KR20180016988A - 생체접합체 및 그의 용도 - Google Patents

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존 에릭 파더리
줄리아 첸
러시 로이드 바틀렛 2세
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시믹 아이피, 엘엘씨
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Abstract

본원에는 글리칸 및 그에 결합된 1 내지 약 50개 펩티드(들)을 포함하며, 펩티드(들)이 콜라겐-결합 단위, 히알루론산-결합 단위, ICAM-결합 단위, VCAM-결합 단위 및/또는 셀렉틴-결합 단위를 포함하는 것인 생체접합체, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 용도가 제공된다.

Description

생체접합체 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참고
본 출원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2015년 4월 17일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 62/149,428, 2015년 10월 13일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 62/241,057, 및 2015년 10월 21일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 62/244,665를 우선권으로 주장하며, 상기 각각의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
분야
본원에는 글리칸 및 그에 결합된 1 내지 약 50개 펩티드(들)을 포함하며, 펩티드(들)이 콜라겐-결합 단위, 히알루론산-결합 단위, ICAM-결합 단위, VCAM-결합 단위 및/또는 셀렉틴-결합 단위를 포함하는 것인 생체접합체, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 용도가 제공된다.
조직에서, 세포는 다양한 거대분자, 예컨대 생체접합체, 콜라겐, 히알루론산, 라미닌, 피브로넥틴 등을 함유하는 세포외 매트릭스 (ECM)에 의해 둘러싸여 있다. 포유류에서, 생체접합체는 세포외 매트릭스의 주요 성분이며, 여기서 이들은 다른 생체접합체, 히알루론산 및 섬유 매트릭스 단백질 (예컨대 콜라겐) 모두와 큰 복합체를 형성한다. 포유류가 노화됨에 따라 일부 질환 상태에서는, 신체의 특정 영역에서 (예를 들어, 윤활 관절, 유리체액, 척추 디스크, 피부 등에서) 세포외 매트릭스가 분해되어 원치않는 증상, 예컨대 다양한 형태의 관절염, 시력 상실 등을 초래할 수 있다. 또한, 일부 조직 손상, 예컨대 혈관 손상, 각막 손상 및 피부 창상은 콜라겐 및 히알루론산을 비롯한 세포외 매트릭스 및/또는 그의 성분의 노출을 일으킨다.
이전에는, 펩티드의 접합을 위해 사용되는 알데히드 관능기를 제공하기 위해 글리칸 골격 내의 당류 고리 중 하나 이상을 분할하는 산화 화학을 통해 생체접합체를 합성하였다.
본 개시내용은 글리칸, 및 -C(O)-NH-NH-C(O)- (즉, 히드라지드-카르보닐) 연결을 통해 그에 공유 결합된, 콜라겐-결합 단위, 히알루론산-결합 단위, 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM 수용체-결합 단위를 포함하는 1 내지 50개 펩티드를 포함하는 생체접합체를 제공한다. 본원에 기재된 생체접합체는, 펩티드가 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 연결되고, 히드라지드-카르보닐의 카르보닐 기가 글리칸 상에 존재하는 엑소시클릭 카르보닐 기라는 점에서 관련 기술분야에 공지된 것들과 구조적으로 상이하다. 본원에 개시된 생체접합체에서, 히드라지드-카르보닐의 카르보닐 기는 글리칸 내의 당류 고리, 예컨대 이로 제한되지 않지만 D-글루쿠로네이트 또는 L-이두로네이트 상에 있는 펜던트이다. 본원에 개시된 생체접합체에 의해 발휘되는 유익한 효과 (예컨대, 증가된 결합 친화도)는 적어도 부분적으로 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않는 글리칸 때문일 수 있는 것으로 고려된다. 고려되는 또 다른 유익한 효과는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않는 생체접합체의 개선된 안정성이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 생체접합체는 산화되지 않은 글리칸 및/또는 펩티드가 분할된 당류로부터 생성된 관능기에 의해 접합되지 않은 글리칸을 포함한다. 특정 실시양태에서, 글리칸은 화학적으로 개질된 글리칸 유도체, 예컨대 부분적으로 N-탈술페이트화된 글리칸 유도체, 부분적으로 O-탈술페이트화된 글리칸 유도체, 부분적으로 O-카르복시메틸화된 글리칸 유도체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 다른 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 카르보닐 기와 글리칸 상의 히드라지드 기 사이에 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 글리칸 및 1 내지 50개 펩티드(들)을 포함하며, 펩티드(들)은 콜라겐-결합 단위 및/또는 히알루론산-결합 단위를 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합된 것인 생체접합체에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 글리칸, 및 콜라겐-결합 단위를 포함하는 1 내지 50개 펩티드(들), 및 히알루론산-결합 단위를 포함하는 1 내지 50개 펩티드(들)을 포함하며, 펩티드들이 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합된 것인 생체접합체에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 글리칸 및 약 1 내지 약 50개 펩티드(들)을 포함하며, 펩티드(들)은 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM-결합 단위를 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합된 것인 생체접합체에 관한 것이다.
또한, 본원에 기재된 생체접합체를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 방법이 제공된다. 한 측면에서, 본원에 기재된 생체접합체를 포함하며, 글리칸에 결합된 펩티드 개수가 다양한 것인 조성물이 제공된다. 예를 들어, 조성물은 생체접합체에 결합된 펩티드의 개수가 평균으로서, 예컨대 글리칸당 약 5 내지 약 20개 펩티드로 계산되는 것인 생체접합체를 포함할 수 있다.
또한, 본원에는 a) 글리칸, 및 히알루론산-결합 단위를 포함하는 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 생체접합체; b) 글리칸, 및 셀렉틴-결합 단위를 포함하는 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 생체접합체; c) 글리칸, 및 ICAM-결합 단위를 포함하는 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 생체접합체; d) 글리칸, 및 VCAM-결합 단위를 포함하는 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 생체접합체; e) 글리칸, 및 콜라겐-결합 단위를 포함하는 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 생체접합체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체접합체를 포함하는 조성물이 제공된다.
특정 실시양태에서, 특히 한 가지가 넘는 유형의 결합 단위를 갖는 상이한 펩티드를 포함하는 생체접합체 (예를 들어, 콜라겐-결합 단위를 갖는 펩티드 및 히알루론산-결합 단위를 갖는 펩티드를 포함하는 생체접합체)에서는 하나만이 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 생체접합체 또는 그를 함유하는 조성물, 및 1종 이상의 희석제 또는 담체 (예컨대 염수)를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본원에 기재된 펩티드-관능화된 중합체의 생물학적 기능은 글리칸 골격 및/또는 그에 부착된 펩티드의 변화에 의해 조정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 생체접합체는 질환, 예컨대 혈관 손상 및/또는 염증과 관련된 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 생체접합체 및 그를 포함하는 조성물은 환자에서 관상 동맥 질환 및/또는 말초 동맥 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 바이패스 이식편은 관상 동맥 질환 (CAD) 및 말초 동맥 질환 (PAD) 둘 다에서 동맥 폐쇄 치료의 한 형태로서 사용된다. 미국에서 연간 대략 500,000건의 관상 동맥 바이패스 이식편 (CABG) 시술 및 70,000건이 넘는 말초 바이패스 이식편 시술이 이루어진다. 가장 흔하게는, 자가조직 혈관 이식편을 대개 복재 정맥으로부터 수확한다. 본원에 기재된 생체접합체는 자가조직 정맥 이식편을 이용하여 수술적 바이패스를 하고 있는 심혈관 질환 환자를 위한 정맥 이식편 보존 용액으로서 사용될 수 있다.
또한, 본원에는 본원에 기재된 생체접합체 또는 그를 포함하는 조성물의 유효량을 혈관에 적용하는 것을 포함하는, 혈관 손상 또는 중재술 이전에, 동안에 및/또는 이후에 환자의 혈관을 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 본원에는 벌룬 혈관성형술 이전에, 동안에 및/또는 이후에 본원에 기재된 생체접합체 또는 그를 포함하는 조성물의 유효량을 포함하는 용액을 내강의 내벽에 적용하는 것을 포함하는, 환자에서 내강 (예를 들어, 대퇴슬와부 동맥) 내의 협착 또는 폐색을 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 관절염을 치료하는 방법이 제공되며, 치료는 관절염과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 관절염과 관련된 다양한 증상, 예컨대 이로 제한되지 않지만 통증, 경직, 압통, 염증, 부기, 홍조, 온기 및 감소된 이동성이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다양한 실시양태에서, 관절염은 골관절염 또는 류마티스성 관절염이다.
또한, 본원에는 임의적으로 활성화제의 존재하에 글리칸을 충분한 양의 펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 글리칸 및 1 내지 50개 펩티드(들)을 포함하는 생체접합체의 제조 방법이 제공되며, 여기서 펩티드는 생체접합체를 제공하기 위한 커플링 반응 조건하에 히드라지드 기를 포함하고, 펩티드(들)은 콜라겐-결합 단위, 히알루론산-결합 단위, ICAM-결합 단위, VCAM-결합 단위 및/또는 셀렉틴-결합 단위를 포함하고, 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합된다. 특정 실시양태에서, 방법은 글리칸을 활성화제와 접촉시켜, 적어도 1개의 활성화된 카르복실산 모이어티를 갖는 활성화된 글리칸을 제공하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 카르보닐 기와 글리칸 상의 히드라지드 기 사이에 있다.
본 개시내용의 특정 측면은 첨부된 도면에서 볼 수 있다. 다음이 포함된다:
도 1a-1d는 (1a) 펩티드가 없는 비오틴-표지된 콘드로이틴 술페이트 (대조군); (1b) 산화성 당류 개환 화학 및 BMPH 링커를 통해 CS에 결합된 GAH 펩티드를 갖는 생체접합체; (1c) 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 CS에 결합된 GAH 펩티드를 갖는 생체접합체; 및 (1d) 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 CS에 결합된 STM 펩티드를 갖는 생체접합체에 대한 히알루론산-결합 친화도를 도시한다 (실시예 5 참고).
도 2는 시간에 따른 eDS-SILY (본원에 기재된 생체접합체) 대 oxDS-SILY (산화된 글리칸을 이용하여 합성된 생체접합체)의 안정성을 도시한다 (실시예 11 참고).
본 개시내용이 기재된 특별한 실시양태로 제한되지 않으며, 따라서 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특별한 실시양태를 기재하기 위한 목적이며 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
1. 정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속한 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것임을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "펩티드"에 대한 기재는 다수개의 펩티드들을 포함한다.
본원에 사용된 하기 용어 및 약어들은 다음과 같은 의미를 갖는다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본원에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는, 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만 다른 것들을 배제하는 것은 아님을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우 "로 본질적으로 이루어진"은 명시된 목적을 위해 조합에 대해 임의의 본질적으로 유의한 다른 요소는 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 요소로 본질적으로 이루어지는 조성물은 청구된 기본적인 신규한 특성(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계는 배제하지 않을 것이다. "로 이루어진"은 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미미하지 않은 요소는 배제하는 것을 의미한다. 이들 이행 용어들 각각에 의해 정의된 실시양태는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
용어 "약"은 범위를 비롯한 수치적 명칭, 예를 들어 온도, 시간, 양 및 농도, 예컨대 범위 앞에 사용될 때 (+) 또는 (-) 10%, 5% 또는 1%만큼 달라질 수 있는 근사치를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "생체접합체", "펩티도글리칸", 및 "프로테오글리칸", 및 "합성 프로테오글리칸"은 상호 교환적으로 사용되고, 글리칸 및 그에 공유 결합된 하나 이상의 펩티드를 포함하는 합성 접합체를 지칭한다. 글리칸 부분은 합성에 의해 제조되거나 또는 동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 펩티드는 히드라지드-카르보닐 연결 (즉, -C(O)-NH-NH-C(O)-)을 통해 글리칸에 공유 결합된다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 다른 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 카르보닐 기와 글리칸 상의 히드라지드 기 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 용어 생체접합체는 펩티도글리칸을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "글리칸"은 글리코시드에 의해 연결된 수많은 단당류를 갖는 화합물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 글리칸은 우론산과 교대 방식으로 연결된 2-아미노당을 포함하고 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴, 케라틴 및 데르마탄과 같은 중합체를 포함하는 글리코사미노글리칸 (GAG)이다. 따라서, 본원에 기재된 실시양태에서 사용될 수 있는 글리칸에는 알기네이트, 아가로스, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트 (CS), 데르마탄, 데르마탄 술페이트 (DS), 헤파란 술페이트, 헤파린 (Hep), 케라틴, 케라탄 술페이트, 및 히알루론산 (HA), 예컨대 이들의 유도체가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 글리칸의 분자량을 변화시켜 생체접합체의 효능을 조정한다 (예를 들어, Radek, K. A., et al., Wound Repair Regen., 2009, 17: 118-126; 및 Taylor, K. R., et al., J. Biol. Chem., 2005, 280:5300-5306 참고). 한 실시양태에서, 글리칸은 산화 및 알칼리성 제거에 의해 분해되어 (예를 들어, Fransson, L. A., et al., Eur. J. Biochem., 1980, 106 :59-69 참고), 보다 적은 분자량 (예를 들어, 약 10 kDa 내지 약 50 kDa)을 갖는 분해된 글리칸을 생성한다. 일부 실시양태에서, 글리칸은 개질되지 않는다. 특정 실시양태에서, 글리칸은 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않고 함유하지 않았다. 특정 실시양태에서, 글리칸은 유도체화된다.
본원에 사용된 용어 "유도체화된 글리칸"은 글리칸의 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 유도체화된 글리칸은 하나 이상의 화학적 유도체화, 예컨대 이로 제한되지 않지만 부분적으로 N-탈술페이트화된 유도체, 부분적으로 O-탈술페이트화된 유도체 및/또는 부분적으로 O-카르복시메틸화된 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용된 용어 "헤파린"은 헤파린 및 그의 유도체, 예컨대 이로 제한되지 않지만 부분적으로 N- 및/또는 부분적으로 O-탈술페이트화된 헤파린 유도체, 부분적으로 O-카르복시메틸화된 헤파린 유도체, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 산화되지 않은 헤파린이고 (즉, 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않음), 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "결합된" 및 "공유 결합된"은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 두 원자에 의해 하나 이상의 전자쌍을 공유하는 것을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 펩티드 서열은 스페이서를 통해 글리칸에 결합된다. 본원에 사용된 용어 "스페이서"는 결합 단위 또는 펩티드를 히드라지드-카르보닐 결합에 연결시키는 생체접합체의 임의적인 부분을 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 펩티드는 1 내지 약 5개 아미노산을 포함하는 스페이서 서열을 가질 수 있다. 임의의 천연 또는 비천연 아미노산이 스페이서 서열에서 사용될 수 있으며, 단 스페이서 서열은 펩티드의 의도된 결합을 유의하게 방해하지 않는 것으로 고려된다. 예시적인 스페이서에는 1 내지 5개 글리신 단위 (예를 들어, G, GG, GGG, GGGG, 또는 GGGGG)를 포함하고, 임의적으로 시스테인 (예를 들어, GC, GCG, GSGC, 또는 GGC) 및/또는 세린 (예를 들어, GSG, SGG, 또는 GSGSG)을 포함하거나, 또는 1 내지 5개 아르기닌 단위 (예를 들어, R, RR, RRR 등)를 포함하는 짧은 서열이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 스페이서는 또한 비-아미노산 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 6-아미노헥산산, 숙신산, 또는 이들의 조합을 추가의 아미노산 스페이서와 함께 또는 없이 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 서열은 추가로 GSG-NHNH2 모이어티를 포함한다. 전형적으로, GSG-NHNH2 모이어티는 C- 또는 N-말단에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 생체접합체는 콜라겐에 직접적으로 또는 간접적으로 결합한다. 본원에 사용된 용어 "결합" 또는 "결합한다"는 예를 들어 혼성화 검정, 표면 플라즈몬 공명, ELISA, 경쟁적 결합 검정, 등온 적정 열량법, 파지 디스플레이, 친화도 크로마토그래피, 유동학 또는 면역조직화학을 이용하여 검출될 수 있는 분자간 상호작용을 포함하는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한 분자간 "결합" 상호작용을 포함하는 것으로 의도된다. 결합은 "직접적" 또는 "간접적"일 수 있다. "직접적인" 결합은 분자간의 직접적인 물리적 접촉을 포함한다. 분자간의 "간접적인" 결합은 하나 이상의 분자와 직접적인 물리적 접촉을 동시에 갖는 분자를 포함한다. 이 결합은 상호작용 분자를 포함하는 "복합체"를 형성할 수 있다. "복합체"는 공유 또는 비공유 결합, 상호작용 또는 힘에 의해 함께 유지되는 2개 이상의 분자의 결합을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "펩티드" 및 "펩티드 서열"은 펩티드 (또는 아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산의 선형 또는 분지형 쇄를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, 펩티드는 약 3 내지 약 120개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 110개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 90개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 80개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 70개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 60개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 50개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 40개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 120개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 90개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 80개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 70개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 60개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 50개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 40개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 30개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 10개 아미노산을 포함한다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 펩티드 (또는 결합 단위)는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함함으로써 개질될 수 있다. 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 펩티드 중 임의의 비-결정적 아미노산을 보존적 치환에 의해 변경하는 것은, 교체 아미노산의 측쇄가 교체된 아미노산의 측쇄와 유사한 결합 및 접촉을 형성할 수 있어야 하기 때문에, 펩티드의 활성을 유의하게 변경시키지 않는다. 비보존적 치환 또한 가능하며, 단 이는 펩티드의 결합 친화도 (즉, 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM 결합 친화도)에 유의한 영향을 미치지 않는다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 두 펩티드 사이에 또는 두 핵산 분자 사이에 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 동일성의 수준을 지칭한다. 비교한 서열 중 소정의 부분이 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유된 경우, 분자는 해당 부분에서 동일하다. 펩티드 (또는 폴리펩티드 또는 펩티드 영역)이 또 다른 서열과 특정한 백분율 (예를 들어, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%)의 "서열 동일성"을 갖는다는 것은, 정렬시 두 서열을 비교하면 해당 백분율의 염기 (또는 아미노산)가 동일하다는 것을 의미한다. 본원에 개시된 임의의 서열 ("기준 서열")의 경우, 기준 서열과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열 또한 본 개시내용의 범위 내에 있음을 주목해야 한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 또한 기준 서열과 비교시 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 명시된 하나 이상의 서열에서, 서열은 각각으로부터 1, 2 또는 3개 아미노 부가, 결실 및/또는 치환을 가짐으로써 개질될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포외 매트릭스"는 주변 세포에 대해 구조적 및 생화학적 지지를 제공하는 조직의 세포외 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조성물"은 적어도 1종의 제약 활성 성분, 예컨대 그의 임의의 고체 형태를 함유하는 치료 목적을 위해 의도된 환자에게 투여하기에 적합한 제조물을 지칭한다. 조성물은 화합물의 개선된 제제를 제공하기 위한 적어도 1종의 제약상 허용가능한 성분, 예컨대 적합한 담체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 필름, 겔, 패치 또는 액체 용액으로서 제제화된다. 본원에 사용된 용어 "국소"는 국부적 효과를 위해 치료되는 조직 및/또는 장기의 표면 (내부 또는 일부 경우에는 외부)에 조성물을 비전신적으로 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용가능한"은, 합리적으로 신중한 의사가 사용되는 양 및/또는 치료되는 질환 또는 상태 및 각각의 투여 경로를 고려하여 환자에게로의 투여를 회피하게 하는 성질을 지정된 물질이 갖지 않는 것을 나타낸다. 전형적인 제약상 허용가능한 물질은 본질적으로 멸균성이다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용가능한 담체"는, 임의의 보충물 또는 조성물, 또는 그의 성분을 한 장기 또는 신체 일부로부터 또 다른 장기 또는 신체 일부로 운반 또는 수송하는 것과 관련된 또는 정맥의 내부 표면으로 작용제를 전달하기 위한, 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "제제화된" 또는 "제제화"는 1종 이상의 제약 활성 성분을 비롯한 상이한 화학 물질을 합하여 투여 형태를 제공하는 절차를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 제약 활성 성분을 단일 투여 형태 또는 조합된 투여 단위로 공동 제제화할 수 있거나 또는 조합된 투여 단위로 별도로 및 순차적으로 제제화할 수 있다. 서방형 제제는 연장된 시간에 걸쳐 신체에 치료제를 천천히 방출하도록 고안된 제제인 반면에, 속방형 제제는 단기간에 걸쳐 신체에 치료제를 신속히 방출하도록 고안된 제제이다.
본원에 사용된 용어 "전달"은 그의 목적하는 치료 효과를 안전하게 달성하기 위해 필요에 따라 신체에서 제약 조성물을 수송하기 위한 경로, 접근법, 제제, 기술 및 시스템을 지칭한다. 전달 경로는 임의의 적합한 경로, 예컨대 이로 제한되지 않지만, 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피부, 피하, 경피, 피내 및 표피내 경로일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "용액"은 관련 기술분야에 널리 공지된 용액, 현탁액, 에멀젼, 점적제, 연고, 액체 세정제, 스프레이 및 리포좀을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 액체 용액은 소량의 산 또는 염기를 첨가할 때 pH 변화에 저항하는 수성 pH 완충화제를 함유한다. 특정 실시양태에서, 액체 용액은 윤활성 강화제를 함유한다.
본원에 사용된 용어 "중합체", "중합체 매트릭스" 또는 "중합체성 작용제"는 생체적합성 중합체 물질을 지칭한다. 본원에 기재된 중합체 물질은 예를 들어 당 (예컨대 만니톨), 펩티드, 단백질, 라미닌, 콜라겐, 히알루론산, 이온성 및 비이온성 수용성 중합체; 아크릴산 중합체; 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리비닐알콜; 셀룰로스성 중합체 및 셀룰로스성 중합체 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 에테르화 셀룰로스; 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 락트산과 글리콜산의 공중합체, 또는 다른 중합체성 작용제, 천연 및 합성 둘 다를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 중합체성 매트릭스는 흡수성이며, 예를 들어 콜라겐, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리디옥산 및 카프로락톤이다. 본원에 사용된 용어 "흡수성"은 물질이 체내에 흡수되는 능력을 지칭한다. 다른 실시양태에서, 중합체는 비흡수성이며, 예를 들어 폴리프로필렌, 폴리에스테르 또는 나일론이다.
본원에 사용된 용어 "pH 완충화제"는 소량의 산 또는 염기를 첨가하였을 때 pH 변화에 저항하는 수성 완충제 용액을 지칭한다. pH 완충 용액은 전형적으로 약산 및 그의 짝염기의 혼합물 또는 그 반대를 포함한다. 예를 들어, pH 완충 용액은 인산염, 예컨대 인산나트륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소나트륨 이수화물, 인산수소이나트륨, 인산수소이나트륨 12수화물, 인산칼륨, 인산이수소칼륨 및 인산수소이칼륨; 붕산 및 붕산염, 예컨대, 붕산나트륨 및 붕산칼륨; 시트르산 및 시트르산염, 예컨대 시트르산나트륨 및 시트르산이나트륨; 아세트산염, 예컨대 아세트산나트륨 및 아세트산칼륨; 탄산염, 예컨대 탄산나트륨 및 탄산수소나트륨 등을 포함할 수 있다. pH 조정제는 예를 들어 산, 예컨대 염산, 락트산, 시트르산, 인산 및 아세트산, 및 알칼리성 염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨 및 탄산수소나트륨 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, pH 완충화제는 인산염 완충된 염수 (PBS) 용액 (즉, 인산나트륨, 염화나트륨 및 일부 제제에서는 염화칼륨 및 인산칼륨을 함유함)이다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 혈관 손상 또는 중재술 이전에, 동안에 및/또는 이후에 질환 또는 장애의 하나 이상의 임상적 증상을 예방, 치유, 역전, 감쇠, 완화, 최소화, 억제, 저해 및/또는 정지시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "동시에"는 동시에 (즉, 함께) 투여하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 투여는 2종 이상의 제약 활성 성분, 예컨대 그의 임의의 고체 형태가 동시에 함께 전달되도록 공동투여한다.
본원에 사용된 용어 "순차적으로"는 별도로 (즉, 상이한 시간에) 투여하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 투여는 2종 이상의 제약 활성 성분, 예컨대 그의 임의의 고체 형태가 상이한 시간에 별도로 전달되도록 시차를 두는 것이다.
콜라겐-결합 펩티드
"콜라겐-결합 펩티드"는 하나 이상의 콜라겐-결합 단위 (또는 서열)를 갖는 1 내지 약 120개 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 본원에 사용된 용어 "콜라겐-결합 단위"는 콜라겐에 결합된 펩티드 내의 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. "콜라겐-결합"은, 화합물이 콜라겐과 우호적으로 결합 또는 상호작용하도록, 소수성, 이온성 (전하) 및/또는 반 데르 발스 상호작용을 포함할 수 있는, 콜라겐과의 상호작용을 지칭한다. 이 결합 (또는 상호작용)은, 콜라겐 상에서 펩티드가 결합하는 관능기를 함유하는 임의의 종과 펩티드가 상호작용하도록, 일반적인 관능기와의 공유 결합 및 비특이적 상호작용과는 차별화되는 것으로 의도된다. 펩티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 콜라겐에 대한 결합을 시험 및 평가할 수 있다. 예를 들어, Li, Y., et al., Current Opinion in Chemical Biology, 2013, 17: 968-975, Helmes, B.A., et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 11683-11685, 및 Petsalaki, E., et al., PLoS Comput Biol, 2009, 5(3): e1000335를 참고한다. 한 실시양태에서, 펩티드, 또는 펩티드의 콜라겐-결합 단위는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 콜라겐에 결합한다.
펩티드는 콜라겐 원섬유형성과 정상적으로 관련된 또는 정상적으로 관련되지 않은 단백질의 일부분과 아미노산 상동성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 펩티드는 소형 류신-풍부 생체접합체의 아미노산 서열, 혈소판 수용체 서열, 또는 콜라겐 원섬유형성을 조절하는 단백질과 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 펩티드는 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호(SEQ ID NO): 1), GELYKSILY (서열식별번호: 2), RRANAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 3), GELYKCILY (서열식별번호: 4), RLDGNEIKR (서열식별번호: 5), AHEEISTTNEGVM (서열식별번호: 6), NGVFKYRPRYFLYKHAYFYPPLKRFPVQ (서열식별번호: 7), CQDSETRTFY (서열식별번호: 8), TKKTLRT (서열식별번호: 9), GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM (서열식별번호: 10), SQNPVQP (서열식별번호: 11), SYIRIADTNIT (서열식별번호: 12), KELNLVYT (서열식별번호: 13), GSIT (서열식별번호: 14), GSITTIDVPWNV (서열식별번호: 15), GQLYKSILY (서열식별번호: 16), RRANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 17)로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 콜라겐에 결합할 수 있는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, Chiang, T.M., et al. J. Biol. Chem., 2002, 277: 34896-34901, Huizinga, E.G. et al., Structure, 1997, 5: 1147-1156, Romijn, R.A., et al., J. Biol. Chem., 2003, 278: 15035-15039, 및 Chiang, et al., Cardio. & Haemato. Disorders-Drug Targets, 2007, 7: 71-75 (각각 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 펩티드는 폰 빌레브란트 인자 (vWF) 또는 혈소판 콜라겐 수용체의 콜라겐-결합 도메인(들)과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 비제한적인 예는 vWF로부터 유래된 WREPSFCALS (서열식별번호: 18)이다.
콜라겐-결합 친화도 (또는 콜라겐-결합 도메인/단위)에 대해 펩티드 서열을 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에서는 일상적이다. 본원에 개시된 생체접합체 및 방법에 사용될 수 있는 콜라겐-결합 친화도 (또는 콜라겐-결합 단위)를 갖는 것으로 공지된 다른 펩티드 서열에는 βAWHCTTKFPHHYCLYBip (서열식별번호: 19), βAHKCPWHLYTTHYCFTBip (서열식별번호: 20), βAHKCPWHLYTHYCFT (서열식별번호: 21) 등 (여기서, Bip는 비페닐알라닌이고, βA는 베타-알라닌임) (Abd-Elgaliel, W.R., et al., Biopolymers, 2013, 100(2), 167-173 참고), GROGER (서열식별번호: 22), GMOGER (서열식별번호: 23), GLOGEN (서열식별번호: 24), GLOGER (서열식별번호: 25), GLKGEN (서열식별번호: 26), GFOGERGVEGPOGPA (서열식별번호: 27) 등 (여기서, O는 4-히드록시프롤린임) (Raynal, N., et al., J. Biol. Chem., 2006, 281(7), 3821-3831 참고), HVWMQAPGGGK (서열식별번호: 28) (Helms, B.A., et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 11683-11685 참고), WREPSFCALS (서열식별번호: 18) (Takagi, J., et al., Biochemistry, 1992, 31, 8530-8534 참고), WYRGRL (서열식별번호: 29) 등 (Rothenfluh D.A., et al., Nat Mater. 2008, 7(3), 248-54 참고), WTCSGDEYTWHC (서열식별번호: 30), WTCVGDHKTWKC (서열식별번호: 31), QWHCTTRFPHHYCLYG (서열식별번호: 32) 등 (U.S. 2007/0293656 참고), STWTWNGSAWTWNEGGK (서열식별번호: 33), STWTWNGTNWTRNDGGK (서열식별번호: 34) 등 (WO/2014/059530 참고), CVWLWEQC (서열식별번호: 35), 시클릭 CVWLWENC (서열식별번호: 36), 시클릭 CVWLWEQC (서열식별번호: 35), (Depraetere H., et al., Blood. 1998, 92, 4207-4211, 및 Duncan R., Nat Rev Drug Discov, 2003, 2(5), 347-360 참고), CMTSPWRC (서열식별번호: 37) 등 (Vanhoorelbeke, K., et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 37815-37821 참고), CPGRVMHGLHLGDDEGPC (서열식별번호: 38) (Muzzard, J., et al., PLoS one. 4 (e 5585) I- 10 참고), KLWLLPK (서열식별번호: 39) (Chan, J. M., et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2010, 107, 2213- 2218 참고), 및 CQDSETRTFY (서열식별번호: 8) 등 (U.S. 2013/0243700 참고), H-V-F/W-Q/ M-Q-P/A-P/K (Helms, B.A., et al., J. Am. Chem. Soc., 2009, 131(33), 11683-11685) (상기 각각은 전문이 본원에 참고로 포함됨)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에 개시된 생체접합체 및 방법에 사용될 수 있는 콜라겐-결합 친화도 (또는 콜라겐-결합 단위)를 갖는 것으로 공지된 추가의 펩티드 서열에는 LSELRLHEN (서열식별번호: 40), LTELHLDNN (서열식별번호: 41), LSELRLHNN (서열식별번호: 42), LSELRLHAN (서열식별번호: 43), 및 LRELHLNNN (서열식별번호: 44) (Fredrico, S., Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 37, 10980-10984 참고)가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 펩티드는 RVMHGLHLGDDE (서열식별번호: 45), D-아미노산 EDDGLHLGHMVR (서열식별번호: 46), RVMHGLHLGNNQ (서열식별번호: 47), D-아미노산 QNNGLHLGHMVR (서열식별번호: 48), RVMHGLHLGNNQ (서열식별번호: 47), GQLYKSILYGSG-4K2K (서열식별번호: 49) (4-분지 펩티드), GSGQLYKSILY (서열식별번호: 50), GSGGQLYKSILY (서열식별번호: 51), KQLNLVYT (서열식별번호: 52), KELNVYT (서열식별번호: 53), CVWLWQQC (서열식별번호: 54), WREPSFSALS (서열식별번호: 55), GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR (서열식별번호: 56), 및 GHRPLNKKRQQAPSLRPAPPPISGGGYR (서열식별번호: 57)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
콜라겐-결합 펩티드와 유사하게, 콜라겐에 대해 선택된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 펩티드가 생성될 수 있다. 상기 펩티드는 SPR, ELISA, ITC, 친화도 크로마토그래피와 같은 임의의 기술, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 기술에 의해 콜라겐으로의 결합에 대해 합성 및 평가할 수 있다. 한 예는 고정된 콜라겐을 함유하는 마이크로플레이트 상에서 인큐베이션한 비오틴 개질된 펩티드 서열 (예를 들어, SILY비오틴)일 수 있다. 스트렙타비딘-발색단을 이용하여 용량 반응 결합 곡선을 생성하여, 펩티드가 콜라겐에 결합하는 능력을 측정할 수 있다.
