JP2003289881A - アルツハイマー病関連遺伝子のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アミロイドβタンパクの産生を制御する遺伝
子のスクリーニング方法の提供。 【解決手段】 アミロイドβタンパクの産生を制御する
遺伝子、該遺伝子にコードされるタンパク質またはその
塩などの提供。該遺伝子を用いたスクリーニング方法の
提供。前記タンパク質に対する抗体、該抗体を含有して
なる診断剤等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルツハイマー病
の発症・進展に深くかわっているアミロイドβタンパク
（Ａβ）の産生を制御する遺伝子を探索する方法に関す
る。すなわち、本発明は、Ａβ前駆体タンパク質（βＡ
ＰＰ）フラグメントからのＡβの産生が促進されること
により薬剤耐性遺伝子の発現が亢進するよう設計された
細胞株、および、その細胞株を作製するために必要な組
換えＤＮＡ構築物、さらに、該細胞株にヒトｃＤＮＡラ
イブラリーをトランスフェクトし、薬剤耐性能を獲得し
Ａβの産生が亢進している細胞のｃＤＮＡを同定するこ
とによるＡβの産生を制御する遺伝子のスクリーニング
方法に関する。また、本発明は、このスクリーニング方
法により見出されたＡβの産生を制御する遺伝子、該遺
伝子を含有する組換えベクター、これによる形質変換
体、該形質変換体による組換えタンパク質製造法、該製
造法による組換えタンパク質、該組換えタンパク質に対
する抗体、これらの形質変換体あるいは組換えタンパク
質を用いたＡβ産生阻害剤のスクリーニング方法、その
スクリーニング法より得られたＡβ産生阻害剤に関す
る。本発明はさらに、これらの遺伝子、その遺伝子と特
異的にハイブリダイズするヌクレオチド、それらの遺伝
子に由来する組換えタンパク質、その抗体あるいはＡβ
産生阻害剤を含有する医薬組成物、疾病の診断方法、治
療方法および予防方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病患者脳の病理学的特徴
として、神経細胞の脱落に加えて、老人斑、神経原線維
変化の蓄積が知られている。これらのうち、アルツハイ
マー病における最初期の病理変化は老人斑の形成であ
り、その主要構成成分がＡβであることから、Ａβの産
生あるいは分解の異常がアルツハイマー病の発症・進展
に深くかわっていると考えられている。Ａβは前駆体タ
ンパク質（βＡＰＰ）からβ−セクレターゼとγ−セク
レターゼにより切断され産生される。β−セクレターゼ
については、既に新規アスパラギン酸プロテアーゼであ
ることが同定された（Neuron 27, 419-422, 2000）。一
方、γ−セクレターゼについては、家族性アルツハイマ
ー病（ＦＡＤ）原因遺伝子、プレセニリンあるいはプレ
セニリンを含む複合体がその活性発現に関与しているこ
とが明らかにされている（Neuron 27,419-422, 200
0）。また、最近、プレセニリンと複合体を形成し、β
ＡＰＰのプロセシングに関与する新規膜貫通型糖蛋白質
としてニカストリン（Nicastrin）が報告された（Natur
e 407, 48-54, 2000）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、γ−セ
クレターゼについては、その実体の詳細は不明である
（Neuron 27, 419-422, 2000）。γ−セクレターゼ活性
は抗プレセニリン抗体によって巨大な分子量のフラクシ
ョンに回収され、その活性の制御には、プレセニリンＮ
端およびＣ端フラグメント複合体の安定化因子など、多
くの未同定の因子が関与し得ると考えられる。さらに、
βＡＰＰのプロセシングは、粗面小胞体、Golgi体など
から細胞膜上へ輸送される分泌経路、細胞膜上、さら
に、細胞内に再取り込みされた後のエンドソーム内で引
き起こされることから（Trends in CellBiology 8, 447
-453, 1998）、βＡＰＰの細胞内輸送系に関与する様々
な因子もＡβの産生に影響し得ると考えられる。そこ
で、これらの因子を遺伝子として同定することは、Ａβ
の産生を抑制する薬剤の開発やアルツハイマー病の診断
薬など、新しい医薬への応用を図ることができることか
ら、極めて重要なことと考えられる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、Ａβの産生
を制御する遺伝子を探索するため、まず、βＡＰＰフラ
グメントからＡβの産生が促進されることにより薬剤耐
性遺伝子の発現が亢進するよう設計された細胞株を考案
した。詳しくは、第一に、βＡＰＰのγ−セクレターゼ
切断部位を含むβＡＰＰフラグメントと、NotchのＣ端
側転写因子領域との融合タンパク質（CAPP-NICD）をコ
ードする融合遺伝子を作製し、第二に、Notchの転写活
性によりピューロマイシン耐性遺伝子の転写が開始され
るように、ＨＥＳ−１プロモーターの下流にピューロマ
イシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を結合
させた選択マーカー遺伝子を作製し、これら第一および
第二の組換え遺伝子を共発現させた細胞株を作製した。
即ち、この細胞株においては、細胞内でCAPP-NICDがγ
−セクレターゼによって切断を受け、Notch転写因子が
細胞膜から遊離すると細胞がピューロマイシン耐性にな
るよう設計されている。実際、発明者は、この細胞でCA
PP-NICDから内在性γ−セクレターゼによりＡβが産生
されること、それに依存してピューロマイシン耐性遺伝
子が発現していることを確認した。従って、この細胞を
用いて、γ−セクレターゼあるいはγ−セクレターゼ活
性を促進する調節因子のｃＤＮＡを同定することは、次
の４ステップで行うことができる。まず、この細胞株に
ヒトｃＤＮＡライブラリーをトランスフェクトし、ピュ
ーロマイシン耐性度が増したＤＮＡを有する細胞を選択
する。次に、それらの細胞が産生するＡβを測定し、Ａ
β産生を高めるｃＤＮＡを有する細胞を選択する。さら
に、そのｃＤＮＡをＰＣＲ法により同定する。最後に、
得られたｃＤＮＡを、ＡＰＰを発現している他の細胞に
トランスフェクトし、実際に、得られたｃＤＮＡ がＡ
βの産生を高めるかどうかを調べる。これらの手段によ
り、本発明者はこれまでにγ−セクレターゼあるいはγ
−セクレターゼ活性を促進する調節因子として少なくと
も３種類の遺伝子を同定した。本発明者らは、これらの
知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完
成するに至った。

【０００５】即ち、本発明は、〔１〕アミロイドβタン
パク質（Ａβ）の前駆体タンパク質（βＡＰＰ）フラグ
メントからのＡβの産生が促進されることにより選択マ
ーカー遺伝子の発現が亢進するよう設計された細胞株
に、ＤＮＡライブラリーを導入し、Ａβの産生が亢進し
ている細胞の導入ＤＮＡクローンを同定することを特徴
とするＡβの産生を制御するＤＮＡのスクリーニング方
法、〔２〕Ａβの産生を制御するＤＮＡがヒトｃＤＮＡ
である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、〔３〕Ａ
βの産生を制御するＤＮＡがヒト染色体ＤＮＡである上
記〔１〕記載のスクリーニング方法、〔４〕該細胞株
が、（１）βＡＰＰのγ−セクレターゼ切断部位を含む
βＡＰＰフラグメントと転写促進因子との融合タンパク
質をコードするＤＮＡを含むベクターと（２）転写促進
因子の転写活性により選択マーカー遺伝子の転写が惹起
されるようにプロモーターの下流に選択マーカー遺伝子
を結合させたＤＮＡを含むベクターとで形質転換された
形質転換体である上記〔１〕記載のスクリーニング方
法、〔５〕細胞株が、（１）βＡＰＰのγ−セクレター
ゼ切断部位を含むβＡＰＰフラグメントとNotchのＣ端
側転写因子領域との融合タンパク質（CAPP-NICD）をコ
ードするＤＮＡを含むベクターと（２）Notchの転写活
性により薬剤耐性遺伝子の転写が惹起されるようにＨＥ
Ｓ−１プロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子を結合させ
たＤＮＡを含むベクターとで形質転換された形質転換体
である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、〔６〕細
胞株が融合タンパク質と選択マーカーを共発現する上記
〔４または５〕記載のスクリーニング方法、〔７〕上記
〔１〕記載のスクリーニング方法により得られうるＡβ
の産生を制御するＤＮＡとハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするＤＮＡを含有するＤＮＡ、
〔８〕Ａβの産生を制御するＤＮＡがヒトｃＤＮＡであ
る上記〔７〕記載のＤＮＡ、

〔９〕Ａβの産生を制御す
るＤＮＡがヒト染色体ＤＮＡである上記〔７〕記載のＤ
ＮＡ、〔１０〕アルツハイマー病に関連する上記〔７〕
記載のＤＮＡ、〔１１〕Ａβの産生を亢進するＤＮＡで
ある上記〔７〕記載のＤＮＡ、〔１２〕Ａβの産生を亢
進するＤＮＡが、配列番号：４で表わされる塩基配列を
含有するヒトｃＤＮＡ（Genbank accession No. AAH062
23）をコードするＤＮＡである上記〔１１〕記載のＤＮ
Ａ、〔１３〕Ａβの産生を亢進するＤＮＡが、配列番
号：５で表わされる塩基配列を含有するヒトHerp（Genb
ank accession No. AB034989）をコードするＤＮＡであ
る上記〔１１〕記載のＤＮＡ、〔１４〕Ａβの産生を促
進するＤＮＡが、配列番号：６で表わされる塩基配列を
含有するヒト５−リポキシゲナーゼ（Genbank accessio
n no. XM 005818）の部分配列をコードするＤＮＡであ
る上記〔１１〕記載のＤＮＡ、〔１５〕Ａβの産生を促
進するＤＮＡが、配列番号：２１で表わされる塩基配列
を含有するヒト５−リポキシゲナーゼの全長配列をコー
ドするＤＮＡである上記〔１１〕記載のＤＮＡ、〔１
６〕上記〔７〕記載のＤＮＡを含有する組換えベクタ
ー、〔１７〕上記〔１６〕記載の組換えベクターで形質
転換された形質転換体、〔１８〕上記〔１７〕記載の形
質転換体を培養し、上記〔７〕記載のＤＮＡにコードさ
れるペプチドまたはタンパク質を生成せしめることを特
徴とする上記〔７〕記載のＤＮＡにコードされるペプチ
ドもしくはタンパク質またはその塩の製造法、〔１９〕
上記〔７〕記載のＤＮＡまたはその一部を含有してなる
診断剤、〔２０〕アルツハイマー病の診断剤である上記
〔１９〕記載の診断剤、〔２１〕上記〔７〕記載のＤＮ
Ａを用いることを特徴とするアルツハイマー病の診断方
法、〔２２〕上記〔７〕記載のＤＮＡを用いることを特
徴とする上記〔７〕記載のＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ
ｓ）を検出する方法、〔２３〕アルツハイマー病患者の
上記〔７〕記載のＤＮＡに相当するＤＮＡの塩基配列を
解読し、上記〔７〕記載のＤＮＡの塩基配列と比較する
ことを特徴とする上記〔２２〕記載の検出方法、〔２
４〕上記〔７〕記載のＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ
ｓ）、〔２５〕上記〔２４〕記載の一塩基多型（ＳＮＰ
ｓ）を含有してなる診断剤、〔２６〕さらに上記〔７〕
記載のＤＮＡまたはその一部を含有する上記〔２５〕記
載の診断剤、〔２７〕アルツハイマー病の診断剤である
上記〔２５〕または〔２６〕記載の診断剤、〔２８〕上
記〔２４〕記載の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を用いること
を特徴とするアルツハイマー病の診断方法、〔２９〕上
記〔７〕記載のＤＮＡまたはその一部を用いる上記〔２
８〕記載の診断方法、〔３０〕上記〔７〕記載のＤＮＡ
にコードされるペプチドもしくはタンパク質またはその
塩、〔３１〕アルツハイマー病に関連する上記〔３０〕
記載のペプチドもしくはタンパク質またはその塩、〔３
２〕Ａβの産生を亢進する上記〔３０〕記載のペプチド
もしくはタンパク質またはその塩、〔３３〕配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一
のアミノ酸配列を含有する、Ａβの産生を亢進するタン
パク質またはその塩、〔３４〕配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する、Ａβの産生を亢進するタンパク質または
その塩、〔３５〕配列番号：３で表わされるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
る、Ａβの産生を亢進するタンパク質またはその塩、
〔３６〕配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する、Ａβ
の産生を亢進するタンパク質またはその塩、〔３７〕上
記〔２９〕〜〔３６〕のいずれかに記載のペプチド、タ
ンパク質またはその塩に対する抗体、〔３８〕上記〔２
９〕〜〔３６〕のいずれかに記載のペプチド、タンパク
質またはその塩の活性を不活性化する中和抗体である上
記〔３７〕記載の抗体、〔３９〕上記〔３７〕記載の抗
体を含有してなる診断剤、〔４０〕アルツハイマー病の
診断剤である上記〔３９〕記載の診断剤、〔４１〕上記
〔３７〕記載の抗体を用いることを特徴とする上記〔２
９〕〜〔３６〕のいずれかに記載のペプチド、タンパク
質またはその塩の定量法、〔４２〕上記〔４１〕記載の
定量法を用いるアルツハイマー病の診断方法、〔４３〕
上記〔３２〕記載のＡβの産生を亢進するペプチドもし
くはタンパク質またはその塩に対する抗体を含有してな
る医薬、〔４４〕アルツハイマー病の予防・治療剤であ
る上記〔４３〕記載の医薬、〔４５〕哺乳動物に対し
て、上記〔３２〕記載のＡβの産生を亢進するペプチド
もしくはタンパク質またはその塩に対する抗体の有効量
を投与することを特徴とするアルツハイマー病の予防・
治療方法、〔４６〕上記〔７〕記載のＤＮＡと相補的な
塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスＤ
ＮＡ、〔４７〕上記〔４６〕記載のアンチセンスＤＮＡ
を含有してなる診断剤、〔４８〕アルツハイマー病の診
断剤である上記〔４７〕記載の診断剤、〔４９〕上記
〔１１〕記載のＡβの産生を亢進するＤＮＡと相補的な
塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスＤ
ＮＡを含有してなる医薬、〔５０〕アルツハイマー病の
予防・治療剤である上記〔４９〕記載の医薬、〔５１〕
哺乳動物に対して、上記〔４９〕記載のアンチセンスＤ
ＮＡの有効量を投与することを特徴とするアルツハイマ
ー病の予防・治療方法、〔５２〕上記〔７〕記載のＤＮ
Ａを用いることを特徴とするＡβ産生阻害薬のスクリー
ニング方法、〔５３〕上記〔３０〕記載のペプチドもし
くはタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする
Ａβ産生阻害薬のスクリーニング方法、〔５４〕上記
〔３７〕記載の抗体を用いることを特徴とするＡβ産生
阻害薬のスクリーニング方法、〔５５〕上記〔４６〕記
載のアンチセンスＤＮＡを用いることを特徴とするＡβ
産生阻害薬のスクリーニング方法、〔５６〕上記〔１
７〕記載の形質転換体を用いることを特徴とするＡβ産
生阻害薬のスクリーニング方法、〔５７〕上記〔５２〕
〜〔５６〕のいずれかに記載のスクリーニング方法で得
られうるＡβ産生阻害薬、〔５８〕上記〔５７〕記載の
Ａβ産生阻害薬を含有してなる医薬、〔５９〕アルツハ
イマー病の予防・治療剤である上記〔５８〕記載の医
薬、〔６０〕哺乳動物に対して、上記〔５７〕記載のＡ
β産生阻害薬の有効量を投与することを特徴とするアル
ツハイマー病の予防・治療方法、〔６１〕（ｉ）Ａβの
前駆体タンパク質（βＡＰＰ）フラグメントからのＡβ
の産生が促進されることにより選択マーカー遺伝子の発
現が亢進するよう設計された細胞株と（ii）その細胞株
に上記〔１１〕記載のＡβの産生を亢進するＤＮＡを導
入した細胞株に対して、試験化合物を添加した場合にお
ける、それぞれのＡβの産生量の差を測定することを特
徴とするＡβの産生を制御する物質のスクリーニング方
法、〔６２〕（ｉ）Ａβの前駆体タンパク質（βＡＰ
Ｐ）フラグメントからのＡβの産生が促進されることに
より選択マーカー遺伝子の発現が亢進するよう設計され
た細胞株と（ii）その細胞株に上記〔１２〕記載のＡβ
の産生を亢進するＤＮＡを導入した細胞株に対して、試
験化合物を添加した場合における、それぞれの選択マー
カーの生物活性の差を測定することを特徴とするＡβの
産生を制御する物質のスクリーニング方法、〔６３〕選
択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子であり、選択マーカ
ーの生物活性が薬剤耐性である上記〔６２〕記載のスク
リーニング方法、〔６４〕上記〔７〕記載のＤＮＡを用
いることを特徴とする当該ＤＮＡの発現抑制薬のスクリ
ーニング方法、〔６５〕上記

