ES2742218T3 - Peptidoglicanos sintéticos que se enlazan al colágeno destinados a ser utilizados en operaciones vasculares - Google Patents

Abstract

Un peptidoglicano de unión a colágeno de fórmula (PnL)xG, en el que n es de 1 a 7, x es de 1 a 10, P es un péptido sintético de hasta 40 aminoácidos que comprenden una secuencia de RRANAALKAGELYKSILY, L es un enlazador, y G es glicano, para uso en un método para tratar: i) una lesión vascular; o ii) hiperplasia intimal.

Description

DESCRIPCIÓN

Peptidoglicanos sintéticos que se enlazan al colágeno destinados a ser utilizados en operaciones vasculares CAMPO TÉCNICO

[0001] Esta invención se refiere al campo de los peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno. Más particularmente, esta invención se refiere a peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno para uso en procedimientos de intervención vascular.

ANTECEDENTES Y RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0002] Las intervenciones vasculares que involucran un dispositivo médico insertado o implantado en el cuerpo de un paciente, por ejemplo, angioplastia, colocación de stent, aterectomía e injerto, a menudo se asocian con efectos indeseables. Por ejemplo, la inserción o implantación de catéteres o stents puede conducir a la formación de émbolos o coágulos en los vasos sanguíneos. Otras reacciones adversas a la intervención vascular pueden incluir hiperplasia, reestenosis, oclusión de vasos sanguíneos, agregación plaquetaria y calcificación.

[0003] El número de procedimientos de intervención coronaria percutánea (PCI), comúnmente conocido como angioplastia con balón, se ha incrementado en 30% durante los últimos 10 años por un total de más de 1,3 millones de pacientes en los EE.UU. anualmente a un costo de más de 60 mil millones $. Durante la intervención coronaria percutánea, los catéteres guía avanzan desde la periferia, generalmente la arteria femoral, hacia la aorta. La punta del catéter se coloca en el ostium de una arteria coronaria. Posteriormente, se avanzan cables, catéteres de globo u otros dispositivos a través del catéter guía hacia las arterias coronarias epicárdicas grandes para tratar lesiones estenóticas.

[0004] El gran aumento en el número de procedimientos se debe a un aumento en las enfermedades del corazón, así como los avances tecnológicos, lo que ha llevado a la práctica más segura y eficaz. Sin embargo, los procedimientos de PCI no están exentos de problemas, como la trombosis y la hiperplasia de la íntima, que son complicaciones del procedimiento. Las áreas de enfoque para mitigar estas complicaciones son la coagulación y las respuestas inflamatorias que ocurren en la pared del vaso como resultado del procedimiento. El inflado con balón da como resultado una denudación endotelial de la pared vascular, que inicia la coagulación y la inflamación a través de la activación de las plaquetas y es actualmente una posible consecuencia de los procedimientos de PCI.

[0005] El documento WO2009/120995A2 se refiere a peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno y matrices de colágeno diseñadas que comprenden una matriz de colágeno y un peptidoglicano sintético de unión a colágeno en el que se encuentra el pepididliclicano sintético de unión a colágeno.

[0006] Nili et al., Decorin Inhibition of PDGF-stimulated vascular smooth muscle cell function", The American Journal of Pathology, septiembre de 2003, páginas 869-878.

[0007] Paderi et al. "Collagen-Binding Peptidoglycans: A Biomimetic Approach to Modulate Collagen Fibrillogenesis for Tissue Engineering Applications", Tissue Engineering Part A, 2009, vol. 15, No. 10, páginas 2991-2999.

[0008] Paderi et al. "Design of a Synthetic Collagen-Binding Peptidoglycan that Modulates Collagen Fibrillogenesis", Biomacromolecules, 2008, vol. 9, páginas 2562-2566.

[0009] Lee et al. "Injectable gel with synthetic collagen-binding peptide for enhanced osteogenesis in vitro and in vivo", Biochemical and Biophysical Research Communications, Academic Press Inc., mayo de 2007, vol. 357, N° 1, páginas 68-74.

[0010] Los peptidoglicanos de unión de colágeno sintéticos descritos en este documento pueden sintetizarse con control de diseño y en grandes cantidades a bajo costo, haciendo su uso clínico factible. Tal como se describe en el presente documento, los pepidoglicanos de unión a colágeno sintéticos están diseñados para unirse al colágeno con alta afinidad, donde permanecen unidos durante el flujo sanguíneo para prevenir la unión de plaquetas al colágeno expuesto del endotelio desnudo y, en consecuencia, para prevenir la activación de plaquetas, trombosis, inflamación como resultado de desnudar el endotelio, la hiperplasia de la íntima y el vasoespasmo. Los peptidoglicanos sintéticos de unión al colágeno descritos en el presente documento también pueden estimular la proliferación de células endoteliales y pueden unirse al colágeno en un vaso denudado.

