WO2004024760A1 - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

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WO2004024760A1
WO2004024760A1 PCT/JP2003/011630 JP0311630W WO2004024760A1 WO 2004024760 A1 WO2004024760 A1 WO 2004024760A1 JP 0311630 W JP0311630 W JP 0311630W WO 2004024760 A1 WO2004024760 A1 WO 2004024760A1
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present
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salt
cancer
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PCT/JP2003/011630
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Inventor
Atsushi Nakanishi
Yumiko Uno
Yoji Sagiya
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a novel sodium-dependent bile acid transporter protein, a polynucleotide encoding the protein, a compound that promotes or inhibits the activity of the protein, a compound that promotes or inhibits the expression of the protein gene, and the like. And a compound obtained by the screening method. Furthermore, the present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases (preferably Parkinson's disease group and the like) and screening thereof.
  • Background art preferably Parkinson's disease group and the like
  • Bile acids are synthesized in the liver and secreted into the small intestine, and play an important fi role in promoting absorption of lipids, fat-soluble vitamins, and cholesterol in the small intestine. Bile acids are efficiently reabsorbed mainly from the small intestine (ileum), return to the liver via the portal vein, and are excreted again in the bile (enterohepatic circulation). Since the body cholesterol pool size is controlled not only by dietary cholesterol but also by the bile acids in the enterohepatic circulation, the bile acid intestine using a bile acid adsorbent (anion exchange resin) is used. The treatment of hypercholesterolemia is being controlled by suppressing the reabsorption of cholesterol.
  • a bile acid adsorbent anion exchange resin
  • Parkinsonism is a degenerative disease in which dopamine deficiency occurs in the striatum with nerve endings due to degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra, and extrapyramidal dyskinesia appears.
  • Tremor, muscular rigidity, slow motion, immobility and postural reflex disorder are the four main subjects. The prevalence is about 100 per 100,000. The etiology is unknown and the involvement of some poisoning substance is presumed.
  • NTCP NaVtaurocholate cotransransporting
  • polypept ide is mainly expressed in the liver
  • ISBT Ile sodium sodium I bile sal t cotranspor ier
  • the sodium-dependent bile acid transporter is thought to play an important role in the transport of bile acids in the liver and small intestine, but its detailed relevance to mechanism-related diseases is not so clear. Not. Elucidation of the role of sodium-dependent bile acid transporter in detailed substrate specificity and bile acid metabolism will lead to the development of therapeutics for diseases involving bile acid metabolism.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found a human sodium-dependent bile acid transporter protein (human TCH162) and its mouse ortholog (mouse TCH162).
  • Human TCH162 shows 34% homology at the amino acid level to human NTCP (J. Clin. Invest. 93: 1326-1331, 1994) and can function as a sodium-dependent bile acid transporter It is a thing. It is also a part of the base sequence of Genbank Accession No. BC019066.
  • Methods for inhibiting the above proteins include, for example, bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, Such as kephalin) or suppress the transcription of the protein to lower the expression level.
  • Methods for activating the protein include, for example, promoting the transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.), and promoting the promoter of the protein. Activation and stabilization of mRNA may increase expression levels.
  • a medicament comprising the polynucleotide of (17), (19) a protein of (1) or a partial peptide or a salt thereof of (4), A method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the protein of the above (1) or the partial peptide or the salt thereof of the above (4);
  • the protein of (1) or the partial peptide of (4) or a salt thereof comprising the protein of (1) or the partial peptide of (4) or a salt thereof.
  • (22) a medicament comprising the compound of (21) or a salt thereof, (23) expression of the protein gene of (1), characterized by using the polynucleotide of (5). Screening methods for compounds or salts thereof that promote or inhibit
  • kits for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1) which comprises the polynucleotide according to (5);
  • (31) a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein of (1), obtained by using the screening method of (29) or the screening kit of (30);
  • (32) a medicament comprising the compound of (31) or a salt thereof, (33) a prophylactic or therapeutic agent for central nervous system diseases, (11), (12), (16), (18) ), The medicine according to (22), (26) or (32), (34) the diagnostic agent according to (13) or (15), which is a diagnostic agent for a central nervous system disease,
  • (35) a method for preventing and treating central nervous system diseases, which comprises administering to a mammal an effective amount of the compound or a salt thereof according to (21), (25) or (31);
  • FIG. 4 is a diagram showing a comparison of the amino acid sequences of FIG.
  • TCH162 indicates the amino acid sequence of human TCH162
  • NTCP indicates the amino acid sequence of sodium-dependent bile acid transporter (NTCP).
  • the mouth indicates amino acids that are identical in the two sequences.
  • FIG. 2 is a diagram showing the expression level of human TCH162 gene product in each tissue.
  • the results obtained by measuring the expression level of human TCH162 in human tissue cDNAs (Human MTC panel I and MTC panel II: manufactured by Clontech) by TaiMan PCR are shown.
  • the expression level was represented by the number of copies per cDNA solution.
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression level of human TCH162 gene product in each tissue. The results of measuring the expression level of human TCH162 in human tissue cDM (Human digestive system MTC panel: Clontech) by TaqMan PCR are shown. The expression level was represented by the number of copies per cDNA solution.
  • FIG. 4 is a diagram showing the expression level of human TCH162 gene product in each tissue.
  • the results of measuring the expression level of human TCH162 in human tissue cDNA (Human Adhesive Digestive System Normal Tissue cDNA Panel I and V: BioChain) by TaqMan PCR are shown.
  • the expression level was expressed as the number of copies per 11 TCH162 cDNA solution divided by the number of copies of glyceraldehi de-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in an equal amount of each tissue cDNA.
  • GPDH glyceraldehi de-3-phosphate dehydrogenase
  • FIG. 5 is a diagram showing a comparison of amino acid sequences between human TCH162 (hTC62) and mouse TCH162 (mTCH162).
  • hTC62 human TCH162
  • mTCH162 mouse TCH162
  • the mouth indicates an amino acid that matches in the two sequences.
  • FIG. 6 is a view showing the expression level of mouse TCH162 gene product in each tissue cDNA (Mouse MTC pane I and MTC panel II: manufactured by Clontech).
  • FIG. 7 is a diagram showing the expression level of the mouse TCH162 gene product in each tissue of a 7-week-old BALB / c mouse.
  • the expression amount is the number of copies per mouse TCH162 cDM solution, and the equivalent amount of each tissue cDM rodent glyceraI dehide-3-p osphate
  • rGAPDH Dehydrogenase
  • FIG. 8 shows the results of the expression level of human TCH162 using the GeneLogic Database.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION-A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 19 used in the present invention (hereinafter referred to as "protein").
  • the protein of the present invention or the protein used in the present invention may be a human warm-blooded animal (for example, guinea pig, rat, mouse, chick, egret, bush, hidge, fox, monkey, etc.).
  • Cells eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney B cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerens cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibers Blast cells, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ cells, ⁇ cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, Basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells Or cancer cells, etc.) or any tissue where these cells are present, such as the brain, parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus,
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 50% or more, preferably about 60% or more, and preferably about 70% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. % Or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is about 50% or more, preferably about 60% or more, preferably An amino acid sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more can be mentioned.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 19 And a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • Substantially equivalent activities include, for example, the transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.). Substantially homogenous indicates that the properties are homologous in nature (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, transportation of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) is equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably It is preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times), but the degree of these activities and the quantitative factors such as protein molecular weight may be different.
  • Activities such as transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters can be measured according to known methods. For example, Am J. Physiol., Vol. 274, G157-169, 1998, or a method analogous thereto.
  • Examples of the protein of the present invention include (1) (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 200, preferably 1 to 150) About 1, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) (Ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or more (eg, about 1 to 200, preferably about 1 to 150) , Preferably about 1 to 100 pieces, preferably about 1 to 50 pieces, preferably about 1 to 30 pieces, preferably about 1 to 10 pieces, and more preferably a number (1 to 5) pieces.
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or more amino acids for example, about 1-2 Preferably about 1 to 1 (about 50 pieces, preferably about 1 to 100 pieces, preferably about 1 to 50 pieces, preferably about 1 to 30 pieces, preferably about 1 to 10 pieces, more preferably Is an amino acid sequence in which a number (1 to 5) of amino acids have been inserted; (iv) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 200, preferably Is about 1 to 150 pieces, preferably about 1 to 100 pieces, preferably about 1 to 50 pieces, preferably about 1 to 30 pieces, preferably about 1 to 10 pieces, and more preferably.
  • amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 eg, about 1 to 200, preferably Is about 1 to 150 pieces, preferably about 1 to 100 pieces, preferably about 1 to 50 pieces, preferably about 1 to 30 pieces, preferably about 1 to 10 pieces, and more preferably.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (potassium terminus) according to the convention of peptide notation.
  • Protein of the present invention C-terminal, the force Rupokishiru group (- COOH), Karupokishireto (one CO ⁇ -) amide filed in any (one C_ ⁇ _NH 2) or an ester (one C_ ⁇ _ ⁇ _R) May be.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, isopropyl
  • C WINCH 6 alkyl group such as n- heptyl, for example, Shikuropen chill
  • C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl, C 6 _ 1 2
  • Ariru groups such as single-naphthyl shed, for example, benzyl, such as full Eniru C alkyl or ⁇ - naphthylmethyl such phenethyl ⁇ - Nafuchiru
  • a C 7 —i 4 aralkyl group such as a C 2 alkyl group, a pivaloyloxymethyl group, and the like are used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carbonyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • amino acid residues e.g., Mechionin residues
  • N-terminal Amino group protecting groups e.g., such as C Bok 6 ⁇ Rukanoiru such formyl group, Asechiru group C ⁇ - e Ashiru Group
  • substituents on side chains of amino acids in the molecule eg, 1 OH, 1 SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group
  • a suitable protecting group for example, a formyl group, acetyl group, etc. (eg, a 6- alkyl group such as ⁇ _6 alkanoyl group), or a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • a suitable protecting group for example, a formyl group, acetyl group, etc. (eg, a 6- alkyl group such as ⁇ _6 alkanoyl group), or a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • protein of the present invention examples include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, and the like.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is the above-mentioned partial peptide of the protein of the present invention, and preferably any peptide having the same properties as the above-mentioned protein of the present invention.
  • a peptide having an amino acid sequence of 70 or more, more preferably 100 or more, most preferably 200 or more is used.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, Alternatively, one or more (preferably, about 1 to 20, more preferably, about 1 to 10, and more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 20; more preferably, about 1 to 10; more preferably, about 1 to 5) amino acids are inserted into the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence have been substituted with another amino acid. Is also good.
  • the partial peptide of the present invention for example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 1st to 97th, the 169th to 191st, and the 25th to 277th A peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; amino acids 1 to 97, amino acids 169 to 191 and amino acids 254 to 277 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 Peptides containing an acid sequence are exemplified.
  • the C-terminus is usually a hydroxyl group (one C ⁇ H) or a carboxylate (_CO ⁇ -), but as in the protein of the present invention, the C-terminus is an amide. (One C ⁇ NH 2 ) or ester (one COOR).
  • the partial peptides used in the present invention include, as in the case of the above-mentioned protein of the present invention, those having a hepoxyl group (or carpoxylate) in addition to the C-terminus, and N-terminal amino acid residues ( E.g., a methionine residue) whose amino group is protected by a protecting group, a glutamine residue formed by cleavage of the N-terminus in vivo, and oxidation of glutamic acid, on the side chain of an amino acid in the molecule And those in which the substituent of the above is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
  • N-terminal amino acid residues E.g., a methionine residue
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • an antibody for example, for the purpose of preparing the antibody of the present invention described below, for example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 1st to 28th, the 99th to 129th, and the 180th to 1st 93 Peptide having the 3rd and 24th to 26th amino acid sequence, SEQ ID NO: 1st to 97th and 16th to 19th amino acids in the amino acid sequence represented by 19 And a peptide containing the amino acid sequence at positions 254 to 277.
  • salts with physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • Acceptable acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid,
  • the protein of the present invention a partial peptide thereof, or a salt thereof is prepared according to the method described above.
  • the protein can be produced from known cells or tissues of warm-blooded animals by a known method for purifying a protein, or by culturing a transformant containing a DNA encoding the protein. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be generally used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzylhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and PAM resin.
  • 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin polyacrylamide tree J3, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4,- Dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired protein or partial peptide or an amide thereof. Get the body.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HOB t, HO OB t), or may be pre-formed as a symmetrical anhydride or HOB t ester or HO OB t ester. Protection net It can be added to the resin after activation of the acid.
  • a racemization inhibitor eg, HOB t, HO OB t
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols, sulphoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. Used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 T: to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include, for example, Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 1 _Z, Br—Z, adamantyl
  • oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified (eg, methyl, ethyl 'propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl 'propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methylbenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification benzyloxycarponyl Hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide It can be protected by dani, trityl hydrazide or the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a group derived from carbonic acid such as a lower (such as an acetyl group, an aroyl group such as an alkanoyl group or a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, or an ethoxycarbonyl group) is used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz 1, C 1 2 - Bz l, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • the imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy 2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the activated carbonyl group of the raw material include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOB t)].
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOB t
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about _20 t to 40 ° C.
  • a ligand-agonizing force-trapping agent such as 1,4-butanedithiol or 1,2-dienedithiol.
  • a ligand-agonizing force-trapping agent such as 1,4-butanedithiol or 1,2-dienedithiol.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane.
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein or partial peptide for example, first, amidation of the carboxy-terminal amino acid is protected by amidation, and then a peptide (protein) chain on the amino group side is a desired chain After lengthening the protein, a protein or partial peptide from which only the N-terminal amino-protecting group of the peptide chain is removed, and a protein or partial peptide from which only the C-terminal protecting group of the hydroxyl group is removed Then, these proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or peptide is purified by various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain an amide of the desired protein or peptide.
  • an ester of a protein or peptide for example, after condensing the «-hydroxyloxyl group of the terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, in the same manner as the amide of a protein or peptide, It is possible to obtain a desired protein or an ester of a peptide.
  • the partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide used in the present invention and the remaining portion are reduced.
  • the product has a protecting group
  • the desired peptide can be produced by removing the protecting group. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include, for example, the methods described in the following (a) to (e).
  • the partial peptides used in the present invention can be purified and isolated by combining these methods.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to a suitable salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide is obtained as a salt, the known method can be used.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention which can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto, may be any containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention. Anything may be used.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used in the library may be any of pateriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using a preparation of a total RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include (1) SEQ ID NO: A DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a DNA encoding a protein having substantially the same properties as a protein containing (2) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, or a DNA encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15;
  • Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27 under high stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, particularly preferably about 80% or more, and most preferably about 50% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 90% or more is used.
  • Hybridization can be performed by a known method or a method analogous thereto, for example, molecular cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et. al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, the reaction can be carried out under highly stringent conditions.
  • the high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15;
  • a DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27 or the like is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cell-tissue, cDNA library derived from the above-described cell / tissue, and synthetic DNA may be used.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include a part of the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27.
  • the present invention comprises a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 27 and a nucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, DNA containing a part of DNA encoding a protein having substantially the same activity as that of the above-mentioned protein is used.
  • the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27 has the same significance as described above.
  • the same hybridization method and high stringent conditions as described above are used.
  • the DNA amplified by the PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or the DNA incorporated into an appropriate vector is Selection can be performed by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the region or labeled with a synthetic DNA.
  • the hybridization is performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR or a known kit such as Mutan TM _super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.) or Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) using the ODA-LA PCR method or the Gapped method. It can be carried out according to a known method such as the duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used by digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon on its 3, terminal. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention can be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) promoting the DNA fragment in a suitable expression vector in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting downstream of
  • vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR32.5, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, , P SH 19, p SH 15), pacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pAl_ll, ⁇ XT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I / Neo, etc. Used '.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR32.5, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • examples include SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like.
  • the CMV (cytomegalovirus) promoter cytomegalovirus
  • SRa promoter cytomegalovirus
  • the trp promoter, 1 ac promoter, recA promoter, APL promoter, promoter, and 7 promoters are used.
  • the host is a Bacillus genus
  • yeast such as SP01 promoter, SP ⁇ 2 promoter, penP promoter, etc., PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • an expression vector containing, if desired, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotregitate (MTX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp 1 ). And a neomycin resistance gene (hereinafter, sometimes referred to as Neo 1 ", G418 resistance) and the like.
  • dh fr gene when used as a selection marker using Chinese hamster cells deficient in the dh fr gene, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host may be added to the protein of the present invention. Add to N terminal side. If the host is a genus Escherichia, the PhoA * signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, the ⁇ -amylase signal sequence, subtilis, syn signal sequence, etc. If the host is an yeast, MFQ; signal sequence, SUC2, signal sequence, etc. If the host is an animal cell, the insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. A transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
  • Examples of the host include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI 114 MI61 ⁇ , 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevlsiae AH 22, AH22R—, ⁇ 87-11 A, DKD—5D, 2 OB—12, Schizosaccharomyces pombe N CYC 1913, NCYC 2036, (Pichia pastoris) KM71 or the like is used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, High derived from egg of Trichoplusia ni FiveTM cells,
  • Mamestra brassicae-derived cells or Est igmena acrea-derived cells are used. It is.
  • the virus is BmNPV
  • a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N cell; BmN cell) or the like is used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used (Maeda et al.,
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CH ⁇ (hereinafter CHO (dh fr—) cell Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, and human FL cells.
  • Transformation of a bacterium belonging to the genus Escherichia can be performed, for example, according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) or Gene, 17, 107 (1982). it can.
  • Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). be able to.
  • a liquid medium is suitable as a medium for cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonium salts, nitrates, corn chip lica, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, etc.
  • Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972 ] Is preferred.
  • a drug such as 33-indolylacrylic acid is added to make the promoter work efficiently:
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • a medium such as Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)) is used. What added the thing suitably is used.
