WO2004005538A1 - 抗癌剤のスクリーニング方法 - Google Patents

抗癌剤のスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004005538A1
WO2004005538A1 PCT/JP2003/008470 JP0308470W WO2004005538A1 WO 2004005538 A1 WO2004005538 A1 WO 2004005538A1 JP 0308470 W JP0308470 W JP 0308470W WO 2004005538 A1 WO2004005538 A1 WO 2004005538A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
compound
gene
aid
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/008470
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tasuku Honjo
Kiyotsugu Yoshikawa
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company Limited filed Critical Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority to AU2003246255A priority Critical patent/AU2003246255A1/en
Publication of WO2004005538A1 publication Critical patent/WO2004005538A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an anticancer agent and a mutation-inducing agent using an AID (Activation-induced cytidine deaminase) gene or its product, an anticancer agent obtained by using the screening method, a mutation-inducing agent, and the like.
  • AID Activation-induced cytidine deaminase
  • the vertebrate immune system uses somatic DNA mutations to increase the limited amount of information encoded in the genome.
  • a few germline germic-type gene fragments (germic segments) scattered by V (D) J recombination are reconstituted, and T and B lymphocytes receive antigen.
  • V Variable
  • Ig immunoglobulin
  • the immunoglobulin (Ig) gene of mature B lymphocytes is transformed by three genetic alterations: somatic mutation (SHM) in the V gene, gene conversion (GC), and heavy chain constant.
  • SHM somatic mutation
  • GC gene conversion
  • C H class switch recombination in gene
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-245669 discloses AID protein and its fragment, DNA encoding the protein and its fragment (cDNA, genomic DNA, and primer DNA), an expression vector containing the DNA, and a plasmid with the expression vector. Transformed cells, an antibody reactive with the protein or a fragment thereof, a cell producing the antibody, production of the protein, and a gene encoding the protein. A method for identifying a substance that regulates transcription to mRNA or the enzymatic activity of the protein is disclosed.
  • diseases that are expected to prevent the onset, alleviate the disease state, treat and / or treat the symptomatic effect by controlling the function of the AID protein or the gene encoding the AID protein include, for example, the innate immune system.
  • the AID protein or the gene encoding the AID protein can be made to function in all cells, controlling the function of the AID protein or the gene encoding the AID protein is considered. Thus, it is possible to prevent and Z or treat diseases caused by various dysfunctions. Therefore, further elucidation of the function of the AID protein or the gene encoding the AID protein has been desired. Disclosure of the invention
  • the present inventors have clarified that the AID gene is involved in somatic mutation, and have completed the present invention. That is, the present invention provides a method for screening an anticancer agent using an AID gene or a product thereof, an anticancer agent obtained by using the screening method, a method for producing a mutant protein in a cell, a kit for producing the same, and the like. More specifically, the present invention provides
  • [1] A step of culturing cells producing an AID protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the presence and absence of a test compound under various conditions And (2) (i) comparing the level of the AID protein produced by cells cultured in the presence of the test compound with the level of the AID protein produced by cells cultured in the absence of the test compound Or (ii) the level of mRNA encoding the AID protein transcribed in cells cultured in the presence of the test compound and the AID transcribed in cells cultured in the absence of the test compound Comparing the level of mRNA encoding the protein, and a method of screening for a compound having an anticancer effect or a salt thereof.
  • a compound having an anticancer activity or a salt thereof including an AID protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and a cell producing another protein other than the AID protein.
  • a compound having an anticancer effect or a salt thereof obtainable by using the screening method according to [1] or [2], or the screening kit according to [9] or [10],
  • An anticancer agent comprising the compound of the above-mentioned [11] or a salt thereof,
  • a method for screening a compound or a salt thereof that alters the frequency of somatic mutation comprising: (1) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or substantially the same A step of introducing a recombinant vector containing the same base sequence into a cell into which the substrate gene of the AID protein has been introduced; (2) a step of culturing the cell under the presence and absence of a test compound (3) somatic mutation in each of the cells in the presence and absence of the test compound Comparing the frequency of the screening method,
  • mutant reporter gene is a gene obtained by converting a tyrosine codon TAC in a normal reporter gene to a stop codon TAG.
  • a mutagenesis promoter comprising the compound of the above-mentioned [21] or a salt thereof,
  • a medicament comprising the compound of the above-mentioned [23] or a salt thereof,
  • cancer is lymphoma, leukemia, prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer or colon cancer.
  • a method for producing a mutant protein in a cell comprising: (1) a base sequence identical or substantially identical to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Introducing the recombinant vector containing the sequence into cells into which the target gene has been introduced, (2) under the conditions in the presence or absence of the compound according to [21] or a salt thereof, Expressing a target gene product by culturing the cell, a method for producing a mutant protein,
  • a kit for producing a mutant protein in a cell comprising: (1) a recombinant vector containing a nucleotide sequence identical or substantially identical to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 , (2) cells into which the target gene is introduced, (3)
  • FIG. 1 shows a GFP substrate (pi) under a tetracycline-inducible promoter (Tetpromoter).
  • TRE, PminCMV, and TATA stand for tetracycline responsive element, minimal CMV promoter, and TATA box, respectively.
  • CMVPF and Tet GFPR are primers for PCR amplification and sequencing.
  • FIG. 2 shows the results of analysis of GFP expression by FACS. ... ':'
  • Figure 3 shows AID infectivity dependence of AID-induced HM.
  • FIG. 4 shows GFP + cells and the frequency of mutations on day 10 of culture with changes in tetracycline concentration.
  • FIG. 5 shows the analysis result of the change over time of HM.
  • FIG. 6 shows the distribution of mutations on the GFP substrate. 247 point mutations, 18 deletions (double-headed arrow) and 2 duplications (thick underline) from 53 sequenced GFP clones mapped onto the GFP substrate sequence This is shown. The start codon, the mutation stop codon, and the original stop codon are indicated by an asterisk.
  • FIG. 7 shows the bias of mutation to GZC base pairs and the superiority of translation substitution.
  • the AID protein used in the present invention has SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. It is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the represented amino acid sequence.
  • mRNA encoding the AI D protein is observed in various lymphoid tissues other than the thymus (Peyer's patch, mesenteric lymph nodes, axillary lymph nodes, spleen, bone marrow). In particular, remarkable expression is seen in peripheral lymphoid organs such as lymph nodes and Peyer's patches. On the other hand, the level of expression in primary lymphoid organs is lower than that in peripheral lymphoid organs.
  • the AID protein used in the present invention includes, for example, cells of humans and other mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, hamsters, egrets, stags, pits, sheep, pigs, monkeys, etc.) [eg, Macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, leukocytes) or progenitor cells of these cells or tissues in which these cells are present (eg, , Lymph nodes, lymphoid tissues (Peyer's patch, mesenteric lymph nodes, axillary lymph nodes, spleen, bone marrow), etc. or proteins derived from blood cells or their cultured cells, and synthetic proteins and other It may be a recombinant protein containing a fusion protein with a protein of the present invention.
  • mammals eg, guinea pigs, rats, mice, hamsters, egre
  • substantially the same amino acid sequence refers to, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, based on the amino acid sequence to be compared. More preferably, it refers to an amino acid sequence having about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more homology.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 include, for example, a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
  • proteins having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 are preferred.
  • Substantially equivalent activities include cytidine deaminase activity. Substantially the same indicates that the activity is the same in nature. Therefore, it is preferable that the cytidine kinase activity is equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). But these activities Quantitative factors such as the degree of sex and the molecular weight of the protein may be different.
  • cytidine deaminase activity can be performed according to the method described in Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), Vol. 270, pp. 14768-14775 (1995). .
  • the AID protein used in the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 (preferably, about 1 to 80, more preferably 1 to 80); About 20 amino acids, more preferably several (1 to 5) amino acids are deleted, and (2) one or more amino acids (preferably 1 or more) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 An amino acid sequence to which about 80, more preferably about 1 to 20, and still more preferably several (1 to 5) amino acids are added; (3) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 One or two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids of which have been replaced with other amino acids Amino acid sequences, or (4) amino acids Such protein containing an acid sequences may be mentioned.
  • the position of the amino acid deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (capilloxy terminus) according to the convention of peptide notation.
  • the proteins used in the present invention include a carboxylate (one COOH), a carboxylate (one COO-) ), Amide (one CONH 2 ) or ester (—COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, C i_ 6 alkyl group such as isopropyl or n- butyl, Shikuropen chill, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example , phenyl, C 6 _ 12 Ariru groups such as ⁇ - naphthyl, for example, benzyl, phenyl, such as phenethyl
  • the AID protein used in the present invention has a lipoxyl group (or In the case of having a carboxylate, the protein of the present invention also includes those in which the carbonyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the AID protein used in the present invention have you the protein described above, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, C 2 _ 6 Al force Noiru group such as ⁇ Se Chill It is protected with a protecting, C M Ashiru group), such as, for even Darutamiru group N-terminal region is cleaved in vivo to form pyroglutamic acid, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (e.g., single ⁇ _H, - SH, amino group, imidazole group, indole group, Guanijino group, etc.) a suitable protecting group (e.g., formyl group, C 2 such Asechiru - 6 such as C Hj Ashiru group such Arukanoiru group) with protection Or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, C 2 such As
  • the AID protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • the AID protein used in the present invention may be a partial peptide of the AID protein.
  • Examples of such a partial peptide include those having the same activity as the above-mentioned AID protein of the present invention, such as cytidine deaminase activity. Any of them may be used.
  • a partial peptide of the AID protein a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 Partial peptides having substantially the same activity as the above are preferred.
  • the partial peptide of the AID protein has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 in an amount of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, and still more preferably A partial peptide of a protein having a homology of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used. More specifically, SEQ ID NO: 1 or 3 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by (preferably, about 1 to 80, more preferably 1 to 20) Amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted, more preferably 1 or 2 or more (preferably 1 to 80) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
  • Amino acid sequence to which about 1 amino acid sequence is added more preferably about 1 to 20 amino acids, and still more preferably several (1 to 5) amino acids, 1 or 3 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
  • a partial peptide of a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them or the like is also included.
  • the C-terminus of the partial peptide of the AID protein is usually a hydroxyl group (—CO OH) or a carboxylate (—COO—), but the C-terminus is an amide (—CO NH 2 ) Or an ester (one COOR) (R is the same as defined above).
  • the partial peptide of the AID protein Te partial peptide odor mentioned above, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, etc. Ashiru groups such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechi Le ),
  • the N-terminal side is cleaved in vivo, and the daryumin group generated is oxidized by lipamine, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule (eg, _OH,- SH, amino group, I imidazole group, indole group, etc.
  • Guanijino group is protected with a suitable protecting group (e.g., ho mill group, such as C w Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru) And complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
  • a suitable protecting group e.g., ho mill group, such as C w Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru
  • complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
  • Examples of the salt of the AID protein or a partial peptide thereof used in the present invention include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the AID protein or a salt thereof used in the present invention can be produced from the above-described method for purifying a protein from human or other mammalian cells or tissues, or a trait containing a DNA encoding the AID protein. It can also be produced by culturing the transformant.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain a target protein.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • the carpoimides DCC, N, N, diisopropyl carpoimide, N-ethyl N '-(3-dimethylaminopropyl) carpoimide, and the like are used.
  • Activation by these involves adding a protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t, HO OB t) or using a symmetrical anhydride or HO
  • the protected amino acid can be added as a Bt ester or HOOBt ester to the resin after activation of the protected amino acid in advance.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • solvents known to be usable for the protein condensation reaction For example, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, black form, trifluoroethanol, dimethylsulfoxide, pyridine, dioxane, methylene chloride, tetrahydrofuran, acetate nitrile, ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of 120 to 50C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, tertiary amyloxycarponyl, isopolnyloxycarponyl, 4-methoxybenzyloxy ⁇ : caprolponyl, C1-Z, Br-Z Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthalyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • Examples of the protecting group for the lipoxyl group include an alkyl ester (e.g., an ester group such as methyl, ethyl, propyl, butyl, ethyl tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, and 2-adamantyl).
  • an alkyl ester e.g., an ester group such as methyl, ethyl, propyl, butyl, ethyl tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, and 2-adamantyl.
  • Benzyl ester 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methylbenzyl ester, benzhydryl ester, phenacine ester, benzyloxycarponyl hydrazide, tert-butoxycarponyl hydrazide, trityl hydrazide, etc. Is used.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and benzyloxycarponyl. And a group derived from carbon such as an ethoxycarbonyl group.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2- nitrobenzyl, B r- Z, as a protecting group of the imidazole group of histidine such as tertiary butyl is used
  • B z 1, C 1 2 - B zl, 2- nitrobenzyl, B r- Z as a protecting group of the imidazole group of histidine such as tertiary butyl
  • Tos 4-methoxy 2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated raw oxypoxyl groups include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (for example, pen phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4 -Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H ⁇ B t)].
  • active esters for example, pen phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4 -Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H ⁇ B t
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd_'carbon, or anhydrous 'Fusigei, methane' Acid treatment with sulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia Also used.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd_'carbon, or anhydrous 'Fusigei
  • methane' Acid treatment with sulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia Also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 to 40, but in the acid treatment, for example, anisol, phenol, thioanisole, meta-cresol, para-cresol, dimethyl
  • cation scavengers such as sulfide, 1,4-butanedithiol, and 1,2-ethanedithiol is effective.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-
  • an amide form of a protein first, a carboxyl group of the amino acid at the carboxy terminal is protected by amidation, and then a peptide (protein) chain is extended to a desired length on the amino group side. Thereafter, a protein from which only the protecting group for the N-terminal amino group of the peptide chain has been removed and a protein from which only the protecting group for the C-terminal carboxyl group has been removed are prepared. Condense in. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. This crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • an ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester.
  • the partial peptide of the AID protein of the present invention or a salt thereof which can be obtained can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the AID protein with a suitable peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used.
  • the desired peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protective group include the methods described in the following (1) to (1).
  • the AID protein of the present invention can be isolated and purified by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the protein obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method. Can be converted.
  • the polynucleotide encoding the AID protein used in the present invention may be any polynucleotide containing a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the above-described protein (DNA or RNA, preferably DNA). You may.
