CN108314721B - 人Wnt5a-NL核酸重组体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型的人Wnt5a‑NL核酸重组体及其制备方法与应用。本发明的人Wnt5a‑NL核酸重组体是将如SEQ ID NO:1所示的人Wnt5a蛋白截短体编码基因构建到真核表达载体上得到的重组质粒。实验表明，人Wnt5a‑NL核酸重组体注射小鼠能够抑制炎症和骨破坏，可开发用于治疗类风湿关节炎等疾病。本发明提供的核酸重组体属于治疗性质粒，可为类风湿关节炎等疾病提供一种新的治疗途径和思路。该核酸重组体治疗效果良好，且制备简单、成本低廉、稳定性好、贮存方便，适于规模化生产。

Description

人Wnt5a-NL核酸重组体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种人Wnt5a-NL核酸重组体及其制备方法与应用。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种能够导致全身性骨丢失和骨折风险增加的慢性炎症性疾病。其骨影像学可表现为关节周围骨质疏松和边际糜烂。病理学检测结果可出现侵蚀性滑膜炎、关节软骨和骨组织侵蚀性破坏。疾病早期关节周围的骨流失和后来发展的边际糜烂会造成关节周围骨质疏松，进而出现全身性骨密度降低。骨流失作为RA的并发症，在局部和全身都会发生，这会增加骨折风险。近年有报道提示，无翅(wingless,WNT)信号通路的激活可以通过刺激炎症滑膜关节中骨免疫细胞的活化而加速骨吸收。

Wnt5a是一种分泌型糖蛋白，据报道，Wnt5a基因编码外显子1a和1b两种异构体，这种转录基于如核因子κB(nuclear factor-k B,NF-κB)、转化生长因子β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)、Notch和Hedgehog信号等多种机制的参与。与其他Wnts蛋白类似，Wnt5a蛋白需要两个重要的翻译后修饰才能获得完全的功能。Wnt5a蛋白的棕榈酰化和糖基化是其与特定受体结合和介导分泌的必要步骤。分泌型Wnt5a蛋白总是被脂质修饰而具有疏水性。由于这种独特的翻译后修饰，增加了研究内源性Wnt5a蛋白溶解性和生化特征的障碍。

Wnt5a作为非经典Wnt蛋白家族的一个成员，主要激活非经典Wnt信号转导途径，包括Wnt-Ca²⁺和Wnt-PCP通路。例如，Wnt5a可以与Ror2结合，诱导细胞内JNK信号的转导和活化，同时抑制经典β-catenin通路。另外，也有报道显示Wnt5a可以结合FZ-4受体激活β-catenin通路。Wnt5a的这种双信号活性可能是由于其不同的结构域能结合和激活特定的受体。获得Wnt5a活性蛋白和解析晶体结构的困难，以及可结合受体的多样性，都对全面了解其功能造成了极大的困难。

近年来，Wnt5a在类风湿关节炎中的作用受到重视。Maeda和他的同事在自然医学(nature medicine)杂志上报道，骨细胞之间Wnt5a-Ror2的交叉对话，能够增强骨吸收，从而负向调节骨骼平衡。另外，成骨细胞和破骨细胞前体之间Wnt5a/Ror2/JNK信号通路的相互作用可以增强小鼠破骨细胞的分化和骨吸收。通过对Wnt受体-配体在成骨细胞和骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophages,BMMs)中表达谱的比较，Maeda等人发现，成骨细胞系细胞自分泌表达高水平的Wnt5a和Ror2，破骨细胞前体细胞表达Ror2而非Wnt5a。令人惊讶的是，Wnt5a和Ror2单倍型缺失鼠导致的骨量改变是相反的。Wnt5a的杂合子小鼠骨形成和骨吸收均减少，导致骨质疏松；而敲除一个Ror2等位基因却能够减少骨吸收，增加骨体积。成骨细胞和破骨细胞前体之间的Wnt5a-Ror2信号可以增强破骨细胞的形成，这是由于Wnt5a显著增加了RANK配体(RANKL)依赖的破骨细胞分化，这种效果在没有Ror2作用下是无效的。Wnt5a-Ror2信号通过激活破骨前体细胞增强JNK活性，并招募c-Jun到编码RANK的基因启动子，促进RANK的表达，从而提高RANKL诱导的破骨细胞形成。经典的共培养实验表明，成骨细胞分泌的Wnt5a，是野生型破骨细胞前体分化所必须的。Wnt5a杂合子小鼠和共培养实验的结果表明，Wnt5a过多或过少都会导致骨破坏，Wnt5a过多将通过Wnt5a-Ror2通路促进破骨细胞的形成，Wnt5a过少则会抑制成骨细胞的功能，成骨细胞和破骨细胞功能失衡就会造成骨破坏。但是，通过我们的实验发现，Wnt5a作用于成骨细胞参与骨形成时并不依赖于Ror2的功能，Wnt5a可以单独作为类风湿关节炎等骨疾病治疗的靶标。应用Wnt5a核酸重组体干扰相关信号通路或作为调节异常免疫应答的分子，可以延缓RA等骨破坏疾病的进展，具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种人Wnt5a-NL核酸重组体及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种人Wnt5a蛋白截短体，所述蛋白截短体为：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或

