KR20100017494A - 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 이용한 상처 및 피부손상의 치료 - Google Patents

프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 이용한 상처 및 피부손상의 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (꼭 한정적이지는 않으나) 프로테오글리칸 폴리펩타이드 같은, 적어도 하나의 글리코스아미노글리칸 쇄를 포함하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 구조에 것으로, 글리코스아미노글리칸 쇄에 의하여 당화 폴리펩타이드 같은 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 구조를, 상처 또는 기타 피부손상의 치유를 위하여 기능성 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 생성하기 위하여 상처지점에 투여한 개체의 정상적인 생리적 과정을 통하여 상처 또는 피부손상 지점으로 전달하는 방법에 관한 것이다. 전달되는 핵산 구조는 연결된 폴리펩타이드를 생성하기 위하여 (여기에서 "연결" 또는 "글리케이션"으로 언급되는) 글리코스아미노글리칸 쇄를 추가하는 방식으로 전사, 번역, 또는 번역후 수정이 이루어진다. 연결된 폴리펩타이드는 이후 세포에서 분비되는데, 이는 개체 내에서의 상처치유 및/또는 피부손상 및/또는 개체 내에서의 피부손상의 예방을 제공하기 위하여 세포 내에서 생성되는 것이다.

Description

프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 이용한 상처 및 피부손상의 치료{WOUND AND CUTANEOUS INJURY HEALING WITH A NUCLEIC ACID ENCODING A PROTEOGLYCAN POLYPEPTIDE}
이건은 2006년 11월 28일자로 미국 특허 7,141,551로 등록된 2003년 4월 22일자 미국 출원번호 10/420,270의 계속 출원인 2006년 11월 27일자 미국 특허 출원번호 11/604,633의 계속 부분 출원이며, 2003년 4월 22일자 미국 가출원 출원번호 60/374,553에 대한 우선권과 혜택을 주장하고 있다.
본 발명은 상처 치유와 치료에 관여하는 생체분자 및 상처 치유 및 치료에 있어서 이러한 생체분자의 이용 방법 및 전달 방법에 관한 것이다.
프로테오글리칸은 (핵심단백으로 간주될 수 있는) 단백질 부분과 글리코스아미노글리칸 부분으로 구성된 분자이다. 글리코스아미노글리칸은 동물계에서 가장 광범위하게 존재하는 다당류이며 주로 결합조직 내에서 발견된다. 글리코스아미노글리칸은 우론산과 헥소시민을 구성하는 선형 이당류 단위로 구성되어 있는 생물학적 고분자이며 연결 4당류 반족을 매개로 하여 핵심단백에 붙어 있다. 주요 글리코스아미노글리칸에는 히알루론산, 황산 콘드로이친, 헤파란 황산, 황산 데르마탄 및 황산 케라탄이 있다.
(한정적이지는 않으나) 용매화 및 생물 조직과 구조 사이의 상호작용 같은 물리화학적 성상은, 적어도 부분적으로는, 글리코스아미노글리칸 쇄 내의 카복실산 및/또는 황 군의 존재와 관련되어 있다. 글리코스아미노글리칸 쇄는 상당량의 음전하를 프로테오글리칸 단백질에 전달할 수 있다. 정렬된 황화 글리코스아미노글리칸 쇄는, 물속에서 무게의 여러 배를 유지하는 방식의 하이드로겐 본딩을 통하여 물을 격리시킬 수 있다. 부분적으로는, 이러한 특성이 세포 외 기질 내의 글리코스아미노글리칸의 생물학적 활동성을 결정한다. 또한 글리코스아미노글리칸은 세포 성장을 위하여 유리한 환경을 유지하는 것을 돕는다. 이러한 고유성 때문에, 글리코스아미노글리칸은 임상 및 의료 용도에 널리 쓰이고 있다. 화장품 업계에서의 글리코스아미노글리칸의 이용 또한 분자 무게와 수분 유지능력과 연관된 물리화학적 및 생물학적 성상에 기인한다.(Gagnieu 외, Peau Seche et Hydratation, Lyon, France, Journees Internationales de Dermocosmetologie de Lyon, 1998). 재조합형으로 발현되는 프로테오글리칸의 수화 가능성은 이미 공개되어 있다.(Huc 외, Peau Seche et Hydration, Lyon, France, 1988).
막 결합 단백질은 막전위영역에서 내재성 막단백질이 되거나, 지질이중층과 연계된 글리코실포스포티딜리노시톨(GPI)이 된다. 내재성 막단백질 내의 막전위 나선은 알파나선형 구조를 가진 부분이며, 길이는 약 20 아미노산 정도로, 막을 "채우는" 것으로 알려져 있다.
글리코스아미노글리칸 쇄는, 이당류 단위의 복합중합반응에 따라 네 개의 단당류를 세린 잔여물에 순차적으로 추가하는 방식을 포함하는, 유사한 루트를 통하 여 합성된다. 글리신 잔여물의 결과물로 나오는 세린이 글리코스아미노글리칸 글리코실화의 첫 단계에 있어 핵심요소인 크실로스트랜스퍼레이즈의 수용체로서 매우 유리한 것으로 보여진다. 글리코실화 유형을 결정할 뿐 아니라 글리코스아미노글리칸 합성의 기폭제 역시 핵심단백에 의해 일부 합성된다. 예를 들어, 콘드로이친 황산에 의한 헤파란 황산의 형성은 핵심단백이 둘 혹은 그 이상의 세린-글리신(SG) 교감서열이 서로 상당히 근접한 상태일 때, 산성 아미노산의 클러스터가 인접하게 위치하고 있을 때, 트립토판 잔여물이 (SG) 글리코스아미노글리칸 접촉 지점으로 즉시 연결될 때에 촉진된다. 그러나, 산성 클러스터는 콘드로이친 황산 프로테오글리칸 내에서도 발견되며 따라서 헤파란 황산 글리코실화의 기폭제로서 필요하기는 하나 적절하지 않은 것으로 보인다. 따라서, 글리코스아미노글리칸 부착 지점이 다소 알려져 있으나, 글리코스아미노글리칸 변형의 타입과 범위를 정하는 규칙은 여전히 불분명하다. GAG 부착 지점은, 퍼레칸(Dolan et al, J. Biol. Chem., Vol. 272, p. 4316-4322, 1997), 콜라겐 XVIII(Dong 외, J. Biol. Chem., Vol. 278, p. 1700-1707,2003), 신데칸-1(Zhang 외, J. Biol. Chem., Vol. 270, p. 27127-27135, 1995), 글리피칸(Chen 외, J. Biol. Chem., Vol. 276, p. 7507-7517, 2001) 및 아그린(Winzen 외, J. Biol. Chem., Vol. 278, p. 30106-30114, 2003)을 포함하는 다수의 프로테오글리칸으로 알려져 있다.
만성적 일광 노출은 노출된 피부에 상당한 변화를 유발한다. 가장 두드러지는 조직 병리학적 변화는 일광탄력섬유증으로 알려진, 진피표층부 내에서의 엘라스틴의 착색 고유성을 지니는 물질의 대량 축적이다. 최근에, 거대 콘드로이친 황산 프로테오글리칸인 베르시칸이 탄력섬유와 관련이 있는 진피 내에서 확인되었으며, 이보다는 작은 크기의 콘드로이친 황산 프로테오글리칸인 데코린이 교원섬유에 분배되는 것으로 확인되었다. 탄력섬유와 베르시칸의 밀접한 연관 및 교원섬유와 데코린의 밀접한 연관에 관한, 특히 광손상 피부 내에서 발생하는 비정상적인 섬유 조각의 상황에 대한(Bernstein 외, Lab Invest 72(6): 662-9, 1995) 증거들이 공개되었다. 이외에도, 베르시칸 및 데코린 면역염색에서의 변화들이 유전자발현에서와 유사한 변경에 의하여 수반되었다. 또 다른 연구에서는, 분포 및 진피 프로테오글리칸의 합성에서의 UVB 노출의 영향이 쥐의 피부 내에서 측정되었다(Margelin 외, Photochem Photobiol 58(2): 211-8, 1993). 이 결과는 UVB의 만성적 사용이 정량적 및 정성적 측면 모두에서 프로테오글리칸 대사를 변화시킨다는 것을 설명한다.
주사에 의한 건조, 피부에 수분을 유지시키고 경피수분손실량(TEWL)을 줄일 뿐 아니라, 각질층의 활동력을 높여주는 보습제의 능력(Draelos, Dermatol Clin 18(4): 597-607, 2000; Bikowski, Cutis 68(5 Suppl): 3-11, 2001; Rawlings 외, Dermatol Ther 17 Suppl 1: 49-56, 2004; Draelos, Cutis 76(6 Suppl): 19-25, 2005) 같은, 피부 손상을 겪고 있는 환자들에의 보습제의 필요성에 대한 다수의 기사들이 공개되어 있다. 이러한 보습제에는 프로테오글리칸이 포함되어 있을 수 있다. 비록 이러한 보습제가 환자의 피부 건강 및 겉모습을 개선시키는 것으로 보여지고 있지만, 이들은 전합성된 프로테오글리칸으로 전달되는 것으로 보여지며 효과에 있어서는 제한적이다.
조제학에서의 프로테오글리칸과 글리코스아미노글리칸의 광범위한 사용 및 적용에도 불구하고, 폴리뉴클레오티드 형태로 전달될 때의 프로테오글리칸의 이용은 과학문헌에서의 프로테오글리칸 데코린 및 바이글리칸과 특허문헌 내에서의 데코린(미국 특허번호 6,524,573) 및 퍼레칸(미국 특허번호 7,141,551)으로만 나타난다. 이외에도, 세포결합분자로 표현되는 융합 막전위 단백질로서 신데칸 세포 내의 서열을 합성하는 핵산의 원위치로의 전달을 기술하는 특허가 발행되어 있다(미국 특허번호 7,029,668). 이는 분비 프로테오글리칸을 합성하는 폴리뉴클레오티드를 발표하고 있는 본 발명의 범위 및 의미와는 실질적으로 다르다. 피부의 생체항상성 유지에 있어, 프로테오글리칸을 세포 외 기질로 분비하는 것은 본 발명의 중요한 측면이며 이 분야의 전문가들에게 명확하게 증명되지는 않았다.
물을 격리시키는 경향 때문에, 노화, 일광노출, 피부병, 또는 외상에 의한 상처 또는 피부 손상지점으로의 프로테오글리칸 폴리펩타이드 전달은 격리된 물이 지역을 촉촉하게 함으로써 주름 또는 표면의 고르지 못함을 가시적으로 줄일 수 있을 것이며 상처 및/또는 피부손상의 치료 및/또는 예방에 적절한 조건을 만들 수 있을 것이다.
이외에도, 혈류 및 탄력을 높이는 것이 가능하며, 추가적으로 외모를 개선하며, 영양분을 더 즉각적으로 분배할 수 있게 되어 환자의 건강을 증진할 수 있게 할 수 있음으로, 더 많은 수분을 포함한 피부는 더 잘 활동하게 될 것이다.
본 발명은 프로테오글리칸 폴리펩타이드 같은, 글리코스아미노글리칸 쇄에 의한 글리케이션을 위한 하나 이상의 지점을 포함하는, 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산구조에 관한 내용이며, 글리코스아미노글리칸 쇄에 의하여 연결된 발현된 폴리펩타이드 같은 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 구조를, 상처 또는 기타 피부손상의 치료를 위하여 폴리펩타이드를 생성하기 위하여 상처지점에 투여한 개체의 정상적인 생리적 과정 과정을 통하여 상처 또는 피부손상 지점으로 전달하는 방법에 관한 내용이다. 전달되는 핵산 구조는 연결된 폴리펩타이드를 생성하기 위하여 (여기에서 "연결" 또는 "글리케이션"으로 언급되는) 글리코스아미노글리칸 쇄를 추가하는 방식으로 전사, 번역, 또는 번역후 수정이 이루어진다. 당화 폴리펩타이드는 이후 세포에서 분비되는데, 분비에 충분한 서열에 의하여 세포 내에서 직접적으로 생성되어 분비되는 것이다. 분비과정 중에, 이러한 서열의 전체 또는 부분은 쪼개어질 수도 있다. 분비 후에, 당화 폴리펩타이드는 개체 내에서의 상처치유 및/또는 피부손상 및/또는 개체 내에서의 피부손상의 예방을 제공할 수 있게 된다. 그 결과, 분비된 당화 폴리펩타이드는 특정 개체에의 투여지점의 통상적인 조건에 따라 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 제공하기 위하여 개체의 정상적인 생리적과정에서 최적으로 연결된다. 특정한 구현에 있어서, 폴리펩타이드를 포함하는 글리코스아미노글리칸은 프로테오글리칸 폴리펩타이드이다
본 발명은 프로테오글리칸 폴리펩타이드을 합성하는 핵산과, 개체의 정상적인 생리적 과정을 통하여, 상처 또는 기타 피부손상의 치유에 있어서 기능성 당화 폴리펩타이드를 생산하여 투여 지점에서 발현 폴리펩타이드가 글리코스아미노글리칸 쇄에 의하여 연결되는 것과 같은, 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 상처 또는 피부손상 지점으로 전달하는 방법에 대한 내용이다. 하나의 구현에서, 적어도 하나 이상의 폴리펩타이드가 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 된다. 더구나, 하나의 구현에서, 이러한 핵산 구조는 아래에 기술된 바와 같이 분비에 충분한 서열을 구성할 수 있다. 전달되는 핵산 구조는 당화 폴리펩타이드를 생산하기 위한 (여기에서 "연결" 또는 "글리케이션" 으로 언급되는) 글리코스아미노글리칸 쇄의 추가에 따라 복사, 번역 및 번역후 수정된다. 이후 당화 폴리펩타이드가 분비에 충분한 서열에 의하여 직접적으로 생산되는 세포에서 분비된다. 분비 과정 동안, 이러한 서열의 전체 또는 일부분은 쪼개질 수 있다. 분비 후에, 당화 폴리펩타이드는 상처 및/또는 피부손상의 치료 및/또는 예방에 적합하다. 결과적으로, 특정 개체 내의 정확한 지점으로 전달하는 조건에 기반하여 폴리펩타이드 분자를 포함하는 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 제공하기 위하여, 방출된 폴리펩타이드는 개체의 정상적인 생리적 과정에 의하여 최적 상태로 당화된다.
대략 30개의 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 10kDa에서 >500kDa 사이의 크기 분포를 나타내며 부착된 글리코스아미노글리칸 쇄의 수는 1개에서 >100개 사이이다. 대표적인 프로테오글리칸은 아래에 더 상세하게 논의되어 있다. 어그레칸은 다수의 콘드로이친 황산 및 황산 케라탄 쇄(>100)로 연결된 거대핵심단백이며, 언급된 프로테오글리칸의 분자 각각에 대부분의 물을 격리하려는 습성이 있다. 어그레칸은 또한 관절에서 높은 물 성분을 지니게 하며 관절 내의 삼투팽창을 증대시키는 방식으로 연골 내에서 히알루론산과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 핵심단백은 2162 아미노산을 지닌 225KDa이다. 130개에서 200개 초과 사이의 탄수화물 쇄를 추가한 후에, 분자량은 상당히 상당히 채워져서 물에서 무게의 75%를 유지할 수 있는, 친수성을 띠는 부분보다 더 높아진다. 콘드로이친 황산 쇄가 C말단 섹션에 위치하는 것과 달리 황산 케라탄 쇄는 일반적으로 N말단에 위치하고 있다. 어그레칸 프로테오글리칸 단백질 단편은 생산이 덜 효과적으로 비용이 많이 들 수 있으며, 총 길이 단백질에 대한 필요가 없는 유익한 물리화학적 성상을 제공할 수도 있기 때문에, 유리하게 이용될 수 있다.
베르시칸은 12-15개의 콘드로이친 황산 쇄가 붙어 있는 약 265KDa의 거대 프로테오글리칸이다. 이 단백질은 피부의 진피층을 구성하는 주요 성분이며, N말단 접촉을 통하여 세포 외 기질 내에서 히알루로난과 상호작용을 한다. 베르시칸은 또한 C말단 접촉을 통하여 다수의 신호분자와 상호작용을 한다. 베르시칸의 중심 영역은 글리코스아미노글리칸 부착점을 포함하고 있으나, 다양한 조직 내에서의 차별화된 접합 글리코스아미노글리칸 부착 및 황화 패턴의 다양성을 야기하며, 다른 분자와 글리코스아미노글리칸 쇄의 상호작용의 분류를 야기할 수도 있다. 이외에도, 베르시칸이 히알로로난과 상호작용하는 것으로 알려져 있기 때문에, 베르시칸 생산을 증가시키는 것은 히알루로난 생산을 증가시킬 수 있다.