한 실시양태에서, 펩티드는 콜라겐 유형 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII 또는 XIV 중 임의의 하나 이상에 결합하는 하나 이상의 콜라겐-결합 단위를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 유형 I 콜라겐에 결합한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 유형 II 콜라겐에 결합한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 유형 III 콜라겐에 결합한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 유형 IV 콜라겐에 결합한다.
히알루론산-결합 펩티드
"히알루론산-결합 펩티드"는 하나 이상의 콜라겐-결합 단위 (또는 서열)를 갖는 1 내지 약 120개 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 본원에 사용된 "히알루론산-결합 단위"는 히알루론산에 결합하는 펩티드 내의 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. "히알루론산-결합"은, 화합물이 히알루론산과 우호적으로 결합 또는 상호작용하도록, 소수성, 이온성 (전하) 및/또는 반 데르 발스 상호작용을 포함할 수 있는, 히알루론산과의 상호작용을 나타낸다. 이 결합 (또는 상호작용)은, 히알루론산 상에서 펩티드가 결합하는 관능기를 함유하는 임의의 종과 히알루론산-결합 펩티드가 상호작용하도록, 일반적인 관능기와의 공유 결합 및 비특이적 상호작용과는 차별화되는 것으로 의도된다. 예를 들어, Becerra, S.P., et al. J. Biol. Chem., 2008, 283: 33310-33320을 참고한다. 한 실시양태에서, 펩티드, 또는 히알루론산-결합 단위는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 히알루론산에 결합한다.
특정 실시양태에서, 합성 생체접합체의 히알루론산-결합 단위는 히알루노난-매개 운동성 수용체 (RHAMM)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (예시적인 서열에는 NP_001136028, NP_001136029, NP_036616, 및 NP_036617이 포함되나, 이로 제한되지 않음).
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 합성 생체접합체의 히알루론산-결합 펩티드 성분은 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58), STMMSRSHKTRSHHV (서열식별번호: 59), TMTRPHFHKRQLVLS (서열식별번호: 60), STMMSRSHKTRSCHH (서열식별번호: 61), STMMSRSHKTRSHH (서열식별번호: 62), GDRRRRRMWHRQ (서열식별번호: 63), GKHLGGKHRRSR (서열식별번호: 64), RGTHHAQKRRS (서열식별번호: 65), RRHKSGHIQGSK (서열식별번호: 66), SRMHGRVRGRHE (서열식별번호: 67), RRRAGLTAGRPR (서열식별번호: 68), RYGGHRTSRKWV (서열식별번호: 69), RSARYGHRRGVG (서열식별번호: 70), GLRGNRRVFARP (서열식별번호: 71), SRGQRGRLGKTR (서열식별번호: 72), DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR (서열식별번호: 73), AGPVEFPDRKIKGRR (서열식별번호: 74), RMRRKGRVKHWG (서열식별번호: 75), RGGARGRHKTGR (서열식별번호: 76), TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR (서열식별번호: 77), RQRRRDLTRVEG (서열식별번호: 78), STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR (서열식별번호: 79), RRIGHQVGGRRN (서열식별번호: 80), RLESRAAGQRRA (서열식별번호: 81), GGPRRHLGRRGH (서열식별번호: 82), VSKRGHRRTAHE (서열식별번호: 83), RGTRSGSTR (서열식별번호: 84), RRRKKIQGRSKR (서열식별번호: 85), RKSYGKYQGR (서열식별번호: 86), KNGRYSISR (서열식별번호: 87), RRRCGQKKK (서열식별번호: 88), KQKIKHVVKLK (서열식별번호: 89), KLKSQLVKRK (서열식별번호: 90), RYPISRPRKR (서열식별번호: 91), KVGKSPPVR (서열식별번호: 92), KGRYSISR (서열식별번호: 93), RRRCGQKK (서열식별번호: 94), KTFGKMKPR (서열식별번호: 95), RIKWSRVSK (서열식별번호: 96) 및 KRTMRPTRR (서열식별번호: 97)로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 히알루론산에 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
히알루론산-결합 합성 생체접합체의 펩티드 성분으로서 포함될 수 있는 추가의 펩티드에는 Arg-Arg (R-R) 모티프를 갖는 펩티드, 예컨대 RRASRSRGQVGL (서열식별번호: 98), GRGTHHAQKRRS (서열식별번호: 99), QPVRRLGTPVVG (서열식별번호: 100), ARRAEGKTRMLQ (서열식별번호: 101), PKVRGRRHQASG (서열식별번호: 102), SDRHRRRREADG (서열식별번호: 103), NQRVRRVKHPPG (서열식별번호: 104), RERRERHAVARHGPGLERDARNLARR (서열식별번호: 105), TVRPGGKRGGQVGPPAGVLHGRRARS (서열식별번호: 106), NVRSRRGHRMNS (서열식별번호: 107), DRRRGRTRNIGN (서열식별번호: 108), KTAGHGRRWSRN (서열식별번호: 109), AKRGEGRREWPR (서열식별번호: 110), GGDRRKAHKLQA (서열식별번호: 111), RRGGRKWGSFEG (서열식별번호: 112), 및 RQRRRDLTRVEG (서열식별번호: 78)로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 (예를 들어, Amemiya et al., Biochem. Biophys. Acta, 2005, 1724, 94-99 참고, 본원에 참고로 포함됨); 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 히알루론산에 결합할 수 있는 서열이 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드는 RDGTRYVQKGEYR (서열식별번호: 113), HREARSGKYK (서열식별번호: 114), PDKKHKLYGV (서열식별번호: 115), 및 WDKERSRYDV (서열식별번호: 116) (예를 들어, Yang, B., et al., EMBO Journal, 1994, 13, 286-296, 및 Goetinck, P.F. et al., J. Cell. Biol, 1987, 105, 2403-2408 참고, 둘 다 본원에 참고로 포함됨); 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 히알루론산에 결합할 수 있는 서열로부터 선택된다.
펩티드는 또한 히알루론산으로의 결합에 대한 양성 선택을 이용하여 파지 디스플레이에 의해 선택될 수 있다. 히알루론산-결합 펩티드는 히알루론산과의 상호작용에 의해 결정될 수 있고, 분자 상호작용을 평가하기 위해 사용되는 임의의 기술 (예컨대, 표면 플라즈몬 공명, ELISA, 경쟁적 결합 검정, 등온 적정 열량법, 친화도 크로마토그래피, 유동학 및/또는 면역조직화학)에 의해 측정될 수 있다. "히알루론산-결합"으로 고려되는 펩티드는, 상호작용이 공지된 화학적 반응성 기로 인한 것이 아니도록 히알루론산 또는 히알루론산-함유 조직과 상호작용할 수 있다. 상기 상호작용은 펩티드의 아미노산 잔기로부터 생성된 소수성 및 전하 상호작용으로 인한 것일 수 있다. 상기 상호작용은 마이크로플레이트 상에 히알루론산을 고정시키고, 히알루론산-결합 펩티드와 함께 인큐베이션한 후, 발색단을 사용하는 비오틴-아비딘과 같은 검출 기술에 의해 측정할 수 있다. 상기 상호작용은 또한 히알루론산-결합 펩티드와 함께 또는 히알루론산-결합 펩티드 또는 펩티드들을 함유하는 합성 생체접합체와 함께 인큐베이션한 히알루론산-함유 액체, 겔 또는 조직 상에서 기계적 영향에 의해 측정할 수 있다.
펩티드를 확인하기 위해, 파지 디스플레이로부터 선택된 펩티드, 또는 단백질 중 히알루론산-결합 모티프로부터 확인된 펩티드를 히알루론산과의 상호작용에 대해 합성 및 평가할 수 있다. 예를 들어, B-X7-B 서열을 N-말단에서 비오틴 개질에 의해 합성하고, 히알루론산 코팅된 마이크로플레이트 상에서 인큐베이션할 수 있다. 용량 반응 결합 곡선을 생성하여, 펩티드가 히알루론산에 결합하는 능력을 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 펩티드는 약 3 내지 약 120개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 110개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 90개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 80개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 70개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 60개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 50개 아미노산, 또는 약 3 내지 약 40개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 120개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 90개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 80개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 70개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 60개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 50개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 40개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 30개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 5 내지 약 10개 아미노산을 포함한다.
ICAM , VCAM 및 셀렉틴 -결합 펩티드
"ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 결합 펩티드"는 하나 이상의 콜라겐-결합 단위 (또는 서열)를 갖는 1 내지 약 120개 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 본원에 사용된 용어 "ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 결합 단위"는 ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 수용체 중 하나 이상에 결합하는 펩티드 내의 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 결합은, 화합물이 ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 수용체와 우호적으로 결합 또는 상호작용하도록, 소수성, 이온성 (전하) 및/또는 반 데르 발스 상호작용을 포함할 수 있는, ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 수용체와의 상호작용을 나타낸다. 이 결합 (또는 상호작용)은, ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 수용체 상에서 펩티드가 결합하는 관능기를 함유하는 임의의 종과 ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 결합 펩티드 또는 단위와 상호작용하도록, 일반적인 관능기와의 공유 결합 및 비특이적 상호작용과는 차별화되는 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 결합 단위는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 수용체에 결합한다.
셀렉틴에 결합할 수 있는 유용한 펩티드의 예에는 하기 펩티드 서열 (또는 단위)가 포함된다: IELLQAR (서열식별번호: 117), IELLQARGSC (서열식별번호: 118), IDLMQAR (서열식별번호: 119), IDLMQARGSC (서열식별번호: 120), QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 121), QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 122), 및 이들의 조합. 셀렉틴은 S-, P- 또는 E-셀렉틴일 수 있다. E-셀렉틴-결합 친화도 (또는 E-셀렉틴-결합 단위)에 대해 펩티드 서열을 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에서는 일상적이다 (예를 들어, Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136; 및 Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888 참고).
본원에 개시된 생체접합체 및 방법에서 사용될 수 있는 E-셀렉틴-결합 친화도 (또는 E-셀렉틴-결합 단위)를 갖는 것으로 밝혀진 다른 펩티드 서열에는 LRRASLGDGDITWDQLWDLMK (서열식별번호: 123), HITWDQLWNVMN (서열식별번호: 124), QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 121), YGNSNITWDQLWSIMNRQTT (서열식별번호: 125), WTDTHITWDQLWHFMNMGEQ (서열식별번호: 126), EPWDQITWDQLWIIMNNGDG (서열식별번호: 127), HITWDQLWLMMS (서열식별번호: 128), DLTWEGLWILMT (서열식별번호: 129), RGVWGGLWSMTW (서열식별번호: 130), DYSWHDLWFMMS (서열식별번호: 131), KKEDWLALWRIMSVPDEN (서열식별번호: 132), RNMSWLELWEHMK (서열식별번호: 133), KEQQWRNLWKMMS (서열식별번호: 134), SQVTWNDLWSVMNPEVVN (서열식별번호: 135) 및 RSLSWLQLWDWMK (서열식별번호: 136) (예를 들어, Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136 참고), DITWDQLWDLMK (서열식별번호: 137) (예를 들어, Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888 참고), DITWDELWKIMN (서열식별번호: 138), DYTWFELWDMMQ (서열식별번호: 139), DMTHDLWLTLMS (서열식별번호: 140), EITWDQLWEVMN (서열식별번호: 141), HVSWEQLWDIMN (서열식별번호: 142), HITWDQLWRIMT (서열식별번호: 143), DISWDDLWIMMN (서열식별번호: 144), QITWDQLWDLMY (서열식별번호: 145), RNMSWLELWEHMK (서열식별번호: 133), AEWTWDQLWHVMNPAESQ (서열식별번호: 146), HRAEWLALWEQMSP (서열식별번호: 147), KKEDWLALWRIMSV (서열식별번호: 148), KRKQWIELWNIMS (서열식별번호: 149), WKLDTLDMIWQD (서열식별번호: 150) 및 HITWDQLWNVMLRRAASLG (서열식별번호: 151) (예를 들어, Simanek, E. E. Chem. Rev. 1998, 98, 833-862 참고), 또는 이들의 조합 (상기 각각의 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함됨)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
ICAM-결합 친화도 (또는 ICAM-결합 단위)에 대해 펩티드 서열을 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에서는 일상적이다 (예를 들어, Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136; 및 Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888 참고). ICAM과 결합할 수 있는 유용한 펩티드 서열에는 NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 152), NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 153), ITDGEA (서열식별번호: 154), ITDGEAGSC (서열식별번호: 155), DGEATD (서열식별번호: 156), DGEATDGSC (서열식별번호: 157), 및 이들의 조합이 포함된다.
본원에 개시된 생체접합체 및 방법에서 사용될 수 있는 ICAM-결합 친화도 (또는 ICAM-결합 단위)를 갖는 것으로 밝혀진 다른 다른 펩티드 서열에는 EWCEYLGGYLRYCA (서열식별번호: 158) (예를 들어, Welply, J. K. et al. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 1996, 26(3): 262-270 참고), FEGFSFLAFEDFVSSI (서열식별번호: 159) (예를 들어, 미국 공보 번호 WO2014059384 참고), NNQKIVNLKEKVAQLEA (서열식별번호: 160), NNQKIVNIKEKVAQIEA (서열식별번호: 161), NNQKLVNIKEKVAQIEA (서열식별번호: 162), YPASYQR (서열식별번호: 163), YQATPLP (서열식별번호: 164), GSLLSAA (서열식별번호: 165), FSPHSRT (서열식별번호: 166), YPFLPTA (서열식별번호: 167) 및 GCKLCAQ (서열식별번호: 168) (예를 들어, 미국 특허 8,926,946 참고), GGTCGGGGTGAGTTTCGTGGTAGGGATAATTCTGTTTGGGTGGTT (서열식별번호: 169), EWCEYLGGYLRCYA (서열식별번호: 170) (예를 들어, Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888 참고), GRGEFRGRDNSVSVV (서열식별번호: 171) (예를 들어, 중국 공보 번호 CN1392158 참고), QTSVSPSKVI (서열식별번호: 172), PSKVILPRGG (서열식별번호: 173), LPRGGSVLVTG (서열식별번호: 174), 및 QTSVSPSKVILPRGGSVLVTG (서열식별번호: 175) (예를 들어, Tibbetts, S. A. et al. Peptides 21 -2000 1161-1167 참고), 및 이들의 조합 (상기 각각의 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함됨)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
VCAM-결합 친화도 (또는 VCAM-결합 단위)에 대해 펩티드 서열을 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에서는 일상적이다 (예를 들어, Martens, C. L. et al. J. Biol. Chem. 1995, 270(36), 21129-21136; 및 Koivunen, E. et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, 883-888 참고). 본원에 개시된 생체접합체 및 방법에 사용될 수 있는 VCAM-결합 친화도 (또는 VCAM-결합 단위)를 갖는 것으로 밝혀진 다른 펩티드 서열에는 YRLAIRLNER (서열식별번호: 176), YRLAIRLNERRENLRIALRY (서열식별번호: 177) 및 RENLRIALRY (서열식별번호: 178) (예를 들어, EP 공보 번호 EP1802352 참고), 및 이들의 조합 (상기 각각의 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함됨)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 서열은 임의의 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산)이 그로부터 부가, 결실 또는 치환되도록 개질될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 임의의 하나 이상의 아미노산이 알라닌으로 교체되도록 개질된다. 일부 실시양태에서, 서열은 임의의 하나 이상의 l-아미노산이 상응하는 d-아미노산 스캔으로 교체되도록 개질된다. 일부 실시양태에서, 서열은 임의의 하나 이상의 발린이 류신으로 교체되고, 임의의 하나 이상의 글루탐산이 글루타민으로 교체되고, 임의의 하나 이상의 아스파르트산이 아스파라긴으로 교체되고/거나 임의의 하나 이상의 아르기닌이 글루타민으로 교체되도록 개질된다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 콜라겐-결합 단위, 히알루론산-결합 단위, ICAM-결합 단위, VCAM-결합 단위 및/또는 셀렉틴-결합 단위를 갖는 펩티드는 이전의 문단들에 기재된 임의의 아미노산 서열, 또는 이들 임의의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 합성 생체접합체의 펩티드 성분은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함시킴으로써 개질될 수 있다. 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 펩티드 중 임의의 비-결정적 아미노산을 보존적 치환에 의해 변경하는 것은, 교체 아미노산의 측쇄가 교체된 아미노산의 측쇄와 유사한 결합 및 접촉을 형성할 수 있어야 하기 때문에, 펩티드의 활성을 유의하게 변경시키지 않는다.
관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 아미노산의 "보존적 치환" 또는 펩티드의 "보존적 치환 변이체"는 1) 펩티드의 이차 구조; 2) 아미노산의 전하 또는 소수성; 및 3) 측쇄의 벌크화, 또는 이들 특성들 중 임의의 하나 이상을 유지하는 아미노산 치환을 지칭한다. 예시적으로, 널리 공지된 용어 "친수성 잔기"는 세린 또는 트레오닌을 지칭한다. "소수성 잔기"는 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌 등을 지징한다. "양으로 하전된 잔기"는 리신, 아르기닌, 오르니틴, 또는 히스티딘을 지칭한다. "음으로 하전된 잔기"는 아스파르트산 또는 글루탐산을 지칭한다. "벌키 측쇄"는 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신 등을 지칭한다. 예시적인 보존적 아미노산 치환을 표 1에 열거하였다.
<표 1>
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일부 실시양태에서, 펩티드 서열은 하나 이상의 글루탐산 잔기(들)을 글루타민으로 및/또는 하나 이상의 아스파르트산 잔기(들)을 아스파라긴으로 교체하도록 개질된다.
2. 생체접합체
본원에는 글리칸, 및 -C(O)-NH-NH-C(O)- (즉, 히드라지드-카르보닐) 연결을 통해 그에 공유 결합된, 콜라겐-결합 단위 및/또는 히알루론산-결합 단위, 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM 수용체-결합 단위를 포함하는 1 내지 50개 펩티드(들)을 포함하는 생체접합체가 제공된다.
이전에는, 글리칸 상에 알데히드 결합 부위를 제공하기 위해 글리칸 골격 내의 당류 고리 중 하나 이상을 분할하는 산화 화학을 이용하여 펩티드를 글리칸, 예컨대 데르마탄 술페이트에 결합시켰다. 이어서, 알데히드 결합 부위를 사용하여 펩티드에 (예를 들어, -C(O)-NH-N=C 결합을 통해) 접합시켰다.
본원에 기재된 생체접합체는 펩티드가 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합하고, 히드라지드-카르보닐의 카르보닐 기가 글리칸 상에 존재하는 엑소시클릭 카르보닐 기라는 점에서 관련 기술분야에 공지된 것들과 구조적으로 상이하다. 엑소시클릭 카르보닐 기는 천연 글리칸에 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로 이러한 관능기를 포함하도록 글리칸을 개질시킬 수 있다. 이러한 방법은 이후에 추가로 설명된다. 본원에 개시된 생체접합체에 의해 발휘되는 유익한 효과 (예컨대, 증가된 결합 친화도)는 적어도 부분적으로 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않는 글리칸 때문일 수 있는 것으로 고려된다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 임의의 단일 단량체 단위 또는 단량체 단위 조합으로 이루어지는 중합체 골격 (예를 들어, 글리칸 이외의 생체적합성 중합체)을 포함할 수 있으며, 단 본원에 기재된 펩티드(들)이 그에 공유 결합될 수 있도록 적어도 1개 및 일부 예에서 1 내지 약 50개의 적합한 관능기가 존재한다. 중합체는 선형, 분지형이거나, 측쇄 (예를 들어, 1 내지 50개 펩티드 이외에)를 함유할 수 있다. 중합체는 중성, 양이온성, 음이온성 또는 쯔비터 이온성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 중합체는 당중합체이다. 중합체는 공중합체, 예컨대 화학식 A-B-A의 블록 공중합체일 수 있다. 이러한 중합체를 제공하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 리빙 중합이 포함된다. 한 실시양태에서, 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이다. 또 다른 실시양태에서, 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이 아니다. 특정 실시양태에서, 중합체는 글리칸 또는 나노입자가 아니다. 특정 실시양태에서, 중합체는 글리칸이다.
본원에 기재된 생체접합체의 특정 실시양태에서, 글리칸은 알기네이트, 콘드로이틴, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파란 술페이트, 헤파린, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 또는 히알루노난일 수 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트이다. 또 다른 실시양태에서, 글리칸은 헤파린이다. 약 650-700 Da의 단일 이당류 단위에서부터 약 50 kDa의 글리칸까지 다양한 분자량의 헤파린을 본원에 기재된 생체접합체에 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤파린은 약 10 내지 약 20 kDa이다. 일부 실시양태에서, 헤파린은 약 15, 또는 약 16, 또는 약 17, 또는 약 18, 또는 약 19, 또는 약 20 kDa 이하이다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 콜라겐 유형 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII 또는 XIV 중 하나 이상에 결합하는 콜라겐-결합 단위를 갖는 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 콜라겐-결합 단위는 콜라겐과 결합시 원섬유형성을 촉진 또는 억제한다. 한 실시양태에서, 콜라겐-결합 단위는 콜라겐과 결합시 원섬유형성을 촉진 또는 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 유형 I 콜라겐에 결합한다. 다른 실시양태에서, 펩티드는 유형 IV 콜라겐에 결합한다. 특정 실시양태에서, 콜라겐에 대해 특정한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 펩티드(들)이 본원에 기재된 생체접합체에 사용될 수 있다. 예를 들어, 합성 생체접합체는 유형 I 콜라겐에 대해 결합 친화도를 갖는 적어도 하나의 펩티드 및 유형 IV 콜라겐에 대해 결합 친화도를 갖는 적어도 하나의 펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드는 유형 I 콜라겐에 대해 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드는 유형 IV 콜라겐에 대해 결합 친화도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 유형 II 콜라겐에 대해 결합 친화도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 유형 III 콜라겐에 대해 결합 친화도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 1 가지가 넘는 유형의 콜라겐에 결합하고, 여기서 각각의 콜라겐 유형에 대한 상대적인 결합 친화도는 다를 수 있다. 한 실시양태에서, 콜라겐-결합 단위는 약 1 mM 미만, 또는 약 900 μM 미만, 또는 약 800 μM 미만, 또는 약 700 μM 미만, 또는 약 600 μM 미만, 또는 약 500 μM 미만, 또는 약 400 μM 미만, 또는 약 300 μM 미만, 또는 약 200 μM 미만, 또는 약 100 μM 미만의 해리 상수 (K d )로 콜라겐에 결합한다.
추가로, 본원에 기재된 생체접합체는 1개 초과의 결합 단위를 갖는 펩티드를 포함할 수 있으며, 상기 결합 단위는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 펩티드는 2개 이상의 콜라겐-결합 단위를 포함하고, 콜라겐-결합 단위들이 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드가 2개 이상의 콜라겐-결합 단위를 포함하고, 콜라겐-결합 단위들이 상이하다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 화학식 (I) 또는 (II)의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다:
(X)n-YKS-(X)m (I)
(X)n-YKC-(X)m (II)
상기 식에서,
n은 0 내지 50이고;
m은 0 내지 50이고;
각각의 X는 천연 또는 비천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, 각각의 X는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 YKSILY (서열식별번호: 179), LYKSILY (서열식별번호: 180), ELYKSILY (서열식별번호: 181), GELYKSILY (서열식별번호: 2), AGELYKSILY (서열식별번호: 182), KAGELYKSILY (서열식별번호: 183), LKAGELYKSILY (서열식별번호: 184), ALKAGELYKSILY (서열식별번호: 185), AALKAGELYKSILY (서열식별번호: 186), NAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 187), ANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 188), RANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 189), RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1), QLYKSILY (서열식별번호: 190), GQLYKSILY (서열식별번호: 16), AGQLYKSILY (서열식별번호: 191), KAGQLYKSILY (서열식별번호: 192), LKAGQLYKSILY (서열식별번호: 193), ALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 194), AALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 195), NAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 196), ANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 197), RANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 198), 및 RRANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 17)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKS 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 YKCILY (서열식별번호: 199), LYKCILY (서열식별번호: 200), ELYKCILY (서열식별번호: 201), GELYKCILY (서열식별번호: 4), AGELYKCILY (서열식별번호: 202), KAGELYKCILY (서열식별번호: 203), LKAGELYKCILY (서열식별번호: 204), ALKAGELYKCILY (서열식별번호: 205), AALKAGELYKCILY (서열식별번호: 206), NAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 207), ANAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 208), RANAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 209), RRANAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 3), QLYKCILY (서열식별번호: 210), GQLYKCILY (서열식별번호: 211), AGQLYKCILY (서열식별번호: 212), KAGQLYKCILY (서열식별번호: 213), LKAGQLYKCILY (서열식별번호: 214), ALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 215), AALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 216), NAALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 217), ANAALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 218), RANAALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 219), 및 RRANAALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 220)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKC 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 LYKS (서열식별번호: 221), ELYKS (서열식별번호: 222), GELYKS (서열식별번호: 223), AGELYKS (서열식별번호: 224), KAGELYKS (서열식별번호: 225), LKAGELYKS (서열식별번호: 226), ALKAGELYKS (서열식별번호: 227), AALKAGELYKS (서열식별번호: 228), NAALKAGELYKS (서열식별번호: 229), ANAALKAGELYKS (서열식별번호: 230), RANAALKAGELYKS (서열식별번호: 231), 및 RRANAALKAGELYKS (서열식별번호: 232)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKS 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 LYKC (서열식별번호: 233), ELYKC (서열식별번호: 234), GELYKC (서열식별번호: 235), AGELYKC (서열식별번호: 236), KAGELYKC (서열식별번호: 237), LKAGELYKC (서열식별번호: 238), ALKAGELYKC (서열식별번호: 239), AALKAGELYKC (서열식별번호: 240), NAALKAGELYKC (서열식별번호: 241), ANAALKAGELYKC (서열식별번호: 242), RANAALKAGELYKC (서열식별번호: 243), 및 RRANAALKAGELYKC (서열식별번호: 244)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKC 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 AYKS (서열식별번호: 245), RAYKS (서열식별번호: 246), LRAYKS (서열식별번호: 247), NLRAYKS (서열식별번호: 248), LNLRAYKS (서열식별번호: 249), RLNLRAYKS (서열식별번호: 250), ARLNLRAYKS (서열식별번호: 251), LARLNLRAYKS (서열식별번호: 252), ILARLNLRAYKS (서열식별번호: 253), AILARLNLRAYKS (서열식별번호: 254), EAILARLNLRAYKS (서열식별번호: 255), AEAILARLNLRAYKS (서열식별번호: 256), KAEAILARLNLRAYKS (서열식별번호: 257), GKAEAILARLNLRAYKS (서열식별번호: 258), 및 YGKAEAILARLNLRAYKS (서열식별번호: 259)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKS 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 AYKC (서열식별번호: 260), RAYKC (서열식별번호: 261), LRAYKC (서열식별번호: 262), NLRAYKC (서열식별번호: 263), LNLRAYKC (서열식별번호: 264), RLNLRAYKC (서열식별번호: 265), ARLNLRAYKC (서열식별번호: 266), LARLNLRAYKC (서열식별번호: 267), ILARLNLRAYKC (서열식별번호: 268), AILARLNLRAYKC (서열식별번호: 269), EAILARLNLRAYKC (서열식별번호: 270), AEAILARLNLRAYKC (서열식별번호: 271), KAEAILARLNLRAYKC (서열식별번호: 272), GKAEAILARLNLRAYKC (서열식별번호: 273), 및 YGKAEAILARLNLRAYKC (서열식별번호: 274)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKC 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 아미노산 서열 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58), 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 약 1 mM 미만의 해리 상수 (K d )로 히알루론산에 결합하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 아미노산 서열 STMMSRSHKTRSHHV (서열식별번호: 59), 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 약 1 mM 미만의 해리 상수 (K d )로 히알루론산에 결합하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 생체접합체는 화학식 (IA) 또는 (IIA)의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다:
(X)n-YKS-(X)m-GSG (IA)
(X)n-YKC-(X)m-GSG (IIA)
상기 식에서,
n은 0 내지 50이고;
m은 0 내지 50이고;
각각의 X는 천연 또는 비천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글리신, 이소류신, 류신, 리신 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시양태에서, 임의의 화학식 I, II, IA 및 IIA에서 n은 0 내지 약 50, 또는 0 내지 약 40, 또는 0 내지 약 30, 또는 0 내지 약 20, 또는 0 내지 약 15, 또는 0 내지 약 10, 또는 0 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 약 40, 또는 1 내지 약 30, 또는 1 내지 약 20, 또는 1 내지 약 15, 또는 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, n은 0 내지 약 50, 또는 0 내지 약 40, 또는 0 내지 약 30, 또는 0 내지 약 20, 0 내지 약 15, 또는 0 내지 약 10, 또는 0 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
일부 실시양태에서, 임의의 화학식 I, II, IA 및 IIA에서 m은 0 내지 약 50, 또는 0 내지 약 40, 또는 0 내지 약 30, 또는 0 내지 약 20, 또는 0 내지 약 15, 또는 0 내지 약 10, 또는 0 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, m은 1 내지 약 50, 또는 1 내지 약 40, 또는 1 내지 약 30, 또는 1 내지 약 20, 또는 1 내지 약 15, 또는 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, m은 0 내지 약 50, 또는 0 내지 약 40, 또는 0 내지 약 30, 또는 0 내지 약 20, 0 내지 약 15, 또는 0 내지 약 10, 또는 0 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 약 40개 이하의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 임의의 화학식 I, II, IA 및 IIA에서 n과 m의 합계는 약 120, 또는 약 110, 또는 약 100, 또는 약 90, 또는 약 80, 또는 약 70, 또는 약 60, 또는 약 50, 또는 약 40, 또는 약 30, 또는 약 25, 또는 약 20, 또는 약 15, 또는 약 10, 또는 약 5, 또는 약 3, 또는 약 2이다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 YKSILYGSG (서열식별번호: 275), LYKSILYGSG (서열식별번호: 276), ELYKSILYGSG (서열식별번호: 277), GELYKSILYGSG (서열식별번호: 278), AGELYKSILYGSG (서열식별번호: 279), KAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 280), LKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 281), ALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 282), AALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 283), NAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 284), ANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 285), RANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 286), 및 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKS 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 YKCILYGSG (서열식별번호: 288), LYKCILYGSG (서열식별번호: 289), ELYKCILYGSG (서열식별번호: 290), GELYKCILYGSG (서열식별번호: 291), AGELYKCILYGSG (서열식별번호: 292), KAGELYKCILYGSG (서열식별번호: 293), LKAGELYKCILYGSG (서열식별번호: 294), ALKAGELYKCILYGSG (서열식별번호: 295), AALKAGELYKCILYGSG (서열식별번호: 296), NAALKAGELYKCILYGSG (서열식별번호: 297), ANAALKAGELYKCILYGSG (서열식별번호: 298), RANAALKAGELYKCILYGSG (서열식별번호: 299), 및 RRANAALKAGELYKCILYGSG (서열식별번호: 300)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKC 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 YKSGSG (서열식별번호: 301), LYKSGSG (서열식별번호: 302), ELYKSGSG (서열식별번호: 303), GELYKSGSG (서열식별번호: 304), AGELYKSGSG (서열식별번호: 305), KAGELYKSGSG (서열식별번호: 306), LKAGELYKSGSG (서열식별번호: 307), ALKAGELYKSGSG (서열식별번호: 308), AALKAGELYKSGSG (서열식별번호: 309), NAALKAGELYKSGSG (서열식별번호: 310), ANAALKAGELYKSGSG (서열식별번호: 311), RANAALKAGELYKSGSG (서열식별번호: 312), 및 RRANAALKAGELYKSGSG (서열식별번호: 313)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKS 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 YKCGSG (서열식별번호: 314), LYKCGSG (서열식별번호: 315), ELYKCGSG (서열식별번호: 316), GELYKCGSG (서열식별번호: 317), AGELYKCGSG (서열식별번호: 318), KAGELYKCGSG (서열식별번호: 319), LKAGELYKCGSG (서열식별번호: 320), ALKAGELYKCGSG (서열식별번호: 321), AALKAGELYKCGSG (서열식별번호: 322), NAALKAGELYKCGSG (서열식별번호: 323), ANAALKAGELYKCGSG (서열식별번호: 324), RANAALKAGELYKCGSG (서열식별번호: 325), 및 RRANAALKAGELYKCGSG (서열식별번호: 326)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKC 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 AYKSGSG (서열식별번호: 327), RAYKSGSG (서열식별번호: 328), LRAYKSGSG (서열식별번호: 329), NLRAYKSGSG (서열식별번호: 330), LNLRAYKSGSG (서열식별번호: 331), RLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 332), ARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 333), LARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 334), ILARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 335), AILARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 336), EAILARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 337), AEAILARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 338), KAEAILARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 339), GKAEAILARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 340), 및 YGKAEAILARLNLRAYKSGSG (서열식별번호: 341)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKS 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 AYKCGSG (서열식별번호: 342), RAYKCGSG (서열식별번호: 343), LRAYKCGSG (서열식별번호: 344), NLRAYKCGSG (서열식별번호: 345), LNLRAYKCGSG (서열식별번호: 346), RLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 347), ARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 348), LARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 349), ILARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 350), AILARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 351), EAILARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 352), AEAILARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 353), KAEAILARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 354), GKAEAILARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 355), 및 YGKAEAILARLNLRAYKCGSG (서열식별번호: 356)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKC 서열을 포함하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 아미노산 서열 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357), 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 약 1 mM 미만의 해리 상수 (K d )로 히알루론산에 결합하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 아미노산 서열 STMMSRSHKTRSHHVGSG (서열식별번호: 358), 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 83% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가지며, 단 약 1 mM 미만의 해리 상수 (K d )로 히알루론산에 결합하는 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 히알루론산에 대해 특정한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 펩티드(들)을 본원에 기재된 생체접합체에 사용할 수 있다. 추가로, 본원에서 사용되는 펩티드는 1개 초과의 히알루론산-결합 단위를 포함할 수 있고, 여기서 결합 단위는 동일하거나 상이할 수 있다.