  • the polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double-stranded DNA, a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a hybrid of DNA: RNA may be used. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • Examples of the DNA encoding the AID protein used in the present invention include genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell or tissue-derived cDNA, the above-described cell or tissue-derived cDNA library, and synthesis. Any of DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of pateriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of total RNA or mRNA fraction from the cells or tissues described above. it can.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • DNA encoding the AID protein for example, a salt identical or substantially identical to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under high stringent conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; DNA containing a base sequence having a homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization is carried out according to a known method or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook and DW Russell, Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). I can. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • the “high stringent conditions” are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. Is shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • a protein in which a certain amino acid has been substituted, deleted or added can also be produced by preparing a polynucleotide (preferably DNA) encoding the same.
  • a polynucleotide preferably DNA
  • Such a polynucleotide can be obtained from a known kit based on a known method such as the ODA-LA PCR method, the Gap eddup 1 ex method, the Knuke 1 method, and the like, for example, Mutan TM -'s upper Expression Ks (Takara Shuzo Co., Ltd. )), Muta ⁇ ⁇ M _K (Takara Shuzo Co., Ltd.) or the like, or by PCR.
  • DNA containing the AID protein used in the present invention Recombinant vectors capable of expressing a gene include, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA (eg, cDNA) containing DNA encoding AID protein, and It can be produced by ligating downstream of a promoter in a vector.
  • DNA eg, cDNA
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pCl94
  • Yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., as well as ⁇ A1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pc DNA I / Neo, etc. are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoter when animal cells are the host, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, etc. are used. Of these, it is preferable to use the CMV promoter, SR ⁇ promoter overnight, and the like.
  • trp promoter When the host is Esherihia genus bacterium, trp promoter, 1 ac promoter evening one, re cA promoter, AP L promoter, lpp promoter mono-, such as T7 promoter, if the host is Bacillus, SPO l promoter
  • yeast such as the P02 promoter, the SP02 promoter, and the penP promoter
  • the PHO5 promoter, the PGK promoter, the GAP promoter, the ADH promoter, and the like When the host is an insect cell, polyhedrin promoter overnight, P10 promoter and the like are preferable.
  • selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [Mesotorekise Ichito (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r) Neomycin resistant Gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance), tetracycline resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Te t f), and the like.
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • MTX ampicillin phosphorus resistant gene
  • Amp r Neomycin resistant Gene
  • Te t f tetracycline resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host can be added to the N terminal of the AID protein.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an Omp A signal sequence, or the like.
  • the host is an animal cell, an insulin signal sequence, an ⁇ -interferon signal sequence, an antibody molecule signal sequence, and the like can be used, respectively.
  • a transformant can be produced using the recombinant vector containing the DNA encoding the AID protein thus constructed.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia bacteria When using Escherichia bacteria as a host, specifically, Escherichia coli Escherichia coli K12 ⁇ DH 1 [Procedures of the national abbreviation of the 'Science' Sci. USA (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)), J ⁇ 103 (Nucleic Acids Research), 9 volumes , 309 (1981)], JA 221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41] , 459 (1969)], C 600 [Genetics, 39, 440 (1954)], DH5a CInooe, ⁇ ⁇ , Nojima, H.
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1 984)] as a host, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
  • yeast When yeast is the host, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD_5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris (Pichia pastoris) and the like are used.
  • Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD_5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris (Pichia pastoris) and the like are used.
  • yeast for example, see Methods in Enzymology, 194, 182-187 (199).
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of Spodoptera (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell); MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni; High Five derived from egg of Trichoplusia ni TM cells, cells derived from Mamestra brass icae or cells derived from Est igmena acrea.
  • Sf cells include, for example, Sf9 cells (ATCC CRL17
  • Sf21 cells Vaughn, J.L., et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)
  • Sf21 cells Vaughn, J.L., et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)]. Transformation of insect cells or insects can be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • animal cells for example, monkey cells COS-1, COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dh fr—) cell), mouse L cell, mouse At T-20, mouse mouse mouth Cell lines, rat GH3, mouse NIH3T3 fibroblasts, human FL cells, HEK293 cells, C127 cells, Sp_2 / 0 cells and the like are used. Among these, CHO cells, CH 0 (dh fr ”) cells, HEK 293 cells, NI III-3 fibroblasts and the like are preferable.
  • Examples of the method for introducing the expression vector into cells include the calcium phosphate method [Grah am FL and van der Eb A. Journal Virology 52, 456-467 (1973)], the DEAE-dextran method [Sompayrac LM and Danna KJ Prossings of the National Academy of Obs RW et al. Prossings of the National Academy of the Sciences of the USA (Pro c. Natl. Acad. Sci. USA) 86, 6077-6081 (1989)], Electroporation CNuemann E. et al. Empo Journal (EMBO J.) 1, 841-845 (1982)].
  • commercially available reagents and the like using these principles eg, Lipoiectamine (GibcoBRL) can also be used.
  • the above-described method of selecting cells in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into the chromosome by clone selection is used. is there. Specifically, transformants can be selected using the above-mentioned selection abilities as indices. Further, by repeatedly performing clone selection on the animal cells obtained using the selection marker in this manner, it is possible to obtain a stable animal cell line having a high expression ability of the AID protein. it can.
  • the MTX concentration was gradually increased, and the cells were cultured.
  • the resistant strains were selected, whereby DNA encoding the AID protein was amplified together with dhfr in the cells. Furthermore, an animal cell line with higher expression can be obtained.
  • the above transformant is cultured under conditions under which the AID protein can be expressed, and the AID protein or a salt thereof can be produced by producing and accumulating the AID protein.
  • the AID protein can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and Z or freeze-thaw. After disrupting the cells or cells, a method of obtaining a crude extract of the AID protein by centrifugation or filtration may be appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark; sometimes abbreviated as TM hereinafter).
  • the AID protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method using difference in molecular weight, Method using charge difference such as ion exchange chromatography, Method using specific affinity such as affinity chromatography, Hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography, etc.
  • a method using the difference in the isoelectric point such as a method using the difference in the hydrophobicity of the dye, and a method using the isoelectric point electrophoresis, etc. are used.
  • the AID protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained in a salt, a known method Alternatively, it can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the AID protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified and the polypeptide can be partially removed before or after purification by the action of an appropriate protein modification enzyme.
  • the protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysylendopeptidase, thrombin, enterokinase, factor-1Xa, protein kinase, and glycosidase.
  • the present invention provides [1] a method for screening a compound having an anticancer effect or a salt thereof, and [2] a method for screening a compound or a salt thereof having an anticancer effect, using the AID protein or AID gene obtained as described above.
  • a kit [3] a compound having an anticancer effect or a salt thereof, [4] a method for screening a compound or a salt thereof that alters the frequency of somatic mutation, [5] a compound or a salt thereof that alters the frequency of somatic mutation. Salt, [6] cancer preventive and / or therapeutic agent, [7] mutation induction promoter [8] cancer preventive and / or therapeutic method, [9] intracellular mutant protein production method and production kit, etc. I do.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for screening a compound having an anticancer effect or a salt thereof. That is, it is a method of screening for a compound that exhibits an anticancer effect by controlling the function of the AID protein or the AID gene.
  • the first embodiment of the screening method of the present invention comprises: (1) A cell producing an AID protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the presence and absence of a test compound. (2) (i) determining the level of the AID protein produced by the cells cultured in the presence of the test compound and the cells cultured in the absence of the test compound; The AID protein produced Or (ii) culturing in the absence of the test compound with the level of mRNA encoding the AID protein transcribed in cells cultured in the presence of the test compound. Comparing the level of mRNA encoding the AID protein transcribed in the cell.
  • another embodiment of the screening method of the present invention includes: It is characterized in that the transcription of the gene encoding the other protein into mRNA in the cell occurs depending on the level of the signal of transcription of the gene encoding the AID protein into mRNA. (2) culturing the cells under the respective conditions in the presence and absence of the test compound, and (2) determining the level of the other protein produced by the cells cultured in the presence of the test compound and the level of the other protein. Comparing the level of said other protein produced by cells cultured in the absence of the test compound.
  • any cells that can produce the AID protein used in the present invention can be used.
  • a natural cell particularly preferably a natural cell derived from mouse or human
  • a transgenic cell transformed with a gene encoding the AID protein used in the present invention and a gene encoding the AID protein used in the present invention Cells into which mRNA has been introduced.
  • the host cells used for preparing the transgenic cells for example, CHO cells, HEK293 cells, mouse myeloma cells, mouse NIH3T3 fibroblasts and the like can be used. In particular, Mau NIH3T3 fibroblasts are preferred.
  • the method of the present invention includes the so-called reporter gene Atsushi.
  • As the repo overnight protein luciferase derived from fireflies or mushrooms or GFP derived from jellyfish is preferred.
  • the reporter gene accession can be performed, for example, by the following method. First, (1) a gene encoding an AID protein and a gene encoding a reporter protein, or only a gene encoding a reporter protein, are used as signals for transcription of the gene encoding the AID protein into mRNA. Transcription of the gene encoding the reporter protein into mRNA (preferably, to the mRNA of the gene encoding the reporter protein under the control of the activity of the natural promoter of the AID gene).
  • the cells commonly used in the production of recombinant proteins are transformed with the inserted expression vector so that transgenic cells are produced.
  • a test compound is brought into contact with the obtained transformed cells.
  • determining the level of the target protein expressed depending on the action of the test compound by measuring the amount of fluorescence emitted by the reporter protein expressed simultaneously with the expression of the target protein. By measuring, it is analyzed whether the compound affects the expression of the gene encoding the target protein (see, for example, US Pat. No. 5,436,128 and US Pat. No. 5,401,629). ).
  • test compounds using the above assay can be performed manually, but can also be performed automatically using a robot. According to the so-called High Throughput Screening (tissue culture engineering, Vol. 23, No. 13, p. 521-524; U.S. Pat. No. 5,670,113), it is performed more quickly and easily. be able to.
  • test compound for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. Or a known compound.
  • kits for screening a compound having an anticancer activity or a salt thereof comprising a cell producing an AID protein.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • the cells expressing the gene encoding the AID protein 12-well plates and passaged 5x10 5 cells / well in, 37, 5% C0 2, followed by culturing for 2 days at 95% air.
  • a buffer having a physiological salt concentration and pH for example, Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco)). Sterilize by filtration through a filter with a pore size of 0.45 m, store at 4 ° C, or prepare at the time of use.
  • a physiological salt concentration and pH for example, Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco)
  • a cell that produces AID protein is added to a liquid culture medium for cell culture (for example, Dulbecco's modified Eagle's MEM (manufactured by Gibco) with 10% fetal bovine serum).
  • a liquid culture medium for cell culture for example, Dulbecco's modified Eagle's MEM (manufactured by Gibco) with 10% fetal bovine serum.
  • the cells included in the kit of the present invention all cells capable of producing AID derived from humans or other mammals can be used. Among them, mouse CH12F3-2 cells, Daudi cells, IM-9 cells, Raji cells, mouse myeloma cells, and the like are preferable, and mouse CH12F3_2 cells are particularly preferable.
  • a transgenic cell transformed with the AID gene preferably, a transgenic cell containing the natural promoter of AID
  • a transgenic cell preferably a transgenic cell containing the natural promoter of AID transformed with the AID gene and a gene encoding another protein is used.
  • the other protein contained in the cells used in the present invention is desirably a reporter protein.
  • the reporter protein may be any gene as long as it can be expressed in the cells used in the present invention, such as the luciferase gene derived from honey bean or P. mushroom, the GFP gene derived from jellyfish, CAT (chloramphenicol acetyltransferase) gene, alkaline phosphatase gene, j3-galactosidase gene, growth hormone gene and the like are preferable.
  • luciferase is used because its expression can be detected with high sensitivity.
  • a GFP gene whose expression can be directly confirmed without using a gene or a reagent such as another substrate is preferably used.
  • the screening kit of the present invention includes the following reagents.
  • a buffer having a physiological salt concentration and pH for example, Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco)). Sterilize by filtration through a 0.45 m pore size filter, and store at 4 or prepare it before use.
  • (1) Contains a natural promoter of AID and expresses a gene encoding an AID protein and a gene encoding another protein other than the AID protein
  • That cells seed medium liquid cell culture (for example Dulbecco's modified Eagle's MEM (manufactured by GIBCO co Corp.) ⁇ Shi calf serum which was added 10%) by 1 ⁇ 5xl 0 5 cells / well in 24-well plates and suspended in and cultured for 24 hours at 37T :, 5% C0 2, 95 % A ir.
  • liquid cell culture for example Dulbecco's modified Eagle's MEM (manufactured by GIBCO co Corp.) ⁇ Shi calf serum which was added 10%
  • the compound thus obtained can be used as an agent for preventing and / or treating cancer.
  • the cancer include lymphoma, leukemia, prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer and the like.
  • the compound when used as a prophylactic and / or therapeutic agent for cancer, it can be formulated according to conventional means.
  • Somatic mutation involves (1) introducing a recombinant vector containing DNA encoding the AID protein into cells into which a reporter gene has been introduced, (2) culturing the cells under appropriate conditions, and (3) ) Prepare genomic DNA or mRNA from the cells, amplify the reporter gene region using PCR, and (4) determine the nucleotide sequence after subcloning the PCR amplification product into an appropriate vector. More detectable. Using this method of detecting somatic mutations, A compound or a salt thereof that changes the frequency of mutation can be screened.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that alters the frequency of somatic mutation comprising the steps of (1) SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Introducing a recombinant vector containing the same or substantially the same nucleotide sequence as the base sequence to be introduced into a cell into which a reporter gene has been introduced, (2) the above-mentioned conditions under the presence and absence of a test compound.
  • Culturing cells (3) preparing genomic DNA or mRNA from the cells, and amplifying a reporter gene region using PCR, (4) determining the nucleotide sequence of the PCR amplification product And (5) a step of comparing the frequency of somatic mutation in each case in the presence or absence of the test compound.
  • SEQ ID NO: 2 Is a step of introducing a transfection vector having the same or substantially the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 into cells into which the mutant reporter gene has been introduced; After the step of culturing the cells in the presence and absence of the test compound, ( 3 ) comparing the expression of the reporter gene in the presence and absence of the test compound in each case And a screening method comprising the steps of:
  • the reporter gene used in this screening method may be any gene as long as it can be expressed in the cells used in the present invention.
  • the gene may be derived from GFP gene, 3-galactosidase gene, firefly or P. mushroom Luciferase gene, CAT gene, alkaline phosphatase gene, human growth hormone gene and the like are preferred.
