CN101355957A

CN101355957A - 将融合多肽递送入细胞的方法

Info

Publication number: CN101355957A
Application number: CNA2006800504971A
Authority: CN
Inventors: 李尚揆; 李承揆; 崔济民
Original assignee: ForHumanTech Co Ltd
Current assignee: ForHumanTech Co Ltd
Priority date: 2005-11-04
Filing date: 2006-11-03
Publication date: 2009-01-28
Also published as: WO2007052172A3; ATE478676T1; EP1942925B1; WO2007052172A2; WO2007052172A8; EP1942925A2; US20070105775A1; DE602006016468D1; US7723299B2; KR20080084937A; EP1942925A4; JP2010509181A

Abstract

本发明涉及将融合多肽递送入细胞的方法。提供局部例如通过皮肤、眼睛和气道递送融合多肽的方法，以预防过敏性炎症，气道高反应性以及阻断T细胞活化。还提供了递送融合多肽以抑制移植物排斥的方法。

Description

将融合多肽递送入细胞的方法

发明背景

技术领域

本发明涉及将生物分子转导复合物(BTC)诸如融合多肽递送入细胞的方法。所述生物分子转导复合物(BTC)包含蛋白转导结构域(PTD)和目的分子，诸如多肽。

背景技术

通常，大分子诸如蛋白和核酸不能透过活细胞。仅仅小分子可以非常低的速率透过活细胞膜限制了开发利用大分子诸如蛋白和核酸来治疗、预防或诊断疾病的药物的研究。因此，将生物活性大分子有效转导入活细胞的细胞液和细胞核而不会造成有害的副作用的方法是非常需要的。

蛋白转导结构域(PTDs)已经被用于递送生物活性分子(Viehl C.T.，et al.，Ann.Surg.Oncol.12：517-525(2005)；Noguchi H.，et al.，Nat.Med.10：305-309(2004)；和Fu A.L.，et al.，Neurosci.Lett.368：258-62(2004))。但是没有试图利用PTD递送受体蛋白的胞质结构域。也没有试图经鼻内递送载有生物活性分子的PTD。

CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞抗原-4)是的活化诱导的T细胞表面分子，对于T细胞活化的负调控是必需的。其结合抗原呈递细胞(APC)上的B7-1或-2，其亲和力高于T细胞活化的正辅助性刺激分子CD28的亲和力10-到20-倍(Ngoc L.P.，et al.，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.5：161-166(2005)；Noel P.J.，et al.，Adv.Exp.Med.Biol.406：209-217(1996)；和Perkins D.，et al.，J.Immunol.156：4154-4159(1996))。

发现含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的CTLA-4胞质结构域在不同物种之间100％保守，提示该区域对于CTLA-4通过螯合细胞内信号分子对T细胞活化进行负调控是重要的(Ravetch，J.V.&Lanier，L.L.，Science290：84-89(2000)；和Jay，C.U.&Jie，J.，Curr.Opin.Immunol.9：338-343(1997))。因此，CTLA-4的胞质结构域是开发哮喘、自身免疫性疾病以及移植物排斥的免疫治疗药物而言非常好的细胞靶。目前，利用PTD将受体蛋白具体是CTLA-4递送进入细胞是困难的。我们现在已经显示通过将仅仅受体蛋白的胞质结构域与PTD融合来递送CTLA-4作为PTD货物(cargo)的方法。CTLA-4的胞质结构域对于活化的T细胞是特异性的，所以在用作PTD的货物蛋白时，其克服了阳离子PTD组织特异性的缺乏导致的其体内应用的限制。

发明简述

本发明的一个目的是提供抑制患有自身免疫性疾病或炎性疾病的脊椎动物中的T细胞活化的方法，包括给药所述脊椎动物治疗有效量的包含蛋白转导结构域和受体蛋白的胞质结构域的融合多肽。

本发明的另一目的是提供将生物分子转导复合物(BTC)递送给气管或肺细胞的方法，包括经鼻内给药生物分子转导复合物到脊椎动物。生物分子转导复合物包含蛋白转导结构域(PTD)和目的分子。

另一优选实施方案是利用特异于活化T细胞的CTLA-4胞质结构域(SEQ ID NO：11)作为PTD的货物蛋白。利用PTD-ctCTLA-4融合蛋白克服了由于阳离子PTD的组织特异性缺乏导致的其体内应用的限制。

本发明使得能够开发新的治疗蛋白药剂，其包含具体蛋白的蛋白转导结构域，诸如Hph-1，其具有高度细胞或组织特异性。本发明还使得能够经由局部给药途径给药产生的融合多肽，从而最小化或避免系统副作用，诸如行为异常，细胞毒性和免疫原性。

附图简述

图1A显示Hph-1-PTDβ-gal或eGFP缀合的融合蛋白的结构。Hph-1-PTD是11个氨基酸的蛋白转导结构域(YARVRRRGPRR)(SEQ ID NO：1)，从人转录因子Hph-1鉴定。

图1B是通过Western印迹分析的培养的Jurkat(E6.1)细胞中Mph-1-β-gal的转导活性和动力学的照片。

图1C是几种细胞系包括HeLa，HepG2，HaCat和NIH3T3中Hph-1的转导效率的照片。与Hph-1-β-gal保温1小时以后，固定细胞并用X-gal溶液染色。随后通过荧光显微镜方法捕获图像。

图1D是显示Hph-1-FITC细胞内定位的照片，其中通过共聚焦显微镜法进行分析。将Hph-1-eGFP和对照eGFP蛋白与HeLa细胞保温1小时之后，固定细胞并用DAPI进行染色。

图1E显示Hph-1-PTD的体内转导效率。将5mg Hph-1-β-gal或对照β-gal经腹腔内注入小鼠。切除肝、肾、脾、肺、心和脑并固定，加入X＝-gal溶液分析每个完整器官(上方一行)或其薄切片(下方一行)中β-gal的活性。

图2A显示将Hph-1-PTD转导入表皮以及通过皮肤转导入真皮。将Hph-1-FITC和薄荷的混合物施加于无毛小鼠的剥离皮肤，保持2小时。通过共聚焦显微镜法分析皮肤样品中荧光的存在。

图2B显示将Hph-1-PTD-FITC通过眼睛的巩膜递送进入眼睛的视网膜和神经节细胞层。将Hph-1-FITC溶液滴入眼睛，保持30或120min。FITC荧光通过共聚焦显微镜法在眼睛的冷冻切片中检测。

图2C显示Hph-1-PTD-FITC经鼻转导。FITC缀合的Hph-1-PTD溶液通过气管内滴注经局部递送到气管和肺。在支气管以及肺和支气管基底膜中的血管内皮区域中检测FITC荧光。

图3A图示了Hph-1-ctCTLA-4和Hph-1-ctCTLA-4YF突变构建体。

图3B-C显示Jurkat T细胞(已知在其表面不表达CTLA-4)中的Hph-1-ctCTLA-4转导效率和动力学，其通过利用抗-HA-荧光素mAb的细胞内染色分析。

图3D-E显示Hph-1-ct-CTLA-4抑制活化T细胞表面上对CD69和CD25表达的诱导。

图3F-G显示活化Jurkat T细胞以及原代人CD4⁺T细胞中Hph-1-ctCTLA-4对IL-2分泌的抑制。

图4A-C显示在小鼠内进行气管内滴注以后Hph-1-ctCTLA-4-eGFP转导入支气管肺泡细胞。经鼻给予Hph-1-ctCTLA-4-eGFP或ctCTLA-4-eGFP之后，支气管肺泡灌洗(BAL)液中的总BAL细胞或CD3+T细胞中的eGFP水平通过FACS分析。

图4D显示用Hph-1-ctCTLA-4或Hph-1-ctCTLA-4YF突变体经鼻内预处理后观察到的BAL液(OVA攻击后)中各种炎性细胞的数目。

图4E显示经鼻气道给药Hph-1-ctCTLA-4或Hph-1-ctCTLA-4YF突变体之后，分泌进入BAL液中OVA诱导的炎性细胞因子和趋化因子的水平，其通过ELISA分析。

图4F显示Hph-1-ctCTLA-4预处理的OVA攻击的小鼠中支气管周炎症严重度的半定量分析。

图4G显示对照小鼠以及Hph-1-ctCTLA-4处理的小鼠中OVA攻击后肺组织的组织学检查。

图5A-B显示Hph-1-ctCTLA-4对抗原诱导的气道高醋甲胆碱(MCh)反应性的抑制作用。

图6显示Tat-ctCTLA-4处理抑制IL-2分泌的结果。

图7-9证实了Mph-1-ctCTLA-4对腹腔内注射II型胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎动物模型的抑制作用。

图10显示Hph-1-ζ-链处理对IL-2分泌的抑制结果。

图11显示与对照大鼠相比，Mph-1-ctCTLA4处理的变应性大鼠中炎症的抑制，其通过皮炎评分测定。

图12显示与对照大鼠相比，Mph-1-ctCTLA4处理的变应性大鼠中炎症的抑制，其通过以g/m2.H计的透表皮水丢失量(TEWL)来测定。

发明详述

本发明提供了递送包含蛋白转导结构域(PTD)和目的分子的生物分子转导复合物(BTC)诸如多肽的方法。PTD允许通过系统或局部给药将目的多肽在体内和体外的有效递送或吸收进入细胞。给药途径包括以下途径：肌内，腹腔内，静脉内，口服，经鼻，皮下，透皮，经粘膜和吸入。本发明使得能够经由局部给药途径给药产生的融合多肽，由此最小化系统毒性。

一个实施方案涉及利用Hph-1-PTD，来自人转录因子Hph-1(YARVRRRGPRR)(SEQ ID NO：1)的PTD。其他实施方案包括但不限于以下序列的PTD：小鼠转录因子Mph-1(YARVRRRGPRR)(SEQ ID NO：2)，Sim-2(AKAARQAAR)(SEQ ID NO：3)，HIV-1病毒蛋白Tat(YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO：4)，果蝇的触角(Antennapedia)蛋白(Antp)(RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO：5)，HSV-1结构蛋白Vp22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE)(SEQ ID NO：6)，G蛋白信号调节物R7(RRRRRRR)(SEQ ID NO：7)，MTS(AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP)(SEQ ID NO：8)，和短两亲性肽载体Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)(SEQ ID NO：9)以及Pep-2(KETWFETWFTEWSQPKKKRKV)(SEQ ID NO：10)。

