WO2004028558A1 - 神経変性疾患の予防・治療剤 - Google Patents

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WO2004028558A1
WO2004028558A1 PCT/JP2003/012210 JP0312210W WO2004028558A1 WO 2004028558 A1 WO2004028558 A1 WO 2004028558A1 JP 0312210 W JP0312210 W JP 0312210W WO 2004028558 A1 WO2004028558 A1 WO 2004028558A1
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Hideki Matsui
Tomomichi Watanabe
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive / therapeutic agent for neurodegenerative disease, screening thereof, and a diagnostic agent for neurodegenerative disease. Furthermore, the present invention relates to a prophylactic-therapeutic agent and a diagnostic agent for ischemic brain disease, cancer and the like. Background art
  • Alzheimer's disease is a typical neurodegenerative disease with progressive dementia and cognitive dysfunction, but no effective treatment has been found so far. Needless to say, Alzheimer's disease is one of the most important diseases in the aging society, and the development of its therapeutic agent has extremely significant medical economics.
  • abnormal proteins accumulate in the endoplasmic reticulum due to factors that affect protein biosynthesis, such as heat shock and glucose starvation, and stress on the endoplasmic reticulum (ER stress).
  • ER stress stress on the endoplasmic reticulum
  • endoplasmic reticulum stress is applied to a living body, a group of endoplasmic reticulum stress response genes including chaperone molecules are expressed, repair or degrade abnormal proteins, and maintain homeostasis.
  • Parkin was identified as the etiological gene of autosomal recessive juvenile parkinsonism (AR-JP), a hereditary Parkinson's disease (Nature, 392, 605-608, 1998). It has been reported to be an involved ubiquitin ligase (Nat. Genet, 25, 302-305, 2000). Furthermore, Pael (Parkin assoc i ated endothelin receptor-1 ike) receptor was identified as a substrate for Parkin.
  • AR-JP autosomal recessive juvenile parkinsonism
  • Pael Parkin assoc i ated endothelin receptor-1 ike
  • This receptor is a protein whose higher-order structure is difficult to form, and the entire lower-order structure formation of this protein is usually rapidly degraded by the action of parkin, but when the proteolytic system is suppressed, abnormal Pael receptor Accumulates in the endoplasmic reticulum,
  • the cells have been reported to undergo cell death due to endoplasmic reticulum stress (Cell, 105, 891-902, 2001).
  • cells with mutations in the presenilin 1 mutation, the causative gene of familial Alzheimer's disease are vulnerable to ER stress and the deletion of Irel, which is involved in the ER stress response, Increased production has been reported (Biochem. Biophysic. Acta, 1536, pp. 85-96, 2001; J. Biol. Chem., 276, 2108-2114, 2001).
  • Sestrin2 (Ses2) (GenBank Accession No. BC013304) is a gene with weak homology to PA26, whose expression is controlled by p53. PA26 has been reported as a member of the GADD family, whose expression is increased due to DNA damage and the like (Oncogene, 18, 18, 127-137, 1999). In cancer cell lines, Ses2 expression is increased in a P53-independent manner by ischemia and oxidative stress, and is increased in a p53-dependent manner by stimulation accompanied by DNA damage (UV irradiation, doxorubicin).
  • cancer cell lines overexpressing Ses2 are susceptible to cell death due to serum deprivation and DNA damage, but are resistant to cell death due to oxidative stress and ischemia (Oncogene, 21, 6017-6031, 2002). Year) .
  • oxidative stress and ischemia Oncogene, 21, 6017-6031, 2002.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found a gene whose expression is remarkably increased at the time of induction of nerve cell death accompanied by endoplasmic reticulum stress. As a result of repeated studies, the present invention has been completed. That is, the present invention
  • a diagnostic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof,
  • the protein or its protein which comprises using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • the protein or a portion thereof which comprises a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • the protein described above which comprises a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof.
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that regulates gene expression is provided.
  • a method for preventing or treating a neurodegenerative disease which comprises administering to a mammal an effective amount of the compound according to (14) or (17) or a salt thereof.
  • (21) It regulates the expression of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, or regulates the expression of the above protein gene. Prevention and treatment of neurodegenerative diseases.
  • FIG. 1 is a diagram showing the amount of DNA cleavage of cells at 24 hours after stimulation with tunicamycin by OD 405-492.
  • the vertical axis indicates the absorbance
  • the horizontal axis indicates the concentration of tunica mycin.
  • __ indicates the amount of DNA cleavage in control cells
  • ⁇ indicates the amount of DNA cleavage in cells transfected with Ses2 gene.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amount of DNA cleavage of cells 48 hours after stimulation with tunicamycin by OD405-492.
  • the vertical axis indicates the absorbance
  • the horizontal axis indicates the concentration of tunica mycin.
  • — indicates the amount of DNA cleavage in Ses2 gene transduced cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the amount of DNA cleavage of cells 24 hours after tabcigargin stimulation is represented by ⁇ D405—492.
  • the vertical axis indicates absorbance, and the horizontal axis indicates the concentration of evening cigargin.
  • One square indicates the amount of DNA cleavage in control cells, and one square indicates the amount of DNA cleavage in Ses2 gene transduced cells.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 used in the present invention (hereinafter sometimes referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention)
  • human warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, birds, chickens, egrets, bushes, hidges, horses, monkeys, etc.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 50% or more, preferably about 6% or more, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described above. However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferable. Specific examples include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) identical. Therefore, it is preferable that the above activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as protein molecular weight may be different.
  • Examples of the protein used in the present invention include (1) (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, about 1 to 100, preferably 1 to 100). About 30 amino acids, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5 amino acids are deleted, ( ⁇ ) 1 or 2 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence to which the above amino acids are added (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)); ) SEQ ID NO: 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) (Iv) amino acid sequence, and (iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • One or more amino acids in the sequence eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino acids
  • So-called muteins such as proteins containing an amino acid sequence substituted with, or (V) an amino acid sequence combining them.
  • the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) in accordance with the convention of peptide notation.
  • the proteins used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, have a C-terminal lipoxyl group (_C ⁇ OH), carboxylate (—COO—), amide It may be either (—CONH 2 ) or ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, isopropyl
  • C i _ 6 alkyl groups such as n _ butyl, Shikuropen chill
  • C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl , for example, phenyl, alpha - C 1 2 Ariru groups, naphthyl, for example, benzyl, full Eniru alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc.
  • a- naphthyl such as phenethyl - C, C 7 _ i such _ 2 alkyl groups 4
  • An aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group and the like are used.
  • the protein used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • the protein used in the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • an amino group at the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) has a protecting group (eg, alkanol such as formyl group, acetyl group, etc.).
  • a glutamine residue at the amino acid side chain in the molecule (for example,-H, - SH, amino group, imidazole group, indole group, Guanijino group, etc.) a suitable protecting group (e.g., formyl group, C E, such as C E _ 6 Al force Noiru group such Asechiru group - 6 Ashiru group, etc.)
  • a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • protein used in the present invention include, for example, SEQ ID NO: 1 And proteins containing the amino acid sequence represented.
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is the partial peptide of the protein used in the present invention described above, and is preferably any one having the same properties as the protein used in the present invention described above. It may be something.
  • the amino acid sequence at the 1st to 30th and 250th to 280th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 And the like is used among the constituent amino acid sequences of the protein used in the present invention.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, Alternatively, one or more (preferably, about 1 to 20, more preferably, about 1 to 10, and more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 20; more preferably, about 1 to 10; more preferably, about 1 to 5) amino acids are inserted into the amino acid sequence. Or one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are replaced with other amino acids. It may be.
  • the partial peptide used in the present invention may have a carboxyl group (one COOH), a carboxylate (one COO—), an amide (_C ⁇ NH 2 ) or an ester (one COOR) at the C-terminus. .
  • the partial peptides used in the present invention include those having a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminal, and the N-terminal amino acid residue, as in the above-mentioned protein used in the present invention.
  • a carboxyl group or carboxylate
  • N-terminal amino acid residue as in the above-mentioned protein used in the present invention.
  • methionine residue whose amino group is protected by a protecting group, N-terminal cleavage in vivo, dalminamine residue generated by pyroglutamine oxidation, side chain of amino acid in the molecule
  • substitu on Also included are those in which the group is protected by an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bonded, such as a complex peptide such as a so-called glycopeptide.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, an organic acid
  • a base eg, an alkali metal salt
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein or its partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced from the above-mentioned method for purifying a protein from human or warm-blooded animal cells or tissues, or encodes a protein. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then subjected to e-extraction with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and PAM resin.
  • ⁇ - An amino acid having an amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on a resin in accordance with the sequence of a target protein according to various known condensation methods.
  • a protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or partial peptide or an amide thereof. Get the body.
  • various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ Bt, HOOBt) or as a symmetrical anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after the protected amino acid has been activated in advance.
  • a racemization inhibitor additive eg, H ⁇ Bt, HOOBt
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, and trifluorophenols Alcohols, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitol, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. Is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 t: to 50.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxyl-propionyl, CI—Z, Br—Z, and adaman.
  • Tyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyl ester It can be protected by xycarbonylhydrazide, t-butoxycarbonylhydrazide, tritylhydrazide, or the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohe
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, groups derived from carbonic acid such as lower (Ci_ 6 ) alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group. Used.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydrovinylil group, a t-butyl group and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz 1, C 1 2 - Bz l, 2_ nitrobenzyl, B r- Z, such as t _ butyl is used.
  • protecting group for histidine imidazole for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and activated esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) Esters with phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOB t) You.
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoramide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and sodium treatment in liquid ammonia Reduction is also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about ⁇ 2 Ot: to about 40.
  • a cation scavenger such as sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tributanone is treated with 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane.
  • alkali treatment with a dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein or partial peptide for example, first, amidation and protection of the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal are followed by adding a peptide (protein) chain to the amino group side with a desired chain length. After that, a protein or partial peptide from which only the protecting group of the ⁇ -terminal amino group of the peptide chain is removed and a protein or partial peptide from which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminal is removed, These proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • an ester of a protein or peptide for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of the terminal amino acid with the desired 7 alcohols to form an amino acid ester, the amino acid ester can be obtained in the same manner as the amide of a protein or peptide.
  • An ester of the desired protein or peptide can be obtained.
  • the partial peptide used in the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the objective peptide is produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide used in the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group. Can be.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) to (V).
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell / tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the protein used in the present invention includes, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a DNA hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions. Any DNA may be used as long as it contains a soybean base sequence and encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions include, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. More preferably, a DNA containing a base sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used. Specifically, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and the like can be mentioned.
  • -Hybridization is performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, Can be carried out in accordance with an intelligent condition.
  • the high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 2 OmM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65. In particular, a sodium concentration of about 19 mM and a temperature of about 65 are most preferred.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and represented by SEQ ID NO: 7.
  • a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or the like is used. .
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the base sequence encoding the partial peptide used in the present invention described above. . Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from cells and tissues described above, cDNA library derived from cells and tissues described above, and synthetic DNA.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include, for example, a DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a DNA containing a base sequence that hybridizes under high stringent conditions and a part of a DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention can be used.
  • the DNA hybridizable with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 has the same significance as described above.
  • DNA encoding the protein and partial peptide used in the present invention may be simply referred to as the protein of the present invention in the description of the cloning and expression of DNAs encoding them).
  • a sequence having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention may be used. Amplify by the PCR method using a synthetic DNA primer, or incorporate the DNA incorporated in an appropriate vector into a DNA fragment encoding a partial or entire region of the protein of the present invention or a synthetic DNA. Selection can be performed by hybridization with the labeled one. The hybridization can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted by PCR, a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the 0DA-LA PCR method. It can be carried out according to a method known per se, such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by doing.
  • vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, , PSH19, pSH15), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., as well as' PA1-111, pXT1, pRcZCMV, pRcZRSV, pc DNA IZNeo Are used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when an animal cell is used as a host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRa promoter SRa promoter
  • CMV cytomegalovirus
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, lac promoter, rec A promoter, AP L flop port motor, iota [rho [rho promoter - if such as T7 promoter, the host is a bacterium of the genus Bacillus, SP_ ⁇ 1
  • yeast such as promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc., PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter, and the like are preferable.
  • the expression vector may further contain, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly (A) addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like.
  • the selection Ma one car, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [Mesotorekise Ichito (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r) And neomycin resistance gene (hereinafter, sometimes referred to as Ne ⁇ 1 ⁇ , G4 18 resistance).
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • MTX ampicillin resistant gene
  • Amp r ampicillin resistant gene
  • Ne ⁇ 1 ⁇ , G4 18 resistance neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is a genus Escherichia, a PhoA signal sequence, a 0 immediate A signal sequence, etc.
