 260 265 270 Glu Asp Leu Asn Ile Ile Pro Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn 275 280 285 Asp Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Arg Glu Val 290 295 300 Asn Thr Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe 305 310 315 320 Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Arg Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val 325 330 335 Asn Arg Asn Lys Phe Asn Gly Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr 340 345 350 Glu Ile Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr 355 360 365 Phe Ile Lys Tyr Gly Phe Val Lys Val Pro Asp Leu Leu Asp Asp Asp 370 375 380 Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn 385 390 395 400 Asn Arg Gly Gln Asn Ile Asn Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile 405 410 415 Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Ile Lys Phe Cys Lys Ser Ile 420 425 430 Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Gln Ser Pro Ser Leu Cys Ile Arg Val 435 440 445 Asn Asn Arg Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu 450 455 460 Ser Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn 465 470 475 480 Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser 485 490 495 Glu Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Arg Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln 500 505 510 Asp Asn Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Tyr Asp Val Val Asp Phe Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala 530 535 540 Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile 545 550 555 560 Asp Thr Ala Leu Leu Glu Lys Ser Lys Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser 565 570 575 Glu Phe Ile Asp Thr Ile Asn Glu Ser Val Asn Ala Ala Leu Phe Ile 580 585 590 Asp Trp Ile Asn Lys Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln 595 600 605 Lys Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr 610 615 620 Val Gly Leu Ala Leu Asn Ile Val Ile Asp Ala Glu Lys Gly Asn Phe 625 630 635 640 Gln Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val 645 650 655 Pro Glu Leu Thr Ile Pro Val Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Tyr 660 665 670 Ile Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Asn Lys Ala Ile Lys Ala Ile Asn Asn 675 680 685 Ala Leu Ile Glu Arg Glu Ala Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile 690 695 700 Val Ser Asn Trp Leu Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys 705 710 715 720 Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr 725 730 735 Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Lys Asn Arg 740 745 750 Leu Glu Ser Glu Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Glu Glu Glu Leu Asn Lys 755 760 765 Lys Val Ser Leu Ala Met Lys Asn Ile Glu Arg Phe Met Thr Glu Ser 770 775 780 Ser Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Glu Val Gly Lys 785 790 795 800 Leu Lys Lys Tyr Asp Arg His Val Lys Ser Asp Leu Leu Asp Tyr Ile 805 810 815 Leu Tyr His Lys Leu Ile Leu Gly Asp Gln Thr Lys Glu Leu Ile Asp 820 825 830 Leu Val Thr Ser Thr Leu Asn Ser Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser 835 840 845 Tyr Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Phe Asn Arg Leu Tyr Lys 850 855 860 Lys Ile Lys Asp Ser Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys 865 870 875 880 Phe Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asn 885 890 895 Val Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Ser Asp 900 905 910 Arg Leu Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn 915 920 925 Ser Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys 930 935 940 His Tyr Gly Pro Met Asn Arg Asn Arg Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys 945 950 955 960 Met Gly Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Arg Asn Ile Arg 965 970 975 Asp Cys Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Gly Asn Lys Glu 980 985 990 Lys Leu Ile Phe Arg Tyr Glu Glu Leu Ala Asn Ile Ser Asp Tyr Ile 995 1000 1005 Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Val Glu Lys Ser Ile 1025 1030 1035 Ser Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys 1040 1045 1050 Ile Val Gly Cys Asp Asp Lys Thr Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe 1055 1060 1065 Lys Val Phe Asn Thr Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu 1070 1075 1080 Tyr Ser Asn Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asp Tyr Trp Gly 1085 1090 1095 Asn Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu 1100 1105 1110 Arg Lys Asp Lys Tyr Ile Thr Arg Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile 1115 1120 1125 Asn Gln Gln Arg Gly Val Thr Glu Gly Ser Val Phe Leu Asn Tyr 1130 1135 1140 