连接于PTD的所需多肽可为受体蛋白的胞质结构域。利用受体蛋白的胞质结构域作为PTD货物蛋白的发明克服了阳离子PTD缺乏组织特异性导致的其体内应用的限制。本发明的一方面使得能够开发包含融合于目的蛋白的PTD的新的治疗药剂，所述目的蛋白诸如ctCTLA-4(SEQ ID NO：11)和ζ-链(也称为zeta或z链)(SEQ ID NO：12)。ζ-链是T细胞受体的胞质结构域，其含有三个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)。其作为三对酪氨酸残基的同源二聚体存在，所述三对酪氨酸残基称为A1A2(SEQ ID NO：13)，B1B2(SEQ ID NO：14)和C1C2(SEQ ID NO：15)结构域，以便描述本发明。本发明的受体蛋白的胞质结构域可为完整的ζ-链，含有酪氨酸残基对的单个ITAM(即，A1A2，B1B2或C1C2)，或所述结构域中两种的任意组合，即，A1A2-B1B2，A1A2-C1C2或B1B2-C1C2。

另一种可连接于PTD的目的蛋白是PD-1(程序性死亡-1受体)的胞质结构域(SEQ ID NO：16)。

一些实施方案中，连接于PTD的所需多肽是受体蛋白，例如，eGFP(SEQ ID NO：17)或β-Gal(SEQ ID NO：18)。

上述蛋白的氨基酸序列如下：ctCTLA-4(KMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN)(SEQ ID NO：11)；

ζ-链：FLRVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：12)；

ITAM A(A1A2)：

NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR(SEQ ID NO：13)；

ITAM B(B1B2)：

KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG(SEQ ID NO：14)；

ITAM C(C1C2)：

KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：15)；

PD-1：

RAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ ID NO：16)；

eGFP：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSGRTQISSSSFEFCSRRYRGPGIHRI(SEQ ID NO：17)；和

β-Gal：MELWKSCIFLFLNFCIQSEGIVRTSYGNWNIPKIGDRNIPSFLIDESKNQFLLDGLPFRYISGSIHYFRIPRDRWDERLGKVRALGFNAIQYYIPWNMHELEEGNHDFSGLLDFAEFSMMAFHKYGLWTILRVGPYICGELENGGLPWWLLNKNVTKQRSSDRVFTREVENWFEILLPRVKPLLRKNGGPVLMLQIENEYGSYDACDQQYLRFLRDLTRSLVGDDVLLFTTDGSAESLLKCGTVEGVFPTVDFGPTDDAKEIENNFKLQRKFAPNGPLVNSEYYPGWLVLWGQKKQNLPSPQTIINGSQTMYSLGASFNYYMIHGGTNFGFWNGAETEAPCITSYDYDAPISESGDVTTKYLEIRKWIKGLTDWPTPPLDVPGNSPKGRFGKIKMRLVHSVEKLKTLTSLGDPGDCVETDKPISFETLKHPLGLVAYQAKINSCGNLTIPSFGDFVHVYLNGKYIDTLTRRYYNLTRNSVIIEGCLENEENRLFMLVENQGRKTFETINDRKGILSDVFMNGQAIQFWTQCGIKLPLQEDFYFRKAMRNNYRKNVKSNQKQGVFIGILSVDAPTDTWLDTTGWGKGIAIVNGRNFGRYWPTKGPQMTLYIPAEFLKIGENSVMMVELEGAEEACTSTSSCIADFIDHPVFDFQ(SEQ ID NO：18)。

受体蛋白的胞质结构域可通过本领域技术人员已知常规技术融合于PTD。产生的治疗性融合蛋白可有效抑制对活化诱导的表面蛋白的诱导，以及IL-2以皮摩尔浓度的产生。

定义

术语“胞质结构域”或“胞质部分”在本发明中可互换使用并指目的多肽或蛋白的整个胞质结构域或者部分胞质结构域。本发明不仅仅限于融合于PTD的目的多肽或蛋白的胞质结构域，事实上，目的多肽或蛋白的其他结构域或部分也可融合于PTD。

本发明术语“多肽”包括单数的“多肽”或复数的“多肽”并包含由肽键连接的任何链或者两或多个氨基酸的链。因此，本发明中，包括但不限于“肽，”“二肽，”“三肽，”“蛋白，”“氨基酸链，”“寡肽，”“寡聚物，”的术语或任何其他用于指代两个或多个氨基酸的链的术语，也包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可用于替代这些术语或互换使用。该术语还包括经过了翻译后修饰的多肽，例如糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白水解裂解，或用非天然存在的氨基酸修饰。术语“蛋白”也包括蛋白的片段，类似物和衍生物，其中所述片段，类似物或衍生物保持与参照蛋白基本相同的生物活性或功能。

蛋白的“片段，衍生物或类似物”可为这样的物质，(i)其中一或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代，并且所述取代的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的；或(ii)其中一或多个氨基酸残基包括取代基；或(iii)其中成熟多肽与另一种化合物融合，诸如增加多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合，诸如前导或分泌序列，其用于纯化多肽。所述片段，衍生物或类似物包含在本发明的范围内。

尤其优选的是具有下述蛋白氨基酸序列的变体，类似物，衍生物和片段，其中几个例如5-10，1-5，1-3，2或1个氨基酸残基以任意组合被取代，缺失或添加。尤其优选的是沉默取代，添加或缺失，其不改变本发明多肽的性质和活性。还优选保守取代。

除了用一或多个其他氨基酸取代一或多个氨基酸之外，本发明变体的实例是上文定义的融合蛋白。本领域技术人员理解不同的氨基酸具有相似的性质。物质的一或多种所述氨基酸通常可用一或多种其他这种氨基酸取代而不会消除所述物质的所需活性。

因此，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸通常可互相取代(具有脂肪族侧链的氨基酸)。这些可能的取代中优选用甘氨酸和丙氨酸相互取代(因为它们具有相对短的侧链)，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸相互取代(因为它们具有较长的疏水脂肪族侧链)。其他通常可相互取代的氨基酸包括：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)，赖氨酸，精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有氨基侧链的氨基酸)；以及胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。该性质的取代通常称为“保守”或“半保守”氨基酸取代。

术语“生物分子转导复合物”或BTC，指PTD和目的分子的复合物。目的分子可为蛋白，核酸，脂，碳水化合物或化合物。如果目的分子是蛋白，BTC也指融合蛋白或融合多肽。

术语“融合蛋白，”“融合多肽，”“嵌合蛋白，”和“嵌合多肽”在本发明中可互换，指包含目的多肽或蛋白以及PTD的多肽和蛋白。

术语“目的蛋白”，“所需的多肽”，“所需的蛋白”或“靶蛋白”在本发明中可互换，指完整蛋白分子或其一部分，即，蛋白的胞质结构域或其他结构域。多肽或蛋白的胞质结构域或其他部分能诱导细胞反应。

本发明术语“治疗剂”指分子，诸如蛋白，脂类，碳水化合物，核酸或化合物，其在递送给脊椎动物时，治疗即治愈、缓解或减轻所述脊椎动物中给定疾病或病症(例如移植物排斥)的症状，或任选通过减慢终末疾病或病症的进展而延长所述脊椎动物的生命。

本发明术语“治疗性融合多肽”指这样的多肽，当将其给予脊椎动物时，可治疗即治愈、缓解或减轻给定疾病或病症(例如，移植物排斥)的症状，或可选通过减慢终末疾病或病症的发展来延长脊椎动物的生命。

多肽

本发明的治疗性多肽包括但不限于，细胞因子，趋化因子，淋巴因子，配体，受体，激素，凋亡诱导型多肽，酶，抗体和生长因子。实例包括但不限于细胞毒T-淋巴细胞-相关的蛋白4(ctCTLA-4)的胞质结构域，zA1A2的胞质结构域，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，集落刺激因子(CSF)，白介素2(IL-2)，白介素-3(IL-3)，白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素6(IL-6)，白介素7(IL-7)，白介素8(IL-8)，白介素10(IL-10)，白介素12(IL-12)，白介素15(IL-15)，白介素18(IL-18)，干扰素alpha(IFNα)，干扰素beta(IFNβ)，干扰素gamma(IFNγ)，干扰素omega(IFNω)，干扰素tau(IFNτ)，干扰素gamma诱导因子I(IGIF)，转化生长因子beta(TGF-β)，RANTES(活化时调节，正常T-细胞表达并推定分泌的)，巨噬细胞炎性蛋白(例如，MIP-1alpha和MIP-1beta)，利什曼原虫延长启动因子(LEIF)，血小板来源的生长因子(PDGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，生长因子，例如，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，纤维母细胞生长因子，(FGF)，神经生长因子(NGF)，脑来源的神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-2(NT-2)，神经营养因子-3(NT-3)，神经营养因子-4(NT-4)，神经营养因子-5(NT-5)，胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)，毛状神经营养因子(CNTF)，红细胞生成素(EPO)，和胰岛素。

本发明的治疗性融合多肽可用于治疗疾病诸如帕金森氏病，癌症和心脏病。此外，治疗性多肽可用于治疗自身免疫性疾病诸如多发性硬化；干燥综合征；结节病；胰岛素依赖型糖尿病；自身免疫性甲状腺炎；关节炎，例如，骨性关节炎，类风湿性关节炎，反应性关节炎，和银屑病性关节炎；强直性脊柱炎；和硬皮病。本发明的治疗性多肽也可用于治疗急性和慢性炎性疾病(例如，哮喘)，以促进伤口愈合，防止细胞、组织或器官移植(例如胰岛移植)之后的移植物排斥。

本发明的治疗性融合多肽例如神经营养因子(NTFs)，可用于促进脑、脊髓和外周神经中细胞的存活、维持、分化、修复、再生和生长。适宜的NTF包括但不限于，NGF，BDNF，神经营养因子或NT诸如NT-2，NT-3，NT-4，NT-5，GDNF，CNTF等。给药纯化的重组NTF代表治疗所述急性和慢性神经系统疾病的临床策略。所述疾病包括但不限于机械或化学脑或脊髓损伤，帕金森氏病，阿尔茨海默病和其他痴呆症，肌萎缩性侧索硬化以及多发性硬化症。

本发明的治疗性融合多肽例如生长因子可用于促进伤口愈合。有用的生长因子包括但不限于FGF和EGF。

本发明的治疗性融合多肽也可用于促进细胞自杀(称为“凋亡”)。适宜的凋亡多肽包括BAX蛋白。可选，本发明的治疗性融合多肽也可用于预防凋亡。适宜的凋亡拮抗剂包括BAX拮抗剂Bcl-2。可利用凋亡抑制多肽治疗的疾病是肌营养不良(MD)，其中患者具有缺陷蛋白肌营养不良蛋白(dystrophin)。肌营养不良蛋白是正常肌肉功能所需的。非缺陷性正常肌营养不良蛋白如果经由质粒递送到MD患者可以作为抗原。在这种情况下，编码正常肌营养不良蛋白的DNA转导的肌肉细胞可被免疫系统识别并被基于肌营养不良蛋白特异性T细胞的反应而被杀死。所述基于T细胞的杀死已知通过诱导凋亡杀死细胞。如果正常并且可能为免疫原性的肌营养不良蛋白与Bcl-2或其他凋亡预防蛋白一起递送进入肌肉细胞，可预期CTL不能杀死肌肉细胞。这种解释适用于许多遗传疾病，其中治疗涉及递送“正常”并且由此可能具有免疫原性的蛋白的拷贝。

本发明多肽包括前述多肽的片段，衍生物，类似物或变体，及其任意组合。本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或变体可为抗原性和免疫原性多肽，其用于预防或治疗即治愈、缓解、减轻疾病严重性、或预防或减少疾病。

本发明其他实施方案包括这样的多肽，其包含的氨基酸序列与上文所述多肽的氨基酸序列至少95％相同，更优选至少96％、97％、98％或99％相同。

实际上，任何具体多肽是否与例如SEQ ID NO：11-18中所示氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同可利用已知计算机程序常规测定，所述程序诸如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park 575Science Drive，Madison，Wis.53711)。Bestfit利用Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源算法以发现两条序列之间的最佳片段同源性。利用Bestfit或其他任何序列比对程序确定具体序列是否例如与本发明的参照序列95％相同时，参数的设定使得相同性百分比针是针对参照氨基酸序列全长计算的并且同源性中的缺口达参照序列总氨基酸数的5％是允许的。

多核苷酸

此外，本发明还涉及多核苷酸，其编码融合蛋白或嵌合蛋白，重组表达载体，质粒和其他包含它们的多核苷酸构建体(总体称为″表达载体″)，这些表达载体转化的微生物，获得这些多核苷酸的方法，以及利用所述载体转化的细胞。适宜的宿主细胞可利用所述表达载体转化。

本发明术语“表达载体”指这样的构建体，其由遗传物质(即核酸)构成。通常，表达载体含有复制起点，其在细菌宿主细胞例如大肠杆菌中有功能，并含有用于检测包含所述表达载体的细菌宿主细胞的选择性标记。本发明的表达载体含有启动子序列，并包含本发明所述的遗传元件，其排列使得编码序列可在真核细胞中转录并翻译。一些实施方案中，表达载体是封闭环状DNA分子。

术语“表达”是指编码序列编码的产物的生物制备。大多数情况中，DNA序列，包括编码序列，被转录成信使-RNA(mRNA)。信使-RNA随后翻译形成多肽产物，其具有相关生物活性。表达过程还涉及对RNA转录产物的加工，诸如通过拼接去除内含子，和/或多肽产物的翻译后加工。

本发明的融合蛋白或嵌合蛋白可通过重组DNA方法制备。根据本发明，编码所需蛋白的基因序列被分离，合成或通过其他方法获得，并可操作连接于编码PTD肽的DNA序列。含有所需蛋白可操作连接于编码PTD肽的DNA序列的基因的杂合基因称为嵌合基因。可选，编码所需蛋白的基因序列通过连接肽连接于编码PTD肽的DNA序列。

术语“连接肽”指任何优选提供表达的蛋白中包含亲水区域的氨基酸残基的序列。所述亲水区可促进在蛋白裂解位点的酶促裂解作用。

嵌合基因可插入允许所需的嵌合蛋白在适宜转化宿主中表达的表达载体中。所述表达载体为插入的嵌合基因提供必须的调节序列以控制在适宜转化宿主中的表达。

核酸构建体可为载体形式，例如表达载体，并可包含染色体，游离体，病毒来源的载体等，例如来自以下物质的载体：细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母游离体的载体，来自插入元件，来自酵母染色体元件，来自病毒诸如杆状病毒，组病毒，诸如SV40，痘苗病毒，腺病毒，鸡痘病毒，假性狂犬病病毒和逆转录病毒，以及来自其组合的病毒，诸如来自质粒和噬菌体遗传元件的那些，诸如粘粒和噬菌粒。通常，任何适合在宿主中维持、增殖或表达多肽的载体可用于这方面的表达。

控制本发明的融合蛋白的表达的调节元件包括启动子区，5’非翻译区，信号序列，嵌合编码序列，3′非翻译区，转录终止位点。可从宿主分泌到培养基中的融合蛋白也包含信号序列。

类似地，本领域技术人员已知多种翻译控制元件。包括但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子。

制备重组载体并利用其转化宿主细胞、在宿主细胞中复制载体以及表达生物活性外来多肽和蛋白的方法和材料见Principles of Gene Manipulation，by Old and Primrose，2nd edition(1981)，和Sambrook et al.，Molecular Cloning，3^rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)，包含在此作为参考。

本发明术语″DNA多核苷酸″可为环状或线性质粒，或其他线性DNA，其也可为非感染性和非整合性的(即，不整合进入脊椎动物细胞的基因组)。线性质粒是以前为环状但已经线性化的质粒，例如通过利用限制内切核酸酶进行消化。线性DNA在一些情况中的优势在例如下文中讨论：Cherng，J.Y.，et al.，J.Control.Release 60：343-53(1999)，和Chen，Z.Y.，et al.，Mol.Ther.3：403-10(2001)，包含在此作为参考。

本发明的另一实施方案包括这样的载体，其含有嵌合基因，其中含有的核苷酸序列与上文所述包含嵌合基因的载体的任何核苷酸序列具有至少95％相同性，更优选至少96％，97％，98％或99％相同性。

本发明的其他实施方案包括这样的嵌合基因，其包含的核苷酸序列与上文所述嵌合基因的任何核苷酸序列具有至少95％相同性，更优选至少96％，97％，98％或99％相同性。

实际上，任何特定载体或嵌合基因与本发明的核苷酸序列是否具有至少95％，96％，97％，98％或99％相同性可通过利用已知计算机程序常规确定，所述程序诸如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park 575Science Drive，Madison，Wis.53711)。Bestfit利用Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法，以发现两条序列之间的最佳同源片段。利用Bestfit或其他任何序列程序确定具体的序列是否与本发明的参比序列具有例如95％相同性时，参数的设定当然使得相同性百分比针对参比核苷酸序列的全长计算，并且同源性缺口达到参比序列中核苷酸总数的5％是允许的。

密码子优化

“密码子优化”定义为修饰核酸序列以提高在目的脊椎动物细胞中的表达，例如人，通过将至少一种，超过一种，或大量天然序列密码子替换为在该脊椎动物基因中频率更高或最高的密码子来进行。各种物种都显示对于特定氨基酸的具体密码子的特定偏好。

一方面，本发明涉及多核苷酸表达构建体或载体，包含表达构建体或者载体，和包含密码子最优化编码区的核酸片段的宿主细胞，所述编码区编码治疗性多肽，及其片段、变体或衍生物，和各种利用所述多核苷酸表达构建体，载体，宿主细胞以治疗或者预防脊椎动物中的疾病的方法。

本发明术语“密码子最优化的编码区”意指这样的核酸编码区，其已经通过用更频繁地在该脊椎动物的基因中使用的一或多个密码子替代至少一个，或超过一个或大量密码子而被改造用于在给定脊椎动物的细胞中表达。

包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的差异允许编码基因的序列中的变异。由于每个密码子由三个核苷酸组成，并且包含DNA的核苷酸限于四个具体的碱基，共有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(其余的三种密码子编码终止翻译的信号)。许多氨基酸由超过一种密码子编码。例如，丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由6种编码，而色氨酸和蛋氨酸仅仅由一种三联体编码。该简并性允许DNA碱基组合物在较大范围内改变而不改变DNA编码的蛋白的氨基酸序列。

共有序列

本发明还涉及含有嵌合基因的表达质粒，其含有表达具有特定共有序列、其片段、衍生物和变体的治疗性融合蛋白的基因。“共有序列”是例如理想化的序列，其代表最常存在于经过互相比较的两或多个序列的每个位置上的氨基酸。共有序列是理论上代表性氨基酸序列，其中每个氨基酸都是天然地在不同序列中出现频率最高的氨基酸。该术语还指与理论共有序列接近的实际序列。共有序列可来自具有例如共有功能或结构目的的序列。其可通过比对尽可能多的已知具体结构或功能结构域的实例来定义从而最大化同源性。当每种具体氨基酸在其位置适当占优势时，序列通常被认为是共有序列，并且形成比较基础的大多数序列通过相当少的取代与共有序列相关。例如，野生型比较序列与共有序列至少大约50％，75％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性。因此，本发明的多肽与共有序列具有大约50％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同性。

“共有氨基酸”是被选占据共有蛋白中给定位置的氨基酸。组织为选择共有氨基酸的系统可为计算机程序，或一或多种计算机程序与“by hand”分析和计算的组合。如果共有氨基酸获自比对的氨基酸序列的每个位置，则这些共有氨基酸被“排列”以获得共有蛋白的氨基酸序列。

治疗性用途

本发明还涉及治疗性融合蛋白在制备用于治疗炎症和免疫疾病的药物中的用途，所述疾病诸如哮喘，类风湿性关节炎，干草热，过敏性鼻炎，银屑病以及其他皮肤病，以及涉及治疗性融合蛋白在制备用于抑制移植物排斥的药物中的用途，所述移植物排斥例如在胰岛移植中。

还涉及治疗性融合蛋白调节免疫反应的用途，即阻断患有免疫疾病的对象中的T细胞活化，减少炎性细胞的浸润(气道炎症)，减轻Th2型细胞因子的分泌，或减轻气道高反应性。自身免疫性疾病的实例包括多发性硬化；干燥综合征；结节病；胰岛素依赖型糖尿病；自身免疫性甲状腺炎；关节炎，例如，骨性关节炎，类风湿性关节炎，反应性关节炎，以及银屑病性关节炎；强直性脊柱炎；和硬皮病。

本发明还涉及治疗性融合蛋白在治疗炎性疾病中的用途，所述疾病诸如哮喘，肺气肿，干草热(遗传性过敏症)，过敏性鼻炎，银屑病及其他皮肤病，以及治疗性融合蛋白在抑制移植物排斥中的用途，例如，在胰岛移植中。

方法和给药

本发明提供递送治疗性融合多肽或其片段、变体或衍生物的方法，其中所述蛋白作为重组蛋白提供，具体地作为融合蛋白或纯化的亚基提供，所述方法包括给予脊椎动物一或多种本文的组合物，使得在给予所述组合物诸如本发明所述组合物时，在该脊椎动物中产生治疗反应。可通过例如皮肤、鼻、眼或经鞘内递送。鼻内给药可经由气管内滴注进行。

术语“脊椎动物”意图包括单数“脊椎动物”以及复数“脊椎动物”并包含哺乳动物和鸟类，以及鱼类，爬行类和两栖类。

术语“哺乳动物”意图包括单数“哺乳动物”和复数“哺乳动物”，并包括但不限于，人；灵长类诸如猿，猴(例如猫头鹰猴，松鼠猴，卷尾猴，恒河猴，非洲绿猴，赤猴，猕猴和长尾猴)，猩猩，狒狒，长臂猿，和黑猩猩；犬科动物诸如狗和狼；猫科动物诸如猫，狮子，和虎；马类诸如马，驴和斑马，食用动物诸如牛，和羊；有蹄类动物诸如鹿和长颈鹿；熊科的动物诸如熊；及其他诸如兔子，老鼠，雪貂，海豹，鲸。具体地，哺乳动物可以是人类对象，食用动物或陪伴动物。

术语“鸟”意图包括单数“鸟”和复数“鸟”，并包括但不限于野生水鸟(feral water bird)诸如鸭，鹅，燕鸥，剪嘴鸥，和鸥；以及家养鸟类诸如火鸡，小鸡，鹌鹑，野鸡，鹅和鸭。术语“鸟”也包括雀形目的鸟诸如八哥和虎皮鹦鹉。

本发明还提供产生、增强、或调节免疫反应的方法，包括给予人一或多种本文所述的组合物。该方法中，所述组合物可包括一或多种多肽，或其片段，变体或衍生物，其中所述蛋白作为重组蛋白提供，具体作为融合蛋白或纯化亚基提供。

本发明“治疗性反应”指脊椎动物激发对递送给该脊椎动物的本发明所述组合物的阳性反应的能力。治疗性反应的实例包括包括但不限于，免疫反应，创伤愈合，炎性反应和移植物排斥的抑制。

本发明“免疫反应”指脊椎动物激发对递送给该脊椎动物的本发明所述组合物的免疫反应的能力。免疫反应的实例包括抗体反应或细胞反应，例如细胞毒T细胞反应。

如上文所述，本发明的组合物可用于治病性治疗和预防疾病。本发明中，“治疗”指利用本发明的一或多种组合物来预防、治疗、延缓、或降低脊椎动物中疾病的严重度或疾病症状，和/或使得疾病不再恶化。

术语“预防”指本发明的一或多种组合物在脊椎动物中产生治疗性反应的用途。不需要本发明的任何组合物完全治愈或消除所有疾病症状。

一些实施方案中，本发明的一或多种组合物通过本文描述的方法递送给脊椎动物，由此获得有效的治疗性和/或有效的预防性免疫反应。更具体地，本发明的组合物可给予卵巢子宫阴道脊椎动物的任何组织，包括但不限于肌肉，皮肤，脑组织，肺组织，肝组织，脾组织，骨髓组织，胸腺组织，心脏组织，例如，心肌层，心内膜，和心包，淋巴组织，血液组织，骨组织，胰腺组织，肾组织，胆囊组织，胃组织，肠内的组织，阴囊组织，卵巢组织，子宫组织，阴道组织，直肠组织，神经系统组织，眼组织，腺体组织，舌组织，和结缔组织，例如，软骨。

而且，本发明的组合物可给予脊椎动物的任何内腔，包括，然而并非限于，肺，口，鼻腔，胃，腹膜腔，肠，任何的心室，静脉，动脉，毛细管，淋巴腔，子宫腔，阴道腔，直肠腔，关节腔，脑室，脊髓中的椎管，眼窝，唾液腺或肝的导管腔。当部分的组合物给予唾液腺或肝的导管腔时，所述多肽在唾液腺或肝中表达，使得所述多肽从每个唾液腺或肝递送到脊椎动物的血流中。给予微颤该系统的分泌器官的一些模式利用唾液腺、肝和胰腺以释放所需的多肽进入血流公开于美国专利5837693和6004944，其均全文包含在此作为参考。

一些实施方案中，所述组合物给予肌肉，可给予骨骼肌或心肌，或给予肺组织。

根据公开的方法，本发明的组合物可通过肌内(i.m.)，皮下(s.c.)，或肺内途径给药。其他适宜的给药途径包括但不限于气管内滴注，透皮给药，眼内给药，鼻内给药，吸入，腔内给药，静脉内给药(i.v.)，导管内给药(例如，给予胰腺内)以及实质内给药(即给予任何组织内)。对于静脉内给药，可使用可药用载体，诸如磷酸缓冲的盐水，或其他用于静脉内给予药物的物质。透皮递送包括但不限于皮内(例如给予皮肤内或表皮)，透皮(例如皮下)和透粘膜给药(即给予皮肤或粘膜组织中或透过皮肤或粘膜组织)。腔内给药包括但不限于，经口、阴道、直肠、鼻、腹腔或肠腔以及鞘内(即给予椎管内)，室内(即给予脑室或心室内)，心房内(即给予心房内)，以及蛛网膜下(即给予脑的蛛网膜下腔)给药。

任何给药模式均可使用治疗所述模式可在所需的组织中递送或表达所需的肽或蛋白，其量足以对需要所述反应的人中的疾病产生治疗性反应。

本发明的给药工具包括针注射(例如作为无菌分散液，优选等张液)，导管输注，瞬间(biolistic)注射，粒子加速器(例如“基因枪”或肺“无针”注射器)Med-E-Jet(Vahlsing，H.，et al.，J.Immunol.Methods 171：11-22(1994))，Pigjet(Schrijver，R.，et al.，Vaccine 15：1908-1916(1997))，Biojector(Davis，H.，et al.，Vaccine 12：1503-1509(1994)；Gramzinski，R.，et al.，Mol.Med.4：109-118(1998))，AdvantaJet(Linmayer，I.，et al.，Diabetes Care 9：294-297(1986))，Medi-jector(Martins，J.，和Roedl，E.J.，Occup.Med.21：821-824(1979))，明胶海绵药池(gelfoam sponge depots)，其他可商购的药池物质(例如水凝胶)，渗透泵(例如Alza微型泵)，口服或栓剂固体(片剂或丸剂)药物配制剂，局部皮肤霜或凝胶，以及倾析，多核苷酸涂敷的缝合线(Qin，Y.，etal.，Life Sciences 65：2193-2203(1999))或手术中的局部应用。具体的给药模式可为肌内针注射和经由导管滴注的肺应用。能量支持的质粒递送(EAPD)法也可用于给药本发明的组合物。一种所述方法涉及将短的电脉冲应用于注射的组织，该过程通常已知为电穿孔。见Mir，L.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：4262-7(1999)；Hartikka，J.，et al.，Mol.Ther.4：407-15(2001)；Mathiesen，I.，Gene Ther.6：508-14(1999)；Rizzuto G.，et al.，Hum.Gen.Ther.11：1891-900(2000)。该段中的每篇对比文献都全文包含在此作为参考。

本发明一或多种组合物的有效量的确定有赖于多种因素，包括例如被表达或直接给予的融合蛋白，其变体或衍生物，对象的年龄、体重和性别，需要治疗的具体疾病及其严重度，给药途径，融合蛋白体内半寿期，吸收效率，以及待治疗的面积。如果需要可重复治疗，基于参考患者反应的临床判断。

“药物有效量″或“治疗有效量”是足以对疾病状态产生治疗或临床反应的量。术语“药物有效量”或“治疗有效量”可互换使用。基于上述因子，确定精确的量，剂量数，以及给药时间是本领域技术人员已知的并可由主治医师或兽医容易的确定。

对于给药哺乳动物，具体是人，预期活性药剂的日剂量为0.01mg/kg体重，通常大约1mg/kg。上述剂量是一般情况。当然也存在需要更高或更低剂量的情况，包括皮摩尔和纳摩尔浓度，并且这也在本发明的范围内。

本发明还涉及包含公开的融合蛋白以及另外的药物活性剂的组合物。因此，融合蛋白和结合的药物活性剂可与可药用载体组合。所述载体包括但不限于，盐水，缓冲的盐水，葡萄糖，脂质体，水，甘油，聚乙二醇，乙醇及其组合。

本发明的组合物可溶于各种缓冲液。适宜缓冲液包括例如磷酸缓冲的盐水(PBS)，生理盐水，Tris缓冲液，和磷酸钠(例如，150mM磷酸钠)。不溶性多核苷酸可溶于弱酸或弱碱，然后利用缓冲液稀释到所需体积。缓冲液的pH可适当调节。此外，可药用添加剂也可用于提供适宜的渗透性。上所述添加剂是本领域技术人员已知的。对于体内应用的含水组合物，使用无菌无热原水。所述配制剂可包含有效量的多核苷酸以及适宜量的含水溶液以制备适合给予人的可药用组合物。

本发明的组合物可根据已知方法配制。适宜的制备方法的描述见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th Edition，A.Osol，ed.，MackPublishing Co.，Easton，PA(1980)，和Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th Edition，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)，均包含在此作为参考。尽管可将本发明的组合物作为含水溶液给药，其也可配制成乳剂，凝胶，溶液，悬液，冻干形式，或其他本领域已知的形式。此外，所述组合物可包含可药用添加剂，包括例如稀释剂，粘合剂，稳定剂和防腐剂。

以下实施例的目的仅仅为了举例说明，而不是限制权利要求确定的本发明的范围。实施例中引用的文献全文包含在此作为参考。

实施例

材料和方法

以下材料和方法用于本发明公开的所有实施例。具体的材料和方法公开于各个实施例。

除非另有说明，本发明采用细胞生物学、细胞培养、分子生物(包括PCR)，免疫接种学，微生物学，重组DNA，以及免疫学的常规技术，其均为本领域技术人员已知的。所述技术在文献中充分描述。见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook et al.，ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press：(1989)；DNA Cloning，Volumes I和II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cell(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cell And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cell(J.H.Miller andM.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods InEnzymology，Vols.154and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wileyand Sons，Baltimore，Maryland(1989)。每篇文献全文包含在此作为参考。

基因构建

本发明的构建体基于本发明或本领域中提供的序列信息利用标准分子生物学技术构建。

质粒载体

本发明的构建体衍生自pRSET-B表达载体(Invitrogen)。然而，其他标准可商购真核表达载体也可用于本发明，包括但不限于：质粒pcDNA3，pHCMV/Zeo，pCR3.1，pEF1/His，pIND/GS，pRc/HCMV2，pSV40/Zeo2，pTRACER-HCMV，pUB6/V5-His，pVAX1，和pZeoSV2(得自Invitrogen，SanDiego，CA)，以及质粒pCI(得自Promega，Madison，WI)。

本发明描述的载体骨架用于产生表达本发明所述融合蛋白的表达载体。表达载体可含有其他启动子。因此，本发明所述的载体骨架可包含多个表达盒，其中包含启动子和编码微生物的序列，包括本发明所述的多核苷酸等。所述表达盒可编码相同或不同的多肽。此外，表达盒之间可为相同或相反方向。由此从每个盒的转录可为相同或相反方向(即，两个表达盒中均为5′-3′，或可选一个表达盒中为5′-3′，另一个表达盒中为3′-5′)。

质粒DNA纯化

质粒DNA可转化入适当的大肠杆菌的感受态细胞(包括但不限于DH5α株)并可通过修饰的裂解步骤分离高度纯化的共价闭环质粒DNA或利用来自Qiagen(Valencia，CA)的Giga柱根据试剂盒说明纯化。所有质粒制备物不含可检测染色体DNA，RNA和蛋白杂质基于凝胶分析。质粒经乙醇沉淀，重悬于适当溶液中，例如，150mM钠溶液。DNA保存于-20℃备用。DNA以所需摩尔浓度稀释于所需的盐溶液。

哺乳动物细胞系中的质粒表达

表达质粒通过将该质粒转染入Hela细胞或Jurkat T细胞中进行体内分析。其他性质已知的人细胞系也可使用，例如MRC-5细胞，ATCC保藏号CCL-171或人横纹肌肉瘤细胞系RD(ATCC CCL-136)。所述转染利用本领域已知的基于阳离子脂质的转染方法进行。其他转染方法是本领域已知的并可使用，例如电穿孔和氯化钙介导的转染(Graham F.L.and A.J.van derEb，Virology 52：456-67(1973))。转染后，评价转染细胞的细胞裂解物和培养上清以比较抗原表达的相对水平。所述样品通过Western印迹和ELISA利用可商购的多克隆和/或单克隆抗体分析，比较表达的抗原的质量和数量。

T细胞活化分析

原代人CD4⁺T细胞纯化自健康供者的血沉棕黄层。PBMC通过密度梯度离心利用Histopaque(Sigma)分离。收集淋巴细胞层，通过MACS柱利用CD4微珠(Miltenyi Biotec)分离CD4⁺T细胞(Busch R.，et al.，J.Immunol.Methods 286：97-109(2004))。

用Hph-1-ctCTLA-4处理1百万个Jurkat(E6.1)细胞或原代人CD4⁺T细胞1小时，用PBS洗涤并与0.25μg抗-CD28mAb(Pharmingen)4℃保温20min。抗-CD28mAb结合的细胞在0.05μg抗-CD3mAb(Pharmingen)包被的板中活化20小时。每个细胞用抗-CD69-PE和抗-CD25-FITC抗体(Pharmingen)染色并通过FACS calibur(Becton Dickinson)分析。通过ELISA(R&D system)分析每个孔中的上清中分泌的IL-2的水平。

OVA-诱导的过敏性哮喘模型

6周大的雄性BALB/c小鼠(Charles River Technology)保持在无致病原的条件下。小鼠保持在22℃、湿度20-50％、12小时光照的条件下。OVA-攻击的小鼠在第1天和第14天通过腹腔内注射100μgOVA(Sigma)致敏，所述OVA在20mg氢氧化铝(Sigma)中乳化，总体积200μl。在初次致敏之后第15，16和17天，小鼠通过鼻内滴注溶于0.1ml 10％甘油无内毒素PBS中的1.5mgOVA来攻击(Van Rijt L.S.，et al.，Blood 100：3663-3671(2002)；Oh S.W.，et al.，J.Immunol.168：1992-2000(2002)；和Zhang Y.，et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.155：661-669(1997))。在CTLA-4处理的情况中，小鼠接受50μl 10％甘油无内毒素PBS中的25μg Hph-1-ctCTLA-4重组蛋白30min，然后通过鼻内途径用OVA攻击。

气道中炎症的分析

气道阻力通过单室体积描记术(one chamber plethysmography)(ALLMedicus)测定并表达为与PBS攻击之后的Penh值相比而言Mch(醋甲胆碱)的每个浓度增加的倍数。Penh值是呼吸系统阻力(Rrs)值，表示为每分钟的呼吸频率。最后一次OVA攻击之后2天，通过腹腔内注射苯巴比妥钠(100mg/kg)处死小鼠，支气管肺泡灌洗物(BAL)通过四次滴注1ml磷酸盐缓冲的盐水并温和回收来进行。细胞数利用血球计测定，通过细胞离心和Diff-Quick染色在载玻片(Scientific Products)上进行不同的细胞计数。BAL之后即刻，用PBS中的4％多聚甲醛固定左侧主要肺(main lung)，并包埋于石蜡中。对组织进行H&E(伊木精和伊红)染色允许测量细胞学分析。

支气管周炎症的严重度如前所述半定量分级如下：0，正常；1，较少细胞；2，炎性细胞环，其深度为一层细胞；3，炎性细胞环，其厚度超过四个细胞(Myou S.，et al.，J.Exp.Med.198：1573-1582(2003)；和Myou S.，et al.，J.Immunol.171：4379-4384(2003))。

BAL液中的嗜酸细胞活化趋化因子，IL-5(BD Biosciences)，IL-6和IL-13(R&D System)水平通过定量夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定。检测的下限分别为大约15.6pg/ml。低于该限度的值被认为对于统计学分析为零。检测间和检测内方差系数确定为低于10％。

实施例1

表达载体的制备

基于TAT和引导蛋白从胞质到细胞内细胞器的吸收靶向型序列之间的共同结构和功能特征，鉴定来自人转录因子Hph-1的11个氨基酸(YARVRRRGPRR)(SEQ ID NO：1)的Hph-1蛋白转导结构域。术语“Hph-1-PTD”和“Hph-1”指该11个氨基酸的序列并可互换。

Hph-1-PTD-ctCTLA-4，Hph-1-PTD-β-gal，Hph-1-PTD-ctCTLA-4-eGFP，和不与Hph-1-PTD融合的相应基因的产生通过产生PCR片段并将这些PCR片段插入pRSET-B载体(Invitrogen)来进行(图1A)。

实施例2

制备重组蛋白

进行定点诱变产生CTLA-4YF突变体。读框的可信度通过测序验证。每种DNA构建体转化的BL21star(Novagen)用1mM IPTG诱导5小时，并在裂解缓冲液(6M尿素，20mM Tris-HCl，pH 8.0和500mM NaCl)中超声处理。裂解物通过离心(20,000r.p.m.，在20℃进行30min)澄清化，调节为10mM咪唑(Tis-HCl，pH 8.0)并加载在HisTrap螯合柱(Qiagen)上。结合的蛋白用在Tris-HCl缓冲液中纯度＞95％的50，100，250mM或3M咪唑洗脱。包含在每种级分中包含的重组蛋白在PD-10Sephadex G-25(AmershamPharmacia)上脱盐。纯化的蛋白补充了10％甘油，分成等份和在-80℃迅速冷冻(flash-frozen)(Becker-Hapak M.，et al.，Methods 24：247-256(2001))。

实施例3

Hph-1-PTD的体外和体内转导效率的分析

Hph-1-β-gal构建体被转导入每种细胞系1小时之后，细胞用PBS洗涤并立即固定。然后，固定的细胞与X-Gal溶液在37℃保温1-3小时。来自肝、肾、心、肺、脾和脑的小鼠组织样品在ip注射Hph-1-β-gal之后12小时分离，切片(10-和50-μm切片)，并利用X-Gal染色试剂盒分析(Roche)(Schwarze S.R.，et al.，Science 285：1569-1572(1999))。所述图像通过荧光显微法(Nikon)捕获。Hph-1-β-gal的转导能力也通过Western印迹分析来分析。相等数目的细胞溶于SDS-PAGE样品缓冲液，并将蛋白溶于12％凝胶，点于PVDF，其可利用抗β-gal单克隆抗体(1∶1,000)(Cell Signaling)检测。结合的抗体利用与小鼠IgG辣根过氧化物酶偶联的抗体(1∶5,000)，然后是增强的化学荧光(Pierce)检测。为了监测Hph-1-PTD-eGFP融合蛋白的定位，Hela细胞与10μM Hph-1-eGFP融合蛋白保温30min并通过共聚焦显微镜法(Bio Rad)分析eGFP的荧光。

Hph-1-HA-ctCTLA-4的转导效率通过利用HA-荧光素mAb(CellSignaling)的细胞内染色分析。细胞用cytofix/cytoperm溶液(Pharmingen)透化后与HA--荧光素mAb在4℃保温30min。细胞内荧光通过FACS calibur(Becton Dickinson)测定。

利用纯化的Hph-1-β-gal融合蛋白或对照β-gal蛋白，转导效率通过western印迹分析在Jurkat(E6.1)细胞中分析。如图1B所示，10μM Hph-1-β-gal可容易地转导入培养的细胞中，在15min第一次检测，在少于60min之内达到接近最大细胞内浓度。转导的蛋白的降解在转导后120min才检测到，而对照β-gal蛋白甚至在20mM还没有被转导入细胞内。Hph-1-PTD的蛋白转导性质为浓度依赖的方式，并且转导效率在4℃减少40％(图1B)。

确定在Jurkat T细胞中用Hph-1-PTD的蛋白转导的转导动力学和最佳浓度之后，Hph-1-PTD的转导效率利用各种细胞系检测。如图1C所示，在以不同转导效率保温1小时后几乎100％的细胞为β-gal酶活性阳性。

为了监测细胞中Hph-1-PTD融合的蛋白的细胞内定位，Hela细胞与10μM Hph-1-eGFP融合蛋白保温30min，通过共聚焦显微镜法分析eGFP的荧光(图1D)。Hph-1-eGFP在保温几分钟之后累积在细胞核内，内化的融合蛋白见于处理的细胞的细胞核以及细胞浆(图1C)。

为了确定Hph-1-PTD是否辅助蛋白体内递送，Hph-1-β-gal或对照β-gal蛋白经腹腔内注入小鼠，注射4-6小时后分离肝、心、肾、肺、脾和脑。随后分析整个器官及其薄切片的β-gal酶活性(图1E)。所有分离自注射了Hph-1-β-gal的小鼠的组织显示强的且一致的β-gal活性，即使在脑切片中也如此，表明Hph-1-PTD可递送大的蛋白通过脑血屏障。在注射了对照蛋白的小鼠中，没有检测到β-gal或观察到零星的弱染色，可能是由于吞噬细胞对对照β-gal蛋白的短暂的非特异性摄入(Schwarze S.R.，et al.，Science285：1569-1572(1999))。

实施例4

Hph-1-FITC的局部给药

皮肤：无毛小鼠的皮肤用丙酮冲洗，将Hph-1-FITC和油膏的混合物应用于小鼠的背部。2小时之后，对小鼠皮肤样品切片并通过共聚焦显微镜法分析荧光的存在。

眼：PBS溶液中的Hph-1-FITC滴在大鼠的眼上，给药后30min和120min之后，在眼的冻干切片中通过共聚焦显微镜法检测FITC荧光。

鼻：FITC偶联的Hph-1-FITC溶液通过气管内滴注递送入气管和肺。30min后，切除左侧主肺和气管，用PBS中的4％多聚甲醛固定并包埋于石蜡中。来自石蜡包埋的薄切片通过共聚焦显微镜法分析。

为了在用于治疗局部疾病的蛋白疗法中利用Hph-1-PTD，我们试图通过皮肤、眼或鼻气道给予FITC-标记Hph-1-PTD(图2)。与油膏混合的FITC偶联的Hph-1-PTD局部应用于无毛小鼠的皮肤。随后通过共聚焦显微镜法分析皮肤样品中荧光的存在(图2A)。当用Hph-1-PTD-FITC处理时强FITC荧光在真皮以及表皮中检出而荧光的基本水平在用对照肽处理的小鼠的皮肤中观察到。

在图2B中，PBS中的Hph-1-PTD-FITC滴于大鼠的眼上。在眼上局部给药后30和120分钟，通过共聚焦显微镜法在眼的冷冻切片中检测到FITC荧光。Hph-1-FITC能穿透视网膜和神经节细胞层通过巩膜而用对照肽处理的眼样品没有荧光。另一步骤中，通过气管内滴注将FITC偶联的Hph-1-PTD局部递送到气管和肺(图2C)。Hph-1-PTD-FITC在微支气管中以及肺血管的内皮区中检测到，并透入支气管的基底膜。

总而言之，这些结果明确显示Hph-1-PTD能在体外和体内递送大蛋白到细胞的细胞质以及细胞核。由于大蛋白通过各种局部给药途径的体内递送有效，表明功能性融合蛋白与Hph-1-PTD的组合可用作局部给药的治疗性蛋白药物。

实施例5

与CTLA-4胞质结构域融合的Hph-1-PTD对T细胞活化的抑制

通过利用Hph-1-PTD将大靶蛋白在体内通过鼻气道递送进入细胞或器官的能力，将Hph-1-PTD和CTLA-4的胞质结构域的融合蛋白(Hph-1-PTD-ctCTLA-4)如图3A所示构建，用于局部抑制哮喘模型中的免疫反应。我们构建了这样的对照蛋白，其由没有Hph-1-PTD的ctCTLA-4与Hph-1-ctCTLA-4YF组成，其中对于其负功能必要的两种酪氨酸残基被突变成苯丙氨酸。Hph-1-ctCTLA-4的转导效率在Jurkat T细胞中检测，已知其不在表面上表达CTLA-4。这些细胞用不同浓度的Hph-1-ctCTLA-4处理不同时间，通过细胞内染色分析转导效率和动力学。如图3B和3C所示，Hph-1-ctCTLA-4转导入细胞被测定为浓度依赖性的，并且细胞内Hph-1-ctCTLA-4最高水平在保温60分钟达到而不具有Hph-1-PTD的CTLA-4根本没有递送。

为了检测递送的Hph-1-ctCTLA-4是否能抑制T细胞活化，Jurkat T细胞或原代人CD4⁺T细胞用Hph-1-ctCTLA-4处理并用抗-CD28mAb和板结合的抗-CD3mAb刺激。活化诱导的表面蛋白诸如CD69和CD25的水平通过FACS分析。如图3D和3E所示，这些表面标记蛋白的诱导受到细胞内存在的Hph-1-ctCTLA-4的明显抑制。ctCTLA-4在Hph-1-PTD或Hph-1-ctCTLA-4YF突变体缺失时没有显示这些表面标记物的诱导的抑制。Jurkat

T细胞和原代人CD4⁺T细胞容易在对用抗-CD3和抗-CD28mAbs刺激的反应中产生大量IL-2，且如预期的那样10nM CsA(环孢素A)或FK506抑制的IL-2分泌。Hph-1-ctCTLA-4向Jurkat或人CD4⁺T细胞的细胞内递送可以浓度依赖性方式在皮摩尔范围内抑制Il-2分泌的诱导，10pM Hph-1-ctCTLA-4的抑制水平与利用10nM CsA相比更好或相等(图3F和3G)。T细胞活化的抑制的相当水平通过浓度比CsA低1000倍的Hph-1-ctCTLA-4实现。如前报道，在TcR刺激之后包括Zap70，ERK和JNK的各种细胞内信号介导物对酪氨酸磷酸化的诱导在将Hph-1-ctCTLA-4递送入T细胞中时受到明显抑制(Lee K.M.，et al.，Science 282：2263-2266(1998)；Lee K.M.，etal.，J.Immunol.168：4420-4429(2002)；Calvo C.R.，et al.，J.Exp.Med.186：1645-1653(1997)；Kwon H.J.，et al.，J.Immunol.173：6645-6653(2004)；and Brunner M.C.，et al.，J.Immunol.162：5813-5820(1999))。然而，不含有Hph-1-PTD的ctCTLA-4或Hph-1-ctCTLA-4YF阻断IL-2分泌。这些结果显示(1)在10pM浓度下，Hph-1-PTD对CTLA-4的胞质结构域的递送有效阻断T细胞活化；以及(2)CTLA-4胞质结构域中的两个酪氨酸残基对于其抑制功能而言是必需的(Emma L.M.，et al.，J.Immunol.164：5319-5327(2000)；和Thompson C.B.&Allison J.P.，Immunity 7：445-450(1997))。

实施例6

Hph-1-ctCTLA-4抑制OVA-诱导的气道炎症

为了确定Hph-1-ctCTLA-4-eGFP融合蛋白是否能在小鼠中通过气管内滴注有效递送入气管和肺，支气管肺泡灌洗(BAL)液中的细胞在经鼻给药Hph-1-ctCTLA-4-eGFP融合蛋白12小时之后收集，其荧光通过FACS分析。如图4A和4B所示，大量BAL细胞eGFP阳性。Hph-1-ctCTLA-4-eGFP融合蛋白通过鼻气道的体内转导效率为剂量依赖性的，但仅仅在用ctCTLA-4-eGFP处理的小鼠的细胞中检测到基本水平的荧光。Hph-1-ctCTLA-4-eGFP融合蛋白转导入BAL液中的CD3⁺T细胞被进一步分析。高水平eGFP在鼻内滴注Hph-1-ctCTLA-4-eGFP的小鼠的大多数CD3⁺T细胞中检测到(图4C)。根据肺组织的组织学分析，Hph-1-ctCTLA-4-eGFP的递送是明显的(数据未显示)。这些结果表明CTLA-4胞质结构域可通过Hph-1-PTD有效地经由鼻气道递送入BAL细胞。

为了研究通过鼻气道递送的Hph-1-ctCTLA-4蛋白是否能在体内抑制支气管哮喘的发展，小鼠哮喘模型通过免疫和OVA气道攻击来产生。OVA攻击之后，炎性细胞包括嗜酸性细胞，巨噬细胞以及中性粒细胞以及BAL液中的淋巴细胞的数目明显升高。这些小鼠用25μgHph-1-ctCTLA-4鼻内预处理显示可防止这些炎性细胞浸润进入BAL液，达到在PBS攻击的对照组中观察到的水平。但Hph-1-ctCTLA-4YF突变体不显示这些抑制效应(图4D)。

为了评估Hph-1-ctCTLA-4对OVA-诱导的炎性细胞因子分泌的抑制作用，我们测定了OVA攻击的小鼠的BAL液中趋化因子诸如嗜酸细胞活化趋化因子以及Th2细胞因子包括IL-5，IL-6，IL-13和Th1细胞因子(IFN-γ，TGF-β)的水平(图4E)。OVA攻击导致所有细胞因子的分泌明显增加。用25μg ofHph-1-ctCTLA-4单次预处理OVA攻击的小鼠抑制嗜酸细胞活化趋化因子和Th2型细胞因子的产生，但不影响IFN-γ和TGF-β的产生。与图4D中的结果一致，对于接受缺乏Hph-1的CTLA4或Hph-1-ctCTLA-4YF的小鼠中这些Th2细胞因子的产生没有抑制。肺中的炎性指标在用Hph-1-ctCTLA-4预处理的OVA攻击的小鼠中明显降低，但用Hph-1-ctCTLA-4YF预处理的小鼠中不降低(图4F)。

利用肺组织进行组织学检查时，确定OVA攻击诱导的炎性细胞浸润进入气道和肺血管周围的支气管周组织。许多含有上皮细胞的粘液也被注意到(图4G)。炎性细胞不能通过粘液浸润在用Hph-1-ctCTLA-4处理的小鼠中。令人吃惊的是，Hph-1-ctCTLA-4的这些体外和体内抑制效应在递送Hph-1-ctCTLA-4-YF时没有观察到。这显然表明Hph-1-ctCTLA-4的抑制效应对于ctCTLA-4完全特异。

用OVA致敏导致气道高反应性明显提高，如通过与接受盐水吸入的小鼠相比吸入物化醋甲胆碱之后更多的延长的暂停来评估(图5)。对醋甲胆碱的OVA诱导的高反应性水平被Hph-1-ctCTLA-4明显降低，但没有被不具有Hph-1-PTD的CTLA4或Hph-1-ctCTLA-4YF降低。

最近，有两篇报道称腹腔内给药Tat-PTD和类型IA PI3K调节亚基(TAT-dnp85)或Ras(TAT-dnRas)的优势阴性形式(dominant negative form)的融合蛋白有效减弱抗原诱导的嗜酸细胞活化趋化因子气道浸润，降低BALF中Th2细胞因子浓度，并阻断对醋甲胆碱的气道高反应性(Myou S.，et al.，J.Exp.Med.198：1573-1582(2003)；和Myou S.，et al.，J.Immunol.171：4379-4384(2003))。在这些报道中，动物从第一次OVA致敏期开始每12小时接受ip注射TAT-dnp85(10mg/kg)和TAT-dnRas(10mg/kg)。但在抗原攻击之后，TAT-dnp85和TAT-dnRas对中性粒细胞和巨噬细胞迁移进入气道没有影响。与该结果相反，本发明的Hph-1-PTD-ctCTLA-4有效抑制中性粒细胞和巨噬细胞浸润以及其他炎性细胞，并且该抑制效应通过单次经鼻给药仅仅大约1mg/kg Hph-1-ctCTLA-4在第一次OVA攻击期之前即可实现。

我们的结论是利用新Hph-1-PTD经鼻给药CTLA-4胞质结构域有效阻断过敏反应，炎性细胞诸如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的浸润，抗原致敏的小鼠中Th2型细胞因子的分泌。该处理显示也诱导对醋甲胆碱的气道高反应性。

实施例7

通过与CTLA-4胞质结构域融合的Tat-PTD抑制T细胞活化

为了检验与CTLA-4胞质结构域融合的Tat-PTD(Tat-PTD-ctCTLA-4-4)对T细胞活化的抑制，用抗CD-3和抗CD-28mAB刺激的Jurkat T细胞用Tat-PTD-ctCTLA-4-4处理，分泌的IL-2水平利用ELISA试剂盒测定(BDBioscience Cat.No.555190)。本发明术语″Tat-PTD-ctCTLA-4″和″Tat-ctCTLA-4″可互换使用。

抗-CD3和抗-CD25mAb刺激的Jurkat T细胞以密度2×10⁵细胞分布于96孔板上，每个孔都用浓度10pM，1pM，或0.1pM的Tat-PTD-ctCTLA-4处理。所述板在37℃保温过夜。

收集的每孔上清加入4ng/ml抗人IL-2抗体包被的微孔板中，室温用含有10％FBS的PBS封闭1小时，洗涤。去除介质，加入1.6ng/ml生物素化的抗人IL-2抗体和抗生物素辣根过氧化物酶偶联物1小时。用含有0.02％Tween-20的PBS洗涤板之后，将100μl底物溶液加入30min。为了终止反应，加入2N H₂SO₄溶液并测定在450nm的吸光度(图6)。

图6显示Tat-ctCTLA-4向Jurkat T细胞的细胞内递送能以浓度依赖方式在皮摩尔浓度范围抑制IL-2分泌的诱导，1pM Tat-ctCTLA-4的诱导水平与10nM环孢素相比更好或相等(图6)。因此，利用浓度低10,000倍的Tat-ctCTLA-4可实现与环孢素相当的T细胞活化抑制水平。

实施例8

Mph-1-PTD-ctCTLA-4用于类风湿性关节炎

Mph-1-PTD-ctCTLA-4的免疫抑制作用利用类风湿性关节炎(RA)动物模型分析通过腹腔内给药II型胶原蛋白来分析。

RA-诱导的小鼠通过每天静脉内给予4μg或400ng小鼠Mph-1-PTD-ctCTLA-4，以及与关节肿胀有关的关节炎的指标，TNF-α，以及CD4⁺和CD8⁺T细胞的数目分析。

小鼠一经治疗，从炎症恢复。关节炎指标和炎性细胞因子TNF-α水平(分别见图7和8)降低而脾和肺中的CD4+和CD8+T细胞数目增加(图9)。CIA是阴性对照，并代表患有胶原蛋白诱导的关节炎的小鼠，其没有用治疗剂治疗。MTS是阳性对照，表示用甲氨蝶呤治疗的小鼠，甲氨蝶呤是常用的RA治疗物质。

实施例9

抑制遗传性过敏症(atopic)动物中炎症的方法

遗传性过敏症(atopy)被认为是干草热的犬科等同疾病。遗传性过敏症是自身免疫疾病，其中Th2型CD4⁺淋巴细胞在过敏性疾病的发病中起重要作用。本实施例显示通过抑制T细胞中细胞因子的表达抑制遗传性过敏症动物中的炎症。

雄性无毛大鼠(n＝3/组，Jung-Ang Animal，Korea)接受缺镁饮食。大鼠喂以Altromin(Lage，Germany)，这是标准低镁维持饮食，并为其提供去离子水。通常，血清中的镁在饮食开始后15天降低到最低水平，疾病的开始在8±2天观察到。10天之后，所有动物显示背部强红斑以及双耳垂肿胀。

Mph-1-ctCTLA4应用在饮食第11天开始。对于局部给药，将Mph-1-ctCTLA4溶于5％甘油溶液。

异位性皮炎诱导的大鼠通过透皮给药500μg/大鼠的Mph-1-ctCTLA4每周三次、共三周来处理。对照动物以相同方式用载体处理。

分析临床得分和TEWL(透表皮水分丢失)并观察遗传性过敏症动物中炎症的抑制。

图11显示皮炎得分在用Mph-1-ctCTLA4处理的大鼠中较低。与对照大鼠相比，用Mph-1-ctCTLA4处理的大鼠的TEWL也降低(见图12)。

实施例10

在胰岛移植中抑制移植物排斥的方法

利用胶原酶消化的方法以及自供体的Ficoll纯化(Lewis大鼠)分离胰岛。分离的胰岛通过链脲霉素诱导的糖尿病大鼠的门静脉植入肝(FisherDM rat，Asan medical center)。

动物(n＝3大鼠/组)每天接受腹腔内注射的PBS(阴性对照)，5mg/kg环孢素，4μg/kg Mph-1-ctCTLA4，40μg/kg Mph-1-ctCTLA4或5mg/kg环孢素加上4μg/kg Mph-1-ctCTLA4，共15天。

每天检测血液葡萄糖水平。当葡萄糖水平是200mg/dL时，动物被认为经历移植物排斥。结果显示于下表。

Mph-1-ctCTLA4对胰岛异种移植(Lewis到Fisher)之后移植物存活的影响

组	数目	平均生存天数
组	数目	平均生存天数	阴性对照	3	5±2
环孢素(5mg/kg)	3	6.8±2.1	阴性对照	3	5±2
环孢素(5mg/kg)	3	6.8±2.1	Mph-1-ctCTLA4(4μg/kg)	3	14.2±6.5
Mph-1-ctCTLA4(40μg/kg)	3	82.5±12.6	Mph-1-ctCTLA4(4μg/kg)	3	14.2±6.5
Mph-1-ctCTLA4(40μg/kg)	3	82.5±12.6	环孢素(5mg/kg)+Mph-1-ctCTLA4(4μg/kg)	3	＞100

实施例11

Hph-1-ζ-链抑制T细胞活化

ξ链是16-kDa分子，由非常短的细胞外结构域，跨膜区，以及长细胞浆尾组成，其含有三个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。其通常作为同源二聚体存在，从而在TCR复合体中的两条ξ链上存在6个磷酸化位点或ITAM。CD3ξ作为跨膜信号分析在T淋巴细胞中起作用。

具有Hph-1和ζ-链的偶联物递送入活化T细胞并抑制ζ-链的磷酸化，因为所述偶联物与存在TcR复合体上的ζ-链竞争。

为了检验Hph-1-ζ-链对T细胞活化的抑制，用抗-CD3和抗-CD28mAb刺激的Jurkat T细胞用Hph-1-ζ-链处理，利用ELISA试剂盒(BD BiosciencesCat.No.555190)测定分泌的IL-2水平。

抗-CD3和抗-CD25mAb刺激的Jurkat T细胞以密度2×10⁵细胞分布在96-孔板上，然后用10nM Hph-1-ζ-链处理每个孔。所述板在37℃保温过夜。

每个孔中的收集的上清加入用4ng/ml抗人IL-2抗体包的微孔板，用含有10％FBS的PBS室温封闭1小时并洗涤。去除介质，加入抗人IL-21.6ng/ml生物素化抗体和链霉抗生物素辣根过氧化物酶偶联物，保持1小时。含有0.02％Tween-20的PBS洗涤板之后，加入100μl底物溶液保持30min。为终止反应，将2N H₂SO₄溶液加入，测定在450nm的吸光度(图10)。

图10显示Hph-1-ζ-链向Jurkat T细胞中的细胞内递送能抑制纳摩尔范围内的IL-2分泌诱导。

序列表

<110>为人技术株式会社(ForHuman Tech Co.Ltd.)

<120>将融合多肽递送入细胞的方法

<130>2435.002PC01/EKS/GLL

<140>To Be Assigned

<141>Herewith

<150>60/733,183

<151>2005-11-04

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg

1 5 10

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>Mouse

<400>2

Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg

1 5 10

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>Mouse

<400>3

Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg

1 5

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>HIV viral

<400>4

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210>5

<211>16

<212>PRT

<213>Drosophila

<400>5

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210>6

<211>34

<212>PRT

<213>virus HSV-1

<400>6

Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr

1 5 10 15

Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro

20 25 30

Val Glu

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>Mouse

<400>7

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210>8

<211>26

<212>PRT

<213>Mouse

<400>8

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

1 5 10 15

Ala Ala Ala Asp Gln Asn Gln Leu Met Pro

20 25

<210>9

<211>21

<212>PRT

<213>Mouse

<400>9

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210>10

<211>21

<212>PRT

<213>Mouse

<400>10

Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210>11

<211>36

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>ctCTLA-4

<400>11

Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys

1 5 10 15

Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe

20 25 30

Ile Pro Ile Asn

35

<210>12

<211>114

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>zeta-chain

<400>12

Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln

1 5 10 15

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

20 25 30

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

35 40 45

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

50 55 60

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

65 70 75 80

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

85 90 95

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

100 105 110

Pro Arg

<210>13

<211>34

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>ITAM A

<400>13

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

1 5 10 15

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

20 25 30

Arg Arg

<210>14

<211>32

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>ITAM B

<400>14

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

1 5 10 15

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

20 25 30

<210>15

<211>29

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>ITAM C

<400>15

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

1 5 10 15

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

20 25

<210>16

<211>95

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>PD-1

<400>16

Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu

1 5 10 15

Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu

20 25 30

Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys

35 40 45

Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met

50 55 60

Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser

65 70 75 80

Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

85 90 95

<210>17

<211>265

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>eGFP

<400>17

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser

225 230 235 240

Gly Arg Thr Gln Ile Ser Ser Ser Ser Phe Glu Phe Cys Ser Arg Arg

245 250 255

Tyr Arg Gly Pro Gly Ile His Arg Ile

260 265

<210>18

<211>653

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>beta-Gal

<400>18

Met Glu Leu Trp Lys Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Asn Phe Cys Ile

1 5 10 15

Gln Ser Glu Gly Ile Val Arg Thr Ser Tyr Gly Asn Trp Asn Ile Pro

20 25 30

Lys Ile Gly Asp Arg Asn Ile Pro Ser Phe Leu Ile Asp Glu Ser Lys

35 40 45

Asn Gln Phe Leu Leu Asp Gly Leu Pro Phe Arg Tyr Ile Ser Gly Ser

50 55 60

Ile His Tyr Phe Arg Ile Pro Arg Asp Arg Trp Asp Glu Arg Leu Gly

65 70 75 80

Lys Val Arg Ala Leu Gly Phe Asn Ala Ile Gln Tyr Tyr Ile Pro Trp

85 90 95

Asn Met His Glu Leu Glu Glu Gly Asn His Asp Phe Ser Gly Leu Leu

100 105 110

Asp Phe Ala Glu Phe Ser Met Met Ala Phe His Lys Tyr Gly Leu Trp

115 120 125

Thr Ile Leu Arg Val Gly Pro Tyr Ile Cys Gly Glu Leu Glu Asn Gly

130 135 140

Gly Leu Pro Trp Trp Leu Leu Asn Lys Asn Val Thr Lys Gln Arg Ser

145 150 155 160

Ser Asp Arg Val Phe Thr Arg Glu Val Glu Asn Trp Phe Glu Ile Leu

165 170 175

Leu Pro Arg Val Lys Pro Leu Leu Arg Lys Asn Gly Gly Pro Val Leu

180 185 190

Met Leu Gln Ile Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr Asp Ala Cys Asp Gln

195 200 205

Gln Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Asp Leu Thr Arg Ser Leu Val Gly Asp

210 215 220

Asp Val Leu Leu Phe Thr Thr Asp Gly Ser Ala Glu Ser Leu Leu Lys

225 230 235 240

Cys Gly Thr Val Glu Gly Val Phe Pro Thr Val Asp Phe Gly Pro Thr

245 250 255

Asp Asp Ala Lys Glu Ile Glu Asn Asn Phe Lys Leu Gln Arg Lys Phe

260 265 270

Ala Pro Asn Gly Pro Leu Val Asn Ser Glu Tyr Tyr Pro Gly Trp Leu

275 280 285

Val Leu Trp Gly Gln Lys Lys Gln Asn Leu Pro Ser Pro Gln Thr Ile

290 295 300

Ile Asn Gly Ser Gln Thr Met Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Phe Asn Tyr

305 310 315 320

Tyr Met Ile His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Phe Trp Asn Gly Ala Glu

325 330 335

Thr Glu Ala Pro Cys Ile Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Ile Ser

340 345 350

Glu Ser Gly Asp Val Thr Thr Lys Tyr Leu Glu Ile Arg Lys Trp Ile

355 360 365

Lys Gly Leu Thr Asp Trp Pro Thr Pro Pro Leu Asp Val Pro Gly Asn

370 375 380

Ser Pro Lys Gly Arg Phe Gly Lys Ile Lys Met Arg Leu Val His Ser

385 390 395 400

Val Glu Lys Leu Lys Thr Leu Thr Ser Leu Gly Asp Pro Gly Asp Cys

405 410 415

Val Glu Thr Asp Lys Pro Ile Ser Phe Glu Thr Leu Lys His Pro Leu

420 425 430

Gly Leu Val Ala Tyr Gln Ala Lys Ile Asn Ser Cys Gly Asn Leu Thr

435 440 445

Ile Pro Ser Phe Gly Asp Phe Val His Val Tyr Leu Asn Gly Lys Tyr

450 455 460

Ile Asp Thr Leu Thr Arg Arg Tyr Tyr Asn Leu Thr Arg Asn Ser Val

465 470 475 480

Ile Ile Glu Gly Cys Leu Glu Asn Glu Glu Asn Arg Leu Phe Met Leu

485 490 495

Val Glu Asn Gln Gly Arg Lys Thr Phe Glu Thr Ile Asn Asp Arg Lys

500 505 510

Gly Ile Leu Ser Asp Val Phe Met Asn Gly Gln Ala Ile Gln Phe Trp

515 520 525

Thr Gln Cys Gly Ile Lys Leu Pro Leu Gln Glu Asp Phe Tyr Phe Arg

530 535 540

Lys Ala Met Arg Asn Asn Tyr Arg Lys Asn Val Lys Ser Asn Gln Lys

545 550 555 560

Gln Gly Val Phe Ile Gly Ile Leu Ser Val Asp Ala Pro Thr Asp Thr

565 570 575

Trp Leu Asp Thr Thr Gly Trp Gly Lys Gly Ile Ala Ile Val Asn Gly

580 585 590

Arg Asn Phe Gly Arg Tyr Trp Pro Thr Lys Gly Pro Gln Met Thr Leu

595 600 605

Tyr Ile Pro Ala Glu Phe Leu Lys Ile Gly Glu Asn Ser Val Met Met

610 615 620

Val Glu Leu Glu Gly Ala Glu Glu Ala Cys Thr Ser Thr Ser Ser Cys

625 630 635 640

Ile Ala Asp Phe Ile Asp His Pro Val Phe Asp Phe Gln

645 650

Claims

1.抑制患有自身免疫性疾病或炎性疾病的脊椎动物中T细胞活化的方法，包括给予所述脊椎动物治疗有效量的融合多肽，所述融合多肽包含蛋白转导结构域(PTD)和受体蛋白的胞质结构域。

2.权利要求1的方法，其中所述自身免疫性疾病选自以下疾病组成的组：类风湿性关节炎，骨性关节炎，反应性关节炎，银屑病性关节炎，干草热，遗传性过敏症，多发性硬化，干燥综合征，结节病，胰岛素依赖型糖尿病，自身免疫性甲状腺炎，强直性脊柱炎，和硬皮病。

3.权利要求1的方法，其中所述炎性疾病是哮喘。

4.权利要求1的方法，其中所述蛋白转导结构域来自转录因子。

5.权利要求4的方法，其中所述蛋白转导结构域包含氨基酸序列SEQID NO：1。

6.权利要求1的方法，其中所述蛋白转导结构域包含选自下组的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：2；

(ii)SEQ ID NO：3；

(iii)SEQ ID NO：4；

(iv)SEQ ID NO：5；

(v)SEQ ID NO：6；

(vi)SEQ ID NO：7；

(vii)SEQ ID NO：8；

(viii)SEQ ID NO：9；和

(ix)SEQ ID NO：10。

7.权利要求1的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域选自下组：ctCTLA-4(SEQ ID NO：11)，ζ-链(SEQ ID NO：12)，ITAM A(SEQ ID NO：13)，ITAM B(SEQ ID NO：14)，ITAM C(SEQ ID NO：15)，和PD-1(SEQ IDNO：16)。

8.权利要求1的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：11。

9.权利要求1的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域包含选自下组的氨基酸序列：ζ-链(SEQ ID NO：12)，ITAM A(SEQ ID NO：13)，ITAM B(SEQ ID NO：14)，ITAM C(SEQ ID NO：15)，和PD-1(SEQ ID NO：16)。

10.权利要求1的方法，其中所述融合多肽以皮摩尔浓度应用。

11.权利要求1的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域与氨基酸序列SEQ ID NO：11至少95％相同。

12.权利要求1的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：ζ-链(SEQ ID NO：12)，ITAM A(SEQ IDNO：13)，ITAM B(SEQ ID NO：14)，ITAM C(SEQ ID NO：15)，和PD-1(SEQ IDNO：16)。

13.权利要求1的方法，其中所述融合多肽经静脉内给药。

14.抑制脊椎动物中的移植物排斥的方法，包括给予所述脊椎动物治疗有效量的融合多肽，所述融合多肽包含蛋白转导结构域(PTD)和受体蛋白的胞质结构域，其中所述移植物排斥在胰岛移植中。

15.权利要求14的方法，其中所述蛋白转导结构域来自转录因子。

16.权利要求15的方法，其中所述蛋白转导结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。

17.权利要求14的方法，其中所述蛋白转导结构域包含选自下组的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：2；

(ii)SEQ ID NO：3；

(iii)SEQ ID NO：4；

(iv)SEQ ID NO：5；

(v)SEQ ID NO：6；

(vi)SEQ ID NO：7；

(vii)SEQ ID NO：8；

(viii)SEQ ID NO：9；和

(ix)SEQ ID NO：10.

18.权利要求14的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：11。

19.权利要求14的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：12。

20.权利要求14的方法，其中所述融合多肽以皮摩尔浓度应用.

21.权利要求14的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域与氨基酸序列SEQ ID NO：11至少95％相同。

22.权利要求14的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域与氨基酸序列SEQ ID NO：12至少95％相同。

23.权利要求22的方法，其中所述融合多肽经腹腔内给药。

24.将生物分子转导复合物(BTC)递送到气管或肺细胞的方法，包括经鼻内将生物分子转导复合物给药脊椎动物，其中所述生物分子转导复合物包括蛋白转导结构域(PTD)和目的分子。

25.权利要求24的方法，其中通过气管内滴注给药所述生物分子转导复合物。

26.权利要求24的方法，其中所述生物分子转导复合物包含来自转录因子的蛋白转导结构域。

27.权利要求26的方法，其中所述蛋白转导结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。

28.权利要求24的方法，其中所述蛋白转导结构域包含选自下组的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：2；

(ii)SEQ ID NO：3；

(iii)SEQ ID NO：4；

(iv)SEQ ID NO：5；

(v)SEQ ID NO：6；

(vi)SEQ ID NO：7；

(vii)SEQ ID NO：8；

(viii)SEQ ID NO：9；和

(ix)SEQ ID NO：10。

29.权利要求24的方法，其中所述目的分子是受体蛋白的胞质结构域。

30.权利要求29的方法，其中所述受体蛋白的胞质结构域选自下组：ctCTLA-4(SEQ ID NO：11)，ζ-链(SEQ ID NO：12)，ITAM A(SEQID NO：13)，ITAM B(SEQ ID NO：14)，ITAM C(SEQ ID NO：15)，和PD-1(SEQ ID NO：16)。

31.权利要求24的方法，其中所述目的分子选自下组：

(i)eGFP(SEQ ID NO：17)；和

(ii)β-gal(SEQ ID NO：18)。

32.权利要求24的方法，其中所述目的分子与氨基酸序列SEQ IDNO：11至少95％相同。

33.权利要求24的方法，其中所述目的分子与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：ζ-链(SEQ ID NO：12)，ITAM A(SEQ ID NO：13)，ITAM B(SEQ ID NO：14)，ITAM C(SEQ ID NO：15)，和PD-1(SEQ ID NO：16)。