  • the host is a Bacillus genus, an a-myrase * signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc.
  • the yeast can be activated, such as the MFa signal sequence and SUC2 'signal sequence.
  • an insulin 'signal sequence, an ⁇ -interface protein signal sequence, an antibody molecule signal sequence and the like can be used.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia bacteria include, for example, Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • subtil is) MI 114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (1984)) and the like.
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe N CYC 1913, NCYC 2036, Pichia Pastoris (Pichia pastoris) KM71 or the like is used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG 1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and eggs derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells,
  • Mamestra brassicae-derived cells or Est igmena acrea-derived cells are used. It is.
  • a silkworm-derived cell line (Bombyx mori cell; BmN cell) is used.
  • Sf cell examples include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell (Vaughn, J. Shira, In Vivo, 13, 213-217, (1977) ) Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cell). ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 11 (1 979).
  • a liquid medium is suitable as a medium for cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salt, nitrate, cornchee 'liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • the inorganic or organic substance such as a liquid and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium salt.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids (Miller, Journal of Experiments, Journal of Experiments). in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor laboratory, New York 1972].
  • an agent such as 3 / 3-indolylacryl can be added to make the promoter work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • culturing is usually performed at about 30 to 4 Ot: for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • a medium for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., Processings. Of the National Academy of Sciences] Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Procaging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, 5330 (1984)] is the national academy of the world.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually performed at about 20 ⁇ : ⁇ 35 at about 24-72 hours, adding aeration and agitation as necessary.
  • the medium used is Grace s Insect Medium (Grace, T.C.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association] 199, 519 (1967) ], 199 medium [Procedure of the Society for the Biological Medicine]
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30t: ⁇ 40 for about 15-60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane, or outside the cells.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method. '
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then sonicated, lysozyme and Z or freeze-thawed. Causes the cells to break cells After crushing, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • a protein modifier such as urea or hydrochloric guanidine in the buffers may contain a surfactant such as preparative Litton X- 1 0 0 TM. If the protein is secreted into the culture, after the culture is completed, the cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include: , Methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly using differences in molecular weight. Methods that use differences in charge such as chromatography, methods that use specific affinity such as affinity chromatography, methods that use differences in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, and isoelectric focusing. A method utilizing a difference in isoelectric point such as an electrophoresis method is used.
  • the protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, a method known per se or analogous thereto Can be converted into a free form or another salt.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, daricosidase and the like are used.
  • the presence of the thus-produced protein of the present invention can be measured by enzyme immunoassay or Western plotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. There may be.
  • Antibodies against the protein or partial peptide used in the present invention or partial salts thereof are obtained by using the protein of the present invention as an antigen.
  • the antibody or antiserum can be produced according to a known method for producing an antibody or antiserum.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody upon administration, itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse is selected, and spleen or lymph nodes are collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to known methods, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene daricol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is. -20: about 1, PEG (preferably PEG 1000-PEG6) Is added at a concentration of about 10 to 80%, and incubated at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes to efficiently perform cell fusion. Can be implemented.
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then released.
  • a solid phase eg, a microplate
  • Anti-immunoglobulin antibodies labeled with radioactive substances or enzymes (anti-mouse immunoglobulin antibodies are used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A, and monoclonal antibodies bound to the solid phase are detected
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually between 20 and 40, preferably about 37.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the monoclonal antibody can be performed by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method (e.g., salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis, Adsorption / desorption method using ion exchanger (eg DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G Specific Purification Method of Collecting Antibody Only and Dissociating the Bond to Obtain Antibody].
  • an immunoglobulin separation and purification method e.g., salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis, Adsorption / desorption method using ion exchanger (eg DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G Specific Purification Method of Collecting Antibody Only and Dissociating the Bond to
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier-protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting a substance containing an antibody against a protein and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are determined by antibody against hapten immunized by cross-linking with carrier.
  • any material may be crosslinked at any ratio.
  • serum serum albumin, psiloglopurine, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 1 for hapten.
  • the method is used to the couple at a ratio of, a carrier to hapten forces pulling, it can be used a variety of condensation agents, glutaraldehyde or Karupojiimido, maleimide active
  • An active ester reagent containing an ester, a thiol group, or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Polynucleotide encoding protein or partial peptide used in the present invention (Eg, in the description of antisense polynucleotides, these DNAs may be abbreviated to the DNA of the present invention)), or a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of an antisense polynucleotide.
  • an antisense polynucleotide having a part thereof has a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention or a part thereof, and suppresses the expression of the DNA. Any antisense polynucleotide may be used as long as it has the action to be obtained, but antisense DNA is preferable.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention refers to, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • a nucleotide sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology is exemplified.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention for example, An antisense polynucleotide having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a complementary strand of a base sequence near the start codon, etc.
  • an antisense polynucleotide that directs RNA degradation by RNaseH it is at least about 70%, preferably at least about 80%, more preferably at least about 70% of the complementary strand of the entire nucleotide sequence of the DNA of the present invention including introns.
  • Antisense polynucleotides having a homology of about 90% or more, and most preferably about 95% or more, are respectively suitable.
  • an antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a portion thereof Preferably, for example, an antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a part thereof (more preferably, represented by SEQ ID NO: 2 A base sequence complementary to the base sequence of the DNA containing the base sequence, or an antisense polynucleotide having a part thereof).
  • antisense polynucleotides preferably 15 It is composed of about 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense DNA must be chemically modified, such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted by an acid residue.
  • the sugar (dexoxy report) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2,0-methylation, and the base portion (pyrimidine, purine) may also be chemically modified. And any one that hybridizes to DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is designed based on the nucleotide sequence information of the DNA encoding the cloned or determined protein, Can be synthesized.
  • Such nucleotides can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention, inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the protein-related RNA of the present invention. It can regulate and control the expression of the protein gene of the invention.
  • Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of the protein-associated RNA of the present invention, and polynucleotides that can specifically hybridize with the protein-associated RNA of the present invention, include the protein of the present invention in vivo and in vitro. Regulates and regulates gene expression, and is useful for treating or diagnosing disease.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a particular sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids, including genes.
  • Nucleotide The “correspondence” between a nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide (protein) is a peptide in the direction derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • Protein usually refers to amino acids. 5 'end hairpin loop of protein gene, 5' end 6—base pair 'repeat, 5' end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3 'end untranslated region, 3 'End palindrome region, and 3' end hairpin loop are preferred targets although it can be selected as a region, any region within a protein gene can be selected as a target.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be "antisense” if the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target is.
  • Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-dexoxy-D-reports, polynucleotides containing D-liposes, and other types of N-glycolides of purine or pyrimidine bases.
  • Polynucleotides or other polymers having a non-nucleotide backbone eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • polymers containing special bonds provided that the polymer is contained in DNA or RNA
  • Pairing of bases as found contains nucleotides having a configuration that allows base attachment
  • They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • nucleotide such as those having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, Those with rotioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases * inhibitors, toxins, Those with side chains such as antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.
  • an intramolecular nucleotide such as those having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, Those with rotioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases * inhibitors, toxins, Those with side chains such as antibodies, signal peptides, poly-L-ly
  • nucleoside include those containing not only purine and pyrimidine bases but also other modified heterocyclic bases. May be included. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides which are resistant to degradation of polynucleonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. In other words, it makes the antisense nucleic acid more stable in the cell. It makes the antisense nucleic acid more cell-permeable, makes it more compatible with the target sense strand, and if toxic. Reduce the toxicity of antisense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, applied by gene therapy, or added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton
  • lipids which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids (
  • hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acid can include bases, sugars, and intramolecular nucleosides. It could be attached via a sid bond.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. I can do it.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • a protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention (eg, DNA (hereinafter, referred to as the present invention) May be abbreviated as DNA)), an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention), and the antisense polymorph of the DNA of the present invention.
  • DNA hereinafter, referred to as the present invention
  • an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention
  • the antisense polymorph of the DNA of the present invention The use of nucleotides (hereinafter, sometimes abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention) will be described.
  • the expression of the protein of the present invention is increased by nervous cell death accompanied by ER stress, and suppresses ER stress-dependent cell death.
  • expression is increased in a P53-independent manner by ischemia and oxidative stress, and is increased in a P53-dependent manner by stimulation accompanied by DNA damage (UV irradiation, doxorubicin).
  • cancer cell lines overexpressing the protein of the present invention are sensitive to cell death due to serum removal and DNA damage, but are resistant to cell death due to oxidative stress and ischemia.
  • the compounds or salts thereof that regulate the activity of the protein of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome , Amyotrophic lateral stiffness Sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer ( Examples: colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, ovarian cancer , Blood tumors, etc.) can be used as preventive and therapeutic agents.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (f
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates the activity of the protein of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the activity of the protein of the present invention, which comprises using the protein of the present invention.
  • the activity of the protein of the present invention which is characterized by comparing (i) the activity of the protein of the present invention with (ii) the activity of a mixture of the protein of the present invention and a test compound, is regulated (promoted). Or a method of screening for a compound or a salt thereof.
  • the above-mentioned protein of the present invention those produced by culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention and the like are used. Furthermore, a culture solution of the above-mentioned cells, a supernatant thereof, a cell lysate, or the like may be used.
  • a host transformed with a vector containing the above-described DNA encoding the protein of the present invention
  • a host for example, animal cells such as COS 7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant which secretes the protein of the present invention extracellularly or expresses it intracellularly by culturing by the above-mentioned method is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the method for culturing the transformant of the present invention described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the activity in the case of the above (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% as compared with the case of the above (i).
  • the test compound that reduces the above can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • the compound having the activity of promoting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the action of the protein of the present invention.
  • the compound having the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts It is a compound selected from liquids, plasma, etc.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
  • a compound or a salt thereof expressing the gene encoding the protein of the present invention may be, for example, a neurodegeneration.
  • Alzheimer's disease familial Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, Prion's disease, Greutzfeldt-Jakob disease , Huntington's chorea, diabetic disease, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus) Cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, ovary It can be used as a preventive or therapeutic agent for cancer, blood tumors, etc.).
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates the expression of a gene encoding the protein of the present invention.
  • Screening methods include (Hi) the ability to produce the protein of the present invention. And (iv) comparing cells cultured with the ability to produce the protein used in the present invention in the presence of the test compound. .
  • the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) in the cases (iii) and (iv) is measured and compared.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
  • the amount of the protein is measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis, ELISA, or a method analogous thereto. Can be measured.
  • the amount of mRNA can be measured by a known method, for example, Northern hybridization using a nucleic acid containing SEQ ID NO: 2 or a part thereof as a probe, or using SEQ ID NO: 2 or a part thereof as a primer. It can be measured according to the PCR method using the contained nucleic acid or a method analogous thereto.
  • a test compound that promotes the expression of a gene encoding the protein of the present invention a test compound that inhibits about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more of the compound of the present invention, Can be selected as compounds that suppress the expression of the gene encoding
  • the screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, and plant extracts. Liquid, animal tissue extract, plasma or the like, or a salt thereof. A compound or a salt thereof that regulates the activity of a protein.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the compound of the present invention that regulates the activity of the protein or a salt thereof, and the compound or a salt thereof that regulates the expression of a gene encoding the protein of the present invention are, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease). Diseases (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, muscular atrophy '14.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease.
  • Diseases familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.
  • Parkinson's disease Parkinson's disease
  • Down's syndrome muscular atrophy '14.
  • ischemic brain disease eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, Prophylactic / therapeutic agents for biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, Prophylactic / therapeutic agents for biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, and capsules (including soft capsules). Syrups, emulsions and suspensions.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration include injections, suppositories, and the like.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, and joint injections. Includes dosage forms such as injections.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • Aqueous liquids for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, and the like.
  • Suitable solubilizing agents used are, for example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (5 Omol) adduct of hydrogenated castor oil)]
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • Suppositories used for rectal administration are prepared by mixing the antibody or a salt thereof with a usual suppository base.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 5 Q.0 mg per dosage unit form, especially for injections. It is preferable to contain 5 to 100 mg of the above compound in other dosage forms.
  • compositions may contain other active ingredients as long as the compound and the above-mentioned compound do not cause an undesirable interaction.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, higgs, bushus, puppies, pumas, birds, cats, dogs). , Monkeys, chimpanzees, etc.) orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, higgs, bushus, puppies, pumas, birds, cats, dogs.
  • Monkeys, chimpanzees, etc. orally or parenterally.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject of administration, route of administration, and the like.