iii)在i)或ii)的N端连接信号肽得到的融合蛋白；或

iv)i)～iii)任一氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

所述人Wnt5a蛋白截短体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供含有所述人Wnt5a蛋白截短体的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系。

本发明还提供一种人Wnt5a-NL核酸重组体，其是将SEQ ID NO:2所示的核酸序列或SEQ ID NO:2所示核酸序列5′端添加信号肽序列后构建到真核表达载体上得到的重组质粒。

优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明中所用真核表达载体包括但不限于pCMV6-XL5。

人Wnt5a-NL核酸重组体的制备方法，将SEQ ID NO:4所示的核酸序列构建到真核表达载体(如pCMV6-XL5)上，将获得的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，经菌体扩增培养，提取质粒，即得人Wnt5a-NL核酸重组体。

本发明还提供所述人Wnt5a蛋白截短体、其编码基因、含有所述编码基因的生物材料或所述人Wnt5a-NL核酸重组体在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。

本发明进一步提供一种治疗类风湿关节炎的药物，有效成分选自所述人Wnt5a蛋白截短体、其编码基因、含有所述编码基因的生物材料或所述人Wnt5a-NL核酸重组体中的至少一种。

本发明提供一种新型的人Wnt5a核酸重组体，其核酸序列为编码人Wnt5aN末端连接区(NTD-Linker,NL)(125-273aa,SEQ ID NO:1)的片段。Wnt5a是RA的致病因子，在炎症和骨破坏中均有重要的致病作用。本发明的人Wnt5a核酸重组体丧失了其天然蛋白的致病特征，具有了保护RA的功效。

真核表达载体是制备核酸重组体的主体，其表达蛋白能力的强弱，主要取决于其启动子的强弱。一般认为含有巨细胞病毒(CMV)启动子的载体表达水平高，因此应用的最为广泛。本发明选用的真核表达载体pCMV6-XL5，含有CMV启动子，保证了目的基因在肌肉细胞中的高效表达。

实验表明，本发明的人Wnt5a核酸重组体能够在肌肉组织中进行有效表达，减轻胶原诱导关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)小鼠病情严重程度，缓解炎症和骨破坏，可用于治疗类风湿关节炎等炎症性骨病。

本发明的人Wnt5a核酸重组体为类风湿关节炎等疾病提供了一种新的治疗途径和思路。该核酸重组体治疗效果良好，且制备简单、成本低廉、稳定性好、贮存方便，适于规模化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中人Wnt5aN末端连接区(NTD-Linker)的序列示意图和所用表达载体的图谱。

图2为本发明实施例1中人Wnt5a核酸重组体双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，泳道1：DNA分子量Marker；泳道2：重组质粒phWnt5a-NL双酶切鉴定(EcoR I、Xbal I)。

图3为本发明实施例1中人Wnt5a核酸重组体的测序图谱。

图4本发明实施例3中人Wnt5a核酸重组体体外表达情况；其中，泳道1：蛋白分子量Marker；泳道2：转染phWnt5a-NL的293T细胞总蛋白提取物。

图5为本发明实施例3中免疫组化检测人Wnt5a核酸重组体体内表达情况(bar＝100μm)，其中，左图为空质粒对照的肌组织，右图为转染phWnt5a-NL的肌组织。

图6为本发明实施例4中人Wnt5a核酸重组体注射胶原诱导关节炎(CIA)小鼠及CIA小鼠模型制备的流程示意图，其中横线上方箭头表示的是注射人Wnt5a核酸重组体的时间，横线下方箭头表示的是注射CⅡ制备CIA模型鼠的时间。