  • the GFP gene is particularly used because the expression can be confirmed directly without using reagents such as other substrates. Specifically, the tyrosine codon TAC of the somatic mutation hot spot in the GFP gene is replaced with the termination codon TAG, and the mutant GFP gene that produces an immature inactive peptide is terminated by somatic mutation. The codon is replaced with the original amino acid (tyrosine), producing an active form of the GFP protein.
  • the cells into which the reporter gene is introduced may be human or other mammals. Can be used. Among them, CHO cells, HEK293 cells, mouse myeloid cells, mouse NI H3T3 fibroblasts and the like are preferable, and mouse NI H3T3 fibroblasts are particularly preferable.
  • the AID gene and the mutant reporter gene introduced into the cell function together with the chemical drug responsive promoter and the transactivator.
  • the chemical agent include ampicillin, neomycin, kanamycin, and tetracycline.
  • tetracycline is preferably used because the expression level of the target protein can be arbitrarily controlled.
  • NI H3T3 fibroblasts transfected with the tetracycline promoter, the AID gene and the mutant reporter gene, which are regulated by the tetracycline promoter, are usually placed in a medium containing (or not containing) tetracycline. Turn off the expression of AID protein and culture.
  • AID activity for example, to screen for a compound that alters the frequency of somatic mutation or its salts, replace the medium with (or contain) tetracycline and turn on AID protein expression .
  • the stop codon TAG introduced into the mutant repo overnight gene is replaced by the codon TAC encoding the original amino acid (tyrosine) due to the activity of the AID protein, and as a result, the active form of GFP Protein is produced.
  • the expression of the GFP gene in the cells is analyzed using FACS CaIibur and CeI1Quest software (BectonDickinson). At this time, dead cells are deleted from the analysis. That is, by selecting only living cells and measuring the fluorescence emitted by the GFP gene product produced in the cells, the expression of the GFP gene in the cells is confirmed.
  • the genomic DNA or mRNA is prepared from the cells using the method described in (1). Using these as type II, a DNA fragment containing the GFP gene sequence is amplified by PCR using an appropriate primer. P The CR amplification product can be subcloned into an appropriate vector such as pGEM_T (Promega), and its nucleotide sequence can be analyzed.
  • test compound for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. Or a known compound.
  • the compound or a salt thereof obtainable by the above-mentioned screening method is a compound having an effect of changing the frequency of somatic mutation. Specifically, (1) a compound having an effect of reducing the frequency of somatic cell mutation, and (2) a compound having an effect of increasing the frequency of somatic cell mutation.
  • the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • Mutagenesis promoters are used to more efficiently produce mutants of the target protein in cells that express the AID protein.
  • the mutant target protein produced using the AID and the mutagenesis promoter can be used to modify the function of the target protein, elucidate the structure-activity relationship of the target protein, develop drugs using the mutant target protein, etc. Can be used.
  • compounds having an effect of reducing the frequency of somatic mutation include, for example, cancer, allergies (eg, bronchial asthma, atopic dermatitis, conjunctivitis, allergic rhinitis, allergic enteritis, drug allergy, food allergy) , Allergic urticaria, glomerulonephritis, etc.) and useful as a medicament for the prevention and treatment of autoimmune diseases and the like.
  • allergies eg, bronchial asthma, atopic dermatitis, conjunctivitis, allergic rhinitis, allergic enteritis, drug allergy, food allergy
  • Allergic urticaria glomerulonephritis, etc.
  • a compound obtained by the screening method or the like of the present invention is When used as a preventive and / or therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
  • salts When the compound (active ingredient) can form a pharmaceutically acceptable salt, such a salt may be formed.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids, etc.
  • bases eg, alkali metals, etc.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • the above-mentioned compound or a salt thereof can be sterilized orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., if necessary, with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions.
  • the active compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by doing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • Aqueous injection solutions include, for example, saline, isotonic solutions containing pudose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride). Thorium, etc.), and suitable solubilizing agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), non-ionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO) — 50) may be used together.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic and / or therapeutic agents described above include, for example, buffers (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, prochlorinate hydrochloride, etc.), stabilizers ( For example, it may be blended with human serum albumin, polyethylene dalicol, etc.), preservative (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidant and the like.
  • buffers for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, prochlorinate hydrochloride, etc.
  • stabilizers For example, it may be blended with human serum albumin, polyethylene dalicol, etc.
  • preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the dose of the active ingredient of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • oral administration generally, for example, for a patient (as 60 kg), It is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually administered to patients (as 6 O kg).
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the formulation obtained in this way is safe and low toxic.
  • it can be administered to humans and other mammals (for example, rats, eight guinea pigs, guinea pigs, egrets, goats, sheep, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • Intracellular method for producing mutant protein and kit The present invention also provides a method for efficiently producing a mutant protein in a cell and a kit for producing the mutant protein. That is, the present invention relates to (1) a recombinant vector containing the same or substantially the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. (2) culturing the cells in the presence or absence of a compound or a salt thereof that increases the frequency of somatic mutation.
  • a method for producing a mutant protein comprising the steps of: expressing a target gene product; and (1) containing a nucleotide sequence identical or substantially identical to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • a recombinant vector comprising the steps of: expressing a target gene product; and (1) containing a nucleotide sequence identical or substantially identical to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • a production kit comprising: a cell into which a target gene is introduced; and (3) a compound or a salt thereof that increases the frequency of somatic mutation.
  • the target gene may be any gene as long as it can be expressed in the cells used in the present invention.
  • the introduction of a mutation into a target gene can be performed in the presence of a compound or a salt thereof that increases the frequency of somatic mutation as described above, or in the absence of the compound or a salt thereof, It can also be performed using only the functions inherent in the AID gene (or AID protein).
  • Whether or not a mutation has been introduced into the target gene can be confirmed by analyzing the base sequence of the target gene or by analyzing the function (eg, enzyme activity) of the gene product.
  • genomic DNA or mRNA is recovered from the cells by a known method, and the region containing the target gene is amplified by the PCR method. The obtained amplification product is subcloned and its nucleotide sequence is analyzed.
  • the mutation target protein produced using the mutation introduction promoter of the present invention and the method Z kit described above was used to modify the function of the target protein, elucidate the structure-activity relationship of the target protein, and use the mutant target protein. Can be used for drug development, etc.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of a human-derived AID protein used in the present invention.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer TetGFPR used in Example 2.
  • tet-off tetracycline-responsive (tet-off) transactivator and a mutant GFP sequence transcribed by the inducible tetracycline (tet) promoter to test for hypermutation (HM) in non-lymphoid cells
  • HM hypermutation
  • Mutant GFP produces immature peptides
  • RGYW [R is purine (A / G); Y is pyrimidine (C / T); W is A / T] present in the gene has a stop codon (TAG) in the SHM hotspot.
  • the plasmid containing pI has been shown to be useful for apoptosis of SHM in mouse pre-B cell lines and CH12F3-2B lymphoma cell lines (J. Bacl et al. Journal Immunology). J. Immunology) 166, 5051-5057 (2001)).
  • AID was introduced into 19 NIH3T3-PI cell clones by retroviral infection, and Southern blot analysis revealed that each contained 1 to 4 copies of pI.
  • FIG. 2 shows the results. That is, FIG. 2 shows the results of analysis of GFP expression by FACS.
  • the frequency of GFP + cells increased depending on the amount of AID virus infectious, but not with AID m-1 virus.
  • the frequency of GFP + cells increased with decreasing tetracycline concentration in the medium.
  • mutations in the GFP substrate increased depending on the amount of AID virus as well as the level of transcriptional induction.
  • FIGS. As shown in FIG. 5, GFP + cells began to appear 3 days after AID expression and reached a maximum level (0.92 ⁇ 0.14%) at 10 days. Although the frequency of GFP + cells was gradually decreased by 10 20 days, mutation rate of the GFP sequence at 2 day 0 (6. 5x1 CT 3 mutation Zb p) is mutation rates at 10 days (4.
  • Example 2 The following experiments were performed to evaluate the overall mutation frequency. That is, all DNAs of NI H3T3-pI cells infected with AID-expressing virus cultured in the absence of tetracycline for 10 days were prepared by a known method. The fragment containing the GFP gene was amplified by PCR using primers CMVPF (SEQ ID NO: 5) and primer Tet GFPR (SEQ ID NO: 6) using the entire DNA as type II. Amplification was performed at 94 ° C for 30 seconds, 57 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute for 30 cycles.
  • mutation rate is 4. 5x10_ 4 mutations / bp / generation, mutation rates in the SHM of I g (1x10- 4 ⁇ lxl 0-3 mutations / bp / generation) Matches. In contrast, only three mutations were found in the 23 GFP sequences of AID-infected cell lines cultured in the presence of tetracycline. No mutations were detected in AI Dm-1 infected cells, regardless of the presence of tetracycline in culture. Not all transcribed genes are likely to accumulate such high frequency mutations. That is, the c-my c gene, which accumulates a two-digit lower level of mutation in a diffuse large B lymphoma compared to the V gene, did not accumulate AID-induced mutant NI H3T 3 cells.
  • SHM in Ig include many point mutations, sometimes with deletions or duplications, transition rather than transversion, and targeting to the RGYWZWRCY motif.
  • the distribution of the 247 mutations in 53 clones of the GFP sequence was analyzed, and the results are shown in FIGS. As shown in Figure 6, point mutations are statistically biased toward the RGYW / WRCY motif (indicated by white letters), and as shown in Figure 7, transition mutations are superior to transversions. Met. Table 2 shows the results. Table 2 Mutation bias for RGYWZWRCY and secondary structure
  • nucleotide bias may be due to differences in the amount of DNA polymerase or specific DNA repair proteins that are relatively error-prone.
  • 18 deletions and 2 duplications were observed consistent with the properties of SHM in Ig.
  • 10 inducible ] ⁇ Is a common property of Ig with SHM: (a) AID is required, (b) is dependent on target gene transcription, (c) is a mutation biased toward a specific motif, (D) Occasional deletions and duplications; (e) High mutation rates.
  • the function of the gene encoding the AID protein or AID protein, or a similar protein or the gene encoding the same causes (1) cleavage into the DNA chain. Enters. (2) When repairing this, error-prone repair is performed, and mutations accumulate on DNA. (3) Accumulation of mutations may trigger cancer. Controlling the function of these proteins or their genes would enable cancer prevention and Z or treatment, or its diagnosis.
  • the present invention provides a screening method and a screening kit for a compound that alters the frequency of somatic mutation.
  • Compounds obtained by using these screening methods and screening kits can be used as anticancer agents.