  • the pH of the medium is adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [3 ( ⁇ 611, 6,122, 501 (1952)], DMEM) Medium [Virology, Volume 8, 396 (1959)], RPM I 1640 medium CThe Journal 199, 519 (1967)], 1999 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc. Can be Preferably, the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 T to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced inside the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme, and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • a protein modifier such as urea or hydrochloric guanidine in the buffers may contain a surfactant such as preparative Litton X- 1 0 0 TM.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method using a difference in hydrophobicity such as matography, a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the protein thus obtained When the protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a known method or analogous method Depending on the method, it can be converted to a free form or another salt.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • the protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus-produced protein of the present invention can be measured by enzyme immunoassay or Wesin blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof.
  • An antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof uses the protein of the present invention as an antigen, and is a known antibody. It can be produced according to the method for producing antibodies or bovine serum.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible by administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained in them.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained in them.
  • myeloma cells of the same or different species a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum is described in, for example, After reacting the labeled protein with the antiserum, the activity can be measured by measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus.
  • PEG polyethylene glycol
  • Myeloma cells include, for example, NS-1, P3U1, SP 2/0 And myeloma cells of warm-blooded animals such as AP-1, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1 ... 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6 000) is about 10 to 80%.
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then released.
  • a solid phase eg, a microplate
  • Anti-globulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mice) or protein A, and monoclonal antibody bound to solid phase is detected
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as hybridomas can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium containing 1-10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or hybridoma culture Serum-free medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical ( Co., Ltd.) can be used.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the culture supernatant of the hybridoma can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)).
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto.
  • a immunized bovine (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is prepared, and immunized against a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting the antibody-containing substance against the antibody and separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier protein and the mixing ratio between the carrier and the hapten are determined by the efficiency of the antibody against the hapten immunized by crosslinking the carrier. If it is possible, any material may be cross-linked at any ratio, but for example, serum serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc., in a weight ratio of about 0.1 to 2 with respect to 1 hapten. A method of coupling at a rate of 0, preferably about 1 to 5 is used.
  • Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • dartalaldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, etc. are used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production during administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Antisense polynucleotides having a base sequence that is partially complementary or a part thereof include a base sequence that is complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention or a part thereof. Any antisense polynucleotide may be used as long as it has an action of suppressing the expression of DNA, but antisense DNA is preferred.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire nucleotide sequence or a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • a base sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the base sequence is exemplified.
  • the complementary sequence of the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention is approximately 7%.
  • Antisense polynucleotides having a homology of 0% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more are suitable.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: No .: An antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA having the nucleotide sequence represented by 27, or an antisense polynucleotide having a part thereof, preferably, for example, SEQ ID NO: 2, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 27, or an antisense polynucleotide having a part thereof, and the like. .
  • the antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense DNA must be chemically modified with, for example, phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted by a phoric acid residue.
  • phosphate residues phosphates
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention has been cloned or the nucleotide sequence information of the DNA encoding the determined protein has been determined.
  • Can be designed and synthesized based on Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention, inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the protein-related RNA of the present invention. Can regulate and control the expression of the protein gene of the present invention.
  • Polynucleotides complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention, and polynucleotides that can specifically hybridize with the protein-related RNA of the present invention, can be used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling gene expression, and is also useful for treating or diagnosing diseases.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. “Corresponding” between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) in the instructions derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. I have.
  • Protein remains 5 'end hairpin loop, 5' end 6-base spare repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3' end untranslated region, 3
  • the palindrome region at the 'end and the 3'-end loop may be selected as a preferred region of interest, but any region within the protein gene may be selected as the target.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be that the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target is “antisense”.
  • Antisense polynucleotides are polynucleotides containing 2-dexoxy-D-reports, polynucleotides containing D-reports, N-glycosides of purine or pyrimidine bases and other types of polynucleotides Or other polymers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (provided that the polymer is in DNA or RNA) (Including nucleotides having a configuration that permits base attachment and base attachment as found in (1)).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or non-modified polynucleotides).
  • Modified oligonucleotides and those with known modifications, such as those with a label known in the art, capped, methylated, and one or more natural nucleotides Substituted with an intramolecular nucleotide, for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (for example, those having phosphorophosphate, phosphorodithioate, etc., for example, proteins (nucleases, nuclease inhibitors) , Toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (eg, monosaccharides), etc., or those having side chain groups, and inter-activity rate compounds (eg, acridine, psoralen, etc.).
  • an intramolecular nucleotide for example, having an uncharged bond (eg
  • nucleic acid Containing, chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, It may be one having a decorated bond (for example, ⁇ -anomer type 1 nucleic acid).
  • chelating compounds eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.
  • alkylating agents such as a decorated bond (for example, ⁇ -anomer type 1 nucleic acid).
  • nucleoside may include not only those containing purine and bilimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may have been converted to a functional group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphoate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and if toxic Reduce the toxicity of antisense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, applied by gene therapy, or added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton
  • lipids which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids (
  • hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol
  • Add Particularly preferred lipids include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • capping groups specifically located at the 3, 5 or 5 ends of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. .
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • a protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention
  • a DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention hereinafter referred to as a DNA of the present invention
  • an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention
  • an antisense polynucleotide of the DNA of the present invention hereinafter, the present invention
  • Pharmaceuticals containing a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention include, for example, transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.).
  • central nervous system Diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.
  • diabetes e.g., diabetes, renal disease (eg, dysfunction such as Tengitis, cystic fibrosis, etc.), Respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), Asthma, hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, prolonged QT, arteriosclerosis, etc.)
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Asthma hypothyroidism
  • cardiovascular disease eg, heart failure, arrhythmia, prolonged QT, arteriosclerosis, etc.
  • cancer eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer
  • Liver cancer non-small cell lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, Teng's pancreatic cancer, thymoma
  • pharmaceuticals containing a compound or salt thereof that promotes the activity of protein of the present invention include, for example, bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) and the like.
  • lipidemia e.g, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.) , Central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.), diabetes, kidney diseases (eg, inflammation, cystic fibrosis, etc.) Dysfunction, etc., respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, prolonged QT) , Cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, It can be used as a prophylactic or therapeutic agent for colon cancer, rectal cancer, visceral cancer
  • the protein of the present invention has the activity of transporting bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) and the like, and comprises bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, It contributes to the transport of neurotransmitters (eg, dopamine, glutamate, enkephalin, etc.) and plays an important role in bile acid metabolism.
  • neurotransmitters eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or defective, or when the expression level of the protein of the present invention is reduced, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal disease ( Eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system diseases ( Eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, splanchnic disorders (eg, ⁇ dysfunction such as inflammation, Teng cystic fibrosis, etc.), respiratory Systemic diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, atherosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovary) Cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer
  • the protein of the present invention and the DNA of the present invention may be used, for example, in hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer) , Proctitis, etc., central nervous system diseases (eg, Aruhaima disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.), diabetes, renal diseases (eg, inflammation, ⁇ Dysfunction such as cystic fibrosis), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, Atherosclerosis, etc., cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rect
  • the protein of the present invention is reduced or deficient in the living body, the transport activity of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) is sufficient.
  • administering the DNA of the present invention to the patient to express the protein of the present invention in vivo After inserting the DNA of the present invention and expressing the protein of the present invention, the cells are transplanted into the patient, or f) administering the protein of the present invention to the patient, or the like.
  • the role of the protein of the present invention can be sufficiently or normally exerted.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA is simply used. After insertion into a suitable vector, such as a German or retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • a suitable vector such as a German or retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector
  • the DNA of the present invention can be administered as such or with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent
  • the protein is purified to at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, and even more preferably at least 99%. It is preferable to use those that have been prepared.
  • the protein or the like of the present invention can be used, for example, as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, orally, or water or other pharmaceutically acceptable liquid, if necessary. It can be used parenterally in the form of an injection such as a sterile solution or suspension.
  • the protein or the like of the present invention may be used together with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of preparations. It can be manufactured by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above-mentioned ingredients of the evening may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. .
  • Aqueous solutions for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing dextrose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride)
  • Suitable solubilizers for example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50, etc.).
  • examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, warm-blooded animals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats) , Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats
  • the dose of the protein or the like of the present invention varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the protein or the like of the present invention is orally administered for the purpose of treating Parkinson's syndrome, it is generally used.
  • an adult with a body weight of 6 O kg
  • the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the protein or the like of the present invention is administered in the form of an injection to an adult.
  • the protein or the like may be administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 mg / day. It is convenient to administer Omg by intravenous injection. In the case of other animals, it is also possible to administer the equivalent amount per 60 kg of body weight.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • the present invention relates to (1) the activity of the protein of the present invention characterized by using the protein of the present invention (for example, bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid,
  • the present invention provides a method for screening for a compound or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as an accelerator or an inhibitor, respectively) that promotes or inhibits the transport of an enzyme such as enkephalin. More specifically, for example,
  • bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.
  • Transport is measured using radiolabeled substrates or fluorescent dyes and compared using transport of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, and neurotransmitters (eg, dopamine, glutamate, enkephalin, etc.) as indicators.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc., and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • Buffers include bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, and nerves of the protein of the present invention, such as phosphate buffer and borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably ⁇ about 6 to 8). Any buffer that does not inhibit the transport activity of a transmitter (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) may be used.
  • a host transformed with a vector containing the above-described DNA encoding the protein of the present invention is used.
  • the host for example, animal cells such as CHO cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the above-mentioned method is preferably used.
  • the activity of the protein of the present invention for transporting bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters can be determined by known methods, for example, Am. J. Physiol., 274 Vol., G157-169, 1998 or a method analogous thereto.
  • the transport activity of bile acids, steroid hormones, fat-soluble bimin, and neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) in the case (ii) above is compared with the case (i) above.
  • a test compound that promotes about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more can be selected as a compound or its salt that promotes the activity of the protein of the present invention.
  • the transport activity of bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) in the case (ii) above is higher than that in the case (i) above.
  • a test compound that inhibits (or suppresses) about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more may be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof. it can.
  • a gene such as secreted alkaline phosphatase or luciferase is inserted downstream of the promoter of the protein gene of the present invention, expressed in the above-described various cells, and the enzyme activity when the test compound is brought into contact with the cells. Activate also By searching for a compound or a salt thereof that inhibits, a compound or a salt thereof that promotes or suppresses the expression of the protein of the present invention (that is, promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention) can be screened.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the expression of the protein gene of the present invention.
  • the present invention relates to (3) a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein gene of the present invention, which comprises using a polynucleotide encoding the protein of the present invention (hereinafter referred to as a promoter or an inhibitor, respectively) Agent may be abbreviated as an agent), and more specifically, for example,
  • the expression level of the protein gene of the present invention (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) Measure and compare.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the expression of the gene of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) or a borate buffer. May be.
  • a host transformed with a vector containing the aforementioned DNA encoding the protein of the present invention is used.
  • a host for example, CHO cells Animal cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
  • the amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention to detect the protein present in a cell extract or the like. It can be measured in accordance with the corresponding method.
  • the expression level of the protein gene of the present invention can be determined by a known method, for example, Northern blotting, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), a real-time PCR analysis system (manufactured by ABI, TaqMan polymerase chain reac The measurement can be performed according to a method such as (tion) or a method analogous thereto.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • a real-time PCR analysis system manufactured by ABI, TaqMan polymerase chain reac
  • the measurement can be performed according to a method such as (tion) or a method analogous thereto.
  • the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% as compared with the case of the above (iii).
  • the test compound that promotes the above can be selected as a compound that promotes the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
  • the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% as compared with the case of the above (iii).
  • the test compound that inhibits the above can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
  • the antibody of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention.
  • the present invention relates to (5) a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention, characterized by using the antibody of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as a promoter or an inhibitor, respectively). And more specifically, for example,
  • the expression level (specifically, the protein level of the present invention) of the protein of the present invention in the cases (V) and (vi) is measured using the antibody of the present invention (for example, The expression of the protein of the present invention is detected, the expression level of the protein of the present invention is quantified, and the like, and compared.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cells, extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the expression of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8). May be.
  • a host transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used.
  • a host for example, animal cells such as CHO cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
  • the amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention to detect the protein present in a cell extract or the like. It can be measured in accordance with the corresponding method.
  • the expression level of the protein of the present invention in the case of the above (vi) is promoted by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (V).
  • the test compound to be tested can be selected as a compound that promotes the expression of the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the expression level of the protein of the present invention in the case of the above (vi) is ),
  • a test compound that inhibits about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as a compound or a salt thereof that inhibits expression of the protein of the present invention. Can be.
  • the screening kit of the present invention contains a cell capable of producing the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof, or the protein or partial peptide of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, and plant extracts. Liquid, animal tissue extract, plasma or the like, or a salt thereof, and the activity of the protein of the present invention (eg, bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.) Or a salt thereof that promotes or inhibits transport activity such as
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • Compounds or salts thereof that promote the activity of the protein of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, digestive Ulcers, proctitis, etc., central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, renal diseases (eg, ⁇ , ⁇ , ⁇ Dysfunction such as cystic fibrosis), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroid function, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome) , Arteriosclerosis, etc., cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer , Rectal cancer,
  • the compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention includes, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, Ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system disorders (eg, Alheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety nervous disorder, etc.), diabetes, ⁇ Renal disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, dysfunction such as ⁇ ⁇ inflammation, ⁇ cystic fibrosis, etc.) (Eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, atherosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophagus cancer, lung cancer, kidney, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder It is useful as
  • Compounds or salts thereof that promote the expression of the protein gene of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, digestion) Ulcers, proctitis, etc.), central nervous system disorders (eg, Alheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.), diabetes, kidney disease (eg, Teng Inflammation, ⁇ dysfunction such as cystic fibrosis, etc.), respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia) , Long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer
  • the compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention includes, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis). , Gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, kidney disease (eg, S Extraction, dysfunction such as cystic fibrosis, respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia) , Long QT syndrome, movement Pulse sclerosis), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, It is useful as gastrointestinal
  • Compounds or salts thereof that promote expression of the protein of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic Ulcers, proctitis, etc., central nervous system disorders (eg, Alfheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, renal disease (eg, inflammation) , ⁇ dysfunction such as ⁇ cystic fibrosis, etc., respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, QT) Elongation syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer, Col
  • the compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein of the present invention includes, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, Peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system disorders (eg, Alheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.), diabetes mellitus, cervical disorders (eg, inflammation of the heart) , ⁇ cystic fibrosis, etc.
  • hyperlipidemia eg, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, Peptic ulcer, proctitis, etc.
  • central nervous system disorders eg, Alheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.
  • diabetes mellitus eg, inflammation of the heart
  • pulmonary diseases eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • cardiovascular diseases eg, heart failure, arrhythmia
  • Long QT syndrome arteriosclerosis, etc.
  • cancer eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, cervical cancer
  • Colon cancer rectal cancer
  • kidney cancer Etc. thymoma are useful as pharmaceuticals such as prophylactic and therapeutic agents such as.
  • it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent such as Parkinson's syndrome.
  • a prophylactic / therapeutic agent such as Parkinson's syndrome.
  • it can be formulated according to conventional means. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be used.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Fc orally or parenterally to monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Fc orally or parenterally to monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • the salt is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 6 O kg), the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.1 to 10 O mg, preferably about 1.0 to 10 O mg per day. 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating Parkinson's syndrome is promoted.
  • the compound or a salt thereof is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0 to 30 mg per day. It is advantageous to administer from l to 20 mg, more preferably from about 0.1 to 1 O mg, by intravenous injection. In the case of other animals, it is possible to administer the amount in terms of weight per 60 kg.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay.
  • the antibody of the present invention is allowed to competitively react with the test solution and the labeled protein of the present invention, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is determined.
  • a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution which comprises measuring
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab,) 2 , Fab ', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the enzyme is preferably a stable enzyme having a large specific activity.
  • ⁇ -galactosidase, / 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, reluciferin, lucigenin and the like are used.
  • the binding of antibody or antigen to the labeling agent A single avidin system can also be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase carrier or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and two or more types of antibodies are used for the purpose of improving the measurement sensitivity, etc. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds. Used. That is, when the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • BZF separation Measure the amount of any of B and F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody and the like.
  • An immobilized antibody is used as the antibody, or a solid phase immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, then the immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, a laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the system for measuring the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and documents.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the concentration of the protein of the present invention is reduced by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, , Irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc., central nervous system diseases (eg, Al-Hachima Ichi, Parkinson's syndrome, depression, Emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, Teng disease (eg, inflammation, Teng dysfunction such as cystic fibrosis, etc.), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease) (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, lung cancer, kidney) Cancer, liver cancer, non-
  • gastrointestinal disease eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis
  • Gastritis peptic ulcer
  • proctitis etc.
  • central nervous system disorders eg, Alfachima's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.
  • diabetes e.g, stomach Diseases (eg, Tengitis, Teng dysfunction such as cystic fibrosis, etc.), Respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism
  • cardiovascular diseases eg, , Heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, atherosclerosis, etc.
  • cancer eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. can be used for (4) Gene diagnostic agent
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushfishes, horsetails, dogs, cats, dogs) by using them as probes. , Monkeys, chimpanzees, etc.) can detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or partial peptides thereof, for example, damage, mutation or mutation of the DNA or mRNA. ⁇ Whose expression is decreased or whose DNA or mRNA is increased is useful as a diagnostic agent for genes such as overexpression.
  • abnormalities genetic abnormalities
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989) )).
  • gastrointestinal diseases eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, Peptic ulcer, proctitis, etc.
  • central nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.
  • Diabetes e.g., gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, Peptic ulcer, proctitis, etc.
  • central nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.
  • diabetes eg disease (eg, Teng cystic fibrosis and other dysfunctions, respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmias, QT prolongation) Syndrome, arteriosclerosis, etc.)