图7(a)～图7(g)为本发明实施例5中人Wnt5a核酸重组体对胶原诱导关节炎小鼠保护作用的评估结果；其中，图7(a)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠代表疾病严重程度的关节评分和肿胀度的变化；图7(b)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠组织学染色观察炎症细胞浸润程度的结果(bar＝100μm)；图7(c)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠组织学染色观察炎症细胞浸润程度的评分结果；图7(d)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠组织学染色观察软骨侵蚀程度的结果(bar＝100μm)；图7(e)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠组织学染色观察软骨侵蚀程度的评分结果；图7(f)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠micro-CT检测观察骨侵蚀程度的结果；图7(g)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠micro-CT扫描测定皮质骨(左)和小梁骨(右)骨密度的结果。其中，*：p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。

图8(a)～图8(f)为本发明实施例6中人Wnt5a核酸重组体对胶原诱导关节炎小鼠保护作用机制探讨的结果；其中，图8(a)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠CD4⁺/CD8⁺T细胞比值变化的代表图片；图8(b)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠CD4⁺/CD8⁺T细胞比值变化的统计结果；图8(c)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠IgG2a/IgG1比值变化的统计结果；图8(d)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠Treg细胞数量变化的代表图片；图8(e)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠Treg细胞数量变化的统计结果；图8(f)是空质粒对照组小鼠和phWnt5a-NL组小鼠血清中IL-1β(左)和RANKL(右)水平测定结果。其中，*：p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1人Wnt5a-NL核酸重组体的构建

根据Wnt家族蛋白结构的特点，构建phWnt5a-NL核酸重组体，如图1所示，所选择的目的表达载体为pCMV6-XL5，所应用的目的片段为人Wnt5aN末端连接区(NTD-Linker,NL)(125-273aa，SEQ ID NO:1)的片段。首先，从BLAST数据库获得hWnt5a的氨基酸及cDNA全长序列，将hWnt5a氨基酸序列输入SignalP在线信号肽预测服务器，获得hWnt5a的信号肽序列(SEQ ID NO:5)。在信号肽和已选取的hWnt5a-NL区cDNA序列两端，遵照常规引物设计原则人工设计引物；在信号肽的上游引物及hWnt5a-NL片段的下游引物5'端分别添加XbaI和EcoRI限制性内切酶酶切序列；在设计信号肽的上游引物时，在酶切位点然后，ATG之前加入GCCACC(kozak)序列。用PrimerPremier 6.0软件对引物序列进行评估调整。相应的重组基因序列如SEQ ID NO:4所示，其编码蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO:3。PCR扩增目的片段hWnt5a-NL，扩增所用的引物序列如下：

信号肽上游引物：5’-ggaattccggccgccaccatgaagaagtc-3’

信号肽下游引物：5’-gcatcaccctgccttcaattacaacctgg-3’

hWnt5a-NL片段上游引物：5’-ccaggttgtaattgaaggcagggtgatgc-3’

hWnt5a-NL片段下游引物：5’-gctctagagcctactactacgcgctgtcg-3’

冰上配制PCR反应体系的混合物，轻柔混匀后随即放入PCR仪中进行反应。参照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明书对PCR产物纯化回收。参照限制性内切酶使用说明书，对PCR产物进行双酶切，并对hWnt5a-NL基因的双酶切产物进行纯化回收，获得目的基因插入片段。参照上述方法，将pCMV-XL5空质粒载体进行双酶切，并纯化回收酶切片段。将纯化好的目的片段和质粒载体进行浓度测定，按照插入片段:质粒载体(3:1)的质量比，配制T4连接酶的连接体系，室温过夜连接。参照质粒转化说明书，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞，将转化后的感受态细胞涂布含Amp⁺抗生素的LB平板，将LB平板置于37℃培养箱过夜培养。次日，LB平板上出现肉眼可见的单菌落即表明连接成功。从LB平板中挑取单克隆菌落，接种于含Amp⁺抗生素LB液体培养基中，37℃过夜培养。次日，参照质粒提取试剂盒的说明书进行质粒小提，将重组质粒进行酶切鉴定，结果如图2所示，目的片段与预期大小相符(573bp)，后进行测序，测序结果如图3所示，确认phWnt5a-NL核酸重组体构建成功。