  • a mutant protein having a mutation efficiently introduced therein can be produced.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、抗癌剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用いることにより得られる抗癌剤などを提供する。本発明のスクリーニング方法およびスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物は抗癌剤および変異導入促進剤として用いることができる。また、本発明で用いられる体細胞突然変異の検出方法を利用することにより、細胞内で効率的に変異が導入された変異タンパク質を作製することができる。

Description

明細書
抗癌剤のスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 AID (Activation- induced cytidine deaminase) 遺伝子または その産物を用いた抗癌剤および変異導入促進剤のスクリーニング方法、 該スクリ 一二ング方法を用いて得られる抗癌剤、 変異導入促進剤などに関する。 背景技術
非常に多くの病原体による感染から防御するために、 脊椎動物の免疫システム は体細胞の DN A変異を利用して、 ゲノムにコードされる限られた情報量を増加 させている。 まず、 胸腺および骨髄それぞれの分化の過程で、 V (D) J組換え により散在する 2、 3の生殖細胞胚型遺伝子断片 （germic segment) が再構成さ れ、 Tおよび Bリンパ細胞の抗原受容体遺伝子の可変 （V) ェクソンが形成され る。 次に末梢において、 成熟 Bリンパ細胞の免疫グロブリン （I g) 遺伝子が、 3種類の遺伝的変化、 すなわち V遺伝子における体細胞突然変異 （SHM) 、 遺 伝子変換 （GC) 、 および重鎖定常領域 （CH) 遺伝子におけるクラススィッチ 組換え （CSR) により、 さらに修飾される。 抗原に対する I gの特異性と親和 性は、 抗原による選択と合わせて、 非铸型性 SHMまたは V領域遺伝子における 偽遺伝子を铸型とする GCのいずれかにより増大する。 一方、 CSRは CH遺伝 子を C から他の CH遺伝子に置き換え、 それにより I gのイソタイプとェフエ クタ一機能を変化させる。 3種類の DNA変化の分子機構はいまだに研究されて いる。 上記反応のうち、 CSRについて A I D遺伝子が関与していることが判明 している （特開 2001— 245669参照） 。
特開 2001— 245669には、 A I Dタンパク質およびその断片、 該夕ン パク質をコードする DNAおよびその断片 （cDNA、 ゲノム DNA、 およびプ ライマー DNA) 、 該 DNAを含む発現ベクター、 該発現ベクターで形質転換さ れた形質転換細胞、 該タンパクもしくはその断片に反応性を有する抗体、 該抗体 を産生する細胞、 ならびに該タンパクの産生、 該夕ンパクをコードする遺伝子の mRNAへの転写、 もしくは該タンパクの酵素活性を調節する物質を同定する方 法が開示されている。 さらに、 A I Dタンパク質または A I Dタンパク質をコ一 ドする遺伝子の機能を制御することにより発症予防、 病状の軽減、 治療および/ または対症療法効果が期待される疾患としては、 例えば、 先天的な免疫系の異常 を伴う原発性免疫不全症候群、 主として Bリンパ球の欠損、 減少あるいは機能異 常により発症すると考えられている種々の免疫不全症 （例えば、 伴性無 rグロブ リン血症、 成長ホルモン欠乏を伴う伴性無ァグロブリン血症、 I gM高値を伴う 免疫グロブリン欠乏症、 選択的 I gM欠損症、 選択的 I gE欠損症、 免疫グロブ リン重鎖遺伝子欠失変異症、 κ鎖欠乏症、 I gA欠乏症、 I gGサブクラス選択 的欠乏症、 CVID (common variable immunodeficiency) 、 乳児一過性低ァグ ロブリン血症、 Ro s en症候群、 重症複合免疫不全症 （伴性、 常染色体劣性） 、 ADA (adenosine deaminase) 欠損症、 PNP urine nucleoside phospho rylase) 欠損症、 MHCクラス I I欠損症、 細網異形成症、 Wiskott-Aldrich症 候群、 ataxia telangiectasia, DiGeorge症候群、 染色体異常、 家族性 I g異化 過多症、 高 I g E症候群、 G i t 1 i n症候群、 Ne z e l o f症候群、 Go o d症候群、 骨異形成症、 トランスコバランミン症候群、 セクレ夕リービース症候 群など） 、 後天的な原因により引き起こされた免疫系の傷害を伴う続発性免疫不 全症候群 （例えば、 A I DSなど） であり抗体産生不全を伴う種々の疾患および /または種々のアレルギー性疾患 （例えば、 気管支喘息、 アトピー性皮膚炎、 結 膜炎、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー性腸炎、 薬剤性アレルギー、 食品アレルギ ―、 アレルギー性じんましん、 糸球体腎炎など） が挙げられている。 しかし、 A IDタンパク質または A I Dタンパク質をコードする遺伝子の機能と免疫関連疾 患以外の疾患との関連については何ら示唆も開示もされていない。
上記のように、 A I Dタンパク質または A I Dタンパク質をコードする遺伝子 は全ての細胞において機能させることが可能であると考えられるので、 A I D夕 ンパク質または A I Dタンパク質をコードする遺伝子の機能を制御することによ り、 各種の機能不全に起因する疾患を予防および Zまたは治療することが可能で あると考えられる。 したがって、 A I Dタンパク質または A I Dタンパク質をコ —ドする遺伝子の機能のさらなる解明が望まれていた。 発明の開示
本発明者は、 A I D遺伝子が体細胞突然変異に関与していることを解明し、 本 発明を完成させるに至った。 すなわち、 本発明は A I D遺伝子またはその産物を 用いた抗癌剤のスクリーニング方法、 該スクリーニング方法を用いて得られる抗 癌剤、 細胞内での変異タンパク質作製方法および作製キットなどを提供する。 より具体的には、 本発明は、
[ 1 ] ( 1 ) 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有 する A I Dタンパク質を産生する細胞を試験化合物の存在下および非存在下の各 々の条件下で培養する工程、 および （2 ) ( i ) 該試験化合物の存在下で培養し た細胞が産生する該 A I Dタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養 した細胞が産生する該 A I Dタンパク質のレベルを比較する工程、 もしくは （ i i ) 該試験化合物の存在下で培養した細胞中で転写された該 A I Dタンパク質を コードする mR N Aのレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞中で転写 された該 A I Dタンパク質をコードする mR NAのレベルとを比較する工程とを 含む、 抗癌作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングする方法、
[ 2 ] ( 1 ) 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有 する A I Dタンパク質および該 A I Dタンパク質以外の他のタンパク質を産生す る細胞であって、 該細胞における該他のタンパク質をコードする遺伝子の mR N Aへの転写が、 該 A I Dタンパク質をコードする遺伝子の mR NAへの転写のシ グナルの程度に依存して起こるものであることを特徴とする細胞を、 試験化合物 の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、 および （2 ) 該試験化 合物の存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルと該試験化合 物の非存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルを比較するェ 程とを含む、 抗癌作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングする方法、
[ 3 ] 該他のタンパク質をコードする遺伝子の mR NAへの転写が、 該 A I D 遺伝子の天然プロモーター活性に制御されて起こるものであることを特徴とする 上記 [ 2 ] 記載の方法、
[ 4 ] 該細胞が、 該タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組 換え細胞であることを特徴とする上記 [1] 、 [2] または [3] 記載の方法、
[5] 該細胞が、 該タンパク質をコードする遺伝子および該他のタンパク質を コードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする上 記 [2] または [3] 記載の方法、
[6] 該他のタンパク質が、 レポ一夕一タンパク質であることを特徴とする上 記 [5] 記載の方法、
[7] 該他のタンパク質のレベルの比較が 該レポータータンパク質が発する シグナルのレベルの比較であることを特徴とする上記 [6] 記載の方法、
[8] 該レポータータンパク質が、 ルシフェラーゼもしくは GFPであること を特徴とする上記 [6] または [7] 記載の方法、
[9] 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する A
I Dタンパク質を産生する細胞を含む、 抗癌作用を有する化合物またはその塩の スクリーニング用キッ卜、
[10] 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する A I Dタンパク質および該 A I Dタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細 胞を含む、 抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
[11] 上記 [1] または [2] 記載のスクリーニング方法、 あるいは上記 [ 9] または [10] 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗癌作用 を有する化合物またはその塩、
[12] 上記 [11] 記載の化合物またはその塩を含んでなる抗癌剤、
[13] 癌がリンパ腫、 白血病、 前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱 癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 [12] 記載の 抗癌剤、
[14] 体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩をスクリー二 ングする方法であって、 (1) 配列番号： 2または配列番号： 4で表される塩基 配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクターを、 該 A I Dタンパク質の基質遺伝子を導入した細胞に導入する工程、 （2) 試験化合物の 存在下および非存在下の各々の条件で前記細胞を培養する工程、 （3) 前記細胞 において該試験化合物の存在下および非存在下の各々の場合での体細胞突然変異 の頻度を比較する工程、 を含むスクリーニング方法、
[15] 基質遺伝子が変異レポ一ター遺伝子であって、 AI Dタンパク質によ り正常レポーター遺伝子に変換される遺伝子である上記 [14] 記載の方法、
[16] 変異レポーター遺伝子が正常レポーター遺伝子中のチロシンコドン T ACを終止コドン TAGに変換した遺伝子である上記 [15] 記載の方法、
[17] 終止コドン TAGがレポーター遺伝子中の体細胞突然変異ホットスポ ッ卜に存在する上記 [15] 記載の方法、
[18] レポ一夕一遺伝子が GFP遺伝子である、 上記 [15] 記載の方法、
[19] 該 A I Dタンパク質の基質遺伝子を導入した細胞が非免疫細胞である 上記 [14] 記載の方法、
[20] 上記 [14] 記載のスクリーニング方法を用いることにより得られう る体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩、
[21] 体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物が体細胞突然変異の頻度を 増大させる化合物である上記 [20] 記載の化合物またはその塩、
[22] 上記 [21] 記載の化合物またはその塩を含有してなる変異導入促進 剤、
[23] 体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物が体細胞突然変異の頻度を 減少させる化合物である上記 [20] 記載の化合物またはその塩、
[24] 上記 [23] 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
[25] 癌の予防および Zまたは治療剤である上記 [24] 記載の医薬、
[26] 癌がリンパ腫、 白血病、 前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱 癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 [25] 記載の 医薬、
[27] 哺乳動物に対して、 上記 [23] 記載の化合物またはその塩の有効量 を投与することを特徴とする癌の予防および Zまたは治療方法、
[28] 癌の予防および/または治療剤を製造するための上記 [23] 記載の 化合物またはその塩の使用、
[29] 細胞内における変異タンパク質の作製方法であって、 （1) 配列番号 ： 2または配列番号： 4で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配 列を含有する組換えべクタ一を標的遺伝子を導入した細胞に導入する工程、 （2 ) 上記 [21] 記載の化合物またはその塩の存在下の条件、 または非存在下の条 件で、 前記細胞を培養することにより、 標的遺伝子産物を発現させる工程、 を含 む変異夕ンパク質の作製方法、
[30] 細胞内における変異タンパク質の作製キットであって、 （1) 配列番 号： 2または配列番号： 4で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基 配列を含有する組換えベクター、 （2) 標的遺伝子を導入する細胞、 （3) 上記
[21] 記載の化合物またはその塩、 からなる作製キットなどを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 テトラサイクリン誘導プロモーター （Te t p r omo t e r) 下 の GFP基質 （p i) を示す。 TRE、 Pm i nCMV、 TATAはそれぞれ、 テトラサイクリン応答性因子、 最小 CMVプロモーター、 TATAボックスを表 す。 CMVPFぉょびTe t GF PRは PC R増幅およびシ一ケンシングのため のプライマ一である。
図 2は、 F ACSによる GFP発現の解析結果を示す。 … '： ' 図 3は、 A I D誘導性 HMの A I D感染量依存性を示す。
図 4は、 テトラサイクリン濃度の変化に伴う培養 10日目における G F P+細 胞と変異の頻度を示す。
図 5は、 HMの経時変化の解析結果を示す。
図 6は、 GFP基質上の変異の分布を示す。 配列を決定した 53個の GFPク ローンから得られた 247個の点突然変異、 18個の欠失 （両方向の矢印） およ び 2個の重複 （太い下線） を GFP基質の配列上にマップしたものを示す。 開始 コドン、 変異終止コドン、 元来の終止コドンをアスタリスクで示した。
図 7は、 GZC塩基対への変異の偏りと卜ランジシヨン置換の優位を示す。 発明を実施するための最良の形態
(A) A I Dタンパク質
本発明で用いられる A I Dタンパク質は、 配列番号： 1または配列番号： 3で 表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する タンパク質である。
A I Dタンパク質をコードする mR NAの発現は、 胸腺以外の各種リンパ性組 織 （パイエル板、 腸管膜リンパ節、 腋窩リンパ節、 脾臓、 骨髄） で観察される。 特に、 リンパ節やパイエル板などの末梢リンパ器官で顕著な発現が見られる。 一 方、 一次性リンパ器官での発現は該末梢リンパ器官での発現と比べそのレベルは 低いものである。
本発明で用いられる A I Dタンパク質は、 例えば、 ヒトやその他の哺乳動物 （ 例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ハムスター、 ゥサギ、 プタ、 ヒッジ、 ゥ シ、 サルなど） の細胞 〔例えば、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細 胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球、 白血 球） またはこれら細胞の前駆細胞またはそれらの細胞が存在する組織 （例えば、 リンパ節、 リンパ性組織 （パイエル板、 腸管膜リンパ節、 腋窩リンパ節、 脾臓、 骨髄） など） または血球系の細胞もしくはその培養細胞に由来するタンパク質で あってもよく、 また合成タンパク質およびその他のタンパク質との融合タンパク 質を含む遺伝子組換え夕ンパク質であってもよい。
本明細書において、 「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは、 比較するアミノ酸 配列に対して、 例えば、 約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましく は約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 なかでも好ましくは約 9 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。
配列番号： 1または 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1または 3で表わされる アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1または 3で 表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する夕 ンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 シチジンデァミナーゼ活性が挙げられる。 実質 的に同質とは、 その活性が性質的に同質であることを示す。 したがって、 シチジ ンデァミナ一ゼ活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜 2 0倍、 より好ましくは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活 性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
シチジンデァミナーゼ活性の測定は、 ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケ ミストリー （J. Biol. Chem. ) 、 第 270巻、 14768— 14775頁 （19 95) に記載の方法にしたがって行なうことができる。
また、 本発明で用いられる A I Dタンパク質としては、 （1) 配列番号： 1ま たは 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜80 個程度、 より好ましくは 1〜20個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （2) 配列番号： 1または 3で表わされる アミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜80個程度、 より好ましく は 1〜20個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加した ァミノ酸配列、 （ 3 ) 配列番号： 1または 3で表わされるァミノ酸配列中の 1ま たは 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァ ミノ酸配列、 または （4) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパ ク質などもあげられる。 アミノ酸欠失または置換の位置は特に限定されない。 本明細書における A I Dタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って、 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列を含有する A I Dタンパク質を はじめとする、 本発明で用いられるタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 （一 COOH) 、 カルポキシレート （一 COO— ) 、 アミド （一 CONH2) またはェ ステル （—COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの C i_6アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナ フチルなどの C6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル
- C Hアルキル基もしくは 0!—ナフチルメチルなどの 0!—ナフチルー C アルキ ル基などの C 7_14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるピバ口 ィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられる A I Dタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （または カルボキシレー卜) を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステ ル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとし ては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられる A I Dタンパク質には、 上記したタンパク質にお いて、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセ チルなどの C 2_6アル力ノィル基などの C Mァシル基など） で保護されているもの 、 N端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸化したも の、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一〇H、 — S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C2—6アルカノィル基などの C Hjァシル基など） で保 護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合夕 ンパク質なども含まれる。
本発明で用いられる A I Dタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質があげら れる。 ' 本発明で用いられる A I Dタンパク質は、 A I Dタンパク質の部分ペプチドで あってもよく、 かかる部分ペプチドとしては、 前記した本発明の A I Dタンパク 質と同質の活性、 例えばシチジンデァミナーゼ活性を有するものであれば何れの ものであってもよい。
さらに、 A I Dタンパク質の部分ペプチドとしては、 配列番号： 1または 3で 表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1ま たは 3で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有 する部分ペプチドが好ましい。