베르시칸 이외에도, 진피는 데코린, 바이글리칸 및 루미칸 같은 여러 작은 류신을 다량 포함한 프로테오글리칸(SLRPs)을 포함하고 있다. SLRP은 세포활동의 규제와 조직 내에서 및 피부결합조직의 기술적 속성에 있어 중요한 역할을 수행하는 것으로 보여지며. SLRP의 재분배의 변형은 피부노화가 발생하는 변화 내에 포함되는 것으로 보여진다. 루미칸 발현은 노회에 따라 감소하는 반면에 데코린 발현은 증가하는 추세를 보였는데, 이는 데코린에서 루미칸으로의 비율의 강력한 변화에 따른 것이다. 반면에, 바이글리칸 발현은 노화 중에 변경되지 않았다. SLRP 발현의 변화는 노화된 피부에 영향을 미치는 기능적 장해 와 관련될 수 있다(Vuillermoz 외, Mol Cell Biochem 277(1-2): 63-72, 2005).
루미칸은 두개의 황산 케라탄 GAG 부착 점을 지닌 38KDa의 단백질 코어를 가지고 있으며, 세포 외 기질과 피부 구조의 무결상태에 영향을 주는 것으로 알려져 왔다. 예를 들자면, 루미칸을 발현할 수 없게 유전자가 제거된 쥐는 비정상적인 콜라겐조합과 연약한 피부를 나타내는데, 이는 루미칸 이 ECM 유지와 피부 건강에서 중요한 역할을 하는 것을 의미한다(Wegrowski 외, Mol Cell Biochem 205(1-2): 125-31, 2000; Vuillermoz 외, Mol Cell Biochem 277(1-2): 63-72, 2005). 치주 건강 역시 콜라겐과의 상호작용 때문에 루미칸의 제거에 의해 영향을 받는다.(Matheson 외, J Periodontal Res 40(4): 312-24, 2005). 이외에도, Roughley 외 저서는 콜라게나아제에 의해 콜라겐이 분해되는 것을 막는 데에 있어서의 루미칸 및 기타SLRPs의 역할을 나타내는데, 이는 ECM 유지 및 ECM 분해의 예방에 있어 루미칸의 역할을 의미한다(Geng 외, Matrix Biol ., 25(8):484-91 2006). 더욱이, Vuillermoz 외 저서는 루미칸 발현이 나이가 늘어감에 따라 피부 섬유아세포 내에서 줄어드는 것을 보여주는데, 이는 루미칸이 피부에 노화와 관련된 손상을 입히는 역할의 가능성을 암시한다. 이외에도, 여러 연구들이 루미칸이 각막 건강에 있어 어떤 역할을 수행하는 것을 나타내고 있는데 루미칸 발현의 감소 또는 불가능이 각막이 제대로 형성이 되지 않도록 하는 것(Chakravarti, Glycoconj J 19(4-5): 287-93, 2002), 콜라겐 소섬유형성에 있어 지지역할을 수행하는 것 이외에도 정련 루미칸은 각막 상피 상처 치유를 촉진시키는 것으로 나타났다(Yeh, 외 Ophthalmol Vis Sci 46(2): 479-86, 2005). 따라서, 핵산을 합성하는 루미칸을 피부로 전달하는 것은 본 발명에서 언급되는 바와 같이 콜라겐 소섬유형성을 촉진하며 충전 및 글리코스아미노글리칸 쇄의 친수성으로 인하여 수분 성분을 높일 수 있게 되어, 따라서 피부 건강과 외관을 증진시킬 수 있다. 다른 알려진 프로테오글리칸에는 신데칸 1-4, 글리피칸 1-5, 베타글리칸, NG2/CSPG4, CD44/에피칸, 파이브로모듈린, PRELP, 케라토칸, 오스테오어드히린/오스테오모듈린, 에피파이칸, 오스테오글리신/미메칸, 뉴로칸/CSPG3, 브레비칸, 바마칸, 아그린, 및 세르글리신이 포함된다.
첫 번째 구현에서, 본 발명은 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 고립된 핵산 분자를 규정한다. 이러한 고립된 핵산 분자는 개체의 목표세포에서의 발현을 위하여 적절한 벡터의 35 개 부분이 될 수 있다. 대신에, 고립된 핵산 분자는 핵산 상태 그대로 전달될 수도 있다. 첫 번째 구현의 범위 내에서 핵산 분자는 개별 핵산분자, 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 합성, 또는 전달되는 벡터의 부분 또는 핵산 상태 그대로의 전달 뿐만 아니라, 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 첫 번째 구현에 추가된 이형에서 , 핵산 분자는 프로테오글리칸 폴리펩타이드이외에도 다른 에이전트를 구성할 수 있다. 예시를 하나 들자면, 다른 에이전트는 성장인자 분자이다. 성장인자 분자는 동일 핵산또는 개별 핵산분자 내에서 프로테오글리칸 폴리펩타이드로 합성될 수 있으며, 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 함께 전달될 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 구현의 핵산은 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드와 하나 이상의 성장인자를 구성할 수 있다. 단일 핵산이 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드 및 다른 에이전트를 구성할 때, 핵산은 복사 및 개별 합성 인자의 번역에 필요한 적절한 조절인자를 가지는 폴리시스트론의 형태일 수 있다.
두 번째 구현에서, 본 발명은 첫 번째 구현에서의 하나 이상의 핵산을 이루는 구성을 규정한다.
세 번째 구현에서, 본 발명은 첫 번째 구현에서의 하나 이상의 핵산을 본질적으로 이루는 구성을 규정한다.
네 번째 구현에서, 본 발명은 첫 번째 구현에서의 하나 이상의 핵산을 이루는 구성을 규정한다.
네 번째 구현을 통하는 두 번째 구조는 조성물일 수 있으며 약학적으로 용인되는 수송체 및/또는 부가제를 포함할 수도 있다. 이러한 구조는 다섯 번째와 여섯 번째 구현의 치료 및 예방 방법에 이용될 수 있다.
다섯 번째 구현에서, 본 발명은 이러한 치료가 필요한 개체 내에서의 상처 또는 피부손상 지점에 조성물 또는 본 발명의 핵산을 관리하는 방식의 효과적인 상처 또는 피부손상의 치료 방법을 기술하고 있는데, (꼭 한정적이지는 않으나) 첫 번째 구현에서 기술된 핵산 또는 두 번째에서 네 번째까지에서 기술된 구조 같은 것이 있다. 상처지점으로의 이러한 투여는 국소 투여 또는 전체적 투여에 의하여 가능하다. 적어도 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 하나의 핵산 분자는 전달되는 벡터를 이용하거나 핵산 상태 그대로, 혹은 이 기술에서 알려진 다른 방법들을 이용하여 전달된다. 다섯 번째 구현에 의해 포함되는 이러한 치료방법 내에서, 핵산 또는 조성물은 상처 또는 피부손상을 치료하기 위하여 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 치료적 유효량을 전달하기 위하여 관리된다.
여섯 번째 구현에서, 본 발명은 본 발명의 조성물이 이러한 피부손상을 막을 것으로 기대되는 지점을 관리하는 방식으로 개체 내에서의 효과적인 피부손상의 예방 방법을 기술하고 있는데, (꼭 한정적이지는 않으나) 첫 번째 구현에서 기술된 핵산 또는 두 번째에서 네 번째까지에서 기술된 구조 같은 것이 있다. 상처지점으로의 이러한 투여는 국소 투여 또는 전체적 투여에 의하여 가능하다. 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자는 전달되는 벡터를 이용하거나 핵산 상태 그대로, 혹은 이 기술에서 알려진 다른 방법들을 이용하여 전달된다. 여섯 번째 구현에 의해 포함되는 이러한 예방 방법 내에서, 핵산 또는 조성물은 피부손상을 예방하기 위하여 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드을 합성하는 핵산의 치료적 유효량을 전달하기 위하여 관리된다.
다섯 번째와 여섯 번째의 구현에서의 치료 및 예방 방법 내에서, 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 고립된 핵산 분자의 전달은 적절한 글리코스아미노글리칸 쇄에서의 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 연결을 위한 지점으로의 투여에서 개체의 정상적인 생리적 과정을 허용하며 세포에서 당화된 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 방출한다. 글리코스아미노글리칸 인자를 이용한 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 글리케이션이 상처 또는 피부손상지점 및/또는 특정지점에서의 생리적 환경에 따라 차별화된 방법으로 진행이 되기 때문에(결과적으로 다른 환경적 스트레스 요인, 손상지점에서 발생하는 생리적 과정 및/또는 상처 또는 피부손상의 본질을 계속적으로 바꿀 수 있다), 완전하게 연결된 프로테오글리칸 분자의 본질은 계속적으로 바뀔 수 있다. 다섯 번째 및 여섯 번째의 구현에서의 치료 및 예방 방법은 하나 이상의 글리코스아미노글리칸에 변이가 일어나게 되는, (꼭 한정적이지는 않으나) 황화의 넓이 및 글리코스아미노글리칸 인자의 쇄 길이 같은, 최적의 글리코스아미노글리칸 변형(글리케이션)이 일어나도록 하는데, 이것은 특정 개체 내에서의 지점에의 투여에 우세한 조건에 따라 최적화된다. 따라서, 발현된 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 특정한 특정시기에 특정 요구사항과 맞아 떨어지는 개체의 정상적인 생리적 과정에 따라 달라진다((꼭 한정적이지는 않으나) 상처 치유 또는 피부손상 같은).
따라서, 미리 생성된 프로테오글리칸 분자를 상처 또는 피부손상 지점적용하는 선행기술의 이러한 방법은 아무것도 아니거나 혹은 불만족스러운 결과를 가져올 수도 있다. 더구나, 피부층을 통한 완전히 연결된 프로테오글리칸 분자의 전달은 프로테오글리칸 분자의 크기 및 충전 본질에 의해 힘들다. 또한, 피부의 더 깊은 층에서의 핵산 발현의 가능성이 논증되어 왔는데, 이는 현재의 화장품 형태에서 피부에 적용되는 전합성된 외인성 프로테오글리칸의 침투에 대한 의미있는 개선이다.
이외에도, 다섯 번째 및 여섯 번째 구현에서의 치료 및 예방 방법을 이용하여, 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자의 전달은, 전달되는 핵산 분자가 개체 내에서 개별 반감기를 가지는 것으로 위에서 기술된 바와 같이, 연결된 프로테오글리칸 분자의 파생적인 생산을 제공한다. 기술의 현 상태에서의 의미있는 차이 및 개선이 될 수 있는, 본 발명의 또 다른 중요한 측면은 상처 및 피부손상의 치료 및 예방에 있어서의 프로테오글리칸을 합성하는 재조합형 핵산의 전달이, 발현이 감퇴하고 발명의 다른 적용이 추가적인 발현을 위해 필요하게 될 때까지는, 몇일간의 재조합형 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 파생적인 생산에서 기인한다는 사실에 있다.
첫 번째에서 여섯 번째 구현까지의 구조 및/또는 방법으로 핵산을 이용할 때, 많은 이익을 얻을 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 방법은 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자의 전달을 규정하는데, 그때문에 발현된 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 적절한 글리코스아미노글리칸 쇄와 당회시키기 위하여 투여지점에서 발생하는 개체의 정상적인 생리적 과정을 허용하며, 세포로부터 연결된 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 방출한다. 방출된 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 제공하기 위한, 특정 개체에서의 투여지점에서 우세한 조건에 기반하여 최적화되는, 개체의 정상적인 생리적 과정에 의하여 합성된다. 이러한 적용은 전합성된 프로테오글리칸 분자를 관리할 때에는 가능하지 않다. 더구나, 글리코스아미노글리칸 분자 의 수와 본질을 지정하는 프로테오글리칸 코어 분자의 특징은 완전히 이해되지 않았기 때문에, 개별 생리적 요구사항에 따른 개별 전합성 프로테오글리칸 분자의 변형 은 주어진 기술 상태에서는 불가능하다.
이외에도, 발표된 방법에 의한 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자의 전달은 궁극적으로는 더 많은 수의 세포 타입에서 생성되어야 하는 프로테오글리칸 분자의 생성을 허용한다. 본 발명의 방법은 요구되는 지점에서는 가시적으로 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 발현될 것을 허용한다.
더구나, 본 발명의 방법을 이용한, 필요한 프로테오글리칸 분자의 파생적인 생산은 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자가 생산 of 복합 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 생산을 반복적으로 허락하기 때문에 가능하다. 이러한 전합성된 프로테오글리칸 분자를 이용하여 인지하기는 불가능하다.
정의
여기에서 말하는,"예방하다", "예방하는", "예방", "억제하다", "억제하는" 및 여기에서 사용된 억제이라는 단어는, 어떤 증세, 형태 또는 피부손상의 특징을 예방하기 위하여 피부손상의 발병에 앞서 핵산 또는 본 발명의 구성을 관리하는 것을 말한다. 이러한 예방 및 억제(이라는 단어)은 절대적으로 이용될 필요는 없다.
여기에서 말하는, "치료", "치료하는" 및 여기에서 사용된 치료라는 단어는, 피부손상의 발병 또는 상처의 외관이 생긴 이후에 어떤 증세, 형태 또는 피부손상의 특징, 또는 상처와 관련있는 상태를 줄이거나 제거하기 위하여 핵산 또는 본 발명의 구성을 관리하는 것을 말한다. 하나의 구현에 있어, 치료는 상처 또는 피부손상의 치유를 규정한다. 이러한 약정이 절대적으로 이용될 필요는 없다.
여기에서 말하는, 여기에서 사용된 "치료가 필요한" 이라는 단어는 환자가 요구하거나 치료에 이익이 될 것으로 보이는, 요양사에 의해 만들어진 판단을 말한다. 이 판단은 요양사의 전문지식의 영역 내에서 다양한 인자를 고려하여 이루어진다.
여기에서 말하는, 여기에서 사용된 "예방이 필요한" 이라는 단어는 환자가 요구하거나 치료에 이익이 될 것으로 보이는, 요양사에 의해 만들어진 판단을 말한다. 이 판단은 요양사의 전문지식의 영역 내에서 다양한 인자를 고려하여 이루어진다.
여기에서 말하는, "개체", "개인" 또는 "환자"라는 단어는 (꼭 한정적이지는 않으나) 생쥐, 쥐, 기타 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 또는 영장류, 또는 인간 같은 파충류를 포함하는 모든 짐승에 대하여 이용되었다. 이 단어는 남성 혹은 여성 혹은 모두를 특화하거나 남성 혹은 여성을 배제하는 표현일 수 있다.
여기에서 말하는, 병의 형태/컨디션의 예방 혹은 억제을 위하여 "치료적 유효량"이라는 단어는, 처치에 관해서는, 병의 형태/컨디션의 어떤 증세, 형태, 또는 고유성을 추적하는 것이 가능하고, 긍정적인 효과를 가져오는, 단독으로 혹은 조성물에 포함되어 있는 형태의 합성물질의 양을 말한다. 이러한 효과는 절대적으로 이득이 되는 쪽일 필요는 없다.
여기에서 말하는,"글리코스아미노글리칸" 이라는 단어는 광범위하게 정의된 의미이며 지금까지 알려진 것과 알려지지 않은 글리코스아미노글리칸을 의미한다. 대표적인 글리코스아미노글리칸에는 (꼭 한정적이지는 않으나) 히알루론산, 황산 콘드로이친, 헤파란 황산, 데르마탄황산 및 황산 케라탄이 있다.
여기에서 말하는,"벡터" 라는 단어는 핵산을 개체의 숙주세포에까지 전달하는 매커니즘 전체를 의미한다. 벡터라는 단어에는 핵산을 개체의 세포(시험관 세포, 생체 외부, 또는 생체 내부 실험)로 유도하는 바이러스성 및 비바이러스성 매커니즘 모두를 말한다. 비바이러스성 벡터는 (꼭 한정적이지는 않으나) 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 충전된 지질(사이토펙틴 같은), DNA-단백질 복합체 및 바이오폴리머가 포함된다. 바이러스 벡터 벡터는 (꼭 한정적이지는 않으나) 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 소 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 아데노 연관바이러스, 천연두 바이러스, 바큘로바이러스, 우두 바이러스, 헤르페스바이러스 및 둘 혹은 그 이상의 바이러스 벡터 타입의 잡종에서 파생된 벡터들이 포함될 수 있다. 벡터는 (꼭 한정적이지는 않으나) 프로모터 등과 같은, 적어도 하나의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 발현에 필요한 조절서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 특정 세포타입 또는 조직에 따라 최적화된다. 이외에도, 벡터는 하나 이상의 조절 지역, 및/또는 선택, 측정 및 핵산 전달 결과를 모니터링(어떤 세포로 전환되는지, 발현 기간, 등.) 하는데 유용한 선택가능한 마커를 포함할 수 있다.
여기에서 말하는,"분비된" 또는 "분비"라는 용어는 세포에서 폴리펩타이드가 방출, 배출 또는 배설되는 것을 의미한다.