  • a compound that regulates the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating Alzheimer's disease when the salt is orally administered, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.1 to: L0Omg, preferably about 1.0 to 50 mg per day. More preferably, about 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention is regulated for the purpose of treating Alzheimer's disease.
  • the compound or its salt is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection, It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, and more preferably about 0.1 to 1 Omg of the compound or a salt thereof by intravenous injection per day. is there. In the case of other animals, it is possible to administer the amount converted per 6 O kg of body weight.
  • an antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention, and therefore, quantification of the protein of the present invention in a test wave, particularly It can be used for quantification by sandwich immunoassay.
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test wave, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (al) ′) 2 , Fa or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Detecting the amount by chemical or physical means, Any measurement method may be used as long as it is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • 0-galactosidase, / 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, but two or more types are used for the purpose of improving the measurement sensitivity, etc. May be used.
  • an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds is preferably used. That is, when the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, such as the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephelometry.
  • the competition method after the antigen in the test wave and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( BZF separation), measure the amount of labeling of either B or F, and quantify the amount of antigen in the test wave.
  • a soluble phase is used as the antibody
  • B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody or a solid phased antibody is used as the first antibody.
  • the first antibody is a soluble antibody
  • the second antibody is an immobilized antibody.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser-nephrometry utilizing laser-scattering is preferably used.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease ( Familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion's disease, Stammfeld-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy I, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer) , Spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, Tenglian cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.)
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease ( Familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, horses, cats, dogs) by using them as probes. , Monkeys, chimpanzees, etc.) can detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA that encode the protein of the present invention or a partial peptide thereof, for example, damage or mutation of the DNA or mRNA. Alternatively, it is useful as a diagnostic agent for gene expression such as decreased expression, increased DNA or mRNA, or excessive expression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization ⁇ ⁇ PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences). of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)).
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, Juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Stammfeld-Jakob disease, Huntington's disease, diabetic neurobati, multiple sclerosis Disease), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney) Cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.) It is possible.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, Juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's
  • the antisense polynucleotide of the present invention which can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA, has low toxicity, Since the function of the light protein or the DNA of the present invention can be suppressed, for example, neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease , Down syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, Subarachnoid hemorrhage, etc., cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, ⁇
  • the above antisense polynucleotide When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • the above-mentioned antisense polynucleotide is inserted alone or into an appropriate vector such as retrovirus vector-1, adenovirus vector 1, adenovirus associated virus vector, etc. It can be administered orally or parenterally to animals (eg, rats, puppies, sheep, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant to promote ingestion, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel. Alternatively, they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • the above antisense polynucleotide is formulated alone or together with a carrier such as ribosome (injection), and is intravenously, subcutaneously, It may be administered to a lesion or the like.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is administered for the treatment of Alzheimer's disease
  • an adult body weight: 60 kg
  • about 0.1 to 10 O mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
  • the antisense polynucleotide is used in a tissue or a cell of the present invention. It can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of DNA and its expression status.
  • double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the protein of the present invention double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the protein of the present invention, ribozyme containing a part of RNA encoding the protein of the present invention, etc.
  • Gene expression can be suppressed, and the function of the protein used in the present invention or the DNA used in the present invention in vivo can be suppressed.
  • Alzheimer's disease familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.
  • Parkinson's disease Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Schofeld-Jakob disease, Huntington's disease , Diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.
  • ischemic brain disease eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, dragon, It can be used as a preventive or therapeutic agent for liver, biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, kidney, brain, ovarian, blood, etc. it can.
  • Double-stranded RNA can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the lipozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the protein of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the protein of the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme. '
  • RNA or ribozyme When the above-mentioned double-stranded RNA or ribozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • Antibodies of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, Prion disease, Stammfelder-Toyakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer) , Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor etc. It can be used as a therapeutic.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer'
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • injections for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily solution usually used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like, suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene thylene (50 mol) adduc tof hydrogenated cas tor oil)), etc. Good.
  • suitable solubilizing agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene thylene (50 mol) adduc tof hydrogenated cas tor oil)), etc. Good.
  • oily liquids for example For example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections.
  • the antibody contains 5 to 100 mg, and other dosage forms contain 10 to 250 mg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and is used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, porch egret, sheep, bush). Can be administered orally or parenterally (eg, intravenously) to mice, cats, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dosage varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, when used for treatment of Alzheimer's disease in adults, the antibody of the present invention is usually administered in a single dose.
  • 0.1 to 2 O m gZ kg body weight preferably 0.1 to: LO mg Z kg body weight, more preferably 0.1 to 5 mg Z kg body weight, about 1 to 5 times a day, It is convenient to administer as an injection preferably about 0.1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly low, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be used, for example, for neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (family Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis] Disease, prion disease, Croyfeld-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, Breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary, spleen, kidney It is also useful as a diagnostic agent for cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (family Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's
  • the present invention has a DNA encoding an exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal is provided.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, the ribofection method It can be produced by transferring the target DNA by the agglutination method, microinjection method, particle gun method, DE AE-dextran method, or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like. Can be fused with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se to produce the DNA transgenic animal of the present invention.
  • non-human mammal for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, night egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used. Above all, rodents and organisms are relatively short in terms of ontogeny and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems, and they are easy to breed.
  • a cross line a B6 C3 Fi line, a BDFi line, a B6D2 F! Line, a BALBZc line, an ICR line, etc., or a rat (eg, Wistar, SD, etc.) are preferable.
  • mammals in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • Examples of the mutant DNA of the present invention include those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of bases, DNA or the like in which substitution has occurred is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA expressing an abnormal protein of the present invention, for example, a DNA expressing a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention, and the like.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same or different species as the animal of interest.
  • DNAs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • the DNA construct of the present invention eg, a vector, etc.
  • to which a human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing E. coli can be microinjected into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. It is possible to create a DNA transgenic mammal that highly expresses DNA.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus. Animal viruses and the like are used. Among them, Escherichia coli-derived plasmid, Bacillus subtilis-derived plasmid or yeast-derived plasmid And the like are preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates the expression of DNA include, for example, DNA derived from (i) virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.).
  • virus eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • promoters derived from various mammals such as humans, rabbits, dogs, cats, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • mammals such as humans, rabbits, dogs, cats, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • albumin insulin II, peroplaskin II, elastor ', erythropoietin, Endoselin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, Dalphin S-transferase, platelet-derived growth factor) 3, keratins Kl, K10 and K14, collagen types I and II Type, cyclic AMP-dependent protein.
  • Quality kinase / 3 I subunit dyst Lophine, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor thymic synthase (generally abbreviated as Tie 2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase) ), Neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, meta-oral proteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine) 3-hydroxylase , Thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1 (EF-1 ⁇ ), ⁇ -actin, ⁇ and 3 myosin heavy chains, myosin light chains 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C,
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger R R in a DNA-transferred mammal (generally referred to as “taminator”).
  • a DNA-transferred mammal generally referred to as “taminator”.
  • An animal-derived sequence of each DNII can be used, and preferably, SV40 terminator of simian virus or the like is used.
  • translation of splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. 5 'upstream of the promoter region, promoter region, etc. in order to further express the desired foreign DNA Linking between regions or 3 ′ downstream of the translation region is also possible depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention includes DNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). Obtain all or part of the genomic DNA from various commercially available genomic DNA libraries, or the complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid gland J33 ⁇ 4, and fibroblast-derived RNA I can do it.
  • an exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues by a point mutation induction method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the aforementioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after the transfer of DNA indicates that the progeny of the animal produced will retain the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. Means to do.
  • the progeny of such an animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all of the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. It means having an excess of A.
  • the offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is finally enhanced by promoting the function of endogenous normal DNA.
  • the disease may develop and can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA transgenic animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. Further, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for prevention and treatment of diseases related to the protein of the present invention.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Croiffert's disease Jacob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, arachnoid) Bleeding, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer) It can also be used for screening tests for prophylactic and therapeutic agents such as cancer, brain tumor, ovarian cancer, and blood tumor.
  • prophylactic and therapeutic agents such as cancer, brain tumor, ovarian cancer, and blood tumor.
  • the non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably retained by the crossing. Can be done.
  • the target foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a source substance.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germ cells of an animal means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells.
  • the offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is finally impaired by inhibiting the function of endogenous normal DNA. It may become active refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functionally inactive refractory state of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of a normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. Action).
  • a preventive or therapeutic agent for the protein of the present invention or a functionally inactive type refractory disease for example, Degenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease Chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, Liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer,
  • Degenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer'
  • (V) a mutein of the present invention isolated and purified and their antibody production etc. and more c considered, using a DN A transgenic animal of the present invention, including the function inertness type inadaptability of the protein of the present invention,
  • the clinical symptoms of the disease related to the protein of the present invention can be examined, and more detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the protein of the present invention can be obtained. It can contribute to development and further research and treatment of secondary diseases caused by the disease.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a repo overnight gene (eg, a
  • a repo overnight gene eg, a
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated refers to a DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which is artificially mutated to suppress the expression ability of the DNA, or By substantially eliminating the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention). This may be referred to as a non-human mammalian embryonic stem cell (hereinafter abbreviated as ES cell).
  • ES cell non-human mammalian embryonic stem cell
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • Examples of a method for artificially mutating the DNA of the present invention include, for example, deletion of part or all of the DNA sequence by genetic engineering, insertion or substitution of another DNA. Can be performed.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the reading frame of a codon or disrupting the function of a promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomy'sin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (/ 3-galactosidase gene), A DNA sequence that disrupts exon function by inserting a reporter gene, such as cat (chloramphenicylacetyltransferase gene), or terminates gene transcription in the intron between exons (eg, , Po1yA additional signal) to prevent synthesis of the complete messenger RNA
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene hereinafter abbreviated as “gettering vector” is introduced into the chromosome of the animal
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or the method described in the known Evans and Kaufma method may be used. A newly established one may be used.
  • mouse ES cells currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetic background.
  • BDF mice can be used satisfactorily because they collect a large number of eggs and are robust.
  • the ES cells obtained by using them can be used to create a pathological model mouse by backcrossing with C57BLZ6 mice. It can be used advantageously in that the target background can be replaced by C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Early embryos can be obtained. .
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germ line chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, than suffices ES cell number of about 1 colony (about 50),
  • the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling early selection of male cells.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good growth potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts, LIF (1-
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be obtained, for example, by introducing the evening-getting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the evening-getting vector into the DNA of the present invention. Knocking out the DNA of the present invention by homologous recombination in which the DNA sequence in which the DNA sequence is inactivated replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. Can be.
  • the DNA in which the DNA of the present invention was knocked out was used as a targeting vector and a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or a targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe. It can be determined by PCR analysis using the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse as the primer.
  • Non-human mammalian embryonic stem When cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of a non-human mammalian embryo or embryo.
  • the chimeric embryo is injected into a blastocyst and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially obtained from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention with mutation added thereto, for example, by judging coat color or the like.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention. A homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which the evening-getting vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg by a microinjection method. Compared to these transgenic non-human mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
  • the individual knocked out of the DNA of the present invention is bred in a normal breeding environment after confirming that the DNA of the animal obtained by the breeding is also knocked out. be able to.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals with Xe-inactivated DNA are bred and passaged.
  • the non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is the DN of the present invention. It is very useful in creating non-human mammals deficient in A expression.
  • the non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it may be caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It can be a model for disease, and is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • Diseases such as neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, thoroughfeld Jacobs disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method includes the same ones as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and examined for changes in organs, tissues, disease symptoms and the like of the animal.
  • the therapeutic and prophylactic effects of a test compound can be tested using the conversion as an index.
  • Methods for treating a test animal with a test compound include, for example, oral administration and intravenous injection, which are appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, properties of the test compound, and the like.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Dandrosis, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Stamm's disease Felt-Jakob disease, Huntington's disease, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, tiger cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.)
  • the test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present
  • the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic-preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect against a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a medicament such as a safe and low toxic prophylactic / therapeutic agent for the disease. Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may be a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid, etc.) or a base (eg, (Eg, alkali metals) are used, especially physiologically acceptable Acid addition salts are preferred.
  • a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid, etc.
  • a base eg, (Eg, alkali metals) are used, especially physiologically acceptable Acid addition salts are preferred.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, horses, cats, cats, animals). And monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound when the compound is orally administered, generally, an adult (assuming a body weight of 60 kg) Alzheimer's In a patient with a disease, about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease and the like.