さらに、 A I Dタンパク質の部分ペプチドには、 配列番号： 1または 3で表わ されるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは 約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以 上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するタンパク質の部分ペプチドが 用いられ、 より具体的には、 配列番号： 1または 3で表わされるアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜8 0個程度、 より好ましくは 1〜2 0個 程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列 、 配列番号： 1または 3で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜8 0個程度、 より好ましくは 1〜2 0個程度、 さらに好ましくは数個 ( 1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 配列番号： 1または 3で表 わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 よ り好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸 が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 またはそれらを組み合わせたアミノ 酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドなども含まれる。
また、 A I Dタンパク質の部分ペプチドの C末端は通常力ルポキシル基 （― C O OH) またはカルポキシレート （― C O O— ) であるが、 前記した本タンパク 質のごとく、 C末端がアミド （― C O NH2) またはエステル （一 C O O R) ( Rは前記と同義語を示す） であってもよい。
さらに、 A I Dタンパク質の部分ペプチドには、 上記した部分ペプチドにおい て、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ルなどの C2_6アルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダル夕ミル基がピ口ダル夕ミン酸化したもの 、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 _ OH、 ― S H、 アミノ基、 ィ ミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホ ルミル基、 ァセチルなどの C 2_6アルカノィル基などの C wァシル基など） で保護 されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合べプチ ドなども含まれる。
本発明で用いられる A I Dタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容 される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸 、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸) との塩などが用 いられる。
(B ) A I Dタンパク質またはその塩の製造法 本発明で用いられる A I Dタンパク質またはその塩は、 上記したヒトやその他 の哺乳動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造する こともできるし、 A I Dタンパク質をコードする D NAを含有する形質転換体を 培養することによっても製造することができる。
ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトやその他の 哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、 硫安沈殿、 エタノール沈殿、 酸抽出、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマ トグラフィー、 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、 レクチンカラムクロ マトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられる A I Dタンパク質もしくはそれらの塩の合成には、 通常市 販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例 えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベ ンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァ セトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— (2' , 4' -ジメトキシフ土' • 二ルーヒドロキシメチル) フエノキシ樹脂、 4 - (2'， 4' -ジメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル) フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような 樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とす るタンパク質の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さら に高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質 を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C， N， N， 一ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ルー N ' — ( 3—ジメチルァミノプロピル) カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HO B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性 化を行ったのちに樹脂に添加することができる。 保護アミノ酸の活性化や樹脂と の縮合に用いられる溶媒としては、 夕ンパク質縮合反応に使用しうることが知ら れている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド、 N—メチルピロリドン、 クロ口ホルム、 トリフルォロエタノール、 ジメチルスル ホキシド、 ピリジン、 ジォキサン、 塩化メチレン、 テトラヒドロフラン、 ァセト 二トリル、 酢酸ェチルあるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温 度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選 択され、 通常一 2 0 〜 5 0 Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァミノ 酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテス 卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り 返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合 が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未反応ァ ミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては例えば、 Z、 B o c、 ターシャリーアミルォ キシカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4 -メトキシベンジルォキシ < : 力ルポニル、 C 1— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 卜リフルォ . ロアセチル、 フタリル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエ二 ルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。 力ルポキシル基の保護基と しては、 例えばアルキルエステル (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル 、 夕一シャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シ クロォクチル、 2ーァダマンチルなどのエステル基) 、 ベンジルエステル、 4 - 二トロべンジルエステル、 4 -メトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル、 フエナシンエステル、 ベンジルォキシカル ポニルヒドラジド、 ターシャリーブトキシカルポニルヒドラジド、 トリチルヒド ラジドなどが用いられる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルポニル基などの炭素から誘導される基などが用いられる。 また エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基 、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2- B z l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 ターシャリーブチルなどが用いられる ヒスチジンのイミダゾール基の保護基としては、 例えば、 T o s、 4ーメトキ シー 2， 3, 6 -トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル、 B um、 B o c、 T r t、 Fm o cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2, 4， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4-ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール 、 パラニトロフエノール、 H O N B、 N—ヒドロキシスクシイミド、 N—ヒドロ キシフタルイミド、 H〇B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ 基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。 保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば P d—黒あるいは P d _ '炭素など の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水'フツイヒ永 、''メタン スルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン 、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウ ムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 で〜 4 0 の温度で行われるが、 酸処理においては例えば、 ァニソ一ル、 フエノ ール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフィド 、 1, 4-ブタンジチオール、 1， 2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加 が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4 -ジ ニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのィン ドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2 -エタンジチオール、 1, 4 - ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウ ム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段か ら適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 まず、 カルポキシ末端アミノ 酸のひ一カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド （夕 ンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端のひーァミノ 基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端のカルボキシル基の保護基のみを除 去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記のような混合溶媒中で縮 合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保 護タンパク質を精製した後、 上記の方法によりすベての保護基を除去し、 所望の 粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆 使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得 ることができる。
タンパク質のエステル体を得るためには、 カルボキシ末端アミノ酸の α—カル ポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タンパク 質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることができる 本発明の A I Dタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチ ドの合成法に従って、 あるいは A I Dタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断す ることによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては例えば固相合 成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち本発明のタンパク質を構成 しうる部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基 を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することがで きる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、 以下の（1)〜 ）に記載さ れた方法が挙げられる。
(D M. Bodanszkyおよび M. A. Onde t t i, ペプチド ·シンセシス （Pept ide Synthes i s) , Intersc ience Publ i shers, New York (1966年）
(2) Schroederおよび Luebke、 ザ'ペプチド (The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年） (3)泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） （1975年）
(4)矢島治明および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 ( 1977年）
(5)矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成、 廣川書店
また反応終了後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグ ラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて本発明の A I D タンパク質を単離精製することができる。 上記方法で得られるタンパク質が遊離 体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に 塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することが できる。
(C) A I Dタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明で用いられる A I Dタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては 、 上記したタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド （D NA または R NA、 好ましくは D NA) を含有するものであればいかなるものであつ てもよい。 該ポリヌクレオチドとしては、 本発明のレセプタータンパク質をコー ドする D NA、 mR NA等の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であって もよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 D NA、 二本鎖 R NAまたは D NA： R NAの ハイブリッドでもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （すなわち、 コード鎖） であ つても、 アンチセンス鎖 （すなわち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明で用いられる A I Dタンパク質をコードする D NAとしては、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 上記した細胞または組織由来の c D NA、 上 記した細胞または組織由来の c D N Aライブラリ一、 合成 D N Aのいずれでもよ い。 ライブラリ一に使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞または組 織より全 R NAまたは mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transc riptase Polymerase Chain React ion (以下、 R T— P C R法と略称する) によ つて増幅することもできる。
具体的には、 A I Dタンパク質をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番 号： 2または配列番号： 4で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩 基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2または配列番号： 4で表わされる 塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす る DNAを有し、 配列番号： 1または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性 （例えば、 シチジンデァミナ一ゼ活性 ) を有するタンパク質をコードする DNAであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2または配列番号： 4で表わされる塩基配列を有する DNAとハイ ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 2または配列番号： 4で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは 約 80%以上、 より好ましくは約 90 %以上、 さらに好ましくは約 95%以上の 相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー 'クロ一ニング （Molecular Cloning) 3rd (J. Sambrook and D. W. Russell, Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジ ェントな条件に従って行なうことができる。
「該ハイストリンジェントな条件」 とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜 40 mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは 約 60〜65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
あるアミノ酸が置換、 欠失、 付加されたタンパク質は、 それをコードするポリ ヌクレオチド （好ましくは DNA) を作製することによつても製造することがで きる。 そのようなポリヌクレオチドは ODA—LA PCR法、 Gapp e d d u p 1 e x法、 Ku n k e 1法等の公知の方法に基づく公知のキット、 例えば、 Mu t a n™ -' s up e r Exp r e s s Km (宝酒造 （株） ) 、 Mu t a ητ M_K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 あるいは PCRにより製造することができ る。
(D) 組換えベクター
本発明で用いられる A I Dタンパク質をコードする DNAを含有し、 A I D遺 伝子を発現できる組換えべクタ一は、 例えば、 （ィ） A I Dタンパク質をコード する DNAを含有する DNA (例えば、 cDNA) から目的とする DNA断片を 切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当なベクター中のプロモーターの下流に連結 することにより製造することができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pCR4、 pCR2. 1、 pBR322、 p BR 325, pUC 12、 pUC 13) 、 枯草菌由来のプラス ミド （例、 pUB 110、 pTP 5、 pC l 94) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19、 p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイ ルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρ A 1 - 1 1、 pXT 1、 pRc/CMV、 pRc/RSV, p c DNA I /N e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞が宿 主の場合は、 SRひプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプロモータ一 、 CMVプロモータ一、 HS V - TKプロモータ一、 などが用いられる。 これら のうち、 CMVプロモーター、 SR αプロモ一夕一などを用いるのが好ましい。 ' 宿主がェシェリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 1 a cプロモー 夕一、 r e cAプロモーター、 APLプロモーター、 l p pプロモータ一、 T7 プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPO lプロモーター 、 SP02プロモーター、 p e n Pプロモ一ターなど、 宿主が酵母である場合は 、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモータ一、 ADHプ 口モータ一などが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモ 一夕一、 P 10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 S V40複製オリジン (以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amprと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 、 テトラサイクリ ン耐性遺伝子 （以下、 Te tfと略称する場合がある） 等が挙げられる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 A IDタンパク質の N端 末側に付加することもできる。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA シグナル配列、 Omp Aシグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は 、 α—アミラーゼシグナル配列、 サブチリシンシグナル配列などが、 宿主が酵母 である場合は、 MFaシグナル配列、 SUC 2シグナル配列など、 宿主が動物細 胞である場合には、 インシュリンシグナル配列、 α—インターフェロンシグナル 配列、 抗体分子シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