여기에서 말하는, "프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산" 또는" 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산" 이라는 용어는 분비가 충분한 핵산 구조 서열을 합성하는 첫 번째 핵산서열을 구성하는 핵산구조와 글리코스아미노글리칸 쇄에 부착되어 하나 이상의 서열을 가지는 것과 막전위 영역(또는 유사영역)에 모자란, 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산 서열을 말한다. 대신에, "프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산" 또는 "하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산"이라는 용어는 본질적으로 구성하거나 혹은 첫 번째와 두 번째 핵산 서열을 구성하는 핵산구조를 말한다. 필요하다면, 기술된 핵산 서열은 또한 ((꼭 한정적이지는 않으나) 하나 이상의 성장인자 같은).세 번째, 네 번째, 다섯 번째 등의, 하나 이상의 부가적인 에이전트를 포함, 필수적으로 구성 또는 합성하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
위에서 확인된 바와 같이, 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 분비에 충분한 서열을 합성하는 첫 번째 핵산을 포함한다. 분비에 충분한 이러한 서열은 (꼭 한정적이지는 않으나) 선도 서열, 이출 서열, 신호 펩타이드 신호 서열 및 기타 세포에서 단백질 또는 폴리펩타이드를 직접적으로 분비하는 서열(집합적으로 신호 서열로 언급됨)이 포함된다. 신호 서열은 통상적으로 13에서 36개의 아미노산을 포함하고 있는데, 이들은 자연상태에서는 월등하게 소수성을 지닌다. 신호 서열은 신호 인식 분자(SRP)라고 정의되는 다중 단백질집합체에 의하여 인식된다. 적어도 부분적으로는, 이 신호서열은 소포체 막을 통하여 통과함으로써 제거된다
이 기술에서 알려진 이러한 신호 서열의 어떠한 것도 분비에 충분한 신호로 이용될 수 있다. 분비에 충분한 서열은 보통 개체 내의 프로테오글리칸 폴리펩타이드와 연계되거나 혹은 개체 내의 프로테오글리칸 폴리펩타이드와 일반적으로 연결되지 않은 재조합형 또는 변형체조직의 서열일 수 있다. 특정 구현에 있어, 분비에 충분한 서열은 퍼레칸 핵산 서열에서 파생되며 다음과 같다:
atggggtggcgggcgccgggcgcgctgctgctggcgctgctgctg(서열번호 27)
또다른 분비에 충분한 서열은 기술의 통상적인 스킬로 알려져 있다. 분비에 충분한 서열로 번역된 전체 혹은 부분은 분비과정에서 제거될 수 있다.
하나의 구현에서, 글리코스아미노글리칸 쇄의 부착을 위해 하나 이상의 서열을 갖는 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 인간의 마음에 의해 디자인 된 폴리펩타이드이며, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산서열이다. 이러한 폴리펩타이드는 하나 이상의 자연발생적인 프로테오글리칸 폴리펩타이드에서의 부분을 구성할 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 특별히 요구되는 고유성/고유성들을 갖도록 디자인 될 수 있다. 추가적인 구현에 있어, 글리코스아미노글리칸 쇄의 부착을 위한 하나 이상의 서열을 갖는 폴리펩타이드는 프로테오글리칸 폴리펩타이드와 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산서열이다. "프로테오글리칸 폴리펩타이드" 라는 단어는 광범위하게 정의되며 지금까지 알려진 것과 알려지지 않은 프로테오글리칸, 새로이 생성된 프로테오글리칸과 이전의 것의 단편, 새로이 생성된 이러한 프로테오글리칸, 및 적어도 하나의 글리코스아미노글리칸 쇄를 가지는 단편을 포함한다. 따라서, 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 전신 프로테오글리칸 단백질 또는 자연적으로 발생하는 단편일 수 있다. . 대표적인 프로테오글리칸 단백질은 (꼭 한정적이지는 않으나) 어그레칸, 베르시칸, 루미칸, 신데칸 1-4, 글리피칸 1- 5, 베타글리칸, NG2/CSPG4, CD44/에피칸, 파이브로모듈린, PRELP, 케라토칸, 오스테오어드히린/오스테오모듈린, 에피파이칸, 오스테오글리신/미메칸, 뉴로칸/CSPG3, 브레비칸, 바마칸, 아그린 및 세르글리신을 포함한다. 이러한 프로테오글리칸 의 핵산 서열은 SEQ ID NOS: 1-26에 각각 나와있다. 하나의 구현에서, 이러한 프로테오글리칸 폴리펩타이드 데코린 또는 바이글리칸을 포함하지는 않는다. 교차 구현에 있어, 이러한 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 퍼레칸을 포함하지 않는다. "단편" 이라는 단어는, 만일 이러한 단편이 적어도 하나의 지점에 글리코스아미노글리칸이 부착되도록 구성된다면,, 적어도 30 인접 핵산 잔사를 구성하는 핵산을 언급하는 것을 의미한다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 자연적일 수도 인공적일 수도 있다. 교차 구현에 있어, 두 번째 핵산 서열은 비현실적이며 하나 이상의 프로테오글리칸 단백질에서 단편을 합성하는 핵산을 포함한다.
추가적인 구현에 있어, 두 번째 핵산 서열은, 변경된 핵산이 단백질이나 폴리펩타이드를 암호화할 수 있어 상처 또는 피부손상의 치유에 영향을 주는 기능을 하는 자연적으로 발생한 프로테오글리칸 단백질이나 단편이라면, 자연발생적인 프로테오글리칸 단백질 단편을 합성하는 핵산과 구별될 수 있다. 이러한 변경된 서열은 단일점 돌연변이에 의하여 생겨난 변경(여기에서는 돌연변이으로 언급됨), 유전자 코드의 퇴화에 의한 변경(여기에서는 퇴화 변형체으로 언급됨), 또는 자연적으로 발생한 대립 변형체(여기에서는 대립 변형체으로 언급됨) 과 유전공학에 의하여 도입된 추가적인 변형(여기에서는 변형체으로 언급됨)을 포함한다.
변형체 또는 돌연변이는 (꼭 한정적이지는 않으나) 글리코스아미노글리칸 부착지점이 많거나 작게끔 가공된 종을 포함한다. 단백질 또는 이러한 돌연변이, 퇴행 변형체, 대립 변형체 및 변형체을 합성하는 폴리펩타이드의 활동은 여기에서 공개되는 방법에 의해 평가될 수 있으며, 기술 내에서 알려진 바와 같다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에의 이러한 모든 변형은 본 발명에 포함된다.
발현된 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 자연적으로 발생하는 프로테오글리칸 단백질 또는 그 단편과 다르다는 것 같은, 이러한 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에의변화를 유도하는 기법은 기술 내에서 잘 알려져 있다. 이러한 변형은 아미노산 서열 내에서 변화를 가져오는 기저의 탈락, 삽입 또는 치환을 포함한다. 변화들은 활동을 증가시키기 위하여, 생물학적 안정성 또는 반감기를 증가시키기 위하여, 글리코실화 패턴을 변화시키기 위하여, 온도 민감성을 수여하거나 발현 패턴 등등을 개조하기 위하여 만들어질 수 있다.
본 발명에서, 글리코스아미노글리칸 쇄를 상처 또는 피부손상 지점까지 전달하는 것이 요구될 수 있다. 단백질/폴리펩타이드의 이러한 구조가(수용체 결합 등과 같은)다른 적용에 있어서만큼 민감하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명은 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 안에서 발현된 폴리펩타이드의 능력의 손실 없이 다양한 변화가 생길 수 있다는 것과, 상처 또는 피부손상 지점에 글리코스아미노글리칸 쇄를 효과적으로 전달하며 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로의 이러한 변형이 공시의 범위 내에 있다는 것을 심사숙고 하고 있다. 하나의 구현에서, 글리코스아미노글리칸 부착점은 변경되지 않는다.
아미노산의 보존적 치환은 잘 알려져 있으며 결과 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활동성을 변경하지 않고 이루어진다. 예를 들어, 이러한 보존적 치환은 일반적으로 극성 잔여물, 충전 잔여물, 소수성의 잔여물, 소규모 잔여물 등의 그룹 내에서 상호충전에 의해서 일어난다. 예를 들어, 특정 아미노산은 단백질/폴리펩타이드 구조에서, 단백질/폴리펩타이드 구조의 상당한 변경을 하지 않고도 다른 아미노산을 대신할 수 있다. 이러한 변화를 만드는 내에는, 아미노산의 수치 색인이 고려될 수 있다. 단백질에서의 생물학적 기능 상호기능을 참조하는 수치 아미노산 색인의 중요성은 일반적으로 기술 내에서 알려져 있다(Kyte and Doolittle, 1982, 참고문헌이 이 안에 참고문헌으로 붙어있음). 아미노산의 관계 수치 특성이 종결 단백질/폴리펩타이드의 부차적인 구조에 기여한다는 것이 받아들여지고 있는데, 이것은 부분적으로는 단백질/폴리펩타이드의 활동을 정의하는 것이다.
개별 아미노산의 소수성과 충전고유성에 근거하여 다음과 같이 수치색인을 배열하여 왔다(Kyte and Doolittle, 1982). 아이소루신(+4.5), 발린(+4.2), 류신(+3.8), 페닐알라닌(+2.8), 시스테인/시스틴(+2.5), 메티오닌(+1.9), 알라닌(+1.8), 글리신(-0.4), 트레오닌(-0.7), 세린(-0.8), 트립토판(-0.9), 타이로신(-1.3), 프롤린(-1.6), 히스티딘(-3.2), 글루타민산염(-3.5), 글루타민(-3.5), 아스파르트산염(-3.5), 아스파라긴(-3.5), 라이신(-3.9), 및 아르기닌(-4.5).
특정 아미노산이 유사한 수치 색인 또는 점수를 지닌 다른 아미노산을 대체하며 유사한 구조 및/또는 생물학적 활동성의 단백질/폴리펩타이드가 된다는 것은 기술 내에서 이미 알려져 있다. 어떤 변화를 일으키는 데 있어, 치환 아미노산의 수치색인은 +/- 2, +/- 1 or +/- 0.5 내의 범위이다.
유사 아미노산의 치환이 친수성을 기반으로 효과적으로 이루어진다는 것 도한 기술 내에서 이해되고 있다.미국 특허번호 4,554,101은 단백질의 가장 높은 국소인 표준 친수성은, 인접 아미노산의 친수성에 의해 통제되는 바와 같이, 단백질 /폴리펩타이드의 생물학적 고유성과 상호 연계되어 있다고 진술한다. 친수성 값은 아미노산 잔여물에 다음과 같이 할당되어 있다. 아르기닌(+3.0), 라이신(+3.0), 아스파르트산염(+3.0.+-.1), 글루타민산염(+3.0.+-.1), 세린(.+-.0.3), 아스파라긴(+0.2), 글루타민(+0.2), 글리신(0), 트레오닌(-0.4), 프롤린(-0.5.+-.1), 알라닌(-0.5), 히스티딘(-0.5), 시스테인(-1.0), 메티오닌(-1.3), 발린(-1.5), 류신(-1.8), 아이소루신(-1.8), 타이로신(-2.3), 페닐알라닌(-2.5), 트립토판(-3.4).
아미노산은 다른 유사 친수성값을 지니는 다른 아미노산과 치환될 수 있으며 유사 구조 및/또는 생물학적 활동성을 지닌 단백질/폴리펩타이드가 되는 것으로 알려져 있다. 어떤 변화를 일으키는 데 있어, 치환된 아미노산의 친수성 값은 +/- 2, +/- 1 or +/- 0.5 범위 내이다.
위에서 개요를 말한 것과 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 상대적으로 유사한 아미노산 측쇄 치환기에 하는데, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 충전, 크기, 등이 유사한 경우이다. 앞서 말한 고유성을 고려해봐야 하는 대표적인 치환은 기술내에서의 스킬이 잘 알려져 있으며, 다음을 포함한다. 아르기닌과 라이신, 글루타민산염과 아스파르트산염, 세린과 트레오닌, 글루타민과 아스파라긴, 발린, 류신과 아이소루신.
여기에 검토된 바와 같이 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 성장인자 또는 그것의 단편 같은, 적어도 하나의 추가적인 에이전트를 암호화하는 핵산서열을 더 포함할 수도 있다. 대신에, 두 번째 핵산 구조는 성장인자 또는 그것의 단편 같은, 적어도 하나의 추가적인 에이전트 암호화를 제공할 수도 있다. 성장인자 또는 그것의 단편은 헤파린 황산 쇄 같은, 글리코스아미노글리칸 쇄를 형성하는 능력에 따라 선택될 수 있다. 대신에, 이러한 성장인자 또는 그것의 단편은 예방 또는 상처치료 또는 피부손상을 지원하는 능력을 선택할 수도 있다. 대표적인 성장인자에는 (꼭 한정적이지는 않으나) 섬유아세포 성장인자, 케라티노사이트 성장인자, 변형 성장인자 B, 간세포 성장인자, 도관 내피 성장인자, 혈소판 파생 성장인자, 표피 성장인자, 인슐린 유사 성장인자, 골형성 단백질 및 과립구 대식세포 콜로니 자극인자가 포함된다. 특정 구현에 있어, 성장인자는2 또는7 섬유아세포 성장인자 같은, 섬유아세포 성장인자군의 일원이다. 핵산은 또한 돌연변이, 퇴행 변형체, 대립 변형체 및 기술된 성장인자의 변형체으로 구성될 수 있다(이 용어들은 위에 정의되어 있음). 아미노산의 치환에 관한 본 발명의 내용은 여기에서 동일하게 적용된다.
프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 여기에서 공개된 다른 핵산 서열은 발현에 필요하거나 요구되는 하나 이상의 서열을 선택적으로 포함하며 이들과 활동적으로 연결될 수 있다. 대신에, 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 여기에서 공개된 다른 핵산 서열은 여기에 기술된 벡터의 부분이며 이러한 서열을 포함하는 벡터이다. 이러한 서열은 (꼭 한정적이지는 않으나) 프로모터, 인핸서, 복사 인자 결합지점 및 기타 유전자 발현 조절 서열(여기에서는 "발현인자"로 언급됨)이 포함된다. 이러한 벡터들의 발현인자는 벡터의 힘과 특이성에서 다양할 수 있다. 이용되는 호스트 및/또는 벡터에 따라, 적절한 발현인자의 어떤 것이라도 이용될 수 있다. 발현인자는 보통 개체 내에서 핵산과 연계될 수 있다. 대신에, 발현인자는 재조합형 또는 보통 개체 내에서 핵산과 연계되는 변형체조직의 인자일 수 있다. 어떤 일이 생기건, 발현인자는 핵산과 "사용이 가능하게 연계"되는데, 이것은 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에서의 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 발현에 영향을 미치는 그 방식으로 발현인자의 상태를 참고한다. 예시는 다음과 같다: 다른 출처에서 발현되었고 특정세포 타입에서 전달된 DNA의 발현을 규정하는 발현인자를 생성하기 위하여 설계된 개별 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하는, 조직 특화 발현인자. 재조합형 DNA 또는 합성기술에 의하여 생성된 프로모터 뿐만 아니라, 포유류의 세포 내에서 성장하는 바이러스의 게놈으로부터 고립된 발현인자(즉, RSV, 우두 바이러스 7.5K, SV40, HSV, 아데노바이러스 MLP, MMTV LTR 및 CMV 프로모터) 도 이용될 수 있다.
몇몇 예시에서, 발현인자는 구조성을 지니거나 유도 가능한 속성을 지니며 또한 높은 레벨을 지도하기 의한 적절한 조건 하에서 이용되거나 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 발현을 규제하는데 이용될 수 있다. 특정 개시신호 또한 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 절절한 번역에 필요하다. 이러한 신호들은 (꼭 한정적이지는 않으나) ATG 개시코돈 및 인접 서열을 포함한다. 개시코돈 및 인접서열을 포함하는 프로테오글리칸 단백질의 전체 구성 서열이 (단독이거나 혹은 벡터와 결합해서이거나) 이용되는 경우에서, 추가적인 번역통제신호가 필요하지 않을 수 있다. 그러나, (단편 또는 합성 핵산 같은) 프로테오글리칸 단백질의 서열을 구성하는 부분만이 이용되는 경우에는, (꼭 한정적이지는 않으나) ATG 개시코돈을 포함하는 외인성 번역 통제신호가 제공되어야 할 수도 있다. 더구나, 개시코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하는 구성 서열의 판독체제와 일치하여야 한다. 이러한 외인성 번역 통제신호 및 개시코돈은, 자연적이건 인공적이건 간에 발생의 다양성을 지녀야 한다. 발현의 효율 및 통제는 복사 감쇠 서열, 인핸서 인자 등의 포함에 따라 높아질 수 있다.