  • the compound is usually in the form of an injection in an adult (60 kg) Alzheimer's disease patient
  • the compound is administered intravenously, about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg of the compound per day is administered by intravenous injection. It is. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the present invention provides a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention and detecting the expression of a reporter gene. It provides a method for screening the salt.
  • the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention includes the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention described above.
  • DNA is inactivated by introducing a reporter gene, and the reporter gene can be expressed under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same one as described above is used, and —galactosidase gene (1 ac Z), soluble alkaline phosphatase gene, luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene is present under the control of the promoter for the DNA of the present invention because the reporter it gene is present. By tracing the expression of the encoded material, the activity of the promoter can be detected.
  • the tissue expressing the protein of the present invention originally has Instead of the protein of the invention) 3-galactosidase is expressed.
  • a reagent that is a substrate for 3-galactosidase such as 5-bromo-4-monocloth-3-indolyl-j3_galactopyranoside (X-gal)
  • X-gal 5-bromo-4-monocloth-3-indolyl-j3_galactopyranoside
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde and the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37T. : After reacting for about 30 minutes to 1 hour in the vicinity, the i3-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with ImM EDTAZPBS solution, and the coloration may be observed. In addition, mRNA encoding 1acZ may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, a).
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids
  • bases eg, a
  • a salt with an alkali metal salt or the like is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • the compound or its salt that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention or the salt thereof can regulate the expression of the protein of the present invention and regulate the function of the protein, for example, a neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease) (Familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion's disease, Kreutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, Multiple sclerosis etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer) , Renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, ova
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bush, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of the administration, the administration route, and the like.
  • the compound of the present invention that inhibits the activity of the promoter for DNA when orally administered, generally the adult In a patient with Alheimer's disease weighing 60 kg, the compound is used in an amount of about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg. Administer 0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that inhibits the promoter activity of DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult.
  • Alzheimer's disease patient about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day. It is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, or a ⁇ ⁇ ⁇ . It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by insufficient expression of DN ⁇ , or developing therapeutic agents.
  • transgenic animal a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal).
  • transgenic animal transgenic animal
  • By preparing a protein it becomes possible to specifically synthesize the protein and examine its action in living organisms.
  • by binding an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line that expresses this a protein having the action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the protein of the present invention itself can be obtained. It can be used as a search system for molecular compounds.
  • the expression of the protein of the present invention is increased by nervous cell death accompanied by ER stress, and suppresses ER stress-dependent cell death.
  • expression is increased in a P53-independent manner by ischemia and oxidative stress, and is increased in a P53-dependent manner by stimulation accompanied by DNA damage (UV irradiation, doxorubicin).
  • cancer cell lines overexpressing the protein of the present invention are sensitive to cell death due to serum removal and DNA damage, but are resistant to cell death due to oxidative stress and ischemia.
  • neurodegenerative diseases e.g., Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Danish disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Stamm's disease Felt-Jakob disease, Huntington's disease, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, tiger cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc. Disease develops
  • the protein of the present invention and the DNA of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, muscle Amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (Eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, tentacle cancer, brain tumor, ovary It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for cancer, blood tumors, etc.).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (
  • the DNA of the present invention is used.
  • the DNA of the present invention is inserted into (oral) cells to express the protein of the present invention.
  • the role of the protein of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted by transplantation or (8) by administering the protein of the present invention to the patient.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. It can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DN of the present invention A can be administered as is or with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered by a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent
  • the protein is purified to at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, and even more preferably at least 99%. It is preferable to use those that have been prepared.
  • the protein of the present invention can be used, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., which are sugar-coated as required, orally, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the protein of the present invention is mixed with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in a unit dosage form generally required for the practice of preparations. It can be manufactured by The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • Such leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • a liquid carrier such as an oil or fat may be further contained in the above-mentioned dinner material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. .
  • Aqueous liquids for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents for example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 8) 0 TM , HCO-50, etc.).
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, hydrochloride proforce, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, warm-blooded animals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats) , Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats
  • the dose of the protein of the present invention varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the protein of the present invention when administered for the treatment of Alzheimer's disease, generally the adult (body weight) is used. 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the protein is administered per day.
  • the single dose of the protein varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the protein of the present invention is injected into an adult (body weight) in the form of an injection for the treatment of Alzheimer's disease. (As 60 kg), inject about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.:!
  • Ar g Arginine H is: histidine
  • Tr p Tribute fan
  • amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is shown.
  • GenBank Accession No. BC013304 human Ses2
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • amino acid sequence coding for the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 is shown.
  • Type I collagen-coated 24-well plate (SUMIL0N) containing primary rat neurons prepared from TP-17 CD rats (Charles River Japan) containing B27 Neurobasa
  • Psigargin (Thap) is added to the above cultured cells to a final concentration of 2 nM, or (iii) The cultured cells are exchanged twice with glucose-free DMEM medium containing B27 to become 3 mM. 2-Doxyglucose (2DG) was added as described above, and 4, 8, and 24 hours later, total RNA was extracted from the cells using RNeasy Mini kit (Qiagen) according to the experimental manual. As a control, instead of the above drugs (Tnc, Thap and 2DG), cells to which each medium was added (cells to which no drug was added) were used. Using these as materials, gene expression analysis was carried out using an oligo hidden leotide microarray (Rat Genome U34B; Affymetrix).
  • Rat primary neurons prepared in the same manner as in Example 1 were suspended in N2-containing DMEM medium (GIBC0), and then seeded with 250,000 Zwells and cultured for 4 days. After culturing, 3 amyloid suspended in the above medium was added to a final concentration of 25 ⁇ 4, and after 4, 8, and 24 hours, total RNA was extracted from the cells and subjected to gene analysis as in Example 1. Was. As a control, cells to which the above medium was added instead of / 3 amyloid were used. Compared with the control, the expression of the GenBank No. AI013865 gene was enhanced in the cells stimulated with 3) amyloid (Table 2).
  • Sestrin2 Sestrin2
  • human Ses2 was cloned, Ses2 gene-expressing cells were prepared using transient transduction, and used for a cell death induction system.
  • GenBank No. AI013865 When Blast N search was performed in GenBank using GenBank No. AI013865 as a query, it had a high homology (about 90%) with mouse-derived GenBank No. BC005672. Next, a Blast N search was performed in Genbank using the mouse sequence as a query, and Sestrin2 (GenBank No. BC013304) had the highest homology. Therefore, the human ortholog corresponding to GenBank No. AI013865 is Sestrin2.
  • Tabcigargin was added to human neuroblastoma SK-N-AS cells (purchased from ATCC) to a final concentration of 500 nM and cultured for 8 hours. After the culture, total RNA was extracted using IS0GEN (Futtsubon Gene). Using the obtained total RNA as type II, RNA PCR kit
  • TAKARA TAAAA reverse transcription reaction
  • the resulting PCR product was cloned into pCDNA3.1- / V5-His T0P0 (Invitrogen) to transform Escherichia coli DH5 ⁇ .
  • PCR was performed using the obtained colonies, synthetic primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) and ExTaq (TAKARA) as an enzyme to obtain a PCR product.
  • the substrate in this PCR product is digested with ExoSAP-IT (Amersham Pharmacia) and used as a template for BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction.
  • a sequencing reaction was performed using (ABI), and the sequence product was analyzed using a 3100 Genetic analyzer (ABI).
  • a colony containing the plasmid into which the human Ses2 gene was inserted was cultured in an LB medium, and the vector was recovered using a QUAGEN plasmid midi kit (Qiagen).
  • This Ses2 gene expression vector was transduced into SK-N-AS cells using Nucleofector (AMAXA).
  • AMAXA Nucleofector
  • SK-N-AS cells were transduced with PCDNA3.1.
  • Each transduced cell was seeded in a type I collagen-coated 96-well plate (IWAKI) at 7500 Z-wells, cultured after incubation for 1 or 2 days with various concentrations of tunicamycin, or various tabcigargins were added. , And cultured for 1 day to induce cell death. After the culture, DNA cleavage accompanying cell death was detected using CELL DEATH DETECTION ELISA PLUS kit (Roche). The experimental method followed the experimental manual attached to the kit.
  • the proteins and polynucleotides of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, Prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic diabetic, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid blood, etc.), cancer (eg, colorectal cancer, Breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain cancer, ovarian cancer, blood tumor, etc.) It is useful as a diagnostic marker for proteins, etc., and a modulator obtained by screening using the protein, polynucleotide
  • Alzheimer's disease familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.
  • Parkinson's disease Down's syndrome, Amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.
  • ischemic brain disease eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.
  • Cancer eg, colon, breast, lung, prostate, esophageal, stomach, liver, biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, kidney, brain, ovary It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for cancer, blood tumors, etc.).
  • the antisense polynucleotide of the present invention can suppress the expression of the protein of the present invention.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (family Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic disease] Alzheimer's disease), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Croyfeld-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg , Cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as thyroid cancer, fl splenoid cancer, brain tumor, ovarian cancer
  • Alzheimer's disease (Familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion's disease, Kuittsfeld-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy , Multiple sclerosis, etc.), ischemic brain disease (eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.), cancer (E.g., colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, J3 renal cancer, brain tumor, ovary It is useful for diagnosis, prevention or treatment of cancer, blood, fluid tumors, etc.).
  • ischemic brain disease eg, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, etc.
  • cancer E.g.,

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Abstract

　配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、該タンパク質の遺伝子の発現を調節する化合物、該タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体などは、神経変性疾患、虚血性脳疾患、癌などの予防・治療剤として使用することができる。

Description

明 細 書 神経変性疾患の予防 ·治療剤 技術分野
本発明は、 神経変性疾患の予防 '治療剤ならびにそのスクリーニング、 およ び神経変性疾患の診断薬などに関する。 さらには、 虚血性脳疾患、 癌などの予 防 -治療剤および診断薬などに関する。 背景技術
アルツハイマー病 （Al zhe imer's d i sease) は進行性痴呆および認知能力の失 調を伴う神経変性疾患の代表的なものであるが、 これまでに効果的な治療法は 見出されていない。 アルツハイマー病は高齢化社会を迎えつつある現在におい て最も重要な疾患の一つであることは言うまでもなくその治療薬の開発は医療 経済的にも極めて大きな意義を有する。
一方、 ヒートショックやグルコース飢餓などタンパク質の生合成に影響を与 える因子により小胞体に異常タンパク質が蓄積し、 小胞体にストレスがかかる ことが知られている （小胞体ストレス） 。 生体に小胞体ストレスがかかると、 シャペロン分子をはじめとする小胞体ストレス応答遺伝子群が発現し、 異常夕 ンパク質を修復または分解し、 恒常性の維持を行なう。
' 近年、 種々の神経変性疾患と小胞体ストレスとの関連性が重要視されるよう になった。 遺伝性のパーキンソン氏病である常染色体劣性遺伝性若年性パーキ ンソニズム （AR-JP) の病因遺伝子として Parki nが同定され （Nature, 392巻， 605- 608頁， 1998年） 、 タンパク分解系に関与するュビキチンリガ一ゼである ことが報告されている （Nat . Gene t , 25巻， 302- 305頁， 2000年） 。 さらに Parki nの基質として Pael (Parkin assoc i at ed endo the l i n receptor - 1 ike) 受容体が同定された。 この受容体は高次構造形成が困難なタンパク質で、 この タンパク質の高次構造形成不全体は通常、 速やかに parki nの作用で分解され るが、 タンパク質分解系を抑制すると、 異常 Pae l受容体が小胞体に蓄積し、 その細胞は小胞体ストレスによる細胞死に陥ることが報告されている （Cell, 105巻， 891-902頁， 2001年） 。 さらに家族性アルツハイマー病の原因遺伝子 であるプレセニリン 1の変異を有する細胞が小胞体ストレスに対して脆弱とな ること、 および、 小胞体ストレス応答に関与する Irelの欠失により） 3アミ口 イドの産生が上昇すること （Biochem. Biophysic. Acta, 1536巻， 85-96頁， • 2001年； J. Biol. Chem. , 276巻， 2108- 2114頁， 2001年） が報告されている。
一方、 遺伝子発現を網羅的に解析するために、 cDNAまたはオリゴヌクレオチ ドを固定化したマイクロアレイ法が開発され、 疾患特異的な遺伝子発現の変化 を見出す技術が普及し、 その有用性が確認されている。 例えば、 Affymetrix社 の GeneChipシステムはがんなどの疾患の診断や創薬標的遺伝子の発見に多用さ れつつある。
Sestrin2 (Ses2) (GenBank Accession No. BC013304) は、 p53により発現制 御を受けている PA26と弱い相同性を有する遺伝子である。 PA26は DNA傷害などに より発現上昇する GADDファミリ一の一種として報告されている （Oncogene, 18 巻， 127- 137頁， 1999年）。 また、 Ses2は癌細胞株においては、 虚血、 酸化スト レスにより P53非依存的に発現が上昇し、 DNA損傷を伴う刺激 （UV照射、 ドキソ ルビシン） により、 p53依存的に発現が上昇する。 さらに、 Ses2を高発現させた 癌細胞株は、 血清除去、 DNA損傷による細胞死に感受性であるが、 酸化ストレス、 虚血による細胞死に抵抗性を示す （Oncogene, 21巻， 6017-6031頁， 2002年） 。 安全で優れた神経変性疾患の予防 ·治療剤が求められている。 発明の開示
'本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 小胞体 ストレスを伴う神経細胞死誘導の時に発現が顕著に増加する遺伝子を見出し、 この知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の 発現を調節する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療 剤、
(2) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の 遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予 防 ·治療剤、
(3) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一も.しくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(4) 上記 （3) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(5) 神経変性疾患の予防 ·治療剤である上記 （4) 記載の医薬、
(6) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体、
(7) 上記 （6) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(8) 神経変性疾患の予防 ·治療剤である上記 （7) 記載の医薬、
(9) 上記 （6) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(10) 神経変性疾患の診断薬である上記 （9) 記載の診断薬、
(1 1) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬、
(12) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一おしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする、 上記夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたは その塩の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(13) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有することを特徴とする、 上記夕ンパク質もしくはその部分べプチドまた はその塩の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、 (14) 上記 （12) 記載のスクリーニング方法または上己 （13) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
(15) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポ リヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記タンパク質遺伝子の発現を調 節する化合物またその塩のスクリーニング方法、
(16) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有することを特徴とする、 上記夕ンパク質遺伝子の発現を 調節する化合物またその塩のスクリーニング用キット、
(17) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法または上記 （16) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またその塩、 '
(18) 上記 （14) または （1 7) 記載の化合物またその塩を含有してな る医薬、
(19) 神経変性疾患の予防 ·治療剤である上記 （18) 記載の医薬、
(20) 哺乳動物に対して、 上記 （14) または （17) 記載の化合物また その塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患の予防 ·治療法、 .