(Ε) 形質転換体
このようにして構築された A I Dタンパク質をコードする DNAを含有する組 換えベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を宿主とする場合、 具体的には、 ェシエリヒア 'コリ （Esch eric ia coli) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ 力デミ一 'ォブ 'サイェンシィズ'ォブ'ザ 'ュ一エスェ一 （Pro Natl. Acad . Sci. USA) , 60巻， 160 (1968)〕 ， J Μ 103 〔ヌクイレック ·ァシ ッズ' リサーチ， （Nucleic Acids Research) , 9卷， 309 (1981)〕 ， J A 221 〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー （Journal of Molec ular Biology) ， 120巻， 517 (1978)〕 , HB101 〔ジャーナル ·ォ ブ ·モレキュラー ·バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジ エネティックス （Genetics) , 39卷， 440 (1954)〕 , DH5 a CInooe, Η·， Noj ima, H. and Okayama, H. , Gene, 96, 23-28 (1990)] ， DH10B 〔プロ シ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォ ブ.ザ.ユーエスエー （pro Natl. Acad. Sci. USA) ， 87巻， 4645— 4 649 (1990)〕 などを宿主として、 例えば、 プロシージングズ ·ォプ ·ザ · ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ .ザ ·ユーエスエー (Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 2110 (1972)やジーン （Gene) , 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換を行う。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·ズブチルス （Bacillus subtilis ) M I 114 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナ ル 'ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1 984)] などを宿主として、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジェネラル ·ジ エネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168巻， 111 (197 9 )などに記載の方法に従つて形質転換を行う。
酵母が宿主である場合、 例えば、 サッカロマイセス ·セレビシェ （Saccharomy ces cerevisiae) AH22, AH 22 R-， NA87-11 A, DKD_ 5D、 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス 'ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1913, NCYC 2036、 ピキア *パストリス （Pichia pastoris ) などが用いられる。 酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ'イン ·ェン ザィモロジ一 （Methods in Enzymology) , 194巻， 182— 187 (199
I) 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン シィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 75巻， 1
929 (1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 ョトウガの幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞） 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestr a brass icae由来の細胞または Est igmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 カイコ由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細 胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL17
II) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴィポ （In Vivo) ， 13, 21 3-217, (1977)) などが用いられる。 また、 昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫 などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー （Nature) , 315卷， 592 (198 5)〕 。 昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ/テクノロジ ― (Bio/Technology) , 6, 47 - 55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことが できる。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 1、 COS— 7、 Ve r o、 チ ャィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺伝子 欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略 記） 、 マウス L細胞、 マウス At T— 20、 マウスミエ口一マ細胞、 ラット GH 3、 マウス N I H3 T 3線維芽細胞、 ヒト FL細胞、 HEK293細胞、 C 12 7細胞、 S p_ 2/0細胞などが用いられる。 これらの中でも CHO細胞、 CH 0 (dh f r") 細胞、 H E K 293細胞、 N I Η 3 Τ 3線維芽細胞などが好ま しい。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロト コール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジ一 （Virology ) , 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
発現べクタ一の細胞への導入方法としては、 例えばリン酸カルシウム法 〔Grah am F. L. and van der Eb A. ジャーナル ·ヴイロロジー（Virology) 52, 456-467 (1973) ] 、 DEAE— d e x t r an法 〔Sompayrac L. M. and Danna K. J. プ ロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ · ォブ 'ザ*ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7575-7578 (1981) 〕 、 リポフエクシヨン法 CMalone R. W. et al. プロシージングズ ·ォブ ·ザ · ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー (Pro c. Natl. Acad. Sci. USA) 86, 6077-6081 (1989)] ， 電気穿孔法 CNuemann E. et al. ェンポ ·ジャーナル (EMBO J.) 1, 841-845 (1982)] 等が挙げられる。 ま た、 これらの原理を用いた市販の試薬等 （例えば、 Lipoiectamine (GibcoBRL) ) を用いることもできる。
このようにして、 A I Dタンパク質をコードする DNAを含有する組換えべク 夕一で形質転換された形質転換体が得られる。
なお、 動物細胞を用いて、 本発明で用いられるタンパク質を安定に発現させる 方法としては、 上記の動物細胞に導入された発現べクタ一が染色体に組み込まれ た細胞をクローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マ 一力一を指標にして形質転換体を選択することができる。 さらに、 このように選 択マ一カーを用いて得られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選択を行うこ とにより該 A I Dタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることが できる。 また、 d f h r遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、 MT X濃度を 徐々に上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 d h f rと共に該 A I D夕 ンパク質をコードする D NAを細胞内で増幅させて、 さらに高発現の動物細胞株 を得ることもできる。
上記の形質転換体を該 A I Dタンパク質が発現可能な条件下で培養し、 該 A I Dタンパク質を生成、 蓄積せしめることによって、 該 A I Dタンパク質またはそ の塩を製造することができる。
各種宿主について適当な培地、 培養条件などについては公知である （特に、 W 〇 0 0 / 1 4 2 2 7号公報第 2 4頁第 2 4行〜第 2 6頁第 8行、 E P 1 1 1 1 0 4 7 A 2号公報段落 [ 0 0 9 0 ]〜[ 0 0 9 6 ]参照） 。
上記培養物から該 A I Dタンパク質を分離精製するには、 例えば下記の方法に より行うことができる。
該 A I Dタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後 、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波 、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過により該 A I Dタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適 宜用い得る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク変性剤や、 トリ トン X— 1 0 0 (登録商標。 以下 T Mと略称する場合がある）などの界面活性剤が 含まれていても良い。
培養液中にタンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体 あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上 清あるいは抽出液中に含まれる該 A I Dタンパク質の精製は公知の分離 ·精製法 を適切に組み合わせて行うことができる。 これらの公知の分離 ·精製法としては 、 塩析ゃ溶媒沈殿法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ 過法、 および S D S一ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの主に分子量の差を 利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 疎水ク 口マトグラフィ一および逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方 法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 このようにして得られる該 A I Dタンパク質が遊離体で得られた場合には、 公 知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で 得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお組換え体が産生する該 A I Dタンパク質を、 精製前または精製後に適当な タンパク修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリべプチ ドを部分的に除去することもできる。 タンパク修飾酵素としては、 例えば、 トリ プシン、 キモ卜リプシン、 リジルェンドぺプチダーゼ、 トロンビン、 ェンテロキ ナーゼ、 ファクタ一 X a、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられ る。
本発明は、 上記のようにして得られる A I Dタンパク質または A I D遺伝子を 用いる、 [ 1 ] 抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 [ 2 ] 抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、 [ 3 ] 抗 癌作用を有する化合物またはその塩、 [ 4 ] 体細胞突然変異の頻度を変化させる 化合物またはその塩のスクリーニング方法、 [ 5 ] 体細胞突然変異の頻度を変化 させる化合物またはその塩、 [ 6 ] 癌の予防および/または治療剤、 〔7〕 変異 導入促進剤 [ 8 ] 癌の予防および/または治療方法、 [ 9 ] 細胞内における変異 タンパク質の作製方法および作製キットなどを提供する。
以下、 各実施態様について具体的に説明する。
[ 1 ] 抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明の一態様は、 抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方 法に関する。 即ち、 A I Dタンパク質または A I D遺伝子の機能を制御すること により抗癌作用を示す化合物をスクリーニングする方法である。
本発明のスクリ一二ング方法の第 1の態様は、 （ 1 ) 配列番号： 1または配列 番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する A I Dタンパク質を産生する細胞を 試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、 および （2 ) ( i ) 該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該 A I Dタンパク質の レベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該 A I Dタンパク質 のレベルを比較する工程、 もしくは （i i ) 該試験化合物の存在下で培養した細 胞中で転写された該 A I Dタンパク質をコードする mR N Aのレベルと該試験化 合物の非存在下で培養した細胞中で転写された該 A I Dタンパク質をコードする mR N Aのレベルとを比較する工程とを含む。
また本発明のスクリーニング方法の別の態様は、 （ 1 ) 配列番号： 1または配 列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する A I Dタンパク質および該 A I D タンパク質以外の他のタンパク質を産生する細胞であって、 該細胞における該他 のタンパク質をコードする遺伝子の mR NAへの転写が、 該 A I Dタンパク質を コードする遺伝子の mR N Aへの転写のシグナルの程度に依存して起こるもので あることを特徵とする細胞を、 試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件 下で培養する工程、 および （2 ) 該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生す る該他のタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生す る該他のタンパク質のレベルを比較する工程とを含む。
好ましくは、 （1 ) 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列 を含有する A I Dタンパク質および該 A I Dタンパク質以外の他のタンパク質を 産生する細胞であつて、 該細胞における該他のタンパク質をコードする遺伝子の mR NAへの転写が該 A I D遺伝子の天然プロモーター活性に制御されて起こ ¾ ものであることを特徴とする細胞を、 試験化合物の存在下および非存在下の各々 の条件下で培養する工程、 および （2 ) 該試験化合物の存在下で培養した細胞が 産生する該他のタンパク質のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が 産生する該他のタンパク質のレベルを比較する工程とを含む。
本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、 本発明で用いられる A I Dタンパク質を産生し得る細胞であればどのような細胞をも利用し得る。 例 えば、 天然の細胞 （特に好ましくはマウスまたはヒト由来の天然細胞） 、 本発明 で用いられる A I Dタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換 え細胞、 本発明で用いられる A I Dタンパク質をコードする mR NAが導入され た細胞などが挙げられる。 該遺伝子組換え細胞の調製に用いられる宿主細胞とし ては、 例えば C H O細胞、 H E K 2 9 3細胞、 マウスミエローマ細胞、 マウス N I H 3 T 3線維芽細胞等を用いることができるが、 本発明においては特に、 マウ ス N I H 3 T 3線維芽細胞が好ましい。
本発明の方法には、 いわゆるレポーター遺伝子アツセィが包含される。 レポ一 夕一タンパク質としては、 ホタルもしくはゥミシィタケなどに由来するルシフエ ラ一ゼ、 またはクラゲ由来の G F Pなどが好ましい。 レポーター遺伝子アツセィ は、 例えば、 次のような方法で行うことができる。 まず、 （1 ) A I Dタンパク 質をコードする遺伝子とレポータータンパク質をコードする遺伝子、 あるいはレ ポ—タータンパク質をコードする遺伝子のみを、 該 A I Dタンパク質をコードす る遺伝子の mR N Aへの転写のシグナルに依存して該レポータータンパク質をコ ードする遺伝子の mRNAへの転写が起こるように （好ましくは、 該 A I D遺伝 子の天然プロモータ一活性の制御下に該レポータータンパク質をコードする遺伝 子の mR NAへの転写が起こるように） 、 挿入した発現ベクターで、 遺伝子組換 えタンパクの製造で一般的に使用される細胞を形質転換して遺伝子組換え細胞を 作製する。 次に、 （2 ) 得られた形質転換細胞に、 試験化合物を接触させる。 そ して、 （3 ) 該試験化合物の作用に依存して発現される該標的タンパク質のレべ ルを、 該標的タンパク質の発現と同時に発現される該レポ一タータンパク質が発 する蛍光の量を測定することにより、 該化合物が、 標的タンパク質をコードする 遺伝子の発現に影響を与えるか否かを分析する （例えば、 米国特許第 5, 436， 128 号及び米国特許第 5， 401, 629号参照） 。
また、 前記アツセィを用いた試験化合物のスクリーニングは、 マニュアル作業 でも可能であるが、 ロボットを用いて自動で行うこともできる。 いわゆるハイス ル一プットスクリーニング （High Throughput Screening) (組織培養工学， Vol • 23, No. 13, p. 521-524；米国特許第 5, 670, 113号) によれば、 より迅速かつ簡便 に行うことができる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用い られ、 これら化合物は新規な化合物であつてもよいし、 公知の化合物であっても よい。
[ 2 ] 抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット 本発明の別の態様によれば、 A I Dタンパク質を産生する細胞を含む、 抗癌作 用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キットが提供される。 本発明 のスクリーニング用キットの例としては、 次のようなものが挙げられる。
1. スクリーニング用試薬
(1) A I Dタンパク質を産生する細胞
A I Dタンパク質をコードする遺伝子を発現させた細胞を、 12穴プレートに 5x105個/穴で継代し、 37 、 5%C02、 95%a i rで 2日間培養した もの。
(2) 洗浄用緩衝液
生理的な塩濃度および pHを有する緩衝液 （例えば Hanks' Balanced Salt Sol ution (ギブコ社製） ） 。 孔径 0· 45 mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保 存するか、 あるいは用時調製しても良い。
2. スクリーニング法
(1) A I Dタンパク質を産生する細胞を細胞培養用液体培地 （例えば Dulbecco ' s modified Eagle's MEM (ギブコ社製） にゥシ胎仔血清を 10%添加したもの
) に懸濁させ 24穴プレートに 1〜 5x105個/穴ずつ播種し、 37°C、 5%C 02、 95 %A i rで 24時間培養する。
(2) 1 CT3〜10— 1()Mの試験化合物溶液を各穴に 5 1ずつ加えた後、 37°C 、 5%C02、 95%A i rで 24〜72時間培養する。
( 3 ) 培地を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。
(4) 細胞内容物を抽出し、 A I Dタンパク質の抗原量あるいは活性、 もしくは mRNA量を測定し、 条件の違いによる測定結果を比較する。 本発明のキッ卜に含まれる細胞としては、 ヒトまたはその他の哺乳動物に由来 する A I Dを産生しうる全ての細胞を用いることができる。 なかでも、 マウス C H 12 F 3 - 2細胞、 D a u d i細胞、 I M— 9細胞、 R a j i細胞、 マウスミ エローマ細胞等が好ましく、 とりわけマウス CH12 F 3 _ 2細胞が好ましい。 本発明では、 A I D遺伝子を発現する天然に存在する細胞であっても、 A I D遺 伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞 （好ましくは、 A I Dの天然プロモ一夕 —を含有する遺伝子組換え細胞） であってもかまわない。 また別の態様では、 A I D遺伝子および他のタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組 換え細胞 （好ましくは、 A I Dの天然プロモーターを含有する遺伝子組換え細胞 ) が用いられる。