  • cancer e
  • PCR-SSCP method for example, hyperlipidemia, gastrointestinal disorders (eg, irritable bowel syndrome, Ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, Emotional disorders, schizophrenia, anxiety disorders, etc.), diabetes, victory diseases (eg, inflammation, ⁇ cystic fibrosis, etc.
  • hyperlipidemia eg, hyperlipidemia, gastrointestinal disorders (eg, irritable bowel syndrome, Ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, Emotional disorders, schizophrenia, anxiety disorders, etc.), diabetes, victory diseases (eg, inflammation, ⁇ cystic fibrosis, etc.
  • ⁇ dysfunction, etc. respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease ( COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney) Cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, cervix cancer, colon cancer, rectal cancer, kidney cancer, thymoma, etc.) Can be.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • asthma asthma
  • hypothyroidism eg., cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.)
  • cancer eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney) Cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer
  • the antisense polynucleotide of the present invention which can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppresses the expression of the DNA, has low toxicity, and can be used for the production of the protein of the present invention or the DNA of the present invention in vivo.
  • Activity or function eg, bile acids, steroid hormones, fat-soluble vitamins, transport activity of neurotransmitters (eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.)
  • neurotransmitters eg, dopamine, glutamic acid, enkephalin, etc.
  • hyperlipidemia e.g, hyperlipidemia, digestion Organ diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system diseases (eg, Alheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression) , Emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.), diabetes, renal diseases (eg, ⁇ inflammation, ⁇ ⁇ cystic fibrosis, etc.
  • digestion Organ diseases eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis,
  • ⁇ dysfunction, etc. respiratory Diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, atherosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovary) Cancer, breast cancer, esophagus cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectum cancer, kidney cancer, thymoma, etc.) ⁇ Can be used as a therapeutic agent.
  • it is a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases or the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for the Parkinson's syndrome group or the like.
  • the antisense polynucleotide When used as the prophylactic or therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a known method.
  • the antisense polynucleotide when used, the antisense polynucleotide may be used alone or in a retrovirus vector or adenovirus vector.
  • a suitable vector such as a vector, adenovirus associated virus vector, or the like
  • a human or mammal eg, a rat, a rabbit, a sheep, a pig, a pig, a cat, Dogs, monkeys, etc.
  • a human or mammal eg, a rat, a rabbit, a sheep, a pig, a pig, a cat, Dogs, monkeys, etc.
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.For example, when the antisense polynucleotide of the present invention is administered to an affected part for the purpose of treating Parkinson's syndrome, Generally, for an adult (body weight 60 kg), about 0.1 to 10 O mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • the present invention also provides an expression vector containing a gene (DNA) encoding the lipozyme.
  • RNA transcribed from the DNA of the present invention or suppress the function thereof, and the protein of the present invention or the present invention in vivo can inhibit the function of DNA used in, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer , Proctitis, etc., central nervous system disorders (eg, Alzheimer's disease, par: Syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, kidney disease (eg, inflammation, cystic fibrosis, etc.), respiratory disease (eg, Chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc., hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian
  • Double-stranded RNA which is preferably a prophylactic / therapeutic agent for central nervous system diseases and the like, particularly preferably a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's syndrome and the like, is a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001). And can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention.
  • the lipozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, p. 221, 2001). For example, it can be produced by replacing a part of the known lipozyme with a part of RNA encoding the protein of the present invention.
  • RNA encoding the protein of the present invention a sequence near a consensus sequence NUX (where N represents all bases and X represents a base other than G) which can be cleaved by a known lipozyme, etc. No.
  • RNA or lipozyme When the above double-stranded RNA or lipozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide.
  • the expression vector of (V) is used in the same manner as known gene therapy methods and the like, and is used as the prophylactic / therapeutic agent.
  • the present invention has a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal is provided.
  • a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA, which can be expressed in mammals, is provided.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa, and germ cells including their progenitor cells.
  • the stage of embryonic development in non-human mammal development preferably, at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage
  • calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation , Microinjection, particle gun, DEAE-dextran, etc. to introduce the desired DNA.
  • the exogenous DNA of the present invention can be introduced into somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA-introduced animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a known cell fusion method.
  • mice for example, pure strains such as C57BLZ6 strain and DBA2 strain, Preferred are B6C3 strain, BDFi strain, B6D2F strain, BALBZc strain, ICR strain, etc.
  • rat eg, Wistar, SD, etc.
  • mammal in the recombinant vector that can be expressed in mammals, human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • mutant DNA of the present invention those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of bases, or other bases
  • a DNA having substitution with a DNA is used, and an abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • various mammals having the DNA of the present invention having high homology thereto for example, egret, dog, cat, guinea pig, hamus, rat, mouse, etc.
  • Microinjection of a DNA construct eg, a vector, etc.
  • a DNA construct in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing DNA of origin from a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg
  • a DNA-transfected mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced.
  • Examples of the expression vector for the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, vaccinia virus or baculovirus. Animal viruses such as viruses are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates the expression of DNA include, for example, (i) DNA derived from virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.).
  • virus eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • (Ii) promoters derived from various mammals for example, albumin, insulin II, perovrakin II, eras , Erythropoietin, endoselin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S_transferase, platelet-derived growth factor i3, keratin K1, K10 And K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase ⁇ I subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor yuichi tyrosine kinase (generally Tie 2 ), Sodium potassium adenosine 3-phosphatase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallotionin I and II
  • cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the whole body
  • a human polypeptide chain elongation factor 1 (EF-1 ⁇ ) promoter a human and a chicken] 3 actin promoter, and the like are preferable.
  • the vector preferably has a sequence (generally called terminator) that terminates the transcription of the mRN of interest in the mammal into which the DNA is introduced.
  • the sequence can be used, and preferably, SV40 terminator of Simian virus or the like is used.
  • splicing signals of each DNA, enhancer region, part of eukaryotic DNA introns, etc. are used to further express the target exogenous DNA at 5, 5, upstream of the promoter region, promoter region and translation region. It is also possible to connect between 3 or downstream of the translation area depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention is derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamus yuichi, rats, mice, etc.). All or part of genomic DNA from DNA and various commercially available genomic DNA libraries, or liver, Complementary DNA prepared by known methods from kidney, thyroid cells and fibroblast-derived RNA can be obtained as a raw material.
  • a foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal polypeptide translation region obtained from the above cells or tissues by a point mutation induction method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in an introduced animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the aforementioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after the introduction of the DNA indicates that the progeny of the animal to be produced retains the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells Means to do.
  • the progeny of such an animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-carrying animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. . .
  • exogenous DNA of the present invention is provided at the fertilized egg cell stage in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after the introduction of the DNA indicates that all of the offspring of the produced animal contain the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Means to have.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and ultimately promotes the function of endogenous normal DNA.
  • the protein of the present invention may develop hyperactivity of the protein, and can be used as a pathological model animal. For example, using the normal DNA-introduced animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention or a disease associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. Is possible.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention. .
  • a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. I can do it. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. Introduction of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germ cells of the animal produced after the transfer of the DNA means that the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. I do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high expression level of the abnormal DNA of the present invention, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA to ultimately obtain the protein of the present invention. It may become functionally inactive refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the animal with high abnormal DNA expression of the present invention This serves as a model for elucidating the function inhibition (dominant negative effect) of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory state of the protein of the present invention.
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used in a therapeutic drug screening test for the protein of the present invention or a functionally inactive refractory disease thereof. Available.
  • cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture,
  • each organ is removed from the DNA-introduced animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain free DNA-introduced cells, culture them, or systematize the cultured cells using a protease such as trypsin. It is. Further, the identification of the protein-producing cells of the present invention, the relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them, and the study of their abnormalities, etc. This is an effective research material for elucidating the protein of the present invention and its action.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a reporter gene eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity on DNA of the present invention which comprises administering a test compound to the animal according to (7) and detecting expression of a reporter gene.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is an artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which suppresses the expression ability of the DNA, Alternatively, the DNA substantially does not have the ability to express the protein of the present invention by substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • the knockout DNA of the present invention refers to embryonic stem cells of non-human mammals (hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method for artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the reading frame of a codon or disrupting the function of a promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (] 3-galactosidase enzyme), cat (Chloramphenicol acetyltransferase gene) to destroy the exon function by inserting a reporter gene or the like, or to terminate the transcription of the gene in the intron between exons.
  • a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (] 3-galactosidase enzyme), cat (Chloramphenicol acetyltransferase gene) to destroy the exon function by inserting a reporter gene or the like, or to terminate the transcription of the gene in the intron between exons
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed as described above (hereinafter abbreviated as an evening getter vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, a homologous recombination method, and the obtained ES cell is subjected to the DN of the present invention.
  • the DNA sequence on or near A used as a probe for Southern hybridization analysis or the DNA sequence on the targeting vector and the neighborhood other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector It can be obtained by analyzing by a PCR method using the DNA sequence of the region as a primer and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or the known Evans and Kaufman method may be used. It may be newly established according to.
  • ES cells for example, in the case of mouse ES cells, currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetically
  • BDF! Mice C57BL / 6 mice
  • C57BL Z6 mice in which the number of eggs collected by C57BL / 6 mice or C57BLZ6 has been improved by crossing with DBAZ2 BDF and mice can be used satisfactorily in terms of the number of eggs collected, and their strength is high
  • the C57BLZ6 mouse can be used as a background.
  • the ES cells obtained by using this can backcross the C57BL / 6 mouse to the C57BL / 6 mouse by cross-crossing with the C57BL / 6 mouse when creating a disease model mouse. Can be used advantageously.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germ line chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • the primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between males and females, and the early stages of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5%
  • LIF 1-10000 U / m 1
  • Cultivate at about 37 ° C with oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air, etc.
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA
  • ZlmM EDTA trypsin ZEDTA
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and H. Kaufman Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634, 1981; TC Doetsc man et al. Journal of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985
  • DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are in vivo cells. Useful in cell biology studies of the protein of the present invention in the mouth.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be prepared, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, whereby the DNA of the present invention in the targeting vector is lost by the introduction.
  • Activated D The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the NA sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used for Southern hybridization analysis or DNA sequencing on an evening gettering vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and a target vector. It can be determined by PCR analysis using the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used as the primer.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • all the tissues are more artificial than the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention in which a mutation has been added to, for example, by judging coat color or the like.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention. A homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the egg cell nucleus by a microinjection method. Compared to non-human mammals, they can be obtained by selecting those having mutations in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the animal individual obtained by mating should also be confirmed to have the DNA knocked out and subjected to rearing in a normal rearing environment.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner as to have one normal individual and a plurality of homozygous animals. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it may be caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods, because they can serve as a model for the diseases that occur.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a preventive / therapeutic effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention is characterized in that a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention, and changes in the animal are observed and measured.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof having a preventive / therapeutic effect on a disease to be caused.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is treated with a test compound. Then, the preventive / therapeutic effect of the test compound can be tested using the change in each organ, tissue, disease symptom and the like of the animal as an index, as compared with an untreated control animal.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection, or the like is used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • a test compound when screening for a compound having a therapeutic effect on Parkinson's syndrome, is administered to a non-human mammal deficient in expression of a DNA encoding the protein of the present invention, and the compound is administered to the brain of the animal. Measurement of the amount of one-pamine and its metabolites, observation of the number or degeneration of neurons in the substantia nigra, measurement of the amount of exercise of the animal, or analysis of behavioral patterns are performed.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a prophylactic / therapeutic effect against a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a medicament such as a safe and low toxic prophylactic / therapeutic agent for the disease. Furthermore, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, And the like, and salts with alkali metals and the like are used, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the drug containing the protein of the present invention described above. Because it ’s toxic, Or other mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, pigs, horses, cats, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, pigs, horses, cats, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of the administration, the administration route, and the like.
  • Parkinson's syndrome in an adult assuming a body weight of 60 kg
  • the amount of a single dose of the compound varies depending on the subject of administration, the target disease, etc.
  • the compound is usually administered in the form of an injection for the treatment of Parkinson's syndrome in adults (60 kg).
  • the dose can be administered in terms of the weight per 6 Okg.
  • [7b] A method for screening a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention
  • the present invention provides a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to detect the expression of a repo overnight gene, thereby promoting the activity of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a method for screening a compound to be inhibited or a salt thereof is provided.
  • the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention includes, among the above-described non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention, the DNA of the present invention obtained by introducing a repo overnight gene. Those inactivated and capable of expressing the reporter gene under the control of the promoter for the DNA of the present invention are used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the reporter gene the same one as described above is used, and a ⁇ -galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
  • lacZ ⁇ -galactosidase gene
  • soluble alkaline phosphatase gene a luciferase gene and the like are preferable.
  • the repo overnight gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the By tracing the expression of a substance encoded by one gene, the activity of the promoter can be detected.
  • a tissue that originally expresses the protein of the present invention may / 3-galactosidase is expressed in place of the protein. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate for / 3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-1] 3-galactopyranoside (X-gal), the present method can be easily performed. The state of expression of the protein of the present invention in an animal body can be observed.
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the / 3-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with an lmMEDTAZPBS solution, and the coloration may be observed.
  • mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity of DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids
  • bases eg, organic acids
  • physiologically acceptable acid addition salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic
  • the compound of the present invention which promotes promoter activity against DNA or a salt thereof is Since the expression of the protein of the present invention can be promoted and the function of the protein can be promoted, for example, hyperlipidemia, gastrointestinal diseases (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, Blood colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.), central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, nervous system disorders (Eg, dysfunction such as inflammation, cystic fibrosis, etc.), respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure) , Arrhythmia, QT prolonged syndrome, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity on DNA can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein.
  • Organ diseases eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.
  • central nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression
  • Emotional disorders eg, schizophrenia, anxiety, etc.
  • diabetes eg, ⁇ inflammation, ⁇ cystic fibrosis, etc.
  • ⁇ dysfunction, etc. respiratory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease) Diseases (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, atherosclerosis, etc.), cancer (eg, testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer) Cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder, cervix cancer, colon cancer, rectal cancer, kidney cancer, thymoma, etc.) .
  • preventive and therapeutic agents for central nervous system diseases and the like and particularly preferred are preventive and therapeutic agents for parkinsonism and the like.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method is produced in the same manner as the above-described drug containing the protein of the present invention or a salt thereof. be able to.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or other mammals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, bush, pests, and pests). , Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like.
  • a compound that promotes the promoter overnight activity against DNA of the present invention is orally administered
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound of the present invention that promotes the activity of the promoter for DNA is usually in the form of an injection.
  • the compound When administered to an adult (as 6 O kg) patient with Parkinson's syndrome, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 mg per day. It is convenient to administer about 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 6 O kg) patients with Parkinson's syndrome, about 0.1 to 10 Administer 10 Omg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, and the like.
  • a compound that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention in the form of an injection is administered in an adult (assuming a body weight of 6 O kg) patients with Parkinson's syndrome.
  • the compound when administered to an adult (as 60 kg) Parkinson's syndrome patient, is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 2 Omg per day. It is convenient to administer about 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention It is extremely useful for screening compounds or salts thereof that promote or inhibit the activity of the promoter, and is useful for investigating the causes of various diseases caused by insufficient DNA expression of the present invention or developing preventive and therapeutic drugs. Can contribute.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream of the DNA and injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal). If it is created, it will be possible to specifically synthesize the polypeptide and examine the action in the living body.
  • the protein of the present invention itself can be specifically promoted or suppressed in its production ability in the body. It can be used as a search system for low-molecular compounds that have an action.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the relevant field, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • Example 1 shows the base sequence of SP6 used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of T7 used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a cDNA containing the human TCH162 full-length gene obtained in Example 1.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of Ta QM a probe T2 used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of cDNA containing the full-length mouse TCH162 gene obtained in Example 3.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer OF used in Example 6.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer OR used in Example 6.
  • [SEQ ID NO: 31] 14 shows the base sequence of primer BGH RV used in Example 6.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a TaqMan probe T1 used in Example 8.
  • the transformant Escherichia coli TOP10 / pCR-BluntII-TCH162 obtained in Example 1 described below has been used since July 24, 2003 at 1-1, Tsukuba-Higashi 1-chome 1 Chuo No. 6 (zip code 305-8566 It has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) as Patent Deposit No. FERM BP-8434.
  • Primer A3 SEQ ID NO: 3
  • Primer B3 SEQ ID NO: 4
  • PCR was performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo) under the following conditions (1) to (3).
  • a 1.5 kbp band was cut out and cloned using a Zero Blunt TOPO PCR cloning kit (manufactured by Invitrogen). Clones derived from the brain and small intestine cDNA libraries were combined one by one to obtain two clones.
  • Primer DNA Primer DNA [Primer SP6 (SEQ ID NO: 5), Primer T7 (SEQ ID NO: 6), Primer F1 (SEQ ID NO: 7), Primer F2 (SEQ ID NO: 8), Primer F3 (SEQ ID NO: 9) ), Primer R1 (SEQ ID NO: 10), primer R2 (SEQ ID NO: 11), primer R3 (SEQ ID NO: 12), primer A2 (SEQ ID NO: 13) and primer B2 (SEQ ID NO: 14) )] And the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), and the base sequence of the inserted cDNA fragment is analyzed using a DNA sequencer ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Decided.
  • the two clones obtained contained the same DNA fragment and had a base sequence of 1538 (SEQ ID NO: 15).
  • This cDNA fragment encodes 437 amino acid sequences (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2), and the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is named human TCH162 protein. did.
  • a transformant having a plasmid containing the above-mentioned cDNA fragment was named Escherichia coli TOP10 / pCR-BluntII-TCH162.