Lys Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Pro 1145 1150 1155 Ile Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu 1160 1165 1170 Ala Tyr Ile Asn Val Val Tyr His Asp Val Glu Tyr Arg Leu Tyr 1175 1180 1185 Ala Asp Ile Ser Ile Thr Lys Pro Glu Lys Ile Ile Lys Leu Ile 1190 1195 1200 Arg Thr Ser Asn Pro Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met 1205 1210 1215 Asp Ser Ile Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn 1220 1225 1230 Gly Gly Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe His Ser Asp Asn Leu Val 1235 1240 1245 Ala Ser Ser Trp Tyr Tyr Asn Asn Ile Arg Arg Asn Thr Ser Ser 1250 1255 1260 Asn Gly Cys Phe Trp Ser Phe Ile Ser Lys Glu His Gly Trp Gln 1265 1270 1275 Glu <210> 91 <211> 1274 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 91 Met Pro Val Ala Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp 1 5 10 15 Asp Thr Ile Leu Tyr Met Gln Ile Pro Tyr Glu Glu Lys Ser Lys Lys 20 25 30 Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Arg Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu 35 40 45 Arg Asn Thr Ile Gly Thr Asn Pro Ser Asp Phe Asp Pro Pro Ala Ser 50 55 60 Leu Lys Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr 65 70 75 80 Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Thr Ile Lys Leu Phe Lys 85 90 95 Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Lys Val Leu Leu Gln Glu Ile Ser 100 105 110 Tyr Ala Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Asp His Thr Pro Ile Asp Glu Phe 115 120 125 Ser Pro Val Thr Arg Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Leu Ser Thr Asn 130 135 140 Val Glu Ser Ser Met Leu Leu Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro 145 150 155 160 Asp Ile Phe Glu Ser Cys Cys Tyr Pro Val Arg Lys Leu Ile Asp Pro 165 170 175 Asp Val Val Tyr Asp Pro Ser Asn Tyr Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile 180 185 190 Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu Tyr Thr Phe Asn Asp Ile Ser Gly 195 200 205 Gly His Asn Ser Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser 210 215 220 Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Arg 225 230 235 240 Gly Val Thr Tyr Glu Glu Thr Ile Glu Val Lys Gln Ala Pro Leu Met 245 250 255 Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly 260 265 270 Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn 275 280 285 Asn Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Ser Glu Val 290 295 300 Asn Ser Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe 305 310 315 320 Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val 325 330 335 Asn Glu Asn Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr 340 345 350 Glu Ser Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr 355 360 365 Phe Ile Lys Tyr Glu Phe Leu Lys Val Pro Asn Leu Leu Asp Asp Asp 370 375 380 Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn 385 390 395 400 Asn Arg Gly Gln Ser Ile Lys Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile 405 410 415 Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Val Lys Phe Cys Lys Ser Val 420 425 430 Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Ala Pro Pro Arg Leu Cys Ile Arg Val 435 440 445 Asn Asn Ser Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu 450 455 460 Asn Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn 465 470 475 480 Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser 485 490 495 Gln Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Arg Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln 500 505 510 Asp Asn Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Tyr Asp Val Val Asp Phe Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala 530 535 540 Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile 545 550 555 560 Asp Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ser Lys Asp Ile Phe Phe Ser Ser Glu 565 570 575 Phe Ile Asp Thr Ile Asn Lys Pro Val Asn Ala Ala Leu Phe Ile Asp 580 585 590 Trp Ile Ser Lys Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln Lys 595 600 605 Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Val 610 615 620 Gly Leu Ala Leu Asn Ile Ile Ile Glu Ala Glu Lys Gly Asn Phe Glu 625 630 635 640 Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Val Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val Pro 645 650 655 Glu Leu Thr Ile Pro Val Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Tyr Ile 660 665 670 Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Asn Lys Ala Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ser 675 680 685 Leu Ile Glu Arg Glu Ala Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile Val 690 695 700 Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu 705 710 715 720 Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr Ala 725 730 735 Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Lys Asn Arg Leu 740 745 750 Glu Ser Glu Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Glu Glu Glu Leu Asn Lys Lys 755 760 765 Val Ser Leu Ala Met Lys Asn Ile Glu Arg Phe Met Thr Glu Ser Ser 770 775 780 Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Lys Val Gly Lys Leu 785 790 795 800 Lys Lys Tyr Asp Asn His Val Lys Ser Asp Leu Leu Asn Tyr Ile Leu 805 810 815 Asp His Arg Ser Ile Leu Gly Glu Gln Thr Asn Glu Leu Ser Asp Leu 820 825 830 Val Thr Ser Thr Leu Asn Ser Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser Tyr 835 840 845 Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Phe Asn Arg Leu Tyr Lys Lys 850 855 860 Ile Lys Asp Ser Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys Phe 865 870 875 880 Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asn Val 885 890 895 Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Ser Arg 900 905 910 Leu Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn Ser 915 920 925 Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys His 930 935 940 Tyr Lys Pro Met Asn His Asn Arg Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met 945 950 955 960 Gly Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Arg Thr Val Arg Asp 965 970 975 Cys Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Gly Asn Lys Glu Asn 980 985 990 Leu Ile Phe Arg Tyr Glu Glu Leu Asn Arg Ile Ser Asn Tyr Ile Asn 995 1000 1005 Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser 1010 1015 1020 Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Val Glu Lys Ser Ile Ser 1025 1030 1035 Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile 1040 1045 1050 Val Gly Cys Asp Asp Glu Thr Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe Lys 1055 1060 1065 Val Phe Asn Thr Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu Tyr 1070 1075 1080 Ser Asn Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asn Tyr Trp Gly Asn 1085 1090 1095 Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu Arg 1100 1105 1110 Lys Asp Lys Tyr Ile Thr Leu Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile Asn 1115 1120 1125 Gln Gln Arg Gly Val Thr Glu Gly Ser Val Phe Leu Asn Tyr Lys 1130 1135 1140 Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Pro Ile 1145 1150 1155 Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala 1160 1165 1170 Tyr Ile Asn Val Val Asp Arg Gly Val Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala 1175 1180 1185 Asp Thr Lys Ser Glu Lys Glu Lys Ile Ile Arg Thr Ser Asn Leu 1190 1195 1200 Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met Asp Ser Ile Gly Asn 1205 1210 1215 Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Ser Asn Ile Gly 1220 1225 1230 Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr 1235 1240 1245 Tyr Asn Asn Ile Arg Arg Asn Thr Ser Ser Asn Gly Cys Phe Trp 1250 1255 1260 Ser Ser Ile Ser Lys Glu Asn Gly Trp Lys Glu 1265 1270

Claims (23)

  1. 제2 신경독소로부터의 HC 도메인에 공유 연결된 제1 신경독소로부터의 LHN 도메인을 포함하는 키메라 신경독소이며,
    여기서 상기 제1 및 제2 신경독소는 상이하고,
    여기서 상기 LHN 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 상기 제1 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 제1 아미노산 잔기에 상응하고,
    여기서 상기 HC 도메인의 N-말단 아미노산 잔기는 상기 제2 신경독소 내 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 헬릭스의 제2 아미노산 잔기에 상응하는 것인
    키메라 신경독소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 신경독소가 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 혈청형 A, 혈청형 B, 혈청형 C, 혈청형 D, 혈청형 E, 혈청형 F 또는 혈청형 G 또는 파상풍 신경독소 (TeNT)이고, 상기 제2 신경독소가 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 혈청형 A, 혈청형 B, 혈청형 C, 혈청형 D, 혈청형 E, 혈청형 F 또는 혈청형 G 또는 파상풍 신경독소 (TeNT)인 키메라 신경독소.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 신경독소로부터의 상기 LHN 도메인이
    - BoNT/A1의 아미노산 잔기 1 내지 872,
    - BoNT/B1의 아미노산 잔기 1 내지 859,
    - BoNT/C1의 아미노산 잔기 1 내지 867,
    - BoNT/D의 아미노산 잔기 1 내지 863,
    - BoNT/E1의 아미노산 잔기 1 내지 846,
    - BoNT/F1의 아미노산 잔기 1 내지 865,
    - BoNT/G의 아미노산 잔기 1 내지 864, 또는
    - TeNT의 아미노산 잔기 1 내지 880
    에 상응하고;
    제2 신경독소로부터의 상기 HC 도메인이
    - BoNT/A1의 아미노산 잔기 873 내지 1296,
    - BoNT/B1의 아미노산 잔기 860 내지 1291,
    - BoNT/C1의 아미노산 잔기 868 내지 1291,
    - BoNT/D의 아미노산 잔기 864 내지 1276,
    - BoNT/E1의 아미노산 잔기 847 내지 1251,
    - BoNT/F1의 아미노산 잔기 866 내지 1275,
    - BoNT/G의 아미노산 잔기 865 내지 1297, 또는
    - TeNT의 아미노산 잔기 881 내지 1315
    에 상응하는 것인
    키메라 신경독소.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 신경독소가 BoNT/A이고, 상기 제2 신경독소가 BoNT/B인 키메라 신경독소.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 신경독소가 BoNT/A1이고, 상기 제2 신경독소가 BoNT/B1인 키메라 신경독소.