(21) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの発現を調節す る、 または上記タンパク質遺伝子の発現を調節することを特徴とする神経変性 疾患の予防 ·治療法 .
(22) 神経変性疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記 （14) または (17) 記載の化合物またその塩の使用などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ッニカマイシン刺激 24時間後における細胞の DNA切断量を OD 405— 492で表す図である。 図中、 縦軸は吸光度を、 横軸はッニカマイシ ンの濃度を示す。 _〇一は対照細胞における DNA切断量を、 一口—は S e s 2遺伝子形質導入細胞における DNA切断量を示す。 図 2は、 ッニカマイシン刺激 4 8時間後における細胞の D N A切断量を O D 4 0 5— 4 9 2で表す図である。 図中、 縦軸は吸光度を、 横軸はッニカマイシ ンの濃度を示す。 —〇一は対照細胞における D N A切断量を、 —ローは S e s 2遺伝子形質導入細胞における D N A切断量を示す。
図 3は、 タブシガーギン刺激 2 4時間後における細胞の D NA切断量を〇D 4 0 5— 4 9 2で表す図である。 図中、 縦軸は吸光度を、 横軸は夕プシガーギ ンの濃度を示す。 一〇—は対照細胞における D N A切断量を、 一口—は S e s 2遺伝子形質導入細胞における D N A切断量を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 本発明のタンパク質 または本発明で用いられるタンパク質と称することもある） は、 ヒトゃ温血動 物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ 一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） もしくはそれら の細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心齓 胸腺、 脾齓 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク 質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列として は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0%以上、 さらに好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 特 に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するァ ミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好 ましい。 具体的には、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質などが挙げられる。
実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理 学的に） 同質であることを示す。 したがって、 上記活性が同等 （例、 約 0. 0 1〜100倍、 好ましくは約 0. 1〜10倍、 より好ましくは 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量などの量 的要素は異なっていてもよい。
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （1) (i) 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程 度、 好ましくは 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましく は数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （Π) 配列番号： 1 で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程度、 好ま しくは 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましぐは数 .（1 〜5) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 1で表され るアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程度、 好ましくは 1 〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程度、 好ましくは 1〜 30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 きらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組 み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含ま れる。 上記のようにアミノ酸配冽が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿 入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明で用い られるタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 （_ C〇OH) 、 カルボキシレ —ト（― C O O— ) 、 アミド （― C O NH 2) またはエステル （一 C O O R) の 何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピル、 n _ブチルなどの C i _ 6アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α —ナフチルなどの C 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニル アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの a—ナフチル— C , _ 2アルキル基などの C 7 _ i 4ァラルキル基、 ピバロィルォキシメチル基など が用いられる。
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカル ポキシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル 化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。 この場合のェ ステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基など の アルカノィルなどの
Figure imgf000009_0001
ァシル基など） で保護されているもの、 生体 内で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したも の、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば—〇H、 ― S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの Cェ _ 6アル力ノィル基などの Cェ― 6ァシル基な ど） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質な どの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で 表されるァミノ酸配列を含有する夕ンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明で 用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明 で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでも よい。
具体的には、 後述する本発明の抗体を調製する目的には、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列において第 1〜3 0番目、 第 2 5 0〜 2 8 0番目のァミノ 酸配列を有するペプチドなどがあげられる。 例えば、 本発明で用いられるタン パク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以 上、 さらに好ましくは 7. 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好まし くは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1 - 5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さら に好ましくは数 （1.〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そのアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数 個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されて いてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （一 C O O H) 、 カルボキシレート （一 C O O— ) 、 アミド （_ C〇NH 2) またはエス テル （一 C O O R) の何れであってもよい。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられ るタンパク質と同様に、 C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキシレ一 ト） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のアミ ノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダル 夕ミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換 基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖 ぺプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いるこ とができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的 に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などと の塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様 な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マ レイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタン スルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩は、 前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方 法によって製造することもできるし、 夕ンパク質をコードする D N Aを含有す る形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述の ぺプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸など e抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 または そのアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることがで きる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル榭脂、 ヒドロキシメチ ル榭脂、 ベンズヒドリルアミン榭脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシ ベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリル アミド樹脂、 4一 （2 ' , 4， —ジメトキシフエ二ル―ヒドロキシメチル） フ エノキシ樹脂、 4— ( 2 ' ， 4， ージメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチ ル） フエノキシ榭脂などを挙げることができる。 このような榭脂を用い、 α— ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の 配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最 後に榭脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を 除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイ ド結合形成反応を実施し、 目 的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルボ ジイミド類としては、 D C C、 N, Ν'—ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν— ェチル— N'— （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t， H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物ま たは H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミ ノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類、 トリフルォロェ夕ノールなどのアルコール類、 ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テ卜ラヒドロフラン などのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二卜リルなどの二トリル類、 酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。 反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 t：〜 5 0 の範囲から適宜選択さ れる。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。. ニン ヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を 行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができ る。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァ セチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないようにすることができる。 原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Bo c、 t—ペンチルォキ シカルボニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4 _メトキシベンジルォキシ 力ルポニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフル ォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエニル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t—ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへ プチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環 状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4—クロ口べ ンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルボニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級 （Ci_6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジル ォキシカルボニル基、 ェトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基など が用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラ二ル基、 t _ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz 1、 C 12 — Bz l、 2_ニトロベンジル、 B r— Z、 t _ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキ シ— 2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約— 2 O t：〜 4 0での温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフイ ド、 1， 4—ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオール などのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール 処理により除去され、 トリブトフアンのインドール保護基として用いられるホ ルミル基は上記の 1 , 2—エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなど の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウ'ム溶液、 希アンモニ ァなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した 後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該 ペプチド鎖の Ν末端のひーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部 分ペプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質また は部分ペプチドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したよ うな混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法に よりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ること ができる。 この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して 精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのァ ミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 力ルポキシ末 端アミノ酸の α—カルボキシル基を所望の 7ルコール類と縮合しアミノ酸エス テルとした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望の夕 ンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のペプチド の合成法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダ ーゼで切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法として は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本 発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と 残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離すること により目的のぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱 離としては、 例えば、 以下の （i) 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。
(i) M. Bodanszky および M.A. Ondetti, ペプチド 'シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ-ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留，カラムクロマトグ ラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用い られる部分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べ プチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって 適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる, 本発明で用いられるタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 前 述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するもので あればいかなるものであってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとして は、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DN Aのいず れでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織 より totalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略称す る） によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で表され る塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を 含有し、 前記した配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DN Aであれば何れの ものでもよい。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列と 約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 さらに好ましくは約 70%以上、 よ り好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 具 体的には、 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNAなどが挙げられ る。 - ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説 明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリ ンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 19〜 40 mM、 好ましくは約 19〜2 OmMで、 温度が約 50〜70°C、 好ましくは約 60〜65 の条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 6 5 の場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコード する DNAとしては、 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNAなど が用いられる。 .