本発明で用いられる細胞に含有される他のタンパク質は、 レポータータンパク 質であることが望ましい。 レポータータンパク質としては、 本発明で用いられる 細胞において発現できる遺伝子であればいずれの遺伝子であってもよいが、 ホ夕 ルもしくはゥミシィタケなどに由来するルシフェラ一ゼ遺伝子、 またはクラゲ由 来の G F P遺伝子、 C AT (クロラムフエニコールァセチル転移酵素） 遺伝子、 アルカリホスファタ一ゼ遺伝子、 j3—ガラクトシダーゼ遺伝子、 成長ホルモン遺 伝子などが好ましいが、 本発明においては感度よく発現を検出できるため、 ルシ フェラーゼ遺伝子が、 また他の基質等の試薬を使うことなく、 直接的に発現が確 認できる G F P遺伝子が好ましく用いられる。 別の態様では、 本発明のスクリーニング用キットとして、 次のような試薬が含 まれる。
1 . スクリーニング用試薬
( 1 ) A I Dの天然プロモーターを含有し、 A I Dタンパク質をコードする遺 伝子および該 A I Dタンパク質以外の他のタンパク質をコードする遺伝子を発現 する細胞株
( 2 ) 洗浄用緩衝液
生理的な塩濃度および p Hを有する緩衝液 （例えば Hanks' Balanced Sal t Sol ut ion (ギブコ社製） ） 。 孔径 0. 4 5 mのフィル夕一で濾過滅菌し、 4 で保 存するか、 あるいは用時調製しても良い。
2 . スクリーニング法 '
( 1 ) A I Dの天然プロモータ一を含有し、 A I Dタンパク質をコードする遺伝 子および該 A I Dタンパク質以外の他のタンパク質をコードする遺伝子を発現す る細胞を細胞培養用液体培地 (例えば Dulbecco's modified Eagle's MEM (ギブ コ社製） にゥシ胎仔血清を 10%添加したもの） に懸濁させ 24穴プレートに 1 〜5xl 05個/穴ずつ播種し、 37T：、 5%C02、 95 % A i rで 24時間培養 する。
(2) 10— 3〜 10—1QMの試験化合物溶液を各穴に 5 ii 1ずつ加えた後、 37 °C 、 5%C〇2、 95%A i rで 24〜72時間培養する。
( 3 ) 必要であれば培地を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 (4) 必要であれば細胞内容物を抽出し、 該 A I Dタンパク質以外の他のタンパ ク質の抗原量あるいは活性、 もしくは mRNA量を測定し、 条件の違いによる測 定結果を比較する。
[3] 抗癌作用を有する化合物またはその塩、 及びそれを含有する抗癌剤 上記スクリーニング方法により得られる化合物は、 A I Dタンパク質が細胞の 癌化を起こす体細胞突然変異に関与していることが解明されたので、 抗癌剤とし て極めて有用である。
したがって、 このようにして得られる化合物は、 癌の予防および/または治療 剤として用いることができる。 ここで、 癌としては、 リンパ腫、 白血病、 前立腺 癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌などが挙げられる。 該化合物を癌の予防および/または治療剤として使用 する場合は、 常套手段に従って製剤化することができる。
[4] 体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング 方法 ·
体細胞突然変異は、 （1) A I Dタンパク質をコードする DNAを含有する組 換えべクタ一をレポーター遺伝子を導入した細胞に導入し、 （2) 前記細胞を適 当な条件で培養し、 （3) 前記細胞からゲノム DNAもしくは mRNAを調製し 、 PCR法を用いてレポ一ター遺伝子領域を増幅し、 （4) 前記 PCR増幅産物 を適当なベクターにサブクローニングした後に、 その塩基配列を決定することに より検出することができる。 この体細胞突然変異の検出方法を利用して、 体細胞 突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングを行うことが できる。
すなわち、 本発明の別の態様によれば、 体細胞突然変異の頻度を変化させる化 合物またはその塩をスクリーニングする方法であって、 （1) 配列番号： 2また は配列番号： 4で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有 する組換えベクターをレポーター遺伝子を導入した細胞に導入する工程、 （2) 試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件で前記細胞を培養する工程、 （ 3) 前記細胞からゲノム DNAもしくは mRNAを調製し、 PCR法を用いてレ ポーター遺伝子領域を増幅する工程、 (4) 前記 PC R増幅産物の塩基配列を決 定する工程、 及び （5) 該試験化合物の存在下おょぴ非存在下の各々の場合での 体細胞突然変異の頻度を比較する工程、 を含むスクリーニング方法が提供される また本努明では、 （ 1 ) 配列番号： 2または配列番号： 4で表される塩基配列 と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する糸且換えべクタ一を変異レポータ 一遺伝子を導入した細胞に導入する工程、 (2) 試験化合物の存在下および非存 在下の各々の条件で前記細胞を培養する工程の後、 （3) 該試験化合物の存在下 および非存在下の各々の場合での正常ィヒしたレポーター遺伝子の発現を比較する 工程、 を含むスクリーニング方法が提供される。
このスクリーニング方法で用いられるレポーター遺伝子としては、 本発明で用 いられる細胞において発現できる遺伝子であればいずれの遺伝子であってもよい 力 例えば G F P遺伝子、 3—ガラタトシダーゼ遺伝子、 ホタルもしくはゥミシ ィタケなどに由来するルシフェラーゼ遺伝子、 CAT遺伝子、 アルカリホスファ ターゼ遺伝子、 ヒト成長ホルモン遺伝子等が好ましい。 本発明では、 他の基質等 の試薬を使うことなく直接発現が確認できるという理由から、 GFP遺伝子を特 に用いる。 具体的には、 GFP遺伝子中の体細胞突然変異ホットスポットのチロ シンコドン T ACを終止コドン TAGに置換し、 未成熟な不活性ペプチドを産生 する変異 GF P遺伝子を用い、 体細胞突然変異により終止コドンが本来のァミノ 酸 （チロシン） に置換され、 活性型の GFPタンパク質が産生される。
前記レポーター遺伝子を導入する細胞としては、 ヒトまたはその他の哺乳動物 に由来する全ての細胞を用いることができる。 なかでも CHO細胞、 HEK29 3細胞、 マウスミエ口一マ細胞、 マウス N I H3T 3線維芽細胞等が好ましく、 とりわけマウス N I H3T3線維芽細胞が好ましい。
細胞に導入される A I D遺伝子および変異レポーター遺伝子は化学薬剤応答性 のプロモーターならびにトランスァクチべ一夕一と共に機能することが望ましい 。 化学薬剤としては、 例えばアンピシリン、 ネオマイシン、 カナマイシン、 テト ラサイクリン等があげられるが、 本発明においては目的タンパク質の発現量を任 意に制御できるという理由から、 テトラサイクリンが好ましく用いられる。
Te t r a c yc l i n e r e s p on s i ve t r an s a c t i v a t o r、 テトラサイクリンプロモーターで発現制御された A I D遺伝子および変 異レポーター遺伝子を導入した N I H3T3線維芽細胞を、 通常はテトラサイク リン含有の （または不含の） 培地中で A I Dタンパク質の発現を OFFにして培 養する。
A I D活性を評価したい場合、 例えば体細胞突然変異の頻度を変化させる化合 物またはその塩をスクリーニングする場合にはテトラサイクリン不含の （または 含有の） 培地に置換し、 A I Dタンパク質の発現を ONにする。 この条件下では 、 変異レポ一夕一遺伝子に導入された終止コドン TAGが A I Dタンパク質の有 する活性により本来のアミノ酸 （チロシン） をコードするコドン T ACに置換さ れ、 その結果として活性型の GFPタンパク質が産生される。 本発明では、 細胞 中での GFP遺伝子の発現は、 FACS C a 1 i b u rおよび C e 1 1 Qu e s tソフトウエア （Be c t on D i c k i n s on) を用いて解析する。 この際、 死細胞は解析より削除される。 すなわち、 生細胞のみを選択し、 その細 胞中で産生される G F P遺伝子産物が発する蛍光を測定することにより、 細胞中 での GFP遺伝子の発現が確認される。
上記のように GFP遺伝子の発現を解析した後、 公知の方法、 例えばモレキュ ラー ·クロ一ニング （Molecular Cloning) 3 r d (J. Sambrook and D. W. Russ ell, Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) に記載の方法を用いてゲノム DN Aもしくは mRN Aを細胞より調製する。 これらを錶型として GFP遺伝子配列 を含有する DNA断片を適当なプライマ一を用いて PC R法により増幅する。 P C R増幅産物を例えば p G E M_ T (プロメガ） のような適当なベクターにサブ クロ^"ニングし、 その塩基配列を解析することもできる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用い られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。
[ 5 ] 体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩、 及びそれを含有 する医薬
上記スクリーニング方法を用いて得られうる化合物またはその塩は、 体細胞突 然変異の頻度を変化させる作用を有する化合物である。 具体的には、 （1 ) 体細 胞突然変異の頻度を低下させる効果を有する化合物、 （2 ) 体細胞突然変異の頻 度を増大させる効果を有する化合物である。 該化合物としては、 ペプチド、 タン パク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら 化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
体細胞突然変異の頻度を増大させる効果を有する化合物は、 例えば、 変異導入 促進剤として有用である。 変異導入促進剤は、 A I Dタンパク質を発現する細胞 内でより効率的に標的タンパク質の変異体を作製するために用いられる。 A I D および変異導入促進剤を用いて作製された該変異標的タンパク質は、 該標的タン パク質の機能修飾、 該標的タンパク質の構造一活性相関の解明、 変異標的タンパ ク質を用いた医薬の開発等に用いることができる。
また、 体細胞突然変異の頻度を低下させる効果を有する化合物は、 例えば、 癌 、 アレルギー （例えば、 気管支喘息、 アトピー性皮膚炎、 結膜炎、 アレルギー性 鼻炎、 アレルギー性腸炎、 薬剤性アレルギ一、 食品アレルギー、 アレルギー性じ んましん、 糸球体腎炎など） 、 自己免疫疾患等の予防および治療のための医薬と して有用である。
[ 6 ] 本発明の化合物/医薬の製剤化、 投与方法、 投与量など
本発明のスクリーニング方法などによって得られる化合物を、 上記癌などの予 防及び zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従つて製剤化すること ができる。
上記化合物 （活性成分） が、 製薬学的に許容できる塩を形成できるときは、 そ のような塩を形成していてもよい。 そのような塩としては、 生理学的に許容され る酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が 用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩とし ては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩 、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸 、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸 、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
上記化合物又はその塩は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリ キシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で 非経口的に使用できる。 例えば、 上記活性化合物を生理学的に認められる公知の 担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造する ことができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が 得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 プドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80™、 HCO— 50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防及び Zまたは治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩 衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩 酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレンダリ コールなど） 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化 防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
本発明の活性成分の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによ り差異はあるが、.経口投与の場合、 一般的に例えば、 患者 （60 k gとして） に 対して、 一日につき約 0. lmg〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg 、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例 えば、 注射剤の形では通常例えば、 患者 （6 O kgとして） に対して、 一日につ き約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好まし くは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性である。 例えば、 ヒトやその他の 哺乳動物 (例えば、 ラット、 八ムスター、 モルモット、 ゥサギ、 ャギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
[7] 細胞内における変異タンパク質の作製方法および作製キット 本発明はまた、 細胞内における変異タンパク質の効率的な作製方法ならびに作 製キットを提供する。 すなわち、 本発明は （1) 配列番号： 2または配列番号： 4で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えべ クタ一を標的遺伝子を導入した細胞に導入する工程、 （2 ) 体細胞突然変異の頻 度を増大させる化合物またはその塩の存在下の条件、 または非存在下の条件で、 前記細胞を培養することにより、 標的遺伝子産物を発現させる工程、 を含む変異 タンパク質の作製方法、 ならびに （1 ) 配列番号： 2または配列番号： 4で表さ れる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組換えベクター、
( 2 ) 標的遺伝子を導入する細胞、 （3 ) 体細胞突然変異の頻度を増大させる化 合物またはその塩、 からなる作製キットを提供する。
標的遺伝子は、 本発明において用いられる細胞で発現することのできる遺伝子 であればいずれの遺伝子であってもよい。
標的遺伝子への変異の導入は、 上記のように体細胞突然変異の頻度を増大させ る化合物またはその塩の存在下で行うこともできるし、 あるいは前記化合物また はその塩の非存在下で、 A I D遺伝子 （または A I Dタンパク質） が本来有する 機能のみを利用して行うこともできる。
標的遺伝子への変異が導入されたかどうかは、 該標的遺伝子の塩基配列の解析 により、 または該遺伝子産物の有する機能 （例えば、 酵素活性） の解析により確 認することができる。 塩基配列を確認する場合、 細胞より公知の方法にてゲノム D N Aもしくは mR NAを回収し、 標的遺伝子を含む領域を P C R法にて増幅す る。 得られた増幅産物をサブクローニングし、 その塩基配列を解析する。
本発明の変異導入促進剤、 および上記の方法 Zキットを用いて作製された変異 標的タンパク質は、 該標的タンパク質の機能修飾、 該標的タンパク質の構造ー活 性相関の解明、 変異標的タンパク質を用いた医薬の開発等に用いることができる
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などの略号表示は、 IUPAC- ΙϋΒ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものである （WO 0 0 / 1 4 2 2 7号公報第 6 3頁第 1 1行 〜第 6 4頁第 2 7行、 E P 1 1 1 1 0 4 7 A 2号公報段落 [ 0 1 3 7 ]参照） ） 。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明で用いられるマウス由来 A I Dタンパク質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表される A I Dタンパク質をコードする cDNAの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 3 )
本発明で用いられるヒト由来 A I Dタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
配列番号： 3で表される A I Dタンパク質をコードする cDNAの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 2で用いたプライマー CMVPFの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
実施例 2で用いたプライマー Te t GF PRの塩基配列を示す。 実施例
以下に実施例および参考例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これら は本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 1
非リンパ系細胞における高頻度突然変異 （HM) を試験するために、 テトラサ イクリン応答性 （t e t— o f f) トランスァクチべ一ターと、 誘導性テトラサ イクリン （t e t) プロモーターにより転写される変異 GFP配列をもつ p Iプ ラスミド （ジャーナル ·ォブ 'ィムノロジー、 第 166巻、 5051— 5057 頁 （2001) ) をトランスフエクトした N I H3T3細胞株を作製した。 トラ ンスフエクシヨンは、 リポフエクタミン試薬 （G i b c oBRL) を用い、 添付 のマニュアルにしたがって行った。 変異 G F Pは未成熟なペプチドを産生するよ うに、 遺伝子中に存在する RGYW [Rはプリン （A/G) ； Yはピリミジン （ C/T) ； Wは A/T] SHMホットスポットに終止コドン (TAG) を有し、 この変異 GFPを有する p Iプラスミドはマウスのプレ B細胞株および CH 12 F 3— 2 Bリンパ腫細胞株において SHMをアツセィするのに有用であることが 示されている （J. Bac l et al. ジャーナル ·ィムノロジー （J. Immunology) 1 66, 5051-5057 (2001)) 。 A I Dはレトロウイルス感染により、 N IH3T3— P I細胞 19クローンに導入され、 サザンプロット解析により、 それぞれが 1か ら 4コピーの p Iを含有することが明らかとなった。 有意な数の GFP+細胞 （ ：!〜 1. 8 %) がテトラサイクリン非存在下で 10日間培養した A I D感染 N I H3T3— p I細胞で検出され、 一方 mo c k感染またはシチジンデァミナ一ゼ モチーフのほとんどを欠失する A I Dの機能欠失型変異体 （AI Dm_ l) の感 染では GFP+細胞は全く生じなかった。 これらの結果を図 2に示す。 すなわち 、 図 2は FACSによる GFP発現の解析結果を示す。 また、 p iプラスミドを 1コピ一もつ N I H3T3— p I # l 9クローンに由来するソートした G F P + 細胞において得られた 27個の GF P配列の全てにおいて未成熟な終止コドンは 全てチロシンコドン （TAC) に復帰していること、 すなわち G→C変異を起こ していることを確認した。
GFP+細胞の出現頻度は A I Dウィルスの感染量に依存して増加し、 A I D m—1ウィルスでは増加しなかった。 また GFP+細胞の出現頻度は、 培地中の テトラサイクリン濃度の減少に伴い増加した。 GFP+細胞の出現頻度に並行し て、 GFP基質における突然変異は A I Dウィルス量ならびに転写誘導レベル依 存的に増加した。 以上の結果を図 3および図 4に示す。 図 5に示すように、 GF P+細胞は A I D発現 3日後に現れ始め、 10日で最大レベル （0. 92±0. 1 4%) に達した。 10から 20日で GFP+細胞の頻度は徐々に減少したが、 2 0日での GFP配列中の変異率 （6. 5x1 CT3変異 Zb p) は 10日での変異 率 （4. 5x10— 3変異/ bp) より僅かに高く、 追加の変異が GFP基質に蓄 積しつづけたことを示している。 実施例 2 全体的な変異頻度を評価するために、 以下のような実験を行った。 すなわち、 テトラサイクリン非存在下で 10日間培養した A I D発現ウィルスを感染させた N I H3T3-p I細胞の全 DN Aを公知の方法を用いて調製した。 この全 DN Aを鎵型として、 プライマー CMVPF (配列番号： 5) およぴプライマー Te t GFPR (配列番号： 6) を用いて、 GF P遺伝子を含む断片を PC R法にて 増幅させた。 増幅は、 94°C一 30秒、 57°C— 30秒、 72°C— 1分を 30サ ィクルの条件で行った。 PCR増幅後、 その産物に Aを付加し、 pGEM—Tベ クタ一 （プロメガ） にサブクローニングした。 PCR産物のうちランダムに拾つ た 24個のクローンについて、 その GF P配列を決定した。 コントロールとして 、 テトラサイクリン存在下の実験、 A I Dm— 1発現ウィルスを感染させた N I H3T3-p I細胞を用いた実験を行った。 A I D発現ウィルス感染細胞株では 少数の欠失と重複を含む、 かなりの数の変異 （4. 5X10— 3変異/ b p) が G FP配列 24個中 22個で観察された。 この結果を表 1に示す。 表 1 p Iを 1コピー含む N I H3T3— p Iクローン # 19の GFP基質にお ける A ID誘導性突然変異 レトロウイノレス Te t %GFP+細胞 a 基質中の変異した塩基
A I D + 0.00±0.00 3/21, 643 ( 2/23) b 一 0·92±0.14 102/22, 584 (22/24) 0
A I Dm- + 0.00 + 0.00 0/14, 115 ( 0/15) 一 0.03±0.02 0/23,525 ( 0/25)
( ) 内の数値は解析した全クローン中の変異クローンを示す。
a ： 3回の実験で得られた結果の平均値土標準誤差
： 3個所の変異全てが点突然変異