实施例2人Wnt5a-NL核酸重组体在大肠杆菌中的扩增与提取

将转化了重组质粒的大肠杆菌接种于10mL LB培养基(含100mg/L的Amp⁺抗生素)，37℃、250rpm振荡培养过夜。次日将10mL过夜培养物转接于1L LB培养基(含100mg/L的Amp⁺抗生素)，37℃，250rpm培养至OD₆₀₀值2.0左右。离心收集菌体。参照质粒大提说明书提取重组质粒。紫外分光光度计测定DNA的浓度以及纯度，确保提取的质粒A260/A280比值在1.8-2.0之间。

实施例3人Wnt5a-NL核酸重组体的体内、体外表达情况鉴定

将实施例2制备的重组质粒瞬时转染人293T细胞，48h后收集细胞；参照蛋白提取试剂盒说明书，进行总蛋白提取；应用Western blot方法对表达产物进行体外鉴定。确保转染时细胞的汇合度为70％-90％；将1μg质粒和3μL Lipofectamine 2000转染试剂(购自Invitrogen，货号：11668-027)分别用250mL Opti-MEM稀释，再将其混合室温孵育20min。取出细胞后弃上清，PBS洗一遍，加入混好的质粒、转染试剂混合物，轻轻滴加入培养皿中。4-5h后添加DMEM完全培养基培养过夜，用完全培养基换液一次，待48h后收取细胞。参照蛋白提取说明书，提取细胞总蛋白。根据蛋白的分子量选择配制PAGE胶，分离蛋白后，转到PVDF膜上，其中，检测抗体为兔抗小鼠Wnt5a多抗(购自Abcam，货号：ab72583)(1:1000稀释)，反应条件为4℃孵育过夜；常规孵育二抗洗膜后，按配比配好ECL发光液加到PVDF膜上，静置5min后曝光。Western blot的检测结果如图4所示，phWnt5a-NL核酸重组体在体外获得成功表达。

将重组质粒注射BALB/c小鼠股四头肌，一周后处死小鼠，获得肌肉组织，进行组织化学染色，鉴定phWnt5a-NL核酸重组体在体内的表达情况。先用盐酸布比卡因(0.75％)注射于BALB/c小鼠进行预刺激；一周后再将50μg质粒分别与盐酸布比卡因混合(盐酸布比卡因稀释后浓度为0.75％)，注射于股四头肌部位。一周后，取BALB/c小鼠股四头肌肌肉，制备冰冻切片。参照试剂盒说明书进行冰冻切片的组织化学染色。其中，检测抗体为兔抗小鼠Wnt5a多抗(1:200稀释)，反应条件为4℃过夜孵育；DBA染色时，需要镜下观察阳性显色明显且无背景呈色时，终止反应。组织化学的检测结果如图5所示，棕色部位为phWnt5a-NL核酸重组体的表达部位，可见其在体内获得成功表达。

实施例4动物模型制备和人Wnt5a-NL核酸重组体注射实验

6周龄雄性DBA/1小鼠(SPF级)按体重随机分组，每组6只，适应性饲养一周后进行核酸重组体注射和胶原诱导关节炎(CIA)模型制备。核酸重组体注射流程如下(图6)：CIA造模当天计为第0天，不同时间点(-24d，-17d，-3d，14d，42d)肌内注射phWnt5a-NL核酸重组体，将phWnt5a-NL核酸重组体与QuilA佐剂、盐酸布比卡因肌松剂加生理盐水后配成混合物，每只小鼠注射100μL，其中50μg的phWnt5a-NL核酸重组体、50μg的QuilA和0.75％的盐酸布比卡因。注射前，先应用复合麻醉剂25μL，将小鼠麻醉后，剪开股四头肌，应用NEPA21高效基因转染系统仪器，将phWnt5a-NL核酸重组体注射小鼠肌肉组织，并缝合。CIA模型制备方案如下：在10mL的注射器中，将牛Ⅱ型胶原蛋白与等体积的完全弗氏佐剂(CFA)混合(终浓度为1mg/mL)，放于冰上超声乳化仪乳化，用于关节炎模型鼠的初次免疫。将牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)与等量的不完全弗氏佐剂(IFA)混合(终浓度为1mg/mL)的乳化物，用于制备关节炎模型鼠的二次免疫。乳化过程每分钟间歇30sec，防止散热过多。充分乳化至混合物呈油包水状态，注意整个乳化过程避光。2mg/mL牛Ⅱ型胶原和等体积含4mg/mL卡介苗的弗氏完全佐剂乳化后，100μL/只，距小鼠尾根部1.5cm处进行皮内注射，初次免疫记为第0天；初次免疫后21天加强免疫，免疫方法与初次免疫相同。造模过程需要注意选取的注射位置为尾部静脉两侧的白色韧带；如注射部位过深，则会影响免疫效果，如注射入血，则导致小鼠死亡。正确的注射方法应在注射过程中感觉到阻力很大，在乳化的胶原被推入的过程中，看见皮肤明显变白。如皮肤被刺破，不能继续尾部注射；则进行背部皮内多点注射。