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DN A) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配 列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA, ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の cDNA、 前記した細 胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配 列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNAの一部分を有する DNA、 ま たは配列番号： 2で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイ ブリダィズする塩基配列を含有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性 を有するタンパク質をコードする DNAの一部分を含有する DNAなどが用い られる。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイブリダィズできる DNAは、 前記と 同意義を示す。
ハイブリダィゼーシヨンの方法およびハイストリンジェン卜な条件は前記と 同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする DNAのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明の夕 ンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする DN Aのクローニングの 手段としては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列，の一部分を有する合 成 DNAプライマ一を用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なべク 夕一に組み込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコード する DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼ ーシヨンによって選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市 販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCR、 公知のキット、 例えば、 MutanTM-super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA - LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じ る方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする DN Aは目的によりそのまま、 ま たは所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用するこ とができる。 該 DN Aはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有 し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての T A A、 TG Aまたは TAG を有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合 成 DN Aアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質 をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断 片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造す ることができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 3 25, pUC 12， pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0， pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSH19, p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、' PA1— 1 1、 p XT 1、 pRcZCMV、 pRcZRSV、 p c DNA I ZN e oなどが用い られる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 S R aプロモー夕一、 SV40プロモーター、 L TRプロモー夕一、 CMVプロモーター、 HS V- TKプロモー夕一などが挙げ られる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモ一夕一、 SR aプロ モーターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e c Aプロモーター、 A PLプ 口モーター、 ι ρ ρプロモータ—、 T7プロモーターなどが、 宿主がバチルス 属菌である場合は、 S P〇 1プロモーター、 S PO 2プロモーター、 p e n P プロモー夕一など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロ ΐ一夕一、 PGK プロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモ一夕一などが好ましい。 宿 主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモー夕一 などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne ο 1·と略称する場合がある、 G4 1 8耐性） 等が 挙げられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マーカ一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを 含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル 配列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 a—了 ミラーゼ*シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母で ある場合は、 MF a · シグナル配列、 SUC 2 'シグナル配列など、 宿主が動 物細胞である場合には、 インシュリン 'シグナル配列、 α—インターフエ口 ン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Αを含有す るベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。 ' ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ
(Escherichia col i) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショ ナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ'ザ'ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイ レック .ァシッズ · リサーチ （Nucleic Acids Research) , 9卷， 309 (19 81)〕 ， J Α221 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー
(Journal of Molecular Biology) ， 120卷， 517 (1978)〕 ， HB 1 01 〔ジャーナル 'ォブ 'モレキュラー ·バイオロジー， 41巻， 459 (19 69)] , C 600 〔ジェネティックス （Genetics) ， 39巻， 440 (195 4)〕 などが用いられる。
' バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus
subtil is) M I 1 14 〔ジーン， 24卷， 255 (1983)〕 ， 207 -21 〔ジャーナル 'ォブ 'バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) ， 95 巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス. セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R―， NA87 - 1 1 A, DKD— 5D, 2 0B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) N CYC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、
Mamestra brassicae由来の細胞または Est igmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori 細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細 胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J.しら、 イン ·ヴイボ (In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ 一 (Nature) , 3 15巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Ve r o， チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤ ィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラット GH3, ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ *ォブ ' ザ ·ナショナル，アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスェ - (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 2 1 10 ( 1972)やジーン (Gene) ， 1 7巻， 107 (1982 )などに記載の方法に従って行なうことが できる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネ ラル ·ジエネティックス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 1 1 1 (1 979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ ·イン 'ェンザィモ口ジー
(Methods in Enzymology) , 1 94巻， 182— 187 (1 991) 、 プロシ —ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォ ブ .ザ.ユーエスエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1 929 (1 978) などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆 細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ テクノロジー
(Bio/Technology) ,6, 47 - 55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことがで さる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ ロトコール. 263— 267 (1 9.95) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジー (Virology) , 52巻， 456 ( 1973 )に記載の方法に従って行なうことが できる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現ベクターで 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー， ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩^マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成 長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナル ·ォブ ·ェクスぺリメ ンッ 'イン 'モレキュラー 'ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ， 431—433, Cold Spring Harbor laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働 かせるために、 例えば、 3 /3—インドリルアクリル のような薬剤を加えるこ とができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43 で約 3〜24時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜4 Ot:で約 6〜24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシージングズ. ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 プロシージング ズ.ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 81巻， 5330 ( 198 4) 〕 が挙げられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は 通常約 20ΐ：〜 35でで約 24〜 72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を 加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace s Insect Medium (Grace, T. C.，不イチヤー
(Nature) , 195,788 (1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜カロ えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好 ましい。 培養は通常約 27 で約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌 を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜 20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122巻, 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8巻， 39 6 (1959)) , RPM I 1640培地 〔ジャーナル'ォブ ·ザ ·アメリカ ン ·メアイカル ·アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング' ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン
(Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は 通常約 30t：〜 40 で約15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を 加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の夕 ンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方 法により行なうことができる。'
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超 音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによつて菌体ぁるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適 宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 ト リトン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に夕シ パク質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるい は細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質 の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる < これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用 する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換ク 口マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグ ラフィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ 一などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利 用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られ た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白 修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部 分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリフ°シン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 ダリ コシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィ ムィムノアッセィやウエスタンプロッティングなどにより測定することができ る。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する 抗体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を 認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れで あってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしぐは部分べプチドまたはその塩 （以下、 抗体の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合があ る） に対する抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体 または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位 にそ 自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生 能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行 われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよ びラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種 動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノク口一ナル抗体産生ハイブリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の 標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性 を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature)、 256、 495 (1975)] に 従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレンダリ コール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEG が用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0、 AP— 1 などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は . 1 ： ：！〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6 0 0 0 ) が 1 0〜8 0 %程度の濃度で添加され、 2 0〜4 0 °C、 好ましくは 3 0〜3 7 °Cで 1〜 1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を 実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させ た固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放 射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用いられる 細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合 したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、. 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができる。 通常 HA T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地 としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M l 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ） あるいはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製 薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 ：、 好ま しくは約 3 7でである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定 できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製 ' モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロプリ ンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原 結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により 抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行な うことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原) 自体、 あ るいはそれとキャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗 体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパ ク質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造 することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合 体に関し、 キヤリァ一蛋白質の種類およびキヤリァ一とハプテンとの混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブ ミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる c また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 グルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。 ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうこ とができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分べプチドをコードするポリヌクレ ォチド （例、 DNA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 これらの DNAを本発明の DNAと略記する場合がある） ） の塩基配列に相補 的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンス ボリヌクレオチドとしては、 本発明の DNAの塩基配列に相補的な、 または実 質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該 DNAの発現を抑制し得る 作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであって もよいが、 アンチセンス DNAが好ましい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNA に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは 約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などが 挙げられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻 害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列 など） の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンスポリ ヌクレオチドが、 （口） RNa s eHによる RNA分解を指向するアンチセン スポリヌクレオチドの場合は、 イントロンを含む本発明の DN Aの全塩基配列 の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90% 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドがそれぞれ好適である。
具体的には、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する DN Aの塩基配 列に相補的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有す るアンチセンスポリヌクレオチド、 好ましくは例えば、 配列番号： 2で表わさ れる塩基配列を含有する DN Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部 分を有するアンチセンスポリヌクレオチド （より好ましくは、 配列番号： 2で 表わされる塩基配列を含有する DNAの塩基配列に相補な塩基配列、 またはそ の一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド） などが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 10〜40個程度、 好ましくは 15 〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレア一ゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホ スホロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修 飾りん酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシ リポース） は、 2， —0 _メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていても よいし、 塩基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであっても よく、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D N Aにハイブリダィズす るものであればいずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチ ドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害するこ とのできるアンチセンスポリヌクレオチドを、 クローン化した、 あるいは決定 されたタンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し、 合成し うる。 かかるヌクレオチド （核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝子の R N Aと ハイブリダィズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害することが できるか、 あるいは本発明のタンパク質関連 R N Aとの相互作用を介して本発 明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のタンパ ク質関連 R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明 のタンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダィズすることができるポリヌク レオチドは、 生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 - 制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定 の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド. 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレ ォチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド
(蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5 ' 端ヘアピン ループ、 5 ' 端 6—ベースペア ' リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド 翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳領 域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループは好ましい対象 領域として選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選 択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関 係は、 対象物とハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンスポリヌクレオチド は、 2—デォキシ— D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポ ースを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グ 'リコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド 骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特 異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングゃ塩基の 付着を許容する配置をもつヌク 1 ォチドを含有する） などが挙げられる。 それ らは、 2本鎖 D N A、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R N A、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： R N Aハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド (または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化 されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内 ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネ ート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つ もの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌク レア—ゼ*インヒビ夕—、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L—リ ジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有している もの、 インターカレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つ もの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性 の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合 を持つもの （例えば、 ひァノマ一型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌ クレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジ ン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつような ものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリ ミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を 含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチ ドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲン とか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官 能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 R NA、 D N A、 あるいは修飾 された核酸 （R N A、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては核酸 の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃォ リゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする. アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親 和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の 毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al . , P arm Tech Japan, Vol . 8， pp. 247, 1992 ; Vol . 8, pp. 395, 1992 ; S. T.
Crooke et al . ed. , Ant i sense Research and Appl icat ions, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性めものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸 の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオ シド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5， 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレ ァ一ゼ、 R N a s eなどのヌクレア一ゼによる分解を阻止するためのものが挙 げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テト ラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水 酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は； 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系 を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用 できる。 以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べ プチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D N A (以下、 本発明の D N Aと 略記する場合がある） ） 、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそ の塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 および本発 明の D NAのアンチセンスポリヌクレオチド （以下、 本発明のアンチセンスポ リヌクレオチドと略記する場合がある） の用途を説明する。 ( 1 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は小胞体ストレスを伴う神経細胞死により発現が上昇し、 小胞体ストレス依存性の細胞死を抑制する。 一方、 癌細胞株においては、 虚血、 酸化ストレスにより P53非依存的に発現が上昇し、 DNA損傷を伴う刺激 （UV照射、 ドキソルビシン） により、 P53依存的に発現が上昇する。 さらに、 本発明のタン パク質を高発現させた癌細胞株は、 血清除去、 DNA損傷による細胞死に感受性で あるが、 酸化ストレス、 虚血による細胞死に抵抗性を示す。 従って、 本発明の タンパク質の活性を調節する化合物またはその塩は、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬 化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿 病性ニュ一ロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも 膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝 臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤として使用することがで きる。
したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を調節する 化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明 のタンパク質の活性を調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩のスク リーニング方法を提供する。
具体的には、 （i) 本発明のタンパク質の活性と、 （i i ) 本発明のタンパク質 と試験化合物の混合物の活性との比較をすることを特徴する本発明のタンパク 質の活性を調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩のスクリーニング 方法が用いられる。
上記の本発明の夕ンパク質は、 本発明の夕ンパク質を産生する能力を有する 細胞を培養することによって製造されたものなどが用いられる。 さらには、 前 記細胞の培養液、 その上清、 細胞破碎物などを用いてもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するベクターで形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C H O細胞、 H E K 2 9 3細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スク リーニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタン パク質を細胞外に分泌させる、 または細胞内に発現させる形質転換体が好まし く用いられる。 本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、 前記した 本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあ げられる。 例えば、 上記 （i i) の場合における活性が上記 （i ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上上昇させる試 験化合物を、 本発明のタンパク質の活性を促進する化合物として、 上記 （i i ) の場合における活性が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる試験化合物を本発明のタン パク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のタンパク質の活性を促進する活性を有する化合物は、 本発明のタン パク質の作用を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、 本発明のタン パク質の生理活性を抑制する めの安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非 プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どから選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明のぺプ チドの塩と同様のものが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子も、 小胞体ストレスを伴う 神経細胞死誘導により発現が増加するので、 本発明のタンパク質をコードする 遺伝子の発現をする化合物またはその塩は、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アル ッハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性ァ ルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プ リオン病、 グロイツフェルト一ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニュ 一口パチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血 など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの予防 .治療剤として使用することができる。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A) は、 本発明のタンパ ク質をコ一ドする遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニン グのための試薬として有用である。
スクリ "^ニング方法としては、 （H i) 本発明のタンパク質を産生する能力を 有する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存在下、 本発明で用いられ るタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うこと を特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、 （i i i ) と （iv) の場合における、 前記遺伝子の発現量 (具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードする mR N A量） を測定して、 比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を認識す る抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウエスタン 解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することが できる。
mR NA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プローブとして配列番号： 2ま たはその一部分を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダィゼーシヨン、 あ るいはプライマーとして配列番号： 2またはその一部分を含有する核酸を用い る P C R法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、 上記 （iv) の場合における遺伝子発現量を、 上記 （i i i) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上上 昇させる試験化合物を、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進 する化合物として、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の 発現を抑制する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明で用いられるタンパク質もしく は部分ペプチドまたはその塩、 または本発明で用いられるタンパク質もしくは 部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動 物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明の夕 ンパク質の活性を調節する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用 いられる。
本発明の夕ンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、 および本発明の タンパク質をコ一ドする遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩はそれぞ れ、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮 '14.側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性 脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前 立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精 巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの予防，治療 剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の予防 '治療剤として使用する場合、 常套手段に 従って製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的 には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあ げられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野におい て通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネ シゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関 節内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは 油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液と しては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが 用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリ アルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非ィォ ン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 80、 HCO- 50 (polyoxyethylene (5 Omol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕 なとこ併用してもよレ 。 油性 液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息 香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液 は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記 抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。 上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 Q.0mg、 とりわけ注射剤では 5〜100mg、 その他の剤形では 10〜250 m gの上記化合物が含有され ていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用 を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口 的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 アルツハイマー病の治療の目的で本発 明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一 般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物またはそ の塩を約 0.1〜： L 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜 50 mg、 より好ましくは 約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはそ の塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 ァ ルツハイマー病の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を調節する化合物ま たはその塩を注射剤の形で通常成人 （体重 60 kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物またはその塩を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射に より投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O kg当たりに換 算した量を投与することができる。
(2) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検波中 の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに 使用することができる。
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を 測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質の定量法、 および (ii) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質の定量法を提 供する。
上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体 であることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的に は、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F(al)')2 、 Fa ある いは Fab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体—抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定 法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合 法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記 酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 0—ガラクト シダーゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダー ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フル ォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物 質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲ ニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチ ン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。. 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成榭 脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体 を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらし て行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じること ができる。 また、 サンドイツ,チ法による免疫測定法において、 固相用抗体ある いは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感 度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタン パク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次 反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体 が、 本発明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体 は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ る。
競合法では、 被検波中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し ( B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B / F分離をポリエチレ ングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い 第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法.とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の坊原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力、、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザ一ネフロメト リーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の夕ンパク質の測定 系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成 書などを参照することができる。 例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Par t A))、 同書 Vol.