여기에서 말하는, "프로테오글리칸 폴리펩타이드"라는 단어는 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 생성되는 것으로 알려진 세포에서 분비되는, 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에서 발현된 폴리펩타이드를 말한다. 하나 이상의 부착된 글리코스아미노글리칸 쇄를 지니는 프로테오글리칸 폴리펩타이드 같은 것처럼. 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 전장 프로테오글리칸 단백질이거나 혹은 그 단편일 수 있다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 하나 이상의 부착된 글리코스아미노글리칸 쇄를 포함할 수 있다. 더구나, 부착된 글리코스아미노글리칸 쇄의 본성, 정체성 및 수는, 프로테오글리칸 폴리펩타이드라 할지라도, 개체에 의한 프로테오글리칸의 후-번역 글리케이션에 따라 달라질 수 있는 것을 알고 있어야 한다.
구조
본 발명의 핵산을 구성하는 유용한 구조는 기술 내에서 알려진 방법에 따라 공식화 될 수 있다. 하나의 구현에서, 이러한 구조는 조성물이라고 불리운다. 공개된 구조 는 본 발명에 나오는, 첫 번째 구현의 핵산 같은, 약학적으로 용인되는 수송체와 연결되어 있는 핵산을 하나 이상 포함할 수 있다. 이러한 수송체 및 구성 방법의 예시는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(제20판, Lippincott, WILLiams & Wilkins, Daniel Limmer 편집)에서 찾을 수 있다. 효과적인 투여에 적절한 약학적으로 용인되는 구성을 만들기 위해서는, 공개된 프로테오글리칸 핵산 및 기타 단백질, 핵산, 또는 조절 화합물의 양이 효과를 낼 수 있는 수준으로 이러한 구조에 포함되어야 할 것이다. 핵산분자는 여기에 기술된 바와 같이 적절한 벡터와 결합하여 이용될 수 있으며 기술된 구조가 구조 이러한 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 본공시의 치료 및 예방 방법에서 이용될 수 있다. 이러한 구조 는 여기에 공개된 치료 및 예방 방법에 있어 효과적일 수 있도록 하기 위하여, 포함된 핵산이 치료에 효과를 볼 수 있는 양을 전달하기에 충분한 양으로 개체에게 투여한다. 치료에 효과를 볼 수 있는 양은 (꼭 한정적이지는 않으나) 개체의 조건, 체중, 성별 및 연령 같은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 다른 인자는 투여방식 및 지점이다. 조성물은 기술에서 알려진 어떤 방법으로건 개체에게 제공될 수 있다. 대표적인 투여 경로는 (꼭 한정적이지는 않으나) 피하, 정맥, 국소, 피부 내, 경구, 골내부 및 근육 내를 포함한다. 본 발명의 구조는 개체에 1회 이상으로 투여될 수 있다. 더구나, 조성물이 개체에게 1회 이상 투여되는 경우에는, (꼭 한정적이지는 않으나) 일 1회, 주 1회, 월 1회 또는 연 1회 같은, 섭생의 다양성이 이용될 수 있다. 또한 조성물은1일 1회 이상 개체에게 투여될 수도 있다. 치료에 효과를 볼 수 있는 핵산분자의 양과 적절한 투약방법이, 잠재적인 부작용을 최소화 하면서, 최적의 활동성을 얻기 위한 일상시험에 의해서 결정될 수 있다. 이외에도, 다른 에이전트와의 동시 투여 또는 순차 투여가 요구될 수 있다.
본 발명의 조성물은 정맥투여 같이 조직적으로 투여될 수 있으며 피하 주사 또는 고약 또는 크림의 적용 같이 국소으로 투여될 수도 있다. 세포에서의 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 생산은 조직을 샘플링하여 이를 노던블로팅이나 웨스턴블로팅 같은 전통적인 수단을 이용하여 발현을 측정하는 것으로 입증될 수 있다.
본 발명의 구조는 또한 용해도, 반감기, 흡수, 등을 개선하는, 핵산 분자 또는 프로테오글리칸 펩타이드 분자의 에이전트를 분비 전이나 분비 후에 포함할 수도 있다. 더구나, 본 발명의 구조는 달갑지 않은 부작용을 감소시키거나 생성된 프로테오글리칸 펩타이드의 독성을 감소시키는 에이전트를 포함할 수도 있다. 이러한 에이전트들의 예시는 (꼭 한정적이지는 않으나) Remington: The Science and Practice of Pharmacy(제 20판, Lippincott, WILLiams & Wilkins, Daniel Limmer 편집)같은 다양한 텍스트에 기술되어 있다.
본 발명의 구조는 투여를 위한 투약형태의 광범위한 다양성 안에서 집행될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 (꼭 한정적이지는 않으나) 정제, 캡슐, 사체(가루약), 로젠지(사탕형태), 트로키(정제), 알약, 파우더, 과립, 엘릭시르, 팅크, 용액, 현탁액, 엘릭시르, 시럽, 연고, 크림, 고약, 유액, 또는 정맥 투여나 주사를 위한 용액 같은 형태로 투여될 수 있다. 다른 투약형태로는 패치 기구나 연고를 이용한 경피투여가 있다. 앞서 말한 어느 형태라 하더라도 제한적인 방출 및/또는 일관된 방출 형태를 제공하는 형태로 변경될 수 있다.
본 발명에서, 조성물은 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 활성성분으로 포함하고 있으며, 약학적으로 용인되는 수송체에 의하여 보통 투여된다. 핵산 분자는 투여되는 본 발명의 벡터와 같이 혹은 벡터의 한 부분으로서 투여된다. 이러한 약학적으로 용인되는 수송체로는 (꼭 한정적이지는 않으나) 용액, 보조약, 계면활성제, 침강방지제, 에멀션화제, 충전재, 희석제, 첨가제, 습윤제, 결합제, 윤활제, 완충제, 분해제 및 수송체가 있으며, 부가제로서는 (꼭 한정적이지는 않으나) 착색제 및 감미제(여기에서는 집합적으로 수송체로 언급됨) 같은 것이 포함된다. 일반적으로, 약학적으로 용인되는 수송체는 활성혼합체에 화학적으로 비활성이며 이용 조건에 있어 해로운 부작용이나 독성이 없다. 약학적으로 용인되는 수송체는 폴리머와 폴리머 기질이 포함될 수 있다. 약학적으로 용인되는 수송체의 본성은 선택되는 특정 투약형태와 조성물의고유성에 따라 틀려질 수 있다.
예를 들자면, (꼭 한정적이지는 않으나) 정제, 캡슐, 사체(가루약), 로젠지(사탕형태), 트로키(정제), 알약, 파우더, 또는 과립 같은 고체 형태로 경구투여를 하기 위하여는 본 발명의 핵산 분자는 (꼭 한정적이지는 않으나) 충전재, 적절한 결합제, 윤활제, 분해제 및 부가제 같은 경구, 비독성의 약학적으로 용인되는 비활성 수송체와 결합하여야 한다. 적절한 결합제에는 (글루코스나 베타 락토스, 옥수수 감미료 같은) 녹말, 젤라틴, 천연설탕, (아카시아, 트래거캔스 또는 알긴산나트륨, 카복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 및 기타 등등과 같은) 자연산 또는 인공 검이 제한 없이 포함된다. 이러한 투약형태에 이용되는 윤활제에는, 제한 없이, 올레인산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 등이 제한 없이 포함된다. 분해제에는 녹말, 메틸셀룰로스, 한천, 벤토나이트, 크산탄 검 등이 제한 없이 포함된다.
정제 형태에는 다음과 같은 하나 이상의 것들이 포함될 수 있다: 여기에 언급된 다른 수송체 뿐만 아니라, 락토스, 자당, 마니톨, 옥수수 녹말, 감자 녹말, 알긴산, 결정셀룰로스, 아카시아, 젤라틴, 구아검, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카멜로스 나트륨, 탈크, 시트르산마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 아연, 스테아르산. 로젠지 형태는 맛에서의 활성성분(일반적으로 자당 및 아카시아 또는 트래거캔스)을 포함할 수 있으며, 젤라틴 및 글리세린, 또는 자당 및 아카디아, 유액 같은 비활성 베이스에 활성성분을 포함하는 향정 뿐만 아니라, 활성성분에 더하여, 기술 내에서 알려진 이러한 수송체를 포함하는 젤을 포함할 수 있다.
(꼭 한정적이지는 않으나) 팅크, 용액, 현탁액, 엘릭시르, 시럽 같은 경구 액상 형태에는, 본 발명의 핵산 분자가 물, 식염수, 또는 알콜 같은 희석제로 희석될 수도 있다. 더구나, 경구 액상 형태는 적절하게 맛나도록 현탁액이나 트래거캔스, 아카시아, 메틸셀룰로스 등의 합성 또는 천연 검 같은 분산제를 포함할 수 있다. 게다가, 요구되거나 필요할 때에는, 적절한 착색제 또는 기타 부가제는 또한 혼합물 형태로 합성될 수 있다. 적용 가능한 기타 분산제에는 글리세린 등이 있다.
비경구 투여의 적절한 형태에는 수용성 및 비수용성, 항산화제, 완충제, 세균발육저지제 및 환자의 혈액과 등장한 형태를 나타내는 용매를 포함하는 생리 무균 주사 용액 및 침강방지제를 포함할 수 있는 수용성 및 비수용성 무균 현탁액, 솔루빌라이져, 농유제, 안정제 및 방부제가 포함된다. 본 발명의 핵산 분자는 무균용액 또는 물, 식염수, 수용성 포도당을 포함하는 혼합 용액 같은, 생리적으로 용인되는, 연관 당용액, 에탄올, 이소프로판올, 또는 세틸알콜, 프로필렌글리콜 또는 폴리(에틸렌글리콜) 400같은 글리콜 알콜, 2,2-디메칠-1,3-디옥솔란-4-m에탄올, 에테르, 오일, 지방산, 지방산 에스테르 또는 글리세리드 같은 글리세롤 케탈과 같은 폴리에틸렌 글리콜, 또는 약학적으로 용인되는 계면활성제를 추가한 혹은 추가하지 않은 아세틸지방산, (꼭 한정적이지는 않으나) 알칼리금속염, 오일 혹은 세제, (꼭 한정적이지는 않으나) 펙틴, 카보머, 메틸셀룰로스, 하이드로옥시프로필메틸셀룰로스, 또는 카복시메틸셀룰로오스, 또는 에멀션화제 및 기타 약학적 보조약 같은 침강방지제 같은 것을 포함하는 희석액 내에서 투여될 수 있다.
비경구 형태로 이용될 수 있는 오일에는, 석유, 동물성오일, 식물성오일, 또는 인조 오일이 있다. 오일의 특정한 예시에는 땅콩, 대두, 참깨, 목화씨, 옥수수, 올리브, 페트롤레이텀 및 미네랄이 포함될 수 있다. 비경구 형태의 이용에 적절한 지방산에는 소르비탄 모눌리에이트 및 프로필렌글리콜, 올레산, 스테아르산 및 이소스테아르산을 지니는 산화프로필렌의 응축에 의하여 생성된 소수성 기반의 에틸렌산화물의 고분자 중량 부가물 같은 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르가 포함된다.
에틸올레이트 및 이소프로필 미리스테이트 적절한 지방산 에스테르의 예시이다. 비경구 형태의 이용에 적절한 알칼리금속염은 지방성 알칼리금속, 암모늄, 및 트리에탄올아민염을 포함하며 적절한 세제는 (a) 예를 들자면, 디메칠디알킬암모늄 헬라이드 및 알킬피리디니움헬라이드 같은 양이온성 세정제 (b) 예를 들자면, 알킬, 아릴, 및 올레핀 술폰산염, 올레핀 알킬, 올레핀, 에테르, 및 올레핀 모노글리세리드 황산 및 설포석시네이트 같은 음이온 세제 (c) 예를 들자면 비이온 세제, 지방성 아민산화물, 지방산 알칸올마이드, 폴리옥시에틸렌 폴리프로필렌혼성폴리머, (d) 예를 들자면, 알킬 베타아미노프로피온산 및 2-알킬이미다졸린 4기 암모늄 염 같은 양성 세제 및 (e) 그 혼합물 같은 것을 포함한다.
적절한 방부제 및 완충제는 이러한 형태 내에서 이용될 수 있다. 주사지점에서의 자극을 최소화하거나 제거하기 위하여, 이러한 조성물은 대략 12에서 17 사이의 계면활성도(HLB)를 지니는 하나 이상의 30 비이온 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 형태에서의 계면활성제의 양은 중량 기준 약 5%에서 약 15%까지의 범위에 분포한다.
본 발명의 핵산 분자를 포함하는 (꼭 한정적이지는 않으나) 연고, 크림, 고약, 유액 같은 국소적인 투약형태는 기술 내에서 잘 알려진 수용체 물질, 즉 알콜, 알로에베라젤, 알란토인, 글리세린, 비타민 A 및 E 오일, 미네랄 오일, PPG2 미리스틸 프로피온산 등과 같은, 알콜성 용액, 국소적인 세정제, 클렌징 크림, 피부 젤, 피부 로션, 및 크림 혹은 젤 형태의 샴푸를 만드는 물질의 다양성 내에서 혼합될 수 있다. 피부 각질 또는 피부 마모 대비제의 포함 역시 이용될 수 있다. 이러한 국소적인 대비는 트렌스스킨 전달을 위한 패치, 붕대 또는 드레싱에 적용되거나 상처 또는 피부손상지점에 직접적으로 전달되게 하기 위한 붕대 또는 드레싱에 적용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 소형 단층 수포, 대형 단층 수포 및 다층수포 같은 리포좀 전달 시스템의 형태로 투여될 수도 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린 같은 인지질의 여러 태에서 형성될 수 있다. 이러한 리포좀은 리포좀을 특정 세포타입 또는 세포타입의 그룹에 직접적으로 전달하기 위한 단일클론 항체를 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 목표를 정할 수 있는 약물 수송체로서 용해성 폴리머와 연결될 수도 있다. 이러한 폴리머에는 (꼭 한정적이지는 않으나) 폴리비닐피롤리돈, 피란 혼성폴리머, 폴리하이드로옥시프로필메타크릴-아마이드페놀, 폴리하이드록시 에틸라스파트아마이드페놀, 또는 팔미토일 잔여물을 대신할 수 있는 폴리에틸에네옥사이드폴리라이신이 포함될 수 있다. 더구나, 본 발명의 화합물은 약물의 통제된 방출을 달성하는데 유용한, 예를 들어, 폴리유산, 폴리입실런 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로-피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 상호연계되거나 하이드로겔의 양친매성 블록 혼성폴리머 같은 생물분해성 폴리머의 종류와 연결될 수 있다.
치료 및 예방 방법
하나의 구현에서, 본 발명의 내용은 상처 또는 피부손상을 치료하는 방법 내에서 핵산 및 본 발명의 조성물의 이용법을 제공한다. 치료방법은 이러한 핵산 또는 이러한 핵산을 포함하는 혼합물 및 이러한 치료가 필요한 개체 내의 상처 또는 피부손상을 효과적으로 치료하기 위하여 제공하는 단계를 포함한다.
하나의 구현에서, 본 발명의 내용은 상처 또는 피부손상을 예방하는 방법으로 이러한 핵산 및 조성물을 이용을 제공한다. 치유 또는 진압 방법은 이러한 핵산이 제공하는 단계 또는 이러한 핵산을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계와 이러한 예방이 필요한 개체 내의 상처 또는 피부손상을 효과적으로 예방할 수 있는, 치료에 효과를 볼 수 있는 양과 동일하게 적용되는 단계를 포함한다.
핵산 전달 방법
본 발명의 핵산 분자를 개체의 목표세포에 전달할 수 있는 다양한 방법들이 현재 알려져 있다. 이러한 방법은 어떤 것이건 이용될 수 있다. 핵산분자가 각질층을 통과해서 전달될 수 없다는 것은 오랫동안 용인된 개념이다. 그러나, 지난 10년간의 연구들은 플라스미드DNA가 피부 장벽을 뚫고 전달될 수 있으며 다양한 지질 수포의 이용을 통하여 한 단백질 발현을 야기할 수 있다는 것을 보여준다(Raghavachari 외, J Pharm Sci 91(3): 615-22, 2002; Patil 외, Aaps J 7(1): E61-77, 2005). 이외에도, DNA 선택을 통합하는 바이러스는 많은 다양한 조직 타입의 세포를 성공적으로 감염시키며 필요한 폴리펩타이드를 분비한다(Patil 외, Aaps J 7(1): E61-77, 2005). 피부세포의 바이러스 감염은 피하주사에 의하여(Setoguchi 외, J Invest Dermatol 102(4): 415-21, 1994), 유전자총 또는 압력을 이용한 전송장치를 통해서(Gaffal 외, Eur J Cell Biol . , e-publication, 2006.08.21), 빛에 의한 마모 후의 직접적인 집행에 의해서(Shi 외, J Virol 75(23): 11474-82, 2001) 성공적이었다. 각질층을 통한 핵산의 전달은 최근 다수의 치료요법 및 백신접종 기법에 있어 실행가능하며 실용적인 방법이 되었다. 이 기법들은 본 발명의 적용성을 증명하기 위하여 논의된다.