  • Human TCH162 is a gene belonging to the sodium-dependent bile acid transporter family. (Fig. 1). Human TCH162 is a sodium-dependent bile acid transporter reported in humans, sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP) (J. CI in. Invest. 93: 1326, 1994). The homology was 39% at the base level and 34% at the amino acid level. Human TCH162 had the same sequence as the amino acid sequence of Genbank Accession No. BC019066.
  • Example 2 Analysis of tissue distribution of human TCH162 gene product
  • primer DNA primer TF2 (SEQ ID NO: 16) and primer TR2 (SEQ ID NO: 17)
  • TaqMan probe T2 SEQ ID NO: 18
  • Expression of human TCH162 in cDNA of human tissues Human MTC panel I and II, Human digestive system MTC panel; Clontech, Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panel I and V; Noochain
  • the amount was measured by TaqMan PCR.
  • the reaction was performed using the TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) and the ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) at 50 ° C for 2 minutes and then at 95 ° C for 10 minutes.
  • the reaction was repeated for 40 cycles with one reaction cycle consisting of 15 seconds at 95 ° C and 1 minute at 60 ° C, and detection was performed simultaneously.
  • the cDNA of each human tissue used in the measurement is shown in [Table 1].
  • Human MTC panel I Heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, lignum
  • the obtained amplification product was cloned using a Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit (manufactured by Invitrogen) to obtain a plasmid pCR-Bluntll-mTCH162.
  • a transformant having a plasmid containing the above-mentioned cDNA fragment was named Escherichia coli T0P10 / pCR_BluntII-mTCH162.
  • mouse TCH162 was found to be NTCP (J. Clin. Invest., Vol. 93, 1326).
  • P. 1994 showed 41% homology at the base level and 35% homology at the amino acid level.
  • it showed a homology of 40% at the base level and 33% at the amino acid level with mouse NTCP (Genbank: NP-035517), which is a liver sodium-dependent bile acid transporter reported in mice.
  • Mouse TCH162 showed 81% homology at the base level and 86% amino acid level with human TCH162, indicating that mouse TCH162 is a mouse ortholog of human TCH162 (FIG. 5).
  • primer DNA Two types of primer DNA (primer mTF (SEQ ID NO: 25) and primer mTR (SEQ ID NO: 26)) and TaqMan probe mTl (SEQ ID NO: 28) designed from the nucleotide sequence encoding mouse TCH162 Using mouse tissues (bone marrow, eyes, lymph nodes, smooth muscle, prostate, thymus, stomach, uterus, heart, brain, spleen, lung, liver, skeletal muscle, kidney, testis, embryo (7 days) The expression level (copy number) of mouse TCH162 in cDNA (Mouse MTC panel I and Mouse MTC panel II: Clontech) of, embryo (11 days), embryo (15 days) and embryo (17 days) was determined by TaqMan PCR. It was measured.
  • the expression level (copy number) of GAPDH was also measured using TaqMan GAPDH control reagents (manufactured by Applied Biosystems).
  • the reaction was performed using the TaqMan Universal PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems) in the ABI PRISM 7900 sequence detection system (manufactured by Applied Biosystems) for the first minute, then at 95 ° C for 10 minutes, and then at 95 ° C. For 40 seconds, 1 reaction cycle was repeated for 1 minute at 60 ° C for 15 seconds, and detection was performed simultaneously.
  • Fig. 6 shows the results.
  • Mouse TCH162 gene product was expressed in a wide range of tissues in Mouse MTC panel I and MTC panel II, but relatively strong in eyes, smooth muscle, and prostate. Higher expression was observed in the embryo (day 15) and embryo (day 17), and the strongest expression was observed in the brain and embryo (day 11).
  • mRNA Mouse TCH162 gene product
  • Reverse transcription was performed using Transcription Reagents (manufactured by Applied Biosystems) to prepare cDNA.
  • the expression level (copy number) of mouse TCH162 using primer mTF (SEQ ID NO: 25), primer-1 mTR (SEQ ID NO: 26) and TaqMan probe mTl (SEQ ID NO: 28) used in Example 4 was measured by TaqMan PCR.
  • the expression level (copy number) of rodent GAPDH was also measured using TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents VIC Probe (manufactured by Applied Biosystems).
  • the reaction is carried out using the TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) on the ABI PRISM 7900 sequence detec tion system (Applied Biosystems) first for 50 minutes and then 95 minutes. After that, the reaction was repeated 40 times with 1 reaction cycle consisting of 15 seconds at 95 ° C and 1 minute at 60, and the detection was performed simultaneously.
  • Fig. 7 shows the results.
  • mice TCH162 gene product High expression of the mouse TCH162 gene product (mRNA) is observed in the gastrointestinal tract tissues (foregut, hind stomach, duodenum, jejunum, colon, rectum, cecum) and cerebrum of each tissue of 7-week-old BALB / c mice The highest expression was observed in the medulla oblongata and spinal cord.
  • mRNA mouse TCH162 gene product
  • primer 1F sequence PCR was performed using Pyrobest DNA Polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) under the following conditions (1) to (3) using No. 29) and primer OR (SEQ ID NO: 30).
  • the 5 ′ terminal primer OF and the 3 ′ terminal primer OR were designed to add a HindIII site and an EcoRI site to the 5 ′ terminal, respectively, for cloning into a vector.
  • Plasmids were prepared from a plurality of colonies obtained as described above, and this nucleotide sequence was used as a primer for DNA [primer BGH RV (SEQ ID NO: 31), primer T7 (SEQ ID NO: 6), primer F2 (SEQ ID NO: 8), Primer R2 (SEQ ID NO: 11), Primer A2 (SEQ ID NO: 13) and Primer B2 (SEQ ID NO: 14)] and BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)
  • the reaction was performed, and the nucleotide sequence was confirmed using a DNA sequencer ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (manufactured by Applied Biosystems).
  • the transformant having this plasmid is used for Escherichia coli
  • Escherichia coli T0P10 / pCDNA3.1 (+)-TCH162 was cultured, and plasmid DNA was prepared from the E. coli using EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Was. This plasmid DNA was introduced into CHO dhfr- cells using FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche) according to the attached protocol. A mixture of 2 g of the plasmid DNA and the transfusion reagent was added to a 6 cm diameter dish seeded with 3 ⁇ 10 6 CHO dhfr cells 24 hours before.
  • the human TCH162-expressing CH0 cell line prepared in Example 7 was cultured in a 48-well plate or a 24-wel 1 plate, and total RNA was prepared from the grown cells using an RNeasy 96 Kit (manufactured by Qiagen). TaqMan Revease for prepared total RNA
  • Reverse transcription was performed using Transcription Reagents (manufactured by Applied Biosystems) to prepare cDNA.
  • the expression level of human TCH162 was measured by TaqMan PCR using primer TF (SEQ ID NO: 32) and primer TR (SEQ ID NO: 33) and TaqMan probe T1 (SEQ ID NO: 34).
  • the reaction was performed using the TaqMan Universal PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems) and the ABI PRISM 7900 sequence detection system (manufactured by Applied Biosystems) at 50 ° C for 2 minutes and then at 95 ° C for 10 minutes. Forty cycles were repeated with one reaction cycle consisting of 15 seconds at 95 ° C and 1 minute at 60 ° C, and detection was performed simultaneously. Clonal No. 35 was selected as a human TCH162 gene high expression cell line.
  • Fig. 8 shows the results.
  • the protein, polynucleotide and antibody of the present invention include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis) ), Central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety, etc.), diabetes, Tengler disease (eg, inflammation, cystic fibrosis, etc.) ⁇ dysfunction, etc., respiratory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.), hypothyroidism, cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, arteriosclerosis, etc.), Cancer (e.g., testicular tumor, ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, kidney Cancer, th
  • a compound that promotes or inhibits the activity of the protein obtained by a screening method using the protein, polynucleotide, antibody, or the like, is a compound that promotes or inhibits the expression of the protein gene.
  • Compounds that can be used include, for example, hyperlipidemia, digestive disorders (eg, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, ischemic colitis, gastritis, peptic ulcer, proctitis, etc.)
  • Nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, depression, emotional disorders, schizophrenia, anxiety neurosis, etc.
  • diabetes eg, inflammation, cystic fibrosis, etc.
  • Respiratory disease eg, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, etc.
  • hypothyroidism eg, cardiovascular disease (eg, heart failure

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Abstract

胆汁酸、ステロイドホルモン、脂溶性ビタミン、神経伝達物質などの輸送などの活性を有する本発明のタンパク質およびそのポリヌクレオチドは、例えば、高脂血症、消化器疾患、中枢神経系疾患、糖尿病、膵臓疾患、呼吸器疾患、循環器疾患、癌などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物などは、例えば、上記疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。

Description

明 細 新規タンパク質およびその D N A 技術分野
本発明は、 新規なナトリウム依存性胆汁酸トランスポータータンパク質、 該 タンパク質をコードするポリヌクレオチド、 該タンパク質の活性を促進または 阻害する化合物、 該タンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物など のスクリ—ニング方法、 該スクリ一ニング方法で得られる化合物などを提供す る。 さらには、 中枢神経系疾患 (好ましくはパーキンソン症礙群など)の予防- 治療剤およびそのスクリーニングなどにも関する。 背景技術
胆汁酸は肝臓において合成され、 小腸に分泌されるが、'小腸において脂質や' 脂溶性ビタミン、 コレステロールなどの吸収を促すという重要 fi働きを担って い 。 胆汁酸は主に、 小腸 （回腸） から効率良く再吸収され、 門脈を経て肝臓 に戻り、 再び胆汁中に排泄される （腸肝循環） 。 体内コレステロールプールサ ィズは、 食事中のコレステロールだけでなく、 腸肝循環の胆汁酸によってもフ イードバック制御されることから、 胆汁酸吸着薬 （陰イオン交換樹脂） を用い た胆汁酸の腸における再吸収の抑制により、 高コレステロール血症の治療が行 われている。
パーキンソン症候群は、 中脳黒質のドーパミン作動性神経細胞の変性脱落に より、 神経終末がある線条体でド一パミン不足をきたし、 錐体外路性運動障害 が出現する変性疾患で、 静止時振戦、 筋強剛、 動作緩慢、 無動および姿勢反射 障害を四主徵とする。 有病率は 10万人当たり約 100人である。 病因は不明であり 、 何らかの中毒物質の関与が推定されている。
ナトリゥム依存性胆汁酸トランスポ一ターは胆汁酸の運搬に寄与すると考え られている。 ヒトでは、 ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターのアイソフ ォ一ムが 2つ同定されており、 NTCP (NaVtaurochol ate co t ranspor t ing po lypept ide) は主に肝臓で発現し (J. Cl in. Inves t .、 93巻、 1326 - 1331頁、 1994年) 、 ISBT (I l eal sodium I b i le sal t cotranspor i er) は主に回腸 ·腎 臓で発現している (J. Bio l . Chem.、 270巻、 27228 - 27234頁、 1995年) 。 ISBT に関しては、 アミノ酸置換を伴う遺伝子の変異と胆汁酸吸収不良との直接的な 関連が示唆されている (J . Cl in. Inves t .、 99巻、 1880-1887頁、 1997年） 。 ナトリゥム依存性胆汁酸トランスポ一夕一は、 肝臓や小腸における胆汁酸の 運搬において重要な役割を果たしていると考えられているが、 その詳細なメカ 二ズムゃ疾患との関連についてはそれほど明らかにされていない。 ナトリウム 依存性胆汁酸卜ランスポー夕一の詳細な基質特異性や胆汁酸代謝などにおける 役割を解明することが、 胆汁酸代謝などが関与する疾患の治療薬開発につなが る。
ヒトゲノム配列の決定を受け、 パーキンソン症候群をはじめとする中枢神経 系疾患の原因遺伝子が飛躍的に発見され、 それまで発症機構が不明であった疾 患に関しても病態機序が明らかになりつつある。中枢神経系疾患の分野において は、 それぞれの疾患で特異的に発現する分子を標的とし、 尋常タンパク質の産 生抑制ならびに分解促進、 または沈着した異常夕ンパク質のクリアランスゃ沈 着抑制などをターゲットとした薬剤が求められている。 現在のところ様々なパ 一キンゾンの治療剤が存在するものの、 症状を根治する優れた医薬は未だ開発 されていない。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 ヒトナ トリウム依存性胆汁酸トランスポ一タータンパク質 （ヒト TCH162) およびその マウスオルソログ （マウス TCH162) を見出した。 ヒト TCH162はアミノ酸レベル で、 ヒト NTCP (J. Cl in. Inves t .、 93巻、 1326- 1331頁、 1994年) と 34%の相同 性を示し、 ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーターとして機能し得るもので ある。 また、 Genbank Access i on No. BC019066の塩基配列の一部分である。 上記タンパク質を抑 Jする方法としては、 例えば、 胆汁酸、 ステロイドホル モン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ド一パミン、 グルタミン酸、 ェン ケフアリンなど） などの輸送を阻害したり、 該タンパク質の転写を抑制して発 現レベルを低下させることが考えられる。 該タンパク質を賦活化する方法とし ては、 例えば胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （ 例、 ド一パミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送を促進した り、 該タンパク質のプロモーターを活性化したり、 mRNAを安定化することで発 現レベルを亢進することが考えられる。
本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明 を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1または配列番号： 19で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
(2) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはそ の塩、
(3) 配列番号： 19で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質または その塩、
(4) 上記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(5) 上記 （1) 記載のタンパク質または上記 （4) 記載の部分ペプチドを コ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(6) DNAである上記 （5) 記載のポリヌクレオチド、
(7) 配列番号： 20またば配列番号： 27で表わされる塩基配列からなる DNA、
(8) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、
(9) 上記 （8) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(10) 上記 （9) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のタンパク 質または上記 （4) 記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取する ことを特徴とする上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部分 ぺプチドまたはその塩の製造法、
(11) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部分べプチ ドまたはその塩を含有してなる医薬、 (12) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(13) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(14) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分べプチ ドまたはその塩に対する抗体、
(15) 上記 （14) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(16) 上記 （14) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(17) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的 な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド、
(18) 上記 （17) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、 (19) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部分べプチ ドまたはその塩を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載のタンパク質もし くは上記 （4) 記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する 化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(20) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （4) 記載の部分べプチ ドまたはその塩を含有してなる、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （ 4) 記載の部分べプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また はその塩のスクリーニング用キット、
(21) 上記 （19) 記載のスクリーニング方法または上記 （20) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質もし くは上記 （4) 記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する 化合物またはその塩、
(22) 上記 （21) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (23) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上 記 （1) 記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
(24) 上記 （5) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 上記 （1) 記 載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リ一ニング用キッ卜、
(25) 上記 （23) 記載のスクリーニング方法または上記 （24) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質遺伝 子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
(26) 上記 （25) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(27) 上記 （14) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載 のタンパク質の定量方法、 .
(28) 上記 （27) 記載の定量方法を用いることを特徴とする上記 （1) 記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断法、
(29) 上記 （14) 記載の抗体を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記 載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(30) 上記 （14) 記載の抗体を含有してなる、 上記 （1) 記載のタンパ ク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ 卜、 .
(31) 上記 （29) 記載のスクリーニング方法または上記 （30) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質の発 現を促進または阻害する化合物またはその塩、
(32) 上記 （31) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (33) 中枢神経系疾患の予防 '治療剤である、 上記 （11) 、 （12) 、 (16) 、 （18) 、 （22) 、 （26) または （32) 記載の医薬、 (34) 中枢神経系疾患の診断薬である、 上記 （13) または （15) 記載 の診断薬、
(35) 哺乳動物に対して、 上記 （21) 、 (25) または （31) 記載の 化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢神経系疾患の予 防 ·治療方法、
(36) 中枢神経系疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記 （21) 、 ( 25) または （31) 記載の化合物またはその塩の使用などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト TCH162およびナトリゥム依存性胆汁酸トランスポータ一 （NTCP ) のアミノ酸配列の比較を表す図である。 図中、 TCH162はヒト TCH162のァミノ 酸配列を、 NTCPはナトリウム依存性胆汁酸トランスポ一夕一 （NTCP) のァミノ 酸配列を示す。 口は、 2配列で一致するアミノ酸を示す。
図 2は、 ヒト TCH162遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。 ヒ トの各組織 cDNA (Human MTC panel Iおよび MTC panel I I：クロンテック社製） におけるヒト TCH162の発現量を Ta iMan PCRにより測定した結果を示す。 発現量 は cDNA溶液 1 1当たりのコピー数で表した。
図 3は、 ヒト TCH162遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。 ヒ トの各組織 cDM (Human diges t ive sys tem MTC pane l：クロンテック社製） に おけるヒト TCH162の発現量を TaqMan PCRにより測定した結果を示す。 発現量は cDNA溶液 1 1当たりのコピー数で表した。
図 4は、 ヒト TCH162遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。 ヒ トの各組織 cDNA (Human Adul t Digest ive System Normal Ti ssue cDNA Pane l I および V： Bi oChain社製） におけるヒト TCH162の発現量を TaqMan PCRにより測定 した結果を示す。 発現量は、 TCH162の cDNA溶液 1 1当たりのコピ一数を、 等量 の各組織 cDNAにおける glyceraldehi de- 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH)の コピー数で割った値で表した。
図 5は、 ヒト TCH162 (hTC 62)およびマウス TCH162 (mTCH162) のアミノ酸配 列の比較を表す図である。 図中、 liTCm 62はヒト TCH162のアミノ酸配列を、 mTCH162はマウス TCH162のアミノ酸配列を示す。 口は、 2配列で一致するァミノ 酸を示す。
図 6は、 マウス TCH162遺伝子産物の各組織 cDNA (Mouse MTC pane l Iおよび MTC panel I I :クロンテック社製） における発現量を表す図である。
図 7は、 マウス TCH162遺伝子産物の 7週齢 BALB/cマウス各組織における発現量 を表す図である。 発現量は、 マウス TCH162の cDM溶液 1 1当たりのコピ一数を 、 等量の各組織 cDM〖こおける rodent glyceraI dehide-3-p osphate
dehydrogenase (rGAPDH) のコピー数で割った値で表した。
図 8は、 ジーンロジックデータベースを用いたヒト TCH162の発現量の結果を 示す。 発明を実施するための最良の形態 - 本発明で用いられる配列番号： 1または配列番号： 1 9で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク質 （以下 、 本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもあ る） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 B細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲル八 ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 線維芽細胞 、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 Τ細胞、 Β 細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝 細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細 胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各 部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延 髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう 、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸 腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨 格筋などに由来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよ い。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ま しくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 配列番号： 1 9で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは 約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に 好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミ ノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1 9で表されるァミノ 酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 9で表されるァ ミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質など が好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat ional Center for Biotechno logy Informat ion Bas ic Local Al ignment Search Tool ) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62 ；フィルタリング =0FF) にて計算することができる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶 性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ド一パミン、 グルタミン酸、 エンケフアリン など） などの輸送などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質 的に （例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがつ て、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ドー パミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍 ) であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量などの 量的要素は異なっていてもよい。
胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ド一パ ミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送などの活性の測定は、 公知の方法に準じて行うことができ、 例えば、 Am. J. Phys iol.、 274巻、 G157- 169頁、 1998年に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することがで ぎる。 また、 本発明のタンパク質としては、 例えば （1 ) ( i ) 配列番号： 1で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましく は 1〜1 5 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程 度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましく は数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 1 で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ま しくは 1〜1 5 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0 個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ま しくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1( 5 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに 好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配 列番号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0 個程度、 好ましくは 1〜1 5 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好まし くは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度 、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された アミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタン パク質などのいわゆるムティン、 （2 ) (i) 配列番号： 1 9で表されるァミノ 酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 2 0 0個程度、 好ましくは 1〜 1 5 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1 ~ 5 0個程度、 好まし くは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) '配列番号： 1 9で表され るアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1 〜1 5 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1 9で 表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好まし くは 1〜1 5 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個 程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好まし くは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号 ： 1 9で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程 度、 好ましくは 1〜1 5 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さ らに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ ノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク 質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その揷 入、 欠失または置換の位置は、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 本発明のタンパ ク質は、 C末端が力ルポキシル基 ( - C O O H) 、 カルポキシレート （一 C O 〇-) 、 アミド （一 C〇NH 2) またはエステル （一 C〇〇R) のいずれであつ てもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピル、 n—プチルなどの C卜 6アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ 一ナフチルなどの C 6 _ 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニルー C アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー
C ^ 2アルキル基などの C 7— i 4ァラルキル基、 ピバロィルォキシメチル基など が用いられる。
本発明のタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレ一 ト） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されてい るものも本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例え ば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン 残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C卜 6ァ ルカノィルなどの C^— eァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断 されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子 内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一 OH、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾ —ル基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミ ル基、 ァセチル基などの (^ _ 6アルカノィル基などの — 6ァシル基など） で保 護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合 タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質などがあげられる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明のタンパク質 の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明のタンパク質と同様の 性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、 本発明の夕ンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 5個以上 、 好ましくは 1 0個以上、 好ましくは 1 5個以上、 好ましくは 2 0個以上、 好 ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個 以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用 いられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さら に好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そのアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数 個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されて いてもよい。
本発明の部分ペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列において第 1〜 9 7番目、 第 1 6 9〜 1 9 1番目、 第 2 5 4〜 2 7 7番目 のアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列に おいて第 1〜9 7番目、 第 1 6 9〜 1 9 1番目、 第 2 5 4〜 2 7 7番目のアミ ノ酸配列を含有するぺプチドなどがあげられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端が通常力ルポキシル基 （一 C〇〇H) またはカルボキシレート （_ C O〇—） であるが、 前記した本発明 のタンパク質のごとく、 C末端がアミド （一 C〇NH 2) またはエステル （一 C O O R) であってもよい。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明のタンパク 質と同様に、 C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレート） を有し ているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護 基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基 がピ口ダル夕ミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な 保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドな どの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いるこ とができる。 たとえば、 後述する本発明の抗体を調製する目的には、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列において第 1〜2 8番目、 第 9 9〜1 2 9番目、 第 1 8 0〜 1 9 3番目、 第 2 4 6〜2 8 6番目のアミノ酸配列を有す るペプチド、 配列番号'： 1 9で表されるアミノ酸配列において第 1〜9 7番目 、 第 1 6 9〜1 9 1番目、 第 2 5 4〜2 7 7番目のアミノ酸配列を含有するべ プチドなどがあげられる。
本発明のタンパク質または部分べプチドの塩としては、 生理学的に許容され る酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用い られ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩として は、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あ るいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 篠酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸 、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前述したヒ トや温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造 することもできるし、 タンパク質をコードする D NAを含有する形質転換体を 培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド合成法 に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィ一などのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそのアミド 体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 その ような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベ ンズヒドリルアミン榭脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルァ ルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒド ロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹 J3旨、 4— ( 2 ' , 4 ' —ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキシ 樹脂、 4— ( 2 ' , 4， —ジメトキシフエニル— F m o cアミノエチル） フエ ノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—アミノ基 と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通り に、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から タンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さら に高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク 質もしくは部分べプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力ルポ ジイミド類としては、 D C C、 N, Ν'—ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν— ェチルー N'— ( 3 _ジメチルァミノプロリル) 力ルポジィミドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t , HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物ま たは H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミ ノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン などのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。 反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 T：〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択さ れる。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 二 ンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離 を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことがで きる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸または ァセチルイミダゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化することによって 、 後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキ シカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベンジルォキシ カルボニル、 C 1 _ Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフル ォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二卜口フエニルスルフエニル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル ' プロピル、 ブチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロ ヘプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは 環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステ ル、 4 _ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ 口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、. ベンジルォキシカルポニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド ィ匕、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級 （( アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジル ォキシカルボ二ル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基など が用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t—ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz 1、 C 12 — Bz l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。 ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4一メ卜キ シー 2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノ一ル 、 2， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノ メチルアルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシ ミド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いら れる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸 アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約 _ 20t〜 40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば 、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾー ル、 ジメチルスルフィド、 1, 4一ブタンジチオール、 1, 2—ェ夕ンジチォ —ルなどのようなリガンド作動性力チォン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル 基はチオフエノール処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基 として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1 , 4ーブ 夕ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウ ム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば 、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の《—力ルポキシル基をアミド化して保護し た後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端のひーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または 部分ペプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質ま たは部分ペプチドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記した ような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である 。 縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法 によりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得るこ とができる。 この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使し て精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドの アミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 力ルポキシ末 端アミノ酸の《—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エス テルとした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望の夕 ンパク質またはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 公知のペプチドの合 成法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断する ことによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固 相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用いられ る部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮 合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺ プチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例 えば、 以下の （a) 〜 （e) に記載された方法が挙げられる。
(a) M. Bodanszkyおよび M.A. Ondetti, ペプチド ·シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(b) Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
(c) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(d) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 I V、 205、 （1977年）
(e) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留，カラムクロマトグ ラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用い られる部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べ プチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって ji当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる 本発明の夕ンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述した本発 明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるもので あってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲ ノム DNAライブラリ一、 前記した細胞'組織由来の cDNA、 前記した細胞 •組織由来の cDN Aライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。
ライプラリーに使用するベクターは、 パクテリオファ一ジ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織 より totalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT- PCR法と略称する ) によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば （1) 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で表される塩基 配列とハイス卜リンジエンドな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の 性質を有するタンパク質をコードする DNA、 (2) 配列番号： 15で表され る塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 15で表される塩基配列とハ イストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し'、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有 するタンパク質をコードする DNA、 (3) 配列番号： 20で表される塩基配 列を含有する DNA、 または配列番号： 20で表される塩基配列とハイストリ ンジエンドな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 19で 表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタ ' ンパク質をコードする DNA、 (4) 配列番号： 27で表される塩基配列を含 有する DNA、 または配列番号： 27で表される塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 19で表され るアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク 質をコ一ドする DN Aなどであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2、 配列番号： 15、 配列番号： 20または配列番号： 27で表 される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 15、 配列番号： 20または 配列番号： 27で表される塩基配列と約 50%以上、 好ましくは約 60%以上 、 より好ましくは約 70%以上、 特に好ましくは約 80%以上、 最も好ましく は約 90 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる 塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い 、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；フィルタリング =0N；マッチス コア =1；ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば 、 モレキュラー ·クローニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な うことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 .より好ましくは、 ハイストリン ジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 19〜 40 mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60〜65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2または配列番号： 15で表され る塩基配列を含有する DNAが、 配列番号： 19で表されるアミノ酸配列を含 有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 20または配列番 号： 27で表される塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
本発明の部分べプチドをコードする D N Aとしては、 前述した本発明の部分 ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであって もよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞-組 織由来の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 D NAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコ一ドする DNAとしては、 例えば、 配 列番号： 2、 配列番号： 15、 配列番号： 20または配列番号： 27で表され る塩基配列を有する DNAの一部分を有する DNA、 または配列番号： 2、 配 列番号： 15、 配列番号： 20または配列番号： 27で表される塩基配列とハ イストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 本発明 のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DNAの 一部分を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 15、 配列番号： 20または配列番号： 27で表 される塩基配列とハイブリダィズできる DN Aは、 前記と同意義を示す。 ハイブリダイゼ一ションの方法およびハイストリンジェン卜な条件は前記と 同様のものが用いられる。 本発明のタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする DNAのク ローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と 略記する場合がある） を完全にコードする DN Aのクロ一ニングの手段として は、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 DN Aプ ライマ一を用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み 込んだ D N Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DNA 断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼ一ションに よって選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モ レ干ユラ一 ·クロ一ニンク (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと ができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記 載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 MutanTM_super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LA PCR法や Gapped duplex法や Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方 法に従つて行なうことができる。
クロ一ン化されたタンパク質をコードする DNAは目的によりそのまま、 ま たは所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用するこ とができる。 該 DN Aはその 5'末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し 、 また 3，末端側には翻訳終止コドンとしての T A A、 TG Aまたは TAGを有 していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 D N Aアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質 をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断 片を適当な発現ベクター中のプロモー夕一の下流に連結することにより製造す ることができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322, pBR 3 2.5, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 11 0， pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH 15) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl_l l、 ρ XT1、 pR c/CMV, pRc/RSV, p c DNA I /N e oなどが用い 'られる。
本発明で用いられるプロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRひプロモータ一、 SV40プロモータ一、 L TRプロモータ一、 CMVプロモーター、 HS V- TKプロモータ一などが挙げ られる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRaプロ モーターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒァ属菌である場合は、 t r pプロモーター、 1 a cプロモータ一、 r e cAプロモーター、 APLプ 口モー夕—、 プロモーター、 丁 7プロモ一夕一などが、 宿主がバチルス 属菌である場合は、 SP01プロモーター、 SP〇2プロモー夕一、 p enP プロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGK プロモーター、 GAPプロモ一夕一、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿 主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモータ一、 P 10プロモータ一 などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下 、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いるこ とができる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレギセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマ イシン耐性遺伝子 （以下、 Ne o1"と略称する場合がある、 G418耐性） 等 が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い て dh f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジン を含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA *シグ ナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は 、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリ、シン ·シグナル配列などが、 宿主 が酵母である場合は、 MFQ; ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 α—ィンター フエロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DNAを含有す るべクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞 、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア ·コリ
(Escherichia coli) K 12 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60巻 , 160 (1968)] , J M 103 [： Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1981)〕 ， J A 221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔 Journal of Molecular Biology, 41巻， 459(1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39巻 ,440(1954)] などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis ) MI 114 ½61^,24巻，255 (1983)〕 ， 207 - 21 [Journal of
Biochemistry, 95巻，87(1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevlsiae) AH 22, AH22R— , ΝΑ87- 11 A, DKD— 5D， 2 OB— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) N CYC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、
Mamestra brassicae由来の細胞または Est igmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞 ； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 In Vivo, 13, 213- 217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、
Nature, 315卷， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤ ィニーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） ， マ ウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒ ト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従つて行なう ことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従つて行なうことができる。 酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182 -
187(1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology，6， 47-
55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ ロトコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載 の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現べクタ一で 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ·リカ一 、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機また は有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリ ゥム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成長促進因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) , Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972 〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例 えば、 33—インドリルァクリル酸のような薬剤を加える:；とができる。
宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43 °Cで約 3〜 24時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー (Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77卷， 4505 (1980)〕 や 0.5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔 Bitter, G. A. ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81巻， 5330 (1984)〕 が挙げられ る。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20t〜 3 5 で約24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C.C. , Nature, 195, 788 (1962)) に非動化し た 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pH は約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5 日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔3(^611じ6,122巻，501(1952)〕 ， DM EM培地 [Virology, 8巻， 396 (1959)〕 ， RPM I 1640培地 CThe Journal of the Amer i can Medi cal Assoc iat ion 199巻， 519 (1967)〕 ， 1 9 9培地 〔 Proceeding of the Soc i ety for the Bi o logical Medic ine, 73巻， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 T〜 4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 胞膜または細胞外に本発明のタ ンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方 法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超 音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適 宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 ト リトン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタン パク質が分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と 上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質 の精製は、 公知の分離 '精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用す る方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトダラ フィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一 などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 公知の方法ある いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変 換することができる。 ' なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白 修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部 分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリ コシダ一ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィ ムィムノアッセィやウェス夕ンブロッティングなどにより測定することができ る。
本発明のタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩に対する抗体は、 本 発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれ ば、《ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗体の説明 においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対す る抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 公知の抗体または坊血清の 製造法に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の夕ンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位 にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生 能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行 われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよ びラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物 、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に 脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異 種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイブ リド一マを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記 の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活 性を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば 、 ケーラーとミルスタインの方法 〔Nature、 256、 495 (1975)] に従い実施する ことができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコ一ル （PE G) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— 1 などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U 1が好ましく用いられる 。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ·· 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6 000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 3 0〜37 で 1〜10分間ィンキュベ一トすることにより効率よく細胞融合を 実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させ た固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放 射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる 細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合 したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行な うことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別おょぴ育種用培地とし ては、 ハイプリド一マが生育できるものならばどのような培地を用いても良い 。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20 %の牛胎児血清を含む RPM I 1640培地、 1〜 10 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株 ) ) あるいはハイブリド一マ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 ( 株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましく は約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週 間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリド一 マ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定でき る。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの 分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結 合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により坊 体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なう ことができる。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製 造することができる。 例えば、 免疫坊原 （タンパク質抗原） 自体、 あるいはそ れとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造 法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパク質に対 する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造すること ができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合 体に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は 、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば 、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し 、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられ る。
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル 、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロインドアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など 、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこ とができる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードする D NA (以下、 アンチ センスポリヌクレオチドの説明においては、 これらの D N Aを本発明の D NA と略記する場合がある） の塩基配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基 配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、 本発明 の D N Aの塩基配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその 一部を有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれ のアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、 アンチセンス D N Aが好 ましい。
本発明の D NAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D NA に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは 約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが 挙げられる。 特に、 本発明の D NAの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のタン パク質の N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の 塩基配列など） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ま しくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセ ンスポリヌクレオチドが好適である。
具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 1 5、 配列番号： 2 0または配列番 号： 2 7で表わされる塩基配列を有する D N Aの塩基配列に相補的な、 もしく は実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌ クレオチド、 好ましくは例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 1 5、 配列番号： 2 0または配列番号： 2 7で表わされる塩基配列を有する D N Aの塩基配列に 相補な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドな どが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5 〜3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレア一ゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホ スホロチォェ一ト、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修 飾りん酸残基に置換されていてもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチ ドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害するこ とのできるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 ある いは決定されたタンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し 、 合成しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝 子の R NAとハイブリダィズすることができ、 該 R NAの合成または機能を阻 害することができるか、 あるいは本発明のタンパク質関連 R N Aとの相互作用 を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本 発明のタンパク質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明のタンパク質関連 R N Aと特異的にハィブリダイズすることがで きるポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の 発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用 である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列また は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （タンパク質） との間で 「対応 する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指 令にあるペプチド （タンパク質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺 伝子の 5，端ヘアピンループ、 5 ' 端 6—べ一スペア · リピート、 5 ' 端非翻訳 領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳終止 コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドロ一ム領域、 および 3 ' 端へァピ ンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何 なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関 係は、 対象物とハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は 、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンスポリヌクレオチ ドは、 2—デォキシ— D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リ ポースを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N— グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチ ド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販のタンパク質核酸および合成 配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマ一 （ 但し、 該ポリマーは D NAや R NA中に見出されるような塩基のペアリングや 塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する) などが挙げられる 。 それらは、 二本鎖 D NA、 一本鎖 D NA、 二本鎖 R NA、 一本鎖 R NA、 さ らに D NA : R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレ ォチド （または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加され たもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの 、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチル ホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど ) を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォ ェ一ト、 ホスホロジチォェ一トなど） を持つもの、 例えばタンパク質 （ヌクレ ァーゼ、 ヌクレアーゼ ·インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L—リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基 を有しているもの、 インタ一力レート化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレン など） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホ ゥ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修 飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマ一型の核酸など） であってもよい 。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンお よびビリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基 をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリ ンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその 他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾され たヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸 基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァ ミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R N A、 D N A、 ある いは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例とし ては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシドア ミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それ に限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好 ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なも のにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖 に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセ ンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al . , Pharm Tech Japan, Vol . 8, pp. 247, 1992 ; Vo l . 8， pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al . ed.， Ant i sense Research and Appl i cat ions, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸 の 3 '端あるいは 5，端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド 結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3，端あ るいは 5，端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレン グリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護 基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系 を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる
以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べ プチドをコードする D NA (以下、 本発明の D NAと略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 および本発明の D NAのアンチセンス ポリヌクレオチド （以下、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する 場合がある） の用途を説明する。 ·
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩を含有する医薬 は、 例えば、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （ 例、 ド一パミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど) などの輸送を抑制する ことで、 例えば、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎 、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系 疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合 失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 滕炎、 脬嚢胞性線維症な どの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機能低下、 .循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症 候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎 臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌 、 直腸癌、 滕臓癌、 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤として使用することがで きる。
一方、 本発明の夕ンパク質の活性を促進する化合物もしくはその塩を含有す る医薬は、 例えば、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達 物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送を促 進することで、 例えば、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性 大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢 神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害 、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線 維症などの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T 延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺 癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 勝臓癌、 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤として使用するこ とができる。 〔 1〕 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防。治療剤
本発明のタンパク質は、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神 経伝達物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸 送活性などを有し、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達 物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど) などの輸送に寄 与するとともに、 胆汁酸代謝などに重要な役割を果たしている。
したがって、 本発明のタンパク質をコードする D NAに異常があったり、 欠 損している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には 、 例えば、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クロ ーン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （ 例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症 、 不安神経症など） 、 糖尿病、 勝臓疾患 （例、 塍炎、 滕嚢胞性線維症などの塍 機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息な ど） 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸 癌、 脬臓癌、 胸腺腫など） などの種々の疾患が発症する。
したがって、 本発明のタンパク質および本発明の D NAは、 例えば、 高脂血 症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大 腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アルッ八イマ 一病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症など ) 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維症などの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機能 低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞 肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 塍臓癌、 胸腺 腫など） などの予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 好まし くは中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候群 などの予防 ·治療剤である。
例えば、 生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているた めに、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ド ーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送活性が十分に、 あ るいは正常に発揮されない患者がいる場合に、 （ィ） 本発明の D NAを該患者 に投与し、 生体内で本発明のタンパク質を発現させることによって、' （口） 細 胞に本発明の D NAを挿入し、 本発明のタンパク質を発現させた後に、 該細胞 を患者に移植することによって、 または ひ ) 本発明のタンパク質を該患者に 投与することなどによって、 該患者における本発明のタンパク質の役割を十分 に、 あるいは正常に発揮させることができる。
本発明の D NAを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 該 D NAを単 独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウィル スァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクタ一に挿入した後、 常 套手段に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認めら れる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテ —テルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なくと も 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好まし くは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質等は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水も しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤など の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質等を生理 学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤 などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和する ことによって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示さ れた範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのよう な香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記夕 イブの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウ ムなど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど) 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエ チレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0TM、 HCO— 50など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液 、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレン グリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアン プフレに充填される。
本発明の DNAが挿入されたべクタ一も上記と同様に製剤化され、 通常、 非 経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与するこ とができる。
本発明のタンパク質等の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 パーキンソン症候群の治療目的で本発明のタンパ ク質等を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては 、 一日につき該タンパク質等を約 0. lmg〜l 0 Omg、 好ましくは約 1. 0 〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与す る場合は、 該タンパク質等の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても 異なるが、 例えば、 パーキンソン症候群の治療目的で本発明のタンパク質等を 注射剤の形で成人 （体重 6 O kgどして） に投与する場合、 一日につき該タン パク質等を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omgを静脈に注射することにより投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することが でさる。 〔2〕 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化 合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、 （1 ) 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタ ンパク質の活性 （例えば、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神 経伝達物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸 送など） を促進または阻害する化合物またはその塩 （以下、 それぞれ促進剤、 阻害剤と略記する場合がある） のスクリーニング方法を提供する。 より具体的 には、 例えば、
( 2 ) ( i ) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の胆汁酸、 ステ ロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ドーパミン、 ダルタミ ン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送活性と （i i) 本発明のタンパク質を産 生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物の胆汁酸、 ステロイドホルモン 、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフ ァリンなど） などの輸送活性の比較を行なうことを特徴とする促進剤または阻 害剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i ) と （i i) の場合において、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物 質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送を、 放 射標識.した基質もしくは蛍光色素で測定し、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂 溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケファリ ンなど） などの輸送を指標として比較することを特徴とするものである。 試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙 げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質を産生する 能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファ一に浮遊して調製する。 バッファ一には、 p H約 4〜 1 0 (望ましくは、 ρ Η約 6〜8 ) のリン酸バッ ファー、 ほう酸バッファーなどの、 本発明のタンパク質の胆汁酸、 ステロイド ホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ド一パミン、 グルタミン酸、 エンケファリンなど） などの輸送活性を阻害しないバッファ一であればいずれ でもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するベクターで形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C H O細胞など の動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、，前述の方 法で培養することによって、 本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質 転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質の胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経 伝達物質 （例、 ド一パミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送 活性は、 公知の方法、 例えば、 Am. J. Physiol .、 274巻、 G157-169頁、 1998年 に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。 例えば、 上記 （i i) の場合における胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビ 夕ミン、 神経伝達物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど ) などの輸送活性を、 上記 （ i ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を本発明のタン パク質の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。 また、 例えば、 上記 （i i) の場合における胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂 溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケファリ ンなど） などの輸送活性を、 上記 （i ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ま しくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害 （または抑制） する試験 化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択 することができる。
また、 本発明のタンパク質遺伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホス ファターゼ、 ルシフェラ一ゼなどの遺伝子を挿入し、 上記の各種細胞に発現さ せ、 該細胞に上記試験化合物を接触させた場合における酵素活性を賦活化また は阻害する化合物またはその塩を探索することによって本発明のタンパク質の 発現を促進または抑制 （すなわち、 本発明のタンパク質の活性を促進または阻 害） する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
本発明の夕ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、 本発明のタンパク質 遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのた めの試薬として有用である。
本発明は、 （3 ) 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用い ることを特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化 合物またはその塩 （以下、 それぞれ促進剤、 阻害剤と略記する場合がある） の スクリーニング方法を提供し、 より具体的には、 例えば、
( 4 ) (i i i) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合 と （iv) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合 物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスク リ一ニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 (i i i) と (iv) の場合におけ る、 本発明のタンパク質遺伝子の発現量 （具体的には、 本発明のタンパク質量 または前記タンパク質をコードする mR NA量） を測定して、 比較する。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物 、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが 挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であ つてもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質を産生する 能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。 バッファーには、 p H約 4〜1 0 (望ましくは、 p H約 6〜8 ) のリン酸バッ ファー、 ほう酸バッファ一などの、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害 しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するべクタ一で形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C H O細胞など の動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方 法で培養することによって、 本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質 転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質 を認識する抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ゥ エスタン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定す ることができる。
本発明のタンパク質遺伝子の発現量は、 公知の方法、 例えば、 ノーザンプロ ッテインクや Reverse t ranscr ipt ion- polymerase chain reac t ion (R T— P C R) 、 リアルタイム P C R解析システム （ABI社製、 TaqMan polymerase chain reac t i on) などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがつて測定することが できる。
例えば、 上記 （iv) の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、 上記 （i i i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を 促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、 上記 （iv) の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、 上記 （i i i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を 阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
さらに、 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する 化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、 （5 ) 本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のタンパク 質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩 （以下、 それぞれ促進剤、 阻害剤と略記する場合がある） のスクリーニング方法を提供し、 より具体的に は、 例えば、
( 6 ) (V) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と (vi) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物 を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリ 一二ング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 本発明の抗体を用いて （V) と (vi) の場合における、 本発明のタンパク質の発現量 （具体的には、 本発明の タンパク質量） を測定 （例、 本発明の蛋白質の発現を検出、 本発明の蛋白質の 発現量を定量等） して、 比較する。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物 、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞,抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが 挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であ つてもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質を産生する 能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファ一に浮遊して調製する。 バッファ一には、 p H約 4〜1 0 (望ましくは、 p H約 6〜8 ) のリン酸バッ ファー、 ほう酸バッファーなどの、 本発明のタンパク質の発現を阻害しないバ ッファ一であればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するべクタ一で形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C HO細胞など の動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方 法で培養することによって、 本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質 転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質 を認識する抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ゥ エスタン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定す ることができる。
例えば、 上記 （vi) の場合における本発明のタンパク質の発現量を、 上記 （V ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を促進する化合物 またはその塩として選択することができる。
例えば、 上記 （vi) の場合における本発明のタンパク質の発現量を、 上記 （V ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物 またはその塩として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質もしくは部分ぺプ チドまたはその塩、 または本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドを産生す る能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク 、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明の タンパク質の活性 （例、 胆汁酸、 ステロイドホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経 伝達物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送 活性など） を 進または阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用 いられる。
本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 高脂 血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性 大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 ァルツハイ マー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症な ど） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 塍炎、 滕嚢胞性線維症などの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機 能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細 胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 膳臓癌、 胸 腺腫など） などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。 好ましくは中枢 神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候群などの予 防 ·治療剤である。
また、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば 、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アル ッハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神 経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維症などの塍機能不全 など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲 状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化 など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癍、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 塍臓 癌、 胸腺腫など） などの予防，治療剤などの医薬として有用である。 好ましく は中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候群な どの予防 ·治療剤である。
本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩は、 例えば 、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アル ッハイマー病、 パ一キンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神 経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 滕炎、 塍嚢胞性線維症などの塍機能不全 など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲 状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化 など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 滕臓 癌、 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。 好ましく は中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候群な どの予防 ·治療剤である。
また、 本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クロ一 ン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例 、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 S萃炎、 塍嚢胞性線維症などの塍機 能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など ) 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動 脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝 臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌 、 塍臓癌、' 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。 好 ましくは中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症 候群などの予防 ·治療剤である。
本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 高脂 血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性 大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アルッ八ィ マー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症な ど） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維症などの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機 能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細 胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 滕臓癌、 胸 腺腫など） などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。 好ましくは中枢 神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候群などの予 防 ·治療剤である。
また、 本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩は、 例えば 、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アル ッハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神 経症など） 、 糖尿病、 勝臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維症などの滕機能不全 など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） '、 甲 状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化 など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 腾臓 癌、 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。 好ましく は中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候群な どの予防 ·治療剤である。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の予防。治療剤として使用する場合、 常套手段に 従って製剤化することができる。 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口 的 fc投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル —トなどにより差異はあるが、 例えば、 パーキンソン症候群治療の目的で本発 明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一 般的に成人 （体重 6 O k gとして) においては、 一日につき該化合物またはそ の塩を約 0. 1〜1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 mg、 より好ましくは 約 1 . 0〜2 0 m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはそ の塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 パ 一キンソン症候群治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進する化合物ま たはその塩を注射剤の形で通常成人 （体重 6 O k gとして） に投与する場合、 一日につき該化合物またはその塩を約 0 . 0 1〜3 0 m g、 好ましくは約 0 . l〜2 0 mg、 より好ましくは約 0 . 1〜1 O m gを静脈注射により投与する のが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した量を投 与することができる。
〔3〕 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので 、 被検液中の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による 定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を 測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
( i i ) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質の定量法を提 供する。 .
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体 であることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクロ一ナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的に は、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b，）2 、 F a b' 、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体 、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し 、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測 定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競 合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度 、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては 、 例えば、 〔125 1〕 、 〔131 1〕 、 〔 〕 、 〔14c〕 などが用いられる。 上記酵 素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ^一ガラクトシ ダ一ゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダーゼ 、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォ レスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質 としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 リレシフェリン、 ルシゲ二 ンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン 一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹 脂、 ある.いはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） .、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体 を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらし て行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じること ができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用坊体ある いは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感 度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明の夕ン パク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次 反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体 が、 本発明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体 は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノク口一ナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば 、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで さる。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し (B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレ ングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い 第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の 抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識 化扰体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相 の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメト リ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定 系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成 書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川 栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「 酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「 酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Me thods in ENZYMOLOGYJ Vol . 70 (1醒 unochemi cal Techniques (Part A))、 同書 Vol . 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol . 84 (Immunochemi cal Techniques (Part D: Selec ted Immunoassays)) > 同書 Vol . 92 (Immunochemical Techniques (Part E :Monoc lonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) ) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and
Monoc lonal Ant ibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。 以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク 質を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の夕ンパク質の濃度を定量すること によって、 本発明のタンパク質の濃度の減少が検出された場合、 例えば、 高脂 血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性 大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アルッ八ィ マ一病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症な ど） 、 糖尿病、 滕臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維症などの滕機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機 能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細 胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 睦臓癌、 胸 腺腫など） などが発症している可能性が高いと診断することができる。 反対に 、 例えば、 本発明のタンパク質の濃度の上昇が検出された場合、 例えば、 高脂 血症、 消化器疾患 '(例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性 大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アルッ八ィ マ一病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症な ど） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 滕炎、 塍嚢胞性線維症などの滕機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機 能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細 胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 ·子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 滕臓癌、 胸 腺腫など） などが発症している可能性が高レゝと診断することが出来る。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン パク質を検出するために使用する.ことができる。 また、 本発明のタンパク質を 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタン パク質の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのた めに使用することができる。 〔4〕 遺伝子診断剤
本発明の DNAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィ.ヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の タンパク質またはその部分ペプチドをコ一ドする DNAまたは mRNAの異常 (遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRN Aの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加ある ^は発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイ ブリダィゼーシヨンや PCR— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5 巻， 874〜 879頁 （1989年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショ ナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ュ一エスエー (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することが できる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーションにより発現増加が検出された場合 、 例えば高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クロ一 ン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例 、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 滕臓疾患 （例、.塍炎、 滕嚢胞性線維症などの塍機 能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （COPD) 、 喘息など ) 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 QT延長症候群、 動 脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝 臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌 、 滕臓癌、 胸腺腫など） などである可能性が高いと診断することが出来る。 反 対に、 発現低下が検出された場合や PC R— S S CP法により DN Aの突然変 異が検出された場合は、 例えば、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群 、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など ) 、 中枢神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 勝臓疾患 （例、 塍炎、 塍 嚢胞性線維症などの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 ( C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整 脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食 道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 ，胃癌、 膀胱癌、 子宮 頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 塍臓癌、 胸腺腫など） などである可能性が高いと診 断することができる。
〔5〕 アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の D N Aに相補的に結合し、 該 D N Aの発現を抑制することができる 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 '生体内における本発 明のタンパク質または本発明の D NAの活性や機能 （例、 胆汁酸、 ステロイド ホルモン、 脂溶性ビタミン、 神経伝達物質 （例、 ドーパミン、 グルタミン酸、 エンケフアリンなど） などの輸送活性） を抑制することができるので、 えば 、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アル ッハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神 経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維症などの塍機能不全 など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲 状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化 など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 塍臓 癌、 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤などとして使用することができる。 好ま しくは中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候 群などの予防 ·治療剤である。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防■治療剤として使用する場 合、 公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
例えば、 該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、 該アンチセンスポ リヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスべク ター、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクタ一などの適当なベクタ 一に挿入した後、 常套手段に従って、 ヒ卜または哺乳動物 （例、 ラッ卜、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経 口的に投与することができる。 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 そのまま で、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体ととも に製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって 投与できる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ル —トなどにより差異はあるが、 例えば、 パーキンソン症候群の治療の目的で本 発明のアンチセンスポリヌクレオチドを患部に投与する場合、 一般的に成人 （ 体重 6 0 k g ) においては、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0 . 1〜1 0 O m g投与する。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ一 ブとして使用することもできる。
さらに、 本発明は、
(0 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部とそれに相補的な R NAを 含有する二重鎖 R NA、
(i i) 前記二重鎖 R NAを含有してなる医薬、
(i i i) 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部を含有するリポザィム、 (iv) 前記リポザィムを含有してなる医薬、
(V) 前記リポザィムをコードする遺伝子 （D NA) を含有する発現ベクターな ども提供する。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 二重鎖 R NA、 リポザィムな ども、 本発明の D N Aから転写される R N Aを破壊またはその機能を抑制する ことができ、 生体内における本発明のタンパク質または本発明で用いられる D N Aの機能を抑制することができるので、 例えば、 高脂血症、 消化器疾患 （例 、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性 潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パー： 症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾 患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維症などの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （ 例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃 癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 塍臓癌、 胸腺腫など） などの予防 •治療剤などとして使用することができる。 好ましくは中枢神経系疾患などの 予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防 ·治療剤である 二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecul ar Medic ine, 7卷， 221 頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 公知のリポザィムの配冽の一部を本発明のタンパ ク質をコードする R N Aの一部に置換することによって製造することができる 。 本発明のタンパク質をコードする R N Aの一部としては、 公知のリポザィム によって切断され得るコンセンサス配列 NUX (式中、 Nはすべての塩基を、 Xは G以外の塩基を示す） の近傍の配列などが挙げられる。
上記の二重鎖 R NAまたはリポザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場 合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することがで きる。 また、 前記 （V) の発現べクタ一は、 公知の遺伝子治療法などと同様に用 い、 上記予防 ·治療剤として使用する。
〔6〕 本発明の D NAを有する動物の作出
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする D NA (以下、 本発明 の外来性 D N Aと略記する） またはその変異 D N A (本発明の外来性変異 D N Aと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の外来性 D NAまたはその変異 D NAを有する非ヒ卜哺乳動物、 (2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えべクタ一などを提供する。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下 、 本発明の DNA導入動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびそ の始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生 における胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階で かつ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエ クション法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 D EAE—デキストラン法などにより目的とする DN Aを導入することによって 作出することができる。 また、 該 DNA導入方法により、 体細胞、 生体の臓器 、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを導入し、 細胞培養、 組織 培養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知 の細胞融合法により融合させることにより本発明の DN A導入動物を作出する こともできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として 、 C57BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 系統 , BDFi系統， B 6D2F 系統， BALBZc系統， I CR系統など） また はラット （例えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては 、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DNAの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた D NAなどが用いられ、 また、 異常 D NAも含まれる。 該異常 D N Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる D N Aを意 味し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現 させる D N Aなどが用いられる。
本発明の外来性 D NAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の D N Aを対象動物に導入するにあ たっては、 該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモー夕一の下流に結合した D NAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明の ヒト D NAを導入する場合、 これと相同性が高い本発明の D NAを有する各種 哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 ラット、 マウスなど） 由来の D NAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明 のヒト D NAを結合した D NAコンストラクト （例、 ベクタ一など） を対象哺 乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすること によって本発明の D NAを高発現する D N A導入哺乳動物を作出することがで きる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯 草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファ一ジなどのバクテリオ ファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィル スまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の D NA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （i) ウィル ス (例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス 、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する D NAのプ 口モーター、 （i i) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン 、 インスリン I I、 ゥロブラキン I I、 エラス夕一ゼ、 エリスロポエチン、 ェ ンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチ オン S _トランスフェラ一ゼ、 血小板由来成長因子 i3、 ケラチン K 1， K 1 0 および K 14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパ ク質キナーゼ β Iサブュニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォ スファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプ夕一チロシンキナーゼ (一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵 素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタロチォネィ ン Iおよび I I A、 メタ口プロティナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン j8—水酸化酵素、 甲状 腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ポリペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 ) 、 βァクチン、 ひおよび j8ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン 基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy_ l、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 (VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C 、 平滑筋ひァクチン、 プレプロエンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモ —ターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメ ガロウィルスプロモー夕一、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1ひ （EF— 1 α) のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ ]3ァクチンプロモーターなどが好適であ る。
上記ベクターは、 DN Α導入哺乳動物において目的とする mRN Αの転写を 終結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが好ましく 、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用いるこ とができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネ夕一などが用い られる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのス プライシングシグナル、 ェンハンサ 領域、 真核 DN Aのイントロンの一部な どをプロモータ一領域の 5， 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻 訳領域の 3' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば 、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 ラット、 マウスなど） 由来 の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DN Aおよび市販の各種ゲノム D NAライブラリ一よりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 R NAより公知の方法により調製された相 補 D NAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D NAは、 上記の細胞または組織より得られた正常なポリぺプチドの翻訳領域を点突然変 異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は導入動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの導入は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A導入後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動 ' 物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有す る。
本発明の外来性正常 D NAを導入した非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育 環境で継代飼育することが出来る。 .
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D NAの導入は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA導入後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは 、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D NAを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの 種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを 過剰に有する。
導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように 繁殖継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に 本発明の夕ンパク質の 能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物 として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA導入動物を用いて 、 本発明のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の 病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能であ る。
また、 本発明の外来性正常 D N Aを導入した哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患 に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述の プラスミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D NAコンストラク卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができ る。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの導入は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D NA転移後の作出 動物の胚芽細胞において本発明の異常 D NAが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有すること を意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その 胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有する。 導入 D NAを相 同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D NAを有するように繁殖継代することができ る。
本発明の異常 D NAを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル 動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A導入動物を用 いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの 疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質によ る正常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとな る。
また、 本発明の外来異常 D N Aを導入した哺乳動物は、 遊離した本発明の夕 ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質またはその機能不 活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A導入動物のその他の利用可能性として、 例えば、
(i) 組織培養のための細胞源としての使用、
(i i) 本発明の D NA導入動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析す る、 または D N Aにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、 本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関 連性についての解析、
(i i i) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （i i i) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる さらに、 本発明の D NA導入動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器にお けるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該 疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA導入動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などのタンパク質分解酵素により、 遊離した D NA導入細胞の取得、 その培養 またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の夕 ンパク質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 ま たはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなど ができ、 本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料とな る。
さらに、 本発明の DNA導入動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行な うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療 薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA導 入動物または本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク 質が関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。 〔7〕 ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化された上記 （1) 記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である上記 （1) 記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （1) 記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである上記 （4) 記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポ一ター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記 （6) 記載の非ヒト哺 乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （6) 記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである上記 （8) 記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 上記 （7) 記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の 発現を検出することを特徴とする本発明の D N Aに対するプロモーター活性を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺 乳動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DNAの 発現能を抑制するか、 あるいは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質 の活性を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明のタンパク 質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがあ る） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破读す ることにより本発明のノックアウト DN Aを作製すればよい。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の DNA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (]3—ガラクトシダ —ゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子） を代表とするレポ一ター遺伝子等を揷入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる DNA配列 （例えば、 p o 1 yA付加シグナルなど） を揷入し、 完全な m RNAを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構 築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕一ゲッティングベクターと略記 する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES 細胞について本発明の DN A上あるいはその近傍の DN A配列をプローブとし たサザンハイブリダィゼ一ション解析あるいはタ一ゲッティングベクタ一上の D N A配列と夕一ゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の 近傍領域の D N A配列をプライマーとした P C R法により解析し、 本発明のノ ックアウト E S細胞を選別することにより得ることができる。 また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞と しては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 の Evansと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウ スの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されている が、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に 遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 B L / 6マウスや C 57 BLZ 6の採卵数の少なさを DBAZ 2との交雑により改善 した BDF!マウス （C 57 BL/6と DBAZ2との F を用いて樹立した ものなども良好に用いうる。 BDF,マウスは、 採卵数が多く、 か,つ、 卵が丈夫 であるという利点に加えて、 C 57 BLZ 6マウスを背景に持つので、 これを 用いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C57 BL/6 マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BL/ 6マウスに代 えることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効 率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生 殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を 要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので 、 培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこと が可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は 大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常 数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 STO線維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1〜1 0000 U/m 1 ) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5 %炭酸ガス、 95%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 °Cで培養す るなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通 常 0.001〜 0.5 %トリプシン / 0.1〜 5 mM EDTA, 好ましくは約 0. 1%トリプシン ZlmM EDTA) 処理により単細胞ィ匕し、 新たに用意したフ ィ一ダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受け られた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び H. Kaufman, Nature第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetsc man ら、 ジャーナル ·ォ ブ ·ェンブリオロジー ·アンド .ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87 巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の DNA 発現不全細胞は、 インビト口における本発明のタンパク質の細胞生物学的検討 において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別 することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製 したタ一ゲッティングベクタ一をマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し 、 導入によりターゲッティングベクタ一の本発明の DNAが不活性化された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染 色体上の本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明 の D N Aをノックアウトさせることができる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D N A上またはその 近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析または 夕一ゲッティングベクター上の D N A配列と、 タ一ゲッティングベクタ一に使 用したマウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ 一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細 胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化され た細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D NA座をも つ細胞と人為的に変異した本発明の D NA座をもつ細胞との両者から構成され るキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個 体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 こ のようにして得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個 体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの 産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D NA溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に 導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常 の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。 さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち 、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得しうる。 得られたホモ ザィゴ一ト動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴ一ト複数にな るような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴ ート動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴ一 トおよびへテロザィゴ一ト動物を繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質によ り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活 性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因 究明及び治療法の検討に有用である。
〔7 a〕 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防 ·治療 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷な どに起因する疾病に対して予防 ·治療効果を有する化合物のスクリーニングに 用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 '測定することを特徴とする、 本発明の D NA の欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防 ·治療効果を有する化合物また はその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物 、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿 などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合 物であってもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の予防 ·治療効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択することができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の 性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、 パーキンソン症候群に対して治療効果を有する化合物のスクリ一二 ングをする場合、 本発明のタンパク質をコードする D NA発現不全非ヒト哺乳 動物に試験化合物を投与し、 該動物の脳内におけるド一パミンおよびその代謝 物量の測定、 黒質内の神経細胞の数または変性の観察、 該動物の運動量の測定 または行動パターンなどの解析を行う。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から 選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起 こされる疾患に対して予防 ·治療効果を有するので、 該疾患に対する安全で低 毒性な予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記ス クリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることがで さる。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 (例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸 、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸 、 リンゴ酸、 篠酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
,該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たはその他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができ る。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体 重 60 kgとして） のパーキンソン症候群の患者においては、 一日につき該化 合物を約 0.1〜： L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは 約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投 与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射 剤の形で通常成人 （60 kgとして） のパーキンソン症候群の患者に投与する 場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 Okg当たりに換算した量を投与する ことができる。
〔7 b〕 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し 、 レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対す るプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物 としては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明 の DN Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一タ —遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが 用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 β—ガラクトシダ —ゼ遺伝子 （ l a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシ フェラーゼ遺伝子などが好適である。 本発明の DN Aをレポ一ター遺伝子で置換された本発明の DNA発現不全非 ヒト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の DNAに対するプロモータ一 の支配下に存在するので、 レポ一夕一遺伝子がコ一ドする物質の発現をトレ一 スすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の 3_ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （1 ac Z) で置換している場合、 本来、 本発明 のタンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに /3—ガラクト シダ一ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモー 4一クロロー 3—インド リル一 ]3—ガラクトピラノシド （X— g a l) のような /3—ガラクトシダーゼ の基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の 動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本 ¾明の タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し 、 リン酸緩衝生理食塩液 (PBS) で洗浄後、 X-ga 1を含む染色液で、 室 温または 37°C付近で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を lm M EDTAZPBS溶液で洗浄することによって、 /3—ガラクトシダーゼ反 応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 l ac Zをコード する mRN Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の DN Aに対するプロモーター 活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有 機酸など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が 好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭 化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚 酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用 いられる。
本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩は 、 本発明のタンパク質の発現を促進し、 該タンパク質の機能を促進することが できるので、 例えば、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大 腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神 経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維 症などの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D ) 、 喘息など） 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延 長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌 、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結 腸癌、 直腸癌、 勝臓癌、 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤などの医薬として有 用である。 好ましくは中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパ —キンソン症候群などの予防 ·治療剤である。
また、 本発明の D N Aに対するプロモー夕一活性を阻害する化合物またはそ の塩は、 本発明のタンパク質の発現を阻害し、 該タンパク質の機能を阻害する ことができるので、 例えば高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍 性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中 枢神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障 害、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 勝臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性 線維症などの塍機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱 、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌、 塍臓癌、 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤などの医薬とし て有用である。 好ましくは中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましく はパーキンソン症候群などの予防 ·治療剤である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たはその他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 ブ夕、 ゥシ、 'ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができ る。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモ一夕一活性を促進 する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） のパー キンソン症候群患者においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する 。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患な どによっても異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモータ一活性を 促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） のパーキンソン症 候群患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度 を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当 たりに換算した量を投与することができる。
一方、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物 を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） のパーキンソン症 候群患者においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜10 Omg、 好ましくは 約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的 に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 '対象疾患などによって も異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害する化 合物を注射剤の形で通常成人 （60 k gとして） のパーキンソン症候群患者に 投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは 約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算 した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに 対するプロモータ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ —ニングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。 また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞 に注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子導入動物） を作出すれば 、 特異的にそのポリペプチドを合成させ、 その生体での作用を検討することも 可能となる。 さらに上記プロモ一夕一部分に適当なレポ一夕一遺伝子を結合さ せ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのもの の体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物 の探索系として使用できる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該 分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸 に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとす る。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
dATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP '三リン酸
dCTP '三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 バリン
Leu ロイシン
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリプトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n ダル夕ミン
p G 1 u ピログルタミン酸
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
Me メチル基
E t ェチル基
Bu プチル基 P h フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) —カルボキサミド基
T o s p—トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
Cl2-Bzl 2， 6—ジクロロべンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1一 z 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r— Z 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c t—ブトキシカルポニル
DNP ジニトロフエニル
T r t 卜リチル
Bum t一ブトキシメチル
Fmo c N— 9 _フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
H〇〇B t 3， 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシ— 4—ォキソ一
1, 2, 3一べンゾトリアジン
HONB 1 -ヒドロキシ- 5 -ノルポルネン- 2, 3-ジカルポキシィ DCC 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
実施例 1で取得したヒト TCH162タンパク質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するヒト TCH162タンパク質を コードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 1で用いられたプライマー A 3の塩基配列を示す。 〔配列番号： 4〕