추가로, 특정 실시양태에서, 생체접합체는 적어도 하나의 히알루론산-결합 단위 및 적어도 하나의 콜라겐-결합 단위를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 생체접합체는 적어도 하나의 히알루론산-결합 단위 및 적어도 하나의 콜라겐-결합 단위를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함하고, 여기서 콜라겐-결합 단위는 콜라겐 유형 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII 또는 XIV 중 하나 이상에 결합한다.
본 개시내용은 또한 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM-결합 단위를 포함하는 1 내지 약 50개 펩티드를 포함하는 생체접합체에 관한 것이다. 펩티드는 히드라지드-카르보닐 결합을 통해 글리칸 (예를 들어, 글리코사미노글리칸 또는 GAG), 예컨대 데르마탄 술페이트에 결합하고, 생체접합체는 또한 1 내지 약 3개의 소수성 꼬리(들) (예를 들어, 알킬 꼬리)를 포함할 수 있다.
이러한 생체접합체는 손상, 요독증, 산화적 스트레스 및 염증으로부터 혈관의 내피 세포 라이닝을 보호할 수 있다. 생체접합체는 수술에 의해 손상된 혈관뿐 아니라 카테터가 설치된 혈관의 내피 세포 라이닝을 보호하는데 특히 유용한 S/E 셀렉틴-결합 및 ICAM-결합 항호중구/단핵구 관내 라이닝 (즉, EC-SEAL)을 형성한다.
본원에 기재된 생체접합체는 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있도록 하나 이상의 유형의 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 셀렉틴-결합 펩티드 및 ICAM-결합 펩티드 둘 다를 포함하는 생체접합체가 포함된다. 또한, 셀렉틴-결합 펩티드 및 VCAM-결합 펩티드 둘 다를 포함하는 생체접합체, 또는 ICAM-결합 펩티드 및 VCAM-결합 펩티드 둘 다를 포함하는 생체접합체가 포함된다. 또한, 펩티드는 단일 펩티드 내에 하나 이상의 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM-결합 단위 (또는 서열)를 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에는 셀렉틴-결합 단위 및 ICAM-결합 단위 둘 다를 갖는 펩티드를 포함하는 생체접합체가 포함된다. 또한, 셀렉틴-결합 단위 및 VCAM-결합 단위 둘 다를 갖는 펩티드를 포함하는 생체접합체가 포함된다. 또한, ICAM-결합 단위 및 VCAM-결합 단위 둘 다를 포함하는 생체접합체가 포함된다.
특정 실시양태에서, 생체접합체는 IELLQAR (서열식별번호: 117), IELLQARGSC (서열식별번호: 118), IDLMQAR (서열식별번호: 119), IDLMQARGSC (서열식별번호: 120), QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 121), 및 QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 122)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 결합 단위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 실시양태에서, 생체접합체는 셀렉틴-결합 단위, 예컨대 LRRASLGDGDITWDQLWDLMK (서열식별번호: 123), HITWDQLWNVMN (서열식별번호: 124), QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 121), YGNSNITWDQLWSIMNRQTT (서열식별번호: 125), WTDTHITWDQLWHFMNMGEQ (서열식별번호: 126), EPWDQITWDQLWIIMNNGDG (서열식별번호: 127), HITWDQLWLMMS (서열식별번호: 128), DLTWEGLWILMT (서열식별번호: 129), RGVWGGLWSMTW (서열식별번호: 130), DYSWHDLWFMMS (서열식별번호: 131), KKEDWLALWRIMSVPDEN (서열식별번호: 132), RNMSWLELWEHMK (서열식별번호: 133), KEQQWRNLWKMMS (서열식별번호: 134), SQVTWNDLWSVMNPEVVN (서열식별번호: 135), RSLSWLQLWDWMK (서열식별번호: 136), DITWDQLWDLMK (서열식별번호: 137) DITWDELWKIMN (서열식별번호: 138), DYTWFELWDMMQ (서열식별번호: 139), DMTHDLWLTLMS (서열식별번호: 140), EITWDQLWEVMN (서열식별번호: 141), HVSWEQLWDIMN (서열식별번호: 142), HITWDQLWRIMT (서열식별번호: 143), DISWDDLWIMMN (서열식별번호: 144), QITWDQLWDLMY (서열식별번호: 145), RNMSWLELWEHMK (서열식별번호: 133), AEWTWDQLWHVMNPAESQ (서열식별번호: 146), HRAEWLALWEQMSP (서열식별번호: 147), KKEDWLALWRIMSV (서열식별번호: 148), KRKQWIELWNIMS (서열식별번호: 149), WKLDTLDMIWQD (서열식별번호: 150) 및 HITWDQLWNVMLRRAASLG (서열식별번호: 151)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 생체접합체는 ICAM-결합 단위를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 생체접합체는 NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 152), NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 153); ITDGEA (서열식별번호: 154), ITDGEAGSC (서열식별번호: 155), DGEATD (서열식별번호: 156), 및 DGEATDGSC (서열식별번호: 157)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 ICAM-결합 단위, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 개시된 생체접합체 및 방법에 사용될 수 있는, ICAM-결합 친화도 (또는 ICAM-결합 단위)를 갖는 것으로 공지된 다른 펩티드 서열에는 EWCEYLGGYLRYCA (서열식별번호: 158), FEGFSFLAFEDFVSSI (서열식별번호: 159), NNQKIVNLKEKVAQLEA (서열식별번호: 160), NNQKIVNIKEKVAQIEA (서열식별번호: 161), NNQKLVNIKEKVAQIEA (서열식별번호: 162), YPASYQR (서열식별번호: 163), YQATPLP (서열식별번호: 164), GSLLSAA (서열식별번호: 165), FSPHSRT (서열식별번호: 166), YPFLPTA (서열식별번호: 167), GCKLCAQ (서열식별번호: 168), GGTCGGGGTGAGTTTCGTGGTAGGGATAATTCTGTTTGGGTGGTT (서열식별번호: 169), EWCEYLGGYLRCYA (서열식별번호: 170), GRGEFRGRDNSVSVV (서열식별번호: 171), QTSVSPSKVI (서열식별번호: 172), PSKVILPRGG (서열식별번호: 173), LPRGGSVLVTG (서열식별번호: 174), 및 QTSVSPSKVILPRGGSVLVTG (서열식별번호: 175), 또는 이들의 조합이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 생체접합체는 VCAM-결합 단위를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, VCAM-결합 단위는 YRLAIRLNER (서열식별번호: 176), YRLAIRLNERRENLRIALRY (서열식별번호: 177) 및 RENLRIALRY (서열식별번호: 178), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 하나 이상의 VCAM-결합, ICAM-결합 및/또는 셀렉틴-결합 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 하나 이상의 ICAM-결합 펩티드 및 하나 이상의 셀렉틴-결합 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 생체접합체는 하나 이상의 VCAM-결합 단위, ICAM-결합 단위 및/또는 셀렉틴-결합 단위를 포함하는 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 하나 이상의 ICAM-결합 단위 및 하나 이상의 셀렉틴-결합 단위를 포함하는 펩티드를 포함한다.
생체접합체의 목적하는 특성에 따라, 글리칸에 결합되는 펩티드의 총 개수가 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체접합체에 존재하는 펩티드의 총 개수는 약 1 내지 약 50, 또는 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 30, 또는 약 1 내지 약 25, 또는 약 2 내지 약 30, 또는 약 2 내지 약 25, 또는 약 3 내지 약 25, 또는 약 4 내지 약 25, 또는 약 5 내지 약 25, 또는 약 5 내지 약 30, 또는 약 1 내지 약 25, 또는 약 2 내지 약 25, 또는 약 11 내지 약 14, 또는 약 1 내지 약 8, 또는 약 1 내지 약 5, 또는 약 1, 또는 약 2, 또는 약 3, 또는 약 4, 또는 약 5, 또는 약 6, 또는 약 7, 또는 약 8개 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 생체접합체는 약 10 내지 약 40개 펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 생체접합체는 약 5 내지 약 30개 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 약 20개 미만의 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 약 18개 미만의 펩티드를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 생체접합체는 약 4 내지 약 18개 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 약 15개 미만의 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 약 10개 미만의 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 약 30개 미만의 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 약 25개 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체접합체는 약 5 내지 약 40, 또는 약 10 내지 약 40, 또는 약 5 내지 약 20, 또는 약 4 내지 약 18, 또는 약 10, 또는 약 11, 또는 약 18, 또는 약 20개 펩티드, 또는 약 25개 펩티드, 또는 약 30개 펩티드, 또는 약 40개 펩티드, 또는 약 50개 펩티드를 포함한다.
본원에 기재된 펩티드는 펩티드로의 접합을 위해 히드라지드 모이어티를 추가로 포함한다. 히드라지드 기는 임의의 적합한 부착 지점, 예컨대 C-말단, N-말단에서 또는 아미노산 상의 측쇄를 통해 펩티드(들)에 결합할 수 있다. 예를 들어, 펩티드가 펩티드의 아미노산의 측쇄를 통해 글리칸에 결합되는 경우, 상기 측쇄는 글루탐산 또는 아스파르트산이다. 히드라지드는 펩티드 서열의 아미노산에 존재하는 카르보닐 기 (예를 들어, C-말단 카르보닐 기)에 결합된 히드라진 (-NHNH2) 사이에 형성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 히드라지드 기는 스페이서를 통해 펩티드(들)에 결합한다. 스페이서는 임의의 적절히 관능화된 선형 또는 분지형 모이어티일 수 있고, 전형적으로 약 4 내지 약 100개 원자를 갖는다. 한 실시양태에서, 스페이서는 1개 이상의, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 3개의 아미노산을 포함한다. 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있고, 일부 예에서 비극성 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린이다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 글리신, 알라닌, 아르기닌 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 스페이서는 글리신, 글리신-글리신, 글리신-세린-글리신, 아르기닌-아르기닌, 아르기닌-글리신-세린-글리신 및 리신-글리신-세린-글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 스페이서는 또한 비-아미노산 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 6-아미노헥산산, 숙신산, 또는 이들의 조합을 추가의 아미노산 스페이서(들)과 함께 또는 없이 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 서열은 추가로 GSG-NHNH2 모이어티를 포함한다. 전형적으로, GSG-NHNH2 모이어티는 C- 또는 N-말단에 결합한다.
특정 실시양태에서, 스페이서는 1개 초과의 펩티드 서열이 거기에 결합되어 분지형 구조물을 형성할 수 있도록 1개 초과의 결합 부위 (선형 또는 분지형일 수 있음)를 포함한다. 또한, 펩티드가 말단 또는 비말단 아미노산 모이어티를 통해 글리칸에 결합할 수 있기 때문에, 펩티드가 비말단 아미노산 모이어티를 통해 글리칸에 결합되는 경우에는 분지형일 것이다. 스페이서 상의 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있고, 임의의 적합한 결합 부위, 예컨대 목적하는 펩티드 서열이 (예를 들어 아미드 결합을 통해) 거기에 결합할 수 있도록 아민 또는 카르복실산 모이어티일 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 스페이서는 1개 이상의 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산 잔기를 함유한다. 이러한 구조물은 화학식 PnL (여기서, P는 콜라겐- 및/또는 히알루론산-결합 단위이고, L은 스페이서이고, n은 2 내지 약 10, 또는 2 내지 8, 또는 2 내지 6, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10의 정수임)의 1개 초과의 콜라겐- 및/또는 히알루론산-결합 단위를 갖는 펩티드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 스페이서 L은 각각 2, 3 또는 4개의 결합 부위를 제공하는 KGSG (서열식별번호: 359), KKGSG (서열식별번호: 360), 또는 KKKGSG (서열식별번호: 361) 등과 같은 아미노산 서열일 수 있다.
특정 실시양태에서, 스페이서 또는 그의 조합은 추가의 분지를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 추가의 펩티드 또는 콜라겐-결합 단위를 연결할 수 있는 측쇄를 함유하는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 스페이서에 포함되는 예시적인 아미노산에는 리신, 글루탐산, 아스파르트산 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 스페이서는 2 내지 6개 아미노산, 또는 3 또는 4개 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 스페이서는 화학식 KXX의 하나 이상의 아미노산 서열 (여기서, 각각의 X는 독립적으로 천연 또는 비천연 아미노산임)을 포함한다. 분지형 구조물을 제조하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 스페이서의 구체적인 예에는 KRR, KKK, (K)nGSG 및 (KRR)n-KGSG (여기서, n은 0 내지 5, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5임)가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 스페이서는 GSGKRRGSG (서열식별번호: 362)이다.
펩티드에 결합된 이들 스페이서의 구조를 하기 표에 도시하였다.
Figure pct00006
예시적인 콜라겐-결합 구조물에는 (GELYKSILYGSG)2K (서열식별번호: 363), (GELYKSILYGSG)2KGSG (서열식별번호: 364), (GELYKSILYGSG)3KK (서열식별번호: 365), (GELYKSILYGSG)3KKGSG (서열식별번호: 366), (GELYKSILYGSG)4KKK (서열식별번호: 367), (GELYKSILYGSG)4KKKGSG (서열식별번호: 368), (GQLYKSILYGSG)2K (서열식별번호: 369), (GQLYKSILYGSG)2KGSG (서열식별번호: 370), (GQLYKSILYGSG)3KK (서열식별번호: 371), (GQLYKSILYGSG)3KKGSG (서열식별번호: 372), (GQLYKSILYGSG)4K2K (서열식별번호: 373), (GQLYKSILYGSG)4K2KGSG (서열식별번호: 374), (GQLYKSILYGSG)4KKK (서열식별번호: 375), (GQLYKSILYGSG)4KKKGSG (서열식별번호: 376), (GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-K (서열식별번호: 377), 및 (GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-KGSG (서열식별번호: 378)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 히드라지드 기는 펩티드(들) N-말단에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드 기는 펩티드(들) C-말단에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드 기는 펩티드(들) 중 아미노산, 예컨대 글루탐산 및/또는 아스파르트산의 측쇄에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드 기는 스페이서를 통해 펩티드(들) C-말단에 결합한다. 스페이서는 임의의 적합한 결합을 통해 펩티드에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 아미드 결합을 통해 펩티드에 결합한다.
한 실시양태에서, 히드라지드 기는 글리신, 알라닌, 아르기닌 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 스페이서를 통해 C-말단에 결합한다. 한 실시양태에서, 스페이서는 글리신, 글리신-글리신, 및 글리신-세린-글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 실시양태에서, 펩티드는 아미노산 스페이서, 예컨대 글리신-세린-글리신 (GSG), KRRGSG (서열식별번호: 384), 또는 GSGKRRGSG (서열식별번호: 362)를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 글리칸당 펩티드의 개수는 평균이며, 조성물 중에서 어떤 생체접합체는 글리칸당 더 많은 펩티드를 가질 수 있고, 어떤 생체접합체는 글리칸당 더 적은 펩티드를 갖는다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드의 개수는 생체접합체의 조성물 중에서 평균이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸당 펩티드의 평균 개수가 약 5인 조성물이다. 다른 실시양태에서, 글리칸당 펩티드의 평균 개수는 약 6, 또는 약 7, 또는 약 8, 또는 약 9, 또는 약 10, 또는 약 11, 또는 약 12, 또는 약 13, 또는 약 14, 또는 약 15, 또는 약 16, 또는 약 17, 또는 약 18, 또는 약 19, 또는 약 20, 또는 약 25, 또는 약 30이다.
특정 실시양태에서, 글리칸당 펩티드의 개수는, 글리칸 골격에서 펩티드로 관능화된 이당류 단위의 퍼센트를 기준으로 "퍼센트 (%) 관능화"로 기재될 수 있다. 예를 들어, 글리칸 상에 존재하는 이용가능한 이당류 단위의 총 개수는, 단일 이당류 단위의 분자량 (또는 평균 분자량) (예를 들어, 약 550-800 Da, 또는 약 650-750 Da)을 글리칸의 분자량 (예를 들어, 약 25 kDa 내지 약 70 kDa, 또는 심지어 약 100 kDa)으로 나누어 계산할 수 있다. 글리칸이 통상적인 "이당류 단위"를 함유하지 않는 경우에는 (예를 들어, 알긴산), 본원에 제시된 계산에 사용되는 글리칸 상에 존재하는 이용가능한 이당류 단위의 총 개수는, 단일 당류 단위의 분자량 (또는 평균 분자량)을 글리칸의 분자량으로 나누고 2를 곱함으로써 계산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 글리칸 상에 존재하는 이용가능한 이당류 단위의 개수는 약 10 내지 약 80, 또는 약 10 내지 약 70, 또는 약 15 내지 약 70, 또는 약 20 내지 약 70, 또는 약 30 내지 약 70, 또는 약 35 내지 약 70, 또는 약 40 내지 약 70, 또는 약 10 내지 약 75, 또는 약 15 내지 약 75, 또는 약 20 내지 약 75, 또는 약 30 내지 약 75, 또는 약 35 내지 약 75, 또는 약 40 내지 약 75, 또는 약 10 내지 약 50, 또는 약 20 내지 약 50, 또는 약 25 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 35, 또는 약 15 내지 약 35, 또는 약 20 내지 약 35, 또는 약 10 내지 약 30, 또는 약 15 내지 약 30, 또는 약 20 내지 약 30, 또는 약 15, 또는 약 20, 또는 약 25, 또는 약 30, 또는 약 35, 또는 약 40, 또는 약 45, 또는 약 50, 또는 약 55, 또는 약 60, 또는 약 65, 또는 약 70이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 글리칸은 약 1 내지 약 50, 또는 약 5 내지 약 30% 관능화, 또는 약 25% 관능화를 포함하고, 상기 퍼센트 (%) 관능화는 펩티드로 관능화된 글리칸 상에서 이당류 단위의 퍼센트로서 결정된다. 일부 실시양태에서, 글리칸의 퍼센트 (%) 관능화는 약 1% 내지 약 50%, 또는 약 3% 내지 약 40%, 또는 약 5% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 1%, 또는 약 2%, 또는 약 5%, 또는 약 10%, 또는 약 15%, 또는 약 20%, 또는 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50%, 또는 약 55%, 또는 약 60%, 또는 약 65%, 또는 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 100%이다.
특정 실시양태에서, 펩티드가 (예를 들어, 이온 결합을 통해) 생체접합체에 근접하게 회합되어 있는 것인, 본원에 기재된 생체접합체 및 펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 이로써 생체접합체 응집물이 형성될 수 있다. 생체접합체 응집물 (생체접합체 및 비공유 결합된 펩티드를 포함함)은 1% 내지 200% 관능화 (펩티드로 관능화된 글리칸 상에서 이당류 단위의 퍼센트에 의해 결정됨)를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 생체접합체의 퍼센트 (%) 관능화는 약 1% 내지 약 50%, 또는 약 3% 내지 약 40%, 또는 약 5% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 1%, 또는 약 2%, 또는 약 5%, 또는 약 10%, 또는 약 15%, 또는 약 20%, 또는 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50%, 또는 약 55%, 또는 약 60%, 또는 약 65%, 또는 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 100%이다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서 임의의 글리칸, 예컨대 이로 제한되지 않지만 알기네이트, 아가로스, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트 (CS), 데르마탄, 데르마탄 술페이트 (DS), 헤파란 술페이트, 헤파린 (Hep), 케라틴, 케라탄 술페이트, 및 히알루론산 (HA)이 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 글리칸은 천연 발생이거나 또는 화학적으로 유도체화될 수 있고, 예컨대 이로 제한되지 않지만 부분적으로 N-탈술페이트화된 유도체, 부분적으로 O-탈술페이트화된 유도체, 및/또는 부분적으로 O-카르복시메틸화된 유도체가 있다.
일부 실시양태에서, 글리칸은 개질되지 않는다. 특정 실시양태에서, 글리칸은 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않으며, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다. 본원에 개시된 생체접합체에 의해 발휘되는 유익한 효과는 적어도 부분적으로 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않는 글리칸 때문일 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 히알루론산-결합 단위를 갖는 본원에 개시된 생체접합체는 관련 기술분야에 공지된 히알루론산-결합 생체접합체에 비해 증가된 결합 친화도를 나타낸다 (예를 들어, 실시예 5 참고).
이러한 연결은 펩티드 상의 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 (예를 들어, 카르복실산 기, 또는 그의 활성화된 유도체)를 커플링함으로써, 또는 대안적으로 글리칸 상의 히드라지드 기와 펩티드 상의 카르보닐 기 (예를 들어, 카르복실산 기, 또는 그의 활성화된 유도체)를 커플링함으로써 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드(들) 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다.
한 실시양태에서, 글리칸은 헤파린이고, 상기 헤파린은 헤파린 유도체, 예컨대 이로 제한되지 않지만 부분적으로 N- 및/또는 부분적으로 O-탈술페이트화된 헤파린 유도체, 부분적으로 O-카르복시메틸화된 헤파린 유도체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 산화되지 않은 헤파린이고 (즉, 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않음), 알데히드 관능기를 함유하지 않는다. 헤파린 유도체, 예컨대 부분적으로 N-탈술페이트화된 헤파린 및/또는 부분적으로 O-탈술페이트화된 헤파린 (즉, 2-O 및/또는 6-O-탈술페이트화된 헤파린) 및/또는 헤파린 유도체의 제공 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, Kariya et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:25949-5958; Lapierre, et al. Glycobiology, 1996, 6(3):355-366 참고). 또한, 부분적으로 O-카르복시메틸화된 헤파린 (또는 임의의 글리칸) 유도체, 예컨대 Prestwich, et al. (US 2012/0142907; US 2010/0330143)에 따라 제조될 수 있는 것들은 본원에 개시된 생체접합체를 제공하기 위해 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
특정 실시양태에서, 글리칸의 분자량을 변화시켜 생체접합체의 효능을 조정한다 (예를 들어, Radek, K. A., et al., Wound Repair Regen., 2009, 17: 118-126; 및 Taylor, K. R., et al., J. Biol. Chem., 2005, 280:5300-5306 참고). 또 다른 실시양태에서, 글리칸은 산화 및 알칼리성 제거에 의해 분해되어 (예를 들어, Fransson, L. A., et al., Eur. J. Biochem., 1980, 106 :59-69 참고), 보다 적은 분자량 (예를 들어, 약 10 kDa 내지 약 50 kDa)을 갖는 분해된 글리칸을 생성한다.
한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트 (DS)이다. DS의 생물학적 기능은 광범위하고, 내피 세포 및 각질형성세포 증식 및 이동을 촉진시키는 성장 인자 FGF-2, FGF-7 및 FGF-10의 결합 및 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 데르마탄 술페이트의 중량 범위는 약 10 kDa 내지 약 70 kDa이다. 한 실시양태에서, 데르마탄 술페이트의 분자량은 약 46 kDa이다. 또 다른 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화 및 알칼리성 제거에 의해 분해되어 (예를 들어, Fransson, L. A., et al., Eur. J. Biochem., 1980, 106:59-69 참고), 보다 적은 분자량 (예를 들어, 약 10 kDa)을 갖는 분해된 데르마탄 술페이트를 생성한다.
또 다른 실시양태에서, 글리칸은 헤파린이다. 약 650-700 Da의 단일 이당류 단위에서부터 약 50 kDa까지 다양한 분자량의 헤파린이 본원에 기재된 생체접합체에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤파린은 약 10 내지 약 20 kDa이다. 일부 실시양태에서, 헤파린은 약 15, 또는 약 16, 또는 약 17, 또는 약 18, 또는 약 19, 또는 약 20 kDa 이하이다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 당류 고리 중 하나 이상을 분할하지 않는 조건하에 산화될 수 있다 (예를 들어, Wang, et al. Biomacromolecules 2013, 14(7):2427-2432 참고).
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸, 및 약 5 내지 약 10, 또는 약 7개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GELYKSILY (서열식별번호: 2) 또는 GELYKSILYGSG (서열식별번호: 278) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 헤파린이다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 20개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GELYKSILY (서열식별번호: 2) 또는 GELYKSILYGSG (서열식별번호: 278) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸, 및 약 5 내지 약 10, 또는 약 7개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GQLYKSILY (서열식별번호: 16) 또는 GQLYKSILYGSG (서열식별번호: 387) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 헤파린이다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 20개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GQLYKSILY (서열식별번호: 16) 또는 GQLYKSILYGSG (서열식별번호: 387) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸, 및 약 5 내지 약 10, 또는 약 7개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 헤파린이다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 20개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 데르마탄 술페이트, 및 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1), RRANAALKAGELYKSILYGC (서열식별번호: 388) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함하는 약 1 내지 약 50개 펩티드를 포함하며, 펩티드가 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합하는 것인 생체접합체가 아니다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸, 및 약 5 내지 약 10, 또는 약 7개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 RRANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 17) 또는 RRANAALKAGQLYKSILYGSG (서열식별번호: 389) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 헤파린이다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 20개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 RRANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 17) 또는 RRANAALKAGQLYKSILYGSG (서열식별번호: 389) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸, 및 약 1 내지 약 5, 또는 약 1 내지 2개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 (GQLYKSILY)4-(KRR)2-K (서열식별번호: 390), (GQLYKSILYGSG)4-(KRR)2-KGSG (서열식별번호: 378) 또는 (GQLYKSILY)4-(KRR)2-KGSG (서열식별번호: 391)을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 헤파린이다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 5 내지 약 10개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58) 또는 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 콘드로이틴 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 5 내지 약 10개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 STMMSRSHKTRSHHV (서열식별번호: 59) 또는 STMMSRSHKTRSHHVGSG (서열식별번호: 358) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 콘드로이틴 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 1 내지 약 20개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58) 또는 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357) 중 적어도 하나의 서열, 및 WYRGRL (서열식별번호: 29) 또는 WYRGRLGSG (서열식별번호: 392) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 한 실시양태에서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 콘드로이틴 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 1 내지 약 20개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58) 또는 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357) 중 적어도 하나의 서열, 및 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 한 실시양태에서, 글리칸은 콘드로이틴 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 콘드로이틴 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 5 내지 약 15개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 IELLQAR (서열식별번호: 117) 또는 IELLQARGSG (서열식별번호: 393) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 5 내지 약 15개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 IDLMQAR (서열식별번호: 119) 또는 IDLMQARGSG (서열식별번호: 394) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 5 내지 약 15개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 ITDGEA (서열식별번호: 154) 및/또는 ITDGEAGSG (서열식별번호: 395) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 5 내지 약 15개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 DGEATD (서열식별번호: 156) 및/또는 DGEATDGSG (서열식별번호: 396) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 글리칸 및 약 5 내지 약 15개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 DGEATD (서열식별번호: 156), DGEATDGSG (서열식별번호: 396), ITDGEA (서열식별번호: 154) 및/또는 ITDGEAGSG (서열식별번호: 395) 중 적어도 하나의 서열, 및 IELLQAR (서열식별번호: 117), IELLQARGSG (서열식별번호: 393), IDLMQAR (서열식별번호: 119), 및/또는 IDLMQARGSG (서열식별번호: 394) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 특정 실시양태에서, 히드라지드-카르보닐 연결은 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이에 있다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다. 특정 실시양태에서, 데르마탄 술페이트는 산화적으로 분할된 당류 고리를 함유하지 않고, 따라서 알데히드 관능기를 함유하지 않는다.