본 발명은 (꼭 한정적이지는 않으나) 상피세포 같 개체의 살아있는 세포로의 핵산 분자의 전송을 계획한다. 이러한 세포 타입에는 (꼭 한정적이지는 않으나) 표피 케라티노사이트(표피 세포와 구별됨), 표피 기저세포(줄기세포), 손톱과 발톱의 케라티노사이트, 손톱층 기저세포(줄기세포), 수질 모간 세포, 피질 모간 세포, 표피 모간 세포, 표피 모근소 세포, 헉슬리층(내상피층)의 모근소 세포, 헨레층(외상피층)의 모근소 세포, 외부모근소 세포의 모근소 세포, 모발 기질 세포(줄기세포), 원핵세포(박테리아), 진핵세포(식물 및 동물 세포 세포), 각막 중층편평상피의 표면 상피 세포 , 혀, 구강, 식도, 항문관, 말단 요도 및 질, 각막상피의 기저세포(줄기세포), 혀, 구강, 식도, 항문관, 말단 요도 및 질, 비뇨기 상피 세포(비뇨기 방광과 비뇨기 도관 내부), 타액 선 점액질 세포(다당류가 풍부하게 분비), 타액 선 혈청 세포(당단백질 효소가 풍부하게 분비), 혀의 외측설선 세포(미뢰세척), 젖샘 세포(유즙분비), 눈물샘 세포(눈물분비), 귀의 귀지샘 세포(귀지 분비), 에크린 한선 암세포(당단백질 분비), 에크린 한선 투명세포(소분자 분비), 아포크린 한선 세포(암내 분비, 성호르몬에 민감), 눈꺼풀 내의 몰세포선(분화된 한선), 피지선 세포(지질이 풍부한 피지분비), 코의 보우만선 세포(후각 상피를 세척), 십이지장의 브루너선(효소 및 알칼리성 점액), 저정낭세포(정액의 움직임을 위한 과당을 포함한 정액 조성물질을 분비,), 전립선 세포(정액 조성물질을 분비), 구요도샘l 선 세포(점액 분비), 바르톨린선 세포(질 윤활제 분비), 점액세포선(점액 분비), 자궁 내막 세포(탄수화물 분비), 호흡기 및 소화관의 고립 배상세포(점액 분비), 위 내부 점액질 세포(점액 분비), 위샘 효소 세포(펩시노겐 분비), 위샘 산분비 세포(염산 분비), 췌장 포상세포(중탄산염 및 소화효소 분비), 소장의 파네트 세포(라이소자임 분비), 폐의 폐포대식세포(계면활성제 분비), 폐의 비섬모상피세포(클라라세포), 뇌하수체전엽 세포, 성장자극세포, 프로락틴 분비세포, 갑상샘, 성선자극호르몬 분비세포, 코르티코트로프, 뇌하수체 중엽세포, 분비 멜라노사이트자극 호르몬, 거대세포 신경분비 세포, 분비 옥시토신, 분비 바소프레신, 세로토닌을 분비하는 내장 및 기도 세포, 엔도르핀 분비, 성장억제호르몬 분비, 가스트린 분비, 세크레틴 분비, 콜레사이토키닌 분비, 인슐린 분비, 글루카곤 분비, 봄베신 분비, 갑상선 세포, 갑상선 상피 세포, 여포방 세포, 부갑상선 세포, 10 부갑상선 주세포, 호산세포, 부신 세포, 크롬친화성세포, 스테로이드 호르몬 분비(미네랄코르티코이드 및 글루코코르티코이드), 테스토스테론을 분비하는 정소의 라이디히 세포 분비, 에스트로겐을 분비하는 원시난포의 내난포막세포, 프로게스테론을 분비하는분열된 원시난포의 황체세포, 신장 사구체옆장치 세포(레닌 분비), 신장의 치밀반 세포, 신장의 혈관극주위세포, 신장의 사구체간질 세포, (미세융모에 있는) 장브러시 보더 세포, 외분비선 선형 도관세포, 쓸개 상피 세포, 신장 근위세뇨관 브러시 보더 세포, 신장 말단 세관 세포, 수출세관 비섬모세포, 부고환 주세포, 부고환 기저세포, 간세포(간 세포), 백색지방질세포, 갈색지방질세포, 간 지방세포, (폐의 공기공간을 연결하는) 평평상피세포, 췌장 도관세포(샘꽈리중심세포), (한선, 타액 선, 젖샘 등의) 비선성 도관세포, 신장 사구체 체벽 세포, 신장 사구체 족세포, (신장 내) 헨네 쇄의 얇은 부분 세포, 신장 수집 도관세포, (저정낭, 전립선 등의) 도관세포, 혈관 및 림프 도관 내피 유창 세포, 혈관 및 림프 도관 내피 연결 세포, 혈관 및 림프 도관 내피 비장세포, 활액 세포 (관절공을 연결하며 히알루론산 분비), (복막, 늑막, 및 심장막강을 연결하는) 장막 세포, (귀의 외림프를 연결하는) 편평상피세포, (귀의 내림프 공간을 연결하는) 편평상피세포, (귀의 내림프 공간을 연결하는) 미세융모가 있는 내림프낭의 주상세포, (귀의 내림프 공간을 연결하는) 미세융모가 없는 내림프낭의 주상세포, (귀의 내림프 공간을 연결하는) 암세포, (귀의 내림프 공간을 연결하는) 전정 막 세포, (귀의 내림프 공간을 연결하는) 혈관조 기저세포, (귀의 내림프 공간을 연결하는) 혈관조 주변세포, 클라우디오스 세포, (귀의 내림프 공간을 연결하는) 보예처 세포, 맥락총 세포(뇌척수액 분비), 연-거미막 편평상피세포, 눈의 색소가 있는 속눈썹 상피 세포, 눈의 색소가 없는 속눈썹 상피 세포, 각막 내피세포, 기도 섬모세포, (여성의) 난관 섬모세포, (여성의) 자궁내막섬모세포, (남성의) 망상조직 정소 솜털 세포, (남성의) 고환날세관 섬모세포, (뇌강을 연결하는) 중앙 신경계 시스템의 솜털 상의세포, 에나멜 모세포 상피 세포(치아 에나멜 분비), 귀의 전정기관의 편평 반달면 상피 세포(프로테오글리칸 분비), 코르티 조직 치간 상피 세포 (모발세포를 덮는 분비 표피 막), 느슨한 결합조직 섬유아세포, 각막 섬유아세포, 건 섬유아세포, 골수 세망조직 섬유아세포, 기타 비상피성 섬유아세포, 혈관주위세포, 추간판의 수핵 세포, 시멘트질모세포/백악질세포(치근의 뼈와유사한 백악질 분비), 조치세포/치아모세포(치아 상아질 분비), 유리질 연골세포, 섬유 연골세포, 탄성 연골세포, 골아세포/골세포, 간세포(골아세포의 줄기세포), 눈의 유리체의 유리체세포, 귀의 외림프 공간의 방사상 세포, 적색 뼈대근육 세포(느린), 백색 뼈대근육 세포 (빠른), 중간 뼈대근육 세포, 근방추의 핵낭 세포, 근방추의 핵고리 세포, 위성세포(줄기세포), 심장근육세포, 심장결절근육세포, 푸르키니예 섬유세포, 평활근 세포(여러 형태), 홍채의 근사피세포, 외분비선의 근사피세포, 적혈구, 거핵세포(혈소판 전구체), 단핵백혈구, 결합조직 대식세포(여러 형태), 표피 랑게르한스 세포, (뼈 속의) 용골세포, (임파 조직내의) 수지상돌기 세포, (중앙 신경계 시스템 내의) 소교세포, 호중성 과립구, 호산성 과립구, 호염기성 과립구, 비만세포, 조력자 T 세포, 억제자 T 세포, 세포독성 T 세포, B 세포, 자연살상 세포, 망상적혈구, 혈액과 면역체계에 적용되는 줄기세포 및 원종세포(여러 형태), 코르티 조직의 이소골 내부 모발 세포, 코르티 조직의 이소골 외부 모발 세포, 후각 상피의 기저세포(후각 뉴런을 위한 줄기세포), 냉감성 원발성 감각신경, 열감성 원발성 감각신경, 표피의 메르켈 세포(터치 센서), 후각수용체 뉴런, 통감성 원발성 감각신경(여러 형태), 눈의 광수용체 간상세포, 눈의 광수용체 청감성 원추세포, 눈의 광수용체 녹감성 원추세포, 눈의 광수용체 적감성 원추세포, 고유수용 원발성 감각신경(여러 형태), 촉감성 원발성 감각신경(여러 형태), 타입 I 경동맥 세포체(혈액 pH 센서), 타입 II 경동맥 세포체(혈액 pH 센서), 귀의 전정기관의 타입 I 모발 세포(가속 및 중력), 귀의 전정기관의 타입 II 모발 세포(가속 및 중력), 타입 I 미뢰 세포, 콜린성 신경세포(여러 형태), 아드레날린 작용 신경세포(여러 형태), 펩타이드성 신경세포(여러 형태), 코르티 조직의 내부 주상세포, 코르티 조직의 외부 주상세포, 코르티 조직의 내부 지골 세포, 코르티 조직의 외부 지골 세포, 코르티 조직의 표피 세포, 코르티 조직의 헨센 세포, 전정 기관 지지 세포, 타입 I 미뢰 지지 세포, 후각 상피 지지 세포, 슈반 세포, 위성세포(캡슐화된 말초신경 세포체), 장 신경교세포, 성상세포(여러 형태), 뉴런 세포(상당히 다양한 타입을 지니고 있으나, 아직 알려진 바는 거의 없음), 희돌기아교세포, 방추 뉴런, 수정체 렌즈 상피 세포, 크리스탈린을 포함하는 렌즈 섬유 세포, 카란 세포, 멜라노사이트, 망막 색소 상피 세포, 난원세포/난모세포, 정세포, 정모세포, 정원세포(정모세포의 줄기세포), 정자, 난포 세포, (정소에서의) 지지세포 및 흉선상피 세포를 포함한다.
이러한 세포는 일반적으로 포유류의 세포이며 하나의 구현에서는 인간 세포이다. 따라서, 이러한 전송을 위하여 선택된 벡터는 포유류 발생의 살아있는 세포로 본 발명의 핵산 분자를 전달하기에 적절하여야 한다.
본 발명에 포함된 벡터는 넓은 영역의 매커니즘을 포함하는 것으로 여겨진다. 벡터에는 바이러스 성 및 비바이러스성 벡터 모두가 포함된다. 비바이러스성 벡터는 (꼭 한정적이지는 않으나) 플라스미드, 리포좀, (사이토펙틴 같이) 전기적으로 충전된 지질, DNA-단백질 합성 및 생체고분자를 포함한다. 이러한 비바이러스성 벡터는 기술 내에서 알려진, 인산칼슘 공침, 리포좀 트랜스펙션, 세포융합, 수용체-전달방식의 유전자 전달, 네이키드 DNA 주사, 전기 천공법 및 생물탄도비행 또는 분자 가속을 포함하여 어떠한 방법을 이용하여서도 세포 내로 전달될 수 있다.
벡터로서 이용하기에 적절한 플라스미드에는 (꼭 한정적이지는 않으나) pcDNA3, pMC 1 neo, pXT1, pSG5, EBO-pSV2, pBPV-1, pBPV-MMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pUCTag, IZD35, pHB-Apr-1 -neo, EBO-pcD-XN, pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2dhfr, pTk2, pMSG, pSVT7, pKoneo 및 pHyg가 포함된다. 이러한 플라스미드는 숙주세포 내에서의 자발적 복제를 위한 복제의 기원, 선택적 표지자, 다수의 유용한 한정 효소 지점, 높은 복제 넘버에 대한 가능성 및 특정세포타입에서 활성화되는 프로모터를 포함하고 있다. RNA 폴리메라아제가 핵산에 붙도록 유도하며 초기 RNA합성을 유도하는 프로모터는 핵산 서열에 의해 정의된다.
바이러스성 벡터는, 감염 및 트랜스펙션을 포함하는, 기술 내에서 알려진 어떤 방법을 이용해서라도 세포 내로 전달될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 바이러스 벡터는 (꼭 한정적이지는 않으나) 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 소 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 아데노 연관바이러스 천연두 바이러스, 바큘로바이러스, 우두 바이러스, 헤르페스바이러스 및 둘 혹은 그 이상의 바이러스 벡터 타입의 변형체 에서 파생된 벡터를 포함한다.
아데노바이러스는 핵산을 세포 타입으로 효과적으로 전달하도록 변형이 가능한 진핵DNA 바이러스이다. 타입 2 와 타입 5 인간 아데노바이러스 및 동물 발생 아데노바이러스를 포함하는 아데노바이러스의 다양한 항원형이 존재한다. 하나의 구현에서, 아데노바이러스는 불완전한 복제이며 LTR, 염기서열 및 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 특정 구현에 있어, 적어도 아데노바이러스 벡터의 El지역은 비기능적이다. 다른 지역은 E3 지역(W095/02697 참고), E2 지역(W094/28938참고), E4 지역(W094/28152, W094/12649, 및 WO 95/02697 참고), 또는 L1에서 L5 사이의 느린 유전자 중 어느 것을 포함하도록 수정될 수 있다
아데노바이러스 벡터는 기술 내에서 숙련된 사람에 의해 알려진 기법에 의해 만들어질 수 있다. 특히 아데노바이러스와 본 발명의 핵산 분자를 옮기는 플라스미드 간의 상동재조합에 의하여 만들어질 수 있다. 상동재조합은 다음의 아데노바이러스와 플라스미드를 적절한 세포 라인으로 옮기는 상호트랜스펙션에 영향을 받는다. 선택된 세포 라인은 언급된 조성물질에 의하여 전달 가능해야 하며 (복제 불완전한 아데노바이러스가 사용된다면) 복제 불완전한 아데노바이러스에서 손상된 지역을 보완할 수 있는 서열을 포함하여야 한다. W094/26914 및 W095/02697에 언급된 바와 같이, 이용될 수 있는 세포라인의 예시는 게놈에 통합된 Ad5 아데노바이러스(12%)의 놈의 왼손 부분을 포함하는 인간 태아의 세포라인 293(Graham 외, J. Gen. Virol. 36, 59(1977)), 과 El 및 E4 기능을 포함할 수 있는 세포라인이다. 재조합형 아데노바이러스는 기술 내에서 일반적인 스킬을 지닌 이들에게 알려져 있는 표준 생물기법을 이용하여 복구되고 정련된다.
유용한 아데노바이러스 벡터의 한 클래스는 Bett 외, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 91:8802-6(1994)에 따라 만들어질 수 있는데, 여기에는 El 및 E3 지역 내에서의 추가 또는 탈락을 이용하는 아데노바이러스 벡터의 구조에 대한 시스템을 기술하고 있다.
아데노바이러스 벡터는 높은 역가(ml당 1010에서 1012 전염 단위)에서 생성될 수 있으며, 시험관 실험 또는 생체실험에서, 감염된 목표세포 내의 요구되는 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 일시적으로 발현하기 위하여 이용될 수 있다.
레트로바이러스는 통상적으로 분열된 세포를 감염시키는 통합된 바이러스이다. 렌티바이러스는 분열하지 않고 있는 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 타입이다. 아래의 논의는 일반적으로 레트로바이러스에 적합한데 렌티바이러스도 포함시킬 수 있다. 레트로바이러스 게놈은 두 개의 긴 말단 반복(LTRs), 염기서열 및 3개의 코딩 지역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합형 레트로바이러스 벡터의 구조는 기술 내에서 스킬을 지닌 이들에게 알려져 있다.
재조합형 레트로바이러스 벡터 내에서, gag, pol, env 유전자는 보통 전체 혹은 부분적으로 삭제되고 변형체조직의 핵산 서열을 이용하여 재배치된다. 이러한 벡터는 M-MuLV, MSV(쥐과의 몰로니 육종바이러스), HaSV(하비 육종바이러스), SNV(비장 괴사 바이러스), RSV(로우스 육종바이러스) 및 프렌드 바이러스 같은 레트로바이러스의 다른 타입에서 구성될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합형 레트로바이러스를 구성하기 위하여는, LTRs, 염기서열 및 코딩서열을 포함하는 플라스미드가 구성된다. 이 구성은 포장세포라인을 세포감염시키는데 이용되는데, 이러한 세포라인은 플라스미드 내에서 부족한 레트로바이러스의 기능을 치환하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 일반적으로, 포장세포라인은 gag, pol, env 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 포장세포라인은 선행기술에서 설명되어 왔다. 특정 세포라인에서, PA317(미국특허번호 4,861,719), PsiCRIP 세포라인(W090/02806) 및 GP+envAm-12 세포라인(W089/07150) 이 이용될 수 있다. 재조합형 레트로바이러스 벡터는 기술 내에서 일반적인 스킬을 지닌 이들에게 알려져 있는 표준 기법을 이용하여 정련된다.