实施例5人Wnt5a-NL核酸重组体对胶原诱导关节炎小鼠保护作用实验

CⅡ二次免疫后即开始观察小鼠的发病情况，记录关节评分并测定肿胀度，关节评分采用如下标准：0分＝无关节炎症状；1分＝足爪或一个脚趾肿和(或)红；2＝累及两个关节的肿和(或)红；3＝两个以上的关节肿和(或)红；4＝累及整个足或脚趾的严重的关节炎症状。

关节肿胀度测定使用0.2μm的游标卡尺。空质粒对照组小鼠发病初期表现单个或多个关节肿胀，继而由趾端向踝关节发展，40天达到疾病发病高峰，注射phWnt5a-NL核酸重组体的小鼠发病延迟，随时间进展疾病出现不同程度缓解，代表疾病严重程度的关节评分和肿胀度测定随时间出现明显下降，结果如图7(a)所示。48天后，断颈处死小鼠。分离各组小鼠后爪，去除皮肤和肌肉组织，尽量剥离干净，脱钙后进行组织学染色和Micro-CT断层扫描，评估各组小鼠的关节炎症细胞浸润程度、软骨和骨的侵蚀程度，并计算骨形态学参数来评估phWnt5a-NL核酸重组体对CIA小鼠的保护效果。其中，小鼠Micro-CT扫描采用上海软拓生物科技有限公司提供的SKYSCAN1172(Bruker,Belgium)小动物断层扫描设备；骨形态学参数和三位重建采用CTAnSoftware软件分析系统(Bruker,Belgium)。测量和计算的参数包括：皮质骨骨密度(Cor.BMD)，小梁骨骨密度(Tra.BMD)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁分离度(Tb.Sp)，骨体积(BV)和总组织体积(TV)。组织学染色结果显示，注射phWnt5a-NL核酸重组体的小鼠关节炎症浸润程度明显减轻，结果如图7(b)所示；炎症细胞浸润程度评分明显下降，结果如图7(c)所示。关节软骨侵蚀程度明显减轻，结果如图7(d)所示；关节软骨侵蚀程度评分明显下降，结果如图7(e)所示。Micro-CT断层扫描结果显示，注射phWnt5a-NL核酸重组体的小鼠骨破坏程度明显减轻，结果如图7(f)所示。骨形态学参数计算的结果显示，注射phWnt5a-NL核酸重组体的小鼠皮质骨(左)和小梁骨(右)的骨密度分别增加了9.0％和12.1％，结果如图7(g)所示。