3. 생체접합체의 합성
본원에서 사용되는 펩티드는 시판 공급처로부터 구입하거나 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 (예를 들어, 화학적 및/또는 생명공학적 방법)을 이용하여 부분적으로 또는 완전히 합성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 관련 기술분야에 널리 공지된 고체상 펩티드 합성 프로토콜에 따라 펩티드를 합성한다. 또 다른 실시양태에서, 널리 공지된 Fmoc 프로토콜에 따라 고체 지지체 상에서 펩티드를 합성하고, 트리플루오로아세트산을 이용하여 지지체로부터 분할시키고, 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 따라 크로마토그래피에 의해 정제한다. 다른 실시양태에서, 통상의 기술자에게 널리 공지된 생명공학 방법을 이용하여 펩티드를 합성한다. 한 실시양태에서, 목적하는 펩티드에 대한 아미노산 서열 정보를 코딩하는 DNA 서열을 통상의 기술자에게 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 발현 플라스미드 (예를 들어, 펩티드의 친화성 정제를 위해 친화성 태그를 도입시킨 플라스미드)에 라이게이션하고, 플라스미드를 발현을 위해 숙주 유기체에 형질감염시킨 다음, 예를 들어 친화성 정제에 의해 펩티드를 숙주 유기체 또는 성장 배지로부터 단리한다. 재조합 DNA 기술 방법은 Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001) (본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있고, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
반응식 1에 도시된 바와 같이, 본원에 기재된 펩티드는 카르복실산 모이어티를 통해 글리칸 (예를 들어, 헤파린) 1A에 공유 결합되어 본원에 개시된 생체접합체 1B를 제공할 수 있다. 펩티드 커플링 반응에서 전형적인 바와 같이, 활성화제를 이용하여 반응을 용이하게 할 수 있다. 적합한 커플링제 (또는 활성화제)는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 카르보디이미드 (예를 들어, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N,N'-디시클로펜틸카르보디이미드, N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), N-t-부틸-N-메틸카르보디이미드 (BMC), N-t-부틸-N-에틸카르보디이미드 (BEC), 1,3-비스(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일메틸)카르보디이미드 (BDDC) 등), 알데히드 (예를 들어, 대칭, 혼합 또는 시클릭 알데히드), 활성화된 에스테르 (예를 들어, 페닐 활성화된 에스테르 유도체, p-히드록삼산 활성화된 에스테르, 헥사플루오로아세톤 (HFA) 등), 아실라졸 (CDI를 이용하는 아실이미다졸, 아실벤조트리아졸 등), 아실 아지드, 산 할라이드, 포스포늄 염 (HOBt, PyBOP, HOAt 등), 아미늄/우로늄 염 (예를 들어, 테트라메틸 아미늄 염, 비스피롤리디노 아미늄 염, 비스피페리디노 아미늄 염, 이미다졸륨 우로늄 염, 피리미디늄 우로늄 염, N,N,N'-트리메틸-N'-페닐우레아로부터 유래된 우로늄 염, 모르폴리노-기재 아미늄/우로늄 커플링 시약, 안티모니에이트 우로늄 염 등), 유기인산 시약 (예를 들어, 포스핀산 및 인산 유도체), 유기황 시약 (예를 들어, 술폰산 유도체), 트리아진 커플링 시약 (예를 들어, 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4 메틸모르폴리늄 클로라이드, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4 메틸모르폴리늄 테트라플루오로보레이트 등), 피리디늄 커플링 시약 (예를 들어, 무카이야마(Mukaiyama) 시약, 피리디늄 테트라플루오로보레이트 커플링 시약 등), 중합체-지지된 시약 (예를 들어, 중합체-결합된 카르보디이미드, 중합체-결합된 TBTU, 중합체-결합된 2,4,6-트리클로로-1,3,5-트리아진, 중합체-결합된 HOBt, 중합체-결합된 HOSu, 중합체-결합된 IIDQ, 중합체-결합된 EEDQ 등) 등이 포함된다 (예를 들어, El-Faham, et al. Chem. Rev., 2011, 111(11): 6557-6602; Han, et al. Tetrahedron, 2004, 60:2447-2467 참고).
한 실시양태에서, 펩티드 커플링 반응은 글리칸의 카르복실산 모이어티와 커플링제 (예를 들어, 카르보디이미드 시약, 예컨대 이로 제한되지 않지만, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 등)를 반응시켜 O-아실이소우레아 중간체를 형성함으로써 활성화된 글리칸 중간체를 통해 진행된다. 이러한 카르보디이미드 화학은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 적합한 커플링제는 시판 공급처로부터 구입할 수 있다. O-아실이소우레아 중간체와 목적하는 펩티드를 접촉시켜 생체접합체를 수득한다. 글리칸은 펩티드보다 먼저 또는 펩티드의 존재하에 활성화제와 접촉시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 또는 그의 유도체의 존재하에 반응을 수행한다. 특정 실시양태에서, 펩티드 서열은 글리칸 또는 그의 O-아실이소우레아 중간체와의 커플링 반응을 보조하기 위해 반응성 모이어티 (예를 들어, 히드라지드 관능기)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 서열은 결합 단위와 말단 아미노산 (예를 들어, 종결 글리신) 또는 반응성 모이어티 (즉, 히드라지드 관능기) 사이에서 스페이서로서 작용하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 세린-글리신 (SG), 글리신-세린-글리신 (GSG) 또는 글리신-세린-글리신-세린-글리신 (GSGSG) 스페이서를 첨가하여, 글리칸을 위한 부착 지점을 제공할 수 있다. 또한, 펩티드 중 하나 이상의 아미노산이 반응성 관능기 (예를 들어, 카르복실산 측쇄)를 함유하는 특정한 예에서, 표준 보호기 화학을 이용하여 하나 이상의 측쇄를 보호시킴으로써 커플링 반응을 용이하게 할 수 있다. 또한, 비-아미노산 스페이서를 단독으로 또는 아미노산 스페이서 (예를 들어, 아미노헥산)와 함께 사용할 수 있다.
반응식 1. 생체접합체의 합성
Figure pct00007
특정 실시양태에서, 생체접합체는 개질된 글리칸 유도체 (예를 들어, 헤파린)로부터 유래된다 (반응식 2). 본원에 기재된 생체접합체에서 사용하기에 적합한 다양한 글리칸 유도체가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예컨대 부분적으로 N-탈술페이트화된 헤파린 및 부분적으로 O-탈술페이트화된 헤파린 (즉, 2-O 및/또는 6-O-탈술페이트화된 헤파린이 있다 (예를 들어, Kariya et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:25949-5958; Lapierre, et al. Glycobiology, 1996, 6(3):355-366 참고). 예시적인 방법이 하기 반응식 2에 도시되어 있다. 반응식 2에 도시된 바와 같이, 글리칸 (예를 들어, 헤파린) 1A를 적합한 탈술페이트화제, 예컨대 염기 (예를 들어, NaOH) 또는 실릴화 시약 (예를 들어, N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (BTSA), N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로 아세트아미드 (MTSTFA) 등)과 반응시켜 하나 이상의 탈술페이트화된 글리칸 유도체(들) 2A를 제공할 수 있다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 부분, 완전 또는 혼합물인 탈술페이트화된 글리칸 유도체(들) 2A를 수득할 수 있도록 글리칸 유도체 2A를 사용된 시약 및 반응 조건에 따라 조정할 수 있다. 이어서, 상기 반응식 1에 기재된 바와 같이 임의적으로 커플링제의 존재하에 전형적인 펩티드 커플링 반응 조건하에 탈술페이트화된 글리칸 유도체(들) 2A를 펩티드와 반응시켜 생체접합체 2B를 제공할 수 있다. 또한, 반응식 2에 도시된 바와 같이, 적어도 1개의 히드록실 기를 갖는 글리칸 유도체 (예를 들어, 6-O-탈술페이트화된 헤파린)를 O-카르복시메틸화된 글리칸 유도체(들) (예를 들어, 6-O-카르복시메틸화된 헤파린) 2C로 전환시킬 수 있다 (예를 들어, Prestwich, et al. US 2012/0142907 및 US 2010/0330143 참고). 상기 반응식 1에 기재된 바와 같이 임의적으로 커플링제의 존재하에 전형적인 펩티드 커플링 반응 조건하에 2C와 펩티드를 반응시켜 생체접합체 2D 및/또는 2E를 제공할 수 있다.
반응식 2. 생체접합체의 대안적인 합성
Figure pct00008
반응식 1 및 2와는 대조적으로, 반응식 3은 관련 기술분야에 공지된 생체접합체의 합성을 도시한다. 반응식 1에 도시된 바와 같이, 글리칸 (예를 들어, 콘드로이틴 술페이트 "CS")을 과아이오딘산염 시약, 예컨대 과아이오딘산나트륨을 이용하여 산화시켜, 글리칸에 펩티드를 공유 결합시키기 위한 글리칸 상의 알데히드 관능기를 제공할 수 있다 (예를 들어, "ox-CS"). 이어서, 산화된 글리칸 (예를 들어, "ox-CS")의 알데히드 관능기를 N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드 (BMPH)와 반응시켜 글리칸 중간체 (예를 들어, "BMPH-CS")를 형성하고, 글리칸 중간체를 적어도 1개의 유리 티올 기 (즉, -SH 기)를 함유하는 펩티드와 추가로 반응시켜, 펩티드를 글리칸 (예를 들어, 콘드로이틴 술페이트 "CS")에 공유 결합시킴으로써, 합성 펩티도글리칸을 수득한다.
반응식 3. CS- BMPH - 펩티드 n 의 합성
Figure pct00009
4. 사용 방법
4.1 콜라겐-결합 생체접합체의 사용 방법
한 실시양태에서, 콜라겐과의 접촉을 위한 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 콜라겐-결합 합성 생체접합체가 콜라겐과 결합하고, 혈소판의 활성화가 억제되는 것인, 혈소판의 활성화를 억제하는 방법이 기재된다. 또 다른 실시양태에서, 콜라겐과의 접촉을 위한 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 콜라겐-결합 합성 생체접합체가 콜라겐과 결합하고, 콜라겐으로 혈소판의 부착이 억제되는 것인, 콜라겐으로 혈소판의 부착을 억제하는 방법이 기재된다. 콜라겐-결합 생체접합체를 이용하는 다른 방법이 하기에 논의된다.
a. 관상 동맥 질환 (CAD) 및 말초 동맥 질환 (PAD)
본 개시내용의 한 실시양태는 수술적 바이패스 시술의 성공률을 증가시키고/거나 실패를 감소시키기 위한 방법 및 관련 조성물을 제공한다. 바이패스 이식편은 관상 동맥 질환 (CAD) 및 말초 동맥 질환 (PAD) 둘 다에서 동맥 폐쇄 치료의 한 형태로서 사용된다. 미국에서 연간 대략 500,000건의 관상 동맥 바이패스 이식편 (CABG) 시술 및 70,000건이 넘는 말초 바이패스 이식편 시술이 이루어진다. 가장 흔하게는, 자가조직 혈관 이식편을 대개 복재 정맥으로부터 수확한다.
혈류를 복구하기 위해 자가조직 정맥 이식편을 이용하는 수술적 바이패스가 널리 보급되었음에도 불구하고, CAD 및 PAD 둘 다에서 수많은 정맥 이식 실패 (VGF)가 있다. 말초 단독의 경우, 정맥 이식 실패율이 5년 이내에 50% 실패 수준에 이르렀다. 5% 내지 10%의 정맥 이식편이 기술적인 요인 및 급성 혈전증으로 인해 이식 직후에 실패한 반면에, 20% 내지 30%의 또 다른 사례에서 중기 실패 (3 내지 24개월)가 발생할 수 있고, 많은 비용이 드는 감시, 재중재 시술 및 절단을 초래할 수 있다. CLI 환자 (n = 1219)에서 정맥 이식 실패의 12개월 발병률은 브리검 여성 병원(Brigham and Women's Hospital)에서 20년의 경험 동안 29%이었다. 정맥 이식 실패의 결과는 대개 재발성 허혈 증상, 쇠약 수술 및 사지 손실을 비롯하여 환자에게 심각하다. 지금까지, 약물요법 및 기술 혁신은 정맥 이식 실패를 감소시키는데 거의 영향을 미치지 못하였다.
정맥 이식편 수확, 보존 배지, 바이패스를 위한 준비중 과도한 조작, 또는 허혈 및 재관류 손상에 의해 초래되건 아니건 간에, 정맥 이식편 도관의 약한 내피층에 대한 손상은 이식후에 혈관 벽 내에서 혈소판 매개된 염증 반응을 일으키는 것으로 고려된다. 이러한 내피 손상 및 ECM-혈소판 활성화 캐스케이드는 급성 염증 및 혈전증을 통한 초기 VGF, 또는 신생내막 과형성증을 통한 지연된 VGF를 일으킬 수 있다. 따라서, 이식후 정맥 이식편 내피하 매트릭스가 순환중인 혈소판에 노출되는 것을 제한하면, 급성 혈관 벽 염증을 감소시키고, 재상피화를 개선시키고, 혈관 폐색 및 VGF를 초래할 수 있는 과도한 신생내막 과형성증을 제한하는데 도움이 될 수 있다. 본원에 기재된 생체접합체는 자가조직 정맥 이식편을 이용하여 수술적 바이패스를 받고 있는 심혈관 질환을 가진 환자를 위한 정맥 이식편 보존 용액으로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 생체접합체 및 그를 포함하는 조성물을 이용하여, 환자에서 관상 동맥 질환 및/또는 말초 동맥 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 한 실시양태에 따라, 혈관 절편의 내벽을 본 개시내용의 합성 생체접합체를 함유하는 용액과 접촉시킴으로써 혈관 이식편 (예를 들어, 정맥 이식편)을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 접촉을 용이하게 하는 한 가지 방법은 절편을 상기 용액에 함침시키는 것이다. 이러한 접촉을 위한 조건은 합성 생체접합체의 농도 및 혈관의 특성에 따라 달라질 수 있지만, 적합한 양의 합성 생체접합체가 내벽에 결합하도록 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 방법으로 제조된 혈관 이식편 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
이식편을 제조한 후, 그를 필요로 하는 환자에게 이식할 수 있다. 전문 의료진에 의해 수술적 바이패스 시술이 용이하게 수행될 수 있다. 이식한 후, 이식편의 내벽에 결합된 합성 생체접합체가 급성 혈관 벽 염증을 감소시키고, 이식편의 재상피화를 개선시키고, 이식편의 과도한 신생내막 과형성증을 제한하여, 이식 실패를 감소시키는데 도움이 될 수 있다.
한 실시양태에서, 바이패스 시술 동안에 또는 이후에 이식편을 상기 기재된 합성 생체접합체로 처리한 경우에는, 합성 생체접합체가 이식편의 내벽에 결합하도록 합성 생체접합체의 용액을 이식편의 내강에 주사할 수 있다. 한 측면에서, 혈류가 이식편을 통해 복구되거나 개시되기 전에 상기 주사를 수행한다. 또 다른 측면에서, 혈류가 복구 또는 개시된 직후에 (예를 들어, 10분 이내에, 5분 이내에, 또는 1분 이내에) 상기 주사를 수행한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈관의 부정적인 리모델링을 억제하는데 효과적이다. 허혈성 또는 관상동맥 심장 질환으로도 공지된 관상 동맥 질환은, 관상 동맥 (심근으로 혈액을 공급하는 동맥) 내부의 평활한 탄성 라이닝의 일부에서 심장으로의 혈류를 효과적으로 제한하는 아테롬성동맥경화증이 진행된 경우에 발생한다. 아테롬성동맥경화증 또는 동맥 경화로도 공지된 말초 동맥 질환은, 순환계의 동맥에서 발생하는 장애이다. 부정적인 리모델링은 혈관 직경 및 내강 직경의 감소를 일으키는 자극에 대한 혈관의 생리학적 또는 병리학적 반응을 포함한다. 이러한 자극은 예를 들어 혈류의 변화 또는 혈관성형술 시술에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 생체접합체 및 그를 포함하는 조성물의 주사는 주사하지 않은 혈관 직경에 비해 혈관 직경을 약 10%, 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 95%, 또는 그 이상 증가시킨다. 부정적인 리모델링은 예를 들어 혈관조영술에 의해 병변 부위 (또는 질환 부위)에서의 퍼센트 직경 협착으로서 정량화될 수 있다. 리모델링 정도를 측정하는 또 다른 방법은 혈관내 초음파 (IVUS)를 이용하여 변병내 외탄력막 면적을 측정하는 것을 포함한다. IVUS는 외탄력막뿐 아니라 혈관 내강을 영상화할 수 있는 기술이다. 일부 실시양태에서, 부정적인 리모델링은 혈관 중재 시술, 예컨대 혈관성형술, 스텐트 시술 또는 죽종절제술과 관련이 있다. 따라서, 본원에 기재된 생체접합체 및 그를 포함하는 조성물을 혈관 중재 시술 이전에, 동안에 및/또는 이후에 주사할 수 있다. 특정 실시양태에서, 벌룬 혈관성형술 이전에, 동안에 및/또는 이후에 본원에 기재된 생체접합체 또는 그를 포함하는 조성물의 유효량을 포함하는 용액을 내강의 내벽에 적용하는 것을 포함하는, 환자에서 대퇴슬와부 동맥 내부의 협착 또는 폐색을 치료하는 방법이 제공된다.
따라서, 본 개시내용은 혈관 벽 또는 혈관 벽을 둘러싸는 조직에 본원에 기재된 생체접합체 또는 그를 포함하는 조성물의 유효량을 주사하는 것을 포함하는, 개체의 혈관 (예를 들어, 동맥)에서 부정적인 리모델링을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 생체접합체 또는 조성물을 잠재적인 또는 실제의 부정적인 리모델링 부위에서 또는 그에 인접하여 (예컨대, 상기 부위로부터 약 2, 1 또는 0.5 cm 이하로 떨어져서) 주사한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물을 잠재적인 또는 실제의 부정적인 리모델링 부위로부터 멀리 (예를 들어, 상기 부위로부터 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 cm 떨어져서) 주사한다. 일부 실시양태에서, 상기 주사는 니들을 가진 카테터를 통해 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 부위는 관상 동맥 또는 말초 동맥이다. 일부 실시양태에서, 동맥은 신장 동맥, 대뇌 동맥, 폐 동맥 및 하지 동맥으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 동맥은 벌룬 손상된 동맥이다. 추가의 예로는 복부 대동맥, 전경골 동맥, 대동맥궁, 궁상 동맥, 액와 동맥, 상완 동맥, 경동맥, 복강 동맥, 회선 비골 동맥, 총간 동맥, 총장골 동맥, 심부 대퇴 동맥, 심부 수장측 동맥궁, 배측 지동맥, 배측 중족골 동맥, 외경동맥, 외장골 동맥, 안면 동맥, 대퇴 동맥, 하장간막 동맥, 내장골 동맥, 장 동맥, 외측하슬 동맥, 외측상슬 동맥, 수장측 지동맥, 비골 동맥, 슬와 동맥, 후경골 동맥, 대퇴 심부 동맥, 폐 동맥, 요골 동맥, 신장 동맥, 비장 동맥, 쇄골하 동맥, 표재 수장측 동맥궁, 상잔간 동맥, 상척측 측부 동맥 및/또는 척골 동맥이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 동맥은 관상동맥 혈관의 일부이다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 사용되는 생체접합체는 헤파린 및 약 5 내지 약 10, 또는 약 7개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 헤파린에 결합한다.
b. 혈관 치료
본원에 기재된 생체접합체 및 조성물을 사용하여 혈관 손상 또는 중재술 이전에, 동안에 및/또는 이후에 환자의 혈관을 치료할 수 있다. 혈관 중재술에는 스텐트를 사용하거나 사용하지 않는 혈관성형술, 이식 혈관, 죽종절제술 및 혈관 통로 기능장애, 또는 다른 수술적 시술이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 생체접합체 또는 그의 조성물을 혈전증, 탈락된(denuded) 내피의 노출된 콜라겐으로 혈소판 결합, 내피 탈락으로 인한 염증, 내막 과형성증 또는 혈관경련을 비롯하여 혈소판 활성화를 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 생체접합체를 예를 들어 정맥내로 또는 근육으로 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위한 다른 적합한 경로에는 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피부, 피하, 경피, 피내 및 표피내 전달이 포함된다. 비경구 투여를 위한 적합한 수단에는 니들 (마이크로니들 포함) 인젝터, 주입 기술, 및 카테터-기재 전달이 포함된다. 카테터-기재 전달에는 벌룬 상의 코팅으로서, 다공성 벌룬을 통해 또는 스텐트 상의 코팅으로서 생체접합체를 전달하는 것이 포함될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 생체접합체를 전신으로 전달할 수 있다 (즉, 표적 혈관으로 직접 전달하는 것이 아니라, 비경구 투여에 의해 전달함).
이들 생체접합체는 물리적 펩티드-콜라겐 상호작용을 통해 노출된 콜라겐에 국부적으로 결합한다. 콜라겐에 결합하면, 생체접합체는 1) 혈소판 부착/활성화에 대한 장벽으로서 작용, 2) MMP 접근을 억제함으로써 분해로부터 콜라겐의 보호, 및 3) 성장 인자 FGF-2, FGF-7 및 FGF-10을 격리시켜 내피 및 상피 세포 증식 및 이동의 촉진을 비롯한 수많은 기능을 갖는다.
생체접합체는 콜라겐 상의 혈소판 결합 부위에 대해 경쟁하여 혈소판 결합 및 활성화를 예방할 수 있다. 생체접합체의 글리칸 골격은 음으로 하전되어 물 분자와 결합하여, 혈소판 및 단백질 부착을 방지하는, 콜라겐 표면 상에 친수성 장벽을 생성할 수 있다. 정상 혈소판 기능을 억제하는 것이 아니라 노출된 콜라겐을 차단함으로써, 생체접합체는 염증 및 내막 과형성증으로 가는 캐스케이드의 초기 단계를 다루는 국부 치료를 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 혈액투석을 받는 환자에서 혈관 통로 기능장애의 충족되지 않는 요구를 다루는 신규한 접근법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 접근법은 본원에 기재된 생체접합체로부터 고안된 관내 혈관 코팅의 생성을 수반한다. 동정맥루 (AVF)에서, 예를 들어 신생내막 과형성증은 AVF의 정맥 부분에서 대부분 발생한다. 내막 과형성증의 초기 메카니즘이 동맥 및 정맥에서 유사하지만, 생성된 병변에는 차이가 있다. 말초 혈관 질환의 설정에서 정맥 신생내막 과형성증은 동맥 내막 과형성증에 비해 더욱 공격적인 병변을 갖는 경향이 있고, 혈관성형술에 대해 불량한 반응을 갖는다. 개시된 생체접합체가 동맥 손상에서 혈소판 결합 및 내막 과형성증을 예방하는 능력은 신생내막 과형성증을 감소 또는 예방하는 그의 능력에 기여하는 것으로 고려된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 혈액투석이 필요한 환자에서 동정맥루 (AVF) 성숙을 개선시키거나, 또는 대안적으로 AVF에서 개방성을 증가시키거나, 정맥의 내경을 확대시키거나, 협착을 감소시키거나, 신생내막 과형성증을 감소시키거나, 혈역학적 스트레스를 감소시키거나, 내피 또는 평활근 세포 손상을 감소시키거나, 혈관 통로 기능장애를 감소시키거나 또는 응고 또는 염증을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 AVF 내강의 내벽에 용액을 적용하고, AVF에서 혈류를 복구 또는 개시하는 것을 수반하며, 여기서 용액은 본 개시내용의 생체접합체이거나 또는 상기 용액은 유효량의 본 개시내용의 생체접합체를 포함한다.
노출된 콜라겐에 특이적으로 결합하는 합성 중합체 관내 코팅을 사용하는 국부 치료가 개시되며, 여기서 코팅은 혈관 벽으로의 혈소판 부착을 차단하여, 혈전증 및 내막 과형성증에서 개시 사건을 억제할 수 있다. 추가로, 코팅은 혈관 벽의 신속한 재내피화를 촉진하여 보다 빠른 치유를 일으킬 수 있다. 생성하는 동안 개시된 생체접합체를 본래의 AV 누공에 적용하면 유의하게 적은 협착 및 더 큰 직경을 가진 누공을 제공할 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 혈류가 개시되기 전에 새로 생성된 AVF의 경우, 혈류가 개시되기 약 10분 미만 전에 용액을 적용한다. 일부 실시양태에서, 혈류가 개시되기 약 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2분, 또는 60, 45, 30, 20, 10 또는 5초 미만 전에 용액을 적용한다. 일부 실시양태에서, 혈류가 개시되기 적어도 1분 또는 적어도 2, 3, 4, 5분 전에 용액을 적용한다. 일부 실시양태에서, 혈류가 개시되기 적어도 1분 또는 적어도 2, 3, 4, 5분 후에 용액을 적용한다. 일부 실시양태에서, 혈류가 개시된 다음, 용액의 전달을 허용하도록 중단시킨다. 일부 실시양태에서, 문합 생성 이전에, 문합 생성 동안에 또는 문합 생성 이후에 용액을 혈관에 적용한다. 일부 실시양태에서, 문합 생성 이전에, 문합 생성 동안에 또는 문합 생성 이후에 용액을 혈관에 적용한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 니들, 카테터 또는 다른 약물-전달 기기를 이용하여 AVF를 통해 용액을 플러슁한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 AVF를 용액으로 플러슁한 후에 AVF를 밀폐시키는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 용액을 적용하는 것 외에도 또는 대안적으로, 수립된 AVF의 근위 및 정맥 및 동맥을 클램핑하여 생성된 밀폐된 내강으로 용액을 주사한다.
한 실시양태에서, 정맥의 내경을 확대시키는데 이용되는 AVF의 정맥 부분의 확장 또는 문지름 이후 약 5분 이내에 (또는 대안적으로 10, 9, 8, 7, 6, 4, 3 또는 2분 이내에) 용액을 적용한다. 정맥 내부의 기계적으로 확장되거나 문지른 표면에 용액을 적용하면, 문지르는 동안 생체접합체의 손실을 감소시킬 수 있다.
추가로, 개시된 조성물 및 방법을, 혈관 통로에 있는 혈관 벽으로 본 개시내용의 용액을 적용하고, 혈관 통로에서 혈류를 복구 또는 개시하는 것을 수반할 수 있는, 환자에서 혈관 통로를 수립하는 방법에 이용할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 상기 벽은 혈관의 내벽이지만, 임의의 혈관의 외벽일 수도 있다.
일부 실시양태에서, 혈관 통로는 동정맥루 (AVF), 동정맥 이식편 (AVG), 또는 비경구 영양법, 화학요법 또는 혈장분리를 위해 사용되는 내구성 있는 혈관 통로이다. 상기 용액은 혈관 벽이 혈소판에 노출되는 것을 감소시키는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 혈관 벽은 손상 또는 수술적 시술로 인해 혈류에 노출된 세포 또는 조직을 포함한다. 용액의 적용이 혈관 통로, 예컨대 AVF 및 AVG에서 개방성을 개선시키거나, 생존을 개선시키거나, 혈류를 개선시키거나, 혈관 내경을 확대시키거나 또는 협착을 감소시키는 것으로 확인된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 혈액투석이 필요한 환자에서 동정맥루 (AVF) 성숙을 개선시키거나, 또는 대안적으로 AVF에서 개방성을 증가시키거나, 정맥의 내경을 확대시키거나, 협착을 감소시키거나, 신생내막 과형성증을 감소시키거나, 혈역학적 스트레스를 감소시키거나, 내피 또는 평활근 세포 손상을 감소시키거나, 혈관 통로 기능장애를 감소시키거나 또는 응고 또는 염증을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 AVF 내강의 내벽에 용액을 적용하고, AVF에서 혈류를 복구 또는 개시하는 것을 수반하며, 여기서 용액은 유효량의 본 개시내용의 생체접합체를 포함한다.
생체접합체를 경피적으로 또는 정맥내로 환자의 혈관 내부에 투여할 수 있는 것으로 고려된다. 경피 또는 정맥내 전달은 수술적 누공 생성 이후에 환자의 치료를 허용한다. 생체접합체를 혈관의 치료, 혈관의 유지, 또는 누공 실패의 예방을 위해 전달할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 유지 적용, 예컨대 벌룬-보조된 성숙, 벌룬 혈관성형술, 죽종절제술, 또는 응괴 제거 시술을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 또한, 일부 실시양태에서, 혈액투석 시점에서, 특히 시술 이후에, 특히 높은 유속이 내피 및 이식편 또는 누공으로의 주사를 손상시키는 경우에는 예방적 전달이 협착의 유지 및 예방에 유익한 것으로 고려된다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 사용되는 생체접합체는 헤파린 및 약 5 내지 약 10, 또는 약 7개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 헤파린에 결합한다. 특정 실시양태에서, 헤파린은 미분획된 헤파린 (UFH) 또는 저분자량 헤파린 (LMWH)이다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 사용되는 생체접합체는 헤파린 및 약 5 내지 약 20% 관능화를 가진 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 헤파린에 결합한다.
c. 혈관 중재술
혈관 중재술, 예컨대 경피적 관상동맥 중재술은 콜라겐-결합 합성 생체접합체의 투여 이전에, 동안에 또는 이후에 임의의 통상적인 절차에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 방법과 함께 사용하기 위해 고려되는 혈관 중재 시술의 예에는 스텐트 시술, 죽종절제술, 및 혈관성형술, 예컨대 벌룬 혈관성형술이 포함된다. 혈관 중재 시술은 혈관을 일시적으로 폐색시키는 것일 수 있거나 (예를 들어, 벌룬 혈관성형술), 또는 혈관을 일시적으로 폐색시키지 않는 것일 수 있다 (예를 들어, 비-벌룬 혈관성형술 시술, 벌룬 혈관성형술과 관련이 없는 스텐트 시술 등). 예시적인 전달 방법에는 카테터, 비경구 투여, 벌룬 상의 코팅, 다공성 벌룬, 코팅된 스텐트, 및 이들의 임의의 조합 또는 혈관 중재 시술 동안 약물을 전달하는 공지된 임의의 다른 방법이 포함된다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 혈관 중재 시술 동안에, 보존적 아미노산 치환을 갖는 이들 임의의 생체접합체는 탈락된 내피의 노출된 콜라겐으로 혈소판 결합, 혈소판 활성화, 혈전증, 내피 탈락으로 인한 염증, 내막 과형성증 및/또는 혈관경련을 억제할 수 있거나, 또는 내피 세포 증식을 자극할 수 있거나, 또는 탈락된 혈관에서 콜라겐에 결합할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 혈관 중재 시술 동안에, 본 문단에 기재된 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 생체접합체는 탈락된 내피의 노출된 콜라겐으로 혈소판 결합, 혈소판 활성화, 내막 과형성증 및/또는 혈관경련을 억제할 수 있거나, 또는 탈락된 혈관에서 콜라겐에 결합할 수 있다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 환자 (예를 들어, 혈전증, 탈락된 내피의 노출된 콜라겐으로 혈소판 결합, 혈전증, 내피 탈락으로 인한 염증, 내막 과형성증, 또는 혈관경련을 비롯하여 혈소판 활성화를 억제하기 위한 치료가 필요한 환자)에게 투여할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 예를 들어 정맥내로 또는 근육으로 투여할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 경로에는 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피부, 피하, 경피, 피내 및 표피내 전달이 포함된다. 비경구 투여를 위한 적합한 수단에는 니들 (마이크로니들 포함) 인젝터, 주입 기술, 및 카테터-기재 전달이 포함된다. 예시적인 실시양태에서, a) 제약상 활성인 양의 콜라겐-결합 합성 생체접합체; b) 약 pH 4.5 내지 약 pH 9 범위의 pH를 제공하기 위한 제약상 허용가능한 pH 완충화제; c) 약 0 내지 약 300 밀리몰의 농도 범위의 이온 강도 조정제; 및 d) 약 0.25% 내지 약 10% 전체 제제 중량의 농도 범위의 수용성 점도 개질제, 또는 임의의 개별 성분 a), b), c) 또는 d), 또는 a), b), c) 및 d)의 임의의 조합을 포함하는 비경구 투여 또는 카테터-기재 전달을 위해 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 사용하는 제약 제제가 제공된다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 임의의 적합한 방식으로 환자의 혈관 내로 (예를 들어, 동맥 또는 정맥으로) 투여할 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 혈관 중재술 이전에, 동안에 또는 이후에 환자의 혈관에 투여할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 혈관 중재술, 예컨대 경피적 관상동맥 중재술 (PCI)에는 예를 들어 스텐트 시술, 죽종절제술, 이식, 및 혈관성형술, 예컨대 벌룬 혈관성형술이 포함될 수 있다. 예시적으로, 혈관 중재술은 동맥, 예컨대 관상 동맥 또는 정맥을 일시적으로 폐색시키는 것일 수 있거나 (예를 들어, 벌룬 혈관성형술), 또는 동맥 또는 정맥을 일시적으로 폐색시키지 않는 것일 수 있다 (예를 들어, 비-벌룬 혈관성형술 시술, 벌룬 혈관성형술과 관련이 없는 스텐트 시술 등). 예시적인 전달 방법에는 카테터, 비경구 투여, 벌룬 상의 코팅, 다공성 벌룬, 코팅된 스텐트, 및 이들의 임의의 조합 또는 혈관 중재 시술 동안 약물을 전달하는 공지된 임의의 다른 방법이 포함된다. 한 예시적인 실시양태에서, 표적 혈관에는 관상 동맥, 예를 들어 환자의 심장 조직으로 혈액을 공급하는 임의의 혈관, 예컨대 본래의 관상동맥뿐 아니라 예를 들어 초기 관상 동맥 바이패스 시술에서 환자에게 이식된 것이 포함된다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체가 투여되고 혈관 중재 시술이 수행되는 표적 혈관은 폐쇄, 예컨대 협착, 또는 혈관을 통한 혈류의 감소를 초래하는 일부 다른 형태의 완전한 또는 부분적인 폐쇄를 함유할 수 있다. 따라서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 카테터 (예를 들어, 확장 카테터, 선위(over-the-wire) 혈관성형술 벌룬 카테터, 주입 카테터, 신속 교환 또는 모노레일 카테터, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 카테터)를 통해 혈관에 전달할 수 있으며, 상기 카테터는 환자에게 경피적으로 삽입되고, 환자의 혈관을 통해 표적 혈관으로 쓰레딩된다. 다양한 카테터-기재 기기, 예컨대 미국 특허 번호 7,300,454 (본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것들이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 카테터가 사용되는 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 전달하기 위해 사용되는 카테터는 혈관 중재술이 수행되는 카테터와 동일할 수 있거나, 또는 상이한 카테터 (예를 들어, 동일하거나 상이한 피부 절개부를 통해 환자에게 경피적으로 삽입되고/거나 동일하거나 상이한 경로를 통해 환자의 혈관을 거쳐 표적 혈관에 쓰레딩되는 카테터)일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 표적 혈관에 직접 주사할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 전신으로 전달할 수 있다 (즉, 표적 혈관으로 직접 전달하는 것이 아니라, 카테터-기재 전달 없이 비경구 투여에 의해 전달함).