HIV-1, HIV-2, 및 SIV 같이, 렌티바이러스에서 파생된 레트로바이러스 벡터는 to 분열되지 않은 세포로의 전달을 위해 이용될 수 있다. 이러한 바이러스들은 M-MuLV 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV) 같은 다른 바이러스의 표면 당단백질을 이용하여 슈도타이핑 될 수 있다. VSV 당단백질을 이용하여 슈도타이핑 된 고 역가 HIV-1의 생산은 Bartz 와 Vodicka에 의하여 Method 12(4):337-42(1997)에 공개되었으며, 약화된 렌티바이러스 벡터의 증가는 Zufferey 외에 의하여 Nature Biotechnology 15:871-75(1997) 에 공개되었다. 이러한 렌티바이러스 벡터는 분열되지 않은 세포를 감염시킬수 있고, 광대한 호스트 범위를 지니며, 초원심분리를 이용하여 고 역가로 응축될 수 있다.
가상 아데노바이러스/레트로바이러스 벡터 시스템은 효과적인 유전자 전달 및 장기간의 발현을 얻기 위하여 이용될 수도 있다. 아데노바이러스 벡터가 생체실험에서 일시적 레트로바이러스 생산자 세포를 생성하기 위하여 이용되는, 프로제니 레트로바이러스분자가 인접세포를 감염시키거나 하는, 가상 바이러스 시스템이 Feng 외에 의하여 Nature Biotechnology 15:866-70(1997.09 )에 기술되어 있다.
본 발명의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터는 분자생물학의 표준기법을 이용하여 여러 방식으로 발생시킬 수 있다. 포유류의 세포에서의 안정적이고 높은 레벨의 발현을 위하여 벡터는 적절하여야 한다. 초기 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)/인핸서 같은, 삽입된 핵산의 발현을 드라이브하는 강한 바이러스 프로모터를 포함하는 레트로바이러스 벡터가 이용될 수 있다.
본 발명의 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 발현을 합성하는 벡터 합성하는 발현은 개체 여기에 기술된 바와 같이 개체에 투여된다.
효과적인 양은 내과 의사 또는 다른 자격이 있는 의료 전문가에 의하여 정해질 수 있다. 재조합형 바이러스는 일반적으로 약 104~1014pfu, 약 106~109pfu, 또는 약 106~108pfu의 1회 분량으로 형성되고 투여된다
여기에서 기술된 핵산 조작을 수행하는 데에는, 핵산을 조작하고 수정하는 다양한 기법들이 이용될 수 있다. 이러한 기법을 실증하는 것은 다음과 같다. Gene Probes for Vacteria(Macario and De Marcario, editors, Academic Press Inc., 1990); Genetic Analysis , Principles Scope and Objectives(John R. S. Ficham, Blackwell Science Ltd., 1994); Recombinant DNA Methodology II(Ray Wu, editor, Academic Press, 1995); Molecular Cloning . A Laboratory Manual(Maniatis, Fritsch, and Sambrook, editors, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982); PCR(Polymerase Chain Reaction ), (Newton and Graham, editors, Bios Scientific Publishers, 1994). 여기에 열거된 각각의 앞서 말한 참고문헌은 공시를 전체적으로 설명하는 것과 같은 참고문헌에 의하여 통합되어 있다.
도 1A 및 1B는 신호 서열을 구성하는 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 섬유아세포 및 내피세포에서 분비되는 것을 설명하고 있다.
도 1 A는 가용화된 잔여 세포기질 샘플 100 ㎕ 의 96-웰 도트블롯 및 조건배지의 100 ㎕(비치견본으로 표기)을 보여준다. 면역반응은 항-D I mAb A71을 이용하여 평가되었다. 컬럼 1과2는 퍼레칸Dl-Ad 및 관리배지 RevD 1-Ad를 이용한 감염 후 9일 후의 배지에서의 원발성 인간 내피세포배양에서의 가용화된 잔여 세포기질을 각각 나타낸다. 컬럼 3과4는 퍼레칸Dl-Ad 및 관리배지 RevD 1-Ad를 이용한 감염 후 5일 후의 배지에서 제거된 원발성 인간 내피세포배양으로부터의 조건배지를 각각 나타낸다. 컬럼 5와 6은 퍼레칸Dl-Ad 및 관리배지 RevD 1-Ad를 이용한 감염 후 6-9일 후의 배지에서 제거된 원발성 인간 내피세포배양으로부터의 조건배지를 각각 나타낸다.
도 1B는 가용화된 잔여 세포기질 샘플 100 IA의 96-웰 도트블롯과 of the 조건배지(비치견본으로 표기)의 100 ㎕을 나타낸다. 면역반응은 항-D5 mAb A74 을 이용하여 평가되었다. 컬럼 1과 2는 퍼레칸D1 -Ad 및 관리배지 RevD 1-Ad를 이용한 감염 후 9일 후의 배지에서의 원발성 인간 내피세포배양에서의 가용화된 잔여 세포기질을 각각 나타낸다. 컬럼 3과 4는 퍼레칸Dl-Ad 및 관리배지 RevD 1-Ad를 이용한 감염 후 5일 후의 배지에서 제거된 원발성 인간 내피세포배양으로부터의 조건배지를 각각 나타낸다. 컬럼 5와 6은 퍼레칸Dl-Ad 및 관리배지 RevD 1-Ad를 이용한 감염 후 6-9일 후의 배지에서 제거된 원발성 인간 내피세포배양으로부터의 조건배지를 각각 나타낸다.
도 2는 항-D1 mAb A71을 이용하여 가시화시킨 무혈청 배지에서의 8일 후, 퍼레칸Dl-Ad 및 RevD1-Ad에 의하여 감염된 세포의 섬유아세포 조건배지의 웨스턴블로 팅을 나타낸다. 레인 1은 퍼레칸D 1-Ad에 의하여 감염된 섬유아세포배양에서의 조건배지를 , 레인 2는 the RevD1-Ad에 의하여 감염된 섬유아세포배양에서의 조건배지를 나타낸다. 레인 1에서의 면역반응성 물질은35kDa에서의 우성조건에서 32kDa에서 42kDa까지 확장되었다.
도 3A은 헤파란 황산 글리코스아미노글리칸 쇄와 콘드로이친 황산을 인식하는 항체 내에서의 황화의 돌연변이을 인식하는 항체패널을 이용하여, 퍼레칸 D1 -Ad에 의하여 감염된 원발성 인간 내피세포로부터의 조건배지를 면역블로팅(도트블로팅) 한 것이다. 2Q546 항-헤파란 황산 단일항체는 고도로 황화된 헤파란 황산을 인지하는 반면, Hep-SS1 항체는 낮은 수준으로 황화된 헤파란 황산을 인지한다. mAb CS56는 콘드로이친 황산을 인지한다. 도트블롯의 꼭대기 줄에는 표준 헤파린 황산 프로테오글리칸이 관리시료로 포함되어 있는데, 바닥 줄에는 원발성 인간 내피세포에 감염된 퍼레칸 Dl-Ad 의 조건배지 가 있다. 이용된 원발성 항체는 Hep-SS1(패널 A), 2Q546(패널 B), CS-56(패널 C)와 아무것도 이용하지 않은 것(패널 D)이다.
도 3B은 원발성 인간 내피세포에 감염된 퍼레칸D1 -Ad(꼭대기)과 RevD1-Ad(바닥) 조건배지를 mAB 2Q546를 이용하여 착색한 후의 면역블로팅(도트블롯) 이다. 도. 4는 낮은 황산 밀도를 지닌 헤파란 황산지역을 퇴화시키는, 1mU 의 헤파란티나아제 I(레인 2)의 효소분해 후의 조건배지의 웨스턴블로팅 rDl 또는, 콘드로이친 황산 쇄를 제거하거나, 혹은 버퍼가 있는 경우에만(레인 3) 해당되는 20mU 의 콘드로이치나아제 abc(레인 1)이다.
도 5는 격렬한 두개 상처 모델을 이용하여 평가된, 상처치유에 있어 재조합형 퍼레칸 D1 발현의 영향을 보여준다. 상공막 손상이 발생한지 18일이 지나 흰쥐로부터 제거된 두개관이 만들어져 있으며, 또한 작은 HA 조각을 포함하는 젤라틴 젤을 이용하여 이식되어 있는 상태로, 퍼레칸D 1-Ad(좌측) 또는 관리배지 RevD 1-Ad(우측)를 각각 나타낸다. 폐쇄에 앞서, 이식조직은 직경 3 mm의 저지막을 이용하여 덮였다(Biomend, 유도된 조직재생에 이용된 소의 콜라겐).
도 6은 면역화학 및 Masson의 트라이크롬 염색을 이용한 두개골 부분의 조직학적 분석을 보여준다.
도 7은 퍼레칸 Dl의 예측모델을 보여준다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현(그에 한정되지는 않음)을 예증하고 있다.
실시예 1 - 분비 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열의 대표적인 생산
하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 고립된 핵산 분자는 서열을 합성하는 분비에 적절한 첫 번째 핵산 서열을 포함한다. 글리코스아미노글리칸 쇄의 부착을 위하여 하나 이상의 서열을 가지면서 막전위 영역(또는 유사영역)이 부족한 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산 서열을 포함한다. 복사, 번역 및 글리코실화 후에 생성된 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 분비에 충분한 신호의 존재에 따라 그것을 생성하는 세포로부터 분비된다.
분비에 충분한 신호는 세포로부터의 단백질 또는 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 어떠한 서열일 수 있다. 특정 예시로, 퍼레칸 프로테오글리칸으로부터의 신호 서열이 이용될 수 있다. 퍼레칸 프로테오글리칸으로부터의 신호 서열은 atggggtggcgggcgccgggcgcgctgctgctggcgctgctgctg(서열번호 27)서열을 갖는다. 기술 내에서 잘 알려진 바대로, 이 신호서열은 기술 내에서 알려진 방법을 이용하여 하나 이상의 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 고립된 핵산분자에 통합될 수 있다. 신호 서열은 일반적으로 핵산의 5' 끝에 위치한다(프로테오글리칸 폴리펩타이드의 NH2-말단). 서열번호 27을 설명하는 신호서열을 가지는 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 이러한 세포 타입이 발현될 때에 섬유아세포와 내피세포에 의하여 분비된다.
본 발명의 대표적인 핵산의 설계 및 구조는 본 발명의 개념을 추가적으로 설명하기 위하여 아래에 제시되어 있다. 대표적인 프로테오글리칸 퍼레칸인 20-mer 안티센스 3' 퍼레칸 영역 1(D1) 프라이머는 NM 005529 유전자은행 서열의639에 기반하여 확장되도록 만들어졌다. 전체 피부 마이크로 도관 내피세포mRN로부터의 역 복사가 수행되었으며 결과적인 cDNA는 PCR 을 NM 005529 서열 의 38에 기반하여 확장되도록 되어 있는 상류의19-mer 프라이머로 확대시켰으며, 세포로부터의 분비를 위한 신호서열을 포함했다. 그 결과로, Bg12 억제 효소 지점이 38 프라이머와 639 프라이머 의 5' 말단에서부터 확장하기 위하여 합성되었다. PCR은 원래의 D1 확대 생산을 반복하며, PCR 생산은 D1Bg12 변형유전자를 생성하면서 Bg12를 증해하는 것이다. 이 생산은 결과적으로 앞서는 퍼레칸D1 -Ad 클론을 만들어내면서 발현 시스 템의 Bg12 클로닝 지점으로 결찰하였다(Adenovator, Qbiogene). 이 방법에 따라, 재조합형 퍼레칸 D1 발현 생산(rDl)이 발생하였다. CMV-5 프로모터와 연관이 있는 역기원에서 D1 인서트를 가지는 관리배양 RevD 1-Ad 클론 또한 생성되었다.
원발성 인간 내피세포 또는 피부 섬유아세포는 플라스틱 위에 배양되었으며, 퍼레칸Dl-Ad 또는 관리배양 RevD 1-Ad으로 감염되었다. 감염은 DMEM 내에 배양한지 16에서 24시간 사이에 96웰 또는 24웰 배양 플레이트 내에50㎕ 또는 250㎕ 배양으로 접종된 감염 투약을 다양하게 한 10%의 FBS를 이용하여 각각 수행되었다. 감염은 37℃에 5%의 CO2농도로 16에서 24시간 동안 지속적인 진동을 주면서 진행되었으며, 이때 배양은 1% 세럼이 들어 있거나 혹은 들어있지 않은 F12로 보충된 DMEM로 변경되었다. 감염된 세포 배양은 다양한 기간을 두고 배양되었다.
며칠간의 배양 후, 조건배지가 제거되었으며 루즈 셀 파편에서부터 원심분리기를 이용하여 분리되었으며, 검사를 위하여 냉동보관 되었다. 잔여 세포 및 축적된 세포 이하의 기질은 PBS에서 1회 세척되었으며, 이후 차가운 메탄올, 또는 가용화된 50 또는 200 IA의 0.1% SDS를 이용하여 프로테아제 억제 칵테일(결과번호 # P 2714, Sigma Aldrich Corp, St. Louis, MO)를 함유한 물 속, 96웰 또는 24웰 검사에 각각 고정되었다.
가용화된 잔여 세포기질 샘플 및 조건배지 샘플은 항-DI 단일클론항체(mAb) A71(도 1A) 또는 항-D5 mAb A74(도 1B)를 이용하여 염색되었다. 도 1A 와1B 각각에서, 100 ㎕ 의 가용화된 잔여 세포기질 샘플과100 ㎕ 의 조건배지는 도트블롯 형태 에서 중복 웰 안에 니트로셀룰로스를 적용하였다. 니트로셀룰로스는 0.1%의 트윈-20 세제를 포함하는 PBS(PBS/Tween)를 이용하여 차단되었으며, 원발성 항체는 1 ㎍/ml에서 적용되었다. 원발성 항체를 이용하여 밤새 배양한 후, 1㎕/m1의 부차적인 항-흰쥐 AP 켤레가 PBS/Tween와 BCIP를 이용하여 개발된 블롯에 2시간 동안 적용되었다. 컬럼 1 과 2 는 퍼레칸Dl-Ad와 관리배양 RevD 1-Ad로 감염된 배양을 각각 이후 9일간의 배양을 거친 후 원발성 인간 내피세포배양으로부터 잔여 세포기질을 가용화하였다. 컬럼 3 과 4는 각각 이후 5일간의 배양을 거친 후 제거한 원발성 인간 내피세포배양으로부터의 조건배지다. 컬럼 5와 6은 각각 이후 6에서9일간의 배양을 거친 후 제거한 조건배지 원발성 인간 내피세포배양으로부터의 조건배지다.
가용화된 잔여 세포기질 샘플 내에서, 오염된 세포들(col. 1)로부터 탐지가능한 mAb A71 면역반응(도 1A)과 관리표본(col. 2)내에서의 아주 조금 더 많은 면역반응이 있었는데, 이 배경은 선천적인 퍼레칸이며 세포 또는 세포 이하의 기질 내에서 어떤 재조합형도 유지되지 못했다는 것을 시사한다. 선천적인 퍼레칸의 영역 5(D5)를 결합하는 mAb 35 A74(도 1B)의 면역반응은, mAb A71 신호와 동등하거나 더 큰 강도였기 때문에, mAb A71 면역반응의 가능한 출처가 선천적인 퍼레칸이라는 것을 확증하였다. 유사한 결과가 섬유아세포배양(데이터 제시되지 않음)에서도 얻어졌다. D1 또는 D5 신호 어느 것도 상기 배경이지 않기 때문에(제시되지 않음), 고정된 세포에 대한 면역형광분석은 실험실의 웰 내에서 축적된 rD1의 부족에 대한 증거를 지지한다.
관리배양 RevD 1-Ad(col. 4)로 감염된 배양으로부터의 조건배지에는 상기 배 경의 면역반응이 전혀 나타나지 않은 반면에, mAb A71(도 1A)을 이용하여 퍼레칸Dl-Ad 클론은 5일간의 배양 동안 내피세포 조건배지 안에(col. 3) 면역반응성 생산을 확실히 축적시켰다, 유사한 결과가 5일차와 9일차 사이에 수집된 조건배지 사이에서 나타났다(cols. 5-6). mAb A74를 이용한 조건배지에서의 항-D5 면역반응의 배경 레벨은 도 1B의 cols. 3-6에 나타나 있다.
퍼레칸D1-Ad 또는 관리배양 RevD1-Ad로 감염된 내피세포로부터의 조건배지는 4-10%의 구배젤 위에 놓인 SDS-PAGE에 종속되며, 따라서 웨스턴블로팅 분석을 위한 니트로셀룰로스로 전달된다. 항체 농도 및 도 1A와 1B에 나타나 있는 바와 같다. 항-D1 A71 항체 퍼레칸Dl-Ad 샘플 내에서 명백하게 32-42KDa로 분포하는 착색된 넓은 다중결합지역을 나타내고 있으나(도 2 레인 1), 관리표본 내의 특정 종은 나타나지 않으며(도 2, 레인 2), 도트블롯 결과를 확인하고 있으며(도 1 A 및 1 B), rD1 이 적어도 11-21KDa 의 GAG 쇄가 부착된 형태로 대개 수정된다는 것을 제시하고 있다.
핵산 조작은 어떠한 적절한 신호 서열을 이용하여 반복될 수 있으며 및 확인된 리더 서열은 여기에 기술된 바와 같이 재조합형 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 생산하기 위하여 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 코드화하는 어떠한 요구되는 핵산 서열도 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 대표적인 핵산의 설계 및 구조는 본 발명의 개념을 아래에서 추가적으로 설명하기 위하여 규정된다. 대표적인 프로테오글리칸 루미칸인 도서수납번호 U1872의 인간 루미칸 cDNA는 CMV-5 규정 포유류의 발현 벡터 pcDNA3.1N5-His(Invitrogen)로 우선 복제되며 CMV-5 규정 아데노바이러스 트랜스퍼 벡터(AdenoVator, Qbiogene)로 복제된다. 아데노바이러스 트랜스퍼 벡터를 복제하는 데 있어, 필수 제한 효소 지점인 Bgl2는 상기에 언급된 바와 같이 대표적인 프로테오글리칸 퍼레칸으로 프라이머를 이용하는 PCR에 의하여 루미칸-V5-His 변형유전자의 끝에 복제될 것이다.
실시예 2- 분비 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열에서 생성된 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 당화한 헤파란 황산의 대표적인 생산
상기 실시예 1에 나와있는 바와 같이 생성된 내피 조건배지는 헤파란 황산 글리코스아미노글리칸 쇄 내에서의 황화의 변이를 인식하는 항체패널을 이용한 면역블로팅(도트블롯)에 의존한다(도 3A). Hep-SS1 항체가 낮은 황화 헤파란 황산을 인식하는 반면에 2Q546 항-헤파란 황산 단일항체는 높은 헤파란 황산을 인식한다. mAb CS56는 콘드로이친 황산을 인식한다. 도트블롯의 가장 낮은 줄에는 원발성 인간 내피세포에 의해 감염된 퍼레칸 D1-Ad로부터의 조건배지를 두는 반면에, 가장꼭대기 줄에는 표준 헤파란 황산 프로테오글리칸을 관리배양으로 포함하고 있다. 이용된 원발성 항체는 Hep-SS1(패널 A), 2Q546(패널 B), CS-56(패널 C) 및 아무 항체도 적용되지 않은 경우이다(패널 D). BCIP에 의해 수반되는 부차적인 항-흰쥐 IgM-AP 켤레가 시각화를 위하여 이용되었다. 도 1A 와1B에 기술된 대로 과정이 수행되었다.
내피세포배양을 감염시킨 퍼레칸D1-Ad로부터의 조건배지(도 3A, 맨 아래 줄)은 Hep-SS1 항체에 대하여 면역반응성을 거의 나타내지 않으며(패널 A), 쥐과의 헤 파란 황산 프로테오글리칸 2의 표준약수로부터 상대적으로 강한 신호를 나타낸다. 대조적으로, 2Q546 항체를 이용한 조건배지의 면역반응(도 3A, 패널 B)은 표준 HSPG를 이용한 면역반응에 비하여 강했다.
도 3B는 mAb 2Q546를 이용하여 가시화된 퍼레칸Dl-Ad의 면역블로팅(맨 위) 과 대조군 조건배지(맨 아래)을 한 쌍으로 만들어 보여주었다. 항체 농도 및 조작은 도 3A에 나타나 있는 바와 같았다. 2Q546 항체를 이용한 대조군 조건배지가 상당히 낮은 수준의 면역반응을 보인다고 한다면(도 3B), 이 데이터들은 내피세포로부터 시험관 실험으로 발현된 Dl 는 높게 황화되고 충전된 상태로 수정된 헤파란 황산과 연결된다는 것을 나타내었다.
항-CS 단일클론 항체 CS56 를 이용하여 블로팅 된 조건배지의 면역반응(도 3A, 패널 C)은 배경(패널 D) 위에서 약간의 반동성(아래 줄)을 나타내고 있다. 그러나, 조건배지 내에서 탐지된 약간의 CS56 반동성은 대조군 조건배지에서의 배경 레벨에서도 보여지는 것이다(데이터 제시되지 않음). 이 데이터들은 시험관 실험 내피세포 배양 조건배지에서의 rDl 콘드로이친 황산과 연결되어 있지 않다는 것을 나타내었다.
조건배지에서의 rD1 은 글리코스아미노글리칸 쇄의 본질을 추가적으로 정의하기 위한 효소분해(도 4)에 의존적이다. 낮은 황산 밀도를 나타내는 헤파란 황산의 영역을 감퇴시키기 위한 1mU 의 헤파란티나아제 I을 적용한 rDl 의 효소 소화(레인 2), 또는 콘드로이친 황산 쇄를 제거하기 위하여 20mU 의 콘드로이치나아제 abc 적용한 경우(레인 1), 또는 단지 버퍼만이 적용된(레인 3) 퍼레칸D1-Ad에 감염 된 내피세포배양으로부터의 조건배지 위에서 수행되었다. 웨스턴블로팅 분석은 37℃에서 1시간 동안 배양된 샘플 위에서 수행되었다(도 4). 블로팅의 역치 이미지 분석을 이용하여, 조건배지 내의 샘플에서의 헤파란티나아제 소화가(도 4, 레인 2) 버퍼 배양을 이용한 조건배지 (레인 3)와 비교하여 면역반응성 rDl의 상당한 손실을 가져온다는 것이 명확해졌다. rDl의 콘드로이치나아제 abc 소화(도 4, 레인 1)는 적은 면역반응성 rDl이 나타나지 않았다. 이 데이터들이 하나로 합쳐져서, rDl이 헤파란 황산과, 있다고 해도 거의 없는 수준의 콘드로이친 황산에 의해서 우선적으로 연결된다는 것을 나타낸다. 불완전한 헤파란 황산 소화는, 여기에서 이용된 헤파란티나아제 I 의 기질 특이성에 기인하는 것일 수 있는데 이는 rDl 이 높게 황화된다는 것을 주장하는 데이터를 지지한다.
실시예 3- 분비프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열의 전달을 이용한 효과적인 상처 치료
상처치유에 있어 분비 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 전달을 표현하는 효과는 격렬한 두개 상처 모델을 이용하여 평가되었다. 느리게 돌아가는 3mm 다이아몬드 절삭기와 엄청난 식염수 드립을 이용하여 Balb C 마우스의 두개골에 좌우 양측으로 두개의 결손이 만들어졌다. 단시간의 압력이 혈류정지를 위하여 적용되었고 그리고는 퍼레칸Dl-Ad, 또는 관리배양 RevD 1-Ad 중 하나로 미리 충전된 대략 15 ㎕ 의 하이드록시아파타이트(HA) 현탁액이 각각의 흰쥐에게 쌍으로 만들어진 결손과 반대로 적용되었다. 결손 당 거의 1.6 x107 의 퍼레칸D 1 -Ad 바이 러스 분자와 5.2 x 106 의 RevD1-Ad 바이러스 분자가 HA 현탁액 내로 전달되었다(감염량과 거의 동일하게 측정되었음). 스파츌러를 이용하여 결손지점에 결정을 얇게 채웠으며 피부 플랩을 대신하여 보호하기 위하여 결손을 덮었다. 18일 또는 22일 이후 쥐들은 희생되었으며 HistoChoice 내에 고정시키기 위하여 두개관이 24시간동안 제거되었다(Amresco, Solon, OH), 10% w/v EDTA에서 6일간 석회질이 제거되었으며, 파라핀이 채워졌다. 파라핀이 채워지지 않은 부분은 콜라겐 과 뼈를 확인하기 위하여 3색염색으로 착색되었다.
8 마리의 쥐 그룹이18일째에 희생되었다. 수집된 두개골의 전체 관찰에 의하여, 퍼레칸D1 -Ad이 적용된 곳은 프로테오글리칸 구조가 적용된 지점은 경험이 없는 관찰자도 명확히 알 수 있을 정도로, 통제 전달 구조(RevD1-Ad)에 있어 어느 지점이 처치가 된 부분인지 알 수 있었다. 여덟 개의 실험 지점 중 일곱 개가 정확하게 인지되었기 때문에 여덟 번째는 0으로 표시되었다. 도 5는 수집된 두개골의 하나의 예시로, 퍼레칸D 1-Ad를 수용한 왼쪽 위 결절 과 통제 아데노바이러스(RevD 1-Ad)를 수용한 오른쪽 위 결절이 있는 것을 보여준다. 혈관질의 더 큰 레벨은 퍼레칸Dl-Ad를 적용한 중앙의 결절에서 나타나며 실험용 이식조직을 둘러싼 보더가 밀도가 상당 수준 더 높은 것이 나타난다.
재조합형 퍼레칸 D1 발현은 격렬한 두개 상처 모델에서 새로운 뼈가 가속적으로 자라는 부위와 연관되어 있다. 22 일간 상처를 치유하도록 허용되었던 두개골의 파라핀이 채워지지 않은 부분과 인접한 부분은 20㎍/ml 의 항-D1 mAb A71 또는 대조군으로서의 반-영역 3(D3) mAb7B5가 밤새 배양되었다. 세척 후 AP- 켤레를 적용한 후에, 항-흰쥐 IgG 항체, BCIP 가시화에서, 결합조직 내의 퍼레칸 D1 새로운 뼈의 생장(도 6, 항-D1)과 관련된 결합조직 내의 퍼레칸 D1이 재건되지 않은 결절(항-D1. 픽셀 밀도 흰쥐 #4: 54 ± 19 vs. 15 ± 5, 각각. p =.02를 의미함)보다 상당히 많다는 것이 밝혀졌다. 동시에, 퍼레칸 D3 신호는 두개관의 어느 쪽에서도 비교적 동일하였다(도 6, 항-D3). 대조군 섹션(부차적인 항체 만을 적용한) 은 공백이었다(데이터 제시되지 않음). 항-D1 의 비율이 4번 쥐와 5번 쥐의 재건된 쪽 대 재건되지 않은 쪽의 항-D1 에서 항-D3 신호로의 비율은 거의 7 fold(± 5 fold)로 22일을 타임포인트로 하였을 때 내생적 D1보다 더 많은 rD1이, 완전히 재건된 이식조직 쪽 대 덜 재건된 이식조직 쪽의 비교에서 명확하게 나타났다
헤파란 황산은 단일클론항체 2Q546를 이용하기 위해 국소으로 적용되는데 이는 높게 충전된 헤파란 황산의 지역을 인식하는 것이다. 이 항체는 위에서 논증된 바와 같이 시험관 실험에서의 헤파란 황산-연결 재조합형에 더 친화도를 가졌다. 흰쥐 #4에서, 헤파란 황산 면역반응의 더 큰 밀도가 더 높은 퍼레칸 D1의 레벨 및 새로운 뼈와 연관이 있는 것이 명백하였다,(도 6, 항-HS).
mAb A71(청색) 과 mAb 7B5(자색)의 듀얼스테인이 수행되었으며, 대조-강화 이미지는 of 청색 신호 뼈 재건 지역에서의 청색 신호의 존재도 및 감도가 재건되지 않은 뼈의 결절에서보다 훨씬 높은 것을 나타낸다(도 6). 이 데이터들은 더 빠르고 완벽한 두개 결절의 뼈의 재생과 연관되어 재조합형 퍼레칸 D1이 발현되고 축적되었다는 것을 나타낸다. 더욱이, 3색염색에 의하여, 발현된 재조합형 퍼레칸 D1 과 연관이 있는 새로 생긴 뼈의 양이 현저하게 나타났다(도 6).
예언적 실시예
실시예 1- 뼈의 상처에의 분비된 프로테오글리칸 폴리펩타이드을 합성하는 핵산의 이용
본 발명은 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 전달하는 데에 있어서의 매커니즘과 벡터의 다양성을 생각한다. 하나의 구현에서, 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 뼈의 상처에 전달된다. 앞에 설명된 바와 같이, 이 구현에서는 cDNA 같이 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 인간 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터의 복사통제 하에서의 복제-부전, E1/E3-결여형 인간 아데노바이러스 항원형 5-파생 벡터로 결찰될 수 있다(Shi 외, J Virol 75(23): 11474-82, 2001). 복원 프로테오글리칸 발현을 위하여, 상처 표면 국부의 단위 cm2 당, 또는 외과적 조직이식 지점의 단위 cm3당 102에서 109의 아데노바이러스 분자가 전달될 것이다.
전달을 위하여, 외과적인 이식조직 물질 또는 임플란트 물질이 이벡터 전달 시스템에 사전에 pH 7.4의 인산염 버퍼 같은 무균 버퍼 안에서 바람직하게 처치될 수도 있다. 전치료는 수술 동안에 수행될 수도 있고, 혹은 덮여있는 외과적 임플란트 물질이 전치료 후 언제라도 온도가 변하는 영향을 받지 않으면서 잠깐 동안은 전치료 용액 내에 담겨있을 수 있다면 수술에 앞서서 수행될 수도 있다. 그런 뒤에 전처리된 이식조직 물질 또는 임플란트가 외과적으로 위치할 수도 있다. 다양한 성 장인자가 결합을 위한, 흡수를 위한 용액과 이식조직 물질 및 외과적 임플란트가 합쳐질 수도 있다. 준비되고 난 후에는, 이식조직 물질 및 외과적 임플란트는 표준 과정에 따라 이용되어야 한다.
아데노바이러스 벡터 시스템은 핵산을 상처지점으로 전달하며, 아데노바이러스 벡터 시스템은 상처지점에서 목표세포의 과반수를 감염시킨다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 이후 복사, 전이되며, 결과적인 폴리펩타이드는 이후 적어도 하나의 글리코스아미노글리칸 쇄에서 목표세포에 의하여 당화된다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 배설에 충분한 서열을 포함하고 있기 때문에, 생성된 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 목표세포로부터 배출되어, 여기에 검토된 바와 같이, 상처의 효과적인 치료에 적용될 수 있다.
실시예 2- 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 피부손상의 치료에의 이용
교차 구현에 있어, 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명의 핵산은 피부손상 지점으로 전달된다. 이 구현 내에서, cDNA 같이 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 복제-부전, E1/E3- 결여형 인간 아데노바이러스 항원형 5-파생 벡터로 결찰될 수 있거나, (꼭 한정적이지는 않으나) 리포좀 같은 다른 벡터와 결합되어 이용될 수 있다.
2 cm2 의 피부손상 영역에서, 아데노바이러스 또는 리포좀 벡터 시스템은 작은 규모(<50pL 같은)에 적용되며 처치 후에 건조한 상태가 되어도 된다. 아데노바 이러스는 전달되는 102~109VP/ml의 감염 용량에 있어 처치를 지원하기 위하여 농유제로서10%의 글리세롤을 포함하는, 인산염으로 완충된 식염수 용액을 이용하여 전달될 수도 있다. 만일 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 이 각질층을 통해 플라스미드DNA 형태로 전달된다면, 플라스미드DNA 가 각질층을 통과할 수 있도록 하는 것으로 여겨지는 지질 수포가 이용되어 세포를 감염시킬 것이다(Alexander 외, Hum Mol Genet 4(12): 2279-85, 1995; Raghavachari, et al, J Pharm Sci 91(3): 615-22, 2002). 양이온 지질 DOTAP(아반티 극성 지질)은 리포좀을 구성하는 지질 소수포로 이용될 수 있다. DNA가 리포좀이 되는 비율은 1:1 에서 1:100사이로 다양하다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 시스템은 필요하다면 여러 번 적용될 수도 있다.
벡터 시스템은 피부손상지점으로 핵산을 운반하며, 벡터 시스템은 피부손상 지점에서 목표세포의 과반수를 감염시킨다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 복사, 번역되며, 결과적인 폴리펩타이드는 목표세포에 의하여 적어도 하나의 글리코스아미노글리칸 쇄로 당화된다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 배설에 충분한 서열을 포함하고 있기 때문에, 생성된 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 목표세포로브터 배출되고, 여기에 검토된 바와 같이, 피부손상의 효과적인 치료에 적용될 수 있다.