73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part
D:Selected Immunoassays)) , 同書 Voし 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and
Monoclonal Ant ibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク 質を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量すること によって、 本発明のタンパク質の濃度の増加または減少が検出された場合、 例 えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年 性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウ ン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハン チントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾 患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺 癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などである、 または将来 罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン パク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の夕ン パク質の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのた めに使用することができる。
(3) 遺伝子診断薬
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DN Aまたは mRN Aの異常 (遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DN Aまたは mRN Aの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加ある いは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダィゼーションゃ PCR— SSCP法 （Genomics，第 5巻， 874〜879頁 (1989年)、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，第 86巻， 2766〜2770頁（1989年））などにより実施することが できる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼーシヨンにより発現過多または減少が検出 された場合や P C R— S SCP法により D N Aの突然変異が検出された場合は、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年 性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウ ン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハン チントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾 患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺 癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などである可能性が高い と診断することができる。
(4) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の DN Aに相補的に結合し、 該 DN Aの発現を抑制することができる 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発 明のタンパク質または本発明の D N Aの機能を抑制することができるので、 例 えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年 性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウ ン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハン チントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾 患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺 癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤とし て使用することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場 合、 自体公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロ ウィルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソシエーテツ ドウィルスベクタ一などの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチ センスポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤な どの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲル力 テ一テルのようなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾル化し て吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目 的に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担 体とともに製剤 （注射剤） 化し、 静脈、 皮下、 病変部等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ル —卜などにより差異はあるが、 例えば、 アルツハイマー病の治療の目的で本発 明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k g ) においては、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0 . 1〜 1 0 O m g投与する。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の DN Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ一 ブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコード する RNAの一部を含有する二重鎖 RNA、 本発明のタンパク質をコードする RN Aの一部を含有するリボザィムなども、 本発明の遺伝子の発現を抑制する ことができ、 生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用 いられる DN Aの機能を抑制することができるので、 例えば、 神経変性疾患
〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬 化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿 病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも 膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 龍、 肝 臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤などとして使用すること ができる。
二重鎖 RNAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7巻， 221 頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする RNAの一部に 公知のリポザィムを連結することによって製造することができる。 本発明の夕 ンパク質をコードする RN Aの一部としては、 公知のリボザィムによって切断 され得る本発明の RNA上の切断部位に近接した部分 （RNA断片） が挙げら れる。 '
上記の二重鎖 RNAまたはリボザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場 合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することがで さる。
(5) 本発明の抗体を含有する医薬 本発明の抗体は、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アル ッハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パ 一キンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェル トーヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症 など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱 癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） な どの予防 ·治療剤として使用することができる。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成 物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための.組成物としては、 固体または液体の剤 形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒 剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁 剤などがあげられる。 かかる組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野 において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン 酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤など の剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体 またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸 濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な 溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O - 5 0 (po l yoxye thyl ene (50mo l) adduc t o f hydrogenated cas tor o i l ) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例え ば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベ ンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当な アンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩 を通常の坐薬用基剤に混合することによつて調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜 2 5 0 m gの上記抗体が含有されて いることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま 液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口 的または非経口的 （例、 静脈投与） に投与することができる。 投与量は、 投与 対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の アルツハイマー病の治療のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量と して、 通常 0 . 0 1〜2 O m gZ k g体重程度、 好ましくは 0 . 1〜： L O m g Z k g体重程度、 さらに好ましくは 0 . l〜5 m g Z k g体重程度を、 1日 1〜5 回程度、 好ましくは 1日 .1〜3回程度、 注射剤として投与するのが好都合であ る。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することが できる。 症状が特に蓽ぃ場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
また、 本発明の抗体は、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家 族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病な ど） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイ ッフェルト一ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発 性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎 癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍 など） などの診断薬としても有用である。
(6) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明 の外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DN Aと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 (2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物， .
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキス卜ラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作 出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公 知の細胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出す ることもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B6 C3 Fi系統， BDFi系統， B6D2 F!系統， BALBZc系統， I CR系統など） または ラット （例えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒ卜哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DN Aも含まれる。 該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DN Aを意 味し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現 させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるに あたっては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し た DNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明 のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本 発明のヒト DNAを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクタ一など） を対 象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションする ことによって本発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出すること ができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯 草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオ ファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィル スまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DN A発現調節を行なうプロモー夕一としては、 例えば、 （i) ウィル ス （例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳がんウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプ 口モーター、 (ii) 各種哺乳動物 （ヒ卜、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスター '、 エリスロポエチン、 ェン ドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダル夕チォ ン S—トランスフェラ一ゼ、 血小板由来成長因子 )3、 ケラチン K l, K 1 0お よび K 1 4、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク. 質キナーゼ /3 Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォス ファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ (一般に T i e 2と略される） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵 素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタロチォネィ ン Iおよび I I A、 メタ口プロティナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン )3—水酸化酵素、 甲状 腺ペルォキシダ一ゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 α) 、 βァ クチン、 αおよび 3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎夕 ンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VN P) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑 筋 aァクチン、 プレプロエンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモータ一 などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウ ィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 α) のプロモー ター、 ヒトおよびニヮトリ /3ァクチンプロモーターなどが好適である。
上記べクタ一は、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R ΝΑの転写を終結する配列 （一般にタ一ミネタ一と呼ばれる） を有している,こ とが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Αの配 列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネ夕 一などが用いられる。 その他、 目的とする外来性 DN Aをさらに高発現させる目的で各 DN Aのス プライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一部な どをプロモーター領域の 5'上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳 領域の 3' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の 肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎 臓、 甲状腺細 J3¾、 線維芽細胞由来 RN Aより公知の方法により調製された相補 DN Aを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DN Aは、 上 記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘 発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DNAが存在することは、 作出動 物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有す る。
本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 DN Aを安定に保持することを確認して、 該 DN A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DNA転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種 の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有する。
導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように 繁殖継代することができる。
本発明の正常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D N Aが高発 現させられており、 内在性の正常 D NAの機能を促進することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物 として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病 態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である また、 本発明の外来性正常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 の夕ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾 患に対する予防 ·治療剤、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族 性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病な ど） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイ ッフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発 性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎 癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍 など） などの予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D N Aを前述の プラスミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの D N Aコンストラクトは、 通常の D N A工学的手法によって作製することができ る。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出 動物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有すること を意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その 胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができ る。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D N Aが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル 動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用 いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの 疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質によ る正常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとな る。
また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質または機能不活 性型不応症に対する予防 ·治療剤、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー 病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性ァルツハイマ 一病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 (例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓 癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血 液腫瘍など） などの予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。 また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、 (i) 組織培養のための細胞源としての使用、
(ii) 本発明の DNA転移動物の組織中の DNAもしくは RNAを直接分析す るか、 または DN Aにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本 発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性 についての解析、
(iii) DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （iii) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる c さらに、 本発明の DN A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器にお けるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該 疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などのタンパク質分解酵素により、 遊離した DNA転移細胞の取得、 その培養 またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の夕 ンパク質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 ま たはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなど ができ、 本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料とな る。
さらに、 本発明の DN A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行な うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療 薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転 移動物または本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク 質が関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。 (7) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の 3—ガラクトシダ一ゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、 (5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の |3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺 乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の 発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺 乳動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの 発現能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質 の活性を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のタンパク 質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DN Aと称することがあ る） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DN Aに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 DNA配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊す ることにより本発明のノックアウト D N Aを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の DNA不活性化 ES細胞または本発明のノックアウト ES細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイ'シン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (/3—ガラクトシダ ーゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子） を代表'とするレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる DNA配列 （例えば、 p o 1 yA付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメ ッセンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊 するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕ーゲッティングべ クタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DN A上あるいはその近傍の DN A配列を プローブとしたサザンハイブリダィゼ一ション解析あるいは夕ーゲッティング ベクター上の DNA配列とターゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をプライマーとした PC R法により解析し， 本発明のノックアウト ES細胞を選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞と しては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝 的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57BLZ6マ ウスや C 57 BLZ 6の採卵数の少なさを DBAZ 2との交雑により改善した BDFiマウス （C 57 BLZ6と DB AZ2との F を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 BDF マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫で あるという利点に加えて、 C 57 BL/6マウスを背景に持つので、 これを用 いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BLZ6マ ウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ6マウスに代え ることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効 率よく多数の初期胚を取得することができる。 .
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生 殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数 を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むの で、 培養初期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこ とが可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間 は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常 数の 100 %が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞) に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、.通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1〜
10000U/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95 %空 気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 で培養するなどの 方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZED T A溶液 （通常 0.001〜 0.5%トリプシン /0. l〜5mM EDTA、 好ましくは約 0.1%トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法など がとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行なうが、 この際に細胞の 観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄す ることが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び H. Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. , Martin プロ シーディングス 'ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ユーェ スエー （Proc. Natl. Acad. Scに U.S.A.) 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C.
Doetschman ら、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジー ·アンド ·ェクスぺリメ ン夕ル ·モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化 させて得られる本発明の DNA発現不全細胞は、 インビト口における本発明の タンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別 することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製 した夕一ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し, 導入により夕一ゲッティングベクタ一の本発明の D N Aが不活性化された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色 体上の本発明の DNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DN Aをノックアウトさせることができる。
本発明の DN Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の DN A上またはその 近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ一ション解析または ターゲッティングベクター上の DNA配列と、 ターゲッティングベクターに使 用したマゥス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ 一とした P C R法による解析で判定する.ことができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細 胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化され た細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をも つ細胞と人為的に変異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成され るキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個 体を、'例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 こ のようにして得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個 体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの 産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D NA溶液を注入することにより夕ーゲッティングベクタ一を染色体内に 導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトラ ンスジヱニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常 の飼育環境で飼育.継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち, 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N A を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザ ィゴ一ト動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になる ような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴ一 ト動物の雌雄を交配することにより、 薛不活化 D N Aを有するホモザィゴート およびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質によ り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活 性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因 究明及び治療法の検討に有用である。
( 7 a ) 本発明の D N Aの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷な どに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに 用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D N A の欠損や損傷などに起因する疾病、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー 病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性ァルツハイマ —病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌
(例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓 癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血 液腫瘍など） などに対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその塩のスク リーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D N A発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物 であってもよい。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択す
ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質 などにあわせて適宜選択することができる。
例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若 年性ァルツハイ 一病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダ ゥン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハ ンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳 疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立 腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などに対して治療- 予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D N A発現不全 非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、 試験化合物非投与群と神経細胞死数の 違い、 種々のタンパク質量の違いなどを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該 試験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 - 予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリ一二ング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から 選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起 こされる疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低 毒性な予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記ス クリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることがで きる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩どしては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 (例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） と の塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜ま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
' 該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体 重 60 kgとして） のアルツハイマー病患者においては、 一日につき該化合物 を約 0.1〜： I 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は 投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 該化 物を注射剤の形 で通常成人 （60 kgとして） のアルツハイマー病患者に投与する場合、 一日 にっき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが 好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与するこ とができる。
(7 ) 本発明の DN Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対する プロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物 としては、 前記した本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明 の DN Aがレポーター遺伝子を導 することにより不活性化され、 該レポ一タ 一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが 用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 —ガラクトシ ダーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはル シフェラ一ゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DNAをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非 ヒト哺乳動物では、 レポ一ター it伝子が本発明の DNAに対するプロモーター の支配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレー スすることにより、 プロモー夕一の活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の )3—ガラクトシダーゼ遺伝子 （ 1 ac Z) で置換している場合、 本来、 本発明 の夕ンパク質の発現する組織で、 本発明の夕ンパク質の代わりに) 3—ガラクト シダ一ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモ—4一クロ口— 3—インド リル一 j3_ガラクトピラノシド （X—g a l) のような ]3—ガラクトシダ一ゼ の基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の 動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明の タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し， リン酸緩衝生理食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温 または 37T:付近で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を ImM EDTAZPBS溶液で洗浄することによって、 i3—ガラクトシダ一ゼ反応を 停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRN Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモーター 活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基'（例、 ァ ルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩な どが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物また はその塩は、 本発明のタンパク質の発現の調節、 該タンパク質の機能を調節す ることができるので、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性ァ ルツハイマ一病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフエ ルトーヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発性硬化 症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱 癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） な どの予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラッ卜、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害 する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） のアル ッハイマー病患者においては、 一日につき該化合物を約 0 . 1〜 1 0 0 m g、 好 ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患など によっても異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻 害する化合物を注射剤の形で通常成人 （60 kgとして） のアルツハイマー病 患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ま しくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静 脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たり に換算した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに 対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその ί^.をスクリ —ニングする上で極めて有用であり、 本発明の DN Α発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞 に注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能 となる。 さらに上記プロモー夕一部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体 内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探 索系として使用できる。
(8) 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防，治療剤
本発明のタンパク質は小胞体ストレスを伴う神経細胞死により発現が上昇し、 小胞体ストレス依存性の細胞死を抑制する。 一方、 癌細胞株においては、 虚血、 酸化ストレスにより P53非依存的に発現が上昇し、 DNA損傷を伴う刺激 （UV照射、 ドキソルビシン） により、 P53依存的に発現が上昇する。 さらに、 本発明のタン パク質を高発現させた癌細胞株は、 血清除去、 DNA損傷による細胞死に感受性で あるが、 酸化ストレス、 虚血による細胞死に抵抗性を示す。
したがって、 本発明のタンパク質をコードする DN Aに異常があったり、 欠 損している場合あるいは本発日 の夕ンパク質め発現量が減少している場合には、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若 年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダ ゥン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハ ンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳 疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立 腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの種々の疾患が 発症する。
したがって、 本発明のタンパク質および本発明の D N Aは、 例えば、 神経変 性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性ァルツハイ マー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮 性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏 病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗 塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、.肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤として使用する ことができる。
例えば、 生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているた めに、 本発明のタンパク質の活性が十分に、 あるいは正常に発揮されない患者 がいる場合に、 （ィ） 本発明の D NAを該患者に投与し、 生体内で本発明の夕 ンパク質を発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の D NAを挿入し、 本発明のタンパク質を発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって， または （八） 本発明のタンパク質を該患者に投与することなどによって、 該患 者における本発明のタンパク質の役割を十分に、 あるいは正常に発揮させるこ とができる。
本発明の D N Aを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 該 D NAを単 独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウィル スァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常 套手段に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認めら れる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテ 一テルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なくと も 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好まし くは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もし くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの 注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質を生理学的 に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤など とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和すること によって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された 範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のよう な香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記夕 ィプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウ ムなど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエ チレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルべ一ト 8 0TM、 HCO— 50など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩 酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレング リコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプ ルに充填される。
本発明の DNAが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非 経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与するこ とができる。
本発明のタンパク質の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 アルツハイマー病の治療目的で本発明のタンパク質 を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日 にっき該タンパク質を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該 タンパク質の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例え ば、 アルツハイマー病の治療目的で本発明のタンパク質を注射剤の形で成人 （ 体重 60 kgとして） に投与する場合、 一日につき該タンパク質を約 0. 01 〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. ：!〜 10 mgを患部に注射することにより投与するのが好都合である。 他の動物の場合 も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学 異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする <
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d ATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグァノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ダリシン
A l a ァラニン
V 1 バリン
Le u ロイシン
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
Ar g アルギニン H i s ： ヒスチジン
Ph e ： フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
Tr p ： トリブトファン
P r o ： プロリン
As n ：ァスパラギン
G i n ： グル夕ミン
p G 1 υ ： ピログルタミン酸
S e c ：セレノシステ^!ン selenocys teine)
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
Me メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基 .