实施例6人Wnt5a-NL核酸重组体保护胶原诱导关节炎小鼠的机制探讨

造模48天后，眼眶内眦静脉取血，分离血清；血清分离后，利用ELISA试剂盒检测各组小鼠IgG1、IgG2a、IL-1β和RANKL的表达量。脱颈处死各组小鼠，75％酒精浸泡5min，在超净工作台内进行后续操作，用剪刀剪开小鼠皮肤，钝性剥开皮肤，仔细寻找小鼠腹股沟和腘窝淋巴结，并用镊子取下淋巴结。置于放有PBS的无菌培养皿中洗涤，将200目尼龙筛放入另一个盛有PBS的培养皿中，并用注射器柄轻压研磨，收集细胞筛下面的细胞，制备单细胞悬液；将单细胞悬液置于15mL离心管中，1500rpm，离心5min；10mL PBS洗一遍，1500rpm，离心5min；细胞计数，接种于添加1640完全培养基的培养皿中；添加50ng/mLPMA,750ng/mLIonomycin,10mg/mL Brefeldin A来刺激和抑制蛋白转运，37℃培养4-5h。将FITC标记的大鼠抗小鼠CD4流式抗体(购自美国BD公司，货号：557307)、PE标记的大鼠抗小鼠CD8流式抗体(购自美国BD公司，货号：561048)和APC标记的大鼠抗小鼠CD25流式抗体(购自美国BD公司，货号：561048)按照1:200稀释比进行组合，4℃避光染色30min。参照固定破膜液的说明书步骤，将细胞重悬于Fixation/Permeabilization solution固定破膜液中，进行细胞固定和破膜打孔；将PE标记的大鼠抗小鼠Foxp3流式抗体(购自美国BD公司，货号560408)按照1:200稀释比进行组合，4℃避光染色30min。流式细胞术检测各组小鼠CD4⁺/CD8⁺T细胞比例变化的代表性图片如图8(a)所示，phWnt5a-NL核酸重组体组小鼠的CD4⁺T细胞下降，CD8⁺T细胞增加；统计结果显示，注射phWnt5a-NL核酸重组体的小鼠CD4⁺/CD8⁺T细胞的比值出现明显下降，结果如图8(b)所示，这提示应用phWnt5a-NL核酸重组体后CIA小鼠异常的自身免疫反应出现恢复；ELISA检测IgG1和IgG2a后计算IgG2a/IgG1的比值，结果如图8(c)所示，注射phWnt5a-NL核酸重组体的小鼠IgG2a/IgG1的比值出现明显下降，这提示应用phWnt5a-NL核酸重组体后Th2细胞比例有所上升，这也是CIA病情出现恢复的指标；流式细胞术检测各组小鼠Treg细胞变化的代表性图片如图8(d)所示，phWnt5a-NL核酸重组体组小鼠的Treg细胞数量增加；统计结果显示，注射phWnt5a-NL核酸重组体的小鼠Treg细胞数量出现增加了3.29倍，结果如图8(e)所示，这提示应用phWnt5a-NL核酸重组体后CIA小鼠病情缓解与Treg细胞数量增加有关；ELISA检测IL-1β和RANKL浓度的统计结果如图8(f)所示，注射phWnt5a-NL核酸重组体的CIA小鼠炎症因子IL-β和骨破坏分子RANKL的下降最明显。以上结果表明，phWnt5a-NL核酸重组体缓解CIA的机制可能是通过某种生物学效应，例如分子模拟或增加细胞接触，来促进Treg细胞数量的增多，进而抑制炎症和骨破坏相关因子(IL-1β和RANKL)，并且逆转疾病状态下异常的免疫应答(CD4⁺/CD8⁺T细胞比值和Th1/Th2细胞比值)来发挥治疗作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 首都医科大学

<120> 人Wnt5a-NL核酸重组体及其制备方法与应用

<130> KHP181110191.3

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Arg Val Met Gln Ile Gly Ser Arg Glu Thr Ala Phe Thr Tyr Ala

1 5 10 15

Val Ser Ala Ala Gly Val Val Asn Ala Met Ser Arg Ala Cys Arg Glu

20 25 30

Gly Glu Leu Ser Thr Cys Gly Cys Ser Arg Ala Ala Arg Pro Lys Asp

35 40 45

Leu Pro Arg Asp Trp Leu Trp Gly Gly Cys Gly Asp Asn Ile Asp Tyr

50 55 60

Gly Tyr Arg Phe Ala Lys Glu Phe Val Asp Ala Arg Glu Arg Glu Arg

65 70 75 80

Ile His Ala Lys Gly Ser Tyr Glu Ser Ala Arg Ile Leu Met Asn Leu

85 90 95

His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Arg Thr Val Tyr Asn Leu Ala Asp Val

100 105 110

Ala Cys Lys Cys His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ser Leu Lys Thr Cys

115 120 125

Trp Leu Gln Leu Ala Asp Phe Arg Lys Val Gly Asp Ala Leu Lys Glu

130 135 140

Lys Tyr Asp Ser Ala

145

<210> 2

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcagggtga tgcagatagg cagccgcgag acggccttca catacgcggt gagcgcagca 60

ggggtggtga acgccatgag ccgggcgtgc cgcgagggcg agctgtccac ctgcggctgc 120

agccgcgccg cgcgccccaa ggacctgccg cgggactggc tctggggcgg ctgcggcgac 180

aacatcgact atggctaccg ctttgccaag gagttcgtgg acgcccgcga gcgggagcgc 240

atccacgcca agggctccta cgagagtgct cgcatcctca tgaacctgca caacaacgag 300

gccggccgca ggacggtgta caacctggct gatgtggcct gcaagtgcca tggggtgtcc 360

ggctcatgta gcctgaagac atgctggctg cagctggcag acttccgcaa ggtgggtgat 420

gccctgaagg agaagtacga cagcgcg 447

<210> 3

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Lys Ser Ile Gly Ile Leu Ser Pro Gly Val Ala Leu Gly Met

1 5 10 15

Ala Gly Ser Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val Ala Leu Ala Ile

20 25 30

Phe Phe Ser Phe Ala Gln Val Val Ile Glu Gly Arg Val Met Gln Ile

35 40 45

Gly Ser Arg Glu Thr Ala Phe Thr Tyr Ala Val Ser Ala Ala Gly Val

50 55 60

Val Asn Ala Met Ser Arg Ala Cys Arg Glu Gly Glu Leu Ser Thr Cys

65 70 75 80

Gly Cys Ser Arg Ala Ala Arg Pro Lys Asp Leu Pro Arg Asp Trp Leu

85 90 95

Trp Gly Gly Cys Gly Asp Asn Ile Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Ala Lys

100 105 110

Glu Phe Val Asp Ala Arg Glu Arg Glu Arg Ile His Ala Lys Gly Ser

115 120 125

Tyr Glu Ser Ala Arg Ile Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala Gly

130 135 140

Arg Arg Thr Val Tyr Asn Leu Ala Asp Val Ala Cys Lys Cys His Gly

145 150 155 160

Val Ser Gly Ser Cys Ser Leu Lys Thr Cys Trp Leu Gln Leu Ala Asp

165 170 175

Phe Arg Lys Val Gly Asp Ala Leu Lys Glu Lys Tyr Asp Ser Ala

180 185 190

<210> 4

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaagaagt ccattggaat attaagccca ggagttgctt tggggatggc tggaagtgca 60

atgtcttcca agttcttcct agtggctttg gccatatttt tctccttcgc ccaggttgta 120

attgaaggca gggtgatgca gataggcagc cgcgagacgg ccttcacata cgcggtgagc 180

gcagcagggg tggtgaacgc catgagccgg gcgtgccgcg agggcgagct gtccacctgc 240

ggctgcagcc gcgccgcgcg ccccaaggac ctgccgcggg actggctctg gggcggctgc 300

ggcgacaaca tcgactatgg ctaccgcttt gccaaggagt tcgtggacgc ccgcgagcgg 360

gagcgcatcc acgccaaggg ctcctacgag agtgctcgca tcctcatgaa cctgcacaac 420

aacgaggccg gccgcaggac ggtgtacaac ctggctgatg tggcctgcaa gtgccatggg 480

gtgtccggct catgtagcct gaagacatgc tggctgcagc tggcagactt ccgcaaggtg 540

ggtgatgccc tgaaggagaa gtacgacagc gcg 573

<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Lys Lys Ser Ile Gly Ile Leu Ser Pro Gly Val Ala Leu Gly Met

1 5 10 15

Ala Gly Ser Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val Ala Leu Ala Ile

20 25 30

Phe Phe Ser Phe Ala Gln Val Val Ile Glu

35 40

Claims (9)

1.人Wnt5a蛋白截短体，其特征在于，所述蛋白截短体为：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或

iii)在i)或ii)的N端连接信号肽得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白截短体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系。

4.人Wnt5a-NL核酸重组体，其特征在于，其是将SEQ ID NO:2所示的核酸序列或SEQ IDNO:2所示核酸序列5′端添加信号肽序列后构建到真核表达载体上得到的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的核酸重组体，其特征在于，所述真核表达载体为pCMV6-XL5。

6.根据权利要求4所述的核酸重组体，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。

7.权利要求4所述核酸重组体的制备方法，其特征在于，将SEQ ID NO:4所示的核酸序列构建到真核表达载体上，将获得的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，经菌体扩增培养，提取质粒，即得人Wnt5a-NL核酸重组体。

8.权利要求1所述蛋白截短体、权利要求2所述基因、权利要求3所述生物材料或权利要求4-6任一所述核酸重组体在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。

9.一种治疗类风湿关节炎的药物，其特征在于，有效成分选自权利要求1所述蛋白截短体、权利要求2所述基因、权利要求3所述生物材料或权利要求4-6任一所述核酸重组体中的至少一种。

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