〔９〕記載のヒト染色体Ｄ
ＮＡのプロモーター領域とレポーター遺伝子を組み合わ
せて、試験化合物を添加した場合と添加しない場合にお
ける、それぞれのレポーター活性を測定することを特徴
とする当該ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝
子のプロモーター活性を抑制または促進する化合物のス
クリーニング方法、〔６６〕上記〔３０〕記載のペプチ
ドもしくはタンパク質またはその塩を発現し得る細胞
に、試験化合物を添加した場合と添加しない場合におけ
る、それぞれの当該ペプチドもしくはタンパク質または
その塩あるいはそれらのＤＮＡの発現量を抑制する化合
物のスクリーニング法を提供する。さらに、本発明は、
〔６７〕上記〔３２〕記載のＡβの産生を亢進するペプ
チドもしくはタンパク質のドミナントネガティブペプチ
ドもしくはタンパク質またはその塩、〔６８〕アミノ酸
配列の置換、欠失または（および）付加によりＡβの産
生を亢進する作用が損失または減弱している上記〔６
７〕記載のドミナントネガティブペプチドもしくはタン
パク質またはその塩、〔６９〕上記〔６７〕記載のドミ
ナントネガティブペプチドもしくはタンパク質またはそ
の塩を含有してなる医薬、〔７０〕アルツハイマー病の
予防・治療剤である上記〔６９〕記載の医薬、〔７１〕
哺乳動物に対して、上記〔６７〕記載のドミナントネガ
ティブペプチドもしくはタンパク質またはその塩の有効
量を投与することを特徴とするアルツハイマー病の予防
・治療方法、〔７２〕上記〔６７〕記載のドミナントネ
ガティブペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮ
Ａ、〔７３〕上記〔７２〕記載のＤＮＡを含有してなる
医薬、〔７４〕アルツハイマー病の予防・治療剤である
上記〔７３〕記載の医薬、および〔７５〕哺乳動物に対
して、上記〔７２〕記載のＤＮＡの有効量を投与するこ
とを特徴とするアルツハイマー病の予防・治療方法を提
供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】〔ＤＮＡ構築物〕本発明のＡβの
産生を制御するＤＮＡを探索する方法には、βＡＰＰフ
ラグメントからのＡβの産生が促進されることにより選
択マーカー遺伝子の発現が亢進するよう設計された細胞
株が用いられる。この細胞株には２種類の組換え遺伝子
構築物が導入される。まず第一の組換え遺伝子構築物
は、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有するβ
ＡＰＰのγ−セクレターゼ切断部位を含むβＡＰＰフラ
グメントとある種の転写因子活性を促進するタンパク質
（転写促進因子）との融合タンパク質をコードする融合
遺伝子を含む構築物（ベクター）である。βＡＰＰフラ
グメントは、該融合タンパク質を細胞膜に繋ぎとめるこ
とができ、βＡＰＰのγ−セクレターゼ切断部位である
Ａβ40（配列番号：１８）または（および）Ａβ42（配
列番号：１９）を含む長さのフラグメントでγ-セクレ
ターゼで切断されるものであればいずれの長さのもので
も良いが、好ましくは配列番号：２０で表わされるアミ
ノ酸配列を有するＡβ（1-52）が用いられる。また、γ
−セクレターゼで切断されるものであれば、該βＡＰＰ
フラグメントに１ないし複数のアミノ酸の欠失、付加あ
るいは置換が施されても良い。これらの置換には家族性
アルツハイマー病（ＦＡＤ）で認められるアミノ酸変異
なども含まれる。該融合タンパク質に用いられる転写因
子活性を促進するタンパク質（転写促進因子）として
は、内在性の転写因子システムと質的にあるいは量的に
区別可能であること、前記βＡＰＰフラグメントとの融
合タンパク質が細胞膜に繋ぎとめられるものであるこ
と、さらに、融合タンパク質がγ−セクレターゼで切断
された際に核内に移行し転写を促進できるものであるこ
と等の条件が満たされるものであれば、どのような転写
因子システムも利用することができるが、好ましくは、
膜内で調節的限定分解を受ける転写因子システムである
SREBP、Notch、Ire1またはATF6（Cell 100, 391-396, 2
000）の転写因子領域あるいは転写促進活性領域、さら
に好ましくはNotchの細胞内ドメインである配列番号：
１０表わされるアミノ酸配列を有するＣ端側転写因子領
域（NICD）が用いられる。

【０００７】第二の組換え遺伝子構築物は、前記融合タ
ンパク質に用いた転写因子が作用しうるプロモーター配
列とその下流に選択マーカー遺伝子を含む構築物（ベク
ター）である。プロモーター配列は、目的とする転写促
進因子選択的にプロモーター活性が発現されるものであ
ればどのような配列でも構わないが、例えば、転写促進
因子としてNICDを用いた場合、プロモーター配列として
はＨＥＳ−１またはその類似配列が、転写促進因子とし
てIre1のRnase Lドメインを用いた場合、プロモーター
配列としてはunfolded protein response element（Ｕ
ＰＲＥ）が、転写促進因子としてp50ATF6を用いた場
合、プロモーター配列としてはER stress responseelem
ent（ＥＲＳＥ）またはその類似配列が用いられる。前
記類似配列には、一つあるいはそれ以上の挿入、置換ま
たは欠失を含んでも良い。選択マーカー遺伝子として
は、前記プロモーター配列支配下に発現し、その発現を
容易に検出できるものであればどのような遺伝子を用い
ることも可能であるが、好ましくは薬剤耐性遺伝子が用
いられる（新生化学実験講座２、核酸III、3.6動物細胞
発現ベクター、p84-103）。薬剤耐性遺伝子と薬剤の組
み合わせとして、（１）ピューロマイシン−Ｎ−アセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子とピューロマイシンとの組
み合わせ、（２）アミノグリコシドホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（ＡＰＨ）とＧ４１８との組み合わせ、
（３）ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺
伝子（ＨＰＨ）とハイグロマイシンＢとの組み合わせ、
（４）キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）とマイコフェノール酸との組み
合わせ、などを用いることができる。また、親株の細胞
株がヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）またはチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）欠損株である場合、これらの遺伝子とＨＡＴ（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン）との組み合わ
せを用いることができる。さらに、選択マーカー遺伝子
としては、ジヒドロ葉酸還元酵素やアンピシリン耐性遺
伝子などを用いることもできる。また、前記選択マーカ
ー遺伝子の代用として、種々のレポーター遺伝子を用い
ることもできる。レポーター遺伝子としては、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、
β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、成長因子、β
−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Green
fluorescent protein（ＧＦＰ）およびβ−ラクタマー
ゼなどが好んで用いられる。これらレポーター遺伝子の
ベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことがで
きる（例えば、Molecular Biotechnology 13, 29-43,19
99）。これらの第一および第二の組換え遺伝子構築物を
含有するベクターには、以上の他に、所望によりエンハ
ンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナ
ル、その他の選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを付加
させても良い。

【０００８】〔細胞株〕本発明のスクリーニング方法に
用いられる細胞株は、βＡＰＰフラグメントからのＡβ
の産生が促進されることにより選択マーカー遺伝子の発
現が亢進する機能を有する限り、特に限定されないが、
具体的には前記２種類の組換え遺伝子構築物を導入した
細胞株が用いられる。前記2種類の組換え遺伝子構築物
を導入する細胞株としては、ＤＮＡライブラリーを効率
よくトランスフェクトできる細胞株であれば、どのよう
な細胞株を用いても良い。該細胞株としては、内在性に
βＡＰＰを発現していない細胞株であることが望ましい
が、発現していても導入したβＡＰＰフラグメントが効
率良く切断されるのであれば、そうした細胞株を用いる
こともできる。また、内在性にγ−セクレターゼ活性を
有する細胞株でも、プレセニリンなどの導入でγ−セク
レターゼ活性を導入した細胞株でも、検出に十分なγ−
セクレターゼ活性を有するものであれば、いずれの細胞
株を用いることもできる。具体的には、細胞株として
は、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ，ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨ
Ｏ，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエロ
ーマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞、ＨＥＫ−２９
３細胞等の動物細胞株が挙げられるが、好ましくは、マ
ウスpro-B cell由来の細胞株、ＢａＦ／３が用いられ
る。

【０００９】ＤＮＡライブラリーのＤＮＡとしては、ｃ
ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、合成ＤＮＡの何れであってもよ
い。染色体ＤＮＡとしては、プロモーター領域、エンハ
ンサー領域などを含むものであってもよい。また、ＤＮ
Ａライブラリーとしては、ヒトやその他の温血動物（例
えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサ
ギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）由来のものが用い
られるが、なかでもヒト由来のものが好ましく用いられ
る。さらに、ＤＮＡライブラリーとしては、ヒトやその
他の温血動物のあらゆる細胞（例えば、網膜細胞、肝細
胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在
するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網
膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下
部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵
臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾
丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または
血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，
Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−
６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−
３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥ
Ｍ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−
２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−
１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−
１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来
するものであってよく、好ましくはヒト脳由来あるいは
ヒト脳各部位（例えば、海馬）由来のものが用いられ
る。これらの組織は正常由来であっても、あるいは患者
（例えばアルツハイマー病）由来であっても良い。ライ
ブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、
プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであっ
てもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡ
またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Revers
e Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、
ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもで
きる。前記２種類の組換え遺伝子構築物を導入された細
胞株へのＤＮＡライブラリーのトランスフェクション法
としては、例えば、実験医学別冊、遺伝子導入と発現・
解析法（1994年）（羊土社発行）などに従うことができ
る。これらの方法には、物理学的手段（マイクロインジ
ェクション、エレクトロポレーション）、化学的手段
（リポフェクション、リン酸カルシウム法）およびレト
ロウイルスなどのウイルスベクターによる方法等が含ま
れる。

【００１０】〔Ａβの産生を制御するＤＮＡのスクリー
ニング方法〕Ａβの産生を制御するＤＮＡを探索するに
は、まず、前記２種類の組換え遺伝子構築物を導入され
た細胞株（以下、親株と記載する）へＤＮＡライブラリ
ーをトランスフェクションする。そののち、例えば、選
択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いた場合、対応す
る薬剤の濃度を高め、高濃度の薬剤存在下でも耐性とな
るＤＮＡを持つ細胞を選択することによりなされる。例
えばピューロマイシンを薬剤として用いる場合、あらか
じめＤＮＡライブラリーをトランスフェクションしてい
ない状態で、親株のピューロマイシン感受性を調べ、ほ
とんどの親株が生存できないピューロマイシン濃度を選
択する。例えば、ピューロマイシン濃度として0.1〜25
μg/ml、好ましくは1〜25μg/ml、さらに好ましくは5〜
25μg/mlが用いられる。また、選択マーカーの代用とし
て、前記レポーター遺伝子を用いた場合、そのアッセイ
法は公知の技術に従うことができる（例えば、Molecula
rBiotechnology 13, 29-43, 1999）。

【００１１】次に、それらの選択された細胞が産生する
Ａβを測定し、Ａβ産生を亢進させるＤＮＡを有する細
胞をスクリーニングし、そのＤＮＡをＰＣＲなど公知の
技術により同定する。Ａβの測定法には種々の方法が用
いられるが、Ａβ特異的抗体を用いる免疫化学的方法を
用いることが好ましい。これらの方法には、免疫沈降
法、ウエスタンブロッテイング、酵素免疫測定法、サン
ドイッチ型酵素免疫測定法あるいはそれらの組み合わせ
方法が用いられる。Ａβ特異的抗体としては、ポリクロ
ーナル抗体を用いても良いが、例えば、BAN50、BNT77、
BS85、BA27、BC05（Biochemistry, 34, 10272-10278, 1
995）または6E10、４G8などのモノクローナル抗体を用
いても良い。とりわけ、BA27およびBC05は、それぞれＡ
β40およびＡβ42/43に選択的な抗体であるため、これ
らの抗体、あるいは同様な選択性を有する抗体を用いれ
ば、Ａβ40の産生を亢進させる遺伝子、Ａβ42/43の産
生を亢進させる遺伝子、あるいはＡβ40およびＡβ42/4
3いずれの産生も亢進させる遺伝子を見つけることが可
能となる。さらに、分泌型ＡＰＰ量はＡβの産生を間接
的に反映すると考えられることから、分泌型ＡＰＰ量を
免疫沈降法、ウエスタンブロッテイング、酵素免疫測定
法、サンドイッチ型酵素免疫測定法などの免疫化学的方
法で検出しても良い。このようにして選択されたＡβの
産生を亢進する候補遺伝子を、βＡＰＰを産生している
他の細胞株にトランスフェクトし、Ａβを測定し、これ
らの候補遺伝子の導入により、実際にＡβの産生亢進が
引き起こされることを確認する。このとき同様にＡβ42
/43あるいは分泌型ＡＰＰを指標とすることもできる。
これらの確認用の細胞株にはβＡＰＰを産生し、γ−セ
クレターゼ活性を有している細胞株ならどのようなもの
も用いることができるが、例えば、IMR-32、PC12h、Neu
ro-2a、SK-N-SHなどの細胞株、またはβＡＰＰとPS-1/2
を導入したHEK-293などの細胞株が用いられる。なお、
上記した本発明のスクリーニング方法において、選択マ
ーカーとして前記のレポーター遺伝子を使用し、そのレ
ポーター活性を指標とすることにより、Ａβの産生を促
進または阻害する遺伝子をスクリーニングすることがで
きる。

【００１２】〔スクリーニングで得られたＤＮＡおよび
その産物〕本発明のスクリーニング方法で得られるＤＮ
Ａ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）は、
Ａβの産生を制御するＤＮＡであり、ｃＤＮＡ、染色体
ＤＮＡ、合成ＤＮＡの何れであってもよく、特にヒトｃ
ＤＮＡ、ヒト染色体ＤＮＡが好ましい。また、本発明の
ＤＮＡは、本発明のスクリーニング方法で得られたＤＮ
Ａそのものであってもよいし、当該ＤＮＡまたはその一
部をプローブまたはプラーマーとして用い、遺伝子工学
の常套手段を用いてクローニングしたｃＤＮＡまたは染
色体ＤＮＡであってもよい。Ａβの産生を制御するＤＮ
Ａには、Ａβの産生を亢進するＤＮＡなどが含まれる。
本発明のスクリーニング方法で得られたＤＮＡとして、
具体的に、以下の３つの遺伝子が取得された。 （１）Genbankに登録されているヒトｃＤＮＡ（accessi
on No. AAH06223） このｃＤＮＡは配列番号：４で表わされる塩基配列を有
しており、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有
するタンパク質Ａをコードしている。このヒトｃＤＮＡ
は機能不明なタンパク質ＡをコードするマウスｃＤＮＡ
としてGenbankに登録されているｃＤＮＡ（accession N
o. AK003241）と極めて高い相同性を示した。さらに、
このｃＤＮＡはニワトリからsyndecan-4と結合するタン
パク質として酵母two-hybrid法によって同定されたSynd
esmos (Baciu P.C., et al. J. Cell Science 113, 31
5, 2000; accession no. AF095446) とも高い相同性を
示した。 （２）Genbankに登録されているHerp（（Kokame K. et
al. J. Biol. Chem. 275: 3286, 2000; accession no.
AB034989） このｃＤＮＡは配列番号：５で表わされる塩基配列を有
しており、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有
するタンパク質Ｂをコードしている。このｃＤＮＡにコ
ードされるタンパク質Ｂは、小胞体に局在し、小胞体ス
トレスでその発現が誘導されるが機能の不明なタンパク
質であった。 （３）Genbankに登録されている５−リポキシゲナーゼ
（accession no. XM 005818）のＮ末端１から３８９個
の途中配列を含むｃＤＮＡ。このｃＤＮＡは配列番号：
６で表わされる塩基配列を有しており、配列番号：３で
表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｃをコード
している。これらの３つのヒトｃＤＮＡを過剰発現させ
るとＡβの産生が亢進することから、これらのｃＤＮＡ
はアルツハイマー病に関連するＤＮＡであることが判明
した。これらのＤＮＡに関しては、エクソン領域のみな
らず、プロモーター領域およびイントロン領域も、全て
アルツハイマー病との関連で重要である。

【００１３】本発明のスクリーニング方法で得られたＤ
ＮＡにコードされるペプチド、タンパク質またはその塩
は、前記したヒトまたはその他の温血動物のあらゆる細
胞やあらゆる組織由来するタンパク質であってもよく、
組換えタンパク質であってもよく、また合成タンパク質
であってもよい。本発明のタンパク質は、配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：２２
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するタンパク質である。実質的に
同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：、配
列番号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わ
されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０
％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましく
は約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性
を有するアミノ酸配列などが挙げられる。さらに、本発
明のタンパク質は配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：２２
で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質
的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。実
質的に同質の活性としては、Ａβの産生において配列番
号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：
２２で表わされるタンパク質と同質の影響を与えるもの
であれば、他の活性は異なっていてもかまわない。

【００１４】また、本発明のタンパク質としては、配
列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番
号：２２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以
上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜
１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のア
ミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わさ
れるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１
〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに
好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列、配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、
より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個
（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された
アミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸
配列を含有するタンパク質なども用いられる。

【００１５】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１、
配列番号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表
わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をはじめとす
る本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−
ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ^-)、アミド
（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れ
であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、
例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル
もしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、例えば、
シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロア
ルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ
_6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどの
フェニル−Ｃ_1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチ
ルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキル基などのＣ_7-14
アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用される
ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明の
タンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカル
ボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がア
ミド化またはエステル化されているものも本発明のタン
パク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例え
ば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さら
に、本発明のタンパク質には、上記したタンパク質にお
いて、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例
えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_2-6アルカノイル
基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、
Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピロ
グルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の
置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾ
ール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保
護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_2-6アル
カノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されてい
るもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質
などの複合タンパク質なども含まれる。

【００１６】本発明のタンパク質の部分ペプチド（以
下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前
記した本発明のタンパク質の部分ペプチドと実質的に同
一のアミノ酸配列であれば何れのものであってもよい。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、例えば、前記
した配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で
表わされる構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以
上、好ましくは２０個以上、より好ましくは１００個以
上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。実
質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と
約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましく
は約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も
好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を示す。

【００１７】また、本発明の部分ペプチドは、上記アミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ
酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個
以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１
〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の
アミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ま
しくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ
酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発
明の部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯ
ＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ^-）、アミド（−
ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれで
あってもよい。ここで、エステルにおけるＲは上記と同
意義を示す。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記
した本発明のタンパク質と同様に、Ｎ末端のメチオニン
残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側
が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸
化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当
な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合し
たいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれ
る。本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩と
しては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙
げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま
しい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。

【００１８】前記した本発明の配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わされ
るアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、
本発明のスクリーニング方法で得られたＤＮＡにコード
されるペプチド、タンパク質（以下、ペプチドも含めて
タンパク質と略記する）またはその塩は、前述したヒト
やその他の哺乳動物の細胞または組織から公知のペプチ
ドまたはタンパク質の精製方法によって製造することも
できるし、後述する本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっ
ても製造することができる。また、後述のタンパク質合
成法またはこれに準じて製造することもできる。ヒトや
その他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、
ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞をホモジナイ
ズした後、酸などで抽出を行ない、得られた抽出液を逆
相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。

【００１９】本発明のタンパク質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常
市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そ
のような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒ
ドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミ
ノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール
樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹
脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミド
メチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２'，４'
−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ
樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ
アミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合
させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと
同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子
内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク
質またはそのアミド体を取得する。上記した保護アミノ
酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種
活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイ
ミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、
Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル
−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミ
ドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化
抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに
保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無
水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステ
ルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後
に樹脂に添加することができる。

【００２０】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化す
ることができる。

【００２１】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、ア
ラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−
ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステ
ル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジ
ル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕ
ｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。

【００２２】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタン
ジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカ
チオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンの
イミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロ
フェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリ
プトファンのインドール保護基として用いられるホルミ
ル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタ
ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外
に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによる
アルカリ処理によっても除去される。

【００２３】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。

【００２４】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００２５】本発明のスクリーニング方法で得られたＤ
ＮＡにコードされるタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドは、以下に説明する本発明の配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドと同様に調製することができる。本発明
の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配
列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するタン
パク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：２２
で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
する塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮ
Ａ）を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。該ポリヌクレオチドとしては、本発明の配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：２２
で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっ
ても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖
ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリ
ッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コー
ド鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード
鎖）であってもよい。本発明の配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わされ
るアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、染色体ＤＮＡ、染色体ＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを
用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain R
eaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって
増幅することもできる。具体的には、本発明の配列番
号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：
２２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質を
コードするＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番
号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：
２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配
列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番
号：２１で表わされる塩基配列とハイストリンジェント
な条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明
の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配
列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するタン
パク質と実質的に同質のＡβ産生亢進活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよ
い。配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または
配列番号：２１で表わされる塩基配列とハイブリダイズ
できる塩基配列としては、例えば、配列番号：４、配列
番号：５、配列番号：６または配列番号：２１で表わさ
れる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以
上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９
５％以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。

【００２６】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の
方法などに従って行なうことができる。また、市販のラ
イブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の
方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハ
イストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナト
リウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２
０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜
６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍ
Ｍで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。本発明の配
列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番
号：２２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質
をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡ
と相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオ
チドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味
で用いられる。本発明の配列番号：１、配列番号：２、
配列番号：３または配列番号：２２で表わされるアミノ
酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲ
とその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じ
た方法により、本発明の配列番号：１、配列番号：２ま
たは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有する
タンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。本発明
に従えば、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３
または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有
するタンパク質遺伝子の複製又は発現を阻害することの
できるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、ク
ローン化したあるいは決定された配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わされ
るアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうし
たポリヌクレオチド（核酸）は、配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わされ
るアミノ酸配列を含有するタンパク質の遺伝子のＲＮＡ
とハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成又は
機能を阻害することができるか、あるいは配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：２２
で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質関連Ｒ
ＮＡとの相互作用を介して配列番号：１、配列番号：
２、配列番号：３または配列番号：２２で表わされるア
ミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子の発現を調節・
制御することができる。配列番号：１、配列番号：２、
配列番号：３または配列番号：２２で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列
に相補的なポリヌクレオチド、及び配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するタンパク質関連ＲＮＡと特
異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチ
ドは、生体内及び生体外で配列番号：１、配列番号：
２、配列番号：３または配列番号：２２で表わされるア
ミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子の発現を調節・
制御するのに有用であり、また病気などの治療又は診断
に有用である。そうしたポリヌクレオチドは、配列番
号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：
２２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質遺
伝子の５'端ヘアピンループ、５'端６−ベースペア・リ
ピート、５'端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コド
ン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、
３'端非翻訳領域、３'端パリンドローム領域、及び３'
端ヘアピンループを好ましい対象領域として選択し調製
しうるが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３
または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有
するタンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選
択しうる。

【００２７】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なポリヌクレオチドとの関係、あるいは、対象物
とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドと
の関係は、「アンチセンス」であるということができ
る。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ
−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチ
ド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プ
リン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他
のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド
骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパ
ク質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊
な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマー
はＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリン
グや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含
有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、
１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤ
ＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非
修飾ポリヌクレオチド（又は非修飾オリゴヌクレオチ
ド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当
該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたも
の、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチ
ドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾の
されたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホ
ネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カ
ルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫
黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌク
レアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗
体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖
（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有し
ているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリ
ジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物
（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性
の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有する
もの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー
型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシ
ド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、プリン及び
ピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその
他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。
こうした修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジ
ン、アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはそ
の他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌク
レオチド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修
飾されていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲン
とか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエー
テル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。

【００２８】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうして修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。本発明のアン
チセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、
塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロス
フェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療
により適用されたり、付加された形態で与えられること
ができうる。こうして付加形態で用いられるものとして
は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ
ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高め
たり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例え
ば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水
性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質として
は、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリ
ルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こ
うしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させる
ことができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介し
て付着させることができうる。その他の基としては、核
酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ
用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌク
レアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられ
る。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレング
リコール、テトラエチレングリコールなどのグリコール
をはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙
げられるが、それに限定されるものではない。アンチセ
ンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の
生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：２２
で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質の生体
内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核
酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。

【００２９】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、染色体ＤＮＡ、染色体ＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ
−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもでき
る。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：４、配列番
号：５、配列番号：６または配列番号：２１で表わされ
る塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮ
Ａ、または（２）配列番号：４、配列番号：５、配列番
号：６または配列番号：２１で表わされる塩基配列とハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基
配列を有し、本発明の配列番号：１、配列番号：２、配
列番号：３または配列番号：２２で表わされるアミノ酸
配列を有するタンパク質と実質的に同質のＡβ産生亢進
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基
配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：４、
配列番号：５、配列番号：６または配列番号：２１で表
わされる塩基配列の部分塩基配列とハイブリダイズでき
る塩基配列としては、例えば、配列番号：４、配列番
号：５、配列番号：６または配列番号：２１で表わされ
る塩基配列の部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは
約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ま
しくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが用
いられる。

【００３０】本発明の配列番号：１、配列番号：２、配
列番号：３または配列番号：２２で表わされるアミノ酸
配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド（以
下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全
にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本
発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプ
ライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または
適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク
質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしく
は合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼ
ーションによって選別することができる。ハイブリダイ
ゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法
などに従って行なうことができる。また、市販のライブ
ラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法
に従って行なうことができる。

【００３１】ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキッ
ト、例えば、Mutan^TM-G（宝酒造）、Mutan^TM-K（宝酒
造）などを用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの
公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なう
ことができる。クローン化された本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望に
より制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして
使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側に
は翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ
を有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終
止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加
することもできる。本発明のタンパク質の発現ベクター
は、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含むＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）から目的とするＤ
ＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現
ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより
製造することができる。

【００３２】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好
ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐ
プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモー
ター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーターなど
が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモ
ーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター
など、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場
合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター
などが好ましい。

【００３３】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグ
ナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチ
ルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配
列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母で
ある場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナ
ル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュ
リン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル
配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。このようにして構築された本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換
体を製造することができる。

【００３４】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１
巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス
（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用い
られる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズ
ブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。

【００３５】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spod
optera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia n
iの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来の
High Five^TM 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞また
はEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイ
ルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Bomb
yx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細
胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓ
ｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In
Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫
としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前
田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９
８５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ
−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ
（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャ
イニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。

【００３６】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載
の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆
虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー
（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方
法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換す
るには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロト
コール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、
ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)
に記載の方法に従って行なうことができる。このように
して、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有す
る発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られ
る。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質
転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液
体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に
必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられ
る。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリ
ン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例え
ば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リ
カー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ
ショ抽出液などの無機または有機物質、無機物として
は、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよ
い。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

【００３７】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)」や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）」が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、
必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００３８】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞膜に本発明の
タンパク質を生成せしめることができる。

【００３９】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用
いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタ
ンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活
性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明のタンパ
ク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で
菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。こ
のようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含
まれる本発明のタンパク質の精製は、公知の分離・精製
法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの
溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過
法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが用いられる。

【００４０】かくして得られる本発明のタンパク質が遊
離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準
じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得
られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法に
より、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生する本発明のタンパク質を、精製前
または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させる
ことにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部
分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素とし
ては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニ
ルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシ
ダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明のタ
ンパク質またはその塩の活性は、標識したリガンドとの
結合実験、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセ
イ、酵素活性、シグナル情報伝達活性、物質輸送活性、
物質透過活性、Ａβ産生亢進活性などにより測定するこ
とができる。

【００４１】〔抗体〕本発明のタンパク質もしくはその
部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質
と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタン
パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し
得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体の何れであってもよい。本発明のタンパク質もし
くはその部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタ
ンパク質と略記する場合もある）に対する抗体は、本発
明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗
血清の製造法に従って製造することができる。

【００４２】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、哺乳動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺
乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモ
ット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、
マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクロー
ナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された
温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体
を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を
採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と
融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の
測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを
反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定す
ることにより行なうことができる。融合操作は既知の方
法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャ
ー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に
従い実施することができる。融合促進剤としては、例え
ば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられ
る。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好まし
く用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数
と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程
度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥ
Ｇ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約
２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０
分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を
実施できる。

【００４３】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、タンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着
させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ
培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識し
た抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞が
マウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられ
る）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタン
パク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検
出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマの選別は、公知あるいはそれに準じる方
法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動
物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育
種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものな
らばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０
％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩ
Ｔ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培
養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））な
どを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０
℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日
〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、
通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリド
ーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測
定と同様にして測定できる。

【００４４】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。

【００４５】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
（本発明のタンパク質抗原）とキャリアータンパク質と
の複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法
と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発
明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の
分離精製を行なうことにより製造できる。哺乳動物を免
疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク
質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およ
びキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架
橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くでき
れば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい
が、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリ
ン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比
でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１
〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハ
プテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を
用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジ
イミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオ
ビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられ
る。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能
な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与さ
れる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロ
イントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを
投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ず
つ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクロ
ーナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血
液、腹水など、好ましくは血液から採取することができ
る。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の
血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリク
ローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体
の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従っ
て行なうことができる。

【００４６】以下に、本発明のＡβの産生を制御するＤ
ＮＡ（本発明のＤＮＡ）、そのＤＮＡと相補的な塩基配
列を有するアンチセンスＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する
組換えベクターによる形質変換体、そのＤＮＡがコード
するタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩（本発
明のタンパク質）および本発明の抗体の用途を説明す
る。 （１）アルツハイマー病の組織マーカー 本発明のタンパク質は、アルツハイマー病患者の脳にも
発現しているため、アルツハイマー病の組織マーカーと
して使用することができる。また、本発明のタンパク質
に選択的に結合するペプチド、タンパク質もしくはＤＮ
Ａの検出または分取にも利用できる。 （２）本発明のタンパク質が関与する各種疾病の治療・
予防剤 本発明のＡβ産生を亢進する作用を有するタンパク質や
例えば、（１）神経変性疾患（例、老年期痴呆、アルツ
ハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、クロイツフェ
ルト・ヤコブ病、筋萎縮性脊髄側索硬化症、糖尿病性ニ
ューロパシー等）、（２）脳血管障害（例、脳梗塞、脳
出血、脳動脈硬化に伴う脳循環不全等）時、頭部外傷・
脊髄損傷時、脳炎後遺症時または脳性麻痺時の神経障
害、（３）記憶障害（例、老年期痴呆、健忘症等）、
（４）軽度認知障害（mild cognitiveimpairment（M.C.
I.））または（５）精神疾患（例、うつ病、恐慌性障
害、精神分裂症等）など、好ましくはアルツハイマー病
患者でその活性あるいは発現量が亢進しているものにつ
いては、そのドミナントネガテイブ体は上記疾患の治療
・予防剤等の医薬として使用することができる。上記ド
ミナントネガテイブ体は、そのアミノ酸配列の一部が置
換もしくは欠失したもの、そのアミノ酸配列にアミノ酸
が付加したもの、または置換、欠失、付加が組み合わさ
ったもののいずれであってもよく、Ａβ産生を亢進する
作用が損失または減弱しているものである。このドミナ
ントネガテイブ体は、通常の遺伝子工学的手法により作
製することができる。例えば、本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列を公知のキット、例えば、Mu
tan^TM-G（宝酒造）、Mutan^TM-K（宝酒造）などを用い
て、Gapped duplex法やKunkel法などの公知の方法ある
いはそれらに準じる方法に従って変換した後、上記の本
発明のタンパク質の製造法に準じて製造することができ
る。また、Ａβ産生を亢進する作用が損失または減弱し
ていることは、ドミナントネガテイブ体またはそれをコ
ードするＤＮＡのＡβ産生を亢進する作用を本発明のス
クリーニング方法で確認することによって行うことがで
きる。

【００４７】（３）各種疾患に対する医薬候補化合物の
スクリーニング法 本発明のＡβ産生を亢進する作用を有するタンパク質の
機能（活性）を阻害（抑制）する化合物またはその塩
は、例えば、（１）神経変性疾患（例、老年期痴呆、ア
ルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、クロイツ
フェルト・ヤコブ病、筋萎縮性脊髄側索硬化症、糖尿病
性ニューロパシー等）、（２）脳血管障害（例、脳梗
塞、脳出血、脳動脈硬化に伴う脳循環不全等）時、頭部
外傷・脊髄損傷時、脳炎後遺症時または脳性麻痺時の神
経障害、（３）記憶障害（例、老年期痴呆、健忘症
等）、（４）軽度認知障害（mild cognitive impairmen
t（M.C.I.））または（５）精神疾患（例、うつ病、恐
慌性障害、精神分裂症等）など、好ましくはアルツハイ
マー病の治療・予防剤等の医薬として使用できる。した
がって、本発明のタンパク質およびそのＤＮＡは、本発
明のタンパク質の機能（活性）を阻害する化合物または
その塩のスクリーニングのための試薬として有用であ
る。すなわち、本発明は、本発明のタンパク質、そのＤ
ＮＡ、そのＤＮＡと相補的に結合するアンチセンスＤＮ
Ａ、そのＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換さ
れた形質変換体、または本発明の抗体を用いることを特
徴とする本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害する
化合物（以下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリ
ーニング方法を提供する。また、本発明のスクリーニン
グ用キットは、本発明のタンパク質、そのＤＮＡ、その
ＤＮＡと相補的に結合するアンチセンスＤＮＡ、そのＤ
ＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質変
換体、または本発明の抗体を含有するものである。上記
スクリーニング方法として、具体的には、次のようなも
のが挙げられる。

【００４８】（３−１）本発明のタンパク質と組織、細
胞、またはそれらの膜画分との反応を阻害する化合物の
スクリーニング方法 （ｉ）本発明のタンパク質が作用する組織、細胞または
それらの膜画分に、本発明のタンパク質を接触させた場
合と（ii）本発明のタンパク質が作用する組織、細胞ま
たはそれらの膜画分に、本発明のタンパク質および試験
化合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴とす
る本発明のタンパク質と組織、細胞またはそれらの膜画
分との反応性を阻害する化合物またはその塩のスクリー
ニング方法があげられる。上記の細胞には株化細胞を用
いても良いし、初代培養系を用いても良い。細胞または
組織としては、ヒトやその他の温血動物（例えば、モル
モット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒ
ツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、神経細胞、内分
泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨
髄細胞、肝細胞、脾細胞、メサンギウム細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑
膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺
細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細
胞、幹細胞もしくはガン細胞等、もしくはそれらの細胞
が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位
（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下
部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵
臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸
（精巣）、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋
等を用いても良い。

【００４９】本発明のスクリーニング方法においては、
上記した反応性としては、結合量、細胞刺激活性、組織
刺激活性などを測定して比較する。結合量を測定する場
合、ビアコアなどの測定機器や標識リガンドが用いられ
る場合もある。後者の場合、例えば、〔³Ｈ〕、
〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕、蛍光色素、蛍光タン
パク質、ビオチン、β−ガラクトシダーゼやパーオキシ
ダーゼなどの酵素、フラッグなどのタグと呼ばれるペプ
チドなどで標識された本発明のタンパク質を利用するこ
とができる。本発明の配列番号：１、配列番号：２また
は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタ
ンパク質の結合量を調べる場合、それぞれ、syndecan-
4、プレセニリンあるいはＦＬＡＰと呼ばれるタンパク
質、あるいはそれらの類似タンパク質を含有する組織、
細胞、その膜画分あるいは粗精製画分などを用いても良
い。また、細胞刺激活性としては、細胞の生化学的な変
化を伴うものであればどのようなものでも良いが、例え
ば、アラキドン酸代謝物、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ²⁺の遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生
成、イノシトールリン酸産生、細胞外液のｐＨの低下、
細胞膜電位変動、Ｋ⁺チャンネル機能、細胞内タンパク
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ＮＦκＢの活性
化、小胞体Ｃａ濃度、capacitative calcium entry（Ｃ
ＣＥ）、小胞体ストレス、小胞体ストレスに伴う分子シ
ャペロンの誘導、タウのリン酸化、軸索輸送、キネシン
依存性ＡＰＰ軸索輸送、NO産生、アポトーシス、細胞増
殖活性、細胞接着活性、細胞遊走活性、該細胞が特有に
産生している生理活性物質の産生などが挙げられる。組
織刺激活性としては、組織の生化学あるいは生理学的な
変化を伴うものであればどのようなものでも良いが、例
えば、収縮や弛緩活性を挙げることができる。

【００５０】（３−２）本発明のタンパク質の酵素活性
に対する促進剤または阻害剤のスクリーニング法 本発明のタンパク質が酵素活性を有する場合または酵素
活性に何らかの関係を有する場合、その活性を指標とし
て、本発明のタンパク質の酵素活性を促進する化合物
（以下、促進剤と略記する）または阻害する化合物（以
下、阻害剤と略記する）をスクリーニングできる。例え
ば、本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を
含有するタンパク質は５−リポキシゲナーゼのＮ端部分
配列に相当することから、５−リポキシゲナーゼ活性の
促進剤または阻害剤のスクリーニングを行うことができ
る。

【００５１】（３−３）形質転換体を用いた、本発明の
タンパク質の活性に対する促進剤または阻害剤のスクリ
ーニング法 本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡを含有する組換えベクターによる形質転換体を
用いて、導入された該ＤＮＡに起因する形質転換体の生
化学的な変化を指標として、本発明のタンパク質の活性
を促進する化合物（以下、促進剤と略記する）または阻
害する化合物（以下、阻害剤と略記する）をスクリーニ
ングできる。形質転換体としては、酵母や細胞が好まし
く用いられるが、細胞を用いる場合、親株として、株化
細胞を用いても、初代培養系を用いても、さらに、上記
（３−１）記載の種々の細胞を用いても良い。上記の導
入された該ＤＮＡに起因する形質転換体の生化学的な変
化の指標としては、検出可能であればどのようなものも
指標として用いることが可能である。例えば、該形質転
換体が特有に産生している物質（例えば、Ａβ）の産生
を指標とすることができる。Ａβの測定法には種々の方
法が用いられるが、Ａβ特異的抗体を用いる免疫化学的
方法を用いることが好ましい。これらの方法には、免疫
沈降法、ウエスタンブロッテイング、酵素免疫測定法、
サンドイッチ型酵素免疫測定法あるいはそれらの組み合
わせ方法が用いられる。形質転換体を作製する親株とし
ては、内在性にβＡＰＰを発現しているものでも、ある
いは外来性にβＡＰＰあるいはそのフラグメントを導入
したものでも、内在性にγ−セクレターゼ活性を有する
ものでも、プレセニリンなどの導入でγ−セクレターゼ
活性を導入したものでも、検出に十分なＡβ産生量を示
すものであれば、いずれも用いることができる。導入す
るβＡＰＰやプレセニリンはＦＡＤ由来の変異を有して
いてもかまわない。また、本発明者が作製した、βＡＰ
ＰフラグメントからのＡβの産生が促進されることによ
りピューロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子の発現が亢進
するよう設計された細胞株を親株として用いた場合、Ａ
βの測定以外にも、ピューロマイシンなどの薬剤耐性を
指標として、化合物のスクリーニングを実施することが
できる。

【００５２】導入された該ＤＮＡに起因する形質転換体
が特有に産生している物質として、Ａβ以外にも例え
ば、分泌型ＡＰＰを用いても良い。また、Ａβの中でも
特にＡβ４２に注目することもできる。さらに、上記の
導入された該ＤＮＡに起因する形質転換体の生化学的な
変化の指標として、本発明のタンパク質と機能的に関連
する物質、例えば、リガンド、基質、被輸送物質または
複合体形成因子との相互作用の変化を測定しても良い。
本発明の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３ま
たは配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有す
るタンパク質と複合体を形成する因子としては、それぞ
れ、syndecan-4、プレセニリンまたはＦＬＡＰと呼ばれ
るタンパク質、あるいはそれらの類似タンパク質が含ま
れる。さらに、上記の導入された該ＤＮＡに起因する形
質転換体の生化学的な変化の指標として、例えば、アラ
キドン酸代謝物、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺の
遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノ
シトールリン酸産生、細胞外液のｐＨの低下、細胞膜電
位変動、Ｋ⁺チャンネル機能、細胞内タンパク質のリン
酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ＮＦκＢの活性化、小胞体
Ｃａ濃度、capacitative calcium entry（ＣＣＥ）、小
胞体ストレス、小胞体ストレスに伴う分子シャペロンの
誘導、タウのリン酸化、軸索輸送、キネシン依存性ＡＰ
Ｐ軸索輸送、ＮＯ産生、アポトーシス、細胞増殖活性、
細胞接着活性、細胞遊走活性などを測定しても良い。

【００５３】さらに、上記の形質転換体の生化学的な変
化の指標として、核、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリ
ア、エンドゾーム、ライソゾーム、あるいはそれらの
膜、プロテアゾーム、細胞膜へ本発明のタンパク質ある
いはある特定のタンパク質の移行を測定しても良い。特
定のタンパク質として、それぞれ配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３または配列番号：２２で表わされ
るアミノ酸配列を含有するタンパク質と複合体を形成す
る因子である、syndecan-4、プレセニリンまたはＦＬＡ
Ｐと呼ばれるタンパク質、あるいはそれらの類似タンパ
ク質が含まれる。その検出には、放射ラベルアミノ酸な
どを用いて代謝的にラベルを導入し、抗体を用いて免疫
沈降させたり、それらのタンパク質にＧＦＰなどの蛍光
タンパク質やフラッグなどのタグを結合させたキメラタ
ンパク質を発現させ、その蛍光やタグを指標にタンパク
質の移行を測定することができる。

【００５４】（３−４）本発明のタンパク質の発現を阻
害する化合物のスクリーニング法 本発明のタンパク質、そのＤＮＡ、そのＤＮＡと相補的
に結合するアンチセンスＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する
組換えベクターによる形質変換体、または本発明の抗体
は、本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物のスク
リーニング法に用いることができる。用いる材料として
は、本発明のタンパク質を発現している細胞が用いられ
るが、組織、動物などを用いても良い。その際、株化細
胞を用いても、初代培養系を用いても、さらに、上記
（３−１）記載の種々の細胞や組織を用いても良い。上
記動物には、後述するレポーター遺伝子を導入したノッ
クアウト動物も含まれる。本発明のタンパク質の発現量
は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法に
より測定することもできるし、本発明のタンパク質のｍ
ＲＮＡをノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣ
ＲやＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いて、公知の方法によ
り測定することもできる。さらに、本発明のタンパク質
をコードする遺伝子のプロモーター領域（促進プロモー
ター、抑制プロモーターなど）とレポーター遺伝子を組
み合わせ、プロモーター活性を促進または阻害する化合
物をレポータージーンアッセイによりスクリーニングす
ることができる。その際、親株としては、株化細胞を用
いても、初代培養系を用いても、さらに、上記（３−
１）記載の種々の細胞を用いても良い。レポーター遺伝
子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェ
ラーゼ、成長因子、β−グルクロニダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、Green fluorescent protein（ＧＦＰ）
およびβ−ラクタマーゼなどが好んで用いられる。これ
らレポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知
の技術に従うことができる（例えばMolecular Biotechn
ology 13, 29-43, 1999）。

【００５５】（４）本発明の抗体を用いる診断剤 本発明の抗体を作製し、各種疾病、例えば、（１）神経
変性疾患（例、老年期痴呆、アルツハイマー病、ダウン
症、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋
萎縮性脊髄側索硬化症、糖尿病性ニューロパシー等）、
（２）脳血管障害（例、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化に
伴う脳循環不全等）時、頭部外傷・脊髄損傷時、脳炎後
遺症時または脳性麻痺時の神経障害、（３）記憶障害
（例、老年期痴呆、健忘症等）、（４）軽度認知障害
（mild cognitive impairment（M.C.I.））または
（５）精神疾患（例、うつ病、恐慌性障害、精神分裂症
等）など、好ましくはアルツハイマー病の診断に用いる
ことができる。また、それらの抗体を用いて、本発明の
タンパク質を定量できるほか、組織染色等による検出を
行うこともできる。これらの目的には、抗体分子そのも
のを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆ
ａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。抗体はモ
ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト−マウス
キメラ抗体、ヒト抗体、遺伝子工学的に作製されたヒト
抗体でも構わない。ヒト抗体は、ヒトミエローマ細胞を
用いた細胞融合法やヒトイムノグロブリン遺伝子を導入
されたマウスに免疫し、そのマウスの免疫担当細胞をミ
エローマ細胞と細胞融合することにより作製できる（K.
Tomizuka et. Al. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 722-7
27, 2000）。遺伝子工学的に作製されたヒト抗体には、
Ｖ_H領域とＶ_L領域を架橋した単鎖抗体も含まれる。本発
明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に
制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例
えば、本発明のタンパク質量）に対応した抗体、抗原も
しくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段
により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用い
て作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いず
れの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、
競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好
適に用いられる。これら個々の免疫学的測定法を本発明
の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作
等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通
常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて
本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これ
らの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書等
を参照することができる。

【００５６】例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ
イ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Me
thods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techn
iques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techn
iques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techn
iques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techn
iques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 9
2(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Anti
bodiesand General Immunoassay Methods))、 同書 Vo
l. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカ
デミックプレス社発行)等を参照することができる。

【００５７】（５）本発明の抗体を含有する医薬 本発明のＡβ産生を亢進する作用を有するタンパク質の
活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、
当該タンパク質の発現過多に起因する疾患、例えば、
（１）神経変性疾患（例、老年期痴呆、アルツハイマー
病、ダウン症、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤ
コブ病、筋萎縮性脊髄側索硬化症、糖尿病性ニューロパ
シー等）、（２）脳血管障害（例、脳梗塞、脳出血、脳
動脈硬化に伴う脳循環不全等）時、頭部外傷・脊髄損傷
時、脳炎後遺症時または脳性麻痺時の神経障害、（３）
記憶障害（例、老年期痴呆、健忘症等）、（４）軽度認
知障害（mild cognitive impairment（M.C.I.））また
は（５）精神疾患（例、うつ病、恐慌性障害、精神分裂
症等）など、好ましくはアルツハイマー病の治療・予防
剤等の医薬として使用することができる。抗体はモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト−マウスキメ
ラ抗体、ヒト抗体、遺伝子工学的に作製されたヒト抗体
でも構わない。ヒト抗体は、ヒトミエローマ細胞を用い
た細胞融合法やヒトイムノグロブリン遺伝子を導入され
たマウスに免疫し、そのマウスの免疫担当細胞をミエロ
ーマ細胞と細胞融合することにより作製できる。遺伝子
工学的に作製されたヒト抗体には、Ｖ_H領域とＶ_L領域を
架橋した単鎖抗体も含まれる。

【００５８】（６）本発明のタンパク質のワクチン 本発明のタンパク質、それ自身、あるいはキャリアータ
ンパク質とともにワクチンとして免疫し、各種疾患、例
えば、（１）神経変性疾患（例、老年期痴呆、アルツハ
イマー病、ダウン症、パーキンソン病、クロイツフェル
ト・ヤコブ病、筋萎縮性脊髄側索硬化症、糖尿病性ニュ
ーロパシー等）、（２）脳血管障害（例、脳梗塞、脳出
血、脳動脈硬化に伴う脳循環不全等）時、頭部外傷・脊
髄損傷時、脳炎後遺症時または脳性麻痺時の神経障害、
（３）記憶障害（例、老年期痴呆、健忘症等）、（４）
軽度認知障害（mild cognitive impairment（M.C.
I.））または（５）精神疾患（例、うつ病、恐慌性障
害、精神分裂症等）など、好ましくはアルツハイマー病
の進展抑制剤あるいは治療剤として用いることができ
る。キャリアータンパク質としては、生体に対して安全
性が高ければどのようなキャリアータンパク質も用いる
ことが可能であるが、例えば、破傷風毒素などが用いら
れる。

【００５９】（７）本発明のタンパク質に関連した遺伝
子診断法 本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（プロモーター
領域、エクソン、イントロンを含む）またはｍＲＮＡの
性状に関する情報は、それらの異常（遺伝子異常）が見
出された場合、例えば、（１）神経変性疾患（例、老年
期痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン
病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性脊髄側索硬
化症、糖尿病性ニューロパシー等）、（２）脳血管障害
（例、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化に伴う脳循環不全
等）時、頭部外傷・脊髄損傷時、脳炎後遺症時または脳
性麻痺時の神経障害、（３）記憶障害（例、老年期痴
呆、健忘症等）、（４）軽度認知障害（mild cognitive
impairment（M.C.I.））または（５）精神疾患（例、
うつ病、恐慌性障害、精神分裂症等）など、好ましくは
アルツハイマー病に関連した該ＤＮＡまたは該ｍＲＮＡ
の損傷、突然変異、発現低下、コピー数の増加、発現過
多等の異常を検出することを具現化することになるの
で、遺伝子診断を行う際に有用である。ｍＲＮＡに関し
てはスプライスバリアントの発現増加や低下、或いはｍ
ＲＮＡエディティング（C. M. Niswender et.Al. Ann.
N. Y. Acad. Sci. 861, 38-48, 1998）による変異導入
も考慮される。また染色体上の座位に関する情報は本発
明のＤＮＡが関与する遺伝病の研究にも利用できる。本
発明のタンパク質をコードするＤＮＡを用いる上記の遺
伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼー
ションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomic
s），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロ
シージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceeding
s of the National Academy of Sciences of the Unite
d States of America），第８６巻，２７６６〜２７７
０頁（１９８９年）、ＤＮＡマイクロアレイ（サイエン
ス（Science），第２７０巻，４６７〜４７０頁（１９
９５年）、或いはその他の方法（実験医学１８巻１４
号、１８９４−１９０６頁、２０００年）等により実施
することができる。上記のいずれかの手法により該遺伝
子の発現増加或いは低下、ＤＮＡの突然変異が検出され
た場合は、各種疾病、例えば、（１）神経変性疾患
（例、老年期痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、パー
キンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性脊
髄側索硬化症、糖尿病性ニューロパシー等）、（２）脳
血管障害（例、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化に伴う脳循
環不全等）時、頭部外傷・脊髄損傷時、脳炎後遺症時ま
たは脳性麻痺時の神経障害、（３）記憶障害（例、老年
期痴呆、健忘症等）、（４）軽度認知障害（mild cogni
tive impairment（M.C.I.））または（５）精神疾患
（例、うつ病、恐慌性障害、精神分裂症等）など、好ま
しくはアルツハイマー病に関して罹り易いとか、上記疾
患である可能性が高い、等の診断を行うことができる。
特に近年、疾患関連遺伝子を探索する上で非常に重要な
ツールとしてＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphi
sms、一塩基多型）と呼ばれる多型マーカーが登場し、
疾患へのなり易さ（なり難い）を規定していたり、薬剤
に対する応答性の違い・副作用の違いにも影響するもの
としてにわかに注目を集めている。ＳＮＰｓのタイピン
グ法としては、その具体的な目的に応じて、直接塩基配
列決定法、Invader法、Sniper法、MALDI-TOF/MS法、オ
リゴＳＮＰチップ法などが挙げられる（実験医学１８巻
１２号、２０００年）。こうした手法により見出された
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（プロモーター
領域、エクソン、イントロンを含む）に存在するＳＮＰ
ｓは、それ自体単独で、或いは他の遺伝子上のＳＮＰｓ
や本発明のＤＮＡと併せて解析することにより、例え
ば、（１）神経変性疾患（例、老年期痴呆、アルツハイ
マー病、ダウン症、パーキンソン病、クロイツフェルト
・ヤコブ病、筋萎縮性脊髄側索硬化症、糖尿病性ニュー
ロパシー等）、（２）脳血管障害（例、脳梗塞、脳出
血、脳動脈硬化に伴う脳循環不全等）時、頭部外傷・脊
髄損傷時、脳炎後遺症時または脳性麻痺時の神経障害、
（３）記憶障害（例、老年期痴呆、健忘症等）、（４）
軽度認知障害（mild cognitive impairment（M.C.
I.））または（５）精神疾患（例、うつ病、恐慌性障
害、精神分裂症等）など、好ましくはアルツハイマー病
に対する罹りやすさの判定や発症時期の予測、或いは診
断に有用である。

【００６０】（８）本発明のタンパク質に関連したアン
チセンスＤＮＡを含有する医薬 Ａβ産生を亢進する本発明のＤＮＡまたはその一部と相
補的な塩基配列を含み、当該ＤＮＡに相補的に結合し、
当該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンス
ＤＮＡは、生体内における当該ＤＮＡまたはそれにコー
ドされるタンパク質の機能を抑制することができるの
で、例えば、Ａβ産生を亢進するタンパク質の発現過多
に起因する疾患、例えば、例えば、（１）神経変性疾患
（例、老年期痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、パー
キンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性脊
髄側索硬化症、糖尿病性ニューロパシー等）、（２）脳
血管障害（例、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化に伴う脳循
環不全等）時、頭部外傷・脊髄損傷時、脳炎後遺症時ま
たは脳性麻痺時の神経障害、（３）記憶障害（例、老年
期痴呆、健忘症等）、（４）軽度認知障害（mild cogni
tive impairment（M.C.I.））または（５）精神疾患
（例、うつ病、恐慌性障害、精神分裂症等）など、好ま
しくはアルツハイマー病の治療・予防剤として使用する
ことができる。例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あ
るいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター
等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投
与することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのま
まで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に
認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロ
ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に
投与することもできる。さらに、該アンチセンスＤＮＡ
は、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発
現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロー
ブとして使用することもできる。

【００６１】（９）ＤＮＡ導入動物を用いたアルツハイ
マー病の予防・治療薬の評価法 本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）または
その変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する
場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を用いたアルツハ
イマー病の予防・治療薬の評価法を提供する。すなわ
ち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその
変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト哺乳
動物がげっ歯動物である第（１)記載の動物、 （３）げっ歯動物がマウスまたはラットである第（２）
記載の動物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたは
その変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる
組換えベクターを提供するものである。本発明の外来性
ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物
（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受
精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞
等に対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生におけ
る胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精
卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カ
ルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集
法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン
法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等により目的とするＤＮ
Ａを導入することによって作出することができる。ま
た、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組
織細胞等に目的とする本発明の外来性ＤＮＡ導入し、細
胞培養、組織培養等に利用することもでき、さらに、こ
れら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融
合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出する
こともできる。

【００６２】非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、マウス、ラット等が用いられる。なか
でも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および
生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なげっ歯
動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６系統，ＤＢＡ２系統等、交雑系として、Ｂ６Ｃ３
Ｆ₁系統，ＢＤＦ₁系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ₁系統，ＢＡＬＢ／
ｃ系統，ＩＣＲ系統等）またはラット（例えば、Ｗｉｓ
ｔａｒ，ＳＤ等）等が好ましい。哺乳動物において発現
しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、
上記の非ヒト哺乳動物の他にヒト等が挙げられる。本発
明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有してい
る本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離
・抽出された本発明のＤＮＡをいう。本発明の変異ＤＮ
Ａとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例
えば、突然変異等）が生じたもの、具体的には、塩基の
付加、欠損、他の塩基への置換等が生じたＤＮＡ等が用
いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。該異常ＤＮＡと
しては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡ
を意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を
抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡ等が用いられ
る。本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あ
るいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよ
い。本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたって
は、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの
下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが
一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを導入
させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有す
る各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモ
ット、ハムスター、ラット、マウス等）由来のＤＮＡを
発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒト
ＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクター
等）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へ
マイクロインジェクションすることによって本発明のＤ
ＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳動物を作出することが
できる。

【００６３】本発明のタンパク質の発現ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージ等のバクテリオ
ファージ、モロニー白血病ウィルス等のレトロウィル
ス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルス等の動
物ウイルス等が用いられる。なかでも、大腸菌由来のプ
ラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプ
ラスミド等が好ましく用いられる。上記のＤＮＡ発現調
節を行うプロモーターとしては、例えば、ウイルス
（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロ
ニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポ
リオウイルス等）に由来するＤＮＡのプロモーター、
各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、ラット、マウス等）由来のプロモータ
ー、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキ
ンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリ
ン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク
質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来
成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラ
ーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タン
パク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒
石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム
利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般に
Ｔｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン
３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロ
フィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、
メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラ
スＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミ
ンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰ
Ｏ）、タンパク質鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βア
クチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１およ
び２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈ
ｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清
アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニ
ンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、
バソプレシン等のプロモーター等が用いられる。なかで
も、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイル
スプロモーター、ヒトタンパク質鎖延長因子１α（ＥＦ
−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチ
ンプロモーター等が好適である。

【００６４】上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物にお
いて目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般に
ターミネターと呼ばれる）を有していることが好まし
く、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各
ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミア
ンウィルスのＳＶ４０ターミネーター等が用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる
目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサ
ー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部等をプロモータ
ー領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間ある
いは翻訳領域の３'下流に連結することも目的により可
能である。該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤ
ＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流
および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常
のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。受精
卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対
象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在する
ように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞
において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作
出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のす
べてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味す
る。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の
子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外
来性ＤＮＡを有する。

【００６５】本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた非
ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持
することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階に
おける本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の
胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確
保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において
本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動
物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発
明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発
明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はそ
の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡ
を過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つ
ホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配す
ることによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するよ
うに繁殖継代することができる。本発明の正常ＤＮＡを
有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現
させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進する
ことにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症、
や、本発明のタンパク質が関連する疾患、例えばアルツ
ハイマー病あるいはアルツハイマー病様病態（例えば、
Ａβの脳内沈着、ＰＨＦ−タウ、神経細胞死など）を発
症することがあり、その病態モデル動物として利用する
ことができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物、
その組織およびその細胞を用いて、本発明のタンパク質
の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患、
例えばアルツハイマー病あるいはアルツハイマー病様病
態（例えば、Ａβの脳内沈着、ＰＨＦ−タウ、神経細胞
死など）の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方
法の検討を行うことが可能であり、さらに、アルツハイ
マー病の治療・予防薬のスクリーニング試験にも利用可
能である。

【００６６】一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保
持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とす
る外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科とし
て用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンス
トラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製する
ことができる。受精卵細胞段階における本発明の異常Ｄ
ＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の
全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出
動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在する
ことは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細
胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味す
る。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の
子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異
常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持
つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配
することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように
繁殖継代することができる。本発明の異常ＤＮＡを有す
る非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させ
られており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害すること
により最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応
症となることがあり、その病態モデル動物として利用す
ることができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動
物、その組織およびその細胞を用いて、本発明のタンパ
ク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの
疾患を治療方法の検討や治療薬スクリーニング試験にも
利用可能である。また、具体的な利用可能性としては、
本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質
の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質
による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative
作用）を解明するモデルとなる。本発明のタンパク質は
Ａβ産生に密接に関係しており、その発現亢進はＡβの
産生亢進に繋がっている。一方、この事実は、正常範囲
の発現量のタンパク質が、βＡＰＰやプレセニリンを含
有するγ−セクレターゼ複合体の生理的な役割にも関与
している可能性を示唆するものであり、本発明のタンパ
ク質の異常ＤＮＡ転移動物、およびその組織あるいは細
胞は、アルツハイマー病の治療・予防薬の検討に有用で
ある。

【００６７】また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動
物のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現された
本発明のタンパク質組織を分析することによる、本発明
のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化する本
発明のタンパク質との関連性についての解析、 ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異タンパク質の単離精製およびその抗体作
製等が考えられる。 さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症等を含む、本発明のタン
パク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、
また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓
器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治
療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研
究および治療に貢献することができる。

【００６８】また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器
を取り出し、細切後、トリプシン等のタンパク質分解酵
素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、その培養ま
たはその培養細胞の系統化を行うことが可能である。さ
らに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、Ａβ産
生、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、また
はそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異
常を調べること等ができ、本発明のタンパク質およびそ
の作用解明のための有効な研究材料となる。さらに、本
発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の
機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連
する疾患の治療薬の開発を行うために、上述の検査法お
よび定量法等を用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のス
クリーニング法を提供することが可能となる。また、本
発明のＤＮＡ導入動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現
ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患
のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。

【００６９】（１０）ノックアウト動物を用いたアルツ
ハイマー病の予防・治療薬の評価法 本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが不
活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のタ
ンパク質をコードするＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を
用いたアルツハイマー病の予防・治療薬の評価法を提供
する。以下、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを
略して本発明のＤＮＡと記載することがある。すなわ
ち、本発明は、（１）本発明のＤＮＡが不活性化された
非ヒト哺乳動物胚幹細胞、（２）該ＤＮＡがレポーター
遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子）を導入することにより不活性化された第（１）項記
載の胚幹細胞、（３）ネオマイシン耐性である第（１）
項記載の胚幹細胞、（４）非ヒト哺乳動物がげっ歯動物
である第（１）項記載の胚幹細胞、（５）げっ歯動物が
マウスである第（４）項記載の胚幹細胞、（６）本発明
のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物、（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌
由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することに
より不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮ
Ａに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）
項記載の非ヒト哺乳動物、（８）非ヒト哺乳動物がげっ
歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、（９）
げっ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳
動物、および（１０）第（７）項記載の動物に、試験化
合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出すること
を特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性
を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法を提供する。本発明のＤＮＡが不活性化された
非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有す
る本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、
該ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコ
ードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失
させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク
質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤ
ＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞
（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物
としては、前記と同様のものが用いられる。

【００７０】本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方
法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ
配列の一部または全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置
換させることによって行うことができる。これらの変異
により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プ
ロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することによ
り本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。本発
明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞
（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明
のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例として
は、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐
性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬
剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝
子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊する
か、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転
写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナ
ル等）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくするこ
とによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築した
ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティング
ベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該
動物細胞の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について
本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプロ
ーブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいは
ターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッテ
ィングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近
傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により
解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別すること
により得ることができる。

【００７１】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したもので
もよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般
的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学
的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で
免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得する等
の目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／
６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善し
たＢＤＦ₁マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２との
Ｆ₁）を用いて樹立したもの等も良好に用いうる。ＢＤ
Ｆ₁マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であると
いう利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つ
ので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウ
スを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配
（バッククロス）することでその遺伝的背景をＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い
得る。また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後
３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期
胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よ
く多数の初期胚を取得することができる。また、雌雄い
ずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の
方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、
煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌
雄の判別を行うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定
方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性
決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例と
して挙げることができる。この方法を使用すれば、従
来、核型分析をするのに約１０⁶個の細胞数を要してい
たのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０
個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セ
レクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、早期
に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間
は大幅に削減できる。

【００７２】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス
培養器内（好ましくは、約５％炭酸ガス、約９５％空気
または約５％酸素、約５％炭酸ガス、約９０％空気）で
約３７℃で培養する等の方法で培養し、継代時には、例
えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常約０.００１−
０.５％トリプシン／約０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ま
しくは約０.１％トリプシン／約１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理
により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に
播種する方法等がとられる。このような継代は、通常１
−３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的
に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄
することが望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、
高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形
成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、
心筋等の種々のタイプの細胞に分化させることが可能で
あり〔M. J. EvansおよびM. H. Kaufman, ネイチャー
（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschma
nら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・
エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、
1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発
明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明
のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍ
ＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発
現量を比較することにより、正常動物と区別することが
可能である。該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様の
ものが用いられる。

【００７３】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。

【００７４】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた動物個体も
該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常
の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さらに、生
殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。
すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配
することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に
持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザ
イゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモ
ザイゴート複数になるような状態で飼育することにより
効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌
雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモ
ザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代す
る。本発明のタンパク質のＤＮＡが不活性化された非ヒ
ト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のタンパク質のＤＮＡ発
現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用であ
る。また、本発明のタンパク質のＤＮＡ発現不全非ヒト
哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種
々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生
物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得る
ので、これらの疾病の原因究明および治療法の検討に有
用である。本発明のタンパク質はＡβ産生に密接に関係
しており、その発現亢進はＡβの産生亢進に繋がってい
る。一方、この事実は、正常範囲の発現量の本発明のタ
ンパク質が、βＡＰＰやプレセニリンを含有するγ−セ
クレターゼ複合体の生理的な役割にも関与している可能
性を示唆するものであり、本発明のタンパク質のＤＮＡ
発現不全非ヒト哺乳動物、およびその組織あるいは細胞
は、アルツハイマー病の治療・予防薬の検討に有用であ
る。

【００７５】（１０ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷な
どに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合
物のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予
防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることが
できる。すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を
観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠
損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を
有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。該スクリーニング方法において用いられる本発明
のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様
のものがあげられる。試験化合物としては、例えば、ペ
プチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合
物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。具
体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、
試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動
物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として
試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例え
ば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症
状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択すること
ができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試
験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができ
る。該スクリーニング方法において、試験動物に試験化
合物を投与した場合、アルツハイマー病の改善が見られ
た場合、該試験化合物をアルツハイマー病に対して治療
・予防効果を有する化合物として選択することができ
る。

【００７６】（１０ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモ
ーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニ
ング方法 本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法
において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物とし
ては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発
明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる
ものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様の
ものがあげられる。レポーター遺伝子としては、前記と
同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子
またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。本発明
のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本
発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在する
ので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレ
ースすることにより、プロモーターの活性を検出するこ
とができる。例えば、本発明のペプチドをコードするＤ
ＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明の
ペプチドの発現する組織で、本発明のペプチドの代わり
にβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラク
トピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダ
ーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡
便に本発明のペプチドの動物生体内における発現状態を
観察することができる。具体的には、本発明のペプチド
欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドな
どで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄
後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近
で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１
ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、
β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すれ
ばよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲ
ＮＡを検出してもよい。上記スクリーニング方法を用い
て得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物
から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーター活性を促進または阻害する化合物である。本
発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合
物またはその塩は、本発明のペプチドの発現を阻害し、
該ペプチドの機能を阻害することができるので、例えば
アルツハイマー病などの予防・治療剤などの医薬として
有用である。また、本発明のＤＮＡに対する抑制プロモ
ーターのプロモーター活性を促進する化合物またはその
塩は、本発明のペプチドの発現を抑制し、該ペプチドの
機能を抑制することができるので、例えばアルツハイマ
ー病などの予防・治療剤などの医薬として有用である。

【００７７】このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒ
ト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの
活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ
ーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発
現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療
薬の開発に大きく貢献することができる。また、本発明
のペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使っ
て、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連
結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランス
ジェニック動物（遺伝子導入動物）を作出すれば、特異
的にそのペプチドを合成させ、その生体での作用を検討
することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に
適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するよう
な細胞株を樹立すれば、本発明のペプチドそのものの体
内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を
持つ低分子化合物の探索系として使用できる。

【００７８】本発明のスクリーニング方法で得られた化
合物またはそれから誘導される化合物（以下、本発明の
スクリーニング方法で得られた化合物と略記する場合が
ある）は、塩を形成していてもよく、該化合物の塩とし
ては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）
や塩基（例アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわ
け生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な
塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、
臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、
酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コ
ハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香
酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等
が用いられる。本発明のスクリーニング方法で得られた
化合物、もしくはそれから誘導される化合物またはその
塩を含有する医薬は、それ自体または適当な医薬組成物
として投与することができる。上記投与に用いられる医
薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得
る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。か
かる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形とし
て提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組
成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤
（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆
粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、
シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成
物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通
常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するも
のである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳
糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用
いられる。また、例えば非経口投与に適する剤形として
は、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉注射
剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与剤、経
皮投与剤、軟膏剤など）、座剤（例、直腸剤、膣座剤な
ど）、徐放剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）、ペ
レット、点滴剤などが用いられる。

【００７９】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラ
ット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与すること
ができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例え
ば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を経口投与
する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）におい
ては、一日につき該化合物を約０.０１〜１０００ｍ
ｇ、好ましくは約０.１〜１０００ｍｇ、さらに好まし
くは約１．０〜２００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜
５０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合
物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異な
るが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物
を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する
場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【００８０】本発明のタンパク質に対するドミナントネ
ガテイブ体または本発明の抗体を含有する上記疾患の治
療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型
の医薬組成物として、哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウ
サギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対
して経口的または非経口的に投与することができる。投
与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によ
っても異なるが、例えば、本発明のドミナントネガテイ
ブ体や抗体を１回量として、通常０.００１〜２０ｍｇ
／ｋｇ体重程度、好ましくは０.０１〜１０ｍｇ／ｋｇ
体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重
程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程
度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非
経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与
することができる。症状が特に重い場合には、その症状
に応じて増量してもよい。本発明のタンパク質に対する
ドミナントネガテイブ体または本発明の抗体を含有する
医薬は、前記のスクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬と同様にして製造することが
できる。本発明のドミナントネガテイブ体をコードする
ＤＮＡまたは本発明のアンチセンスＤＮＡを含有する医
薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどに
より差異はあるが、例えば、本発明のアンチセンスＤＮ
Ａを吸入剤として気管内に局所投与する場合、一般的に
成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチ
センスＤＮＡを約０．１〜１００ｍｇ投与する。本発明
のドミナントネガテイブ体をコードするＤＮＡまたは本
発明のアンチセンスＤＮＡを含有する医薬は、前記のス
クリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有
する医薬と同様にして製造することができる。

【００８１】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission o
n Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００８２】 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｈｓｅ ：ホモセリン

【００８３】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ₂−Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００８４】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号：１］本発明のＡβの産生を制御するタンパ
ク質Ａのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２］本発明のＡβの産生を制御するタンパ
ク質Ｂのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：３］本発明のＡβの産生を制御するタンパ
ク質Ｃのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：４］本発明のＡβの産生を制御するタンパ
ク質Ａの塩基配列を示す。 ［配列番号：５］本発明のＡβの産生を制御するタンパ
ク質Ｂの塩基配列を示す。 ［配列番号：６］本発明のＡβの産生を制御するタンパ
ク質Ｃの塩基配列を示す。 ［配列番号：７］実施例１で用いられたＡβのＮ末端か
らγ−セクレターゼ切断部位を含むＡＰＰ細胞膜領域ま
でのＡＰＰフラグメントのＮ末端にメチオニンを付加し
たＣ５３のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：８］実施例１で用いられたプライマーの塩
基配列を示す。 ［配列番号：９］実施例１で用いられたプライマーの塩
基配列を示す。 ［配列番号：１０］実施例１で用いられたマウスNotch
1の細胞内ドメイン(NICD)のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１１］実施例１で用いられたプライマーの
塩基配列を示す。 ［配列番号：１２］実施例１で用いられたプライマーの
塩基配列を示す。 ［配列番号：１３］実施例１で用いられたＤＮＡオリゴ
マーの塩基配列を示す。 ［配列番号：１４］実施例１で用いられたＤＮＡオリゴ
マーの塩基配列を示す。 ［配列番号：１５］実施例２記載のＨＥＳ−１プロモー
ターの塩基配列を示す。 ［配列番号：１６］実施例６で用いられたプライマーの
塩基配列を示す。 ［配列番号：１７］実施例６で用いられたプライマーの
塩基配列を示す。 ［配列番号：１８］Ａβ４０のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１９］Ａβ４２のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２０］Ａβ５２のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２１］全長５−リポキシゲナーゼｃＤＮＡ
の塩基配列を示す。 ［配列番号：２２］全長５−リポキシゲナーゼのアミノ
酸配列を示す。 ［配列番号：２３］実施例７で用いられたＰＣＲ産物１
を増幅するためのセンスプライマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：２４］実施例７で用いられたＰＣＲ産物１
を増幅するためのアンチセンスプライマーの塩基配列を
示す。 ［配列番号：２５］実施例７で用いられたＰＣＲ産物２
を増幅するためのセンスプライマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：２６］実施例７で用いられたＰＣＲ産物１
を増幅するためのアンチセンスプライマーの塩基配列を
示す。

【００８５】後述の実施例１で得られたプラスミドをpC
xNC53NICDを保持する形質転換体エシェリヒア・コリ（E
scherichia coli）DH5α/pCxNC53NICDは、２００１年７
月２６日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第
６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技
術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７６７６として寄託され、さらに、２００１年
６月１９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７
番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発
酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６６５１とし
て寄託されている。後述の実施例２で得られたプラスミ
ドpHESpacを保持する形質転換体エシェリヒア・コリ（E
scherichia coli）DH5α/pHESpacは、２００１年７月２
６日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術
総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７６７７として寄託され、さらに、２００１年６
月１９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番
８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵
研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６６５２として
寄託されている。

【００８６】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・
クローニング（Molecular cloning）に記載されている
方法に従った。

【００８７】実施例１ キメラタンパク質C53NICDをコ
ードするＤＮＡの作製 ＡβのＮ末端からγ−セクレターゼ切断部位を含むＡＰ
Ｐ細胞膜領域までのＡＰＰフラグメントのＮ末端にメチ
オニンを付加したＣ５３（配列番号：７）をコードする
ＤＮＡをヒトＡＰＰ ｃＤＮＡ（Kang J. et al., Natur
e 32, 733-736,1987）を鋳型にＰＣＲ法により作製し
た。配列番号：８で示したオリゴＤＮＡ（ATCTGGTACCCC
ACCATGGATGCAGAATTCCGACATGAC）をセンス鎖プライマー
として、配列番号：９で表されるオリゴＤＮＡ（GCTTCT
AGACAGCATCACCAAGGTGATGACGAT）をアンチセンス鎖プラ
イマーとして用いた。その際、マウスNotch 1の細胞内
ドメイン(NICD)（配列番号：１０）をコードするＤＮＡ
断片とのキメラＤＮＡを調製するため、５'側に、Ｋｐ
ｎＩ部位、３'側にＸｂａＩ部位を導入した。NICDをコ
ードするＤＮＡ断片は、マウスNotch 1 cDNA（Amo FF e
t al.,Genomics 15, 259-264, 1993）を鋳型にＰＣＲ法
により以下の方法で調製した。まず、配列番号：１１で
示したオリゴＤＮＡ（CTGTCTAGAAAGCGCCGGCGCCAGCATGGC
CAG）をセンス鎖プライマー、配列番号：１２で表され
るオリゴＤＮＡ（ATTGTTCACCGCGGCCGCCCAATG）をアンチ
センス鎖プライマーとしてＰＣＲ法を行うことにより、
NICDのＮ末端からＣ端側の途中までをコードする短いＤ
ＮＡ断片（928bp）を調製した。この断片は、５'側に人
工的にＸｂａＩ部位を付加しており、また、３'側には
マウスNotch 1 cDNA配列由来のＮｏｔＩ部位を含んでい
る。次に、これにＣ５３をコードするＤＮＡ断片をＸｂ
ａＩでつなげ、このキメラＤＮＡ断片を、あらかじめＫ
ｐｎＩとＮｏｔＩ部位を導入したpCxN（Niwa H etal.,
Gene 108:193, 1991）に、この部位で挿入した。これに
より、Ｃ５３およびNICD Ｃ端側の途中までをコードを
キメラＤＮＡを含むプラスミド、pCxNC53NICD△Cを調製
した。次に、完全長のNICDをコードするＤＮＡ断片を調
製するため、あらかじめクローニングしたNICDコード領
域を含むマウスNotch 1 cDNA Ssp I-Hind III 断片よ
り、ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を調製し、これをp
CxNC53NICD△CのＮｏｔＩ部位に挿入した。これによ
り、C53NICDをコードするキメラＤＮＡが調製され、こ
のキメラＤＮＡを含むプラスミドをpCxNC53NICDと命名
した。なお、ベクターとして用いたpCxN（Niwa H et a
l., Gene 108:193, 1991）は、β−actinのプロモータ
-、ネオマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドである
が、pCxNC53NICDを調製するため、pCxNのＥｃｏＲＩ部
位に配列番号：１３および配列番号：１４のＤＮＡオリ
ゴマー（配列番号１３：5'-AATTCGGTACCCCCGGGGCGGCCGC
CTCGAGGA- 3'、配列番号１４： 3'-GCCATGGGGGCCCCGCCG
GCGGAGCTCCTTTAA-5'）を挿入することにより、新たにＫ
ｐｎＩとＮｏｔＩ部位を導入して使用した。

【００８８】実施例２ ＨＥＳ−１をプロモーターとす
るピューロマイシン耐性遺伝子（pac:puromycin-N-acet
yl-transferase gene）の作製 ＨＥＳ１プロモーター(配列番号：１５)（Takebayashi
K., et al. J Biol Chem .269(7):5150-6, 1994）は、
マウス染色体を鋳型とし、ＰＣＲ法でＫｐｎＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位を付加し増幅し調製した。次に、これを、
ベクターPGV-B（東洋ビーネット株式会社より購入。TOY
O B-Net Co., LTD）のＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位に
挿入した。このプラスミドをpGV-B-HES-1と命名した。
一方、ピューロマイシン耐性遺伝子は、pPUR(クローン
テック社)より、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ
でピューロマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断片
を切り出し調製した。このＤＮＡ断片をpGV-B-HES-1の
ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位に挿入し、完成したプ
ラスミドをpHESpacと命名した。

【００８９】実施例３ ピューロマイシン耐性遺伝子お
よびC53NICDcDNA（およびヒトヒトプレセニリン１ｃＤ
ＮＡ）を恒常的に発現する細胞株：A5-9細胞（およびA5
-9-PS1）の樹立 マウスpro-B細胞由来の細胞株、BaF/3細胞（Palacios,
R., et al., Cell 41:727, 1985）に上記の構築したプ
ラスミドをエレクトロポレーション法により遺伝子導入
した。細胞はネオマイシンおよびピューロマイシン耐性
を指標に選択した。得られた形質変換体をA5-9細胞と命
名した。さらに、A5-9細胞にヒトプレセニリン１ｃＤＮ
Ａを導入した。ヒトプレセニリン１ｃＤＮＡは、ヒト脳
より調製したｃＤＮＡよりＰＣＲ法で調製し（Sudoh,
S. et al., J. Neurochem. 71:1535, 1998）、ＳＲαプ
ロモーター（Takebe,Y., Mol. Cell. Biol. 8:466, 198
8）とハイグロマイシン耐性遺伝子をもつベクターに挿
入したのち、エレクトロポレーション法によりA5-9細胞
に遺伝子導入した。細胞はハイグロマイシン耐性を指標
に選択した。得られた形質変換体をA5-9-PS1細胞と命名
した。

【００９０】実施例４ ヒトｃＤＮＡライブラリーの作
製とA5-9あるいはA5-9-PS1細胞へのトランスフェクショ
ン ヒトｃＤＮＡライブラリーは、ヒト海馬由来のｍＲＮＡ
（クローンテック社）より、ギブコ社から市販されてい
るｃＤＮＡ合成キット（SuperScriptTM Choicesystem）
を用いてｃＤＮＡを合成し調製した。得られたｃＤＮＡ
は、BstX Iアダプター（インビトロゲン社）を付け、
レトロウイルスベクター、pMX（Onishi,M. et al., Ex
p. Hematol. 24:324, 1996）のBstXI部位に導入した。
このライブラリーをパッケージング細胞 Phnenix-Eco
細胞にトランスフェクトし、ヒトｃＤＮＡライブラリー
を含むウイルスを産生させた（Xu X. et al., Nature G
enetics. 27:23-29, 2001; Hitoshi Y. et al., Immuni
ty. 8:461-471, 1998 ）。このウイルスを既に報告され
ている方法にしたがい（Kitamura, K. et al., Proc.Na
tl. Acad. Sci., 92:9146, 1995）A5-9細胞あるいはA5-
9-PS1細胞（それぞれ4X10⁶細胞数）に感染させた。感染
効率は、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを同時に感染させ
て、ＧＦＰを発現している細胞の蛍光で解析した結果、
ほぼ２５％であった。

【００９１】実施例５ Ａβ産生を上げる細胞の選択 上記実施例４記載の、レトロウイルスによる感染により
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを遺伝子導入されたA5-9
細胞あるいはA5-9-PS1細胞を、高濃度のピューロマイシ
ン(A5-9細胞, 25μg/ml；A5-9-PS1細胞, 9μg/ml)存在
下で培養することにより、ピューロマイシン耐性能を獲
得した細胞を選択した。用いたピューロマイシン濃度
は、親株であるA5-9細胞およびA5-9-PS1細胞が死滅する
ピューロマイシン最低濃度が、それぞれ20μg/ml およ
び5μg/mlであることから決定した。次に、それらの細
胞が産生するＡβを、高感度ウエスタンブロッティング
法(IdaN. et al., J. Biol. Chem. 271:22908, 1996)を
用いて測定した。即ち、Ａβの検出は、３日間の培養
（初期細胞濃度2X10⁵細胞/ml、3ml培地）で培地に分泌
されるＡβを抗Ａβモノクローナル抗体6E10で免疫沈降
し、その沈降物を抗Ａβ抗体を用いる高感度ウエスタン
ブロッティング法で検出した。Ａβ産生量の比較は、ウ
エスタンブロッティング法で検出されるＡβのバンドの
強度を親株の産生するＡβ量と比較して判定した。結果
を表１に示す。ＰＳ１を過剰発現していないA5-9細胞で
は、１６クローンのピューロマイシン耐性細胞が、ま
た、ＰＳ１を過剰発現しているA5-9-PS1細胞では、２回
のトランスフェクションの結果、合計約６０クローンの
ピューロマイシン耐性細胞が得られた。それらのうち、
A5-9細胞では５クローンが、A5-9-PS1では、２５クロー
ンがＡβ４０の産生を上げていることがわかった（表
１）。

【００９２】実施例６ Ａβ産生を上げるｃＤＮＡの同
定 上記実施例５で選択されたＡβ産生をあげるクローンか
ら、ヒト海馬由来ｃＤＮＡをウイルスベクター、pMXの
部位をプライマー（センス鎖プライマー、配列番号：１
６；GGTGGACCATCCTCTAGACTG；アンチセンス鎖プライマ
ー、配列番号：１７；GTTACTTAAGCTAGCTTGCC）としてＰ
ＣＲ法により同定した。) ＰＣＲ法により得られたｃＤ
ＮＡを、ベクターpcDNA3（インビトロゲン社）につな
ぎ、ＡＰＰおよびＰＳ１を過剰発現させたHEK２９３細
胞（Tomita S., et al., J. Biol. Chem. 273: 19304-1
9310, 1998; Tomita S., et al., J. Biol. Chem. 275:
13056-13060, 2000）４×１０⁵細胞にトランスフェク
トした。１日後に、新しい培地に変え、２４時間培養し
たのち、培地中に分泌されたＡβ量を、ＥＬＩＳＡ法
（Asami-Odaka, A. et al., 34:10272, 1995）で測定し
た。これまでに３種類のヒト海馬由来ｃＤＮＡがＡβ産
生量を高めることを見出した（表２）。その一つは、Ge
nbankに登録されているヒトｃＤＮＡ（accession No. A
AH06223）と同一のものであった。以下、本発明ではこ
のｃＤＮＡを遺伝子Ａ（配列番号：４）とし、そのコー
ドするタンパク質をタンパク質Ａ（配列番号：１）とす
る。遺伝子Ａは機能不明なタンパク質をコードするマウ
スｃＤＮＡとしてGenbankに登録されているｃＤＮＡ（a
ccession No. AK003241）と極めて高い相同性を示し
た。さらに、遺伝子Ａはニワトリからsyndecan-4と結合
するタンパク質として酵母two-hybrid法によって同定さ
れたSyndesmos（Baciu P.C., et al. J. Cell Science
113, 315, 2000; accession no. AF095446）とも高い相
同性を示した。他のＡβ産生を制御する遺伝子として見
出されたものは、小胞体に局在し、小胞体ストレスでそ
の発現が誘導されるが機能の不明なタンパク質であるHe
rp（（Kokame K. etal. J. Biol. Chem. 275: 3286, 20
00; accession no. AB034989）（ｃＤＮＡ：配列番号：
５、タンパク質：配列番号：２）であった。さらに、他
のＡβ産生を制御する遺伝子として見出されたものは、
５−リポキシゲナーゼ(accessionno. XM 005818)のＮ末
端１から３８９個の途中配列を含むｃＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ：配列番号：６、タンパク質：配列番号：３）であっ
た。これらの結果から、上記３種類の遺伝子およびその
産物は、アルツハイマー病の発症あるいは進展に関与す
ると考えられる。

【００９３】

【表１】

【００９４】

【表２】

【００９５】実施例７ また、実施例６のスクリーニングによって得られた５−
リポシゲナーゼの部分ｃＤＮＡ配列（配列番号：６）に
ついても、全長５−リポシゲナーゼ（ｃＤＮＡを配列番
号：２１で、アミノ酸配列を配列番号：２２で示す）を
実施例４記載のヒト海馬由来のｃＤＮＡライブラリーよ
り下記のようにＰＣＲ法により調製した。すなわち、Ｐ
ＣＲ産物１（ＥｃｏＲＩ部位を付加したセンスプライマ
ー CGGAATTCCGCGCCATGCCCTCCTACACG（配列番号：２
３）；アンチセンスプライマー CCCCGCATGCCGTACACGTA
GACA（配列番号：２４））とＰＣＲ産物２（ＳａｌＩ部
位を付加したセンスプライマー TGTCTACGTGTACGGCATGC
GGGG（配列番号：２５）;アンチセンスプライマー GCG
TCGACCTGGCTGGGGCAGCTGGCCTTCCC（配列番号：２６））
をそれぞれヒト海馬由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型
としてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲにより得られた
二つのＰＣＲ産物をＳｐｈＩ部位でのライゲーションに
より全長５−リポシゲナーゼｃＤＮＡを調製した。この
全長５−リポキシゲナーゼｃＤＮＡを用いてＡβの産生
への影響を解析した。この結果を表３に示した。表３に
おいてコントロール（対照）は、ウイルスベクター（ｐ
ＭＸ：実施例４記載）だけをトランスフェクトさせた細
胞を示している。不死化したマウス線維芽細胞２×１０
⁵をヒトＡＰＰ ｃＤＮＡとともに、上記ｃＤＮＡをレト
ロウイルスによる感染により細胞内にトランスフェクト
させ（実施例４記載）、１日後に新しい培地に変え、４
日間の培地中に分泌されたＡβ量を、ＥＬＩＳＡ法で測
定した。Ａβ産生増加率は、対照と比べての増加率で示
した。値は、３サンプルの平均値を示した。

【００９６】

【表３】

【００９７】

【発明の効果】本発明によって、Ａβの産生を制御する
遺伝子のスクリーニング方法が提供され、アルツハイマ
ー病関連遺伝子あるいはアルツハイマー病関連候補遺伝
子が提供される。それらの遺伝子、それらの遺伝子と特
異的にハイブリダイズするヌクレオチド、それらの遺伝
子を含有する組換えベクターによる形質変換体、それら
のｃＤＮＡがコードするタンパク質、あるいは該タンパ
ク質に対する抗体を用いたアルツハイマー病の診断方
法、治療方法および予防方法が提供される。さらに、そ
れらの遺伝子、それらの遺伝子と特異的にハイブリダイ
ズするヌクレオチド、それらの遺伝子を含有する組換え
ベクターによる形質変換体、それらのｃＤＮＡがコード
するタンパク質、あるいは該タンパク質に対する抗体を
用いたＡβ産生阻害剤のスクリーニング方法、そのスク
リーニング法より得られたＡβ産生阻害剤、さらにその
Ａβ産生阻害剤を用いたアルツハイマー病の診断方法、
治療方法および予防方法が提供される。

【００９８】

【配列表】 ［Sequence Listing］ <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> A Method For Screening A Gene Related To Alzheimer's Disease <130> P01-0277A <150> JP 2001-266510 <151> 2001-07-31 <150> JP 2002-25878 <151> 2002-02-01 <160> 26 <210> 1 <211> 211 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ser Thr Ala Ala Val Pro Glu Leu Lys Gln Ile Ser Arg Val Glu 1 5 10 15 Ala Met Arg Leu Gly Pro Gly Trp Ser His Ser Cys His Ala Met Leu 20 25 30 Tyr Ala Ala Asn Pro Gly Gln Leu Phe Gly Arg Ile Pro Met Arg Phe 35 40 45 Ser Val Leu Met Gln Met Arg Phe Asp Gly Leu Leu Gly Phe Pro Gly 50 55 60 Gly Phe Val Asp Arg Arg Phe Trp Ser Leu Glu Asp Gly Leu Asn Arg 65 70 75 80 Val Leu Gly Leu Gly Leu Gly Cys Leu Arg Leu Thr Glu Ala Asp Tyr 85 90 95 Leu Ser Ser His Leu Thr Glu Gly Pro His Arg Val Val Ala His Leu 100 105 110 Tyr Ala Arg Gln Leu Thr Leu Glu Gln Leu His Ala Val Glu Ile Ser 115 120 125 Ala Val His Ser Arg Asp His Gly Leu Glu Val Leu Gly Leu Val Arg 130 135 140 Val Pro Leu Tyr Thr Gln Lys Asp Arg Val Gly Gly Phe Pro Asn Phe 145 150 155 160 Leu Ser Asn Ala Phe Val Ser Thr Ala Lys Cys Gln Leu Leu Phe Ala 165 170 175 Leu Lys Val Leu Asn Met Met Pro Glu Glu Lys Leu Val Glu Ala Leu 180 185 190 Ala Ala Ala Thr Glu Lys Gln Lys Lys Ala Leu Glu Lys Leu Leu Pro 195 200 205 Ala Ser Ser 210 <210> 2 <211> 391 <212> PRT <213> Human <400> 2 Met Glu Ser Glu Thr Glu Pro Glu Pro Val Thr Leu Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Pro Asn Gln Arg His Arg Asp Leu Glu Leu Ser Gly Asp Arg Gly Trp 20 25 30 Ser Val Gly His Leu Lys Ala His Leu Ser Arg Val Tyr Pro Glu Arg 35 40 45 Pro Arg Pro Glu Asp Gln Arg Leu Ile Tyr Ser Gly Lys Leu Leu Leu 50 55 60 Asp His Gln Cys Leu Arg Asp Leu Leu Pro Lys Gln Glu Lys Arg His 65 70 75 80 Val Leu His Leu Val Cys Asn Val Lys Ser Pro Ser Lys Met Pro Glu 85 90 95 Ile Asn Ala Lys Val Ala Glu Ser Thr Glu Glu Pro Ala Gly Ser Asn 100 105 110 Arg Gly Gln Tyr Pro Glu Asp Ser Ser Ser Asp Gly Leu Arg Gln Arg 115 120 125 Glu Val Leu Arg Asn Leu Ser Ser Pro Gly Trp Glu Asn Ile Ser Arg 130 135 140 Pro Glu Ala Ala Gln Gln Ala Phe Gln Gly Leu Gly Pro Gly Phe Ser 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Pro Tyr Gly Trp Leu Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Ile 165 170 175 Tyr Ala Arg Gln Tyr Tyr Met Gln Tyr Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ser 180 185 190 Gly Ala Phe Val Pro Pro Pro Ser Ala Gln Glu Ile Pro Val Val Ser 195 200 205 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ile His Asn Gln Phe Pro Ala Glu Asn Gln 210 215 220 Pro Ala Asn Gln Asn Ala Ala Pro Gln Val Val Val Asn Pro Gly Ala 225 230 235 240 Asn Gln Asn Leu Arg Met Asn Ala Gln Gly Gly Pro Ile Val Glu Glu 245 250 255 Asp Asp Glu Ile Asn Arg Asp Trp Leu Asp Trp Thr Tyr Ser Ala Ala 260 265 270 Thr Phe Ser Val Phe Leu Ser Ile Leu Tyr Phe Tyr Ser Ser Leu Ser 275 280 285 Arg Phe Leu Met Val Met Gly Ala Thr Val Val Met Tyr Leu His His 290 295 300 Val Gly Trp Phe Pro Phe Arg Pro Arg Pro Val Gln Asn Phe Pro Asn 305 310 315 320 Asp Gly Pro Pro Pro Asp Val Val Asn Gln Asp Pro Asn Asn Asn Leu 325 330 335 Gln Glu Gly Thr Asp Pro Glu Thr Glu Asp Pro Asn His Leu Pro Pro 340 345 350 Asp Arg 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Gly Asp Val Glu Val Val Leu 100 105 110 Arg Asp Gly Arg Ala Lys Leu Ala Arg Asp Asp Gln Ile His Ile Leu 115 120 125 Lys Gln His Arg Arg Lys Glu Leu Glu thr Arg Gln Lys Gln Tyr Arg 130 135 140 Trp Met Glu Trp Asn Pro Gly Phe Pro Leu Ser Ile Asp Ala Lys Cys 145 150 155 160 His Lys Asp Leu Pro Arg Asp Ile Gln Phe Asp Ser Glu Lys Gly Val 165 170 175 Asp Phe Val Leu Asn Tyr Ser Lys Ala Met Glu Asn Leu Phe Ile Asn 180 185 190 Arg Phe Met His Met Phe Gln Ser Ser trp Asn Asp Phe Ala Asp Phe 195 200 205 Glu Lys Ile Phe Val Lys Ile Ser Asn Thr Ile Ser Glu Arg Val Met 210 215 220 Asn His trp Gln Glu Asp Leu Met Phe Gly Tyr Gln Phe Leu Asn Gly 225 230 235 Cys Asn Pro Val Leu Ile Arg Arg Cys Thr Glu Leu Pro Glu Lys Leu 240 245 250 Pro Val Thr Thr Glu Met Val Glu Cys Ser Leu Glu Arg Gln Leu Ser 255 260 265 270 Leu Glu Gln Glu Val Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ile Val Asp Phe Glu 275 280 285 Leu Leu Asp Gly Ile Asp Ala Asn Lys Thr Asp Pro Cys Thr Leu Gln 290 295 300 Phe Leu Ala Ala Pro Ile Cys Leu Leu Tyr Lys Asn Leu Ala Asn Lys 305 310 315 Ile Val Pro Ile Ala Ile Gln Leu Asn Gln Ile Pro Gly Asp Glu Asn 320 325 330 Pro Ile Phe Leu Pro Ser Asp Ala Lys Tyr Asp trp Leu Leu Ala Lys 335 340 345 350 Ile trp Val Arg Ser Ser Asp Phe His Val His Gln Thr Ile Thr His 355 360 365 Leu Leu Arg Thr His Leu Val Ser Glu Val Phe Gly Ile Ala Met Tyr 370 375 380 Arg Gln Leu Pro Ala Val His Pro Ile Phe Lys Leu Leu Val Ala His 385 390 395 Val Arg Phe Thr Ile Ala Ile Asn Thr Lys Ala Arg Glu Gln Leu Ile 400 405 410 Cys Glu Cys Gly Leu Phe Asp Lys Ala Asn Ala Thr Gly Gly Gly Gly 415 420 425 430 His Val Gln Met Val Gln Arg Ala Met Lys Asp Leu Thr Tyr Ala Ser 435 440 445 Leu Cys Phe Pro Glu Ala Ile Lys Ala Arg Gly Met Glu Ser Lys Glu 450 455 460 Asp Ile Pro Tyr Tyr Phe Tyr Arg Asp Asp Gly Leu Leu Val Trp Glu 465 470 475 Ala Ile Arg Thr Phe Thr Ala Glu Val Val Asp Ile Tyr Tyr Glu Gly 480 485 490 Asp Gln Val Val Glu Glu Asp Pro Glu Leu Gln Asp Phe Val Asn Asp 495 500 505 510 Val Tyr Val Tyr Gly Met Arg Gly Arg Lys Ser Ser Gly Phe Pro Lys 515 520 525 Ser Val Lys Ser Arg Glu Gln Leu Ser Glu Tyr Leu Thr Val Val Ile 530 535 540 Phe Thr Ala Ser Ala Gln His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gln Tyr Asp 545 550 555 Trp Cys Ser Trp Ile Pro Asn Ala Pro Pro Thr Met Arg Ala Pro Pro 560 565 570 Pro Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Ile Glu Gln Ile Val Asp Thr Leu 575 580 585 590 Pro Asp Arg Gly Arg Ser Cys Trp His Leu Gly Ala Val Trp Ala Leu 595 600 605 Ser Gln Phe Gln Glu Asn Glu Leu Phe Leu Gly Met Tyr Pro Glu Glu 610 615 620 His Phe Ile Glu Lys Pro Val Lys Glu Ala Met Ala Arg Phe Arg Lys 625 630 635 Asn Leu Glu Ala Ile Val Ser Val Ile Ala Glu Arg Asn Lys Lys Lys 640 645 650 Gln Leu Pro Tyr Tyr Tyr Leu Ser Pro Asp Arg Ile Pro Asn Ser Val 655 660 665 670 Ala Ile 673 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 23 cggaattccg cgccatgccc tcctacacg 29 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 24 ccccgcatgc cgtacacgta gaca 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 25 tgtctacgtg tacggcatgc gggg 24 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 26 gcgtcgacct ggctggggca gctggccttc cc 32

【図面の簡単な説明】

【図１】γ−セクレターゼによってC53NICDキメラ蛋白
から遊離したNotch転写因子領域によるピューロマイシ
ン耐性遺伝子の発現を調べる概略図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 25/28 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 25/28 43/00 １１１ ４Ｃ０８５ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 ４Ｈ０４５ 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (72)発明者 駒野 宏人 愛知県刈谷市山池町４丁目612番地 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA13 BB03 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB04 FB07 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 FA02 FA10 GA11 HA12 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ13 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA161 ZA162 ZC022 4C085 AA13 AA14 BB11 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA16 ZC02 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA21 EA50 FA72 FA74

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミロイドβタンパク質（Ａβ）の前駆
   体タンパク質（βＡＰＰ）フラグメントからのＡβの産
   生が促進されることにより選択マーカー遺伝子の発現が
   亢進するよう設計された細胞株に、ＤＮＡライブラリー
   を導入し、Ａβの産生が亢進している細胞の導入ＤＮＡ
   クローンを同定することを特徴とするＡβの産生を制御
   するＤＮＡのスクリーニング方法。
2. 【請求項２】 Ａβの産生を制御するＤＮＡがヒトｃＤ
   ＮＡである請求項１記載のスクリーニング方法。
3. 【請求項３】 Ａβの産生を制御するＤＮＡがヒト染色
   体ＤＮＡである請求項１記載のスクリーニング方法。
4. 【請求項４】 該細胞株が、（１）βＡＰＰのγ−セク
   レターゼ切断部位を含むβＡＰＰフラグメントと転写促
   進因子との融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベ
   クターと（２）転写促進因子の転写活性により選択マー
   カー遺伝子の転写が惹起されるようにプロモーターの下
   流に選択マーカー遺伝子を結合させたＤＮＡを含むベク
   ターとで形質転換された形質転換体である請求項１記載
   のスクリーニング方法。
5. 【請求項５】 細胞株が、（１）βＡＰＰのγ−セクレ
   ターゼ切断部位を含むβＡＰＰフラグメントとNotchの
   Ｃ端側転写因子領域との融合タンパク質（CAPP-NICD）
   をコードするＤＮＡを含むベクターと（２）Notchの転
   写活性により薬剤耐性遺伝子の転写が惹起されるように
   ＨＥＳ−１プロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子を結合
   させたＤＮＡを含むベクターとで形質転換された形質転
   換体である請求項１記載のスクリーニング方法。
6. 【請求項６】 細胞株が融合タンパク質と選択マーカー
   を共発現する請求項４または５記載のスクリーニング方
   法。
7. 【請求項７】 請求項１記載のスクリーニング方法によ
   り得られうるアミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生を
   制御するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイ
   ブリダイズするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
8. 【請求項８】 Ａβの産生を制御するＤＮＡがヒトｃＤ
   ＮＡである請求項７記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 Ａβの産生を制御するＤＮＡがヒト染色
   体ＤＮＡである請求項７記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 アルツハイマー病に関連する請求項７
    記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 Ａβの産生を亢進するＤＮＡである請
    求項７記載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 Ａβの産生を亢進するＤＮＡが、配列
    番号：４で表わされる塩基配列を含有するヒトｃＤＮＡ
    （Genbank accession No. AAH06223）をコードするＤＮ
    Ａである請求項１１記載のＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 Ａβの産生を亢進するＤＮＡが、配列
    番号：５で表わされる塩基配列を含有するヒトHerp（Ge
    nbank accession No. AB034989）をコードするＤＮＡで
    ある請求項１１記載のＤＮＡ。
14. 【請求項１４】 Ａβの産生を促進するＤＮＡが、配列
    番号：６で表わされる塩基配列を含有するヒト５−リポ
    キシゲナーゼ（Genbank accession no. XM 005818）の
    部分配列をコードするＤＮＡである請求項１１記載のＤ
    ＮＡ。
15. 【請求項１５】 Ａβの産生を促進するＤＮＡが、配列
    番号：２１で表わされる塩基配列を含有するヒト５−リ
    ポキシゲナーゼの全長配列をコードするＤＮＡである請
    求項１１記載のＤＮＡ。
16. 【請求項１６】 請求項７記載のＤＮＡを含有する組換
    えベクター。
17. 【請求項１７】 請求項１６記載の組換えベクターで形
    質転換された形質転換体。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載の形質転換体を培養
    し、請求項７記載のＤＮＡにコードされるペプチドまた
    はタンパク質を生成せしめることを特徴とする請求項７
    記載のＤＮＡにコードされるペプチドもしくはタンパク
    質またはその塩の製造法。
19. 【請求項１９】 請求項７記載のＤＮＡまたはその一部
    を含有してなる診断剤。
20. 【請求項２０】 アルツハイマー病の診断剤である請求
    項１９記載の診断剤。
21. 【請求項２１】 請求項７記載のＤＮＡを用いることを
    特徴とするアルツハイマー病の診断方法。
22. 【請求項２２】 請求項７記載のＤＮＡを用いることを
    特徴とする請求項７記載のＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ
    ｓ）を検出する方法。
23. 【請求項２３】 アルツハイマー病患者の請求項７記載
    のＤＮＡに相当するＤＮＡの塩基配列を解読し、請求項
    ７記載のＤＮＡの塩基配列と比較することを特徴とする
    請求項２２記載の検出方法。
24. 【請求項２４】 請求項７記載のＤＮＡの一塩基多型
    （ＳＮＰｓ）。
25. 【請求項２５】 請求項２４記載の一塩基多型（ＳＮＰ
    ｓ）を含有してなる診断剤。
26. 【請求項２６】 さらに請求項７記載のＤＮＡまたはそ
    の一部を含有する請求項２５記載の診断剤。
27. 【請求項２７】 アルツハイマー病の診断剤である請求
    項２５または２６記載の診断剤。
28. 【請求項２８】 請求項２４記載の一塩基多型（ＳＮＰ
    ｓ）を用いることを特徴とするアルツハイマー病の診断
    方法。
29. 【請求項２９】 請求項７記載のＤＮＡまたはその一部
    を用いる請求項２８記載の診断方法。
30. 【請求項３０】 請求項７記載のＤＮＡにコードされる
    ペプチドもしくはタンパク質またはその塩。
31. 【請求項３１】 アルツハイマー病に関連する請求項３
    ０記載のペプチドもしくはタンパク質またはその塩。
32. 【請求項３２】 Ａβの産生を亢進する請求項３０記載
    のペプチドもしくはタンパク質またはその塩。
33. 【請求項３３】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    る、Ａβの産生を亢進するタンパク質またはその塩。
34. 【請求項３４】 配列番号：２で表わされるアミノ酸配
    列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    る、Ａβの産生を亢進するタンパク質またはその塩。
35. 【請求項３５】 配列番号：３で表わされるアミノ酸配
    列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    る、Ａβの産生を亢進するタンパク質またはその塩。
36. 【請求項３６】 配列番号：２２で表わされるアミノ酸
    配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    る、Ａβの産生を亢進するタンパク質またはその塩。
37. 【請求項３７】 請求項２９〜３６のいずれかに記載の
    ペプチド、タンパク質またはその塩に対する抗体。
38. 【請求項３８】 請求項２９〜３６のいずれかに記載の
    ペプチド、タンパク質またはその塩の活性を不活性化す
    る中和抗体である請求項３７記載の抗体。
39. 【請求項３９】 請求項３７記載の抗体を含有してなる
    診断剤。
40. 【請求項４０】 アルツハイマー病の診断剤である請求
    項３９記載の診断剤。
41. 【請求項４１】 請求項３７記載の抗体を用いることを
    特徴とする請求項２９〜３６のいずれかに記載のペプチ
    ド、タンパク質またはその塩の定量法。
42. 【請求項４２】 請求項４１記載の定量法を用いるアル
    ツハイマー病の診断方法。
43. 【請求項４３】 請求項３２記載のＡβの産生を亢進す
    るペプチドもしくはタンパク質またはその塩に対する抗
    体を含有してなる医薬。
44. 【請求項４４】 アルツハイマー病の予防・治療剤であ
    る請求項４３記載の医薬。
45. 【請求項４５】 哺乳動物に対して、請求項３２記載の
    Ａβの産生を亢進するペプチドもしくはタンパク質また
    はその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴と
    するアルツハイマー病の予防・治療方法。
46. 【請求項４６】 請求項７記載のＤＮＡと相補的な塩基
    配列またはその一部を含有してなるアンチセンスＤＮ
    Ａ。
47. 【請求項４７】 請求項４６記載のアンチセンスＤＮＡ
    を含有してなる診断剤。
48. 【請求項４８】 アルツハイマー病の診断剤である請求
    項４７記載の診断剤。
49. 【請求項４９】 請求項１１記載のＡβの産生を亢進す
    るＤＮＡと相補的な塩基配列またはその一部を含有して
    なるアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬。
50. 【請求項５０】 アルツハイマー病の予防・治療剤であ
    る請求項４９記載の医薬。
51. 【請求項５１】 哺乳動物に対して、請求項４９記載の
    アンチセンスＤＮＡの有効量を投与することを特徴とす
    るアルツハイマー病の予防・治療方法。
52. 【請求項５２】 請求項７記載のＤＮＡを用いることを
    特徴とするアミロイドβタンパク質（Ａβ）産生阻害薬
    のスクリーニング方法。
53. 【請求項５３】 請求項３０記載のペプチドもしくはタ
    ンパク質またはその塩を用いることを特徴とするアミロ
    イドβタンパク質（Ａβ）産生阻害薬のスクリーニング
    方法。
54. 【請求項５４】 請求項３７記載の抗体を用いることを
    特徴とするアミロイドβタンパク質（Ａβ）産生阻害薬
    のスクリーニング方法。
55. 【請求項５５】 請求項４６記載のアンチセンスＤＮＡ
    を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質（Ａ
    β）産生阻害薬のスクリーニング方法。
56. 【請求項５６】 請求項１７記載の形質転換体を用いる
    ことを特徴とするアミロイドβタンパク質（Ａβ）産生
    阻害薬のスクリーニング方法。
57. 【請求項５７】 請求項５２〜５６のいずれかに記載の
    スクリーニング方法で得られうるアミロイドβタンパク
    質（Ａβ）産生阻害薬。
58. 【請求項５８】 請求項５７記載のＡβ産生阻害薬を含
    有してなる医薬。
59. 【請求項５９】 アルツハイマー病の予防・治療剤であ
    る請求項５８記載の医薬。
60. 【請求項６０】 哺乳動物に対して、請求項５７記載の
    Ａβ産生阻害薬の有効量を投与することを特徴とするア
    ルツハイマー病の予防・治療方法。
61. 【請求項６１】 （ｉ）アミロイドβタンパク質（Ａ
    β）の前駆体タンパク質（βＡＰＰ）フラグメントから
    のＡβの産生が促進されることにより選択マーカー遺伝
    子の発現が亢進するよう設計された細胞株と（ii）その
    細胞株に請求項１１記載のＡβの産生を亢進するＤＮＡ
    を導入した細胞株に対して、試験化合物を添加した場合
    における、それぞれのＡβの産生量の差を測定すること
    を特徴とするＡβの産生を制御する物質のスクリーニン
    グ方法。
62. 【請求項６２】 （ｉ）アミロイドβタンパク質（Ａ
    β）の前駆体タンパク質（βＡＰＰ）フラグメントから
    のＡβの産生が促進されることにより選択マーカー遺伝
    子の発現が亢進するよう設計された細胞株と（ii）その
    細胞株に請求項１２記載のＡβの産生を亢進するＤＮＡ
    を導入した細胞株に対して、試験化合物を添加した場合
    における、それぞれの選択マーカーの生物活性の差を測
    定することを特徴とするＡβの産生を制御する物質のス
    クリーニング方法。
63. 【請求項６３】 選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子
    であり、選択マーカーの生物活性が薬剤耐性である請求
    項６２記載のスクリーニング方法。
64. 【請求項６４】 請求項７記載のＤＮＡを用いることを
    特徴とする当該ＤＮＡの発現抑制薬のスクリーニング方
    法。
65. 【請求項６５】 請求項９記載のヒト染色体ＤＮＡのプ
    ロモーター領域とレポーター遺伝子を組み合わせて、試
    験化合物を添加した場合と添加しない場合における、そ
    れぞれのレポーター活性を測定することを特徴とする当
    該ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子のプロ
    モーター活性を抑制または促進する化合物のスクリーニ
    ング方法。
66. 【請求項６６】 請求項３０記載のペプチドもしくはタ
    ンパク質またはその塩を発現し得る細胞に、試験化合物
    を添加した場合と添加しない場合における、それぞれの
    当該ペプチドもしくはタンパク質またはその塩あるいは
    それらのＤＮＡの発現量を抑制する化合物のスクリーニ
    ング法。