c ： 97個所の点突然変異、 5個所の欠失 （1から 48 b p) および 2個所の重 (l bpと 22 bp)
1日あたり 1回の分裂と考えると、 おおよその変異率は 4. 5x10_4変異/ bp/世代であり、 I gの SHMにおける変異率 （1x10— 4〜lxl 0-3変異/ bp /世代） と一致する。 対照的に、 テトラサイクリン存在下で培養した A I D 感染細胞株の 23個の GFP配列では 3個の変異が見出されただけであった。 培 養時のテトラサイクリンの存在にかかわらず、 A I Dm— 1感染細胞では変異は 検出されなかった。 転写される遺伝子全てがそのような高頻度の変異を蓄積する とは考えられない。 すなわち、 あるびまん性大細胞型 Bリンパ腫において V遺伝 子の場合と比較して 2桁低レベルの変異を蓄積する c—my c遺伝子は A I D誘 導性変異 N I H3T 3細胞を蓄積しなかった。
I gにおける SHMの特性として、 時として欠失あるいは重複を伴う多くの点 突然変異、 トランスバージョンよりもトランジシヨン、 RGYWZWRCYモチ ーフへのターゲテイングがあげられる。 GFP配列 53クローンの 247個の変 異についてその分布を解析し、 その結果を図 6および図 7に示した。 図 6に示し たように、 点突然変異は統計的に RGYW/WRCYモチーフ （白抜き文字で示 した） に偏っており、 また図 7に示したように、 トランジシヨン変異はトランス バージョンよりも優位であった。 これらの結果を表 2に示す。 表 2 RGYWZWRCYおよび二次構造に対する突然変異の偏り
RGYW/WRCY 二 次 構 造
+ + 変異した配列 186 61 377 117 全配列 247 694 1094 788
P値 (χ2検定) <0.001 <0.001 二次構造は Zuckerにより開発されたコンピュータプログラム MFOLDにより予 測されたものである。 予測条件；イオン条件 [Na] =150mM， [Mg + +] =0. 5mM；フォールディング温度 37°C；対合塩基間の最大距離 2 5。 二本鎖両方を解析し、 その結果を合わせた。 予測された二次構造を図 2— A において配列の上下の線で示した。 以前、 CSRジャンクションはコンピュータで予測される一本鎖 DNAのステ ム一ループ構造周辺に選択的に分布することを示した。 DN Aのそのような二次 構造もまた、 SHMの標的である V遺伝子の相補性決定領域 （CDR) 周辺で認 められる。 図 6に示したように、 A I D誘導性変異はまた二次構造に偏っていた 。 興味深いことに、 A I D誘導性置換は GZC塩基対に偏っており、 247個の 変異のうち 3個だけが AZT塩基対で生じていた。 ヒトおよびマウスの生体内で は、 B細胞の V遺伝子での SHMにおける変異した塩基について、 GZC塩基対 へのそのような強い偏りは示されなかったが、 類似した偏りは A I Dをトランス フエクトしたハイブリドーマ、 マウスのプレ B細胞系、 ヒトのバーキットリンパ 腫株、 ミスマッチ修復欠損マウスの B細胞おょぴ XRCC 2/3欠損ニヮトリの B細胞リンパ腫株の V遺伝子における SHMで報告された。 ヌクレオチドの偏り の違いは、 比較的誤りがちな DNAポリメラーゼまたは特異的な DNA修復タン パク質の量の違いによるものと考えられる。 点突然変異に加え、 18個の欠失と 2個の重複については I gにおける SHMの特性と矛盾することなく観察された 以上の結果から、 1^1113丁3細胞にぉける 10誘導性11]^は、 I gにおけ る SHMと共通の性質、 すなわち （a) A I Dが必要である、 （b) 標的遺伝子 の転写に依存する、 （c) 特異的なモチーフに偏った変異である、 （d) 時折、 欠失および重複をもつ、 （e) 変異率が高い、 という性質を有する。 これらの性 質はまた、 LP Sで刺激された B細胞の S μ領域における HMとも共通する。 こ れらの結果は、 N I Η3 Τ 3細胞における ΗΜが Β細胞の Vおよび S 配列にお ける ΗΜと同一の分子機搆を用いていることを示唆し、 A I Dが非リンパ細胞の 活発に転写される遺伝子における HMに必要な唯一の B細胞特異的な因子である ことを示している。 同一細胞系で C SRが A I Dにより誘導されるという以前の 観察と合わせると、 転写される遺伝子において、 CSRおよび HMを完了するた めに必要な、 A I D以外の全てのトランスに作用する因子が非リンパ細胞で定量 的に宪現することが予想される。
A I Dの欠損は、 C SRを誘導したときに脾臓 B細胞の I g CH座において、 DN A二重鎖切断修復に関与する T —H2AXと NBS 1の蓄積が認められるが 、 A I Dの欠損により、 その蓄積は完全に消失するので、 10は〇31 の切断 段階に関与していると考えられる。 CSRが他の CH対立遺伝子で起きる際に、 HMが胚型 S 領域で誘導されるので、 A I Dは CSRと HMにおいて、 特に D N A切断段階において同様の役割を果たしていると思われる。
すなわち、 細胞、 特に非免疫細胞において、 A I Dタンパク質または A I Dタ ンパク質をコードする遺伝子、 あるいはこれに類似のタンパク質またはこれをコ ードする遺伝子が機能することにより、 （1) DN A鎖に切断が入る。 （2) こ れを修復する際に誤りがちな修復がなされ、 DNA上に変異が蓄積する。 （3) 変異の蓄積が癌化への引き金となることが考えられる。 これらのタンパク質また はその遺伝子の機能を制御することは、 癌の予防および Zまたは治療、 あるいは その診断を可能にするものと考えられる。 産業上の利用可能性
以上説明したように、 本発明では体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物の スクリーニング方法およびスクリーニング用キットが提供される。 これらのスク リーユング方法およびスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合 物は抗癌剤として用いることができる。 また、 本発明で用いられる体細胞突然変 異の検出方法を利用することにより、 細胞内で効率的に変異が導入された変異タ ンパク質を作製することができる。

Claims

請求の範囲
1. (1) 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する A I D (Activation-induced Cytidine Deaminase) タンパク質を産生する細胞 を試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、 および （ 2) ( i) 該試験化合物の存在下で培養した細胞が産生する該 A I Dタンパク質 のレベルと該試験化合物の非存在下で培養した細胞が産生する該 A I Dタンパク 質のレベルを比較する工程、 もしくは （i i) 該試験化合物の存在下で培養した 細胞中で転写された該 A I Dタンパク質をコードする mRN Aのレベルと該試験 化合物の非存在下で培養した細胞中で転写された該 A I Dタンパク質をコードす る mRNAのレベルとを比較する工程とを含む、 抗癌作用を有する化合物または その塩をスクリーニングする方法。
2. ( 1 ) 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する A I Dタンパク質および該 A I Dタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細 胞であって、 該細胞における該他のタンパク質をコードする遺伝子の m R N Aへ の転写が、 該 A I Dタンパク質をコードする遺伝子の mRNAへの転写のシグナ ルの程度に依存して起こるものであることを特徴とする細胞を、 試験化合物の存 在下および非存在下の各々の条件下で培養する工程、 および （2) 該試験化合物 の存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルと該試験化合物の 非存在下で培養した細胞が産生する該他のタンパク質のレベルを比較する工程と を含む、 抗癌作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングする方法。
3. 該他のタンパク質をコードする遺伝子の mRNAへの転写が、 該 A I D遺伝 子の天然プロモーターの活性に制御されて起こるものであることを特徵とする請 求項 2記載の方法。
4. 該細胞が、 該タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え 細胞であることを特徴とする請求項 1、 請求項 2または請求項 3記載の方法。
5. 該細胞が、 該タンパク質をコードする遺伝子および該他のタンパク質をコー ドする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求項 2または請求項 3記載の方法。
6. 該他のタンパク質が、 レポータータンパク質であることを特徴とする請求項 5記載の方法。
7. 該他のタンパク質のレベルの比較が、 該レポータータンパク質が発するシグ ナルのレベルの比較であることを特徴とする請求項 6記載の方法。
8. 該レポ一夕一タンパク質が、 ルシフェラーゼもしくはグリーン ·フルォレセ ント 'プロテイン （GFP) であることを特徴とする請求項 6または請求項 7記 載の方法。
9. 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する A ID タンパク質を産生する細胞を含む、 抗癌作用を有する化合物またはその塩のスク リーニング用キット。
10. 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する A I Dタンパク質および該 A I Dタンパク質以外の他のタンパク質を産生する細胞を 含む、 抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
11. 請求項 1または請求項 2記載のスクリーニング方法、 あるいは請求項 9又 は請求項 10記載のスクリ一エング用キットを用いて得られうる抗癌作用を有す る化合物またはその塩。
12. 請求項 11記載の化合物またはその塩を含んでなる抗癌剤。
13. 癌がリンパ腫、 白血病、 前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 12記載の抗癌剤
14. 体細胞突然変異 （somatic hypennutat ion) の頻度を変化させる化合物ま たはその塩をスクリーニングする方法であって、 （ 1 ) 配列番号： 2または配列 番号： 4で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有する組 換えべクタ一を、 該 A I Dタンパク質の基質遺伝子を導入した細胞に導入するェ 程、 （2) 試験化合物の存在下および非存在下の各々の条件で前記細胞を培養す る工程、 （3) 前記細胞において該試験化合物の存在下および非存在下の各々の 場合での体細胞突然変異の頻度を比較する工程、 を含むスクリーニング方法。
15. 基質遺伝子が変異レポーター遺伝子であって、 AIDタンパク質により正 常レポ一夕一遺伝子に変換される遺伝子である請求項 14記載の方法。
16. 変異レポ一ター遺伝子が正常レポーター遺伝子中のチロシンコドン TAC を終止コドン TAGに変換した遺伝子である請求項 15記載の方法。
17. 終止コドン TAGがレポーター遺伝子中の体細胞突然変異ホットスポット に存在する請求項 15記載の方法。
18. レポーター遺伝子が GFP遺伝子である、 請求項 15記載の方法。
19. 該 A I Dタンパク質の基質遺伝子を導入した細胞が非免疫細胞である請求 項 14記載の方法。
20. 請求項 14記載のスクリーニング方法を用いることにより得られうる体細 胞突然変異の頻度を変化させる化合物またはその塩。
21. 体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物が体細胞突然変異の頻度を増大 させる化合物である請求項 20記載の化合物またはその塩。
22. 請求項 21記載の化合物またはその塩を含有してなる変異導入促進剤。
23. 体細胞突然変異の頻度を変化させる化合物が体細胞突然変異の頻度を減少 させる化合物である請求項 20記載の化合物またはその塩。
24. 請求項 23記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
25. 癌の予防および/または治療剤である請求項 24記載の医薬。
26. 癌がリンパ腫、 白血病、 前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 25記載の医薬。
27. 哺乳動物に対して、 請求項 23記載の化合物またはその塩の有効量を投与 することを特徴とする癌の予防および/または治療方法。
28. 癌の予防および/または治療剤を製造するための請求項 23記載の化合物 またはその塩の使用。
29. 細胞内における変異タンパク質の作製方法であって、 （1) 配列番号： 2 または配列番号： 4で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を 含有する組換えべクタ一を標的遺伝子を導入した細胞に導入する工程、 （2) 請 求項 21記載の化合物またはその塩の存在下の条件、 または非存在下の条件で、 前記細胞を培養することにより、 標的遺伝子産物を発現させる工程、 を含む変異 タンパク質の作製方法。
30. 細胞内における変異タンパク質の作製キッ卜であって、 （1) 配列番号： 2または配列番号： 4で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列 を含有する組換えベクター、 （2) 標的遺伝子を導入する細胞、 （3) 請求項 2 1記載の化合物またはその塩、 からなる作製キット。
PCT/JP2003/008470 2002-07-05 2003-07-03 抗癌剤のスクリーニング方法 WO2004005538A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003246255A AU2003246255A1 (en) 2002-07-05 2003-07-03 Method of screening anticancer agent

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002196764A JP2004033137A (ja) 2002-07-05 2002-07-05 抗癌剤のスクリーニング方法
JP2002-196764 2002-07-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004005538A1 true WO2004005538A1 (ja) 2004-01-15

Family

ID=30112374

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/008470 WO2004005538A1 (ja) 2002-07-05 2003-07-03 抗癌剤のスクリーニング方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP2004033137A (ja)
AU (1) AU2003246255A1 (ja)
WO (1) WO2004005538A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008103474A1 (en) * 2007-02-20 2008-08-28 Anaptysbio, Inc. Methods of generating libraries and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000058480A1 (fr) * 1999-03-29 2000-10-05 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. Nouvelle cytidine desaminase
WO2001032614A2 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 Nalan Utku Novel genes tzap7/a, tzap7/b and tzap7 involved in t cell activation and uses thereof
WO2002069900A2 (en) * 2001-03-01 2002-09-12 Conforma Therapeutics Corp. Methods for treating genetically-defined proliferative disorders with hsp90 inhibitors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000058480A1 (fr) * 1999-03-29 2000-10-05 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. Nouvelle cytidine desaminase
WO2001032614A2 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 Nalan Utku Novel genes tzap7/a, tzap7/b and tzap7 involved in t cell activation and uses thereof
WO2002069900A2 (en) * 2001-03-01 2002-09-12 Conforma Therapeutics Corp. Methods for treating genetically-defined proliferative disorders with hsp90 inhibitors

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTIN A. ET AL: "Activation-induced cytidine deaminase truns on somatic hypermutation in hybridomas", NATURE, vol. 415, February 2002 (2002-02-01), pages 802 - 806, XP010107962 *
MARTIN A. ET AL: "Somatic hypermutation of the AID transgene in B and non-B cells", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, no. 19, September 2002 (2002-09-01), pages 12304 - 12308, XP002964738 *
MURAMATSU M. ET AL: "Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells", J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 26, 1999, pages 18470 - 18476, XP002964736 *
MUTO T. ET AL: "Isolation, tissue distribution and chromo somal localization of the human activation-induced cytidine deaminase (AID) gene", GENOMICS, vol. 68, 2000, pages 85 - 88, XP004437864 *
OKAZAKI I. ET AL: "Constitutive expression of AID leads to tumorigenesis", J. EXP. MED., vol. 197, no. 9, May 2003 (2003-05-01), pages 1173 - 1181, XP002964734 *
REVY P. ET AL: "Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the hyper-IgM syndrome (HIGM2)", CELL, vol. 102, 2000, pages 565 - 575, XP002964737 *
STRAUSBERG R.L. ET AL: "Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, no. 26, December 2002 (2002-12-01), pages 16899 - 16903, XP002245220 *
YOSHIKAWA K. ET AL: "AID enzyme-induced hypermutation in an actively transcribed gene in fibroblasts", SCIENCE, vol. 296, June 2002 (2002-06-01), pages 2033 - 2036, XP002964735 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003246255A1 (en) 2004-01-23
JP2004033137A (ja) 2004-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002112772A (ja) 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
JP4829780B2 (ja) 呼吸器疾患の予防・治療剤
KR20020059726A (ko) 신규 단백질 및 그의 ｄｎａ
WO2004005538A1 (ja) 抗癌剤のスクリーニング方法
WO2001046415A1 (fr) Polypeptides de type tachykinine et utilisation associee
JP2003245076A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
WO2003091434A1 (fr) Nouvelle proteine, et adn de cette proteine
WO2001048203A1 (fr) Nouvelle proteine et adn associe
JP4320151B2 (ja) 新規ポリペプチドおよびその用途
JP2003289881A (ja) アルツハイマー病関連遺伝子のスクリーニング方法
JP4300008B2 (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JPH1143499A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2001299363A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
EP1600165A1 (en) Medicinal use of mip-3alpha inhibitor and method of screening brain/nerve cell protective agent
JP2000139480A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2001029090A (ja) 新規ポリペプチド
JP2004026692A (ja) Ｍｅｐｅの新規用途
JP2005015460A (ja) Ｓｇｌｔホモログ用途
JP2001299364A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2001228146A (ja) 疾患関連遺伝子の用途
JP2005151826A (ja) Ｃ１ｑｔｎｆ５の用途
JP2003219880A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JPH11266870A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004173677A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004075675A (ja) 骨・関節疾患の予防・治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase