ES2708076T3

ES2708076T3 - Peptidoglicanos sintéticos que se unen al ácido hialurónico, preparación y métodos de uso

Info

Publication number: ES2708076T3
Application number: ES17150828T
Authority: ES
Inventors: Shaili Sharma; Alyssa Panitch; Jonathan C Bernhard; John E Paderi
Original assignee: Symic Ip LLC
Current assignee: Symic Ip LLC
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2019-04-08
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: ES2619688T3; IL229539A0; RU2617844C2; US9217016B2; CA2837096A1; SG10201604171WA; CN106117318A; IL229539B; WO2012162534A3; US20140301983A1; EP2714718A4; JP6069307B2; KR102006036B1; RU2013157191A; EP2714718B1; CY1118885T1; US20160222064A1; US20210188915A1; NZ618430A; CN103732614A

Abstract

Un peptidoglicano sintético de unión a ácido hialurónico que comprende al menos un péptido sintético conjugado con un glicano en el que el péptido sintético comprende una secuencia de unión a ácido hialurónico, en el que la secuencia de unión a ácido hialurónico consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: GAHWQFNALTVRGG; GDRRRRRMWHRQ; GKHLGGKHRRSR; RGTHHAQKRRS; RRHKSGHIQGSK; SRMHGRVRGRHE; RRRAGLTAGRPR; RYGGHRTSRKWV; RSARYGHRRGVG; GLRGNRRVFARP;~ SRGQRGRLGKTR; DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR; RMRRKGRVKHWG; RGGARGRHKTGR; TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR; RQRRRDLTRVEG; STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR; RRIGHQVGGRRN; RLESRAAGQRRA; GGPRRHLGRRGH; VSKRGHRRTAHE; RGTRSGSTR; RRRKKIQGRSKR; RKSYGKYQGR; KNGRYSISR; RRRCGQKKK; KQKIKHVVKLK; KLKSQLVKRK; RYPISRPRKR; KVGKSPPVR; KTFGKMKPR; RIKWSRVSK; KRTMRPTRR; y una secuencia de aminoácidos modificada de la misma mediante la inclusión de una sustitución de aminoácidos conservadora, en donde la sustitución de aminoácidos no altera el motivo como se define en: (a) la fórmula B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2, en la que: X1-X8 son aminoácidos no ácidos, X8 está presente o no está presente, y B1-B2 son aminoácidos básicos, (b) la fórmula B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3, en la que: X1-X9 son aminoácidos no ácidos, X9 está presente o no está presente, y B1-B3 son aminoácidos básicos, (c) la fórmula B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3, en la que: X1-X9 son aminoácidos no ácidos, X8 está presente o no está presente, y B1-B3 son aminoácidos básicos, o (d) el motivo Arg-Arg.

Description

DESCRIPCION

Peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico, preparacion y metodos de uso

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica prioridad bajo la 35 U.S.C. § 119(e) de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/489.602 presentada el 24 de mayo del 2011 y la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/550.621 presentada el 24 de octubre del 2011.

Am b ito TECNICO

Esta invencion esta relacionada con el campo de los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico y con los metodos para formar y utilizar dichos compuestos.

ANTECEDENTES Y RESUMEN DE LA INVENCION

El cartflago articular es un componente importante para la proteccion de los huesos del cuerpo. En particular, el cartflago articular actua para evitar que se danen los huesos articulares y proporciona una superficie casi sin friccion para el movimiento oseo, ademas de proporcionar fuerza compresiva a las articulaciones. En lmeas generales, el cardlago articular incluye una matriz extracelular (MEC o ECM, por sus siglas en ingles) derivada a partir de tres componentes principales: un andamio o esqueleto ('scaffold', en ingles) de colageno, acido hialuronico (AH) y agrecano. La composicion de los materiales del cartflago articular determina las propiedades biologicas, qmmicas y mecanicas del tejido. La matriz extracelular (MEC) de un cartflago sano esta compuesta basicamente de una red de pequenas fibras o fibrillas de colageno (colageno de tipo II con un 15-22% en peso humedo), proteoglicanos (4-7% en peso humedo), glicoprotemas, agua (60-85%) y electrolitos, lo que da origen a un tejido viscoelastico con una anisotropfa estructural y mecanica que vana dependiendo de la profundidad.

La degradacion y el deterioro del cartflago es una marca distintiva de la osteoartritis (OA). Durante las etapas iniciales de la osteoartritis (OA), el agrecano, un proteoglicano principal del cartflago, es un componente que se degrada pronto. El monomero de agrecano esta compuesto de un nucleo de protema con cadenas laterales de glicosaminoglicano (GAG) unidas covalentemente y que se enlazan con el acido hialuronico filamentoso mediante dominios globulares y una protema de enlace. Las proteasas, como las agrecanasas, se adhieren al agrecano en sitios espedficos creando fragmentos de protema y cadenas de GAG libres que no pueden unirse de nuevo con el AH. En lugar de eso, estas cadenas de ^gA^glibres se extruden a partir de la matriz, lo cual no solo disminuye la fuerza compresiva, sino que tambien provoca un aumento de las citoquinas pro-inflamatorias y de las metaloproteasas de la matriz. Se ha demostrado que la presencia de agrecano disminuye la difusion de proteasas, protegiendo las fibras de colageno subyacentes de la escision o descomposicion proteolftica. La perdida de agrecano se da incluso en el cartflago normal y no esta relacionada directamente con la OA. Sin embargo, la perdida de colageno de tipo II se considera un proceso irreversible, y provoca un deterioro prematuro.

La osteoartritis es la forma mas comun de artritis, y afecta a 27 millones de personas solo en los Estados Unidos. Los smtomas mas predominantes de la osteoartritis incluyen un gran dolor, un endurecimiento de las articulaciones, y articulaciones fragiles e inflamadas. Las etapas avanzadas de la osteoartritis pueden conllevar la degradacion completa del cartflago articular, causando la inmovilidad de las articulaciones y danando el hueso subyacente. Se estima que los costes directos de la artritis en EE UU son de aproximadamente 185 500 millones de dolares cada ano.

A pesar de que a menudo se provocan cambios en el estilo de vida y se utilizan diversas medicaciones para tratar la osteoartritis, ha habido escaso exito en la regeneracion del cartflago defectuoso y en la paliacion de los smtomas provocados por la perdida de cartflago. Esta falta de capacidad para detener la progresion de la osteoartritis y reparar el dano existente conlleva normalmente un procedimiento invasivo para reemplazar el cartflago en su etapa final. Por ello, existe una gran necesidad de encontrar un tratamiento alternativo para la osteoartritis.

La presente divulgacion describe unos biomateriales mejorados que se utilizan para la regeneracion del cartflago, incluyendo 'peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico', y que se pueden usar para restaurar el cartflago danado de un paciente afectado, junto con metodos para formar y utilizar los peptidoglicanos sinteticos. Ademas, los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico estan disenados para imitar funcionalmente el agrecano, resistir a la degradacion de la agrecanasa y limitar la degradacion proteolftica. La ausencia de la secuencia de aminoacidos nativos que se ha observado en el agrecano hace que estas moleculas sean menos propensas a la escision proteolftica.

La presente invencion se refiere a un peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. Se contemplan los siguientes aspectos numerados:

1. Un peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico que comprende un peptido sintetico conjugado con un glicano en donde el peptido sintetico comprende una secuencia de union a acido hialuronico.

2. El peptidoglicano sintetico de la clausula 1, en el que el peptido sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula B1-X1-X2-X3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

3. El peptidoglicano sintetico de la clausula 1 o la clausula 2 en el que el peptido sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

En cada una de las realizaciones de peptidos anteriores, el peptido puede tener una glicina-cistema (GC) unida al extremo C-terminal del peptido, o una glicina-cistema-glicina (GCG) unida al extremo N-terminal.

4. El peptidoglicano sintetico de cualquiera de las clausulas 1 a 3 en el que el glucano se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

5. El peptidoglicano sintetico de cualquiera de las clausulas 1 a 4, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

6. El peptidoglicano sintetico de cualquiera de las clausulas 1 a 5 en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

7. El peptidoglicano sintetico de cualquiera de las clausulas 1 a 6 en donde el peptidoglicano sintetico esta liofilizado.

8. Un compuesto de formula PnG x en donde n es de 1 a 20;

en donde x es 1 a 20;

en donde P es un peptido sintetico de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoacidos que comprende una secuencia de union a acido hialuronico; y

en donde G es un glicano.

9. Un compuesto de formula (PnL)xG en donde n es de 1 a 20;

en donde x es de 1 a 20;

en donde P es un peptido sintetico de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoacidos que comprende una secuencia de union a acido hialuronico;

en donde L es un conector; y

en donde G es un glicano.

10. Un compuesto de formula P(LGn)x en donde n es de 1 a 20;

en donde x es de 1 a 20;

en donde L es un conector; y

en donde G es un glicano.

11. Un compuesto de formula PnGx en donde n es MWG/1000;

en donde MWG es el peso molecular de G redondeado al 1 kDa mas cercano;

en donde x es de 1 a 20;

en donde G es un glicano.

12. Un compuesto de formula (PnLxG en donde n es MWG/1000;

en donde MWG es el peso molecular de G redondeado al 1 kDa mas cercano;

en donde x es de 1 a 20;

en donde L es un conector; y

en donde G es un glicano.

13. El compuesto de cualquiera de las clausulas 8 a 12, en el que el peptido sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula B1-X1-X2-X3-X4-X6-X7-X8-B2,

en la que X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

14. El compuesto de cualquiera de las clausulas 8 a 13, en el que el peptido sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

15. El compuesto de cualquiera de las clausulas 8 a 14, en el que el glucano se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

16. El compuesto de cualquiera de las clausulas 8 a 15, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

17. El compuesto de cualquiera de las clausulas 8 a 16, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

18. Una matriz de colageno disenada que comprende colageno polimerizado, acido hialuronico, y un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico.

19. La matriz de colageno disenada de la clausula 18, en la que el colageno se selecciona del grupo que consiste de colageno tipo I, colageno tipo II, colageno tipo III, colageno tipo IV, colageno tipo IX, colageno tipo XI y combinaciones de los mismos.

20. La matriz de colageno disenada de acuerdo con la clausula 18 o 19 en la que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de la formula B1-X1-X2-X3-X5-X5-X7-X8-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

21. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 18 a 20, en la que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

22. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 18 a 21, en la que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan, y acido hialuronico.

23. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 18 a 22, en la que el componente de glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

24. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 18 a 23, en la que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

25. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 18 a 24, en la que la matriz es eficaz como un injerto de tejido.

26. La matriz de colageno disenada de acuerdo con la clausula 25 en donde el injerto de tejido se implanta en un paciente.

27. La matriz de colageno disenada de acuerdo con cualquiera de las clausulas 18 a 24, en la que la matriz esta en forma de un gel.

28. La matriz de colageno disenada de acuerdo con la clausula 27, en la que el gel se administra a un paciente mediante inyeccion.

29. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 18 a 24, en donde la matriz es eficaz como una composicion para el cultivo in vitro de celulas.

30. La matriz de colageno disenada de la clausula 29, en donde la matriz comprende ademas una poblacion exogena de celulas.

31. La matriz de colageno disenada de acuerdo con la clausula 30, en la que las celulas se seleccionan del grupo que consiste de condrocitos y celulas madre.

32. La matriz de colageno disenada de acuerdo con la clausula 31, en la que las celulas madre se seleccionan del grupo que consiste de osteoblastos, celulas osteogenicas y celulas madre mesenquimales.

33. La matriz de colageno disenada de acuerdo con cualquiera de las clausulas 18 a 32, que comprende ademas uno o mas nutrientes.

34. La matriz de colageno disenada de acuerdo con cualquiera de las clausulas 18 a 33, que comprende ademas uno o mas factores de crecimiento.

35. La matriz de colageno disenada de acuerdo con cualquiera de las clausulas 18 a 34, en donde la matriz esta esterilizada.

36. Una composicion para el cultivo in vitro de condrocitos o celulas madre que comprende un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico.

37. La composicion de la clausula 36 en la que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula B1-X1-X2-X3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

38. La composicion de la clausula 36 o la clausula 37 en la que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

39. La composicion de cualquiera de las clausulas 36 a 38, en la que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

40. La composicion de cualquiera de las clausulas 36 a 39, en la que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

41. La composicion de cualquiera de las clausulas 36 a 40, en la que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

42. La composicion de cualquiera de las clausulas 36 a 41, en la que las celulas madre se seleccionan del grupo que consiste de osteoblastos, celulas osteogenicas y celulas madre mesenquimales.

43. La composicion de cualquiera de las clausulas 36 a 42, que comprende ademas uno o mas nutrientes. 44. La composicion de cualquiera de las clausulas 36 a 43, que comprende ademas uno o mas factores de crecimiento.

45. La composicion de cualquiera de las clausulas 36 a 44, en la que la composicion esta esterilizada.

46. Un aditivo para un cartflago de biomaterial o una composicion de reemplazo de hueso que comprende un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico para su adiccion a un cartflago de biomaterial existente o material de reemplazo de hueso.

47. El aditivo de la clausula 46, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula B1-X1-X2-X3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

48. El aditivo de la clausula 46 o la clausula 47 en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

49. El aditivo de cualquiera de las clausulas 46 a 48, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

50. El aditivo de cualquiera de las clausulas 46 a 49, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

51. El aditivo de cualquiera de las clausulas 46 a 50, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

52. Un metodo de tratamiento para la artritis en un paciente, dicho metodo comprendiendo el paso de administrar al paciente un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico, en el que el peptidoglicano sintetico reduce un smtoma asociado con la artritis.

53. El metodo de la clausula 52, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula ^b1-X1-X2-^x3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

54. El metodo de la clausula 52 o la clausula 53, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

55. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 54, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

56. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 55, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

57. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 56, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

58. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 57, en el que la artritis es la osteoartritis.

59. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 57, en el que la artritis es artritis reumatoide.

60. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 59, en el que el peptidoglicano sintetico se administra al paciente mediante inyeccion.

61. El metodo de la clausula 60, en el que la inyeccion es una inyeccion intraarticular.

62. El metodo de la clausula 60, en el que la inyeccion es en una capsula articular del paciente.

63. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 62, en el que el peptidoglicano sintetico se administra usando una aguja o un dispositivo para infusion.

64. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 63, en el que el peptidoglicano sintetico actua como un lubricante.

65. El metodo de cualquiera de las clausulas 52 a 64, en el que el peptidoglicano sintetico previene el hueso en la articulacion osea o previene la perdida de cartflago.

66. Un metodo para preparar un biomaterial o reemplazo de cartflago oseo, dicho metodo comprendiendo el paso de combinar el peptidoglicano sintetico y un material existente de biomaterial o de reemplazo de cartflago oseo.

67. El metodo de la clausula 66, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula b 1-X1-X2-x 3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

68. El metodo de la clausula 66 o la clausula 67, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

En cada una de las realizaciones peptfdicas anteriores, el peptido puede tener una glicina-cistema (GC) unida al extremo C-terminal del peptido, o una glicina-cistema-glicina (GCG) unida al extremo N-terminal.

69. El metodo de cualquiera de las clausulas 66 a 68, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

70. El metodo de cualquiera de las clausulas 66 a 69, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

71. El metodo de cualquiera de las clausulas 66 a 70, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

72. Un metodo para reducir o prevenir la degradacion del acido hialuronico en un paciente, dicho metodo comprendiendo administrar al paciente un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico.

73. El metodo de la clausula 72, en el que el componente peptidico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula b 1-X1-X2-x 3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

74. El metodo de la clausula 72 o la clausula 73 en donde el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

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KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

75. El metodo de cualquiera de las clausulas 72 a 74, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

76. El metodo de cualquiera de las clausulas 72 a 75, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

77. El metodo de cualquiera de las clausulas 72 a 76, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

78. El metodo de cualquiera de las clausulas 72 a 77, en el que el peptidoglicano sintetico se administra al paciente mediante inyeccion.

79. El metodo de la clausula 78, en el que la inyeccion es una inyeccion intraarticular.

80. El metodo de la clausula 78, en el que la inyeccion es en una capsula articular del paciente.

81. El metodo de cualquiera de las clausulas 72 a 80, en el que se reduce la velocidad de degradacion del acido hialuronico.

82. Un metodo para corregir o modificar un defecto tisular en un paciente que comprende

administrar en el defecto tisular un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico en el que el defecto se corrige o modifica.

83. El metodo de la clausula 82, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula ^b1-X1-X2-^x3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

84. El metodo de la clausula 82 o la clausula 83 en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

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SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

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RGGARGRHKTGR;

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RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

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GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

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RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

85. El metodo de cualquiera de las clausulas 82 a 84, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

86. El metodo de cualquiera de las clausulas 82 a 85, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

87. El metodo de cualquiera de las clausulas 82 a 86, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

88. El metodo de cualquiera de las clausulas 82 a 87, en el que el peptidoglicano sintetico se administra al paciente mediante inyeccion.

89. El metodo de la clausula 88, en el que la inyeccion es subcutanea.

90. El metodo de cualquiera de las clausulas 82 a 89, en el que el defecto es un defecto cosmetico.

91. Un relleno dermico que comprende un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico.

92. El relleno dermico de la clausula 91, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de la formula B1-X1-X2-X3-X5-X6-X7-X8-X8,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

93. El relleno dermico de la clausula 91 o la clausula 92, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

94. El relleno dermico de cualquiera de las clausulas 91 a 93 que comprende ademas acido hialuronico.

95. Un metodo para reducir o prevenir la degradacion del colageno, comprendiendo dicho metodo los pasos de poner en contacto un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico con acido hialuronico en presencia de colageno, y

reducir o prevenir la degradacion del colageno.

96. El metodo de la clausula 95, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula ^b1-X1-X2-^x3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

97. El metodo de la clausula 95 o la clausula 96, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

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DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

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RQRRRDLTRVEG;

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RRIGHQVGGRRN;

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KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR

98. El metodo de cualquiera de las clausulas 95 a 97, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

99. El metodo de cualquiera de las clausulas 95 a 98, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

100. El metodo de una cualquiera de las clausulas 95 a 99, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

101. El metodo de cualquiera de las clausulas 95 a 100, en el que se reduce la velocidad de degradacion del acido hialuronico.

102. Un metodo para aumentar el tamano de los poros en una matriz de colageno disenada, dicho metodo comprendiendo los pasos de

combinar colageno, acido hialuronico y un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico y aumentar el tamano de los poros en la matriz.

103. El metodo de la clausula 102, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula B1-X1-X2-X3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

104. El metodo de la clausula 102 o la clausula 103, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

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GGPRRHLGRRGH;

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KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

105. El metodo de cualquiera de las clausulas 102 a 104, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

106. El metodo de cualquiera de las clausulas 102 a 105, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

107. El metodo de cualquiera de las clausulas 102 a 106, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

108. El metodo de cualquiera de las clausulas 102 a 107, en el que la matriz esta esterilizada.

109. El metodo de cualquiera de las clausulas 102 a 108, en el que la matriz comprende ademas condrocitos o celulas madre.

110. El metodo de la clausula 109, en el que las celulas madre se seleccionan del grupo que consiste de osteoblastos, celulas osteogenicas y celulas madre mesenquimales.

111. El metodo de una cualquiera de las clausulas 102 a 110, en el que la matriz comprende ademas uno o mas nutrientes.

112. El metodo de cualquiera de las clausulas 102 a 111, en el que la matriz comprende ademas uno o mas factores de crecimiento.

113. Un metodo para reducir o prevenir la degradacion del sulfato de condroitina, dicho metodo comprendiendo los pasos de

poner en contacto un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico con acido hialuronico en presencia de colageno, y

reducir o prevenir la degradacion del sulfato de condroitina.

114. El metodo de la clausula 113 en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de formula B1-X1-X2-X3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

115. El metodo de la clausula 113 o la clausula 114, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

116. El metodo de cualquiera de las clausulas 113 a 115, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

117. El metodo de cualquiera de las clausulas 113 a 116, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de condroitina y sulfato de queratan.

118. El metodo de cualquiera de las clausulas 113 a 117, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

119. El metodo de cualquiera de las clausulas 113 a 118 en el que se reduce la velocidad de degradacion del sulfato de condroitina.

120. El peptidoglicano sintetico, el compuesto, la matriz de colageno disenada, la composicion, el aditivo, el metodo o el relleno dermico de cualquiera de las clausulas anteriores en donde el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico tiene una glicina-cistema (GC) unida al extremo C-terminal del peptido.

121. El peptidoglicano sintetico, el compuesto, la matriz de colageno disenada, la composicion, el aditivo, el metodo o el relleno dermico de cualquiera de las clausulas anteriores en donde el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico tiene una glicina-cistema-glicina (GCG) unida al extremo N-terminal del peptido.

122. El peptidoglicano sintetico, el compuesto, la matriz de colageno disenada, la composicion, el aditivo, el metodo o el relleno dermico de cualquiera de las clausulas anteriores en donde el peptidoglicano sintetico es resistente a las metaloproteasas de la matriz.

123. El peptidoglicano sintetico, el compuesto, la matriz de colageno disenada, la composicion, el aditivo, el metodo o el relleno dermico de la clausula 122, en donde la metaloproteasa de la matriz es aggrecanasa.

124. El peptidoglicano sintetico, el compuesto, la matriz de colageno disenada, la composicion, el aditivo, el metodo o el relleno dermico de cualquiera de las clausulas anteriores en donde la dosis del peptidoglicano sintetico esta en una concentracion que vana de aproximadamente 0,01 uM a aproximadamente 100 uM.

125. El peptidoglicano sintetico, el compuesto, la matriz de colageno disenada, la composicion, el aditivo, el metodo o el relleno dermico de cualquiera de las clausulas anteriores, en donde la dosis del peptidoglicano sintetico esta en una concentracion que vana de aproximadamente 0,1 uM a aproximadamente 10 uM.

BREVE DESCRIPCION DE LAS ILUSTRACIONES

La FIGURA 1 muestra un esquema de reaccion para la produccion de una realizacion del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. Los pasos de la reaccion se detallan en negrita.

La FIGURA 2 muestra una curva o desviacion estandar de la absorbancia (215 nm) de la sal de acido trifluoroacetico de N-[p- Acido maleimidopropionico] hidracido (de aqrn en adelante, 'BMPH'), basada en la cantidad (mg) de BMPH inyectada. La curva estandar se uso para determinar la cantidad de BMPH consumida durante la reaccion de union o acoplamiento.

La FIGURA 3 muestra la union del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico con el acido hialuronico (AH) inmovilizado. Nueve 'peptidos que se unen al AH' (por ejemplo, GAHWQFNALTVRGGGC; de aqrn en adelante 'GAH' o 'mAGC') se unieron con el esqueleto o estructura central ('backbone', en ingles) del glicosaminoglicano funcionalizado (por ejemplo, sulfato de condroitina, de aqrn en adelante 'CS'). Las concentraciones de los peptidoglicanos sinteticos se incrementaron de 0,01 pM a 100 pM.

La FIGURA 4 muestra el enlace del peptidoglicano sintetico con el AH, tal y como se determina mediante barrido de frecuencia reologico (cuadro o panel A). El modulo de almacenamiento de las mezclas de AH se analizo a una frecuencia de oscilacion de 5,012 Hz. A esta frecuencia, se suministro una carga significativa al mismo tiempo que se conservo la integridad de las cadenas de AH. El analisis estadfstico (a=0,05) mostro que AH+CS y AH eran significativamente diferentes (se indica con *) y que AH+ 10,5GAH-CS y AH+CS eran significativamente diferentes (se indica con **). El cuadro B es una representacion alternativa de los mismos datos que se muestran en el cuadro A.

La FIGURA 5 muestra la clasificacion de la turbiedad del colageno de tipo I mas los grupos de tratamiento durante la formacion de las fibrillas de colageno. La absorbancia a 313 nm se midio cada 3 minutos. Despues de una hora (esto es, punto de tiempo o referencia temporal 20) todos los grupos de tratamiento habfan creado redes por completo. No hubo diferencias significativas (a=0,05) entre los grupos de tratamiento con respecto a la absorbancia maxima o el tiempo hasta la mitad de la absorbancia maxima.

La FIGURA 6 muestra la tension de ingeniena compresiva que resistieron los geles de colageno, basandose en la aplicacion de una deformacion de ingeniena de 1% por segundo. El analisis estadfstico (a=0,05) demostro que la adicion de 10.5GAH-CS daba como resultado una diferencia significativa en el pico maximo de la tension de ingeniena ('engineering stress', en ingles); ademas, se analizo la tension de ingeniena con una deformacion de ingeniena ('engineering strain', en ingles) de 5%, 7,5% y 10%.

La FIGURA 7 muestra el modulo de almacenamiento de las mezclas de colageno medido a una frecuencia oscilatoria de 0,5012 Hz. El analisis estadfstico (a=0,05) demostro que la adicion de 10.5GAH-CS daba como resultado un aumento significativo del modulo de almacenamiento del gel de colageno (se indica con *).

La FIGURA 8 muestra el porcentaje de degradacion de las mezclas de AH debido a la adicion de hialuronidasa a las mezclas (cuadro A). El porcentaje de degradacion se determino mediante los cambios en la viscosidad dinamica de las mezclas de AH. Inicialmente, las mediciones de viscosidad dinamica se tomaron a partir de las mezclas, y sirvieron como el punto de referencia a partir del cual se calcularon los porcentajes de degradacion. El punto de tiempo de 0 horas se tomo despues de anadir la hialuronidasa, de dejar que las muestras se mezclaran lo suficiente y se 'pipetearan' o vertieran en el reometro, y pasaron aproximadamente 2 minutos entre la adicion de la hialuronidasa y la medicion de la viscosidad dinamica. El analisis estadfstico mostro diferencias significativas (a=0,05) en el porcentaje de degradacion de la muestra de 10.5GAH-CS, tanto en el punto de tiempo de 0 horas como en el de 2 horas. El cuadro B muestra los mismos datos representados como la viscosidad dinamica normalizada (promedio ± SE, N=3) de las mezclas de AH debido a la adicion de hialuronidasa. Inicialmente, las mediciones de viscosidad dinamica se tomaron de las mezclas antes de anadir hialuronidasa, y estos valores sirvieron como el punto de referencia a partir del cual se calcularon las viscosidades dinamicas normalizadas. Las viscosidades dinamicas normalizadas se determinaron tomando cada viscosidad dinamica medida despues de anadir hialuronidasa y dividiendo este valor por la viscosidad dinamica inicial de esa muestra. Se realizo un analisis estadfstico (a=0,05) y se observaron diferencias significativas en la degradacion normalizada de la muestra de 10.5GAH-CS tanto en el punto de tiempo de 0 horas como en el de 2 horas.

La FIGURA 9 muestra imagenes representativas de cryo-SEM (un aumento de 10000x con una barra de escala de 5 pm) del andamio de CI asociado con cada replica de la ECM de cartflago. El cuadro A representa el control de CI. El cuadro B representa CI+AH+CS. El cuadro C representa CI+AH+10.5GAH-CS.

La FIGURA l0 muestra el porcentaje de degradacion (promedio ± SE, N=3) de CI en replicas de ECM expuestas a MMP-I durante un periodo de duracion de 50 horas. El analisis estadfstico (p<0.05) de los diferentes tratamientos mostro que los tres tratamientos (Control de CI, CI+AH+CS y CI+AH+10.5GAH-CS) eran sustancialmente diferentes unos de otros.

La FIGURA 11 muestra la perdida acumulada de sulfato de condroitina (CS) durante un periodo de cultivo de 8 dfas en un medio estimulado con y sin IL-1p. La perdida de CS se midio con un ensayo de DMMB. La adicion de mAGC tuvo un efecto significativo en la perdida de CS por parte de los andamios (p<0,001). ** denota una importancia o significacion estadfstica entre los andamios preparados sin una copia o reproduccion de agrecano y los preparados con mAGC. denota una importancia estadfstica entre los andamios tratados con y sin IL-1p (p<0,05). Las barras representan el promedio ± SEM (n=3).

La FIGURA 12 muestra la descomposicion de colageno acumulada durante un periodo de cultivo de ocho dfas en un medio estimulado con y sin IL-1p. La descomposicion del colageno se midio mediante un ensayo o analisis de Sircol. La adicion de una reproduccion de agrecano tuvo un efecto significativo en la perdida de colageno por parte de los andamios (p<0,02). ** denota una importancia estadfstica entre los andamios preparados sin una reproduccion de agrecano y los preparados con mAGC. denota una importancia estadfstica entre los andamios tratados con y sin IL-1p (p<0,05). Las barras representan el promedio ± SEM (n=3).

La FIGURA 13 representa una plataforma para estudiar la eficacia del peptidoglicano 'ex vivo'. Se uso un 0,5% de tripsina para eliminar el agrecano nativo (o natural) de los explantes de cartflago bovino. La eliminacion del agrecano se confirmo mediante un ensayo de DMMB. Los graficos representan la cantidad de agrecano eliminada en comparacion con el control positivo.

La FIGURA 14 muestra un ensayo para monitorizar la difusion de peptidoglicano a traves de la matriz de cartflago. El eje Y representa la diferencia de los valores de absorbancia del ensayo de DMMB; esta diferencia se lee u obtiene mediante tapones de cartflago desprovistos de agrecano y que se han tratado con o sin peptidoglicano. El eje X representa la distancia desde la superficie de articulacion del cartflago hasta el hueso subcondral. Las barras representan la diferencia promedio ± SEM (n=3).

La FIGURA 15 muestra tinciones de Safranina O y Avidina-Biotina de explantes de cartflago bovino. Se realizo un corte medio sagital a traves de la matriz y se busco agrecano residual (cuadro superior, tincion oscura) y biotina (cuadro inferior, tincion oscura), respectivamente. El peptidoglicano que se une al colageno de tipo II [WYRGRLGC; "mAG(II)C"] se dfundio a traves del explante. Un mayor aumento (20X) de este corte de tejido mostro que el mAG(II)C penetra aproximadamente 200 um en el tejido.

La FIGURA 16 muestra tinciones de Avidina-Biotina de explantes de cartflago. Se difundieron peptidoglicanos (mAG(II)C y mAGC) a traves del explante de cartflago. Las imagenes indican la profundidad de penetracion de cada uno (tincion oscura).

La FIGURA 17 muestra que la adicion de peptidoglicanos a los explantes desprovistos de agrecano (AD, por sus siglas en ingles) aumento la rigidez de compresion. La adicion del peptidoglicano que se une al AH (mAGC) restauro de manera significativa la rigidez de los explantes de cartflago, en mayor medida que si se compara con el peptidoglicano que se une con el colageno de tipo II (mAG(II)C). La importancia, denotada como *, especifico un aumento de la rigidez de compresion entre los explantes aumentados con AD y AD+mAGC (p<0,005). Los datos se muestran como promedio ± s Em (n=5).

La FIGURA 18 (A) muestra una representacion esquematica de la sonda de MMP-13. BHQ-3 ('Black hole quencher 3', en ingles) y CY5.5 absorbfan y emitfan a 695 nm, respectivamente. Las flechas y las cursivas indican el sitio de escision. (B) muestra el perfil de concentracion de la actividad de la sonda con y sin MMP-13. A la izquierda, partes de biomarcadores de fluorescencia de una microplaca de 96 pocillos; a la derecha, recuperacion de la intensidad de la emision de fluorescencia (695 nm).

La FIGURA 19 muestra el nivel de inflamacion indicado por la sonda MMP-13 en ratas Sprague-Dawley tratadas con y sin peptidoglicano cuatro, seis y ocho semanas despues de la cirugfa.

La FIGURA 20 muestra una imagen de rayos X de las articulaciones de una rata Sprague-Dawley que muestra la rodilla lesionada 6 semanas y 8 semanas despues de una induccion de OA (cuadros A y D, respectivamente), la rodilla lesionada con un tratamiento de peptidoglicano (cuadros B y E, respectivamente), y una rodilla normal (cuadro C) seis semanas despues de una cirugfa de induccion de osteoartritis.

La FIGURA 21 muestra un microCT de ratas Sprague-Dawley que indica el recrecimiento o regeneracion de cartflago nuevo seis y ocho semanas despues de la cirugfa de induccion de osteoartritis. Las rodillas lesionadas 6 semanas y 8 semanas despues de una induccion de OA se muestran en los cuadros A y D, respectivamente. Las rodillas lesionadas tras un tratamiento de peptidoglicano se muestran en los cuadros B y E, respectivamente. La rodilla normal se muestra en el cuadro C.

La FIGURA 22 muestra que la adicion de mAGC a los andamios de colageno incremento los modulos de almacenamiento y la rigidez de compresion. Los barridos de frecuencia (A) sobre los andamios de colageno indicaron un aumento en el modulo de almacenamiento en un rango de 0,1-2,0 Hz. De manera similar, la rigidez de compresion (B) mostro un aumento de los valores cuando el andamio se preparo con la adicion de mAGC. La importancia o significacion se denota como * (p<0,0001). Los datos se muestran como promedio ± SEM (n=5). La FIGURA 23 muestra la perdida acumulada de sulfato de condroitina (CS) durante un periodo de cultivo de ocho dfas en un medio estimulado con y sin IL-1p. La perdida de CS se midio mediante un ensayo de DMMB. Las composiciones de los andamios (A-H) se describen en el cuadro 3. La adicion de mAGC tuvo un efecto significativo en la perdida de CS por parte de los andamios (p<0,001). * denota la significacion estadfstica entre el andamio A y el C, y entre el andamio E y el G (p<0,05). Las barras representan promedio ± SEM (n=3).

La FIGURA 24 muestra la descomposicion acumulada de colageno durante un periodo de cultivo de ocho dfas en un medio estimulado con y sin IL-1p. La descomposicion del colageno se midio mediante un ensayo de Sircol. Las composiciones de los andamios (A-H) se describen en el cuadro 3. La adicion de una replica de agrecano tuvo un efecto significativo en la perdida de colageno por parte de los andamios (p<0,02). * denota una significacion estadfstica entre los andamios A y C, y los andamios E y G (p<0,05). Las barras representan promedio ± SEM (n=3). La FIGURA 25 muestra un analisis de PCR en tiempo real del agrecano y el colageno de tipo II expresados por condrocitos bovinos cultivados en andamios de colageno no alineados (A) y alineados (B). Los valores se normalizaron a una expresion de GAPDH endogeno. La adicion de mAGC altero estadfsticamente la expresion de agrecano y colageno de tipo II (p^agrecano<0,02 y p^colageno<0,001 respectivamente). Tambien hubo una diferencia estadfstica en la expresion de agrecano y colageno de tipo II entre los andamios no alineados y alineados (p<0,001). De manera similar, la expresion de agrecano y colageno de tipo II fue diferente entre los andamios tratados con y sin IL-1p (p<0,01). Las composiciones de los andamios (A-H) se describen en el cuadro 3. Las barras representan promedio ± SEM (n=4).

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

Tal y como se utiliza en el presente texto, un 'peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico' hace referencia a un peptido sintetico conjugado con un glicano, en el que el peptido comprende una secuencia que se une al acido hialuronico.

En el presente texto se describen diversas realizaciones de la divulgacion. En una de las realizaciones descritas en el presente texto, se proporciona un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. El peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico comprende un peptido sintetico conjugado con un glicano, de manera que el peptido sintetico comprende una 'secuencia que se une al acido hialuronico'.

En otra realizacion, se describe un compuesto cuya formula es PⁿG^xy en el que n es de 1 a 20; en el que x es de 1 a 20; en el que P es un peptido sintetico de entre alrededor de 5 y alrededor de 40 aminoacidos que comprende una secuencia que se une al acido hialuronico; y en el que G es un glicano.

En otra realizacion, se describe un compuesto cuya formula es (PⁿL) ^xG

en el que n es de 1 a 20;

en el que x es de 1 a 20;

en el que P es un peptido sintetico de entre alrededor de 5 y alrededor de 40 aminoacidos que comprende una secuencia que se une al acido hialuronico;

en el que L es un conector o conector ('linker', en ingles);

y en el que G es un glicano.

En otra realizacion, se describe un compuesto cuya formula es P(LGⁿ)^x

en el que n es de 1 a 20;

en el que x es de 1 a 20;

en el que L es un conector;

y en el que G es un glicano.

En otra realizacion, se describe un compuesto cuya formula es PnGx

en el que n es MWG/1000;

en el que MWG es el peso molecular de G redondeado hasta el 1 kDa mas cercano;

en el que x es de 1 a 20;

y en el que G es un glicano.

En otra realizacion, se describe un compuesto cuya formula es (PnL)xG

en el que n es MWG/1000;

en el que MWG es el peso molecular de G redondeado hasta el 1 kDa mas cercano;

en el que x es de 1 a 20;

en el que L es un conector;

y en el que G es un glicano.

Para el proposito de la presente invencion, los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico y los compuestos descritos en los parrafos precedentes se denominaran colectivamente como 'peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico' o 'peptidoglicanos sinteticos'.

En cada una de las realizaciones previas sobre peptidos, el peptidoglicano sintetico puede contener 5-15 moleculas peptfdicas (n es 5-15), 5-20 moleculas peptfdicas (n es 5-20), 1-20 moleculas peptfdicas (n es 1-20), o 1-25 moleculas peptfdicas (n es 1-25). En una realizacion, n se selecciona de un grupo que consta de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 25 moleculas peptfdicas.

En otra realizacion ilustrativa descrita en el presente texto, se proporciona una matriz de colageno obtenida por ingeniena. La matriz comprende colageno polimerizado, acido hialuronico y un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. En otra realizacion, se proporciona una composicion para el cultivo 'in vitro' de condrocitos o celulas madre. La composicion comprende cualquiera de los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico descritos en la presente divulgacion.

En otra realizacion descrita en el presente texto, se proporciona un metodo para aumentar el tamano de los poros de una matriz de colageno obtenida por ingeniena. El metodo comprende los pasos de combinar el colageno, el acido hialuronico y el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico, y de aumentar el tamano de los poros de la matriz.

En otra realizacion ilustrativa, se proporciona un metodo para disminuir el deterioro o la erosion del cartflago de un paciente. El peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede usarse en un metodo para disminuir el deterioro o la erosion del cartflago. En una realizacion, la erosion o el deterioro del cartflago pueden estar causados por la artritis. En una realizacion, la erosion o el deterioro del cartflago pueden estar causados por el envejecimiento, la obesidad, un trauma o una lesion, una anormalidad anatomica, enfermedades geneticas, desequilibrios metabolicos, inflamaciones o similares.

En otra realizacion ilustrativa, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede usarse en un metodo para tratar la artritis de un paciente. El peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede usarse en dicho metodo, de manera que el peptidoglicano sintetico reduce o alivia los smtomas asociados con la artritis.

En otra realizacion ilustrativa, se proporciona un metodo para reducir o evitar la degradacion del acido hialuronico en un paciente. El metodo incluye administrar al paciente un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico.

En otra realizacion ilustrativa, se proporciona un metodo para reducir o evitar la degradacion del colageno. El metodo comprende los pasos de poner en contacto un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico con acido hialuronico en presencia de colageno, y de reducir o evitar la degradacion del colageno.

En otra realizacion ilustrativa, se proporciona un metodo para corregir o modificar un defecto en el tejido de un paciente. El metodo incluye administrar al tejido defectuoso un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico de manera que el defecto se corrija o modifique. En otra realizacion ilustrativa descrita en el presente texto, se proporciona un relleno dermico. El relleno comprende un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. En una realizacion, el relleno ademas contiene acido hialuronico.

En otra realizacion, se proporciona un aditivo para una composicion de biomaterial para el recambio del cartflago o del hueso. El aditivo comprende un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico para anadirlo a un material de sustitucion de cartflago o hueso de biomaterial ya existente. En otra realizacion descrita en el presente documento, se proporciona un metodo para preparar un biomaterial o reemplazo de cartflago oseo . El metodo comprende el paso de combinar el peptidoglicano sintetico y un biomaterial existente o material de reemplazo de cartflago oseo.

En las diversas realizaciones, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos cuya formula es B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,

en la que X8 esta presente o no esta presente,

en la que B1 es un aminoacido basico,

en la que B2 es un aminoacido basico, y

en la que X1-X8 son aminoacidos no acidos.

En otra realizacion, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico puede contener o puede ser una secuencia de aminoacidos cuya formula es B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3,

en la que X9 esta presente o no esta presente,

en la que B1 es un aminoacido basico,

en la que B2 es un aminoacido basico,

en la que B3 es un aminoacido basico, y

en la que X1-X9 son aminoacidos no acidos.

En otra realizacion, el peptido sintetico puede contener o puede ser una secuencia de aminoacidos cuya formula es B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3,

en la que X8 esta presente o no esta presente,

en la que B1 es un aminoacido basico,

en la que B2 es un aminoacido basico,

en la que B3 es un aminoacido basico, y

en la que X1-X9 son aminoacidos no acidos.

Tal y como se utiliza en el presente texto, un 'aminoacido basico' se selecciona de un grupo que contiene lisina, arginina o histidina. Tal y como se utiliza en el presente texto, un 'aminoacido no acido' se selecciona de un grupo que se compone de alanina, arginina, asparagina, cistema, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina.

En las diversas realizaciones ilustrativas descritas en el presente texto, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico puede contener una secuencia de aminoacidos seleccionada de un grupo que comprende los siguientes compuestos:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

En cada una de las realizaciones peptidicas previas, el peptido puede tener una glicina-cistema unida al extremo C-terminal del peptido, y/o una glicina-cistema-glicina (CGC) unida al extremo N-terminal del peptido. En diversas realizaciones descritas en el presente texto, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico contiene cualquier secuencia de aminoacidos descrita en el parrafo anterior o una secuencia de aminoacidos con un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 100% de homologfa con cualquiera de estas secuencias de aminoacidos.

Los peptidos adicionales que pueden incluirse como componente peptfdico de los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico incluyen los peptidos descritos en Amemiya et al., Biochem. Biophys. Acta, vol. 1724, pags. 94-99 (2005). Estos peptidos tienen un motivo de Arg-Arg e incluyen peptidos seleccionados de un grupo que se compone de:

RRASRSRGQVGL;

GRGTHHAQKRRS;

QPVRRLGTPVVG;

ARRAEGKTRMLQ;

PKVRGRRHQASG;

SDRHRRRREADG;

NQRVRRVKHPPG;

RERRERHAVARHGPGLERDARNLARR;

TVRPGGKRGGQVGPPAGVLHGRRARS;

NVRSRRGHRMNS;

DRRRGRTRNIGN;

KTAGHGRRWSRN;

AKRGEGRREWPR;

GGDRRKAHKLQA;

RRGGRKWGSFEG; y

RQRRRDLTRVEG.

En cada una de las realizaciones peptfdicas previas, el peptido puede tener una glicina-cistema unida al extremo C-terminal del peptido. En cada una de las realizaciones peptfdicas previas, el peptido puede tener una glicina-cistemaglicina (CGC) unida al extremo N-terminal del peptido. En diversas realizaciones descritas en el presente texto, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico contiene cualquier secuencia de aminoacidos descrita en el parrafo anterior o una secuencia de aminoacidos con un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 100% de homologfa con cualquiera de estas secuencias de aminoacidos.

En otras realizaciones, los peptidos descritos en Yang et al., EMBO Journal, vol. 13, pags. 286-296 (1994) y Goetinck et al., J. Cell. Biol., vol. 105, pags. 2403-2408 (1987) pueden usarse en los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico descritos en el presente texto, incluyendo los peptidos seleccionados del grupo que comprende RDGTRYVQKGEYR, HREARSGKYK, PDKKHKLYGV y WDKERSRYDV. En cada una de estas realizaciones, el peptido puede tener una glicina-cistema unida al extremo C-terminal del peptido. En cada una de estas realizaciones, el peptido puede tener una glicina-cistema-glicina (GCG) unida al extremo N-terminal del peptido. En otras realizaciones, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico contiene una secuencia de aminoacidos con un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 100% de homologfa con cualquiera de estas secuencias de aminoacidos.

En diversas realizaciones, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico descrito en el presente texto puede modificarse mediante la inclusion de una o mas sustituciones conservadoras de aminoacidos. Como es bien sabido para aquellos versados en la materia, alterar cualquier aminoacido no cntico de un peptido mediante una sustitucion conservadora no debena alterar de manera significativa la actividad de dicho peptido, pues la cadena lateral del aminoacido de recambio debena ser capaz de formar vmculos y contactos similares a los de la cadena lateral del aminoacido que ha sido sustituido. Son posibles las sustituciones conservadoras siempre y cuando estas no afecten de manera excesiva a la actividad de union con el acido hialuronico del peptido.

Como es bien sabido en este campo, una 'sustitucion conservadora' de un aminoacido o una 'variante o variacion de una sustitucion conservadora' de un peptido hacen referencia a una sustitucion de un aminoacido que conserva: 1) la estructura secundaria del peptido; 2) la carga o hidrofobia del aminoacido; y 3) el volumen de la cadena lateral o una o mas de estas caractensticas. A tftulo ilustrativo, los conocidos terminos 'residuos hidrofflicos' estan relacionados con la serina o la treonina. 'Residuos hidrofobicos' hacen referencia a la leucina, la isoleucina, la fenilalanina, la valina o la alanina, o similares. 'Residuos cargados positivamente' hacen referencia a la lisina, la arginina, la ornitina o la histidina. 'Residuos cargados negativamente' hacen referencia al acido aspartico o al acido glutamico. Los residuos que tienen 'cadenas laterales voluminosas' hacen referencia a la fenilalanina, el triptofano o la tirosina, o similares. En la TABLA 1 se ofrece una lista ilustrativa de las sustituciones de aminoacidos conservadoras:

TABLA 1

En una realizacion, las sustituciones de aminoacidos conservadoras que se pueden aplicar a las moleculas descritas en el presente texto no alteran los motivos que tienen una formula de B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2, una formula de B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3, una formula de B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3 o un motivo de Arg-Arg.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, el componente glicano (por ejemplo, glicosaminoglicano, abreviado como GAG, o polisacarido) del peptidoglicano sintetico descrito en este texto puede seleccionarse de un grupo que comprende dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, dermatan sulfato, heparan, heparina, queratina, queratan sulfato y acido hialuronico. En una realizacion, el glicano se selecciona de un grupo que se compone de sulfato de condroitina y queratan sulfato. En otra realizacion ilustrativa, el glicano es sulfato de condroitina.

En una realizacion descrita en el presente texto, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico comprende (GAHWQFNALTVRGG)10 conjugado con sulfato de condroitina de manera que cada peptido en la molecula de peptidoglicano esta unido de manera separada con el sulfato de condroitina. En otra realizacion descrita en el presente texto, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico comprende (GAHWQFNALTVRGGGC)11 conjugado con sulfato de condroitina de manera que cada peptido en la molecula de peptidoglicano esta unido de manera separada con el sulfato de condroitina. En cada una de las realizaciones peptfdicas previas, el numero de peptidos puede seleccionarse de un grupo que se compone de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 25 moleculas peptfdicas.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa. En este campo, la agrecanasa se caracteriza por ser cualquier enzima que escinde o descompone el agrecano.

En un aspecto ilustrativo, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede esterilizarse. Tal y como se utilizan en el presente texto, 'esterilizacion', 'esterilizar' o 'esterilizado/a' significan desinfectar los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico eliminando los contaminantes no deseados, incluyendo -pero sin limitarse a- las endotoxinas y los agentes infecciosos.

En diversas realizaciones, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede desinfectarse y/o esterilizarse usando tecnicas convencionales de esterilizacion, incluyendo un tratamiento con oxido de propileno u oxido de etileno, esterilizacion con plasma de gas, radiacion gamma (por ejemplo, irradiacion gamma de 1-4 Mrads o irradiacion gamma de 1-2,5 Mrads), un haz de electrones, y/o esterilizacion con un peracido, como el acido peracetico. Pueden usarse tecnicas de esterilizacion que no afecten de manera adversa a la estructura y las propiedades biotropicas del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. En una realizacion, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede someterse a uno o mas procesos de esterilizacion. En otra realizacion ilustrativa, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se somete a una filtracion esterilizada. El peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede envolverse en cualquier tipo de envase, incluyendo un envoltorio de plastico o un envoltorio de papel de aluminio, y ademas puede esterilizarse. El peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede prepararse en condiciones esterilizadas, por ejemplo, mediante liofilizacion, algo que puede lograrse con facilidad usando las tecnicas estandares que son bien conocidas para aquellos versados en la materia.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico pueden combinarse con minerales, aminoacidos, azucares, peptidos, protemas, vitaminas (como acido ascorbico), o laminina, colageno, fibronectina, acido hialuronico, fibrina, elastina, o agrecano, o factores de crecimiento como factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento transformante beta, factor de crecimiento de fibroblastos, y glucocorticoides como dexametasona o agentes de alteracion viscoelasticos, como polfmeros solubles en agua ionicos y no ionicos; polfmeros de acido acnlico; polfmeros hidrofflicos como oxidos de polietileno, copolfmeros de polioxietileno-polioxipropileno, y polivinilalcohol; polfmeros celulosicos y derivados de polfmeros celulosicos como celulosa de hidroxipropilo, celulosa de hidroxietilo, metilcelulosa de hidroxipropilo, ftalato de metilcelulosa de hidroxipropilo, metilcelulosa, celulosa de carboximetilo, y celulosa eterificada; acido polilactico, acido poliglicolico, copolfmeros de acido lactico y glicolico, u otros agentes polimericos, tanto naturales como sinteticos.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico se sintetiza de acuerdo con protocolos de smtesis de peptidos en fase solida que son conocidos para aquellas personas versadas en la materia. En una realizacion, un precursor peptfdico se sintetiza en un soporte solido de acuerdo con el conocido protocolo Fmoc, se escinde del soporte con acido trifluoroacetico y se purifica mediante cromatograffa siguiendo metodos conocidos para las personas versadas en la materia.

[0043] En varias realizaciones descritas en el presente texto, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico se sintetiza utilizando metodos de biotecnologfa que son bien conocidos por las personas versadas en la materia. En una realizacion, una secuencia de ADN que codifica la informacion de la secuencia de aminoacidos para el peptido deseado se liga mediante tecnicas de ADN recombinante -que son conocidas por las personas versadas en la materia- con un plasmido de expresion (por ejemplo, un plasmido que incorpora una etiqueta de afinidad para la purificacion por afinidad del peptido), el plasmido se transfecta a un organismo huesped para su expresion, y entonces el peptido se afsla del organismo huesped o el medio de crecimiento siguiendo metodos conocidos por las personas versadas en la materia (por ejemplo, mediante purificacion por afinidad). Los metodos con tecnologfa de ADN recombinante se describen en Sambrook et al., 'Molecular Cloning: A Laboratory Manual', 3a Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), y son bien conocidos por los expertos en la materia.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se conjuga con un glicano haciendo reaccionar un grupo amino libre del peptido con una funcion de aldehfdo del glicano en presencia de un agente reductor, utilizando metodos conocidos por las personas versadas en la materia, para producir el conjugado de peptidoglicano. En una realizacion, se forma una funcion de aldehfdo del glicano (por ejemplo, polisacarido o glicosaminoglicano) haciendo reaccionar el glicano con metaperyodato de sodio siguiendo metodos conocidos por las personas versadas en la materia.

En una realizacion, el componente peptidico del peptidoglicano sintetico se conjuga con un glicano haciendo reaccionar una funcion de aldehndo del glicano con 3-(2-piridilditio)propionil hidracido (PDPH) para formar un glicano intermedio y, despues, se hace reaccionar el glicano intermedio con un peptido que contiene un grupo tiol libre para obtener el conjugado de peptidoglicano. En otra realizacion, la secuencia del componente peptidico del peptidoglicano sintetico puede modificarse para incluir un segmento de glicina-cistema para proporcionar un punto de union para un glicano o un conjugado con un conector de glicano. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente texto, el reticulante ('crosslinker', en ingles) puede ser N-[p-acido maleimidopropionico]hidracido (BMPH).

A pesar de que en los parrafos precedentes se han descrito realizaciones espedficas, los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico que se describen en el presente texto pueden obtenerse utilizando cualquier metodo reconocido en este campo para la conjugacion de un peptido y un glicano (por ejemplo, polisacarido o glicosaminoglicano). Esto puede incluir los enlaces covalentes, ionicos o de hidrogeno, tanto de forma directa como de forma indirecta mediante un grupo de union como un conector divalente. Normalmente, el conjugado se forma por medio de un enlace covalente del peptido con el glicano mediante la formacion de enlaces de amidas, esteres o iminas entre los grupos de acido, aldehndo, hidroxi, amino o hidrazo de los respectivos componentes del conjugado. Todos estos metodos son conocidos en este campo o se describen mas adelante en la seccion de Ejemplos de esta solicitud o en Hermanson G.T., 'Bioconjugate Techniques', Academic Press, pags.169-186 (1996). Habitualmente, el conector ('linker', en ingles) comprende entre alrededor de 1 y alrededor de 30 atomos de carbono, y mas habitualmente entre alrededor de 2 y alrededor de 20 atomos de carbono. Normalmente se utilizan conectores con menos peso molecular (esto es, aquellos que tienen, aproximadamente, un peso molecular de entre alrededor de 20 y alrededor de 500).

Ademas, en el presente texto se contemplan las modificaciones estructurales de la zona o porcion del conector en los conjugados. Por ejemplo, los aminoacidos se pueden incluir en el conector y se pueden realizar diversas sustituciones de aminoacidos en la zona del conector del conjugado, incluyendo -pero sin limitarse a- los aminoacidos que existen de manera natural, asf como aquellos que estan disponibles a partir de metodos sinteticos habituales. En otro aspecto, se pueden usar aminoacidos beta, gamma y de cadenas mas largas en lugar de uno o mas aminoacidos alfa. En otro aspecto, el conector puede acortarse o alargarse, tanto alterando el numero de aminoacidos incluidos en el como incluyendo mas o menos aminoacidos beta, gamma o con cadenas mas largas. De manera similar, es posible modificar la longitud y la forma de otros fragmentos qrnmicos de los conectores descritos en el presente texto.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, el conector puede incluir uno o mas fragmentos bivalentes seleccionados -de manera independiente en cada caso- de un grupo que se compone de alquileno, heteroalquileno, cicloalquileno, cicloheteroalquileno, arileno y heteroarileno (cada uno de ellos se puede sustituir de manera opcional). Tal y como se utiliza en el presente texto, heteroalquileno representa un grupo que es el resultado de sustituir uno o mas atomos de carbono de un grupo de alquileno lineal o ramificado con un atomo seleccionado -de manera independiente en cada caso- de un grupo que se compone de oxfgeno, nitrogeno, fosforo y azufre. En una realizacion alternativa, el conector no esta presente.

En una realizacion descrita en el presente texto, se proporciona una matriz de colageno obtenida por ingeniena. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se pueden aplicar a la matriz de colageno obtenida por ingeniena descrita en el presente texto. En una realizacion, la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprende colageno polimerizado, acido hialuronico y un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. En una realizacion, la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprende colageno polimerizado y un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. En diversas realizaciones ilustrativas, se pueden anadir agentes reticuladores o reticulantes -como carbodiimidas, aldehndos, lysl-oxidasa, esteres de N-hidroxisuccinimida, imidoesteres, hidracidos y maleimidas, asf como diversos agentes reticuladores naturales, incluyendo genipina y similares- antes, durante o despues de la polimerizacion del colageno en una solucion.

En diversas realizaciones ilustrativas, el colageno utilizado en el presente texto para preparar una matriz de colageno obtenida por ingeniena puede ser cualquier tipo de colageno, incluyendo colageno de tipo I a XXVIII, solo o con cualquier tipo de combinacion; por ejemplo, pueden usarse colagenos de tipo I, II, III y/o IV. En algunas realizaciones, el colageno utilizado para preparar una matriz de colageno obtenida por ingeniena se selecciona de un grupo que se compone de colageno de tipo I, colageno de tipo II, colageno de tipo III, colageno de tipo IV, colageno de tipo IX, colageno de tipo XI y combinaciones de estos. En una realizacion, la matriz de colageno obtenida por ingeniena se forma usando colageno disponible de manera comercial (por ejemplo, Sigma, St. Louis, MO, EE UU). En una realizacion alternativa, el colageno puede depurarse o purificarse a partir de submucosa que contiene material de tejido como tejido intestinal, estomacal o de la vejiga urinaria. En otra realizacion, el colageno puede purificarse a partir de tendon de la cola. En otra realizacion adicional, el colageno puede purificarse a partir de la piel. En diversos aspectos, el colageno tambien puede contener protemas no colagenas anadidas de manera endogena o exogena -ademas de los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico-, como fibronectina o protemas de seda, glicoprotemas y polisacaridos, o similares. Las matrices de colageno obtenidas por ingeniena y preparadas siguiendo los metodos descritos en el presente texto pueden tener la forma de un injerto tisular (por ejemplo, ser en forma de gel), el cual puede adoptar las propiedades caractensticas del tejido o tejidos con los que estan asociadas en el sitio de implantacion o inyeccion. En una realizacion, la matriz de colageno obtenida por ingeniena es un implante tisular que puede implantarse en un paciente. En otra realizacion, la matriz de colageno obtenida por ingeniena puede ser administrada a un paciente mediante inyeccion. En cualquier realizacion, la matriz puede estar en forma de gel o en forma de polvos, por ejemplo.

En una realizacion, el colageno de la matriz obtenida por ingeniena comprende entre alrededor del 40 y alrededor del 90 del porcentaje (%) del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 40 y alrededor del 80% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 40 y alrededor del 70% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 40 y alrededor del 60% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 50 y alrededor del 90% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 50 y alrededor del 80% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 50 y alrededor del 75% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 50 y alrededor del 70% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 60 y alrededor del 75% del peso en seco de la matriz. En otra realizacion, el colageno de la matriz obtenida por ingeniena comprende alrededor del 90% del peso en seco, alrededor del 85% del peso en seco, alrededor del 80% del peso en seco, alrededor del 75% del peso en seco, alrededor del 70% del peso en seco, alrededor del 65% del peso en seco, alrededor del 60% del peso en seco, alrededor del 50% del peso en seco, alrededor del 45% del peso en seco, alrededor del 40% del peso en seco, o alrededor del 30% del peso en seco de la matriz.

En una realizacion, la concentracion final de colageno de la matriz en forma de gel es de entre alrededor de 0,5 y alrededor de 6 mg por mL, entre alrededor de 0,5 y alrededor de 5 mg por mL, entre alrededor de 0,5 y alrededor de 4 mg por mL, entre alrededor de 1 y alrededor de 6 mg por mL, entre alrededor de 1 y alrededor de 5 mg por mL, entre alrededor de 1 y alrededor de 4 mg por mL. En una realizacion, la concentracion final de colageno de la matriz es de alrededor de 0,5 mg por mL, de alrededor de 1 mg por mL, de alrededor de 2 mg por mL, de alrededor de 3 mg por mL, de alrededor de 4 mg por mL o de alrededor de 5 mg por mL.

En una realizacion, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico de la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprende entre alrededor del 2 y alrededor del 60% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 2 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 5 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 20% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 30% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 25% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 15 y alrededor del 30% del peso en seco de la matriz o entre alrededor del 15 y alrededor del 45% del peso en seco de la matriz. En otra realizacion, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico de la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprende alrededor del 2% del peso en seco, alrededor del 5% del peso en seco, alrededor del 10% del peso en seco, alrededor del 15% del peso en seco, alrededor del 20% del peso en seco, alrededor del 25% del peso en seco, alrededor del 30% del peso en seco, alrededor del 35% del peso en seco, alrededor del 40% del peso en seco, alrededor del 45% del peso en seco o alrededor del 50% del peso en seco de la matriz.

En otra realizacion, la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprende acido hialuronico y el acido hialuronico de la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprende entre alrededor del 2 y alrededor del 60% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 2 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 5 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 20% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 30% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 25% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 15 y alrededor del 30% del peso en seco de la matriz o entre alrededor del 15 y alrededor del 45% del peso en seco de la matriz. En otra realizacion, el acido hialuronico de la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprende alrededor del 2% del peso en seco, alrededor del 5% del peso en seco, alrededor del 10% del peso en seco, alrededor del 15% del peso en seco, alrededor del 20% del peso en seco, alrededor del 25% del peso en seco, alrededor del 30% del peso en seco, alrededor del 35% del peso en seco, alrededor del 40% del peso en seco, alrededor del 45% del peso en seco o alrededor del 50% del peso en seco de la matriz.

En una realizacion, la matriz de colageno obtenida por ingeniena contiene acido hialuronico y un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. El acido hialuronico y el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico de la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprenden entre alrededor del 10 y alrededor del 60% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 20 y alrededor del 60% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 30 y alrededor del 60% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 40 y alrededor del 60% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 10 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 20 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 25 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz, entre alrededor del 30 y alrededor del 50% del peso en seco de la matriz o entre alrededor del 25 y alrededor del 40% del peso en seco de la matriz. En otra realizacion, el acido hialuronico y el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico de la matriz de colageno obtenida por ingeniena comprenden alrededor del 10% del peso en seco, alrededor del 15% del peso en seco, alrededor del 20% del peso en seco, alrededor del 25% del peso en seco, alrededor del 30% del peso en seco, alrededor del 35% del peso en seco, alrededor del 40% del peso en seco, alrededor del 50% del peso en seco, alrededor del 55% del peso en seco, alrededor del 60% del peso en seco o alrededor del 70% del peso en seco de la matriz.

En un aspecto ilustrativo, la matriz de colageno obtenida por ingeniena puede esterilizarse. Tal y como se utilizan en el presente texto, 'esterilizacion', 'esterilizar' o 'esterilizado/a' hacen referencia a desinfectar la matriz eliminando contaminantes no deseados, incluyendo -pero sin limitarse a- endotoxinas, contaminantes del acido nucleico y agentes infecciosos.

En diversas realizaciones ilustrativas, la matriz de colageno obtenida por ingeniena puede desinfectarse y/o esterilizarse usando tecnicas de esterilizacion habituales, incluyendo el curtido con glutaraldetudo, el curtido con formaldetudo con un pH acido, el tratamiento con oxido de propileno u oxido de etileno, la esterilizacion con plasma de gas, la radiacion gamma (por ejemplo, irradiacion gamma de 1-4 Mrads o irradiacion gamma de 1-2,5 Mrads), un haz de electrones y/o la esterilizacion con un peracido, como el acido peracetico. Pueden usarse tecnicas de esterilizacion que no afecten de manera adversa a la estructura y las propiedades biotropicas de la matriz. En una realizacion, la matriz de colageno obtenida por ingeniena puede someterse a uno o mas procesos de esterilizacion. En las realizaciones ilustrativas, el colageno en solucion tambien puede esterilizarse o desinfectarse antes de la polimerizacion. La matriz de colageno obtenida por ingeniena puede envolverse en cualquier tipo de envase, incluyendo un envoltorio de plastico o un envoltorio de papel de aluminio, y ademas puede esterilizarse.

En cualquiera de estas realizaciones, la matriz de colageno obtenida por ingeniena ademas puede comprender una poblacion exogena de celulas. La poblacion anadida de celulas puede comprender una o mas poblaciones de celulas. En varias realizaciones, las poblaciones de celulas comprenden una poblacion de celulas epiteliales queratinizadas o no queratinizadas o una poblacion de celulas seleccionadas de un grupo que se compone de celulas endoteliales, celulas derivadas mesodermicamente, celulas mesoteliales, sinoviocitos, neuronas, celulas gliales, osteoblastos, fibroblastos, condrocitos, tenocitos, celulas musculares lisas, celulas esqueleto-musculares, celulas del musculo cardfaco, celulas progenitoras multipotenciales (por ejemplo, celulas madre, incluyendo celulas progenitoras de la medula osea) y celulas osteogenicas. En algunas realizaciones, la poblacion de celulas se selecciona de un grupo que se compone de condrocitos y celulas madre. En algunas realizaciones, las celulas madre se seleccionan de un grupo que se compone de osteoblastos, celulas osteogenicas y celulas madre mesenquimales. En diversas realizaciones, la matriz de colageno obtenida por ingeniena puede poblarse con uno o mas tipos de celulas de forma combinada.

En diversos aspectos, las matrices de colageno obtenidas por ingeniena o los constructos de injertos obtenidos por ingeniena de la presente invencion pueden combinarse con nutrientes, incluyendo minerales, aminoacidos, azucares, peptidos, protemas, vitaminas (como acido ascorbico), o laminina, fibronectina, acido hialuronico, fibrina, elastina, o agrecano, o factores de crecimiento como factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento transformante beta, factor de crecimiento de fibroblastos, y glucocorticoides como dexametasona o agentes de alteracion viscoelasticos, como polfmeros solubles en agua ionicos y no ionicos; polfmeros de acido acnlico; polfmeros hidrofflicos como oxidos de polietileno, copolfmeros de polioxietileno-polioxipropileno, y polivinilalcohol; polfmeros celulosicos y derivados de polfmeros celulosicos como celulosa de hidroxipropilo, celulosa de hidroxietilo, metilcelulosa de hidroxipropilo, ftalato de metilcelulosa de hidroxipropilo, metilcelulosa, celulosa de carboximetilo, y celulosa eterificada; acido polilactico, acido poliglicolico, copolfmeros de acido lactico y glicolico, u otros agentes polimericos, tanto naturales como sinteticos. En otras realizaciones ilustrativas, los agentes reticuladores, como carbodiimidas, aldetudos, lysl-oxidasa, esteres de N-hidroxisuccinimida, imidoesteres, hidracidos y maleimidas, asf como agentes reticuladores naturales, incluyendo genipina, y similares, pueden anadirse antes, al mismo tiempo o despues de la adicion de las celulas.

Tal y como se ha explicado previamente, de acuerdo con una realizacion, pueden anadirse celulas a las matrices de colageno obtenidas por ingeniena o a los constructos de injertos obtenidos por ingeniena despues de la polimerizacion del colageno o durante la polimerizacion del colageno. Posteriormente, las matrices de colageno obtenidas por ingeniena que contienen las celulas pueden inyectarse o implantarse en un huesped y usarse como constructos de injertos obtenidos por ingeniena. En otra realizacion, las celulas que se encuentran sobre o en las matrices de colageno obtenidas por ingeniena pueden cultivarse 'in vitro', durante un periodo de tiempo predeterminado, para aumentar el numero de celulas o para provocar la remodelacion deseada antes de la implantacion o la inyeccion en un paciente.

En una realizacion descrita en el presente texto, se proporciona una composicion para el cultivo 'in vitro' de condrocitos o celulas madre (esto es, para el cultivo 'in vitro' de celulas sin que despues se implanten o inyecten en un paciente). La composicion para el cultivo 'in vitro' contiene un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse a la composicion para el cultivo 'in vitro' aqrn descrita.

En diversos aspectos, la composicion para el cultivo 'in vitro' de la presente invencion puede combinarse con nutrientes, incluyendo minerales, aminoacidos, azucares, peptidos, protemas, vitaminas (como acido ascorbico), o laminina, fibronectina, acido hialuronico, fibrina, elastina, o agrecano, o factores de crecimiento como factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento transformante beta, factor de crecimiento de fibroblastos, y glucocorticoides como dexametasona.

En algunas realizaciones, la composicion para el cultivo 'in vitro' incluye celulas madre seleccionadas de un grupo que se compone de osteoblastos, celulas osteogenicas y celulas madre mesenquimales. En diversas realizaciones, la composicion para el cultivo 'in vitro' puede proveerse de uno o mas tipos de celulas de forma combinada.

En un aspecto ilustrativo, la composicion para el cultivo 'in vitro' puede esterilizarse. Tal y como se utilizan en el presente texto, 'esterilizacion', 'esterilizar' o 'esterilizado/a' hacen referencia a desinfectar la composicion eliminando contaminantes no deseados, incluyendo -pero sin limitarse a- endotoxinas, contaminantes del acido nucleico y agentes infecciosos. Los procedimientos, metodos y realizaciones de esterilizacion proporcionados en los parrafos precedentes tambien pueden aplicarse a la composicion para el cultivo 'in vitro' descrita en el presente parrafo. La composicion para el cultivo 'in vitro' puede usarse para aumentar las poblaciones de celulas para implantarlas o inyectarlas en un paciente.

En una realizacion descrita en el presente texto, se proporciona un aditivo para una composicion de biomaterial para el recambio del cartflago. El aditivo contiene un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico para anadirlo a un material de biomaterial -ya existente- para el recambio del cartflago. Las realizaciones previamente descritas del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse al aditivo aqrn descrito.

Tal y como se utiliza en el presente texto, la frase 'material para el recambio de cartflago de biomaterial ya existente' hace referencia a una composicion biologicamente compatible que puede usarse para el recambio o sustitucion de cartflago del cuerpo danado, defectuoso o ausente. En este campo se conocen y se contemplan diversos tipos de composiciones de biomaterial para el recambio del cartflago. Por ejemplo, las composiciones de biomaterial ya existentes para el recambio del cartflago o del hueso incluyen el 'DeNovo® NT Natural Tissue Graft' (Zimmer), el 'MaioRegen™' (JRI Limited) o la coleccion de tejidos osteoarticulares criopreservados que produce Biomet.

En una realizacion, se proporciona un metodo para preparar un biomaterial o recambio de cartflago oseo. El metodo incluye el paso de combinar el peptidoglicano sintetico con un biomaterial o un material para el recambio del cartflago oseo ya existentes. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse al metodo aqrn descrito.

En una realizacion, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se utiliza en un metodo para el tratamiento de la artritis en un paciente. El metodo incluye el paso de administrar al paciente un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico, de manera que el peptidoglicano sintetico alivia uno o mas smtomas asociados con la artritis. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse al metodo aqrn descrito.

En diversas realizaciones, el peptidoglicano sintetico utilizado en el metodo para el tratamiento de la artritis reduce uno o mas smtomas asociados con la artritis. En este campo se conocen diversos smtomas que estan asociados con la artritis, incluyendo -pero sin limitarse a- dolor, rigidez, sensibilidad, inflamacion, hinchazon, enrojecimiento, quemazon y movilidad reducida. Los smtomas de la artritis pueden presentarse en una articulacion, un tendon u otras partes del cuerpo. Tal y como se utiliza en el presente texto, 'reducir' significa prevenir o aliviar completa o parcialmente los smtomas de la artritis.

En diversas realizaciones, la artritis es osteoartritis o artritis reumatoide. La patogenesis y los smtomas clmicos de la osteoartritis y de la artritis reumatoide son bien conocidos en este campo. En una realizacion de este metodo, el peptidoglicano sintetico funciona como lubricante despues de su administracion o evita la perdida de cartflago. En otra realizacion, el peptidoglicano sintetico evita la articulacion de los huesos del paciente. Por ejemplo, el peptidoglicano sintetico inhibe la articulacion hueso contra hueso en un paciente con un cartflago disminuido o danado.

En una realizacion, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se utiliza en un metodo para reducir o evitar la degradacion de los componentes de la ECM (la matriz extracelular) de un paciente. Por ejemplo, se proporciona un metodo para reducir o evitar la degradacion de los componentes de la ECM en el cartflago de un paciente. El metodo incluye administrar al paciente un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse al metodo aqrn descrito. En una realizacion, el peptidoglicano sintetico es resistente a las metaloproteasas de la matriz, por ejemplo, la agrecanasa.

En otra realizacion, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se usa en un metodo para reducir o evitar la degradacion del acido hialuronico de un paciente. El metodo incluye administrar al paciente un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse al metodo aqrn descrito.

En otra realizacion, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se usa en un metodo para reducir o evitar la degradacion del colageno. El metodo incluye los pasos de poner en contacto un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico con acido hialuronico en presencia de colageno, y de reducir o evitar la degradacion del colageno. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse al metodo aqrn descrito.

En otra realizacion, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se usa en un metodo para reducir o evitar la degradacion del sulfato de condroitina. El metodo incluye los pasos de poner en contacto un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico con acido hialuronico en presencia de colageno, y de reducir o evitar la degradacion del sulfato de condroitina. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse al metodo aqrn descrito.

'Reducir' la degradacion de los componentes de la ECM, por ejemplo, la degradacion de acido hialuronico, colageno o sulfato de condroitina, significa reducir completa o parcialmente la degradacion de acido hialuronico, colageno o sulfato de condroitina, respectivamente.

En una realizacion, reducir la degradacion del acido hialuronico de un paciente significa reducir el ritmo o tasa de degradacion del acido hialuronico. Por ejemplo, la Figura 8 descrita en la seccion de Ejemplos de la presente solicitud muestra que la tasa de degradacion del acido hialuronico en una mezcla de acido hialuronico y peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se reduce de forma significativa cuando se anade el peptidoglicano sintetico.

En una realizacion, reducir la degradacion del colageno significa reducir el ritmo o tasa de degradacion del colageno. Por ejemplo, la Figura 10 descrita en la seccion de Ejemplos de la presente solicitud muestra que la tasa de degradacion del colageno en presencia de acido hialuronico y de un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se reduce de forma significativa cuando se anade el peptidoglicano sintetico.

En una realizacion, reducir la degradacion del sulfato de condroitina significa reducir el ritmo o tasa de degradacion del sulfato de condroitina. Por ejemplo, la Figura 11 descrita en la seccion de Ejemplos de la presente solicitud muestra que la tasa de degradacion del sulfato de condroitina en presencia de un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se reduce de forma significativa cuando se anade el peptidoglicano sintetico.

En una realizacion descrita en el presente texto, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se utiliza en un metodo para corregir o modificar un defecto en el tejido de un paciente. El metodo incluye administrar en el tejido defectuoso de un paciente acido hialuronico y un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico, de manera que el defecto se corrige o modifica. Las realizaciones previamente descritas sobre el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden aplicarse al metodo aqrn descrito. En una realizacion, el defecto del tejido es un defecto cosmetico.

Las siguientes realizaciones pueden aplicarse a los metodos aqrn descritos, en los que el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se administra a un paciente. En diversas realizaciones, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede inyectarse o implantarse (por ejemplo, incorporado en una composicion o dispositivo para reparar el cartflago). En algunas realizaciones descritas en el presente texto, la inyeccion es una inyeccion intraarticular. En otra realizacion descrita en el presente texto, la inyeccion se realiza en una capsula articular del paciente. En otras realizaciones, la inyeccion es una inyeccion subcutanea, como en el caso de los rellenos dermicos. Los medios adecuados para la inyeccion incluyen un inyector con aguja (incluyendo una miniaguja) o un dispositivo para realizar una infusion.

En una realizacion ilustrativa, las formulaciones farmaceuticas que se usan con peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico para administrarse a un paciente comprenden: a) una cantidad farmaceuticamente activa del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico; b) un agente amortiguador del pH farmaceuticamente aceptable para proporcionar un pH que se encuentre en un rango de entre alrededor de pH 4.5 y alrededor de pH 9; c) un agente que modifique la fuerza ionica con un rango de concentracion de entre alrededor de 0 y alrededor de 300 milimolares; y d) un agente soluble en agua que modifique la viscosidad con un rango de concentracion de entre alrededor del 0,25% y alrededor del 10% del peso total de la formula; o cualquier componente individual a), b), c) o d); o cualesquiera combinaciones de a), b), c) y d).

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, los agentes amortiguadores del pH son aquellos agentes que resultan conocidos para alguien versado en la materia, e incluyen, por ejemplo, amortiguadores de acetato, borato, carbonato, citrato y fosfato, asf como acido hidroclortndrico, hidroxido de sodio, oxido de magnesio, fosfato de monopotasio, bicarbonato, amoniaco, acido carbonico, acido hidroclorico, citrato de sodio, acido cftrico, acido acetico, hidrogeno fosfato disodico, borax, acido borico, acido dietilbarbiturico y protemas, asf como diversos amortiguadores biologicos como, por ejemplo, TAPS, Bicina, Tris, Tricina, HEPES, TES, MOPS, PIPES, cacodilato o MES.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, los agentes que modifican la fuerza ionica incluyen aquellos agentes conocidos en este campo, por ejemplo, glicerina, propilenglicol, manitol, glucosa, dextrosa, sorbitol, cloruro de sodio, cloruro de potasio y otros electrolitos.

Los agentes adecuados que modulan la viscosidad incluyen -pero no se limitan a- polfmeros solubles en agua ionicos y no ionicos, polfmeros reticulados acnlicos y acidos como la familia de polfmeros del 'carbopol' (o 'carbomer'), por ejemplo, carboxipolialquilenos que pueden obtenerse comercialmente bajo la marca registrada Carbopol®; poKmeros hidrofflicos como oxidos de polietileno, copoKmeros de polioxietileno-polioxipropileno, y polivinilalcohol; poKmeros celulosicos y derivados de poKmeros celulosicos como celulosa de hidroxipropilo, celulosa de hidroxietilo, metilcelulosa de hidroxipropilo, ftalato de metilcelulosa de hidroxipropilo, metilcelulosa, celulosa de carboximetilo, y celulosa eterificada; gomas como la goma tragacanto y la goma xantana; alginato de sodio; gelatina, acido hialuronico y sales de estos, quitosanos, goma gellan o cualquier combinacion de estos compuestos. Normalmente, los agentes no acidos que aumentan la viscosidad, como un agente neutro o basico, se emplean para que sea mas facil obtener una formulacion con el pH deseado.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, las formulaciones para inyectarse pueden formularse o prepararse como una solucion esterilizada no acuosa o como una forma seca (por ejemplo, liofilizada) que se usara junto con un vehfculo adecuado como, por ejemplo, agua esterilizada y exenta de pirogenos. La preparacion de formulaciones para inyectarse en condiciones de esterilizacion, por ejemplo, mediante liofilizacion, puede realizarse con facilidad utilizando tecnicas farmaceuticas estandares que son bien conocidas para las personas versadas en la materia. En una realizacion, la viscosidad de una solucion que contiene acido hialuronico se incrementa mediante la adicion de un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, la solubilidad de un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico utilizado en la preparacion de formulaciones para administrarse mediante inyeccion puede aumentarse utilizando las tecnicas de preparacion adecuadas, como la incorporacion de composiciones que aumentan la solubilidad como manitol, etanol, glicerina, polietilenglicoles, polipropilenglicol, poloxomeros y otros compuestos conocidos para aquellas personas con conocimientos en este campo.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, las formulaciones para administrarse mediante inyeccion pueden prepararse para que tengan una liberacion inmediata o modificada. Las formulaciones de liberacion modificada incluyen formulaciones de liberacion retardada, sostenida, pulsatil, controlada, dirigida y programada. Asf, un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede prepararse como un lfquido solido, semisolido o tixotropico que se administra como un deposito implantado y que proporciona una liberacion modificada del compuesto activo. Los ejemplos ilustrativos de estas formulaciones incluyen 'stents' recubiertos de farmacos y microesferas copolimericas de acido (dl-lactico, glicolico) (PGLA). En otra realizacion, los peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico o las composiciones que contienen peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico pueden administrarse de forma continua, siempre y cuando sea lo adecuado.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente texto, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede administrarse solo o en combinacion con diluyentes o portadores ('carriers', en ingles) farmaceuticamente apropiados. Los ingredientes para los diluyentes o portadores utilizados en la preparacion del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden seleccionarse de tal manera que no disminuyan los efectos deseados del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. La formulacion del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede tener cualquier forma que sea adecuada. Los ejemplos de formas para administrar la dosis incluyen soluciones acuosas del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico, por ejemplo, una solucion salina isotonica, un 5% de glucosa u otros portadores o vehfculos lfquidos bien conocidos y farmaceuticamente aceptables como alcoholes, glicoles, esteres y amidas.

Las dosis adecuadas del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico pueden determinarse mediante metodos estandares; por ejemplo, estableciendo curvas de respuesta a la dosis en modelos animales de laboratorio o en ensayos clmicos. En diversas realizaciones descritas en el presente texto, la dosis del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede variar de manera significativa dependiendo de las condiciones del paciente, el estado de la enfermedad que se esta tratando, la via de administracion y la distribucion de los tejidos, y la posibilidad de un uso compartido de otros tratamientos terapeuticos. De forma ilustrativa, las dosis adecuadas de peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico (administradas en un unico bolo o durante mas tiempo) incluyen desde alrededor de 1 ng/kg hasta alrededor de 10 mg/kg, desde alrededor de 100 ng/kg hasta alrededor de 1 mg/kg, desde alrededor de 1 pg/kg hasta alrededor de 500 pg/kg o desde alrededor de 100 pg/kg hasta alrededor de 400 pg/kg. En cada una de estas realizaciones, dosis/kg hace referencia a la dosis por kilogramo de la masa del paciente o peso corporal. En otros aspectos ilustrativos, las dosis eficaces pueden ir desde alrededor de 0,01 pg hasta alrededor de 1000 mg por dosis, desde alrededor de 1 pg hasta alrededor de 100 mg por dosis, desde alrededor de 100 pg hasta alrededor de 50 mg por dosis, desde alrededor de 500 pg hasta alrededor de 10 mg por dosis o desde alrededor de 1 mg hasta alrededor de 10 mg por dosis, o desde alrededor de 1 hasta alrededor de 100 mg por dosis, o desde alrededor de 1 mg hasta alrededor de 5000 mg por dosis, o desde alrededor de 1 mg hasta alrededor de 3000 mg por dosis, o desde alrededor de 100 mg hasta alrededor de 3000 mg por dosis, o desde alrededor de 1000 mg hasta alrededor de 3000 mg por dosis. En una realizacion, las dosis adecuadas de peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico incluyen concentraciones que van desde alrededor de 0,01 uM hasta alrededor de 100 uM, desde alrededor de 0,05 uM hasta alrededor de 100 uM, desde alrededor de 0,1 uM hasta alrededor de 100 uM, desde alrededor de 0,1 uM hasta alrededor de 50 uM, desde alrededor de 0,1 uM hasta alrededor de 20 uM, desde alrededor de 0,1 uM hasta alrededor de 10 uM, desde alrededor de 0,5 uM hasta alrededor de 10 uM, desde alrededor de 0,5 uM hasta alrededor de 50 uM y desde alrededor de 0,5 uM hasta alrededor de 100 uM. En otra realizacion, las dosis adecuadas de peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico incluyen concentraciones de alrededor de 0,01 uM, 0,1 uM, 0,2 uM, 0,5 uM, 1 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 50 uM y 100 uM.

El peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede prepararse en un excipiente. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente texto, el excipiente puede tener una concentracion que va desde alrededor de 0,4 mg/ml hasta alrededor de 6 mg/ml. En diversas realizaciones, la concentracion del excipiente puede ir desde alrededor de 0,5 mg/ml hasta alrededor de 10 mg/ml, desde alrededor de 0,1 mg/ml hasta alrededor de 6 mg/ml, desde alrededor de 0,5 mg/ml hasta alrededor de 3 mg/ml, desde alrededor de 1 mg/ml hasta alrededor de 3 mg/ml, desde alrededor de 0,01 mg/ml hasta alrededor de 10 mg/ml y desde alrededor de 2 mg/ml hasta alrededor de 4 mg/ml.

En las realizaciones en las que el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se implanta como parte de un dispositivo o composicion para reparar el cartflago (por ejemplo, un gel para implantarse), se puede utilizar cualquier preparacion adecuada previamente descrita.

Puede usarse cualquier regimen efectivo para administrar el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. Por ejemplo, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede administrarse como una dosis unica o en un regimen diario de multiples dosis. Ademas, puede usarse un regimen escalonado, por ejemplo, de uno a cinco dfas por semana, como alternativa al tratamiento diario.

En diversas realizaciones descritas en el presente texto, se trata al paciente con multiples inyecciones del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico. En una realizacion, se le inyecta al paciente en multiples ocasiones (por ejemplo, desde alrededor de 2 hasta alrededor de 50 veces) el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico; por ejemplo, en intervalos de 12-72 horas o en intervalos de 48-72 horas. Se le pueden administrar al paciente inyecciones adicionales de peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico en un intervalo de dfas o meses despues de la(s) inyeccion(es) inicial(es).

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente texto, debe entenderse que se puede usar una combinacion de dos o mas peptidoglicanos sinteticos que se unen al acido hialuronico -los cuales difieren en la parte peptfdica, la parte del glicano o ambas- en lugar de un unico peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico.

Tambien debe entenderse que, en las realizaciones anteriores, algunos aspectos de los compuestos, composiciones y metodos se presentan alternativamente en listas, como, por ejemplo y de manera ilustrativa, en selecciones de cualquier G o P. Por lo tanto, debe entenderse que diversas realizaciones alternativas de la divulgacion incluyen elementos individuales de dichas listas, asf como los diversos subconjuntos de dichas listas. Debe entenderse que cada una de esas combinaciones se describe en el presente texto por medio de las listas.

En los siguientes ejemplos ilustrativos, los terminos 'replica o imitacion de(l) agrecano' ('aggrecan mimetic', en ingles) y 'replica o imitacion' ('mimetic', en ingles) se usan como sinonimos del termino 'peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico'.

EJEMPLO 1

Sintesis Peptidica

Todos los peptidos se sintetizaron utilizando un sintetizador de peptidos Symphony (Protein Technologies, Tucson, AZ, EE UU) y utilizando un protocolo Fmoc con una resina Knorr. El peptido crudo se libero de la resina con TFA y se purifico mediante cromatograffa de fase inversa en un AKTAexplorer (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE UU) usando una columna de fase inversa (o reversa) Grace-Vydac 218TP C-18 y un gradiente de agua/acetonitrilo con un 0,1% de TFA. Se prepararon peptidos modificados con Dansyl anadiendo un paso adicional de union con dansyl-Gly (Sigma) antes de la separacion o liberacion de la resina. Las estructuras peptfdicas se verificaron mediante espectrometna de masas. Se prepararon los siguientes peptidos tal y como se ha descrito previamente: GAHWQFNALTVRGGGC, KQKIKHVVKLKGC y KLKSQLVKRKGC.

EJEMPLO 2

Funcionalizacion del Sulfato de Condroitina y Formacion del Peptidoglicano Sintetico

En la Figura 1 puede verse el esquema de reaccion para la creacion de la replica de agrecano (esto es, GAH). La funcionalizacion del sulfato de condroitina (CS) (Sigma, St. Louis, MO, EE UU) se consiguio usando peryodato de sodio (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE UU) para oxidar el CS. Variando el tiempo de duracion de la reaccion y la concentracion del peryodato de sodio, se controlo el numero de grupos de aldehudo producidos por la reaccion de oxidacion, valores que se muestran en la Tabla 2. La Tabla 2 detalla la concentracion del peryodato de sodio y la duracion de la reaccion necesaria para obtener el numero deseado de aldehudos por cada cadena de CS. Mediante progresivas reacciones qrnmicas, esquema que se muestra en la Figura 1, se asume que el numero de BMPH vinculados -o unidos- por cada cadena de CS es igual al numero de aldehudos producidos y al numero de 'peptidos que se unen al acido hialuronico (AH)' vinculados. Basandose en el tiempo de duracion de la reaccion y en la concentracion del peryodato de sodio, en la Tabla 2 se muestra el numero de peptidos (promedio) por cadena de Cs .

TABLA 2

La concentracion del CS se mantuvo constante a 20 mg por mL en todas las reacciones de oxidacion. Se hicieron reaccionar las cantidades medidas de CS y de peryodato de sodio y se protegieron de la luz en un 'buffer' o solucion amortiguadora de 0,1 M de acetato de sodio (pH 5.5) durante los periodos de tiempo especificados. La reaccion se consiguio completar eliminando el peryodato de sodio, para lo que se realizo una cromatograffa de filtracion en gel con una columna de Mini Bio-Gel de bio-Scale llena de perlas de poliacrilamida (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE UU) usando un Purificador AKTA FPLC (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE UU). El 'buffer' utilizado para el proceso de desalacion fue una 'solucion salina de fosfato' (tambien llamada 'tampon fosfato salino' o 'PBS') (pH 7.4, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE UU).

La sal de acido trifluoroacetico de N-[p- Acido maleimidopropionico]hidracido (BMPH) (Pierce, Rockford, IL, EE UU) se hizo reaccionar con un sobrante de 50 M del CS desalado y oxidado en un PBS. El extremo hidracido del BMPH reacciona y se vincula covalentemente con el CS funcionalizado, a traves de los recien creados aldelddos, para formar una base de Schiff intermediaria. Se anadio cianoborohidruro de sodio (5 M, Pierce) a la reaccion para reducir la imina de la base de Schiff intermediaria a una amina mas estable. El sobrante de BMPH se elimino de la solucion mediante una desalacion con FPLC en agua desionizada. Gracias a la capacidad de deteccion de la absorbancia del Purificador AKTA FPLC, se midio la cantidad sobrante de BMPH. El pequeno tamano y el bajo peso molecular del BMPH (297,19 g/mol) provoco que su elucion de la columna se produjera en un punto temporal separado y muy posterior. Con la presencia de sus numerosos enlaces simples y ocasionales enlaces dobles, el BMPH produjo un fuerte espectro de absorbancia tanto en la longitud de onda de 215 nm (caractenstica de los enlaces simples) como en la longitud de onda de 254 nm (caractenstica de los enlaces dobles). Por tanto, se produjo una curva estandar, estableciendose una relacion entre las masas conocidas de BMPH y el area integrada de los espectros de absorbancia de 215 nm (Figura 2). Con esta curva estandar se determino la masa del sobrante de BMPH. Sustraer la masa de BMPH excedente de la masa de la reaccion original permite determinar la masa de BMPH consumida en la reaccion. Usando la masa consumida, se calculo el numero de enlaces de BMPH con el CS oxidado. El producto de CS-BMPH recogido se congelo, liofilizo y almaceno a -80° Celsius.

La secuencia del peptido que se une con el AH se identifico con Mummert. Ligeras modificaciones en la secuencia identificada produjeron la secuencia espedfica de union con el AH, GAHWQFNALTVRGGGC (denominado GAH), que se utilizo en esta investigacion. El peptido fue producido por Genscript (Piscataway, NJ, EE UU) y adquirido a traves del mismo proveedor. Se incluyo el aminoacido de cistema para hacer posible el acoplamiento, mediante la formacion de enlaces de tioeter, al grupo de maleimida del BMPH. Esta reaccion se da con un ratio 1:1, permitiendo asumir que el numero de BMPH que se unen con el CS funcionalizado sera igual que el numero de peptidos de GAH enlazados. El peptido de GAH, con un sobrante de un molar con respecto al numero de BMPH enlazados por cada cadena, se disolvio en dimetilsulfoxido (DMSO) (Sigma) y se anadio a la solucion de CS-BMPH en intervalos de 15 minutos, en un cuarto de volumen cada vez. Tras la ultima adicion del peptido de GAH, se permitio que la reaccion avanzara durante dos horas. Durante este tiempo, el peptido de GAH excedente formo partfculas. Antes de purificar la solucion para obtener CS funcionalizado con g Ah , la solucion se paso a traves de un filtro de Acrodisc con poros de 0,8 pm de diametro (Pall, Port Washington, NY, EE UU) para eliminar el sobrante de partfculas peptfdicas. Despues, la solucion se paso -con agua desionizada-a traves del Purificador AKTA de FPLC para depurar el compuesto de GAH-CS. El compuesto recogido se congelo a -80° Celsius y se liofilizo para producir las replicas de agrecano deseadas. Por decision del laboratorio, la replica de agrecano se nombro mediante (# de peptidos unidos) (las primeras tres letras de la secuencia peptfdica) - (la abreviatura de GAG que se funcionalizo); esto es, en el caso de la replica de agrecano, 3GAH-CS, en relacion con los 3 peptidos de GAH que se unen al AH y se funcionalizaron con un esqueleto de GAG de sulfato de condroitina.

EJEMPLO 3

Union del Peptidoglicano Sintetico con el Acido Hialuronico

Union del Peptidoglicano Sintetico con el Acido Hialuronico Inmovilizado

El Acido Hialuronico (AH, de Streptococcus equi) (Sigma) con una concentracion de 4 mg por mL, se inmovilizo en una placa de 96 pocillos (Costar, blk/clr, Coming, Coming, New York, EE UU) durante la noche a 4° Celsius. Los peptidos de GAH etiquetados o marcados con biotina se unieron, por medio de BMPH, con CS funcionalizado con una concentracion de 1 biotina-GAH por cada cadena de CS. Los peptidos de GAH no etiquetados se unieron con los aldetudos de CS restantes que no habfan reaccionado. Se usaron metodos estandares de deteccion con biotinaestreptavidina para determinar el grado de union de la replica de agrecano con el AH inmovilizado. El bloqueo de la superficie de AH se llevo a cabo durante una hora con 1% de albumina de suero bovino (BSA) (Sera Care Life Sciences, Milford, MA, EE UU) en una solucion de 1x PBS. Despues de un lavado con 1x PBS, la replica de agrecano etiquetada con biotina se incubo en el pocillo durante 30 minutos y despues se lavo con 1x PBS. Una solucion de estreptavidinaperoxidasa de rabano picante (R&D Systems, Minneapolis, Mn , EE UU) se anadio a cada pocillo, y se dejo reaccionar durante 20 minutos. Despues de completarse la reaccion y tras un lavado, se anadio solucion de cromogeno (Substrate Reagent Pack, R&D Systems) y se dejo que se desarrollara durante 15 minutos. A los 15 min., se anadio acido sulfurico (Sigma) directamente a cada pocillo para detener la reaccion. Despues, se analizo la placa de pozos con un M5 SpectraMax Plate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE ^uU) en unas longitudes de onda de 450 y 540 nm. Sustrayendo las dos lecturas de absorbancia obtenidas, se determino la absorbancia debida a la replica de agrecano -etiquetada con biotina- enlazada.

Se sustituyo un peptido de GAH por cada replica de agrecano con un peptido de GAH etiquetado con biotina y la replica de agrecano ya etiquetada se incubo con AH inmovilizado. Los productos para la deteccion de biotina (mediante estreptavidina y HRP) disponibles comercialmente mostraron el grado de union de la replica con el AH inmovilizado (ver Figura 3). Empezando con una concentracion de 1 pM, la replica de agrecano mostro un aumento -dependiente de la dosis- en presencia de AH inmovilizado, lo que demostro que la replica estaba uniendose con el AH. Sin embargo, no se busco determinar la afinidad de enlace de la replica debido a las dudas acerca de la cantidad de AH inmovilizado.

Union del Peptidoglicano Sintetico Obtenido por Reometro con el Acido Hialuronico

Se prepararon soluciones de AH para analizar la capacidad de la replica de agrecano para unirse con el AH en una situacion mas pertinente fisiologicamente. La capacidad de la replica de agrecano para unirse con el AH se dedujo debido a la mejora del modulo de almacenamiento de la solucion, lo cual indico un entrecruzamiento ('crosslinking', en ingles) del AH por parte de la replica. Se crearon multiples tratamientos con 1x PBS pH 7.4 para analizar la capacidad de la replica de agrecano para unirse con el AH: control de AH con un 2,5 de porcentaje de peso, AH+CS con un ratio molar de 25:1 de CS:AH, AH+3GAH-CS con 25:1, AH+7,2GAH-CS con 25:1, AH+10,5GAH-CS con 25:1.

Utilizando el reometro AR-G2 (TA Instruments, New Castle, DE, EE UU), frecuencia (0,1 - 100 Hz, 2,512 Pa) y tension (0,1 -100 Pa, 1,0 Hz), se realizaron barridos para medir el modulo de almacenamiento de cada solucion.

La reologfa estudia el flujo o fluir de una sustancia en respuesta a las fuerzas aplicadas y se usa a menudo a la hora de medir materiales viscoelasticos. En particular, el reometro determina el modulo de almacenamiento y el modulo de perdidas basandose en la reaccion o respuesta de la sustancia frente a la fuerza aplicada. El modulo de almacenamiento es una medicion de la cantidad de energfa que es absorbida elasticamente por la sustancia, y el modulo de perdidas describe la cantidad de energfa que se pierde mediante el calor. Un modulo de almacenamiento grande o elevado es indicativo de una sustancia similar a un gel con una estructura mas ngida y elastica, mientras que un modulo de almacenamiento bajo o pequeno y un modulo de perdidas grande indican un material viscoso que no retiene o conserva elasticamente la carga aplicada. El AH, con su elevado peso molecular (~1.5MDa), es un material muy viscoso que retiene elasticamente una parte de la carga aplicada debido al pseudo-gel que forma por el entrelazamiento de las cadenas de AH. La replica de agrecano que se forma contiene multiples peptidos que se enlazan con el AH y que pueden funcionar como una especie de reticulante de las cadenas de AH adquiriendo una union de replica al Ah adecuada. Hipoteticamente, en solucion con el AH de elevado peso molecular, la replica de agrecano podna aumentar la rigidez de la solucion, creando un modulo de almacenamiento mayor. Un modulo de almacenamiento mayor sena indicativo de un amplio entrecruzamiento (o reticulacion) del AH, lo que probana una fuerte afinidad de enlace entre la replica de agrecano y las cadenas de AH presentes en la mezcla. Se analizaron multiples versiones de la replica de agrecano que se diferenciaban por el numero de peptidos de GAH (de promedio, 3, 7,2 o 10,5) enlazados por cada cadena de CS funcionalizado.

Los resultados del experimento, que se muestran en la Figura 4, demostraron que la adicion de CS reducfa de forma significativa (a=0,05) el modulo de almacenamiento de la solucion de AH. La adicion de densas cargas negativas asociadas con el CS ayudo a extender las cadenas de AH, disminuyendo el grado de entrelazamiento del AH y eliminando el pseudo-gel que guardaba la energfa aplicada. Confimando la hipotesis, ya que el numero de peptidos de GAH por CS aumento de 3 a 10,5, el modulo de almacenamiento de la mezcla tambien aumento. Este aumento puede atribuirse a dos caractensticas beneficiosas que se derivan de tener un mayor numero de peptidos de GAH por cada replica de agrecano. En primer lugar, cuantos mas peptidos de GAH unidos haya por CS, mayor sera la 'avidez' de la replica, lo que provocara una union mas fuerte de la replica con la molecula de A^h. En segundo lugar, cuantos mas peptidos de GAH unidos haya por CS, mayor sera la probabilidad de que la replica funcione como un reticulante entre las moleculas de AH. Ambos efectos contribuyeron a la obtencion de una mezcla mas similar al gel, lo que dio como resultado una medicion mas elevada del modulo de almacenamiento. Un enlace mas debil entre la replica y el AH no restituina el pseudo-gel y no podna almacenar la energfa aplicada por el reometro. El aumento en el modulo de almacenamiento confirma la fuerte union de la replica con el a H inmovilizado, que se muestra en la Figura 3. De forma espedfica, con 10,5 peptidos de GAH por cada cadena de CS, el modulo de almacenamiento fue significativamente mas elevado (a=0,05) que el control de AH+CS, alcanzando un modulo de almacenamiento promedio similar al del control de AH.

EJEMPLO 4

Estudios sobre la Compresion del Peptidoglicano Sintetico

Formacion del Gel de Colageno y Turbidez

Para imitar la matriz extracelular de cartflago nativo, se utilizo colageno para atrapar el AH y los agregados de replicas de agrecano dentro de un andamio natural. Se adquirio colageno de tipo II (CIl) de dos fuentes comerciales diferentes (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE UU, y Sigma). Se prepararon mezclas de los componentes de la ECM de cartflago en un tampon TES (60 mN de TES, 20mM de Na2HPO4, 0,56 M de NaCl, productos qrnmicos de Sigma) con un pH de 7.6 de acuerdo con la descomposicion de los componentes nativos, de manera que el CIl comprendfa el 70% del peso en seco y la combinacion de AH y la replica de agrecano/control de CS formaba el restante 30% de peso en seco de la mezcla. La concentracion final de CII en el gel era de 2 mg por ml. Las muestras estaban compuestas de un control de CII, un control de CII+AH+CS y una replica de CII+AH+agrecano (10,5GAH-CS). Para evitar una fibrilogenesis y una formacion de gel prematuras, las soluciones se conservaron en hielo con un pH acido. Las mezclas de soluciones de los componentes se depositaron en una placa de 384 pocillos (Greinier blk/clr, Monroe, NC, EE UU), y se pusieron a 37° C y con un pH fisiologico para iniciar la fibrilogenesis, y se monitorizaron a 313 nm con un ^m5 SpectraMax para determinar la formacion de gel. El CII no pudo formar geles cuando se incluyo con diversos tratamientos (ver informacion adicional). Por tanto, se utilizo colageno de tipo I (CI, colageno de tipo I de cola de rata altamente concentrado) (BD Biosciences, Bedford, MA, EE UU) para la formacion de gel. Los mismos tratamientos y procedimientos se utilizaron con el CI, exceptuando el hecho de que las masas de los componentes se modificaron para obtener una concentracion final de CI de 4 mg por mL. Se utilizo C i para todos los experimentos siguientes.

Se comprobo la turbidez con Cl para medir la formacion de la replica de cartflago (los resultados se muestran en la Figura 5). Como se demostro, la adicion de AH+10,5GAH-CS no afecto a la fibrilogenesis de las fibras de colageno. Todos los tratamientos siguieron una curva similar y alcanzaron picos de absorbancia similares al mismo tiempo mas o menos. El tratamiento de AH+10,5GAH-CS tema una absorbancia inicial mayor debido a la tendencia de las replicas de agrecano para formar auto-agregados en una solucion de 1x PBS, y no debido a la formacion prematura de fibrillas de Cl. El proceso de agregacion de 10,5GAH-CS se identifico durante los tests de reometro iniciales con el AH, pero dicha agregacion no inhibio la capacidad de la replica de agrecano para unirse con el AH.

Pruebas Sobre las Propiedades del Gel de Colageno

Se realizaron pruebas sobre la compresion de los geles basados en el colageno y tambien se realizaron barridos de frecuencia usando un reometro AR-G2 con una geometna o estructura de placas paralelas de 20 milfmetros (TA Instruments). Las mezclas de gel de 375 |jL se prepararon en hielo y se pasaron con una pipeta a la placa base del reometro. Se rebajo la geometna hasta obtener una distancia entre espacios de 1 mm y se calento la solucion hasta 37° C. Se utilizo una trampa de humedad para evitar la deshidratacion del gel mientras se dejaba que la mezcla se 'gelificara' durante dos horas. Este valor de dos horas se determino mediante los datos sobre el tiempo requerido hasta alcanzar la gelificacion, obtenidos a partir de los datos de turbidez. Despues de un periodo de tiempo de dos horas, los geles se habfan comprimido u oscilaban, dependiendo de la prueba. Las pruebas o tests de compresion se desarrollaron con una tasa de deformacion de ingeniena del 1% (10 jm ) por segundo. Se midieron la distancia entre espacios y la fuerza normal ejercida sobre la cabeza de la estructura. Los barridos de frecuencia midieron el modulo de almacenamiento de los geles formados durante un aumento de frecuencia de logaritmo en base diez que fue desde 0,1 hasta 1 Hz.

Se midieron la fuerza normal y el desplazamiento simultaneos, y se calcularon la tension y deformacion de ingeniena para los tratamientos. Tal y como se muestra en la Figura 6, la inclusion de la replica de agrecano aumento de manera significativa (a=0,05) la fuerza compresiva del complejo de gel. La tension de ingeniena maxima de la replica de colageno+AH+AGG alcanzo 7,5 kPa con una deformacion de ingeniena del 9%, mientras que el control de colageno+AH+CS alcanzo un pico de 4,8 kPa al 4%, y el control de colageno alcanzo un pico de 4,2 kPa al 15% de deformacion.

Dos factores contribuyeron al aumento de la fuerza compresiva del gel de CI+AH+10,5. En primer lugar, la capacidad de la replica para atraer el agua y, en segundo lugar, la capacidad de la replica de agrecano para la reticulacion del AH. En el cartflago nativo, la predominancia de las cargas negativas atrapadas proporcionada por el AH y el CS atrae el agua y retrasa su difusion desde el cartflago. Cuando se aplica una fuerza compresiva al cartflago, el agua no puede difundirse hacia afuera hasta la capsula sinovial. Retener esta agua incompresible aumenta la fuerza compresiva de la estructura. De manera similar, en los complejos de gel analizados la inclusion de las cargas negativas asociadas con el CS en el gel proporciona la misma atraccion. Tal y como se puede ver en la Figura 6, tanto el tratamiento de CS como el tratamiento de 10,5GAH-CS tienen una fuerza compresiva aumentada. El tratamiento de CS no esta fijado en el complejo de CI (no esta unido con el AH) y, por lo tanto, despues de una pequena deformacion compresiva, el CS y el agua que ha atrafdo se difunden fuera del complejo hacia el fluido de alrededor. La difusion del CS y el agua desde el complejo disminuye la fuerza compresiva del mismo, provocando que el perfil compresivo del gel resultante se parezca al del control del andamio de colageno. Por el contrario, el 10,5GAH-CS esta unido con el AH entrelazado. Por lo tanto, se requiere una fuerza compresiva mucho mayor para superar o debilitar la union de la replica con el AH y provocar la difusion del CS y el agua atrafda desde el complejo.

En segundo lugar, la capacidad de la replica de agrecano para funcionar como reticulante del AH confiere un mayor grado de 'atrapamiento' ('entrapment', en ingles) al acido hialuronico y la replica. En efecto, la naturaleza reticulada del AH forma grandes agregados en el complejo de colageno, de manera similar a lo que sucede con los agregados nativos de agrecano/AH. La diferencia principal entre la replica de agrecano y el agrecano nativo reside en el tamano de la molecula. Solamente el esqueleto de la protema de agrecano pesa ~220 kDa, mientras que la replica de agrecano, en su totalidad, solo pesa alrededor de 30kDa. Por lo tanto, el complejo de agregados nativo, con mas de 100 moleculas unidas al AH, produce agregados mucho mas grandes que los que podna producir la replica de agrecano. Sin embargo, al actuar como reticulante entre las cadenas de AH, la replica de agrecano puede producir su propia forma de agregado, que tambien posee las principales caractensticas de los agregados nativos; estructuras voluminosas y cargadas negativamente. El papel de la replica de agrecano como reticulante del AH se investigo mas a fondo aplicando fuerza de cizalla mediante pruebas reologicas con los geles de CI descritos previamente. Los resultados de estos experimentos pueden verse en la Figura 7.

La inclusion de 10,5GAH-CS aumento de manera significativa (a=0,05) el modulo de almacenamiento del gel formado. La red creada por la union de la replica con el AH complemento la rigidez de la matriz de CI, propiciando un aumento de la absorbancia elastica de la energfa aplicada mediante la fuerza de cizalla. Este estudio fue importante puesto que sirvio para verificar la capacidad de reticulacion del 10,5GAH-CS y la creacion de una forma de agregado alternativa.

EJEMPLO 5

Proteccion del Peptidoglicano Sintetico frente a la Degradacion del Acido Hialuronico

Los valores de viscosidad dinamica de las soluciones de AH se determinaron usando el AR-G2. Las soluciones de AH con elevados pesos moleculares tienen una gran viscosidad debido al amplio entrelazamiento de las cadenas causado por la gran longitud de las cadenas. La hialuronidasa (tipo II de las pruebas con ovejas, Sigma) descompone o separa las cadenas de AH, creando cadenas mas cortas con un entrelazamiento menor. Las cadenas mas cortas de AH tendran una viscosidad menor que se puede medir. Las soluciones de AH se incubaron con 100 unidades/mL de hialuronidasa. Las viscosidades dinamicas se determinaron utilizando un barrido de tiempo con una frecuencia angular constante y una tension oscilante al inicio, y en los puntos temporales de 2 y 4 horas. Las muestras (con un 0,5 de porcentaje de peso de AH) estaban compuestas de AH, AH+CS y AH+10,5GAH-CS. Los valores de tratamiento se anadieron con un ratio molar tratamiento/AH de 75:1. El porcentaje de degradacion se calculo con cada medicion dividiendo la viscosidad inicial con la diferencia de la viscosidad medida menos la viscosidad inicial.

El trabajo realizado por Pratta et al. y Little et al. ha demostrado la importancia del agrecano a la hora de prevenir la degradacion de los componentes de cartflago. La destruccion de la matriz de cartflago en la osteoartritis comienza con la descomposicion de los proteoglicanos del agrecano. La eliminacion de la zona rica en GAG del proteoglicano deja los componentes restantes -CII y AH- expuestos a las enzimas degradantes. Con estos conocimientos sobre la importancia del agrecano para evitar la degradacion, se realizaron estudios para determinar la capacidad de la replica de agrecano a la hora de evitar la degradacion del acido hialuronico.

La viscosidad de una solucion de acido hialuronico depende del tamano de las cadenas de AH. Debido al entrelazamiento, las cadenas de AH mas grandes daran lugar a una viscosidad mayor. Cuando se expone a la hialuronidasa, la cadena de AH se separa en unidades mas pequenas. Por lo tanto, el tamano del AH y el grado de entrelazamiento del AH disminuyen. Esta disminucion provoca una disminucion similar en la viscosidad medida. El porcentaje de cambio en la viscosidad de las soluciones de AH en presencia de hialuronidasa proporcionara informacion vital sobre el nivel de degradacion que haya sufrido el AH. La Figura 8 representa el porcentaje de degradacion del control de AH versus los tratamientos asociados. Tal y como se puede observar, la replica de AGG, GAH, redujo de forma significativa la tasa de degradacion del AH, lo que indica que se comporta de forma similar al AGG nativo a la hora de proteger los componentes de la ECM.

Las viscosidades de cada tratamiento sin hialuronidasa (un tampon TES sustituyo al volumen de hialuronidasa) se midieron inicialmente y sirvieron como referencia para los calculos sobre el porcentaje de degradacion. El punto temporal de 0 h requena anadir la hialuronidasa, mezclar la solucion, pasarlo a un reometro con una pipeta y poner en marcha la operacion de equilibrado de la maquina. Por tanto, el punto temporal de 0 h tuvo lugar aproximadamente 2 minutos despues de la adicion de hialuronidasa. Se uso una alta concentracion de hialuronidasa (25 unidades por mL) para replicar el peor escenario posible. Ademas, se dispersaron las moleculas de AH en una solucion, en lugar de estrechamente ligadas en una red de colageno. Tal y como se puede apreciar en la Figura 8, tanto el control de AH como el tratamiento de AH+CS sufrieron una degradacion casi completa de la solucion de AH en el punto temporal de 0 h. Por el contrario, la adicion de 10,5GAH-CS redujo de manera significativa (a=0,05) el nivel de degradacion del AH. De hecho, la presencia de 10,5GAH-CS aumento la viscosidad por encima de los valores de referencia. Se cree que la adicion de hialuronidasa descompone una parte del excedente de AH. Esto permite que el 10,5GAH-CS reticule mejor las cadenas restantes, intactas, creando un gel mas denso que da lugar a una mayor viscosidad.

En el punto temporal de 2 h, tanto el control de AH como el AH+CS se habfan degradado por completo con unos porcentajes de degradacion superiores al 90%, pero la solucion de AH con 10,5GAH-CS mostraba un porcentaje de degradacion significativamente mas bajo (a=0,05). Por ultimo, en el punto temporal de 4 h, todos los tratamientos se habfan degradado, y todos sus porcentajes de degradacion eran superiores al 90%. Entre las tres referencias temporales, el 10,5GAH-CS no pudo evitar por completo la degradacion del AH, pero redujo drasticamente la tasa de degradacion en comparacion con la degradacion del control de AH y el AH+CS. Esta tasa reducida demuestra que el 10,5GAH-CS evita la degradacion de las cadenas de AH. Se cree que esto se consigue mediante la inhibicion competitiva del punto de descomposicion de la hialuronidasa en la cadena de AH. El enlace o union no covalente de la replica con la cadena de AH, junto con la tasa de degradacion gradual de las cadenas de AH, parecen confirmar esta teona. Ademas, se cree que la tasa de degradacion de la solucion de 10.5GAH-CS sigue siendo artificialmente elevada. Despues de la incubacion de la replica en la solucion de AH, se formaron agregados de AH+10,5GAH-CS. Sin embargo, estos agregados no se distribuyeron de manera uniforme por todo el volumen de la solucion. Asf, se mezclaron las soluciones, de forma similar a las otras muestras, antes de realizar las mediciones. El hecho de mezclar la solucion altero los agregados, desplazando el 10,5GAH-CS y dejando expuesto el punto de descomposicion de la hialuronidasa. Incluso despues del punto temporal de referencia de 4 h, cuando, supuestamente, debena haber tenido lugar una degradacion completa, todavfa habfa una agregacion considerable de AH+10,5GAH-CS. En una matriz compacta como la ECM de cartflago, es posible que el 10,5GAH-CS pudiera no solo reducir de forma significativa la tasa de degradacion, sino tambien suprimir por completo la degradacion de AH.

EJEMPLO 6

Microscopio Electronico de Barrido de Congelacion (SEM)

Los constructos basados en la ECM, tal y como se ha descrito en el caso de las mediciones de turbidez, se formaron durante la noche en una placa SEM a 37° C. Las placas SEM se aseguraron en un recipiente y se sumergieron en una solucion de nitrogeno lfquido. Se aplico un vacfo a la muestra cuando esta se transfirio a una precamara Gatan Alto 2500. Ya en la camara, enfriada hasta -170° C, se utilizo un escalpelo enfriado para crear una superficie libre de rupturas en la muestra. Se hizo que la muestra se sublimara a -85° C durante 15 minutos y despues se rocio con un revestimiento de platino durante 120 segundos. Despues del revestimiento, la muestra se transfirio al microscopio y se tomaron imagenes a -130° C.

Se obtuvieron imagenes representativas con un aumento de 10000x, tal y como se muestra en la Figura 9. El Panel A muestra el control de CI, y se caracteriza por el extenso entrecruzamiento (o reticulacion) entre las principales fibrillas, y por el tamano relativamente pequeno de los poros de la matriz. El Panel B muestra el CI+AH+CS y contiene un extenso entrecruzamiento, ademas de un tamano de poros mayor, debido a la presencia de grandes cadenas de AH. El Panel C muestra el CI+AH+10,5GAH-CS e ilustra un grado de entrecruzamiento notablemente mas bajo, ademas de un tamano de poros muy grande. La replica de AGG puede unirse con el AH, creando un complejo relativamente grande y voluminoso que dificulta el entrecruzamiento de CI.

Tal y como se puede observar en las imagenes representativas, la adicion del AH+CS no tuvo ningun efecto sobre la variacion de los diametros de las fibrillas de colageno, pero las muestras de AH+CS sf mostro un espacio vacfo mas grande. En comparacion con los grupos de control, la adicion de la replica de AGG con AH dio como resultado una menor variacion de los diametros de las fibrillas de colageno, debido al limitado numero de diametros de fibrillas pequenos, y un aumento general del espacio vacfo de la muestra. La union de la replica de AGG con la molecula de AH creo un complejo de agregados que quedo atrapado en el andamio de colageno y evito la formacion de fibrillas mas pequenas entre las fibrillas mas grandes debido a los impedimentos estericos.

EJEMPLO 7

Proteccion del Colageno

Los constructos basados en la ECM que contienen solo colaaeno, colageno+AH+CS o colageno+AH+10,5GAH-CS se crearon en laminas compartimentadas de 8 pocillos, tal y como se ha descrito previamente. El volumen final de la muestra fue de 200 pL, y se compoma de 0,8 mg de colageno de tipo I. La metaloproteasa-I de la matriz (MMP-I, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE UU), con una concentracion de 0,133 mg/mL, se activo siguiendo el protocolo que se detalla en las instrucciones del fabricante. De manera resumida, la MMP-1, ya disuelta en el 'buffer' o tampon del fabricante (50mM de Tris, 10 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl, 0,05% de Brij-35, ph 7.5), se combino con un volumen igual de 25 mM de APMA (Sigma) en DMSO a 37° C durante 2 h para activar la enzima. Despues de la activacion, la solucion de MMP-1 se diluyo dos veces en agua y se anadio a la muestra como sobrenadante de 100 pL. Las muestras se incubaron a 37° C y se agitaron con suavidad. 25 horas despues de la adicion de la solucion inicial de enzimas, se elimino el sobrenadante y se sustituyo con un nuevo lote de enzimas. Despues de un total de 50 h de incubacion con las enzimas, los geles que quedaban se retiraron de las laminas compartimenadas, se lavaron con agua desionizada para eliminar cualquier solucion de enzimas o producto de degradacion, y se resolubilizaron en 12 M de HCl. Las muestras se diluyeron en agua para alcanzar una concentracion final de 6 M de HCl, y se hidrolizaron durante la noche a 110° C. Despues de la hidrolisis, se analizo la cantidad de hidroxiprolina (hyp) de acuerdo con el protocolo desarrollado por Reddy, et al. (Clin Biochem, 1996, 29: 225-9). De manera resumida, las muestras hidrolizadas se incubaron con una solucion de cloramina T (0,56 M) durante 25 minutos a temperatura ambiente antes de anadir reactivo de Ehrlich y del desarrollo posterior del cloroforo durante 20 minutos a 65° C. Tras el desarrollo del cloroforo, las muestras se analizaron con un espectrofotometro en una longitud de onda de 550 nm. Las lecturas de absorbancia se compararon con las obtenidas a partir de concentraciones de colageno conocidas para determinar la cantidad de colageno que quedaba en cada muestra.

Cada muestra de replica se preparo con 0,8 mg de CI y, tras la degradacion, se determino la cantidad de CI restante mediante el protocolo desarrollado por Reddy et al. El porcentaje de degradacion se determino sustrayendo el CI restante del CI inicial, dividiendo por el Ci inicial y multiplicando por 100. El porcentaje de degradacion de los tres tratamientos se muestra en la Figura 10. Todos los tratamientos resultaron ser significativamente diferentes unos de otros (p<0,05). En particular, el porcentaje de degradacion de la muestra de la replica de AGG (CI+AH+10,5GAH-CS=41,0%) fue significativamente menor (p<0,05) que los otros dos tratamientos (CI=64,5% y CI+AH+CS=74,7%). La presencia de la replica de AGG redujo la degradacion de CI de forma significativa. La presencia de la replica de AGG puede suponer un obstaculo para los sitios de descomposicion de las enzimas degradantes. Si se crean grandes agregados con AH que estan fuertemente atrapados en el andamio de colageno, la replica de AGG puede ocupar el espacio proximo al colageno, evitando el acceso de las enzimas a los lugares de degradacion.

EJEMPLO 8

Difusion de los Peptidoglicanos a traves de la Matriz de Cartilago

Se obtuvieron explantes de cartflago de la zona de carga de las articulaciones de las rodillas de un animal bovino de tres meses. Se elimino el agrecano nativo de los explantes de cartflago recogidos, lo que dejo una matriz que estaba compuesta principalmente de colageno de tipo II y de GAG residual. Esto se consiguio tratando los explantes con 0,5% (p/v) de tripsina en HBSS durante 3 horas a 37° C (Figura 13). Despues del tratamiento con tripsina, los explantes se lavaron tres veces en HBSS y se incubaron con un 20% de FBS para desactivar la actividad de la tripsina residual. Se disolvio peptidoglicano en agua destilada con una concentracion de 10 pM y se difundio por la superficie articular de los explantes de cartflago depositando 10 pL de la solucion en la superficie cada diez minutos durante una hora a temperatura ambiente (Figura 14). El cartflago normal y el cartflago desprovisto de agrecano se trataron con 1X PBS como control positivo y negativo, respectivamente. Tras la difusion, los explantes se lavaron tres veces con 1X PBS y se guardaron a -20° C para posteriores analisis. La difusion del peptidoglicano se confirmo tinendo con estreptavidinaperoxidasa de rabano picante una zona media sagital del tejido. La tincion de estreptavidina se une con la molecula etiquetada con biotina y se representa en color marron (Figuras 15 y 16).

EJEMPLO 9

Pruebas de Compresion de Volumen

Se llevo a cabo una compresion no confinada y con desplazamiento controlado en un reometro AR G2 con transductores de fuerza capaces de detectar fuerzas normales en un rango de 0,01-50 N (TA Instruments). Los explantes se fijaron a la parte inferior de una lamina impresa hidrofobica (Tekdon) y se cubrieron con un bano de 1X PBS. Se hizo descender una cabeza geometrica de una placa paralela de acero inoxidable de 20 mm de diametro hasta lograr un primer contacto. Se midio la altura del explante utilizando un micrometro digital (Duratool). Se aplicaron fuerzas o cargas de compresion con un 0-30% de deformacion nominal (con intervalos del 5%) a los explantes de manera gradual, lo que requirio una duracion de rampa ('ramp duration', en ingles) de 5 segundos (esto es, una tasa de deformacion del 1,0%/seg) y un tiempo de retencion de 30 seg. Los valores de la rigidez de compresion se obtuvieron usando la pendiente de los valores de la tension de equilibrio, computados en cada zona o seccion de retencion, frente a los respectivos valores de deformacion, basados en un modelo de ajuste lineal. Los andamios que se analizaron en cuanto a la compresion de volumen ('bulk compression', en ingles) incluyeron: 1) Cartflago normal, 2) Cartflago desprovisto de agrecano (AD) y 3) AD+mAGC (Figura 17). La adicion de peptidoglicano que se une al AH (mAGC) restauro de forma significativa la rigidez o firmeza de los explantes de cartflago llevandola a un nivel mayor en comparacion con el peptidoglicano que se une al colageno de tipo II (mAG(II)C).

EJEMPLO 10

Modelo Animal

Para la cirugfa se usaron ratas Sprague-Dawley (250~300g). Se cortaron transversalmente el tendon rotuliano, el ligamento cruzado anterior y posterior, y el ligamento colateral tibial y el ligamento lateral colateral. Se practico una meniscectoirna completa en el menisco medial y lateral. Se reparo la capsula de la articulacion de la rodilla mediante una sutura absorbible y se sello la piel con un monofilamento de nailon 4-0. Comenzando en la cuarta semana, se administraron semanalmente 10 pL de 1 pm de mAGC.

El grado de inflamacion se determino mediante una sonda de MMP-13 (Figura 18) en ratas Sprague-Dawley tratadas con y sin peptidoglicano cuatro, seis y ocho semanas despues de la cirugfa (Figura 19). Las imagenes de rayos X de las articulaciones de la rodilla de las ratas Sprague-Dawley mostraron la rodilla danada 6 semanas y 8 semanas despues de la induccion de OA (Figura 20, Paneles A y D, respectivamente), la rodilla danada con un tratamiento de peptidoglicano (Figura 20, Paneles B y E, respectivamente) y la rodilla normal (Figura 20, Panel C) seis semanas despues de la cirugfa de induccion de la osteoartritis. La microCT de las ratas Sprague-Dawley indico un recrecimiento de cartflago nuevo seis y ocho semanas despues de la cirugfa de induccion de Oa . Se muestran las rodillas danadas 6 semanas y 8 semanas despues de la induccion de OA (Figura 21, Paneles A y D, respectivamente), las rodillas danadas despues del tratamiento con peptidoglicano (Figura 21, Paneles B y E, respectivamente) y la rodilla normal (Figura 21, Panel C).

EJEMPLO 11

Reactivos

El peptido GAHWQFNALTVRGGGC (GAH) se adquirio a traves de Genscript (Piscataway, NJ, EE UU). La sal de acido trifluoroacetico de N-[p- Acido maleimidopropionico] hidracido (BMPH) se adquirio a traves de Pierce (Rockford, IL, EE UU). El colageno de tipo I de cola de rata se adquirio a traves de BD Biosciences (Bedford, MA, EE UU). La interleucina-1p recombinante humana se adquirio a traves de Peprotech (Rocky Hill, NJ, EE UU). A no ser que se indique lo contrario, todos los demas suministros se adquirieron a traves de VWR (West Chester, PA, EE UU) o Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE UU).

EJEMPLO 12

Sintesis de los Andamios de Colageno

Los andamios de colageno se prepararon en un tampon TES (60 mM de TES, 20 mM de Na2PO4, 0,56 M de NaCl) con un pH de 7.6. La composicion de los andamios para las pruebas mecanicas y los estudios sobre modelos inflamatorios 'in vitro' se describen en sus respectivas secciones. Todas las soluciones se conservaron en hielo hasta que comenzo la fibrilogenesis a 37° C. Los andamios de colageno alineados se crearon depositando la solucion de colageno en el isocentro de un iman de 9,4 Teslas (Chemagnetics CMX400) a 37° C durante una hora, mientras que los geles no alineados se prepararon de forma similar, pero sin someterlos a una exposicion magnetica. La lamina que contema la solucion de colageno se coloco en paralelo con el campo magnetico, de manera que las fibras de colageno se orientaron en una direccion perpendicular a la parte inferior (o fondo) de la lamina. Los geles se conservaron a 37° C durante 24 horas en una camara de control de humedad para evitar la evaporacion.

EJEMPLO 13

Pruebas Mecanicas y Reologicas

Las pruebas de cizalla y compresion se realizaron en un reometro AR G2 con la tension controlada (TA Instruments) usando una cabeza geometrica de una placa paralela de acero inoxidable de 20 mm de diametro. Los andamios de colageno se prepararon en laminas impresas hidrofobicas de 20 mm de diametro (Tekdon). Para las pruebas de cizalla, se bajo la cabeza geometrica hasta lograr el contacto a una altura de 950 pm. La frecuencia preliminar y los barridos de tension se realizaron para determinar el rango -lineal e independiente de la tension- del modulo de almacenamiento. Despues, se llevaron a cabo barridos de frecuencia en todos los geles con una tension oscilante de 0,2 Pa y en un rango de frecuencia de 0,1 a 2 Hz. Para las pruebas de compresion, la cabeza geometrica se bajo hasta lograr el contacto con el andamio a una altura de 1000 pm. Se aplicaron fuerzas de compresion con una tension nominal de 0-30% (a intervalos del 5%) al andamio de colageno de manera gradual, lo que requirio una duracion de rampa de 5 segundos (esto es, una tasa de deformacion del 1,0%/seg) y un tiempo de retencion de 30 seg. Los valores de la rigidez de compresion se obtuvieron usando la pendiente de los valores de la tension de equilibrio, computados en cada zona o seccion de retencion, frente a los respectivos valores de deformacion, basados en un modelo de ajuste lineal. La composicion de los andamios de colageno en las pruebas mecanicas fue la siguiente: 1) Colageno no alineado, 2) Colageno alineado, 3) Colageno no alineado+mAGC y 4) Colageno alineado+mAGC.

^{A n a lis is M e ca n ico de l V o lum en :} La replica de agrecano, mAGC, aumento las propiedades mecanicas de volumen de los andamios, independientemente del alineamiento de las fibras (Figura 22). Para las pruebas de cizalla, los valores de los modulos de almacenamiento a 0,5 Hz de los geles de colageno no alineados y alineados fueron de 104,1±3,6 Pa y 49,9±5,4 Pa, respectivamente. La adicion de mAGC al andamio de colageno mostro un aumento significativo de los modulos de almacenamiento de los geles no alineados y alineados, de 113,9±4,6 Pa y 76,6±3,6 Pa, respectivamente (p<0,001). Los geles no alineados mostraron un modulo de almacenamiento mas alto en comparacion con los geles alineados (p<0,0001). Para las pruebas de compresion, la rigidez de compresion de los andamios alineados (2478±250 Pa) fue menor que la de los andamios no alineados (3564±315 Pa) (p<0,001). La adicion de mAGC a estos sistemas de andamios aumento la rigidez de compresion de los andamios alineados y no alineados a 4626±385 Pa y 5747±306 Pa, respectivamente (p<0,0001).

EJEMPLO 14

Modelo de Inflamacion 'In Vitro'

Los andamios de colageno sembrados con condrocitos se estimularon con IL-p y se analizaron con productos degradantes.

^{A is la m ie n to de lo s C o n d ro c ito s :} los condrocitos primarios se recogieron de las articulaciones de las rodillas de un animal bovino de tres meses, obtenidas de un matadero en las 24 horas siguientes a la matanza (Dutch Valley Veal). Las laminas de cartflago, con un grosor de 150-200 pm, se extrajeron del condilo femoral lateral y se lavaron tres veces en un medio de DMEM/F-12 libre de suero (50 pg/mL de acido ascorbico 2-fosfato, 100 pg/mL de piruvato de sodio, 0,1% de albumina de suero bovino, 100 unidades/mL de penicilina, 100 p/mL de estreptomicina y 25 mM de HEPES) antes de digerirlas con un 3% de suero fetal bovino (FBS) y un 0,2% de colagenasa-P (Roche Pharmaceuticals) a 37° C durante seis horas. Los condrocitos liberados se filtraron a traves de un colador de celulas de 70 pm y se centrifugaron a 1000 rpm tres veces durante cinco minutos (cada vez) en un medio que se ha detallado previamente y que estaba enriquecido con un 10% de FBS. El cumulo de celulas se volvio a suspender en un medio -enriquecido- con 10% de FBS y se deposito en platillos de 10 cm, en una medida de 10 000 celulas/mL, y a 37° C en una incubadora humidificada (5% de CO2) hasta que fuera confluente.

^{F a b rica c io n de lo s a n d a m io s :} cuando se consiguio dicha confluencia, las celulas se tripsinizaron y se encapsularon a 10000 celulas/mL en los andamios de colageno (Tabla 3) y se dejo que se equilibraran durante 3 dfas antes del tratamiento.

TABLA 3: composicion de los andamios para las pruebas 'in vitro'

^{M od e lo de In fla m a c io n :} los constructos se incubaron con o sin 20 ng/mL de IL-1p en medios qmmicamente definidos y enriquecidos con un 5% de FBS y antibioticos (100 unidades/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina). El medio de cultivo se sustituyo cada dos dfas. Los extractos de medios eliminados se guardaron a -80° C para pruebas posteriores.

^{E n sa yo de D e g ra d a c io n :} la degradacion de GAG se monitorizo midiendo el CS liberado en el medio de cultivo celular utilizando un ensayo de tincion de dimetilmetiletileno azul (DMMB) y se calculo con una curva estandar de condroitina-6-sulfato. De manera similar, la degradacion de colageno de tipo I en un medio de cultivo celular se monitorizo usando un ensayo de colageno Sircol y siguiendo los protocolos (Bio-Color) establecidos por el fabricante. Se establecio que la degradacion del GAG y el colageno era de liberacion acumulada durante un periodo de cultivo de ocho dfas.

Analisis de Degradacion Proteolftica: la cantidad de CS y colageno liberada en el medio de cultivo celular disminuyo de manera significativa cuando se anadieron andamios que conteman mAGC (Figuras 11, 12, 23 y 24) (pcs<O,0oi y pcolageno<0,02, respectivamente). Los geles de colageno alineados mostraron una liberacion de CS y colageno en el medio mas alta estadfsticamente en comparacion con las fibras de colageno no alineadas (p<0,001).

Tal y como se describe en el presente texto, el peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico puede proteger el Ah -y las fibras de colageno subyacentes del andamio- de la escision proteolftica (o proteolisis). Para la smtesis del peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico se usaron los beneficios condroprotectivos del CS. Se ha demostrado que el CS regula hacia abajo la produccion de metaloproteasas de la matriz. Nuestro peptidoglicano sintetico, descrito en el presente texto, permitio que las cadenas de CS se unieran con el AH, evitando la degradacion de ambas moleculas. Al colocar el peptidoglicano sintetico en un entorno rico en enzimas proteolfticas, su capacidad para evitar una perdida excesiva de los componentes de la ECM quedo demostrada.

EJEMPLO 15

PCR en Tiempo Real

Tras el estudio sobre el cultivo de celulas, los constructos se guardaron en una solucion RNAlater (Ambion) a 4° C durante menos de una semana. El ARNm total se extrajo utilizando Nucleospin RNA II (Clontech) de acuerdo con los protocolos del fabricante. El ARNm extrafdo de todas las muestras se cuantifico usando un espectrofotometro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) y se transcribio inversamente a ADNc usando un Kit de Transcriptasa Inversa de ADNc de Alta Capacidad (Applied Biosystems) con los siguientes cebadores: GAPDH (Bt03210913_g1), agrecano (Bt03212186_ml) y colageno de tipo II (Bt03251861_ml). Se prepararon 60 ng de plantilla de ADNc por cada 20 pL de reaccion para los dos genes de interes y el gen endogeno. El analisis de PCR en tiempo real se realizo usando un Taqman PCR Master Mix y un Sistema de PCR en Tiempo Real 7500 (Applied Biosystems). Los datos recogidos se normalizaron para una expresion genetica de GAPDH.

[0141] Analisis de Expresion de ARNm: el alineamiento de colageno, la presencia de la replica de agrecano y la estimulacion con IL-1p tuvieron un efecto significativo sobre el agrecano (palineamiento <0,001, ppeptidoglicano <0,02 y P^iliP<0,001) y la expresion de colageno de tipo II (palineamiento <0,01, ppeptidoglicano <0,001 y p^il-ip<0,015). La presencia de mAGC limito la perdida excesiva de CS del andamio, lo que da como resultado una expresion de agrecano mas baja (p<0,02) (Figura 25). La presencia de mAGC tambien limito la degradacion de colageno. Sin embargo, la expresion del colageno de tipo II dependio de la cantidad de colageno que se perdio durante la degradacion (Figura 25). En los andamios no alineados, el nivel de expresion del colageno de tipo II fue mas alto en el caso de los andamios preparados sin mAGC, mientras que en los andamios de colageno alineados, el nivel de colageno de tipo II fue mas alto en el caso de los andamios preparados con mAGC (p<0,05).

EJEMPLO 16

Analisis Estadistico

Cada experimento se repitio dos veces, con al menos n=3 en cada conjunto de datos. Se analizo la importancia o significacion estadfstica de los datos de analisis mecanicos con un ANOVA de dos direcciones con el alineamiento y la adicion de peptidoglicano como factores. Los datos del cultivo celular se analizaron usando un ANOVA de tres direcciones con el alineamiento y la adicion del peptidoglicano y el tratamiento con IL-1p como factores. Tambien se uso una comparacion por pares post hoc de Tukey (a= 0,05) para comparar directamente los andamios preparados con y sin la replica de agrecano en cada sistema.

Se contemplan las siguientes clausulas numeradas y no limitativas:

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B 1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

GAHWQFNAL TVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

5. El peptidoglicano sintetico de cualquiera de las clausulas 1 a 4 en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

6. El peptidoglicano sintetico de cualquiera de las clausulas 1 a 5, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico tiene una glicina-cistema unida al extremo C-terminal del peptido.

7. Una matriz de colageno disenada que comprende colageno polimerizado, acido hialuronico y un peptidoglicano sintetico que se une al acido hialuronico.

8. La matriz de colageno disenada de acuerdo con la clausula 7, en la que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de la formula B1-X1-X2-X3-X5-X6-X7-X8-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

9. La matriz de colageno disenada de acuerdo con la clausula 7 u 8, en donde el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

10. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 7 a 9 en la que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan, y acido hialuronico.

11. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 7 a 10, en la que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

12. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 7 a 11, en la que el componente peptidico del peptidoglicano sintetico tiene una glicina-cistema unida al extremo C-terminal del peptido.

13. La matriz de colageno disenada de acuerdo con cualquiera de las clausulas 7 a 12, en la que la matriz comprende ademas una poblacion exogena de celulas.

14. Un metodo de tratamiento para la artritis en un paciente, dicho metodo comprendiendo el paso de administrar al paciente un peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico, en donde el peptidoglicano sintetico reduce un smtoma asociado con la artritis.

15. El metodo de la clausula 14 en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos de la formula B1-X1-X2-X3-X4-X6-X7-X8-B2,

en donde X8 esta presente o no esta presente,

en donde B1 es un aminoacido basico,

en donde B2 es un aminoacido basico, y

en donde X1-X8 son aminoacidos no acidos.

16. El metodo de la clausula 14 o 15, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNAL TVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK; y

KRTMRPTRR.

17. El metodo de cualquiera de las clausulas 14 a 16, en el que el componente glicano del peptidoglicano sintetico se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

18. El metodo de cualquiera de las clausulas 14 a l7, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a la agrecanasa.

19. El metodo de cualquiera de las clausulas 14 a 18, en el que el componente peptfdico del peptidoglicano sintetico tiene una glicina-cistema unida al extremo C-terminal del peptido.

20. El metodo de cualquiera de las clausulas 14 a 19, en el que la artritis se selecciona del grupo que consiste de osteoartritis y artritis reumatoide.

21. El metodo de cualquiera de las clausulas 14 a 20, en el que la dosificacion del peptidoglicano sintetico esta en una concentracion que vana de aproximadamente 0,1 uM a aproximadamente 10 uM.

22. El peptidoglicano sintetico de cualquiera de las clausulas 1 a 6, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a las metaloproteasas de la matriz.

23. La matriz de colageno disenada de cualquiera de las clausulas 7 a 13, en la que el peptidoglicano sintetico es resistente a las metaloproteasas de la matriz.

24. El metodo de cualquiera de las clausulas 14 a 21, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a las metaloproteasas de la matriz.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico que comprende al menos un peptido sintetico conjugado con un glicano en el que el peptido sintetico comprende una secuencia de union a acido hialuronico, en el que la secuencia de union a acido hialuronico consiste de una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de:

GAHWQFNALTVRGG;

GDRRRRRMWHRQ;

GKHLGGKHRRSR;

RGTHHAQKRRS;

RRHKSGHIQGSK;

SRMHGRVRGRHE;

RRRAGLTAGRPR;

RYGGHRTSRKWV;

RSARYGHRRGVG;

GLRGNRRVFARP;

SRGQRGRLGKTR;

DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;

RMRRKGRVKHWG;

RGGARGRHKTGR;

TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;

RQRRRDLTRVEG;

STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;

RRIGHQVGGRRN;

RLESRAAGQRRA;

GGPRRHLGRRGH;

VSKRGHRRTAHE;

RGTRSGSTR;

RRRKKIQGRSKR;

RKSYGKYQGR;

KNGRYSISR;

RRRCGQKKK;

KQKIKHVVKLK;

KLKSQLVKRK;

RYPISRPRKR;

KVGKSPPVR;

KTFGKMKPR;

RIKWSRVSK;

KRTMRPTRR; y

una secuencia de aminoacidos modificada de la misma mediante la inclusion de una sustitucion de aminoacidos conservadora, en donde la sustitucion de aminoacidos no altera el motivo como se define en:

(a) la formula B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2, en la que:

X1-X8 son aminoacidos no acidos,

X8 esta presente o no esta presente, y

B1-B2 son aminoacidos basicos,

(b) la formula B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3, en la que:

X1-X9 son aminoacidos no acidos,

X9 esta presente o no esta presente, y

B1-B3 son aminoacidos basicos,

(c) la formula B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3, en la que:

X1-X9 son aminoacidos no acidos,

X8 esta presente o no esta presente, y

B1-B3 son aminoacidos basicos,

o

(d) el motivo Arg-Arg.

2. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de la reivindicacion 1, en el que la secuencia de union a acido hialuronico consiste de GAHWQFNALTVRGG o una secuencia de aminoacidos modificada a partir de la misma mediante la inclusion de una sustitucion de aminoacidos conservadora, en la que la sustitucion de aminoacidos no altera el motivo como se define en:

(a) la formula B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2, en la que:

X1-X8 son aminoacidos no acidos,

X8 esta presente o no esta presente, y

B1-B2 son aminoacidos basicos.

3. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de la reivindicacion 1, en el que el glicano se selecciona del grupo que consiste de dextrano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan, sulfato de dermatan, heparan, heparina, queratina, sulfato de queratan y acido hialuronico.

4. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de la reivindicacion 1, en el que el glicano es sulfato de condroitina, y la secuencia de union a acido hialuronico consiste de GAHWQFNALTVRGG o una secuencia de aminoacidos modificada a partir de la misma mediante la inclusion de una sustitucion conservadora de aminoacidos, en la que la sustitucion de aminoacidos no altera el motivo como se define en:

(a) la formula B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2, en la que:

X1-X8 son aminoacidos no acidos,

X8 esta presente o no esta presente, y

B1-B2 son aminoacidos basicos.

5. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de cualquier reivindicacion anterior, en el que el peptidoglicano sintetico es resistente a agrecanasa.

6. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de cualquier reivindicacion anterior, en el que el peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico es resistente a las metaloproteasas de la matriz.

7. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de cualquier reivindicacion anterior, en el que el peptido sintetico se conjuga al glicano a traves de un conector.

8. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de la reivindicacion 7, en el que el conector comprende de 1 a aproximadamente 30 atomos de carbono.

9. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de la reivindicacion 8, en el que el conector comprende aminoacidos.

10. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de cualquier reivindicacion anterior, en el que el peptido sintetico del peptidoglicano sintetico tiene una glicina-cistema unida al extremo C-terminal del peptido o una glicinacistema-glicina (GCG) unida al extremo N-terminal del peptido.

11. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que mas de un peptido sintetico se conjuga con el glicano.

12. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de la reivindicacion 11, en el que cada glicano esta conjugado con aproximadamente 5-15 peptidos sinteticos.

13. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en el tratamiento de la artritis en un paciente.

14. El peptidoglicano sintetico de union a acido hialuronico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que la artritis se selecciona del grupo que consiste de osteoartritis.