혈관이 폐쇄 (예를 들어, 협착)를 함유하는 경우에는, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 폐쇄가 있는 부위 또는 폐쇄로부터 멀리 있는 부위 또는 이들 둘 다에서 표적 혈관으로 직접 전달함으로써 투여를 수행할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 폐쇄에 근접한 하나 이상의 부위로 전달할 수 있다. 예시적으로, 콜라겐-결합 합성 생체접합체가 전달되는 동안 카테터 팁을 움직이지 않고 유지시킬 수 있거나, 또는 콜라겐-결합 합성 생체접합체가 전달되는 동안 카테터 팁을 움직일 수 있다 (예를 들어, 처음에는 폐쇄로부터 먼 위치에서부터, 폐쇄로 또는 폐쇄를 통하여, 또는 폐쇄에 근접한 위치까지 근위 방향으로).
상기 나타낸 바와 같이, 한 실시양태에서, 혈관 중재술, 예를 들어 경피적 관상동맥 중재술 이전의 시점에서 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 환자의 혈관에 직접 투여할 수 있다. 예를 들어, 콜라겐-결합 합성 생체접합체의 전달을 혈관 중재술 직전에 (예를 들어, 혈관 중재술 이전 약 1시간 이내에, 예컨대 약 30분 이내에, 약 15분 이내에 및/또는 약 5분 이내에) 수행할 수 있다. 임의적으로, 표적 혈관으로 콜라겐-결합 합성 생체접합체의 직접 전달을 모든 또는 일부 혈관 중재 시술 동안에 및/또는 이러한 시술의 완료 이후에 수행할 수 있거나, 또는 표적 혈관으로 콜라겐-결합 합성 생체접합체의 직접 전달을 혈관 중재 시술의 완료 이전에 중단할 수 있고, 이후에는 권고되지 않는다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체의 전달은 지속적일 수 있거나, 또는 단일 또는 다중 투여를 통해 이루어질 수 있다. 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 표적 혈관에 투여하기 이전에, 동안에 및/또는 이후에, 동일한 콜라겐-결합 합성 생체접합체 또는 하나 이상의 상이한 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 투여할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에서 사용되는 생체접합체는 헤파린 및 약 5 내지 약 10, 또는 약 7개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 헤파린에 연결된다.
d. 내피 기능장애
한 실시양태에서, 본 개시내용은 내피 기능장애와 관련된 질환으로 고통받는 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 본 개시내용의 합성 콜라겐 결합 생체접합체를 포함한다.
본원에서 콜라겐 결합 생체접합체가 급성 및 만성 질환 모두에서 내피 기능장애 또는 손상의 염증성 영향을 감소시킬 수 있음이 발견되었다. 이러한 생체접합체는 기능장애 내피로의 혈소판 결합을 억제 또는 감소시키고, 따라서 혈소판-매개된 염증을 감소시키는 것으로 고려된다. 염증은 혈소판 프로세스, 예컨대 혈소판-혈소판 결합, 혈소판-백혈구 결합, 백혈구 누출의 촉진, 또는 국부적 및 지역적 사이토킨의 혈소판으로부터의 간단한 방출을 통해 활성화될 수 있다.
추가로, 콜라겐 결합 생체접합체가 염증전 사이토킨 분비 및 노출된 내피 세포에서 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴의 발현을 감소시키는 것으로 발견되었다. 더욱이, 이들 생체접합체는 내피 세포 증식 및 이동을 증가시킬 수 있고, 심지어 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF)의 존재하에서도 IL-6 분비 및 혈관 손상 마커 생산을 감소시킬 수 있다. 콜라겐 결합 생체접합체의 투여에 의해 발생하는 이들 효과의 일부 또는 모두는 기능장애 내피에서 염증의 감소에 기여하는 것으로 고려된다.
또한, 일부 실시양태에서, 내피 기능장애가 있는 혈관 부위에서 염증을 예방 또는 감소시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 부위에 본 개시내용의 합성 콜라겐 결합 생체접합체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 수반한다.
용어 "내피 기능장애"는 또한 "내피 세포 (EC) 기능장애," "기능장애 내피," 또는 "기능장애 내피 세포"로도 지칭된다. 내피 기능장애는 내피 세포의 세포 표면 상에 있는 ICAM 및 VCAM 수용체 또는 셀렉틴 수용체의 비차단 또는 노출을 이용하여 결정할 수 있다. P-셀렉틴 및 E-셀렉틴은 손상 및 염증으로 인해 세포 표면 상에서 일시적으로 발현되고 기능장애 내피에서 만성적으로 발현되는 노출된 셀렉틴 수용체의 예이다.
일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 침투된 내피 라이닝 또는 손상된 내피 세포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 글리코칼릭스의 손실을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 내피 세포의 표면 상에서 발현되고 순환에 노출된 셀렉틴 단백질을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 상기 부위에는 염증이 있다.
한 측면에서, 혈관 부위는 물리적 수단에 의해 탈락되지 않고, 혈관 중재 시술을 받지 않고 있다. 혈관 중재 시술의 비제한적인 예에는 경피적 관상동맥 중재술 (PCI)이 포함된다.
"기능장애 내피 세포" 또는 "내피 세포 (EC) 기능장애"는 ICAM 및 VCAM 수용체, 뿐만 아니라 내피 세포의 세포 표면 상의 셀렉틴 수용체의 비차단 또는 노출을 의미한다. P-셀렉틴 및 E-셀렉틴은 손상 및 염증으로 인해 세포 표면 상에서 일시적으로 발현되고 기능장애 내피에서 만성적으로 발현되는 노출된 셀렉틴 수용체의 예이다. 만성 기능장애 내피 세포를 가진 질환 상태의 예는 당뇨병이다.
내피 세포가 기능적 모세관의 유지에 참여하기 때문에, 내피의 기능장애는 광범위한 질환의 발병에서 중요한 역할을 한다.
예를 들어, 내피는 말초 혈관 질환, 졸중, 심장 질환, 당뇨병, 인슐린 내성, 만성 신부전, 종양 성장, 전이, 정맥 혈전증, 및 몇몇 바이러스 감염성 질환에 직접적인 관련이 있다 (Rajendran et al., Int . J. Biol . Sci ., 9:1057-1069, 2013).
본원에 사용된 "내피 기능장애와 관련된 질환"은 내피 기능장애에 의해 적어도 부분적으로 초래되거나 내피 기능장애를 유도하는 인간 질환 또는 상태를 지칭한다. 따라서, 내피 기능장애와 관련된 질환의 치료는 기능장애 내피를 회복시키거나 또는 기능장애 내피로 인해 발생하는 상태 또는 증상, 예컨대 염증, 내막 과형성증 및 혈전증을 예방 또는 개선시킴으로써 상기 질환을 치료하는 것을 지칭한다.
본 발명자들은 콜라겐 결합 생체접합체를 인간 환자의 임의의 장기로 효과적으로 전달할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 콜라겐 결합 생체접합체를 사용하여, 임의의 장기에서 발생하고 하기 임의의 질환 또는 상태와 관련있는 내피 기능장애를 치료할 수 있다.
혈관 질환. 콜라겐 결합 생체접합체에 의해 적합하게 치료될 수 있는 혈관 질환에는 죽상동맥경화성 질환 (말초 동맥 질환, 관상 동맥 질환, 졸중, 경동맥 질환, 신장 동맥 협착), 정맥 혈전성 질환 (심부 또는 표재성 정맥 혈전증), 및 의원성 대혈관 손상 (혈관성형술, 스텐트 배치를 이용하는 혈관성형술, 죽종절제술, 혈전절제술, 투석 통로 생성, 바이패스를 위한 정맥 수확, 뇌동맥류 또는 대동맥류의 치료)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
신장 질환. 콜라겐 결합 생체접합체에 의해 적합하게 치료될 수 있는 신장 질환에는 급성 요세관 괴사, 당뇨병성 만성 신부전, 홍반성 신장염, 신섬유증 및 급성 사구체신염이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
폐 질환. 콜라겐 결합 생체접합체에 의해 적합하게 치료될 수 있는 폐 질환에는 특발성 폐 섬유증 (IPF), 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식 및 폐기종이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
혈액 질환. 콜라겐 결합 생체접합체에 의해 적합하게 치료될 수 있는 혈액 질환에는 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 파종성 혈관내 응고 (DIC), 및 용혈성 요독 증후군 (HUS)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
추가로, 피부 질환, 예컨대 전신성 경화증, 류마티스성 질환, 예컨대 맥관염 장애 (낭창), 류마티스성 관절염 및 다른 염증 관절염 (통풍), 위장관 질환, 예컨대 염증 장 질환, 간염, 및 간 섬유증, 종양 성장, 종양 전이, 감염성 질환, 예컨대 바이러스성 및 박테리아성 패혈증, 신경계 질환, 예컨대 다발성 경화증, 치매, 및 근위축성 측삭 경화증, 안과 질환, 예컨대 황반 변성, 녹내장, 및 포도막염, 내분비계 질환, 예컨대 당뇨병, 및 복합 부위 통증 증후군 (CRPS) 또한 본 개시내용의 콜라겐 결합 생체접합체로 치료될 수 있다.
치료할 질환 및 발병한 기능장애 내피의 위치에 따라 최적화된 치료를 위해 펩티드 종류, 글리칸에 부착된 펩티드의 개수, 및 GAG 골격 종류와 관련하여 생체접합체를 조정할 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 수많은 분자 고안 변수를 조작하여 목표 효과를 최적화시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 콜라겐 결합 펩티드(들)이 부착된 데르마탄 술페이트 (DS)를 포함한다. DS는 상피 세포 이동 및 증식을 촉진시키는 그의 능력 때문에 유용할 수 있다.
본원에 제공된 생체접합체의 다른 변이체 또한 기능장애 내피에서 염증을 억제할 수 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서 생체접합체는 "SILY"로 지칭되는 콜라겐 결합 펩티드, 예컨대 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1)를 포함한다.
e. 조직 유착
본 발명의 방법은 조직 유착, 예컨대 심장, 복부 또는 골반 유착과 관련된 다양한 적용에 유용하다. 본 발명의 방법은 이들 지속적인 결함 또는 재발성 손상을 치료 및/또는 예방하는데 유용할 것으로 고려된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 장기의 부자연스럽게 노출된 조직 상에 제약 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 환자에서 복부 또는 골반 유착을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 글리칸에 결합된 약 1 내지 약 80개 콜라겐 결합 펩티드(들)을 갖는 글리칸을 포함하는 생체접합체를 포함한다. "노출된 조직"은 정상적인 건강한 상태하에 보이는 새로운 환경에 노출된 조직 또는 표면, 또는 정상적인 건강한 상태하에 상이한 장기의 세포 또는 조직에 노출되지 않았으나 질환 또는 손상으로 인해 또는 의학적 시술 동안에 노출된 조직 (즉, "부자연스럽게 노출된 조직")을 지칭할 수 있다.
유착은 정상적으로 연결되지 않은 조직 및/또는 장기에 비정상적으로 결합하는 섬유성 반흔 조직의 띠이다. 유착은 다양한 유형의 손상 또는 조직 장애, 예를 들어 예컨대 수술, 외상, 감염, 화학요법, 방사선, 이물질 또는 암에 반응하여 발생한다.
복부 및 골반 유착은 복부의 수술적 시술의 일반적인 합병증이다. 복부 유착은 중증의 임상적 문제 및/또는 통증을 유발할 수 있다. 예를 들어, 복부 유착-관련된 임상적 문제에는 소장 폐색, 속발성 여성 불임, 자궁외 임신, 만성 복부 및 골반 통증, 및 어렵고 위험한 재수술이 포함될 수 있다 (Diamond, M. P., Freeman, M. L. Eur. Soc. Human. Repro. Embryo. 2001; 7(6): 567-576). 복부 유착은 정상적으로 연결되지 않은 조직 및/또는 장기를 테더링하고 신경의 견인을 초래함으로써 통증을 유발할 수 있다. 장이 폐색되기 시작하면, 팽창은 통증을 유발할 것이다. 따라서, 복부 유착은 위장 장애 및 장 폐색 또는 폐쇄를 유발할 수 있다. 극심한 사례에서, 복부 유착은 혈류를 위축시켜 조직 사멸을 초래하는, 위장 부분의 둘레에 섬유성 띠를 형성할 수 있다.
상기 임상적 문제 및/또는 통증을 유발하는 복부 및 골반 유착의 표준 치료는 수술적 중재술이다. 그러나, 수술적 중재술은 추가의 복부 유착 및 추가의 합병증의 위험을 수반한다. 따라서, 복부 유착을 위한 대안적인 치료 및/또는 예방 옵션은 환자에서 복부 유착을 치료 및/또는 예방하는데 유익할 것이다.
한 측면에서, 복부 조직 또는 장기에 대한 외상은 복부 조직 및/또는 장기 사이에 섬유성 조직 띠를 생성한다. 본원에 기재된 방법이 상기 복부 유착을 치료 및/또는 예방하는데 유용할 것으로 고려된다.
본원에 제공된 합성 생체접합체는 통증을 최소화하고, 복부 조직 및/또는 장기 콜라겐을 분해로부터 보호하고, 상피 이동 및 상피 증식을 촉진시키기 위해 보호성 수화 층을 제공할 것으로 고려된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 복부 장기의 노출된 조직 상에 제약 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 환자에서 복부 유착을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 글리칸에 결합된 약 1 내지 약 80개 콜라겐 결합 펩티드(들)을 갖는 글리칸을 포함하는 생체접합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 부자연스럽게 노출된 건 및/또는 건초에 본원에 기재된 생체접합체 또는 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 환자에서 건 - 건초 유착을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 부자연스럽게 노출된 심장 조직에 본원에 기재된 생체접합체 또는 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 환자에서 심장 조직 유착을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 상기 조직은 수술, 외상, 감염, 화학요법, 방사선, 이물질 또는 암으로 인해 노출된다. 한 측면에서, 상기 조직은 수술에 의해 노출된다.
일부 측면에서, 상기 조성물을 스프레이로서 적용한다. 일부 측면에서, 상기 조직은 복막 조직이다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 또한 예컨대 손 또는 손가락 수술 동안에 정형외과적 유착을 감소 또는 예방하는데 유용한 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 유착을 감소 또는 예방하는데 있어서 관련 기술분야에 공지된 다른 방법, 예컨대 조직을 둘러싸는 메쉬의 사용을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 제공된 생체접합체를 사용하여, 복부 조직 및/또는 장기의 세포외 매트릭스 성분을 표적으로 하는 합성 생체접합체를 복부 유착의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 환자에서 복부 유착을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 복부 조직 혈관화를 촉진시키기 위해 펩티드 종류, 글리코사미노글리칸 (GAG) 골격에 부착된 펩티드의 개수, 및 GAG 골격 종류와 관련하여 본원에 제공된 합성 생체접합체를 조정할 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 수많은 분자 고안 변수를 조작하여 목표 효과를 최적화시킬 수 있다.
본원에 제공된 합성 생체접합체는 조직 유착을 예방 또는 감소시키기 위해 수술시 부속물로서 사용될 수 있다. 수술 동안, 합성 생체접합체를 잠재적으로 유착성인 조직 또는 장기에 전달할 수 있다. 이러한 투여는 수술후 유착을 예방 및/또는 감소시키는데 도움이 될 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 합성 생체접합체를 수술 부위에 전달하는 것을 포함하는, 수술후 유착을 감소 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 합성 생체접합체는 복부 시술, 예컨대 복강경 복부 수술에 유용할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본원에 제공된 합성 생체접합체를 잠재적으로 유착성인 조직 또는 장기에 복강경을 통해 전달할 수 있다. 합성 생체접합체 DS-SILY를 이용하는 치료는 손상 영역에 결합하고, 통증을 최소화시키기 위해 보호성 수화 층을 제공하고, 복부 조직 및/또는 장기 콜라겐을 분해로부터 보호하고, 상피 이동 및 상피 증식을 촉진시킴으로써 복부 유착을 치료 및/또는 예방할 것으로 고려된다. 또한, 하루에 다수회의 치료를 필요로 하지 않도록 DS-SILY는 손상된 영역에서 지속될 것으로 고려된다.
한 실시양태에서, 펩티도글리칸은 콜라겐 결합 펩티드(들)이 부착된 데르마탄 술페이트 (DS)를 포함한다. DS는 상피 세포 이동 및 증식을 촉진하는 그의 능력 때문에 복부 유착 적용에 유용할 수 있다.
본원에 제공된 생체접합체의 다른 변이체는 또한 유형 I 콜라겐으로의 결합을 통해 혈소판 활성화를 억제할 수 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 제공된 합성 생체접합체는 펩티도글리칸의 글리칸 부분이 콜라겐 결합 펩티드(들) (예를 들어, RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1), "SILY"로 지칭됨)을 통해 손상 부위로 테더링되게 함으로써 복부 유착을 치료 및/또는 예방할 것이다.
또 다른 실시양태에서, 생체접합체는 헤파린 (Hep-SILY), 데르마탄 술페이트 (DS-SILY), 또는 덱스트란 (Dex-SILY)을 포함하는, 글리칸에 접합된 콜라겐 결합 펩티드(들) (예를 들어, SILY)을 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 개방 수술 동안 또는 복강경을 통해 또는 수술 부위로의 접근을 허용하는 임의의 장비를 통해 투여될 수 있다.
f. 위식도 손상
한 실시양태에서, 본 개시내용은 환자에서 위식도 손상의 치료 또는 예방의 충족되지 않는 요구를 다루는 신규한 접근법을 제공한다. 일반적으로, 상기 신규한 접근법은 본 개시내용의 합성 콜라겐-결합 생체접합체를 포함하는 제약 조성물을 손상된 위식도 조직 또는 세포에 적용하는 것을 수반한다.
조성물의 이러한 적용은 합성 콜라겐-결합 생체접합체의 코팅을 생성할 수 있다. 합성 콜라겐-결합 생체접합체는 물리적 펩티드-콜라겐 상호작용을 통해 식도 조직 상의 노출된 콜라겐에 결합할 수 있다. 콜라겐에 결합하면, 생체접합체는 1) 혈소판 부착/활성화에 대한 장벽으로서 작용, 2) MMP 접근을 억제함으로써 분해로부터 콜라겐의 보호, 및 3) 성장 인자 FGF-2, FGF-7 및 FGF-10을 격리시켜 내피 및 상피 세포 증식 및 이동을 촉진시킴으로써 조직 복구 및 회복의 유도를 비롯한 수많은 기능을 갖는다.
한 실시양태에서, 콜라겐-결합 생체접합체는 공유 부착된 콜라겐-결합 펩티드를 갖는 다당류 골격을 포함한다. 합성 생체접합체는 콜라겐 상에서 혈소판 결합 부위에 대해 경쟁하고, 혈소판 결합 및 활성화를 예방한다. 글리칸 골격은 음으로 하전되어 물 분자와 결합하여, 혈소판 및 단백질 부착을 방지하는, 콜라겐 표면 상에 친수성 장벽을 생성할 수 있다. 정상 혈소판 기능을 억제하는 것이 아니라 노출된 콜라겐을 차단함으로써, 생체접합체는 염증 및 내막 과형성증으로 가는 캐스케이드의 초기 단계를 다루는 국부 치료를 제공할 수 있다.
이 신규한 접근법은 위식도 손상, 예컨대 이로 제한되지 않지만 GERD 또는 의원성 중재술에 의해 초래되는 손상의 치료에 유용한 것으로 고려된다. 하기 카테고리의 환자는 이 접근법으로부터 이익을 얻을 수 있는 것으로 추가로 고려된다:
- 위식도십이지장 내시경 (EGD) 절제를 요하는 GERD 관련 식도 병변
- EGD 확장을 요하는 식도 협착
- EGD 치료를 요하는 소화성 궤양 질환 (PUD).
제약 조성물을 손상된 위식도 조직의 하나 이상의 병변에 국소 적용할 수 있다. 조직의 제한된 접근성 때문에, 전달 기기의 사용이 유익한 것으로 고려된다. 예를 들어, 조성물을 위식도십이지장 내시경 (EGD) 시술 동안에 또는 위식도십이지장 내시경을 이용하여 전달할 수 있다.
팔리페르민은 구강 점막염의 치료에 유용한 각질형성세포 성장 인자이다. 본 개시내용의 생체접합체는 콜라겐에 결합하고, 내인성 또는 외인성 성장 인자, 예컨대 팔리페르민에도 결합한다. 따라서, 이러한 제제는 팔리페르민의 표적화된 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 팔리페르민을 전달하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 생체접합체 및 팔리페르민을 포함하는 조성물을 환자에게 적용하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 생체접합체 및 팔리페르민을 포함하는 조성물을 구강 점막염의 치료를 필요로 하는 환자에게 적용하는 것을 포함하는, 환자에서 구강 점막염을 치료하는 방법을 제공한다.
손상된 위식도 조직의 회복을 촉진시키기 위해 펩티드 종류, 글리칸에 부착된 펩티드의 개수, 및 GAG 골격 종류와 관련하여 용액으로 제공되는 생체접합체를 조정할 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 수많은 분자 고안 변수를 조작하여 목표 효과를 최적화시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 생체접합체는 콜라겐 결합 펩티드(들)이 부착된 데르마탄 술페이트 (DS)를 포함한다. DS는 상피 세포 이동 및 증식을 촉진시키는 그의 능력 때문에 유용할 수 있다.
본원에 제공된 생체접합체의 다른 변이체는 또한 유형 I 콜라겐으로의 결합을 통해 혈소판 활성화를 억제할 수 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 생체접합체는 콜라겐 결합 펩티드, 예컨대 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) ("SILY"로 지칭됨)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생체접합체는 헤파린 (Hep-SILY), 데르마탄 술페이트 (DS-SILY) 또는 덱스트란 (Dex-SILY)과 같은 글리칸에 접합된 콜라겐 결합 펩티드(들) (SILY)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 생체접합체는 헤파린 및 1 내지 5개 분지형 콜라겐 결합 펩티드, 예컨대 (GQLYKSILY)4-(KRR)2-KGSG (서열식별번호: 391)를 포함한다.
g. 창상 치유
본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여, 조직의 온전함이 손상된 임의의 상태, 예컨대 만성 창상 및 급성 창상, 결합 조직에서의 창상, 및 근육, 골 및 신경 조직에서의 창상을 치료할 수 있다. 본원에 사용된 "창상"에는 수술적 절개부, 화상, 산 및 알칼리 화상, 저온 화상 (동상), 일광 화상, 궤양, 욕창, 자상, 찰과상, 열상, 신체적 외상에 의해 초래된 창상, 선천성 장애에 의해 초래된 창상, 치주 질환에 의해 또는 치과 수술후 초래된 창상, 및 암 조직 또는 종양과 관련된 창상이 포함된다. 본원에 기재된 바와 같이, 창상은 급성 또는 만성 창상을 포함할 수 있다.
급성 창상은 온전한 피부에 대한 외적 손상에 의해 초래되고, 수술적 창상, 물린 상처, 화상, 자상, 열상, 찰과상 등이 포함된다. 만성 창상에는 예를 들어 피부 또는 상피 조직의 온전함을 위태롭게 하는 내인성 메카니즘에 의해 초래된 창상, 예를 들어 하지 궤양, 족부 궤양 및 욕창이 포함된다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 창상 치유를 촉진시키거나 또는 반흔 형성을 감소시키는 조성물을 임의의 시점에서 사용하여 만성 또는 급성 창상을 치료할 수 있다. 예를 들어, 수술적 절개부와 관련된 급성 창상을 수술 이전에, 수술 동안에 또는 수술 이후에 치료하여, 환자에서 창상 치유를 촉진시키고/거나 반흔 형성을 감소시킬 수 있다. 다양한 예시적인 측면에서, 창상 치유를 촉진시키고/거나 반흔 형성을 감소시키기 위해 필요에 따라 본원에 기재된 조성물을 환자에게 1회 용량 또는 다중 용량으로 투여할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "반흔 형성의 감소"는 반흔의 극한 인장 강도의 증가 및/또는 가시적인 반흔 길이의 감소를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 반흔 형성의 감소는 또한 환자에서 반흔 형성의 완전한 억제 또는 가시적인 반흔의 완전한 제거를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "창상 치유의 촉진"은 만성 또는 급성 창상의 부분적인 또는 완전한 치유를 일으키거나 또는 급성 또는 만성 창상에 의해 초래된 임의의 증상을 감소시키는 것을 의미한다. 이러한 증상에는 통증, 출혈, 조직 괴사, 조직 궤양화, 반흔 형성, 및 급성 또는 만성 창상으로 인한 것으로 공지된 임의의 다른 증상이 포함된다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 창상 치유를 촉진시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 콜라겐-결합 합성 생체접합체는 환자에서 창상의 치유를 촉진시킨다. 본원에 기재된 임의의 다양한 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체는 콜라겐 원섬유형성을 정상적으로 조절하는 생체접합체의 아미노산 서열의 일부분과 아미노산 상동성을 갖는 비정상적인 콜라겐-결합 합성 생체접합체 또는 원섬유형성 콜라겐-결합 합성 생체접합체일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 반흔 형성을 감소시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 콜라겐-결합 합성 생체접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 콜라겐-결합 합성 생체접합체는 환자에서 반흔 형성을 감소시킨다. 본원에 기재된 임의의 다양한 실시양태에서, 콜라겐-결합 합성 생체접합체는 콜라겐 원섬유형성을 정상적으로 조절하는 생체접합체의 아미노산 서열의 일부분과 아미노산 상동성을 갖는 비정상적인 콜라겐-결합 합성 생체접합체 또는 원섬유형성 콜라겐-결합 합성 생체접합체일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 창상 치유의 촉진 및/또는 반흔 형성의 감소를 위한 조성물을 창상으로 조성물의 전달에 적합한 임의의 물질, 예컨대 면, 종이, 부직포, 직포, 및 편직물, 모노필라멘트, 필름, 겔, 스폰지 등에 스며들게 할 수 있다. 예를 들어, 수술적 봉합사 (모노필라멘트, 꼬은실 또는 뜨개실), 흡착 패드, 경피 패치, 붕대, 화상용 드레싱, 및 면, 종이, 부직포, 직포, 편직물, 필름 및 스폰지 형태의 팩킹이 사용될 수 있다.
4.2 셀렉틴 , ICAM / VCAM -결합 생체접합체의 사용 방법
본원에 기재된 생체접합체를 사용하여, 내피로의 혈소판 결합을 억제하고, 노출된 상피로 혈중 다른 세포의 결합을 억제하고, 혈소판 활성화를 억제하고, 혈전증을 억제하고, 내피 탈락으로 인한 염증을 억제하고, 내막 과형성증을 억제하고/거나 혈관경련을 억제할 수 있다. 본원에 기재된 생체접합체는 또한 내피 세포 증식을 자극할 수 있고, 혈관 표면에 결합할 수 있다. 임의의 이들 실시양태에서, 상기 언급한 이들 효과는 혈관 중재 시술, 예컨대 카테터-기재 시술 동안에 발생할 수 있다. 임의의 이들 실시양태에서, 적어도 하나의 ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 결합 단위를 갖는 펩티드를 포함하는 상기 기재된 임의의 생체접합체를 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 내피 기능장애와 관련된 질환으로 고통받는 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 본원에 제공된 유효량의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 내피로의 혈소판 결합, 혈소판 활성화, 혈전증, 내피 탈락으로 인한 염증, 내막 과형성증 및/또는 혈관경련 중 하나 이상을 억제하는 것, 또는 내피 세포 증식을 자극하거나 탈락된 혈관에 결합하는데 있어서 그의 효과에 관한 것이다.
본원에 제공된 ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 결합 생체접합체는 급성 및 만성 질환 둘 다에서 내피 기능장애 또는 손상의 염증성 영향을 감소시킬 수 있다. 이러한 접합체가 기능장애 내피로의 혈소판 결합을 억제하거나 감소시키고, 따라서 혈소판-매개된 염증을 감소시키는 것으로 고려된다. 염증은 혈소판 프로세스, 예컨대 혈소판-혈소판 결합, 혈소판-백혈구 결합, 백혈구 누출의 촉진, 또는 국부적 및 지역적 사이토킨의 혈소판으로부터의 간단한 방출을 통해 활성화될 수 있다.
또한, 일부 실시양태에서, 내피 기능장애가 있는 혈관 부위에서 염증을 예방 또는 감소시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 부위에 본 개시내용의 ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 결합 생체접합체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 수반한다.
본원에서 기재된 바와 같이, ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 결합 생체접합체는 혈류에 노출된 내피 셀렉틴 및 ICAM/VCAM 및/또는 셀렉틴 수용체를 표적으로 하며, 여기서 이들은 탈락된 내피로의 혈소판 결합을 방지하고, 결과적으로 혈소판 활성화, 혈전증, 내피 탈락으로 인한 염증, 내막 과형성증 및 혈관경련을 방지하는데 충분한 시간 동안 결합된 채로 유지될 수 있다. 따라서, 이들 생체접합체는 기능장애 내피 세포에서 셀렉틴 또는 ICAM/VCAM의 생성을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 수 있다.
용어 "내피 기능장애"는 또한 "내피 세포 (EC) 기능장애," "기능장애 내피," 또는 "기능장애 내피 세포"로도 지칭된다. 내피 기능장애는 내피 세포의 세포 표면 상에 있는 ICAM 및 VCAM 수용체 또는 셀렉틴 수용체의 비차단 또는 노출을 이용하여 결정할 수 있다. P-셀렉틴 및 E-셀렉틴은 손상 및 염증으로 인해 세포 표면 상에서 일시적으로 발현되고 기능장애 내피에서 만성적으로 발현되는 노출된 셀렉틴 수용체의 예이다.
일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 침투된 내피 라이닝 또는 손상된 내피 세포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 글리코칼릭스의 손실을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 내피 기능장애는 내피 세포의 표면 상에서 발현되고 순환에 노출된 셀렉틴 단백질을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 상기 부위에는 염증이 있다.
본원에 사용된 "내피 기능장애와 관련된 질환"은 내피 기능장애에 의해 적어도 부분적으로 초래되거나 내피 기능장애를 유도하는 인간 질환 또는 상태를 지칭한다. 따라서, 내피 기능장애와 관련된 질환의 치료는 기능장애 내피를 회복시키거나 또는 기능장애 내피로 인해 발생하는 상태 또는 증상, 예컨대 염증, 내막 과형성증 및 혈전증을 예방 또는 개선시킴으로써 상기 질환을 치료하는 것을 지칭한다.
개시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 생체접합체는 기능장애 내피 세포를 치료하여 염증 질환을 치료, 억제 또는 약화시킬 수 있다. Ley, "The role of selectins in inflammation and disease", Vol. 9, Elsevier Science, (2003)에 의해 입증되는 바와 같이 기능장애 내피 세포는 염증 및 다른 염증 질환과 관련이 있다. 다른 염증 질환 및 자가면역 질환의 예에는 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 진성 당뇨병, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 녹내장, 요독증, 패혈증 및 장기 부전이 포함된다.
셀렉틴 수용체의 생성을 억제하고 VCAM/ICAM 수용체를 차단함으로써, 생체접합체를 사용하여 이들 일시적 또는 만성 질환으로 고통받는 환자를 치료할 수 있다. 이들 질환의 억제 또는 약화와 관련된 셀렉틴 억제의 증거는 Ridings et al., "A dual-binding antibody to E- and L-selectin attenuates sepsis-induced lung injury", Vol. 152, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, (1995), Weyrich et al., "In Vivo Neutralization of P-Selectin Protects Feline Heart and Endothelium in Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury", Vol. 91, The American Society for Clinical Investigation, (1993)에 의해 뒷받침되고, 상기 각각의 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 일부 암 또한 염증 및 만성 염증과 관련이 있으며, 따라서 생체접합체를 사용하여 신생물 세포 성장을 치료, 억제 또는 약화시킬 수 있는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.
예시적인 실시양태에서, 혈관 중재 시술에서 본 개시내용의 ICAM, VCAM 및/또는 셀렉틴 결합 생체접합체를 사용하여, 예를 들어 탈락된 내피로 혈소판 결합, 혈소판 활성화, 혈전증, 내피 탈락으로 인한 염증, 내막 과형성증 및 혈관경련 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 예방할 수 있다. 본원에 기재된 생체접합체는 또한 기능장애 내피 세포에서 셀렉틴 또는 ICAM/VCAM의 생성을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에서 사용되는 생체접합체는 글리칸 및 약 5 내지 약 15개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 DGEATD (서열식별번호: 156), DGEATDGSG (서열식별번호: 396), ITDGEA (서열식별번호: 154) 및/또는 ITDGEAGSG (서열식별번호: 395) 중 적어도 하나의 서열, 및 IELLQAR (서열식별번호: 117), IELLQARGSG (서열식별번호: 393), IDLMQAR (서열식별번호: 119) 및/또는 IDLMQARGSG (서열식별번호: 394) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합한다. 한 실시양태에서, 글리칸은 데르마탄 술페이트이다.
4.3 히알루론산-결합 생체접합체의 사용 방법
a. 연골 교체
본원에 기재된 한 실시양태에서, 생물재료 연골 교체 조성물을 위한 첨가제가 제공된다. 상기 첨가제는 기존 생물재료 연골 교체 물질에 첨가하기 위한 히알루론산-결합 합성 생체접합체를 포함한다. 히알루론산-결합 합성 생체접합체에 대해 이전에 기재된 실시양태를 본원에 기재된 첨가제에 적용가능하다.
본원에 사용된 문구 "기존 생물재료 연골 교체 물질"은 신체에서 손상된, 결함있는 또는 손실된 연골을 교체하기 위해 사용될 수 있는 생물학적으로 상용성인 조성물을 의미한다. 다양한 유형의 기존 생물재료 연골 교체 조성물이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 고려된다. 예를 들어, 기존 생물재료 연골 또는 골 교체 조성물에는 데노보(DeNovo®) NT 천연 조직 이식편 (짐머(Zimmer)), 마이오리젠(MaioRegenTM) (제이알아이 리미티드(JRI Limited)), 또는 바이오메트(Biomet)에 의해 생산된 저온보존된 골관절 조직 수집물이 포함된다.
한 실시양태에서, 생물재료 골 또는 연골 교체물을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 합성 생체접합체 및 기존 생물재료 골 또는 연골 교체 물질을 조합하는 단계를 포함한다. 히알루론산-결합 합성 생체접합체에 대해 이전에 기재된 실시양태를 본원에 기재된 방법에 적용가능하다.
한 실시양태에서, 환자에서 관절염을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 히알루론산-결합 합성 생체접합체를 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 합성 생체접합체는 관절염과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시킨다. 히알루론산-결합 합성 생체접합체에 대해 이전에 기재된 실시양태를 본원에 기재된 방법에 적용가능하다.
다양한 실시양태에서, 관절염의 치료 방법에 사용되는 합성 생체접합체는 관절염과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시킨다. 관절염과 관련된 다양한 증상, 예컨대 이로 제한되지 않지만 통증, 경직, 압통, 염증, 부기, 홍조, 온기 및 감소된 이동성이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 상기 관절염 증상은 관절, 건, 또는 신체의 다른 부분에 존재할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "감소시키는"은 관절염의 증상을 예방하거나 또는 완전히 또는 부분적으로 완화시키는 것을 의미한다.
다양한 실시양태에서, 관절염은 골관절염 또는 류마티스성 관절염이다. 골관절염 및 류마티스성 관절염의 병인 및 임상적 증상은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이 방법의 한 실시양태에서, 합성 생체접합체는 투여후 윤활제로서 작용하거나 또는 연골 손실을 예방한다. 또 다른 실시양태에서, 합성 생체접합체는 환자에서 골의 관절화를 예방한다. 예를 들어, 합성 생체접합체는 감소된 또는 손상된 연골을 가진 환자에서 골 대 골의 관절화를 억제한다.
한 실시양태에서, 환자에서 ECM 성분의 분해를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 환자의 연골에서 ECM 성분의 분해를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 히알루론산-결합 합성 생체접합체를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 히알루론산-결합 합성 생체접합체에 대해 이전에 기재된 실시양태를 본원에 기재된 방법에 적용가능하다. 한 실시양태에서, 합성 생체접합체는 매트릭스 메탈로 프로테아제, 예를 들어 아그레카나제에 대해 저항성이다.
또 다른 실시양태에서, 환자에서 히알루론산 분해를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 히알루론산-결합 합성 생체접합체를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 히알루론산-결합 합성 생체접합체에 대해 이전에 기재된 실시양태를 본원에 기재된 방법에 적용가능하다.
또 다른 실시양태에서, 콜라겐 분해를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 콜라겐의 존재하에 히알루론산-결합 합성 생체접합체를 히알루론산과 접촉시키는 단계, 및 콜라겐 분해를 감소 또는 예방하는 단계를 포함한다. 히알루론산-결합 합성 생체접합체에 대해 이전에 기재된 실시양태를 본원에 기재된 방법에 적용가능하다.
또 다른 실시양태에서, 콘드로이틴 술페이트 분해를 감소 또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 콜라겐의 존재하에 히알루론산-결합 합성 생체접합체를 히알루론산과 접촉시키는 단계, 및 콘드로이틴 술페이트 분해를 감소 또는 예방하는 단계를 포함한다. 히알루론산-결합 합성 생체접합체에 대해 이전에 기재된 실시양태를 본원에 기재된 방법에 적용가능하다.
"ECM 성분 분해의 감소", 예를 들어 히알루론산, 콜라겐 또는 콘드로이틴 술페이트 분해의 감소는 각각 히알루론산, 콜라겐 또는 콘드로이틴 술페이트의 분해를 완전히 또는 부분적으로 감소시키는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 환자에서 "히알루론산 분해의 감소"는 히알루론산 분해율을 감소시키는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, "콜라겐 분해의 감소"는 콜라겐 분해율을 감소시키는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, "콘드로이틴 술페이트" 분해의 감소는 콘드로이틴 술페이트 분해율을 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 기재된 한 실시양태에서, 환자에서 조직 결함을 교정 또는 변경하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 조직 결함부에 히알루론산 및 히알루론산-결합 합성 생체접합체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결함이 교정 또는 변경된다. 히알루론산-결합 합성 생체접합체에 대해 이전에 기재된 실시양태를 본원에 기재된 방법에 적용가능하다. 한 실시양태에서, 조직 결함은 미관상 결함이다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에서 사용된 생체접합체는 콘드로이틴 술페이트 및 약 5 내지 약 10개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58) 또는 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357) 중 적어도 하나의 서열을 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 콘드로이틴 술페이트에 결합한다.
4.4 기타
a. 각막 창상
본 발명의 방법은 각막 창상 치유와 관련된 다양한 적용에 유용하다. 한 실시양태에서, 치료를 요하는 각막 창상 상태는 각막에 대한 외상성 손상의 결과이다 (Chiapella, A. P., Rosenthal, A. R. British Journal of Ophthalmology, 1985; 69: 865-870). 또 다른 실시양태에서, 치료를 요하는 창상 상태는 안과적 시술에 의해 초래되고, 예컨대 에피-라식(Epi-Lasik)은 각막 손상을 유도한다 (Tuft, S.J., et al. Br J Ophthalmol. 1993; 77: 243-247). 일부 경우에, 지속적인 결함 또는 재발성 손상은 치유의 부족 또는 불완전한 치유로 인해 발생할 수 있다 (Kenyon, K. R. Cornea and Refractive Atlas of Clinical Wisdom. Eds. S.A. Melki and M. A. Fava. SLACK, Inc.: New Jersey, US, 2011; pp. 39). 본 발명의 방법이 이들 지속적인 결함 또는 재발성 손상을 치료하는데 유용할 것으로 고려된다.
한 측면에서, 각막 상피에 대한 손상은 각막 장벽 기능에 결함을 발생시키고, 본원에 기재된 방법이 상기 손상의 치료에 유용할 것으로 고려된다.
본원에 제공된 합성 생체접합체를 사용하여, 각막 창상 치유에 관련된 특이적인 세포외 매트릭스 성분을 표적으로 하는 생체접합체를 각막 창상 치유를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 환자에서 각막 창상 치유를 촉진시킬 수 있다. 각막 창상 치유를 촉진시키기 위해 펩티드 종류, 글리칸에 부착된 펩티드의 개수, 및 글리칸 종류와 관련하여 본원에 제공된 합성 생체접합체를 조정할 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 수많은 분자 고안 변수를 조작하여 목표 효과를 최적화시킬 수 있다.
데르마탄 술페이트 및 콜라겐 결합 펩티드(들) (예를 들어, RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1), "SILY"로 지칭됨)을 포함하는 생체접합체를 이용하는 치료는 손상 영역에 결합하고, 통증을 최소화하기 위해 보호성 수화 층을 제공하고, 분해로부터 각막 콜라겐을 보호하고/거나 상피 이동 및/또는 상피 증식을 촉진시킴으로써 각막 창상 치유를 강화시킬 것으로 고려된다. 또한, 하루에 다수회의 치료를 필요로 하지 않도록 생체접합체는 손상된 영역에서 지속될 것으로 고려된다.
b. 루브리신 모방체
본원에 기재된 합성 생체접합체는 콜라겐 및 히알루론산 둘 다를 갖는 조직, 예컨대 연골, 윤활액 및 유리체액을 교체, 재생 또는 보충하는데 유용할 수 있다. 특히, 콜라겐-결합 및 히알루론산 결합 펩티드 둘 다를 갖는 펩티도글리칸은 루브리신 모방체로서 하기 기재된 방법 및 용도에 특히 유용할 수 있다.
연골 변성. 관절 연골 상의 잘 윤활된 표면은 윤활 관절의 최적 기능화를 유도한다. 그러나, 골관절염에서 발생하는 바와 같이, 감소된 윤활은 연골 분해 및 원섬유화를 일으키고, 이는 다시 관절 기능장애 및 통증에 기여한다. 감소된 윤활은 또한 다른 형태의 관절염, 예컨대 류마티스성 관절염에서 관절 기능장애 및 통증을 유발한다.
본원에 제공된 합성 생체접합체를 사용하여, 동물 관절의 내부 표면에 있는 조직 라이닝에 의해 분배되는 점액질 당단백질인 루브리신의 기능 중 일부를 모방할 수 있다. 따라서, 합성 생체접합체는 관절 연골 표면에서 윤활을 강화시켜 연골의 마모-유도된 침식을 감소시키는 잠재성을 갖는다. 합성 생체접합체는 또한 효소-유도된 분해로부터 히알루론산 및 유형 II 콜라겐과 같은 거대분자를 보호하는 잠새성을 갖는다.
따라서, 본원에 기재된 세포외 매트릭스-결합 합성 생체접합체를 포함하는 제약 조성물을 연골 변성의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 연골 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 세포외 매트릭스-결합 합성 생체접합체를 포함하는 제약 조성물을 활액강에 주사하여 환자를 치료한다.
또한, 합성 생체접합체를 사용하여 외상성 및 사이토킨-유도된 효소적 분해로부터 관절 연골 매트릭스를 보호함으로써 관절 연골 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있는 것으로 고려된다.
유리체액 변성. 유리체액은 안구의 후방 공간을 채우는 점탄성의 겔과 같은 물질이다. 예를 들어 유리체의 혼탁화 또는 물리적 붕괴 및 액화가 발생한 경우에 기능장애 유리체액을 교체하기 위해, 그리고 망막 수술 동안에 일시적인 또는 영구적인 유리체 교체로서 유리체 교체가 이용되어 왔다. 적합한 유리체 교체물은 투명하고, 생체적합성이며, 천연 유리체와 유사한 밀도 및 굴절률을 가져야 한다.
따라서, 본원에 기재된 세포외 매트릭스-결합 합성 생체접합체를 포함하는 제약 조성물을 유리체액 변성의 치료 및/또는 예방이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 유리체액 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
수핵 변성. 수핵은 척추 디스크에 존재하는 겔과 같은 물질이고, 압축 하중하에 각각의 디스크 내에서 모든 방향으로 수압을 분산시키는 기능을 가지며, 연골세포-유사 세포, 콜라겐 원섬유, 및 히알루론산 쇄를 통해 응집하는 생체접합체 아그레칸으로 이루어진다. 수핵 변성은 디스크가 척추체 사이에서 균일하게 효과적으로 하중을 전달하는 능력을 감소시키고, 섬유륜으로 공지된 디스크의 환상 부위에서 손상을 유발한다. 상기 환에서의 균열 또는 찢어짐은 디스크 탈출 또는 파열로 이어지고, 디스크 부위에서 신경의 침범 및 최종적으로 허리 또는 하지 통증을 일으킬 수 있다.
수핵만을 교체하는 시도 또한 있었다. 수핵의 교체는 변성된 핵의 초기 탈수를 멈추게 하고, 디스크를 완전히 수화된 상태로 되돌려, 관련 통증을 비롯한 변성 과정을 연기 또는 방지하고, 척추 분절에 대한 기계적 기능을 복구시키는 것으로 예상된다.
본원에 기재된 합성 생체접합체는 섬유륜에 결합하여 이를 보호할 것으로 고려된다. 따라서, 본원에 기재된 세포외 매트릭스-결합 합성 생체접합체를 포함하는 제약 조성물을 섬유륜 변성의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 섬유륜 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 또한, 본원에 기재된 세포외 매트릭스-결합 합성 생체접합체를 포함하는 제약 조성물을 수핵 변성의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 수핵 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에서 사용되는 생체접합체는 콘드로이틴 술페이트 및 약 1 내지 약 20개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58) 또는 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357) 중 적어도 하나의 서열, 및 WYRGRL (서열식별번호: 29) 또는 WYRGRLGSG (서열식별번호: 392) 중 적어도 하나의 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에서 사용되는 생체접합체는 콘드로이틴 술페이트 및 약 1 내지 약 20개 펩티드를 포함하고, 여기서 펩티드는 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58) 또는 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357) 중 적어도 하나의 서열, 및 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열을 포함한다.
5. 조성물
한 실시양태에서, 생체접합체를 조성물로 투여한다. 본 개시내용은 생체접합체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 사용될 수 있는 제약상 허용가능한 담체는 통상의 기술자에게 공지된 것, 예컨대 물 또는 염수이다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 상기 성분뿐 아니라 그와 관련된 양은 의도된 용도 및 전달 방식에 따라 결정된다. 조성물에 사용되는 희석제 또는 담체는 이들이 생체접합체의 목적하는 효과를 약화시키지 않도록 선택될 수 있다. 적합한 조성물의 예에는 수용액, 예를 들어 등장성 염수 중 용액, 5% 글루코스가 포함된다. 다른 널리 공지된 제약상 허용가능한 액체 담체, 예컨대 알콜, 글리콜, 에스테르 및 아미드를 이용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 부형제, 예컨대 이로 제한되지 않지만 이온 강도 조정제, 용해도 증진제, 당, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, pH 완충화제, 계면활성제, 안정화 중합체, 보존제 및/또는 공용매를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 수용액이다. 수용액은 제제화 용이성뿐 아니라, 용액 주입 수단에 의한 조성물의 투여 용이성을 기준으로 조성물 제제에 사용하기에 적합하다. 특정 실시양태에서, 조성물은 현탁액, 점성 또는 반점성 겔, 또는 다른 유형의 고체 또는 반고체 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 관련 기술분야에 매우 널리 공지된 발포체, 연고, 액체 세정제, 겔, 스프레이 및 리포좀의 형태를 갖는다. 대안적으로, 국소 투여는 제공된 생체접합체를 펌프-카테터 시스템, 지속적인 또는 선택적 방출 기기, 또는 부착 장벽으로부터 선택된 기기를 통해 치료 부위에 주입하는 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 정맥 또는 동맥의 내벽에 직접 적용되거나 그와 접촉하는 용액이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 중합체 매트릭스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 흡수성이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 pH 완충화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 윤활성 강화제를 함유한다.
특정 실시양태에서, 중합체 매트릭스 또는 중합체 물질은 조성물을 위한 제약상 허용가능한 담체 또는 지지체로서 사용된다. 본원에 기재된 중합체 물질은 천연 또는 비천연 중합체, 예를 들어 당, 펩티드, 단백질, 라미닌, 콜라겐, 히알루론산, 이온성 및 비이온성 수용성 중합체; 아크릴산 중합체; 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리비닐알콜; 셀룰로스성 중합체 및 셀룰로스성 중합체 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 에테르화 셀룰로스; 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 락트산과 글리콜산의 공중합체, 또는 다른 중합체성 작용제 천연 및 합성 모두를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 필름, 겔, 발포체 또는 및 다른 투여 형태로 제제화된다.
적합한 이온 강도 조정제에는 예를 들어 글리세린, 프로필렌 글리콜, 만니톨, 글루코스, 덱스트로스, 소르비톨, 염화나트륨, 염화칼륨, 및 다른 전해질이 포함된다.
특정 실시양태에서, 생체접합체의 용해도를 증진시킬 필요가 있을 수 있다. 이러한 경우에, 적절한 제제화 기술, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 용해도-증진 조성물, 예컨대 만니톨, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴록사머 등의 도입을 이용하여 용해도를 증가시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 윤활성 강화제를 함유한다. 본원에 기재된 바와 같이, 윤활성 강화제는 제약상 허용가능한 담체의 점도를 개질시킬 수 있는 1종 이상의 제약상 허용가능한 중합체 물질을 지칭한다. 적합한 중합체 물질에는 이온성 및 비이온성 수용성 중합체; 히알루론산 및 그의 염, 콘드로이틴 술페이트 및 그의 염, 덱스트란, 젤라틴, 키토산, 겔란, 다른 생체접합체 또는 다당류, 또는 이들의 임의의 조합; 셀룰로스성 중합체 및 셀룰로스성 중합체 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 에테르화 셀룰로스; 콜라겐 및 개질된 콜라겐; 갈락토만난, 예컨대 구아 검, 로커스트 빈 검 및 타라 검, 뿐만 아니라 주요 구조 성분으로서 만노스 및/또는 갈락토스 모이어티를 함유하는 상기 천연 검 및 유사한 천연 및 합성 검으로부터 유래된 다당류 (예를 들어, 히드록시프로필 구아); 검, 예컨대 트래거캔쓰 및 크산턴 검; 겔란 검; 알기네이트 및 알긴산나트륨; 키토산; 비닐 중합체; 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리비닐알콜; 카르복시비닐 중합체 또는 가교된 아크릴산 중합체, 예컨대 중합체의 "카르보머" 부류, 예를 들어 카르보폴(CarbopolTM) 상표명하에 상업적으로 입수가능한 카르복시폴리알킬렌; 및 다양한 다른 점성 또는 점탄성 물질이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 윤활성 강화제는 히알루론산, 데르마탄, 콘드로이틴, 헤파린, 헤파란, 케라틴, 덱스트란, 키토산, 알기네이트, 아가로스, 젤라틴, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 에테르화 셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 포비돈, 카르보머 941, 카르보머 940, 카르보머 971P, 카르보머 974P, 또는 그의 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 윤활성 강화제를 생체접합체와 동시에 적용한다. 대안적으로, 한 실시양태에서, 윤활성 강화제를 생체접합체와 순차적으로 적용한다. 한 실시양태에서, 윤활성 강화제는 콘드로이틴 술페이트이다. 한 실시양태에서, 윤활성 강화제는 히알루론산이다. 윤활성 강화제는 조성물의 점도를 변화시킬 수 있다.
상기 윤활성 강화제의 구조, 화학적 성질 및 물리적 성질과 관련하여 보다 상세한 설명에 대해서는 예를 들어 U.S. 5,409,904, U.S. 4,861,760 (겔란 검), U.S. 4,255,415, U.S. 4,271,143 (카르복시비닐 중합체), WO 94/10976 (폴리비닐 알콜), WO 99/51273 (크산턴 검), 및 WO 99/06023 (갈락토만난)을 참고한다. 전형적으로, 제제의 목적하는 pH를 달성하기 위해 비-산성 윤활성 강화제, 예컨대 중성 또는 염기성 작용제를 이용한다.
일부 실시양태에서, 생체접합체를 미네랄, 아미노산, 당, 펩티드, 단백질, 비타민 (예컨대, 아스코르브산), 또는 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 히알루론산, 피브린, 엘라스틴, 또는 아그레칸, 또는 성장 인자, 예컨대 표피 성장 인자, 혈소판-유래된 성장 인자, 형질전환 성장 인자 베타, 또는 섬유모세포 성장 인자, 및 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타손 또는 점탄성 변경제, 예컨대 이온성 및 비이온성 수용성 중합체; 아크릴산 중합체; 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리비닐알콜; 셀룰로스성 중합체 및 셀룰로스성 중합체 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 에테르화 셀룰로스; 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 락트산과 글리콜산의 공중합체, 또는 다른 중합체성 작용제 천연 및 합성 모두와 조합할 수 있다.
본원의 조성물에 사용하기에 적합한 pH 완충화제에는 예를 들어 아세테이트, 보레이트, 카르보네이트, 시트레이트, 및 포스페이트 완충제, 뿐만 아니라 염산, 수산화나트륨, 산화마그네슘, 인산일칼륨, 비카르보네이트, 암모니아, 탄산, 염산, 시트르산나트륨, 시트르산, 아세트산, 인산수소이나트륨, 보락스, 붕산, 수산화나트륨, 디에틸 바르비투르산, 및 단백질, 뿐만 아니라 다양한 생물학적 완충제, 예를 들어 TAPS, 비신(Bicine), 트리스(Tris), 트리신(Tricine), HEPES, TES, MOPS, PIPES, 카코딜레이트, 또는 MES가 포함된다. 특정 실시양태에서, 적절한 완충제 시스템 (예를 들어, 인산나트륨, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨 또는 붕산)을 조성물에 첨가하여, 보관 조건하에 pH 변동을 방지한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 인산염 완충된 염수 (PBS) 용액 (즉, 인산나트륨, 염화나트륨, 및 일부 제제에서는 염화칼륨 및 인산칼륨을 함유함)이다. 특정한 농도는 사용되는 작용제에 따라 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, pH 완충제 시스템 (예를 들어, 인산나트륨, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨 또는 붕산)을 첨가하여 pH를 약 pH 4 내지 약 pH 8, 또는 약 pH 5 내지 약 pH 8, 또는 약 pH 6 내지 약 pH 8, 또는 약 pH 7 내지 약 pH 8의 범위로 유지한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 4 내지 약 pH 8 범위 내의 pH를 유지하도록 완충제를 선택한다. 일부 실시양태에서, pH는 약 pH 5 내지 약 pH 8이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 염수 완충제이다. 특정 실시양태에서, pH는 약 pH 4 내지 약 pH 8, 또는 약 pH 3 내지 약 pH 8, 또는 약 pH 4 내지 약 pH 7이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 중합체성 매트릭스, pH 완충화제, 윤활성 강화제 및 생체접합체를 포함하는 필름, 겔, 패치 또는 액체 용액의 형태를 갖고, 상기 조성물은 임의적으로 보존제를 함유하고, 상기 조성물의 pH는 약 pH 4 내지 약 pH 8 범위 내에 있다.
보다 높은 농도의 생체접합체를 전달하기 위해 계면활성제가 조성물에 사용된다. 계면활성제는 억제제를 용해시키고, 콜로이드 분산액, 예컨대 미셀 용액, 마이크로에멀젼, 에멀젼 및 현탁액을 안정화시킨다. 적합한 계면활성제는 폴리소르베이트, 폴록사머, 폴리오실 40 스테아레이트, 폴리옥실 피마자유, 틸록사폴, 트리톤, 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함한다. 한 실시양태에서, 계면활성제는 12.4 내지 13.2 범위의 친수성/친유성/균형 (HLB)을 갖고, 트리톤X114 및 틸록사폴과 같은 것은 안과적 사용에 허용가능하다.
특정 실시양태에서, 안정화 중합체, 즉, 보호제(demulcent)를 조성물에 첨가한다. 안정화 중합체는 이온성/하전된 예, 더욱 구체적으로 물리적 안정성을 위해 (-)10-50 mV의 제타-전위를 나타낼 수 있도록 표면 상에 음의 전하를 보유하는 중합체이어야 하고, 물에서 분산액을 형성할 수 있다 (즉, 수용성). 한 실시양태에서, 안정화 중합체는 가교된 폴리아크릴레이트 부류, 예컨대 카르보머 및 페물렌(Pemulen®), 구체적으로 카르보머 974p (폴리아크릴산)로부터의 고분자전해질 또는 고분자전해질들 (한 가지가 넘는 경우)을 약 0.1% 내지 약 0.5% w/w 범위로 포함한다
한 실시양태에서, 조성물은 혈관의 세포외 매트릭스로 생체접합체의 투과성을 증가시키는 작용제를 포함한다. 바람직하게는, 투과성을 증가시키는 작용제는 벤즈알코늄 클로라이드, 사포닌, 지방산, 폴리옥시에틸렌 지방 에테르, 지방산의 알킬 에스테르, 피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 피루브산, 피로글루탐산 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
원치않는 오염물, 예컨대 이로 제한되지 않지만 내독소 및 감염원을 제거하기 위해 생체접합체를 멸균할 수 있다. 생체접합체의 구조 및 생물적 성질에 불리한 영향을 미치지 않는 멸균 기술을 이용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 통상적인 멸균 기술, 예컨대 프로필렌 옥시드 또는 에틸렌 옥시드 처리, 멸균 여과, 기체 플라즈마 멸균, 감마 방사선, 전자 빔 및/또는 과산, 예컨대 과아세트산으로의 멸균을 이용하여 생체접합체를 소독 및/또는 멸균할 수 있다. 한 실시양태에서, 생체접합체를 하나 이상의 멸균 공정에 가할 수 있다. 대안적으로, 생체접합체를 플라스틱 랩 또는 호일 랩을 비롯한 임의 유형의 용기로 랩핑할 수 있고, 추가로 멸균할 수 있다.
일부 실시양태에서, 사용하는 동안 미생물 오염을 방지하게 위해 보존제를 조성물에 첨가한다. 조성물에 첨가되는 적합한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 알킬 파라벤, 알킬 벤조에이트, 클로로부탄올, 클로로크레솔, 세틸 알콜, 지방 알콜, 예컨대 헥사데실 알콜, 수은의 유기금속 화합물, 예컨대 아세테이트, 페닐수은 니트레이트 또는 보레이트, 디아졸리디닐 우레아, 디이소프로필 아디페이트, 디메틸 폴리실록산, EDTA 염, 비타민 E 및 그의 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 벤조도데시늄 브로마이드, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 페닐에틸 알콜, 에덴테이트 이나트륨, 소르브산, 또는 폴리쿼터늄-1로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보존제는 약 0.001% 내지 약 1.0% w/v의 수준으로 사용된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 보존제를 함유하지 않고, "보존되지 않은"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 단위 용량 조성물은 멸균성이지만, 보존되지 않은 것이다.
일부 실시양태에서, 조성물의 전달을 용이하게 하기 위해 생체접합체 및 다른 작용제의 별도의 또는 순차적인 투여가 필요하다. 특정 실시양태에서, 생체접합체 및 다른 작용제를 상이한 투여 빈도 또는 간격으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 생체접합체는 매일 투여할 수 있는 반면에, 다른 작용제는 덜 빈번하게 투여할 수 있다. 추가로, 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 생체접합체 및 다른 작용제를 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 이용하여 투여할 수 있다.
생체접합체를 투여하기 위해 임의의 효과적인 방식을 이용할 수 있다. 예를 들어, 생체접합체를 단일 용량 또는 다중 용량 매일 방식으로 투여할 수 있다. 추가로, 매일 치료의 대안으로서 시차적인 방식, 예를 들어 주당 1 내지 5일을 이용할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 생체접합체를 국소적으로, 예컨대 필름, 겔, 패치 또는 액체 용액에 의해 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 완충된 멸균 수용액 중에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 약 1 내지 약 100 센티푸아즈 (cps), 또는 약 1 내지 약 200 cps, 또는 약 1 내지 약 300 cps, 또는 약 1 내지 약 400 cps의 점도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 용액은 약 1 내지 약 100 cps의 점도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 약 1 내지 약 200 cps의 점도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 약 1 내지 약 300 cps의 점도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 약 1 내지 약 400 cps의 점도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 주사가능한 액체 용액의 형태를 갖는다. 다른 실시양태에서, 조성물은 점성 액체, 즉, 수백 내지 수천 cps의 점도를 갖는 액체, 겔 또는 연고로서 제제화된다. 이들 실시양태에서, 생체접합체를 적절한 제약상 허용가능한 담체 중에 분산 또는 용해시킨다.