実施例 1で用いられたプライマ B 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 1で用いられた SP 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
実施例 1で用いられた T 7の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 1で用いられたプライマー F 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 1で用いられたプライマー F 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
実施例 1で用いられた F 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
実施例 1で用いられた R 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
実施例 1で用いられた R 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
実施例 1で用いられたプライマ一 R 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
実施例 1で用いられたプライマ一 A 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 1で用いられたプライマー B 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕 '
実施例 1で取得したヒ卜 TCH1 62全長遺伝子を含む cDNAの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 16〕
実施例 2で用いられたプライマー TF 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
実施例 2で用いられたプライマ一 TR 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 18〕
実施例 2で用いられた T a Q M a nプローブ T 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
実施例 3で取得したマウス TCH162タンパク質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 20〕
配列番号： 19で表されるアミノ酸配列を有するマウス TCH162タンパク 質をコードする DN Aの塩基配列を示す
〔配列番号： 21〕
実施例 3で用いられたプライマ一 mA 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
実施例 3で用いられたプライマ一 mB 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
実施例 3で用いられたプライマ一 mA 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
実施例 3で用いられたプライマー mB 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
実施例 3で用いられたプライマ一 mT Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕
実施例 3で用いられたプライマ一 mTRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
実施例 3で取得したマウス TCH162全長遺伝子を含む cDNAの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 28〕
実施例 4で用いられた T a Q M a nプローブ mT 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
実施例 6で用いられたプライマー O Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 30〕
実施例 6で用いられたプライマー O Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕 実施例 6で用いられたプライマ一 B GH RVの塩基配列を示す。
〔配列番号： 32〕
実施例 8で用いられたプライマ一 T Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 33〕
実施例 8で用いられたプライマ一 TRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 34〕
実施例 8で用いられた T a q M a nプローブ T 1の塩基配列を示す。 後述の実施例 1で得られた形質転換体 Escherichia coli TOP10/pCR-BluntII- TCH162は、 2003年 7月 24日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番 号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン夕一に寄 託番号 FERM BP- 8434として寄託されている。
後述の実施例 3で得られた形質転換体 Escherichia coli TOP10/pCR-BluntII- D1TCH162は、 2003年 7月 24日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番 号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン夕一に寄 託番号 FERM BP- 8435として寄託されている。 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 本発明はそれに限 定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モリキユラ —クローニング（molecular cloning, 2nd, J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989年）に記載されている方法に従った。
実施例 1
ヒト TCH162遺伝子 cDNAのクロ一ニング
2種のプライマ一 DNA、 プライマー A3 (配列番号： 3) およびプライマー B3 (配 列番号： 4) を用いて、 ヒト脳 cDNA library (宝酒造社製） 、 およびヒト小腸 cDNA library (宝酒造社製) に対して Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造社製) により以下の条件 (1)〜 (3)で PCRを行つた。
(1) 94°C2分間
(2) 98^10秒間-68 30秒間-72 3分間を30サィクル (3)72°C10分間
得られた増幅産物をゲル電気泳動後、 1.5kbpのバンドを切り出し、 Zero Blunt TOPO PCR cloning kit (インビトロジェン社製） を用いてクローニング した。 脳および小腸の各 cDNA libraryに由来するクローンを 1クローンずつ合わ せて 2クローンを得た。 これをプライマ一 DNA 〔プライマー SP6 (配列番号： 5) 、 プライマー T7 (配列番号： 6) 、 プライマー F1 (配列番号： 7) 、 プライマー F2 (配列番号： 8) 、 プライマ一 F3 (配列番号： 9) 、 プライマ一 R1 (配列番号 ： 10) 、 プライマ一 R2 (配列番号： 11) 、 プライマ一 R3 (配列番号： 12) 、 プ ライマ一 A2 (配列番号： 13) およびプライマー B2 (配列番号： 14) 〕 および BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (アプライドバイオシステムズ社製 ) を用いて反応を行い、 揷入されている cDNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ 一 ABI PRISM 3100 DNAアナライザ （アプライドバイオシステムズ社製） を用い て決定した。 その結果、 取得した 2クローンは同一の DNA断片を含んでおり、 1538個の塩基配列を有していた （配列番号： 15) 。 この cDNA断片には 437個のァ ミノ酸配列 （配列番号： 1) がコードされており （配列番号： 2) 、 配列番号： 1 で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をヒト TCH162タンパク質と命名 した。
上記 cDNA断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、 ェシエリヒア ·コリ (Escherichia coli) TOP10/pCR-BluntII- TCH162と命名した。
Blast P (Nucleic Acids Res. 第 25巻、 3389頁、 1997年） を用いて owlに対し てホモロジ一検索を行ったところ、 ヒト TCH162は、 ナトリウム依存性胆汁酸ト ランスポーターファミリーに属する遺伝子であることが判明した （図 1) 。 ヒ ト TCH162は、 ヒトで報告されているナトリゥム依存性胆汁酸トランスポーター である Sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP) (J. CI in. Invest.、 第 93巻、 1326頁、 1994年） とは塩基レベルで 39%、 アミノ酸レベルで 34%の相同性を示した。 ヒト TCH162は、 Genbank Accession No. BC019066のァ ミノ酸配列と同一の配列を有していた。 実施例 2 ヒト TCH162遺伝子産物の組織分布の解析
ヒト TCH162をコードする塩基配列から設計した、 2種のプライマ一 DNA 〔ブラ イマ一 TF2 (配列番号： 16) およびプライマ一 TR2 (配列番号： 17) 〕 および TaqManプローブ T2 (配列番号： 18) を用いて、 ヒトの各組織の cDNA (Human MTC panel Iおよび II、 Human digestive system MTC panel；クロンテック社製 、 Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panel Iおよび V；ノ ィ ォチェーン社製） におけるヒト TCH162の発現量を TaqMan PCRにより測定した。 反応は TaqMan Universal PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製） を用いて、 ABI PRISM 7900 sequence組 detection system (アプライドバイオシ ステムズ社製） にて、 最初 50°C2分間、 さらに 95°C10分間おいた後で、 95°Cで 15 秒、 60°Cで 1分を 1反応サイクルとして 40サイクル繰り返し、 同時に検出を行つ た。 測定に用いたヒトの各組織の cDNAを 〔表 1〕 に示す。
〔表 1〕
cDNA
Human MTC panel I 心臓、 脳、 胎盤、 肺、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 滕臓
Human MTC panel II 脾臓、 胸腺、 前立腺、 精巣、 卵巣、 小腸、 結腸、 末梢血白血球
Human digestive 肝臓、 食道、 胃、 十二二指腸、 空腸、 回腸、 回盲部、 system MTC panel 盲腸、 上行結腸、 横行結腸、 下行結腸、 直腸
Human Adult Digestive I；食道、 胃、 小腸、 結腸
System Normal Tissue V；十二二指 J3易、 空腸、 回腸、 盲腸
cDNA Panel Iおよび V
結果を図 2、 図 3および図 4に示す。 TCH162遺伝子産物 （mRNA) は、 Human MTC panel Iおよび MTC panel IIにおいては、 心臓、 胎盤、 肝臓、 骨格筋、 腎 齓 脾臓、 胸腺、 卵巣、 末梢白血球でわずかな発現が見られ、 前立腺、 精巣、 結腸で若干の発現が見られ、 塍臓、 肺、 脳で強い発現が見られ、 小腸でもっと も強い発現が見られた。 Human digestive system MTC panelにおいては、 胃から直腸まですべての部 位で強い発現が見られ、 回腸、 空腸で特に強い発現が見られた。
Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panel Iおよび V :お ては、 小腸 （空腸、 回腸） 、 盲腸、 結腸において強い発現が見られ、 特に回腸 において最も強い発現が見られた。 実施例 3
マウス TCH162タンパク質をコードする c DNAのクロ一ニング
2種のプライマ一 DNA 〔プライマ一 mA3 (配列番号： 21) およびプライマ一 mB3 (配列番号： 22) 〕 を用いて、 マウス脳 Marathon- Ready cDNA (クロンテック社 製） に対して、 Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造社製） により、 以下の条件 (1)〜（3)で PCRを行った。
(1) 94で2分間
(2) 98°C10秒間一 65°C30秒間一 72°C3.5分間を 30サイクル
(3)72°C10分間
得られた増幅産物を Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit (インビトロジェン社 製） を用いてクロ一エングし、 プラスミド pCR- Bluntll- mTCH162を得た。
これをプライマー DNA 〔プライマ一 SP6 (配列番号： 5) 、 プライマー T7 (配列 番号： 6) 、 プライマー mAl (配列番号： 23) 、 プライマー mBl (配列番号： 24) 、 プライマー mTF (配列番号： 25) およびプライマー mTR (配列番号： 26) 〕 お よび BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (アプライドバイオシステムズ 社製） を用いて反応を行い、 挿入されている cDNA断片の塩基配列を DNAシークェ ンサー ABI PRISM 3100 DNAアナライザ （アプライドバイオシステムズ社製） を 用いて決定した。 その結果、 クローンは 1398個の塩基配列を有していた （配列 番号： 27) 。 この cDNA断片には 437個のアミノ酸配列 （配列番号： 19) がコード されており （配列番号： 20) 、 配列番号： 19で表されるアミノ酸配列を有する タンパク質を、 マウス TCH162タンパク質と命名した。
上記 cDNA断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、 ェシエリヒア コリ (Escherichia coli) T0P10/pCR_BluntII- mTCH162と命名した。 Blast P (Nucleic Acids Res. 第 25巻、 3389頁、 1997年） を用いて owlに対し てホモロジ一検索を行ったところ、 マウス TCH162は、 NTCP (J. Clin. Invest. 、 第 93巻、 1326頁、 1994年） とは塩基レベルで 41%、 アミノ酸レベルで 35%の 相同性を示した。 また、 マウスで報告されている肝臓ナトリウム依存性胆汁酸 トランスポータ一であるマウス NTCP(Genbank： NP— 035517)とは塩基レベル 40% 、 アミノ酸レベルで 33%の相同性を示した。
マウス TCH162は、 ヒト TCH162とは塩基レベルで 81%、 アミノ酸レベルで 86% の相同性を示し、 マウス TCH162がヒト TCH162のマウスオルソログであることが 判明した （図 5) 。 実施例 4
マウス TCH162遺伝子産物の組織分布の解析
マウス TCH162をコードする塩基配列から設計した、 2種のプライマ一 DNA 〔プ ライマー mTF (配列番号： 25) およびプライマ一 mTR (配列番号： 26) 〕 および TaqManプロ一ブ mTl (配列番号： 28) を用いて、 マウスの各組織 （骨髄、 目、 リ ンパ節、 平滑筋、 前立腺、 胸腺、 胃、 子宮、 心臓、 脳、 脾臓、 肺、 肝臓、 骨格 筋、 腎臓、 精巣、 胚 （7日） 、 胚 （11日） 、 胚 （15日） 、 胚 （17日） ） の cDNA ( Mouse MTC panel Iおよび Mouse MTC panel II：クロンテック社製） における マウス TCH162の発現量 （コピー数） を TaqMan PCRにより測定した。 Human Adult Digestive System Normal Tissue cDNA Panel Iおよび Vについては、 TaqMan GAPDH control reagents (アプライドバイオシステムズ社製） を用いて GAPDHの 発現量 （コピー数） も測定した。 反応は TaqMan Universal PCR Master Mix (ァ プライドバイオシステムズ社製) を用いて、 ABI PRISM 7900 sequence detection system (アプライドバイオシステムズ社製） にて、 最初 分間、 さらに 95°C10分間おいた後で、 95 で 15秒、 60°Cで 1分を 1反応サイクルとして 40サイクル繰り返し、 同時に検出を行った。
結果を図 6に示す。
マウス TCH162遺伝子産物 （mRNA) は Mouse MTC panel Iおよび MTC panel IIおいては、 広範な組織で発現が見られたが、 目、 平滑筋、 前立腺で比較的強 い発現が見られ、 胚 （15日） 、 胚 （17日） でさらに強い発現が見られ、 脳、 胚 (1 1日） で最も強い発現が見られた。 実施例 5
マウス TCH162遺伝子産物の 7週齢 BALB/cマウスにおける組織分布の解析
7週齢 BALB/cマウスの各組織 （大脳、 延髄、 海馬、 小脳、 脊髄、 眼球、 前胃、 後胃、 十二指腸、 空回腸、 結腸、 直腸、 盲腸、 肺、 気管、 骨格筋、 心臓、 腎臓 、 滕臓、 肝臓、 脾臓、 胸腺、 精巣、 卵巣、 子宮、 前立腺、 皮膚； 1-10匹分， 卵 巣および子宮以外は雄） より、 RNeasy Mini Ki t (キアゲン社製） を用いて ' to t al RNAを調製した。 調製した to tal RNA に対して TaqMan Revease
Transcr ipt ion Reagents (アプライドバイオシステムズ社製） を用いて逆転写 反応を行い cDNAを調製した。 これについて、 実施例 4で用いたプライマー mTF ( 配列番号： 25) およびプライマ一 mTR (配列番号： 26) および TaqManプローブ mTl (配列番号： 28) を用いて、 マウス TCH162の発現量 （コピー数） を TaqMan PCRにより測定した。 同じ cDNAについて TaqMan Rodent GAPDH Cont rol Reagents VIC Probe (アプライドバイオシステムズ社製） を用いて rodent GAPDHの発現量 (コピー数） も測定した。 反応は TaqMan Universal PCR Mas ter Mix (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて、 ABI PRISM 7900 sequence de tec t ion sys tem (アプライドバイオシステムズ社製） にて、 最初 50 2分間、 さらに 95 10分間おいた後で、 95°Cで 15秒、 60 で 1分を 1反応サイクルとして 40サイクル 繰り返し、 同時に検出を行った。
結果を図 7に示す。
マウス TCH162遺伝子産物 （mRNA) は 7週齢 BALB/cマウスの各組織の消化管系組 織 （前胃、 後胃、 十二指腸、 空回腸、 結腸、 直腸、 盲腸） や大脳で高い発現が 見られ、 延髄、 脊髄で最も高い発現が見られた。 実施例 6
ヒト TCH162発現べクタ一の構築
実施例 1により得られたプラスミド 10ngを铸型として、 プライマ一 0F (配列 番号： 29) およびプライマ一 OR (配列番号： 30) を用いて、 Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造社製） により以下の条件 （1) 〜 （3) で PCRを行った。 5'末 端側プライマ一 OFおよび 3'末端側プライマ一 ORは、 ベクタ一へのクローニング のために 5'末端側にそれぞれ Hind IIIサイトおよび Eco RIサイトを付加するよ うに設計した。
(1) 94°C2分間 '
(2) 98°C 10秒間一 65°C 30秒間一 72 3分間を 30サイクル
(3) 72 :i0分間
上記 PCR反応液をゲル電気泳動後、 主要バンドを精製した。 これにより得られ た PCR断片を、 制限酵素 Hind IIIおよび EcoRIを用いて、 37°Cで 1時間保温するこ とにより消化し、 この反応液をゲル電気泳動後、 精製した。 これを、 動物細胞 発現べクタ一である PCDNA3.1(+) (インビトロジェン社製） の Hind IIIサイトお よび Eco RIサイトに、 Takara ligation kit ver.2 (宝酒造社製）を用いてライ ゲ一シヨンした。 このライゲ一ション反応液をエタノール沈殿処理後、 コンビ —テント細胞である大腸菌 （Escherichia coli) TOP 10 (インビトロジェン社 製） に形質転換した。 これにより得られた複数のコロニーからプラスミドを調 製し、 この塩基配列をプライマ一 DNA 〔プライマー BGH RV (配列番号： 31) 、 プ ライマ一 T7 (配列番号： 6) 、 プライマー F2 (配列番号： 8) 、 プライマ一 R2 ( 配列番号： 11) 、 プライマー A2 (配列番号： 13) およびプライマ一 B2 (配列番 号： 14) 〕 および BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (アプライドバイ ォシステムズ社製） を用いて反応を行い、 塩基配列を DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3100 DNAアナライザ （アプライドバイオシステムズ社製） を用いて確認 した。 このプラスミドを有する形質転換体を、 Escherichia coli
T0P10/pCDNA3.1(+)- TCH162と命名した。 実施例 7
ヒト TCH162発現 CH0細胞株の作製
Escherichia coli T0P10/pCDNA3.1 (+) - TCH162を培養し、 この大腸菌体から EndoFree Plasmid Maxi Kit (キアゲン社製） を用いてプラスミド DNAを調製し た。 このプラスミド DNAを FuGENE 6 Transfection Reagent (ロシュ社製） を用 いて添付のプロトコールに従って CHO dhfr-細胞に導入した。 2 gのプラスミド DNAとトランスフエクシヨン試薬との混合液を 24時間前に 3 X 106個の CHO dhfr一 細胞を播種した直径 6cmシヤーレに添加した。 10%ゥシ胎児血清を含む MEM a培地 で 1日間培養した後、 トリプシン処理により細胞をはがし、 回収した細胞を適 宜希釈して 10cmシャーレに播種した。 さらに 24時間後、 培地に 0.5mg/mlの G418 を添加し、 その後 10日
Figure imgf000085_0001
の6418を含んだ培地中でヒト 11162発現 細胞を選択した。 G418含有選択培地中に増殖してくるモノクローナルなヒト TCH162発現細胞のコロニーを、 96個選択した。 実施例 8
TaqMan PCR法を用いたヒト TCH162発現 CH0細胞株における導入遺伝子発現量の測 定
実施例 7で作製したヒト TCH162発現 CH0細胞株を 48well plateまたは 24wel 1 plateに培養し、 増殖した細胞から RNeasy 96 Kit (キアゲン社製）を用いて total RNAを調製した。 調製した total RNA に対して TaqMan Revease
Transcription Reagents (アプライドバイオシステムズ社製） を用いて逆転写 反応を行い cDNAを調製した。 これについて、 プライマー TF (配列番号： 32) お よびプライマー TR (配列番号： 33) と、 TaqManプロ一ブ T1 (配列番号： 34) と を用いて、 ヒト TCH162の発現量を TaqMan PCRにより測定した。 反応は TaqMan Universal PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製） を用いて、 ABI PRISM 7900 sequence detection system (アプライドバイオシステムズ社製） にて、 最初 50°C2分間、 さらに 95°C10分間おいた後で、 95°Cで 15秒、 60°Cで 1分 を 1反応サイクルとして 40サイクル繰り返し、 同時に検出を行った。 ヒト TCH162 遺伝子高発現細胞株として、 クロ一ン No.35を選択した。 実施例 9
ヒト TCH162遺伝子のデ一夕ベースにおける発現解析
ジーンロジックデータベースを用いて主要な正常脳各部位 （大脳皮質、 側頭 葉、 小脳半球、 海馬、 視床下部、 延髄、 脊髄および黒質） におけるヒト TCH162 の発現を調べた。
結果を図 8に示す。
これより、 ヒト TCH162遺伝子は、 黒質で特異的に発現していることが分かつ た。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質、 ポリヌクレオチドおよび抗体などは、 例えば高脂血症 、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸 炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎など） 、 中枢神経系疾患 （例、 アルツハイマー 病、 パーキンソン症候群、 うつ病、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 滕臓疾患 （例、 塍炎、 塍嚢胞性線維症などの塍機能不全など） 、 呼 吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患 （C O P D) 、 喘息など） 、 甲状腺機能低 下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 (例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺 癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 塍臓癌、 胸腺腫 など） などの診断マーカ一等として有用である。 好ましくは中枢神経系疾患、 特に好ましくはパーキンソン症候群などの診断マーカ一等として有用である。 該タンパク質、 ポリヌクレオチドまたは抗体などを用いるスクリーニング法に より得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物は、 該タンパク 質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物、 該タンパク質の発現を促進また は阻害する化合物などは、 例えば、 高脂血症、 消化器疾患 （例、 過敏性腸症候 群、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 虚血性大腸炎、 胃炎、 消化性潰瘍、 直腸炎な ど） 、 中枢神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 うつ病 、 感情障害、 統合失調症、 不安神経症など） 、 糖尿病、 塍臓疾患 （例、 塍炎、 滕嚢胞性線維症などの腾機能不全など） 、 呼吸器系疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾 患 （C O P D ) 、 喘息など） 、 甲状腺機能低下、 循環器疾患 （例、 心不全、 不 整脈、 Q T延長症候群、 動脈硬化など） 、 癌 （例、 精巣腫瘍、 卵巣癌、 乳癌、 食道癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 子 宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 塍臓癌、 胸腺腫など） などの予防 ·治療剤などと して使用することができる。 好ましくは中枢神経系疾患などの予防 ·治療剤、 特に好ましくはパーキンソン症候群などの予防。治療剤である。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1または配列番号： 1 9で表わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
2 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその 塩。
3 . 配列番号： 1 9で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはそ の塩
4. 請求項 1記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩。
5 . 請求項 1記載の夕ンパク質または請求項 4記載の部分べプチドをコード するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
6 . D N Aである請求項 5記載のポリヌクレオチド。
7 . 配列番号： 2 0または配列番号： 2 7で表わされる塩基配列からなる D NA。
8 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべク夕一。
9 . 請求項 8記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
1 0 . 請求項 9記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質また は請求項 4記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取することを特 徴とする請求項 1記載の夕ンパク質もしくは請求項 4記載の部分べプチドまた はその塩の製造法。
1 1 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分ペプチドまた はその塩を含有してなる医薬。
1 2 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
1 3 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
1 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分ペプチドまた はその塩に対する抗体。
1 5 . 請求項 1 4記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 6 . 請求項 1 4記載の抗体を含有してなる医薬。
1 7 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩 基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド。
1 8 . 請求項 1 7記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
1 9 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする、 請求項 1記載の夕ンパク質もしくは請求 項 4記載の部分べプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また はその塩のスクリーニング方法。
2 0 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の部分ペプチドまた はその塩を含有してなる、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 4記載の 部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリーニング用キット。
2 1 . 請求項 1 9記載のスクリーニング方法または請求項 2 0記載のスクリ —ニング用キットを用いて得られる、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求 項 4記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また はその塩。
2 2 . 請求項 2 1記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
2 3 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 請求項 1記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法。
2 4 . 請求項 5記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 請求項 1記載の夕 ンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一二 ング用キット。
2 5 . 請求項 2 3記載のスクリーニング方法または請求項 2 4記載のスクリ —エング用キットを用いて得られる、 請求項 1記載のタンパク質遺伝子の発現 を促進または阻害する化合物またはその塩。
2 6 . 請求項 2 5記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
2 7 . 請求項 1 4記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載のタン パク質の定量方法。
• 2 8 . 請求項 2 7記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項 1記載の タンパク質の機能が関連する疾患の診断法。
2 9 . 請求項 1 4記載の抗体を用いることを特徴とする、 請求項 1記載の夕 ンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法。
3 0 . 請求項 1 4記載の抗体を含有してなる、 請求項 1記載のタンパク質の 発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
3 1 . 請求項 2 9記載のスクリーニング方法または請求項 3 0記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られる、 請求項 1記載のタンパク質の発現を促進 または阻害する化合物またはその塩。
3 2 . 請求項 3 1記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
3 3 . 中枢神経系疾患の予防，治療剤である、 請求項 1 1、 1 2、 1 6、 1 8、 2 2、 2 6または 3 2記載の医薬。
3 4 . 中枢神経系疾患の診断薬である、 請求項 1 3または請求項 1 5記載の
B多 桌。
3 5 . 哺乳動物に対して、 請求項 2 1、 請求項 2 5または請求項 3 1記載の 化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢神経系疾患の予 防 ·治療方法。
3 6 . 中枢神経系疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 2 1、 請求項 2 5または請求項 3 1記載の化合物またはその塩の使用。
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