P h フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) —カルポキサミド基
To s p—トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
Cl2-Bzl 2, 6—ジクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1一 z 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r -Z 2 _ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t一ブトキシカルボニル
DNP ジニトロフエニル
T r t 卜リチル
Bum t一ブトキシメチル
Fm o c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル HOB t 1ーヒドロキシベンズ卜リアゾール
HOOB t 3， 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4—ォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB 1-ヒドロキシ- 5-ノルボルネン -2， 3-ジカルボキシィミド DCC 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
配列番号： 2で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕 .
GenBank Accession No. BC013304 (ヒト Ses2) の塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 3で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
配列番号： 8で示される塩基配列がコ一ドするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 2で示される塩基配列の 958番目の Aが Gに置換された配列を示 す。 以下において、 実施例により本発明をより具体的にするが、 この発明はこれ らに限定されるものではない。
実施例 1
小胞体ストレスで発現変動する遺伝子群を明らかにするため、 以下のような 実験を行った。
タイプ I型コラーゲンコート 24穴プレート （SUMIL0N) に TP-17の CDラット （日 本チャールズリバ一） より調製したラット初代神経細胞を B27含 Neurobasaけ咅地
(NB培地： GIBC0) に懸濁した後、 25万個 Zwellで播種し 3日間培養した。 （i) 上記培養細胞に最終濃度 ΙΟΟηΜとなるようッニカマイシン （Tnc) を添加し、
(ii) 上記培養細胞に最終濃度 2nMとなるよう夕プシガーギン （Thap) を添加し、 または （iii) 上記培養細胞を、 グルコースを含まない B27含 DMEM培地で 2回培地 交換した後、 3mMとなるよう 2-デォキシグルコース （2DG) を添加し、 それぞれ 4、 8および 24時間後に細胞より RNeasy Mini kit (キアゲン） を用いて実験手引き 書に従い total RNAを抽出した。 対照として上記薬剤 （Tnc、 Thapおよび 2DG) の 代わりに、 各培地を添加した細胞 （薬剤非添加細胞） を用いた。 これらを材料 として ol igo匿 leotide microarray (Rat Genome U34B; Affymetrix社) を用レ て遺伝子発現解析を行った。
実験方法は、 Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。 各薬剤刺激した細胞と非添加の細胞の遺伝子発現プロファ ィルを比較した結果、 GenBank No. AI013865が、 各小胞体ストレス刺激 〔上記
(0 、 (ii) および （iii) 〕 により発現亢進していた （表 1) 。
〔表 1〕
細胞— 遺伝子発現 J
Tnc刺激 4時間後 4.86
非刺激 4時間後 1.29
Tnc刺激 8時間後 5.73
非刺激 8時間後 1.24
Tnc 24時間後 7.31
非刺激 24時間後 1.48
Thap刺激 4時間後 10.57
非刺激 4時間後 1.79
Thap 8時間後 12.93 非刺激 4時間後 1.61
Thap刺激 24時間後 12.31
非刺激 24時間後 1.78
2DG添加 4時間後 12.48
非刺激 4時間後 1.43
2DG添加 8時間後 12.44
非刺激 8時間後 1.05
2DG添加 24時間後 12.73
非刺激 24時間後 1.07
a遺伝子発現量は、 oligonucleotide microarrayで発現が検出された presenceを示す遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した。 実施例 2
小胞体ストレスにより発現亢進した GenBank No. AI013865の発現に )3アミ口 イド刺激が影響を与えるか否かを検討する目的で、 0アミロイド刺激した細胞 を用いて実施例 1と同様に遺伝子発現解析を行なった。
実施例 1と同様に調製したラット初代神経細胞を N2含 DMEM培地 （GIBC0) に懸 濁した後、 25万個 Zwellで播種し 4日間培養した。 培養後、 最終濃度 25^Μとな るよう上記培地で懸濁した3アミロイドを添加し、 4、 8、 24時間後に実施例 1 と同様に、 細胞より total RNAを抽出し、 遺伝子解析を行なった。 対照には /3ァ ミロイドの代わりに上記培地を添加した細胞を用いた。 対照と比較して、 ）3ァ ミロイドで刺激した細胞で GenBank No. AI013865遺伝子の発現が亢進していた (表 2) 。
〔表 2〕
細胞 遺伝子発現量
/3アミ Πイド刺激 4時間後 1.86
非刺激 4時間後 . 1.68
0アミロ仆'刺激 8時間後 3.03 非刺激 8時間後 1.44
0アミロイド刺激 24時間後 5.17
非刺激 24時間後 ― 1.88
a遺伝子発現量は、 oligonucleotide microarrayで発現が検出された
presenceを示す遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した。 . 実施例 3
Sestrin2 (Ses2) が細胞死に与える影響を検討する目的で、 ヒト Ses2のクロ —ニングを行ない、 一過性形質導入を用いて Ses2遺伝子発現細胞を作製し、 細 胞死誘導系に供した。
(1) GenBank No. AI013865に対応するヒトオルソログの同定
GenBank No. AI013865をクエリ一にして GenBankにおいて Blast N検索を行つ たところ、 マウス由来の GenBank No. BC005672と高い相同性 （約 90%) を有し ていた。 次に、 このマウスの配列をクエリ一にして、 Genbankにおいて Blast N 検索を行ったところ、 Sestrin2 (GenBank No. BC013304) が最も高い相同性を 有していた。 よって、 GenBank No. AI013865に対応するヒトオルソログは、 Sestrin2である。
(2) ヒト Ses2の細胞死誘導に対する影響
ヒト神経芽細胞腫 SK- N-AS細胞 （ATCCより購入） に最終濃度 500nMとなるよう タブシガーギンを添加し 8時間培養した。 培養後、 IS0GEN (二ツボンジーン） を 用いて total RNAを抽出した。 得られた total RNAを铸型として RNA PCR kit
(TAKARA) を用いて逆転写反応を行なった。 ヒト Ses2遺伝子の増幅のため、 合 成プライマ一 （配列番号： 3および配列番号： 4) と、 酵素として Pfu turbo (ストラタジーン） を用い、 以下の （1) 〜 （5) の条件で PCRを行ない、 特異的 な PCR産物を得た。
(1) 95X: 30秒
(2) 95 10秒— 68で 10秒一 72T 2分を 3回
(3) 95 10秒— 66°C 10秒— 72で 2分を 3回
(4) 95 10秒— 64で 10秒— 72 2分を 3回 (5) 95t: 10秒一 62°C 10秒一 72°C 2分を 35回
(5) 1T 5分
得られた PCR産物 ¾;、 pCDNA3.1-/V5-His T0P0 (インビトロジェン） へクロー エングし、 大腸菌 DH 5 αを形質転換した。
得られたコロニー、 合成プライマ一 （配列番号： 5および配列番号： 6) お よび酵素として ExTaq (TAKARA) を用いて PCRを行ない、 PCR産物を得た。. この PCR産物中の基質を ExoSAP-IT (アマシャムフアルマシア） により分解後、 これ をテンプレー卜として BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
(ABI) を用いてシーケンス反応を行ない、 シーケンス産物を 3100 Genetic analyzer (ABI) で解析した。 ヒト Ses2遺伝子の挿入されたプラスミドを含有す るコロニーを LB培地で培養し、 QUAGEN plasmid midi kit (キアゲン） を用いて ベクターを回収した。 この Ses2遺伝子発現べクタ一を Nucleofector (AMAXA) を 用い、 SK-N- AS細胞へ形質導入した。 対照として PCDNA3.1を SK-N-AS細胞へ形質 導入した。
各形質導入細胞をタイプ Iコラーゲンコート 96穴プレート （IWAKI) へ 7500個 Zゥエルで播種し、 1晚培養後、 ッニカマイシンを種々の濃度で添加し 1日また は 2日間培養し、 またはタブシガーギンを種々の濃度で添加し 1日間培養し、 そ れぞれ細胞死を誘導した。 培養後、 細胞死に伴う DNA切断を、 CELL DEATH DETECTION EL ISA PLUS kit (ロッシュ） を用い検出した。 実験方法は、 キットに 添付された実験手引き書に従った。
結果を図 1〜図 3に示す。
PCDNA3.1形質導入 SK- N- AS細胞 （対照細胞） と比較して、 ヒト Ses2遺伝子形質 導入細胞では DNA切断が抑制されていた。 これより、 Ses2が細胞死抑制作用を有 することが明らかである。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質およびポリヌクレオチドは、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発 性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性二 ユーロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出 血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの診断マーカー等として有用であり、 該夕ンパク 質、 ポリヌクレオチドまたは該タンパク質に対する抗体などを用いるスクリー ニングにより得られる調節剤、 該タンパク質に対する中和抗体などは、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アル ッハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチント ン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道 癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺 癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤として使用 することができる。
また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 本発明のタンパク質の発 現を抑制することができ、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家 族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病な ど） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイ ッフェルト一ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発 性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎 癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 fl萃臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍 など） などの疾病の予防 ·治療剤として使用することができる。 さらに、 本発 明の各種のポリヌクレオチドは例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病
(家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー 病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 ク 口イツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 虚血性脳疾患 （例、 脳梗塞、 くも膜下出血など） 、 癌 (例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓 癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 J3萃臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血 ,液腫瘍など） などの診断、 予防または治療に有用である。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発 現を調節する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤 c
2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺 伝子の発現を調節する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予 防，治療剤。
3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌ クレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその 一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
4 . 請求項 3記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
5 . 神経変性疾患の予防 ·治療剤である請求項 4記載の医薬。
6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対す る; fcTL体。
7 . 請求項 6記載の抗体を含有してなる医薬。
8 . 神経変性疾患の予防 ·治療剤である請求項 7記載の医薬。
9 . 請求項 6記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 0 . 神経変性疾患の診断薬である請求項 9記載の診断薬。
1 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。
1 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする、 上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 含有することを特徴とする、 上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 4 . 請求項 1 2記載のスクリーニング方法または請求項 1 3記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。
1 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記タンパク質遺伝子の発現を調節 する化合物またその塩のスクリーニング方法。 '
1 6 . ' 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有することを特徴とする、 上記タンパク質遺伝子の発現を調 節する化合物またその塩のスクリーニング用キット。
1 7 . 請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られうる化合物またその塩。
1 8 . 請求項 1 4または請求項 1 7記載の化合物またその塩を含有してなる
1 9 . 神経変性疾患の予防 ·治療剤である請求項 1 8記載の医薬。
2 0 . 哺乳動物に対して、 請求項 1 4または請求項 1 7記載の化合物またそ の塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患の予防 ·治療法。
2 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの発現を調節する. または上記タンパク質遺伝子の発現を調節することを特徴とする神経変性疾患 の予防 ·治療法。
2 2 . 神経変性疾患の予防■治療剤を製造するための請求項 1 4または請求 項 1 7記載の化合物またその塩の使用。
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