카테터-기재 전달을 위해 생체접합체를 사용하기 위한 예시적인 조성물은 a) 본원에 기재된 합성 생체접합체; b) 제약상 허용가능한 담체; c) 중합체 매트릭스; d) 약 pH 4 내지 약 pH 8 범위의 pH를 제공하는 pH 완충화제; 및 e) 약 0.25% 내지 약 10% 전체 화학식량 농도 범위의 수용성 윤활성 강화제, 또는 임의의 개별 성분 a), b), c), d) 또는 e), 또는 a), b), c), d) 또는 e)의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
예시적인 제제는 a) 본원에 기재된 생체접합체; b) 제약상 허용가능한 담체; c) 중합체 매트릭스; 및 d) 약 pH 4 내지 약 pH 8 범위의 pH를 제공하는 pH 완충화제를 포함할 수 있고, 여기서 용액은 액체 용액의 경우 약 3 내지 약 30 cps의 점도를 갖는다.
주사에 의한 투여를 위해 본 개시내용에 의해 고려되는 예시적인 조성물은 또한 수성 또는 유성 현탁액, 또는 에멀젼을 참깨유, 옥수수유, 면실유 또는 낙화생유와 함께, 뿐만 아니라 엘릭시르, 만니톨, 덱스트로스, 또는 멸균 수용액, 및 유사한 제약 비히클을 포함할 수 있다. 염수 중의 수용액 또한 주사를 위해 통상적으로 사용되지만, 본 개시내용의 문맥에서는 덜 바람직하다. 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등 (및 그의 적합한 혼합물), 시클로덱스트린 유도체, 및 식물성유 또한 사용될 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 미생물 작용을 방지할 수 있다.
멸균 주사 용액은 적절한 용매 중에 필요한 양의 성분을 필요에 따라 상기 열거한 다양한 다른 성분들과 함께 도입한 다음, 멸균 여과함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분들을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 다른 필요한 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
본원에 기재된 생체접합체를 포함하는 제약 조성물의 제조시에, 활성 성분을 보통 부형제 또는 담체에 희석하고/거나 캡슐, 사쉐, 종이 또는 다른 용기의 형태일 수 있는 담체 내에 동봉한다. 부형제가 희석제로 작용하는 경우, 이는 활성 성분을 위한 비히클, 담체 또는 매질로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질 (상기와 같음)일 수 있다. 따라서, 조성물은 필름, 겔, 패치, 분말, 로젠지, 사쉐, 엘릭시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸 (고체로서 또는 액체 매질 중에), 예를 들어 활성 화합물을 10 중량% 이하로 함유하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴 필름, 겔, 패치, 멸균 주사 용액, 및 멸균 포장 분말의 형태일 수 있다.
적합한 부형제의 일부 예에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 검 아카시아, 인산칼슘, 알기네이트, 트래거캔쓰, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 멸균수, 시럽, 및 메틸 셀룰로스가 포함된다. 제제는 추가로 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산마그네슘, 및 광유; 습윤제; 유화제 및 현탁화제; 보존제, 예컨대 메틸- 및 프로필히드록시-벤조에이트; 감미제 및 향미제를 포함할 수 있다.
약물 전달을 위해 사용되는 필름은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 침출성 불순물이 없는 무독성 비자극성 중합체, 예컨대 다당류 (예를 들어, 셀룰로스, 말토덱스트린 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 중합체는 친수성이다. 다른 실시양태에서, 상기 중합체는 소수성이다. 필름은 그가 적용되는 조직에 부착하고, 약 1주일에 걸쳐 체내에 천천히 흡수된다. 본원에 기재된 박막 투여 형태에서 사용되는 중합체는 흡수성이고, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 충분한 박리, 전단 및 인장 강도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 필름은 주사가능하다. 특정 실시양태에서, 필름은 수술적 중재술 이전에, 동안에 또는 이후에 환자에게 투여된다.
본원에서 사용되는 겔은 연질 및 약성 내지 경질 및 강성의 범위에 이르는 성질을 가질 수 있는 고체상의 젤리와 같은 물질을 지칭한다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 겔은 유체에 의해 그의 전체 부피에 걸쳐 팽창되는 비-유체 콜로이드성 네트워크 또는 중합체 네트워크이다. 히드로겔은 친수성인 중합체 쇄의 네트워크를 포함하는 겔의 유형이며, 때때로 물이 분산 매질인 콜로이드성 겔로서 발견된다. 히드로겔은 매우 흡수성이고, 많은 양의 물, 예를 들어 90% 초과의 물을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 겔은 천연 또는 합성 중합체 네트워크를 포함한다. 일부 실시양태에서, 겔은 친수성 중합체 매트릭스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 겔은 소수성 중합체 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 겔은 천연 조직과 매우 유사한 정도의 가요성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 겔은 생체적합성 및 흡수성이다. 특정 실시양태에서, 겔은 수술적 중재술 이전에, 동안에 또는 이후에 환자에게 투여된다.
본원에서 사용되는 액체 용액은 관련 기술분야에 널리 공지된 용액, 현탁액, 에멀젼, 점적제, 연고, 액체 세정제, 스프레이, 리포좀을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 액체 용액은 소량의 산 또는 염기의 첨가시 pH 변화에 저항하는 수성 pH 완충화제를 함유한다. 특정 실시양태에서, 액체 용액은 수술적 중재술 이전에, 동안에 또는 이후에 환자에게 투여된다.
예시적인 제제는 a) 본원에 기재된 하나 이상의 생체접합체; b) 제약상 허용가능한 담체; 및 c) 매트릭스 네트워크로서 친수성 중합체를 포함할 수 있고, 상기 조성물은 점성 액체, 즉, 수백 내지 수천 cps의 점도를 갖는 액체, 겔 또는 연고로서 제제화된다. 이들 실시양태에서, 생체접합체를 적절한 제약상 허용가능한 담체 중에 분산 또는 용해시킨다.
특정 실시양태에서, 생체접합체 또는 그를 포함하는 조성물을 제제화 이전에, 동안에 또는 이후에 동결건조시킨다. 따라서, 본원에는 또한 본원에 기재된 생체접합체 또는 그를 포함하는 조성물을 포함하는 동결건조된 조성물이 제공된다.
6. 투여
생체접합체의 적합한 용량은 표준 방법에 의해, 예를 들어 실험실 동물 모델에서 또는 임상 실험에서 용량-반응 곡선을 수립함으로써 결정될 수 있고, 환자 상태, 치료할 질환 상태, 투여 경로 및 조직 분포, 및 다른 치료제의 공동 사용 가능성에 따라 매우 유의하게 달라질 수 있다. 환자에게 투여되는 유효량은 체표면적, 환자 체중 또는 질량, 및 환자 상태의 의사 판단에 기초한다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 용량은 약 0.01 μg 내지 약 10 g의 범위이다. 예를 들어, 전신 전달의 경우, 용량은 약 10 g, 또는 약 5 g, 또는 약 1 g일 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 유효 용량은 약 100 μg 내지 약 10 g/용량, 또는 약 100 μg 내지 약 1 g/용량, 또는 약 100 μg 내지 약 500 mg/용량, 약 0.01 μg 내지 약 100 mg/용량, 또는 약 100 μg 내지 약 50 mg/용량, 또는 약 500 μg 내지 약 10 mg/용량, 또는 약 1 mg 내지 10 mg/용량, 또는 약 1 내지 약 100 mg/용량, 또는 약 1 mg 내지 500 mg/용량, 또는 약 1 mg 내지 200 mg/용량, 또는 약 10 mg 내지 100 mg/용량, 또는 약 10 mg 내지 75 mg/용량, 또는 약 10 mg 내지 50 mg/용량, 또는 약 10 mg/용량, 또는 약 20 mg/용량, 또는 약 30 mg/용량, 또는 약 40 mg/용량, 또는 약 50 mg/용량, 또는 약 60 mg/용량, 또는 약 70 mg/용량, 또는 약 80 mg/용량, 또는 약 90 mg/용량, 또는 약 100 mg/용량이다. 본원에 기재된 임의의 다양한 실시양태에서, 유효 용량은 약 0.01 μg 내지 약 1000 mg/용량, 1 μg 내지 약 100 mg/용량, 약 100 μg 내지 약 1.0 mg, 약 50 μg 내지 약 600 μg, 약 50 μg 내지 약 700 μg, 약 100 μg 내지 약 200 μg, 약 100 μg 내지 약 600 μg, 약 100 μg 내지 약 500 μg, 약 200 μg 내지 약 600 μg, 또는 약 100 μg 내지 약 50 mg/용량, 또는 약 500 μg 내지 약 10 mg/용량 또는 약 1 mg 내지 약 10 mg/용량이다.
일부 실시양태에서, 조성물을 다중투여 형태로 포장한다. 따라서, 사용하는 동안 미생물 오염을 방지하기 위해 보존제가 필요하다. 특정 실시양태에서, 상기 기재된 적합한 보존제를 조성물에 첨가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 보존제를 함유한다. 특정 실시양태에서, 보존제는 약 0.001% 내지 약 1.0% w/v의 수준으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 단위 용량 조성물은 멸균성이지만, 보존되지 않은 것이다.
실시예
실시예 1. EDC 관능화 프로토콜 (Hep- SILY )
재료
적절한 농도의 카오트로픽제(chaotropic agent), 예컨대 부탄올, 에탄올, 염화구아니디늄, 과염소산리튬, 아세트산리튬, 염화마그네슘, 페놀, 프로판올, 소듐 도데실 술페이트, 티오우레아, 또는 우레아 (예를 들어, 약 5 M 내지 약 10 M 우레아)를 사용하여 적합한 반응 완충제 (예를 들어, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES))를 제조하였다. 1 N HCl을 사용하여 최종 pH를 약 4.5 내지 약 6의 pH로 조정하였다.
펩티드 (예를 들어, RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2 (서열식별번호: 397) (MW = 2253 Da, 구조는 하기 도시됨))를 반응 완충제 중에 3 mg/mL로 용해시켰다. 펩티드 용액은 전형적으로 커플링 반응 전에 새로 제조하였다.
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비오티닐화 펩티드 (예를 들어, 비오틴RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2 (서열식별번호: 398) (MW = 2479 Da))를 반응 완충제 중에 3 mg/mL로 용해시켰다. 생성된 표지된 펩티드 용액은 전형적으로 커플링 반응 전에 새로 제조하였다.
글리칸 (예를 들어, 헤파린 (MWavg = 16 kDa))을 반응 완충제 중에 20 mg/mL로 용해시키고, -20℃에서 보관하거나 또는 커플링 반응 전에 새로 제조하였다.
글리칸에 첨가하기 직전에 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)를 반응 완충제 중에 75 mg/mL로 용해시켰다.
접합 - 헤파린 함유 생체접합체 ( 100 mg )
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) (물 중에 75 mg/mL로 용해된 59.3 mg 또는 0.79 mL)를 50 몰 과량으로 헤파린에 첨가하여 헤파린을 활성화시켰다. 이 출발 물질을 실온에서 약 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 표지된 펩티드를 활성화된 헤파린에 1:1 몰비 (헤파린:표지된 펩티드) (반응 완충제 중 3 mg/mL에서 15.3 mg 또는 5.1 mL)로 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 약 5분 동안 실온에서 진탕시켰다. 진탕시키는 동안, 펩티드를 1:7 몰비 (Hep:펩티드) (반응 완충제 중 3 mg/mL에서 97.3 mg 또는 32.4 mL)로 첨가하였다. 이어서, 성분들을 진탕시키면서 실온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 할당된 시간 이후, 진탕시키면서 실온에서 약 30분 동안 0.5 M NaOH (대략 4.5 mL)를 사용하여 pH를 8로 증가시킴으로써 반응을 켄칭시켰다.
대략 15 psi에서 TMP와 함께 5 컬럼 부피 (CV)의 반응 완충제 (대략 250 mL)에 이어 10 CV의 물 (대략 500 mL)을 35 mL/분의 유속으로 사용하는 투석여과기 (스펙트럼 - 미디크로스(MidiKros) mPES 10 K 중공 튜브 여과기)를 통해 생성된 Hep-SILY 생체접합체를 정제하였다. 이어서, 농축물 (즉, 최종 생성물)을 -80℃로 동결시켰다. 임의적으로, 생성물을 동결 건조시켰다.
실시예 2. 혈소판-인자-4 (PF4)에 의해 측정되는 혈소판 억제
하기 방법을 이용하여 혈소판 억제에 대한 본원에 개시된 생체접합체의 효과를 평가하였다. 마이크로플레이트를 원섬유 콜라겐으로 코팅한 다음, 1% 우유로 차단하였다. 생체접합체를 1X PBS 중에서 1 mg/mL에서 시작하여 희석하고, 10X 농축 계수를 이용하여 1X PBS로 희석하고, 50 μL 용액을 콜라겐 코팅된 웰에 첨가하였다. 처리물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 처리 용액을 제거하고 1X PBS로 3회 세정함으로써 웰에서 미결합 처리물을 세정하였다.
인간 전혈을 건강한 지원자로부터 정맥 천자에 의해 수집하였다. 처음 5 mL의 혈액을 폐기한 다음, 대략 15 mL를 시트레이트화된 유리 진공 채혈기 (비디 바이오사이언스(BD Bioscience))에 수집하였다. 혈액을 유리 튜브에서 200 g하에 25℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 혈소판 풍부 혈장인 원심분리된 혈액의 상부층을 혈소판 실험을 위해 사용하였다.
혈소판 풍부 혈장 (50 μL/웰)을 실온에서 1시간 동안 마이크로플레이트에 첨가하였다. 인큐베이션 1시간 후, 45 mL의 혈소판 풍부 혈장을 각각의 웰로부터 제거하고, 5 mL ETP (107 mM EDTA, 12 mM 테오필린, 및 2.8 mM 프로스타글란딘 E1)를 함유하는 미세 원심분리 튜브에 첨가하여, 혈소판 활성화를 추가로 억제하였다. 이들 튜브를 4℃에서 30분 동안 2000 g하에 회전시켜, 혈소판을 펠렛화하였다. 상청액을 ELISA 연구를 위해 수집하여, 혈소판 활성화 마커의 존재에 대해 시험하였다. 샌드위치 ELISA를 이용하여 각각의 단백질을 검출하였다. 모든 샌드위치 ELISA를 위한 성분들은 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터 구입하였고, 제공된 프로토콜에 따랐다. 수치가 검정의 선형 범위 내에 속하도록 하기 위해 1X PBS 중 1% BSA 중에서 혈소판 혈청을 희석할 필요가 있었다. 혈소판 활성화를 혈소판 인자 4 (PF-4)의 방출을 통해 측정하였다.
실시예 3. 원섬유형성 검정
하기 방법을 이용하여, 원섬유형성에 대한 본원에 기재된 생체접합체의 효과를 평가하였다. 콜라겐 용액은 HCl 중 2 mg/mL 콜라겐을 2X TES 완충제 (60 mM TES, 60mM Na2HPO4, 300 mM NaCl) 중에서 1 mg/mL로 희석하고 얼음상에 둠으로써 제조하였다. 생체접합체를 함유하는 시험 샘플을 1X 인산염 완충된 염수 (PBS) 용액 중에서 0.6 mg/mL의 최종 농도로 용해시키고, 또한 얼음상에 두었다. 최종 콜라겐 농도가 0.5 mg/mL가 되도록 시험 샘플을 1:1 (부피:부피)의 비로 콜라겐에 첨가하였다. 이어서, 콜라겐 시험 용액을 볼텍싱에 의해 철저히 혼합하였다.
원섬유형성은 37℃에서 인큐베이션하는 동안 콜라겐 시험 용액의 혼탁도 (313 nm에서의 흡광도)를 모니터링함으로써 측정하였다. 샘플을 96-웰 플레이트에 100 μL/웰로 피펫팅하였다. 마이크로플레이트 판독기는 37℃에서 유지되었고, 혼탁도는 60분 동안 매분 모니터링하였다.
실시예 4. 콜라겐-결합 플레이트 검정
하기 방법을 이용하여 콜라겐에 대한 본원에 개시된 생체접합체의 결합 친화도를 평가하였다. 유사한 검정을 이용하여 다른 표적 (예를 들어, 히알루론산, ICAM, VCAM, 셀렉틴)의 결합 친화도를 평가하였다.
생체접합체 변이체의 콜라겐-결합은 96-웰 플레이트 상에 콜라겐이 코팅된 플레이트-검정에 의해 비교하였다. 콜라겐을 실온에서 1시간 동안 0.02 N 아세트산 중에서 50 μg/mL로 고결합 플레이트 상에 코팅하였다. 미결합 콜라겐을 1X PBS pH 7.4로 세정하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 1X PBS 용액 중 1% 우유로 차단하였다.
비오티닐화 펩티드를 함유하는 생체접합체 변이체를 1X PBS pH 7.4 중 1% 우유 중에서 1 mg/mL의 최종 농도로 용해시켰다. 이 용액으로부터, 10X 계열 희석을 수행하였다. 이어서, 분자를 차단된 콜라겐-코팅된 플레이트 상에서 인큐베이션하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 1% BSA 및 0.2% Tween20을 갖는 1X PBS로 3회 세정하였다.
결합된 분자를 1% BSA 및 0.2% Tween20을 갖는 1X PBS로 1:500 희석하고, 200 μL/웰에서 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하여, 스트렙타비딘-HRP에 의해 검출하였다. 스트렙타비딘 용액을 플레이트로부터 0.2% Tween20을 갖는 1X PBS로 3회 세정하였다. 이어서, TMB 기질 용액을 실온에서 15분 동안 각 웰에 100 μL/웰로 첨가하고, 100 μL 황산 용액 (0.16 M)을 이용하여 색상 진화를 중단시켰다. 이어서, 웰에서 450 nm에서의 흡광도를 측정하고, 결합 친화도를 흡광도 대 농도에 의한 용량-반응으로 플롯팅하였다.
실시예 5. 히알루론산-결합 생체접합체의 비교
이 실시예는 본원에 개시된 바와 같은 히알루론산-결합 단위를 갖는 펩티드를 포함하는 생체접합체가 U.S. 2014/0301983에 기재된 히알루론산-결합 생체접합체와 비교할 때 히알루론산에 대해 예상치 못한 강화된 결합 친화도를 나타낸다는 것을 보여준다.
생체접합체
본원에 기재된 바와 같이 히드라지드-카르보닐 연결을 갖는 히알루론산-결합 생체접합체를 상기 실시예 1에 따라 콘드로이틴 술페이트 및 GAH 펩티드 (즉, GAHWQFNALTVRGSG-NHNH2 (서열식별번호: 399)) 및 STM 펩티드 (즉, STMMSRSHKTRSHHVGSG-NHNH2 (서열식별번호: 400))를 사용하여 제조하였다. 히드라지드-카르보닐 연결을 갖는 히알루론산-결합 생체접합체의 비오티닐화 형태 또한 상기 실시예 1에 따라 콘드로이틴 술페이트 및 표지된 GAH 펩티드 (즉, 비오틴GAHWQFNALTVRGSG-NHNH2 (서열식별번호: 401)) 및 표지된 STM 펩티드 (즉, 비오틴 STMMSRSHKTRSHHVGSG-NHNH2 (서열식별번호: 402))를 사용하여 제조하였다.
U.S. 2014/0301983 (상기 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 산화된 콘드로이틴 술페이트, 및 GGGC 스페이서 (즉, GAHWQFNALTVRGGGC (서열식별번호: 402))를 갖는 GAH 펩티드를 BMPH 링커를 통해 사용하는 히알루론산-결합 생체접합체. 비오티닐화 콘드로이틴 술페이트는 대조군으로 사용하였다 (도 1a).
도입 검정
아그레칸 모방체가 히알루론산에 결합하는 것을 평가하기 위해, 하이스템(HyStem) 히드로겔을 제조자의 프로토콜 (ESI BIO)에 따라 합성하였다. 간략히, 글리코실 (티올-개질된 히알루론산), 엑스트랄린크-라이트(Extralink-lite, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, PEGDA), 및 탈기된 탈이온수 (DG)를 실온이 되게 하였다. 시린지 및 니들을 사용하는 무균성 조건하에 40분 동안 수평 진탕기 상에서 진탕시키면서 1.0 mL의 DG 물을 글리코실 바이알에 첨가하였다. 유사하게, 0.5 mL의 DG 물을 엑스트랄린크-라이트 바이알에 첨가하였다. 이어서, 엑스트랄린크-라이트 및 글리코실을 1:4 부피 비 (0.25 mL 엑스트랄린크-라이트 대 1.0 mL 글리코실)로 혼합하였다. 50 μl의 혼합물을 에펜도르프로부터의 0.5 mL 튜브 캡에 피펫팅하고, 용액을 2시간 동안 겔화시켰다. 이어서, 이들 히드로겔을 500 μl의 아그레칸 모방체 용액과 함께 24 웰 플레이트에서 3시간 동안 수평 진탕기 상에서 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 겔을 밤새 1X 인산염 완충된 염수 (1X PBS) 중에서 인큐베이션하여 세척한 다음, 스트렙타비딘 다이라이트(DyLight) 형광 프로브 (라이프테크놀로지즈(Lifetechnologies))를 이용하여 염색하였다. 스트렙타비딘 다이라이트를 1:200 부피 비로 1X PBS 중에서 희석하고, 1시간 동안 수평 진탕기 상에서 진탕시키면서 겔에 첨가하였다. 비특이적으로 결합된 프로브를 20분 동안 수평 진탕기 상에서 진탕시키면서 1X PBS 중에서 겔을 인큐베이션함으로써 세척해 냈다 (2회 반복). 이어서, 분광 공초점 현미경 (니콘(Nikon), A1+)을 이용하여 겔을 영상화하였다.
도 1은 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 CS에 결합된 GAH 펩티드를 갖는 생체접합체 (도 1c) 및 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 CS에 결합된 STM 펩티드를 갖는 생체접합체 (도 1d)가 산화성 당류 개환 화학 및 BMPH 링커를 통해 CS에 결합된 GAH 펩티드를 갖는 생체접합체 (도 1b)에 비해 보다 큰 히알루론산-결합 친화도를 나타냄을 도시한다.
실시예 6. 관리 표준을 변경하기 않고 누공 혈관으로 생체접합체의 전달
이 실시예는 본원에 개시된 생체접합체가 본래의 AVF에서 내막 과형성증을 예방하기 위한 관내 혈관 코팅으로서 사용될 수 있음을 입증한다. 본원에 개시된 생체접합체로 처리된 또는 대조군으로서 염수로 처리된 돼지의 대퇴 동맥 및 정맥에 누공을 생성하였다. 관리 표준을 변경하지 않고도 생체접합체가 누공 혈관으로 효과적으로 전달될 것이고, 비처리 누공에 비해 협착의 유의한 감소 및 혈관 직경의 확대를 나타낼 것으로 고려된다.
이 실시예에서 세 가지 전달 방법을 시험할 수 있다: (1) 혈류 직전에 전달, (2) 혈류 이전에 누공의 의도적인 탈락 이후에 전달, 및 (3) 혈류가 복구된 후에 (예를 들어, 5분 후에) 형성된 누공으로 전달.
방법 1은 주요 전달 방법으로 고려되고, 방법 2 및 3은 단독으로 사용하거나, 또는 방법 1에서 생체접합체에 의해 혈관 내강이 부적절하게 피복된 경우 방법 1에 추가하여 사용할 수 있다. 방법 2에서, 혈관의 의도적인 탈락은 AVF 생성 동안에 확장기의 임상적 적용과 유사하게 겸자의 손잡이로 정맥을 문질러서 수행하였다. 방법 3은 누공 생성 직후 정맥에서의 높은 혈류로 인해 치료제의 초기 전달에 의해 다루지 못하는 손상이 내피 세포 층에 생기는 경우에 실험할 수 있다. 방법 3에서, 혈류를 누공으로 복구시킨 다음, 근위 정맥 및 동맥을 클램핑하여 중단시켰다. 이어서, 누공을 생체접합체 및 복구된 혈류로 플러슁하였다.
모든 경우에, 새로 생성된 문합에서 단일 봉합사를 제거하였고, 평활한 볼 팁을 갖는 공급 니들을 이용하여 누공을 통해 생체접합체를 플러슁하였다. 생체접합체 (예를 들어, 대략 5 mL)를 누공을 통해 플러슁하였다. 생체접합체 전달후 (예를 들어, 약 2시간) 동물을 희생시켰다. 누공을 제거하고, 염수로 세정하고, 10% 포르말린으로 (예를 들어, 약 10분 동안) 고정시켰다.
세포를 팔로이딘을 이용하여 염색하였다. 생체접합체가 비오틴 태그를 갖는 경우, 형광 표지된 스트렙타비딘 마커를 이용하여 생체접합체를 검출하였다. 정맥을 동맥으로부터 분리하고, 공초점 현미경을 이용하여 그들의 관내 표면을 실험할 수 있도록 두 혈관을 개방시켰다.
생체접합체의 전달이 세 가지 모든 방법에서 효과적일 것으로 고려된다. 비특이적인 결합은 생체접합체에 노출되지 않은 동맥을 시험함으로써, 즉 명백한 염색이 아닌 것으로 해명하였다. 협착의 수준은, 혈관을 가시화할 수 있도록 CT 스캔하는 동안 동물에게 대비 염료를 주사하고, 영상을 통해 혈관의 직경을 측정함으로써 결정하였다.
실시예 7. 대퇴슬와부 동맥 내의 협착 또는 폐색을 치료하기 위한 Hep- SILY
하기는 대퇴슬와부 동맥 내의 협착 또는 폐색의 치료에 있어서 평범한 구식 벌룬 혈관성형술 (POBA) + 염수 (대조군)에 비한 벌룬 혈관성형술 + 관내 Hep-SILY의 안전성 및 효능을 평가 및 비교하기 위해 고안된 임상 시험이다. 헤파린당 대략 6-8 SILY 펩티드를 갖는 Hep-SILY를 실시예 1에 따라 제조하였다.
이 시험은 본래의 대퇴슬와부 동맥에 있는 데 노보 또는 재협착 병변에서 벌룬 혈관성형술 단독에 비한 벌룬 혈관성형술 + 관내 Hep-SILY의 안전성 및 효능의 다중심, 2-아암, 평행, 맹검, 무작위 비교를 제공한다. 하지로 동맥이 유출되는 환자에서 대퇴슬와부 동맥에서 파행 또는 허혈성 안정시 통증 및 혈관조영술적으로 유의한 병변을 제시하는 대략 66명의 대상체를 이 연구를 위해 무작위화하여 처리할 것이다.
주요 포함 기준은 40세가 넘는 연령 및 동의 제공 의지일 것이다. 주요 배제 기준은 임신, 5년 미만의 기대 수명, 스크리닝 3개월 이내에 출혈성 졸중의 이력, 스크리닝 2주 이내에 심근 경색, 혈전용해 또는 협심증의 이력, 및 헤파린에 대한 공지된 금기일 것이다.
대상체는 대퇴슬와부 동맥에 있는 혈관조영술적으로 유의한 병변을 확인하기 위해 기준선 혈관조영술을 받을 것이다. 혈관조영술에 의해 확인하여 가이드와이어에 의해 병변(들)을 성공적으로 교차시킨 후, 대상체를 POBA + SBCV 처리 (그룹 1, N = 44) 대 POBA 처리 + 염수 (대조군) (그룹 2, N = 22)으로 2:1로 무작위화할 것이다. 그룹 1은 벌룬 혈관성형술 및 10 ml 이하의 Hep-SILY 플러슁을 받는 반면에, 그룹 2는 벌룬 혈관성형술 및 10 ml 이하의 염수 플러슁을 받을 것이다.
전체 연구 기간은 4개월의 등록 기간을 포함하여 대략 10개월이다 (첫번째 대상체의 첫번째 방문에서부터 마지막 대상체의 마지막 방문까지). 개별 연구 참여는 초기 시술 이후 대략 24주째이고, 스크리닝 방문은 연구 시술 이전 1개월까지일 것이다.
다양한 데이터를 방출전 뿐만 아니라 4, 8, 12, 18 및 24주 후속 방문시에 수집할 것이다. 일차 종료점은 독립적인 맹검 혈관조영 코어 랩에 의해 평가되는 바와 같이 분석 세그먼트 (손상 세그먼트의 전체 길이 + 5-mm 근위 및 원위 가장자리)에서 처리후 24주째에 후기 내강 손실 (LLL)에 의해 측정되는 효능이다. LLL은 일차 시술 직후의 최소 내강 직경 (MLD)과 후속 조사시의 MLD 사이의 차이로서 정의된다.
LLL은 시술후 혈관조영상과 비교한 24주 후속 혈관조영상을 이용하여 측정할 것이다 (만성 신부전을 가진 대상체의 경우, 이중 도플러 초음파를 사용하여 LLL을 측정할 것임).
이차 종료점은 치료후 발생 유해 사례 (AE)의 발생률, 임상 실험실 평가, 생명 징후, 및 신체 검사 결과에 의해 측정되는 안전성이다. 측정되는 구체적인 안전성 사례에는 모든 원인의 사망, 무절단 (발목 위) 생존 (AFS) 및 표적 혈관 혈관재생 (TVR)이 포함된다.
실시예 8: 신생내막 과형성증 또는 말초 동맥 질환 (PAD)의 치료 또는 예방을 위한 Hep- SILY
신생내막 과형성증은 본원에 기재된 생체접합체 (예를 들어, 실시예 1의 Hep-SILY)가 전달된 토끼 혈관성형술 모델에서 평가하였다. 여러 마리의 (예를 들어, 6마리의) 토끼를 이 연구에 등록하였다. 각각의 동물에게 우측 및 좌측 장골 동맥 둘 다로 벌룬 혈관성형술-매개된 손상을 가하였다. 동물들을 시험군 (헤파린-SILY) 또는 비히클 대조군 (1xPBS)으로 나누었다. 각각의 군에서, 상기 장골 동맥 둘 다를 손상시키고, 벌룬 손상 직후에 시험 물품 또는 대조군으로 처리하였다.
손상후 주어진 시간 (예를 들어, 28일) 이후, 동물들을 안락사시키고, 동맥 세그먼트를 조직학적으로 평가하였다. 전형적으로 각각의 혈관으로부터 가장 중증의 신생내막 반응을 갖는 몇몇 (예를 들어, 3개의) 조직학적 절편을 형태 계측을 위해 선택하였다. 외탄력판 (EEL), 내탄력판 (IEL), 및 내강의 단면적을 모밧(Movat) 염색된 슬라이드로부터 디지털 형태 계측 (아이피랩(IPLab) 소프트웨어, 매릴랜드주 록빌)을 이용하여 측정하였다. 신생내막 두께는 최소 및 최대 부위에서 IEL에서 내강까지의 길이로서 측정한 다음, 평균하였다. 하기 식을 이용하여 단면적을 계산하였다:
· 내측 면적 = EEL 면적 - IEL 면적
· 신생내막 면적 = IEL 면적 - 내강 면적
· 내측-내막 면적 = EEL 면적 - 내강 면적
· % 협착 = [1 - (내강 면적/IEL 면적)] * 100
상기 변수들의 평균을 변량 분석법 (ANOVA)을 이용하여 비교하였다. 0.05 미만의 p-값은 전형적으로 통계적으로 유의한 것으로 고려된다.
본원에 기재된 생체접합체 (예를 들어, 실시예 1의 Hep-SILY)는 신생내막 과형성증을 억제하는데 효과적일 것이고, 따라서 말초 동맥 질환 (PAD)을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
실시예 9: 생체접합체/펩티드 응집물 형성
Hep-SILY를 정제 절차 동안에 하기 변형을 이용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 합성하였다. 5 CV의 반응 완충제 중에서 정제하기 전에, 반응물을 물로 희석하여, 카오트로픽제 (예를 들어, 우레아) 농도를 대략 3 M으로 감소시켰다. 후속적으로, 반응물을 16 CV의 물로 정제하였다.