실시예 3- 새로운 분비 프로테오글리칸을 합성하는 핵산의 생성
상기 논의된 바와 같이, 본 발명 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 규정한다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 목표에 전달되며, 전사되며, 변역하며, 목표세포의 생리적 상태에 따라 지정된 바와 같이 결과적인 폴리펩타이드는 적당한 글리코스아미노글리칸 쇄로 당화된다. 생성된 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 이후 목표세포로부터 분비된다. 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 정의는 광범위한데, 자연적으로 발생하였거나 혹은 새로이 합성되었으며 자연적으로 생겨나지 않은 프로테오글리칸 단백질, 앞서 말한 단편 및 새로운 글리코스아미노글리칸 부착 지점을 포함하도록 개조되어, 따라서 새로운 프로테오글리칸을 생성하는 앞서 말한 것에서 생겨난 변형까지를 포함한다. 이러한 프로테오글리칸 폴리펩타이드는 여기에 검토된 바와 같이 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 변경하여 생산할 수도 있다. 예시는 아래에 규정되어 있다.
하나의 핵산 서열이 글리코실화 지점을 세우기 위하여 어떻게 이용되는가에 대한 예시는 다음과 같다. 예제제로 프로테오글리칸 퍼레칸을 사용하면, 영역 1(D1)은 통상적으로 거의 대부분이 헤파란 황산인 3 글리코스아미노글리칸 쇄를 포함하는 것으로 관찰된다. 일반적으로, 퍼레칸 또는 퍼레칸 D1에 대한 구조적 데이터는 존재하지 않는다. 퍼레칸 D1의 계산적 모델링은, 21KDa 단백질이 알려진 단백질 구조에서 25% 이상의 서열 일치를 나타내지 않기 때문에 다소 의심스럽다. 대부분의 모델링 프로그램에서, 25%의 확정범위로는 전체 단백질의 모델링을 할 수 없다. 그러나, Geno3D는 서열 일치도가 충분히 높을 때에 단백질의 부분적인 섹션의 모델링을 허용한다.(Combet 외, Bioinformatics 18(1): 213-4, 2002). 퍼레칸 D1 은 Geno3D를 이용하여 모델링이 되는데, 단백질을 결합하는 곤충 지방산인 pdb 1 MDC에 대하여, 데이터베이스의 가장 높은 서열 일치성이 24% 일 때 모델링을 보여준다. 아미노산 53 에서144의 예측모델은 β-시트 구조를 시사하며 3개의 글리코스아미노글리칸 쇄 부착 지점을 포위하는데, 이는 도7에서 화살표 1(S65, G66, D67), 화살표 2(S71, G72, D73), 및 화살표 3(S76, G77, D78)에 의해서 보여진다. β-시트 구조는 글리코스아미노글리칸 쇄가 단백질 코어 제3기 구조로부터 떨어져 나올 수 있도록 허락하며, 아마도 성장인자가 (꼭 한정적이지는 않으나) FGF 같이 헤파란 황산 쇄를 결합할 수 있는 단백질의 한 측면 FGF의 표시를 위하여 FGF 수용체를 결합하는 다른 측면을 가질 수 있도록 허락한다. 단백질의 같은 측면에서 자연적인 부착지점으로 설계되어 있는 헤파란 황산 부착의 추가적인 지점은 수적으로 혹은 친화도적으로 결합할 수 있는 성장인자를 늘리고 싶어하는 것이다. 유사한 물리적 성상을 지닌 아미노산을 포함하는 변형의 생성은, 여기에 검토된 바와 같이, 변형을 포함하기 때문에, 구조적인 붕괴의 가능성을 줄인다. 이외에도, 제출된 루프 지역 내에 변형을 포함하는 것은 구조 붕괴의 가능성을 줄이며 성장인자를 결합하기 위한 글리코스아미노글리칸 쇄의 유연성을 허가한다. 따라서, 선택된 두 개의 변형 지점은, 도 7에서도 보여지고 있지만, L87S, V88G, N89D 및 S97, P98G, Q99D. 이 두 개의 아미노산 트라이어드는 SGD 글리코실화 서열로 대체되었다. 이 두 지점은 글리코실화를 위한 세 개의 자연적 지점과 가까우며, 아미노산 변화는 적당한 구조 형성을 허락하기에 충분히 보수적이다. 이러한 변형은 각각의 지점에 대한 PCR의 단일 라운드 내에서 지점에 직접적으로 돌연변이를 생성하여 만들어진다.
유사한 접근법이 다른 프로테오글리칸 단백질/폴리펩타이드 구조에 이용될 수 있다.
앞서 말한 명세는 핵산, 구조, 방법 및 본 발명의 다른 가르침을 도식화하고 기술한다. 추가적으로, 공시는 핵산, 구조, 방법의 특정 구조에서 외, 발표된 다른 가르침에서 보여지고 기술되지만, 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 내용은 다양한 다른 구조, 변형 및 환경에서 이용될 수 있으며, 관련 기술 내에서 일반적인 스킬을 지니고 있는 인력의 스킬 및/또는 지식과 같은 수준으로 여기에 발표된 것과 같은 가르침의 범위 내에서의 변화 또는 변형을 가능하게 하는 것으로 이해되고 있다. 이 위에서 기술된 구현은 본 발명의 방법 및 다른 가르침을 실행하는 것으로 알려진 최적의 모드를 더 설명하고자 하며 기술 내에서 이러한 또는 다른 구현 내에서 및 특별한 적용 및 이용에 의해서 요구되는 다양한 변형에 맞추어 본 발명의 내용을 이용할 수 있도록 다른 이들을 숙달되게 하고자 한다. 따라서, 핵산, 구조, 방법 및 본 발명의 다른 가르침은 여기에서 발표된 정확한 구현 과 예시를 제한하고자 하지 않는다.
(특허 참고문헌을 포함한) 모든 참고문헌은 여기에서 모두 밝혀진 바와 같이 참고문헌들로 이 문서에 통합되어 있다.
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ctgagcgggg accaggaggc cagtgggggt 4140 ggctctgggg ggctcgagcc cttggagggc agcagcgtgg ccacccctgg gccacctgtc 4200 gagagggctt cctgctacaa ctccgcgttg ggctgctgct ctgatgggaa gacgccctcg 4260 ctggacgcag agggctccaa ctgccccgcc accaaggtgt tccagggcgt cctggagctg 4320 gagggcgtcg agggccagga gctgttctac acgcccgaga tggctgaccc caagtcagaa 4380 ctgttcgggg agacagccag gagcattgag agcaccctgg acgacctctt ccggaattca 4440 gacgtcaaga aggattttcg gagtgtccgc ttgcgggacc tggggcccgg caaatccgtc 4500 cgcgccattg tggatgtgca ctttgacccc accacagcct tcagggcacc cgacgtggcc 4560 cgggccctgc tccggcagat ccaggtgtcc aggcgccggt ccttgggggt gaggcggccg 4620 ctgcaggagc acgtgcgatt tatggacttt gactggtttc ctgcgtttat cacgggggcc 4680 acgtcaggag ccattgctgc gggagccacg gccagagcca ccactgcatc gcgcctgccg 4740 tcctctgctg tgacccctcg ggccccgcac cccagtcaca caagccagcc cgttgccaag 4800 accacggcag cccccaccac acgtcggccc cccaccactg cccccagccg tgtgcccgga 4860 cgtcggcccc cggcccccca gcagcctcca aagccctgtg actcacagcc ctgcttccac 4920 ggggggacct gccaggactg ggcattgggc gggggcttca cctgcagctg cccggcaggc 4980 aggggaggcg ccgtctgtga gaaggtgctt ggcgcccctg tgccggcctt cgagggccgc 5040 tccttcctgg ccttccccac tctccgcgcc taccacacgc tgcgcctggc actggaattc 5100 cgggcgctgg agcctcaggg gctgctgctg tacaatggca acgcccgggg caaggacttc 5160 ctggcattgg cgctgctaga tggccgcgtg cagctcaggt ttgacacagg ttcggggccg 5220 gcggtgctga ccagtgccgt gccggtagag ccgggccagt ggcaccgcct ggagctgtcc 5280 cggcactggc gccggggcac cctctcggtg gatggtgaga cccctgttct gggcgagagt 5340 cccagtggca ccgacggcct caacctggac acagacctct ttgtgggcgg cgtacccgag 5400 gaccaggctg ccgtggcgct ggagcggacc ttcgtgggcg ccggcctgag ggggtgcatc 5460 cgtttgctgg acgtcaacaa ccagcgcctg gagcttggca ttgggccggg ggctgccacc 5520 cgaggctctg gcgtgggcga gtgcggggac cacccctgcc tgcccaaccc ctgccatggc 5580 ggggccccat gccagaacct ggaggctgga aggttccatt gccagtgccc gcccggccgc 5640 gtcggaccaa cctgtgccga tgagaagagc ccctgccagc ccaacccctg ccatggggcg 5700 gcgccctgcc gtgtgctgcc cgagggtggt gctcagtgcg agtgccccct ggggcgtgag 5760 ggcaccttct gccagacagc ctcggggcag gacggctctg ggcccttcct ggctgacttc 5820 aacggcttct cccacctgga gctgagaggc ctgcacacct ttgcacggga cctgggggag 5880 aagatggcgc tggaggtcgt gttcctggca cgaggcccca gcggcctcct gctctacaac 5940 gggcagaaga cggacggcaa gggggacttc gtgtcgctgg cactgcggga ccgccgcctg 6000 gagttccgct acgacctggg caagggggca gcggtcatca ggagcaggga gccagtcacc 6060 ctgggagcct ggaccagggt ctcactggag cgaaacggcc gcaagggtgc cctgcgtgtg 6120 ggcgacggcc cccgtgtgtt gggggagtcc ccggttccgc acaccgtcct caacctgaag 6180 gagccgctct acgtaggggg cgctcccgac ttcagcaagc tggcccgtgc tgctgccgtg 6240 tcctctggct tcgacggtgc catccagctg gtctccctcg gaggccgcca gctgctgacc 6300 ccggagcacg tgctgcggca ggtggacgtc acgtcctttg caggtcaccc ctgcacccgg 6360 gcctcaggcc acccctgcct caatggggcc tcctgcgtcc cgagggaggc tgcctatgtg 6420 tgcctgtgtc ccgggggatt ctcaggaccg cactgcgaga aggggctggt ggagaagtca 6480 gcgggggacg tggatacctt ggcctttgac gggcggacct ttgtcgagta cctcaacgct 6540 gtgaccgaga gcgagaaggc actgcagagc aaccactttg aactgagcct gcgcactgag 6600 gccacgcagg ggctggtgct ctggagtggc aaggccacgg agcgggcaga ctatgtggca 6660 ctggccattg tggacgggca cctgcaactg agctacaacc tgggctccca gcccgtggtg 6720 ctgcgttcca ccgtgcccgt caacaccaac cgctggttgc gggtcgtggc acatagggag 6780 cagagggaag gttccctgca ggtgggcaat gaggcccctg tgaccggctc ctccccgctg 6840 ggcgccacgc agctggacac tgatggagcc ctgtggcttg ggggcctgcc ggagctgccc 6900 gtgggcccag cactgcccaa ggcctacggc acaggctttg tgggctgctt gcgggacgtg 6960 gtggtgggcc ggcacccgct gcacctgctg gaggacgccg tcaccaagcc agagctgcgg 7020 ccctgcccca ccccatga 7038 <210> 26 <211> 477 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 atgatgcaga agctactcaa atgcagtcgg cttgtcctgg ctcttgccct catcctggtt 60 ctggaatcct cagttcaagg ttatcctacg cggagagcca ggtaccaatg ggtgcgctgc 120 aatccagaca gtaattctgc aaactgcctt gaagaaaaag gaccaatgtt cgaactactt 180 ccaggtgaat ccaacaagat cccccgtctg aggactgacc tttttccaaa gacgagaatc 240 caggacttga atcgtatctt cccactttct gaggactact ctggatcagg cttcggctcc 300 ggctccggct ctggatcagg atctgggagt ggcttcctaa cggaaatgga acaggattac 360 caactagtag acgaaagtga tgctttccat gacaacctta ggtctcttga caggaatctg 420 ccctcagaca gccaggactt gggtcaacat ggattagaag aggattttat gttataa 477 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 atggggtggc gggcgccggg cgcgctgctg ctggcgctgc tgctg 45

Claims (34)

  1. 글리코스아미노글리칸-연결 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 전달을 통해 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 상처 또는 피부 손상을 효과적으로 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    상기 방법은 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 상처 또는 피부 손상 부위에서 목표 세포에 투여하는 것을 포함하며,
    상기 핵산은 분비에 충분한 서열을 코딩하는 첫 번째 핵산 서열과 글리코스아미노글리칸 쇄의 부착을 위한 하나 이상의 지점을 가진 적어도 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산 서열을 포함하며,
    그에 따라 글리코스아미노글리칸-연결 폴리펩타이드가 개체의 목표 세포에서 만들어진 다음, 목표 세포로부터 분비되어, 개체의 상처 또는 피부 손상에 유효량의 글리코스아미노글리칸이 전달됨으로써 개체의 상처 또는 피부 손상에 효과적 치료 또는 예방 개선이 이루어지며,
    상기 핵산은 치료학적 유효량으로 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리코스아미노글리칸 쇄 부착을 위한 하나 이상을 서열을 가진 폴피펩타이드가 프로테오글리칸 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 자연적으로 발생하는 프로테오글리칸 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 자연적으로 발생하는 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 어그레칸, 베르시칸, 루미칸, 신데칸 1-4, 글리피칸 1- 5, 베타글리칸, NG2/CSPG4, CD44/에피칸, 파이브로모듈린, PRELP, 케라토칸, 오스테오어드히린/오스테오모듈린, 에피파이칸, 오스테오글리신/미메칸, 뉴로칸/CSPG3, 브레비칸, 바마칸, 아그린, 퍼레칸, 데코린, 바이글리칸 및 세르글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 자연적으로 발생하는 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 어그레칸, 베르시칸, 루미칸, 신데칸 1-4, 글리피칸 1- 5, 베타글리칸, NG2/CSPG4, CD44/에피칸, 파이브로모듈린, PRELP, 케라토칸, 오스테오어드히린/오스테오모듈린, 에피파이칸, 오스테오글리신/미메칸, 뉴로칸/CSPG3, 브레비칸, 바마칸, 아그린 및 세르글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 자연적으로 발생한 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 퇴행 변이 또는 대립 변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 돌연변이 또는 자연적으로 발생한 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 변형체인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 돌연변이 또는 변형체가 글리코스아미노글리칸 부착의 부가적인 지점을 포함하도록 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 자연적으로 발생한 폴리펩타이드가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 분비에 충분한 서열이 신호 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 신호 서열이 서열번호 27의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러 스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 천연두 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 바이러스 벡터, 우두 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스성 벡터, 또는 2종 이상의 바이러스 벡터 타입의 잡종인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 비바이러스성 벡터가 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 충전된 지질, DNA-단백질 복합체 또는 생체고분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 폴리시스트론 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 프로테오글리칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 적어도 하나의 추가적인 핵산 서열을 포함하며, 상기 추가적인 핵산 서열이 하나 이상의 성장인자 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 성장인자가 글리코스아미노글리칸 쇄에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 성장인자가 헤파린 황산 쇄에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제19항에 있어서, 상기 성장인자가 섬유아세포 성장인자, 케라티노사이트 성장인자, 변형 성장인자-B, 간세포 성장인자, 혈관내피성장인자, 혈소판-파생 성장인자, 표피 성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 골형성 단백질 및 과립구-대식세포 콜로니 자극인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 성장인자가 섬유아세포 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 성장인자가 섬유아세포 성장인자 2 또는 7인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 핵산이 폴리시스트로닉 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 하나 이상이 성장 인자 또는 그 단편을 암호화하는 하나 이상의 보조 핵산을 포함하는 두 번째 벡터를 가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 성장인자가 글리코스아미노글리칸 쇄에 결합하는 것 을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 성장인자가 헤파린 황산 쇄에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 성장인자가 섬유아세포 성장인자, 케라티노사이트 성장인자, 변형 성장인자-B, 간세포 성장인자, 혈관내피성장인자, 혈소판-파생 성장인자, 표피 성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 골형성 단백질 및 과립구-대식세포 콜로니 자극인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 성장인자가 섬유아세포 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 성장인자가 섬유아세포 성장인자 2 또는 7인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 약학적으로 용인되는 수송체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 전신 전달 또는 국소 전달을 통하여 상처 또 는 피부손상 지점의 목표세포에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 국소 전달이 유전자총 또는 가압식 전달 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 상처가 뼈의 상처인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 피부손상이 일광노출 또는 노화의 결과인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제3항에 있어서, 상기 프로테오글리칸 폴리펩타이드가 자연적으로 발생한 프로테오글리칸 폴리펩타이드의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
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