  6. 제5항에 있어서, 제1 신경독소로부터의 상기 LHN 도메인이 BoNT/A1의 아미노산 잔기 1 내지 872에 상응하고, 제2 신경독소로부터의 상기 HC 도메인이 BoNT/B1의 아미노산 잔기 860 내지 1291에 상응하는 것인 키메라 신경독소.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, BoNT/B 신경독소로부터의 상기 HC 도메인이 천연 BoNT/B 서열과 비교하여 인간 Syt II 수용체에 대한 BoNT/B 신경독소의 결합 친화도를 증가시키는 효과를 갖는 HCC 서브도메인에서의 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 것인 키메라 신경독소.
  8. 제7항에 있어서, HCC 서브도메인에서의 상기 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실이 V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 키메라 신경독소.
  9. 제7항에 있어서, HCC 서브도메인에서의 상기 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실이 E1191M 및 S1199L, E1191M 및 S1199Y, E1191M 및 S1199F, E1191Q 및 S1199L, E1191Q 및 S1199Y, E1191Q 및 S1199F, E1191M 및 S1199W, E1191M 및 W1178Q, E1191C 및 S1199W, E1191C 및 S1199Y, E1191C 및 W1178Q, E1191Q 및 S1199W, E1191V 및 S1199W, E1191V 및 S1199Y, 또는 E1191V 및 W1178Q로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 치환 돌연변이를 포함하는 것인 키메라 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 2개의 치환 돌연변이가 E1191M 및 S1199Y인 키메라 신경독소.
  11. 제7항에 있어서, HCC 서브도메인에서의 상기 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실이, E1191M, S1199W 및 W1178Q인 3개의 치환 돌연변이를 포함하는 것인 키메라 분자.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 신경독소가 BoNT/B이고, 상기 제2 신경독소가 BoNT/C인 키메라 신경독소.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 신경독소가 BoNT/B1이고, 상기 제2 신경독소가 BoNT/C1인 키메라 신경독소.
  14. 제13항에 있어서, 제1 신경독소로부터의 상기 LHN 도메인이 BoNT/B1의 아미노산 잔기 1 내지 859에 상응하고, 제2 신경독소로부터의 상기 HC 도메인이 BoNT/C1의 아미노산 잔기 868 내지 1291에 상응하는 것인 키메라 신경독소.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 키메라 신경독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  16. 제15항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  17. 제15항에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 제16항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 키메라 신경독소를 포함하는 제약 조성물.
  19. 제18항의 제약 조성물 및 그를 필요로 하는 대상체에게의 상기 조성물의 요법적 또는 미용적 투여에 대한 지침서를 포함하는 키트.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 키메라 신경독소를 생산하는 방법이며, 제17항의 세포를 상기 키메라 신경독소가 생산되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제14항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 키메라 신경독소 또는 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 원치 않는 뉴런 활성과 연관된 병태, 예를 들어 연축성 발성장애, 연축성 사경, 후두 이상긴장증, 구강하악 발성장애, 설측 이상긴장증, 경부 이상긴장증, 초점성 수부 이상긴장증, 안검연축, 사시, 편측안면 연축, 안검 장애, 뇌성 마비, 초점성 경직 및 다른 음성 장애, 연축성 결장염, 신경원성 방광, 항문연축증, 사지 경직, 틱, 진전, 이갈기, 치열, 무이완증, 연하곤란 및 다른 근긴장도 장애 및 근육군의 불수의 운동을 특징으로 하는 다른 장애, 누루, 다한증, 과도한 타액분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 연축으로부터의 통증, 두통 통증, 편두통 및 피부과적 병태로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 치료하는데 사용하기 위한 키메라 신경독소 또는 제약 조성물.
  23. 미적 또는 미용적 병태를 치료하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 키메라 신경독소 또는 제18항에 따른 제약 조성물의 비-요법적 용도.
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