생성된 생성물을 크기-배제 크로마토그래피에 의해 평가하여, 응집물 형성을 나타내는 고분자량 종의 형성을 입증하였다. Hep-SILY 복합체의 성능을 이온 상호작용 SILY 펩티드를 함유하지 않는 기준 Hep-SILY와 비교하였다. 응집물을 함유하는 Hep-SILY는 응집물을 함유하지 않는 Hep-SILY에 비해 높은 친화도 (낮은 EC50 값)로 콜라겐과 결합하였다.
실시예 10. 생체접합체로 처리된 정맥 이식편
하기 방법을 이용하여, 바이패스 수술에서 이식편을 사용할 때 본원에 기재된 생체접합체로 처리된 정맥 이식편이 정맥 이식 실패를 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 이 실시예는 또한 정맥 이식편을 제조하기 위한 조건에 대해 시험할 것이다.
A. 생체접합체 농도의 최적화
동물 모델 연구를 시적하기 전에 절개된 토끼 혈관 조직에 대한 생체외 연구로부터의 동맥에 대해 약물 물질 농도 및 함침 시간의 최적화가 수행될 것이다. 생체외 결합 연구로부터의 정보를 이용하여 함침 시간, 약물 물질 농도 및 제제 완충제를 규정하여 정맥 이식편 보존 용액을 생성할 것이다.
먼저, 정맥으로의 생체접합체 결합을 정량화하여, 생체접합체 농도 및 함침 시간의 효과를 실험할 것이다. 한 마리 토끼로부터 절개된 정맥을 대략 1cm2 세그먼트로 절단하고, 24-웰 플레이트에 놓을 것이다. 완충된 염수 중 다양한 농도의 생체접합체 및 다양한 처리 시간에서 시험할 것이다. 조직 조각을 세제를 함유하는 추출 배지 중에서 균질화하고, 펠렛 파편으로 원심분리할 것이다. 상청액을 비신코닌산 검정 (BCA) 시약에 의해 단백질에 대해 및 ELISA 또는 ECL (MSD (메조 스케일 디스커버리, Meso Scale Discovery)에 의한 전자화학발광 기술)에 의해 약물 물질에 대해 검정할 것이다.
추가로, 광범위한 혈관 벽 손상이 결합을 강화시킬 수 있는 방법을 결정하기 위해, 혈관을 조각으로 절단하기 전에 고무찰자로 혈관을 조심스럽게 긁어 내는 두번째 실험 세트를 포함시킬 것이다. 이 절차는 이식하기 전에 외과의가 정맥으로부터 판막을 제거하는 과정을 모의 실험할 것이다.
본원에 기재된 생체접합체를 정량화하는 것 외에도, 면역조직화학 (IHC)을 수행하여, 약물 물질이 정맥의 내강에 결합하는 것을 확인할 것이다. 시험을 위해 두 가지 조건 (농도 및 함침 시간)이 상기 실험을 기준으로 선택될 것이다. 토끼로부터 경정맥을 절개하여, 생체접합체 용액으로 플러슁하고 함침시킬 것이다. 이어서, 정맥을 완충된 염수로 3회 세정할 것이다. 조직을 3개의 세그먼트로 절단할 것이다. 1개의 세그먼트를 중성 완충된 포르말린 (NBF)으로 고정하고, 두번째 세그먼트를 최적 절단 온도 (OCT)에서 저온보존하고, 세번째 세그먼트를 급속 냉동시킬 것이다. 저온조 또는 포르말린-고정되고 파라핀-매립된 (FFPE) 시편으로부터의 조직 절편을 H&E로 염색하고, 이미 제조된 약물 물질에 대해 특이적인 항체를 이용하여 면역염색할 것이다. 생체접합체가 혈관 상의 임의의 노출된 콜라겐에 결합하는 동안, 이 실시예에서 혈관의 내부 표면을 코팅하는 약물 물질을 확인할 것으로 예상된다.
추가로, IHC 시술을 인간 사체 정맥을 이용하여 수행하여, 시술을 인간 조직에 적용하는 것을 보장할 것이다. 정맥 조직은 사망 24시간 이내에 사체로부터 얻을 것이다.
B. 정맥 바이패스 동물 시술에서 생체접합체 용액의 평가
정맥 이식편 모델을 수컷 뉴질랜드 백색종 토끼에서 수행할 것이다. 정맥 바이패스 이식편을 문합 커프 기술을 이용하여 제작할 것이다. 외경정맥을 수확하고, 생체접합체의 적합한 시간 및 농도에서 헤파린 처리 염수 또는 정맥 이식편 보존 용액 중 하나의 용액에 둘 것이다. 보관 기간 이후, 정맥 말단을 4F 혈관 유도관 방식의 폴리우레탄 커프를 통해 통과시킨 다음, 커프의 바깥쪽을 뒤집고, 봉합사로 고정시킬 것이다. 이어서, 경동맥 내강을 1-2 cm 동맥 절개에 의해 노출시킬 것이다. 커프되고 뒤집어진 정맥 말단을 경동맥 내강에 삽입하고, 동맥을 봉합사에 의해 커프 둘레에 고정할 것이다. 혈류가 복구되면, 완전한 정맥 이식편 확장을 허용하도록 동맥의 삽입된 세그먼트를 완전히 분리할 것이다. 이식편 개방성은 이식편 내부의 박동 혈류의 가시화에 의해 확인할 것이다.
총 20마리의 동물을 사용할 것이다. 10 마리의 동물은 경동맥에 이식하기 전이 헤파린 처리 염수 중에 함침된 정맥을 가질 것이고, 10 마리의 동물은 정맥 이식편 보존 용액에 함침된 정맥을 가질 것이다. 동물은 28일 동안 생존할 것이다. 헤파린 처리 염수는 임상 설정에서 흔히 사용되기 때문에 대조군으로서 선택된다.
28일째에, 마취를 유도하고, 혈관의 개방성을 확인할 것이다. 정맥내 헤파린 볼루스가 제공되고, 동물을 희생시킬 것이다. 정맥 이식편은 10% 중성-완충된 포르말린 (NBF)을 이용하여 상행 대동맥으로부터 원위치 관류 고정할 것이다. 이어서, 정맥 이식편을 절개하고, 절편화 및 형태 계측을 위한 파라핀 매립 이전에 NBF 중에서 침수 고정시킬 것이다. 이물질 커프에 바로 인접한 조직은 피하면서 정맥 이식편의 적어도 3개의 상이한 절편을 정맥 이식편의 길이를 따라 분석할 것이다.
파라핀 매립된 6 μm 절편을 모밧 펜타크롬 염색으로 염색하고, 아페리오(Aperio) 현미경으로 영상화할 것이다. 내강의 원주, 내탄력판 (IEL) 및 외탄력판 (EEL)을 나타내고, 각각의 경계선 내의 면적을 계산할 것이다. 신생내막 면적은 IEL 면적 - 내강 면적으로 계산될 것이다.
각각의 그룹에 10개의 정맥 이식편이 있고, 각각의 이식편 내의 최소 3개의 영역을 실험할 것이다. 각각의 이식편 내에서 3개의 측정치를 평균하여, 이식편당 평균 신생내막 면적을 제공할 것이다. 10개의 샘플 크기는 측정시 20% 표준 편차로 신생내막 과형성증에서 25% 감소를 검출하는데 충분한 능력 (0.8, α = 0.05)을 나타낸다. 이 목적에서 성공 기준에는 생체접합체로 처리된 정맥 이식편에서 신생내막 과형성증의 25% 감소가 포함된다.
C. 액체 안정성 연구
생체접합체 화합물의 고안 및 합성은 널리 정립된 대조군을 이용하여 개발 중이다. 안정성 프로그램을 완성하여, 실온에서 및 4℃에서 액체로서 보관된 생체접합체의 안정성을 측정할 것이다. 이전에는 생체접합체 용액을 동결건조된 형태로 보관하였고, 사용전에 재구성하였다. 이러한 용액은 3개월 동안 안정한 것으로 확인되었다 (현재까지 시험된 시간). 따라서, 4℃에서 및 실온에서 액체로서 보관된 생체접합체를 위한 정식 안정성 프로토콜을 시작할 것이다. 액체 제제는 이 설정에서 임상적 전달에 편리한 생체접합체의 형태이다.
D. 래트에서 독성 연구
용량 범위 결과 연구를 수행할 것이다. 먼저, 래트에게 4회 용량 수준의 단일 IV 주사를 제공하여 2일 후에 급성 독성을 확인할 것이다. 위성군에게 유사하게 투여하고, 시간 간격으로 혈액 샘플을 취하여, 약동학적 파라미터를 측정할 것이다. 다음으로, 7일 반복 용량 연구를 회복 기간이 없이 래트에서 비-GLP 설정으로 수행할 것이다. 이 연구로부터의 결과를 이용하여 가장 높은 허용 용량 수준을 선택할 것이다. 마지막으로, 만성 28일 반복 용량 연구를 가장 높은 허용 용량 수준을 이용하여 28일 회복을 가지면서 수행할 것이다.
상기 연구의 종료점에는 사망, 임상적 관찰, 투여 이전 및 부검시의 체중, 투여 이전 및 부검시의 음식 소비, 혈액 수집으로부터의 독성역학적 관찰 및 임상적 병리학이 포함될 것이다. 표준 조직병리학은 표준 장기 상에서 수행할 것이다.
독성이 관찰되지 않을 것으로 예상된다. 임의의 독성 효과를 발견하기 전에 가용성 한계에 도달할 것으로 예상된다.
실시예 11. oxDS - SILY 대 eDS- SILY의 안정성 비교
안정성 연구를 수행하여, 산화 화학에 의해 합성되거나 (즉, 개환; oxDS-SILY) 또는 헤파린 대신에 데르마탄 술페이트를 사용하여 상기 실시예 1에 따라 합성된 (즉, 비-개환; eDS-SILY) DS-SILY의 안정성을 비교하였다.
간략히, oxDS-SILY를 다음과 같이 제조하였다. 데르마탄 술페이트 (DS)를 pH 5.5의 0.1 M 인산나트륨 완충제 중에 용해시켜, 20 mg/mL 농도의 용액을 제조하였다. 관능화 정도는 과아이오딘산염의 농도에 의해 조절하였다. 다양한 농도의 과아이오딘산염 용액을 하기 표에 따라 pH 5.5의 0.1 M 인산나트륨 완충제 중에 용해시킴으로써 제조하였다.
Figure pct00011
DS 용액을 과아이오딘산염 용액과 1:1 (V:V)의 비로 실온에서 2 시간 동안 혼합하여, 산화된 DS를 제공하였고, 이를 포스페이트 완충제 염수를 가진 바이오겔(Biogel) P6 컬럼을 이용하여 정제하였다. 그에 결합된 말단 GSG-NHNH2를 갖는 SILY 펩티드 (즉, RRANAALKAGELYKSILYGSG-NHNH2 (서열식별번호: 397))를 물에 용해시켜, 필요에 따라 초음파를 이용하여 1 mg/mL 농도를 제공하였다. SILY 펩티드를 실온에서 산화된 DS에 천천히 첨가하고, 이를 빛으로부터 보호하면서 약 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 pH를 6보다 높게 유지하였다. 임의적으로, 1 몰의 유사하게 관능화된 SILY비오틴 (비오틴-표지된 펩티드)을 1 몰의 DS와 반응시킬 수 있고, 이어서 비표지된 SILY 펩티드를 예상된 알데히드의 개수로 첨가할 수 있다 (몰 당량 -1). 20 몰의 SILY-비표지된 펩티드를 1 몰의 DS에 첨가하여 DS-SILY20을 제조하였다. 생성물을 물로 정제하여 목적하는 DS-SILY를 제공하였다.
샘플을 합성하고, 8주 동안 동결 보관하였다. HPLC-SEC를 0, 4주 및 8주째에 측정하였다. 피크 면적을 비교하였고, 피크 면적의 감소는 분해를 나타낸다.
결과는 eDS-SILY가 8주 시험 기간에 걸쳐 안정하게 유지되는 반면, oxDS-SILY는 시간이 경과함에 따라 분해되는 것으로 나타났다. oxDS-SILY의 경우에는 주요 피크 및 고분자량 관련 피크 (각각 진한 막대 및 음영 막대)가 8주에 걸쳐 감소한 반면에, eDS-SILY 값은 비교적 일정하게 유지되었고, 시간이 경과함에 따라 감소하지 않았다 (도 2).
실시예 12. 위식도 손상을 치료하기 위한 임상 시험 프로토콜
이 실시예는 본원에 기재된 것들로부터 선택된 생체접합체, 예컨대 Hep-SILY, 상기 논의된 바와 같은 분지형 펩티드를 포함하는 다른 헤파린-함유 생체접합체, 또는 DS-SILY가 위식도 손상을 치료하는 능력을 시험하기 위한 임상 실험을 제안한다. 상기 작용제는 용액 또는 겔로 제조된 생체접합체일 것이다. 위식도 손상은 상당한 사망률을 나타내고, 환자 및 건강관리 시스템에 비용이 든다. 식도 개방성을 유지하는데 상당한 자원이 소모된다.
질환 표적은 GERD로부터 자연적으로 또는 중재술로 인해 의원적으로 발생한 임의의 위식도 손상이다. 이는 위식도 손상의 치료를 위해 위식도십이지장 내시경 (EGD)을 통해 투여되는 국소 생체접합체의 무작위, 다중심, 안전성 및 유효성 연구이다.
이 실험의 목적에는 1) EGD 중재술 시점에 투여된 EGD-전달된 생체접합체 처리의 전반적인 안전성 프로파일을 평가하고, 2) 위식도 손상에서 재협착을 감소시키는데 있어서 EGD-전달된 생체접합체의 유효성을 측정하는 것이 포함된다.
50명의 환자가 실험에 등록할 것이고, 그 중에서 25명은 생체접합체 (EGD-전달된)를 받고, 25명은 비히클 (EGD-전달된)을 받을 것이다.
주요 포함 기준에는 (a) EGD 절제를 요하는 GERD 관련 식도 병변, (b) EGD 확장을 요하는 식도 협착, 및 (c) EGD 치료를 요하는 위궤양 질환 (PUD)이 포함된다. 주요 배제 기준에는 H/O 중증 알러지 질환이 포함된다.
방문 스케쥴은 1주, 6주 및 12주일 것이다. 안전성 평가에는 (1) 유해 사례 (AE) 및 중증 AE (SAE)의 확인, (2) 신체 검사/바이탈: 국부적 결과에 특별히 주의함, 및 (3) 생체접합체 항체를 포함하는 실험실 (기준선, 1주, 12주 및 24주)이 포함된다. EGD 전달은 6주 및 12주에 반복할 수 있다.
식도의 개방성을 측정하기 위해, 정량적인 바륨 연하를 처리전 및 연구 종료시에 수행할 것이다.
이 실험의 일차 종료점은 재발 협착의 감소율이고, 이차 종료점은 경구 식이로의 전전에 걸리는 시간, 재발 협착에 걸리는 시간, 개선된 PUD 점수 또는 증상이다. 상기 실험은 이들 종료점 모두에 대해 성공할 것으로 고려된다.
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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 64 Gly Lys His Leu Gly Gly Lys His Arg Arg Ser Arg 1 5 10 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 65 Arg Gly Thr His His Ala Gln Lys Arg Arg Ser 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 66 Arg Arg His Lys Ser Gly His Ile Gln Gly Ser Lys 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 67 Ser Arg Met His Gly Arg Val Arg Gly Arg His Glu 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 68 Arg Arg Arg Ala Gly Leu Thr Ala Gly Arg Pro Arg 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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<400> 410 Gly Gly Gly Cys 1

Claims (86)

  1. 글리칸 및 적어도 하나의 펩티드(들)을 포함하는 생체접합체이며, 여기서 펩티드(들)은 콜라겐-결합 단위, 히알루론산-결합 단위, ICAM-결합 단위, VCAM-결합 단위 및/또는 셀렉틴-결합 단위를 포함하고, 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합된 것인 생체접합체.
  2. 제1항에 있어서, 글리칸이 알기네이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄, 데르마탄 술페이트, 헤파란, 헤파란 술페이트, 헤파린, 덱스트란, 덱스트란 술페이트 및 히알루노난, 또는 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생체접합체.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 콜라겐-결합 단위를 포함하는 것인 생체접합체.
  4. 제3항에 있어서, 펩티드(들)의 콜라겐-결합 단위가 약 1 mM 미만의 해리 상수 (K d )로 콜라겐에 결합하는 것인 생체접합체.
  5. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 히알루론산-결합 단위를 포함하는 것인 생체접합체.
  6. 제5항에 있어서, 펩티드(들)의 히알루론산-결합 단위가 약 1 mM 미만의 해리 상수 (K d )로 히알루론산에 결합하는 것인 생체접합체.
  7. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 콜라겐-결합 단위를 포함하는 펩티드 및 적어도 하나의 히알루론산-결합 단위를 포함하는 펩티드, 및/또는 콜라겐-결합 단위 및 히알루론산-결합 단위 둘 다를 포함하는 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 생체접합체.
  8. 제1항에 있어서, ICAM-결합 단위를 포함하는 적어도 하나의 펩티드 및 셀렉틴-결합 단위를 포함하는 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 생체접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드(들)이 약 120개 이하의 아미노산, 또는 약 100개 이하의 아미노산, 또는 약 50개 이하의 아미노산, 또는 약 40개 이하의 아미노산을 포함하는 것인 생체접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드(들)이 약 25개 이하의 아미노산을 포함하는 것인 생체접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1 내지 약 25개 펩티드(들), 또는 약 5 내지 약 25개 펩티드, 또는 약 11 내지 약 14개 펩티드를 포함하는 생체접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1 내지 약 10개 펩티드(들), 또는 약 7-8개 펩티드를 포함하는 생체접합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 글리칸이 약 1 내지 약 75 퍼센트 (%) 관능화를 포함하고, 퍼센트 (%) 관능화가 펩티드로 관능화된 글리칸 상에서 이당류 단위의 퍼센트에 의해 결정되는 것인 생체접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 글리칸이 약 5 내지 약 30 퍼센트 (%) 관능화, 또는 약 10 내지 약 40 퍼센트 (%) 관능화를 포함하는 것인 생체접합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 글리칸이 약 25 퍼센트 (%) 관능화, 또는 약 30 퍼센트 (%) 관능화를 포함하는 것인 생체접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 글리칸이 산화적으로 분할된 당류 단위를 함유하지 않는 것인 생체접합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 글리칸이 유도체화된 글리칸인 생체접합체.
  18. 제17항에 있어서, 유도체화된 글리칸이 부분적으로 N-탈술페이트화된 유도체, 부분적으로 O-탈술페이트화된 유도체, 부분적으로 O-카르복시메틸화된 유도체, 또는 이들의 임의의 조합인 생체접합체.
  19. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 YKSILY (서열식별번호(SEQ ID NO): 179), LYKSILY (서열식별번호: 180), ELYKSILY (서열식별번호: 181), GELYKSILY (서열식별번호: 2), AGELYKSILY (서열식별번호: 182), KAGELYKSILY (서열식별번호: 183), LKAGELYKSILY (서열식별번호: 184), ALKAGELYKSILY (서열식별번호: 185), AALKAGELYKSILY (서열식별번호: 186), NAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 187), ANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 188), RANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 189), RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1), QLYKSILY (서열식별번호: 190), GQLYKSILY (서열식별번호: 16), AGQLYKSILY (서열식별번호: 191), KAGQLYKSILY (서열식별번호: 192), LKAGQLYKSILY (서열식별번호: 193), ALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 194), AALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 195), NAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 196), ANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 197), RANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 198), 및 RRANAALKAGQLYKSILY (서열식별번호: 17)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKS 서열을 포함하는 서열을 포함하는 것인 생체접합체.
  20. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 YKCILY (서열식별번호: 199), LYKCILY (서열식별번호: 200), ELYKCILY (서열식별번호: 201), GELYKCILY (서열식별번호: 4), AGELYKCILY (서열식별번호: 202), KAGELYKCILY (서열식별번호: 203), LKAGELYKCILY (서열식별번호: 204), ALKAGELYKCILY (서열식별번호: 205), AALKAGELYKCILY (서열식별번호: 206), NAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 207), ANAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 208), RANAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 209), RRANAALKAGELYKCILY (서열식별번호: 3), QLYKCILY (서열식별번호: 210), GQLYKCILY (서열식별번호: 211), AGQLYKCILY (서열식별번호: 212), KAGQLYKCILY (서열식별번호: 213), LKAGQLYKCILY (서열식별번호: 214), ALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 215), AALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 216), NAALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 217), ANAALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 218), RANAALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 219), 및 RRANAALKAGQLYKCILY (서열식별번호: 220)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 적어도 1개의 YKS 서열을 포함하는 서열을 포함하는 것인 생체접합체.
  21. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 아미노산 서열 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58), 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 히알루론산에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것인 생체접합체.
  22. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 아미노산 서열 STMMSRSHKTRSHHV (서열식별번호: 59), 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 히알루론산에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것인 생체접합체.
  23. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58) 또는 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357) 중 적어도 하나의 서열 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 히알루론산에 결합할 수 있는 서열, 및 WYRGRL (서열식별번호: 29) 또는 WYRGRLGSG (서열식별번호: 392) 중 적어도 하나의 서열 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 콜라겐에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것인 생체접합체.
  24. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 GAHWQFNALTVR (서열식별번호: 58) 또는 GAHWQFNALTVRGSG (서열식별번호: 357) 중 적어도 하나의 서열 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 히알루론산에 결합할 수 있는 서열, 및 RRANAALKAGELYKSILY (서열식별번호: 1) 또는 RRANAALKAGELYKSILYGSG (서열식별번호: 287) 중 적어도 하나의 서열 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 콜라겐에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것인 생체접합체.
  25. 제1항에 있어서, 펩티드(들)이 i) IELLQAR (서열식별번호: 117), IELLQARGSC (서열식별번호: 118), IDLMQAR (서열식별번호: 119), IDLMQARGSC (서열식별번호: 120), QITWAQLWNMMK (서열식별번호: 121), QITWAQLWNMMKGSC (서열식별번호: 122), NAFKILVVITFGEK (서열식별번호: 152), NAFKILVVITFGEKGSC (서열식별번호: 153), ITDGEA (서열식별번호: 154), ITDGEAGSC (서열식별번호: 155), DGEATD (서열식별번호: 156), 또는 DGEATDGSC (서열식별번호: 157)로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 80% 서열 동일성을 가지며, 단 셀렉틴, ICAM 및/또는 VCAM에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것인 생체접합체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 히드라지드 기가 펩티드(들) C-말단에 임의적으로 스페이서를 통해 결합된 것인 생체접합체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 히드라지드 기가 펩티드(들) N-말단에 임의적으로 스페이서를 통해 결합된 것인 생체접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 히드라지드 기가 글리신, 알라닌, 아르기닌, 리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 스페이서를 통해 C-말단에 결합된 것인 생체접합체.
  29. 제27항에 있어서, 스페이서가 글리신, 글리신-글리신, 세린-글리신, 리신-아르기닌, 아르기닌-아르기닌, 및 글리신-세린-글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생체접합체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체를 포함하며, 글리칸당 펩티드(들)의 평균 개수는 약 30개 미만인 조성물.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체를 포함하며, 글리칸당 펩티드(들)의 평균 개수는 약 5 내지 약 30개인 조성물.
  32. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체를 포함하며, 글리칸당 펩티드(들)의 평균 개수는 약 7개인 조성물.
  33. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물, 및 콜라겐-결합 단위, 히알루론산-결합 단위, ICAM-결합 단위, VCAM-결합 단위 및/또는 셀렉틴-결합 단위를 포함하는 추가의 펩티드를 포함하는 조성물이며, 여기서 펩티드는 생체접합체에 비공유 결합되고, 추가로 조성물은 글리칸에서의 이당류 단위의 개수를 기준으로 1% 내지 약 200% 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 추가의 펩티드가 생체접합체에 이온 결합되는 것인 조성물.
  35. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 혈관에 적용하는 것을 포함하는, 혈관 손상 또는 중재술 이전에, 동안에 및/또는 이후에 환자에서 혈관을 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 생체접합체를 환자에게 비경구로 투여하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 비경구 투여가 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피부, 피하, 경피, 피내 및 표피내로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통하는 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 생체접합체를 니들 또는 주입용 기구를 이용하여 비경구로 투여하는 것인 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 생체접합체를 카테터를 이용하여, 벌룬 상의 코팅으로서, 다공성 벌룬을 통해, 또는 스텐트 상의 코팅으로서 환자에게 투여하는 것인 방법.
  40. 제35항에 있어서, 중재술이 혈관성형술, 죽종절제술, 스텐트 시술, 또는 다른 수술적 시술로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제35항에 있어서, 생체접합체가 환자에서 탈락된 혈관에 결합하는 것인 방법.
  42. 제35항에 있어서, 생체접합체가 혈소판 활성화를 억제하는 것인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 생체접합체가 탈락된 혈관으로의 혈소판 결합을 억제하는 것인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 생체접합체가 내막 과형성증을 억제하는 것인 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 생체접합체가 혈전증을 억제하는 것인 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 생체접합체가 혈관경련을 억제하는 것인 방법.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 생체접합체가 내피 세포 증식을 자극하는 것인 방법.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 생체접합체가 탈락된 혈관 상의 노출된 콜라겐에 결합하는 것인 방법.
  49. 혈관 통로에서 혈관 벽에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는 용액을 적용하고,
    혈관 통로에서 혈류를 복구 또는 개시하는 것
    을 포함하는, 환자에서 혈관 통로를 수립하는 방법.
  50. 동정맥루 (AVF)의 내강의 내벽에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는 용액을 적용하고,
    AVF에서 혈류를 복구 또는 개시하는 것
    을 포함하는, 혈액투석을 필요로 하는 환자에서 AVF의 성숙을 개선시키는 방법.
  51. 장기의 노출된 조직에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제약 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 조직 유착의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에서 조직 유착을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  52. 복부 또는 골반 장기의 노출된 조직에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제약 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 복부 또는 골반 유착의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에서 복부 또는 골반 유착을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  53. 내피 기능장애와 관련된 질환으로 고통받는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 내피 기능장애와 관련된 질환으로 고통받는 환자를 치료하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 내피 기능장애와 관련된 질환이 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 진성 당뇨병, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 녹내장, 요독증, 패혈증 및 장기 부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  55. 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 혈관 부위의 염증을 예방 또는 감소시키는 방법이며, 여기서 부위는 (a) 침투된 내피 라이닝 또는 손상된 내피 세포를 포함하고, (b) 혈관 중재 시술로부터 회복되지 않고 있는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 혈관 중재 시술이 경피적 관상동맥 중재 (PCI) 시술을 포함하는 것인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 질환이 혈관 질환, 신장 질환, 폐 질환, 피부 질환, 류마티스성 질환, 위장관 질환, 종양, 혈액 질환, 감염성 질환, 신경 질환, 안과 질환 및 내분비계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제53항에 있어서, 질환이 류마티스성 관절염, 당뇨병, 요독증, 박테리아 또는 바이러스 감염, 아테롬성동맥경화증, 피부염, 사구체신염, 급성 폐 손상, 섬유증, 허혈성 급성 신부전, 및 흡연-유도된 혈관 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  59. 각막 창상 치유의 촉진을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 각막 창상 치유의 촉진을 필요로 하는 환자에서 각막 창상 치유를 촉진시키는 방법.
  60. 위식도 손상으로 고통받는 환자의 손상된 위식도 조직에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는 제약 조성물을 국소 적용하는 것을 포함하는, 위식도 손상으로 고통받는 환자에서 식도 개방성을 유지하거나, 재협착을 감소시키거나, 창상 치유를 개선시키거나, 재발성 협착을 감소시키거나, 경구 식이로의 진전을 촉진시키거나 또는 위궤양 질환 (PUD) 증상을 개선시키는 방법.
  61. 위식도 조직의 병변에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는 제약 조성물을 국소 적용하는 것을 포함하는, 환자에서 위식도 손상을 치료하는 방법.
  62. 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 관절염을 치료하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 관절염이 골관절염 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 반흔 형성의 감소를 필요로 하는 개체에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 반흔 형성을 감소시키는 방법.
  65. 창상 치유의 촉진을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 창상 치유를 촉진시키는 방법.
  66. 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관 중재술을 받았던 환자에서 협착을 치료하는 방법.
  67. 히알루론산 풍부 조직의 분해의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 히알루론산 풍부 조직의 분해를 치료 및/또는 예방하는 방법.
  68. 연골 변성의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 연골 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  69. 연골 변성의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자의 활액강에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 주사하는 것을 포함하는, 환자에서 연골 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  70. 유리체액 변성의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 유리체액 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  71. 수핵 변성의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 수핵 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  72. 벌룬 혈관성형술 이전에, 동안에 및/또는 이후에 내강의 내벽에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는 용액을 적용하는 것을 포함하는, 대퇴슬와부 동맥 내의 협착 또는 폐색의 치료를 필요로 하는 환자에서 대퇴슬와부 동맥 내의 협착 또는 폐색을 치료하는 방법.
  73. 관상 동맥 질환 및/또는 말초 동맥 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 관상 동맥 질환 및/또는 말초 동맥 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  74. 혈관 절편의 내벽을 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 바이패스 수술을 위한 혈관 이식편을 제조하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 혈관이 정맥인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 접촉을 생체접합체가 내벽에 결합하는 것을 허용하는 조건하에 수행하는 것인 방법.
  77. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량에 결합된 내벽을 포함하는 혈관 절편을 포함하는 혈관 이식편.
  78. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량에 결합된 내벽을 포함하는 이식편을 환자의 순환계에 이식하는 것을 포함하는, 바이패스 이식 시술을 받고 있는 환자에서 이식 실패를 예방 또는 감소시키는 방법.
  79. 이식편을 환자의 순환계에 이식하고, 이식 이전에, 동안에 또는 이후에 이식편의 내부에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 생체접합체 또는 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는 용액을 주사하는 것을 포함하는, 바이패스 이식 시술을 받고 있는 환자에서 이식 실패를 예방 또는 감소시키는 방법.
  80. 임의적으로 활성화제의 존재하에 글리칸을 충분한 양의 펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 글리칸 및 1 내지 50개 펩티드(들)을 포함하는 생체접합체를 제조하는 방법이며, 여기서 펩티드는 생체접합체를 제공하기 위한 커플링 반응 조건하에 히드라지드 기를 포함하고, 펩티드(들)은 콜라겐-결합 단위, 히알루론산-결합 단위, ICAM-결합 단위, VCAM-결합 단위 및/또는 셀렉틴-결합 단위를 포함하고, 펩티드 상의 말단 히드라지드 기와 글리칸 상의 카르보닐 기 사이의 히드라지드-카르보닐 연결을 통해 글리칸에 결합되는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 생체접합체가 YKS 또는 YKC 중 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 방법.
  82. 제80항에 있어서, 활성화제가 카르보디이미드 시약인 방법.
  83. 제80항에 있어서, 활성화제가 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  84. 제80항에 있어서, 히드라지드 기가 펩티드(들) C-말단에 임의적으로 스페이서를 통해 결합되는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 스페이서가 글리신, 알라닌, 아르기닌, 리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 스페이서가 글리신, 글리신-글리신, 세린-글리신, 아르기닌-아르기닌, 리신-아르기닌, 리신-아르기닌-아르기닌 및 글리신-세린-글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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