[0011] La presente invención se refiere a un peptidoglicano de unión a colágeno de fórmula (PnL)xG, para uso en un método para el tratamiento de i) lesión vascular o ii) hiperplasia de la íntima de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

[0012] Se contemplan las siguientes realizaciones numeradas:

1. Un peptidoglicano de unión a colágeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en intervención vascular en un paciente, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se une a un vaso desnudo en el paciente.

2. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la realización 1 en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno inhibe la activación de plaquetas.

3. El peptidoglicano de unión a colágeno para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno inhibe la unión de plaquetas al vaso denudado. 4. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno inhibe la hiperplasia de la íntima.

5. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno inhibe la inflamación resultante de la desnudación del vaso.

6. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno inhibe la trombosis.

7. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno inhibe el vasoespasmo.

8. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 7, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno estimula la proliferación de células endoteliales. 9. El peptidoglicano de unión a colágeno para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 8, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se une al colágeno expuesto en el recipiente denudado.

10. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en el que el glicano es un glicosaminoglicano o un polisacárido.

11. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 10, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno es DS-SILY-is.

12. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 11, en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se administra al paciente por vía parenteral.

13. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la realización 12 en el que la administración parenteral es a través de una ruta seleccionada del grupo que consiste en intravascular, intravenosa, intraarterial, intramuscular, cutánea, subcutánea, percutánea, intradérmica e intraepidérmica.

14. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 12 o 13 en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se administra por vía parenteral usando una aguja o un dispositivo para infusión.

15. El peptidoglicano de unión al colágeno para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 14, en el que el peptidoglicano sintético de unión al colágeno se administra al paciente con un catéter, como un recubrimiento en un balón, a través de un globo poroso, o como un recubrimiento en un stent.

16. Un kit que comprende

un peptidoglicano sintético de unión a colágeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9; y un componente seleccionado del grupo que consiste en un catéter, un stent, un globo y una combinación de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0013]

FIGURA 1 muestra una representación esquemática de la interacción entre proteoglicanos vecinos en cadenas de tropocolágeno adyacentes que es importante para determinar las propiedades mecánicas y de alineación de los medicamentos de colágeno.

FIGURA 2. Imágenes de AFM realizadas en modo de contacto, con una tasa de escaneo de 2 Hz con punta de modo de contacto de nitruro de silicio k = puntas de 0,05N/m y punto de ajuste de desviación: 0-1 voltios, de muestras de gel preparadas como en el EJEMPLO 15 (10:1 colágeno:tratamiento) después de la deshidratación con etanol. Las muestras son para colágeno solo (colágeno) y para colágeno con sulfato de dermatán (DS), con decorina (Decorin), conjugado de sulfato de dermatán-RRANAALKAGELYKSILYGC (DS-SILY) y conjugado de dermatán sulfao- SYIRIADTNIT (DS-SYIR).

FIGURA 3. Exploración de resonancia de plasmón de superficie en modo de asociación y modo de disociación del péptido RRANAALKAGELYKSILYGC (SILY) que se une al colágeno unido a las placas CM-3. SILY se disolvió en 1x tampón HBS-EP a concentraciones variables de 100 pm a 1,5 pm en diluciones de 2 veces. FIGURA 4. Unión del péptido SILY modificado con dansilo al colágeno medido en una placa de alta unión de 96 pocillos (negro con un fondo transparente (Costar)). PBS, solo tampón; BSA, BSA tratado bien; Colágeno, bien tratado con colágeno. Las lecturas de fluorescencia se tomaron en un espectrofotómetro M5 Spectramax (Molecular Devices) en longitudes de onda de excitación/emisión de 335nm/490nm, respectivamente. FIGURA 5. Curva de unión del péptido SILY modificado con dansilo modificado a partir de los datos de fluorescencia descritos en la FIGURA 4.

FIGURA 6. Una descripción esquemática del reactivo, PDPH y la química de la conjugación en dos etapas de un péptido que contiene cisteína. con un glucosilaminoglucósido oxidado que muestra la liberación de 2-piridiltiol en la etapa final.

FIGURA 7. Unión del péptido SILY modificado con dansilo conjugado con sulfato de dermatano como se describe en el presente documento al colágeno medido en una placa de alta unión de 96 pocillos (negro con un fondo transparente (Costar)). PBS, solo tampón; BSA, pocillo tratado con BSA; Colágeno, pocillo tratado con colágeno. Las lecturas de fluorescencia se tomaron en un espectrofotómetro M5 Spectramax (Molecular Devices) a longitudes de onda de excitación/emisión de 335nm/490nm respectivamente.

FIGURA 8. Medición del módulo de corte de las muestras de gel (1,5mg/ml de colágeno III, colágeno 5:1: tratamiento) en un reómetro AR-G2 con una geometría de placa paralela de acero inoxidable de 20 mm (TA Instruments, New Castle, DE), y la geometría de la placa paralela de acero inoxidable de 20 mm se redujo a una distancia de 500 pm usando un control de fuerza normal de 0,25N. ♦ - sin tratamiento, es decir, colágeno III solo; ■ - colágeno sulfato de dermatán (1:1); - colágeno sulfato de dermatán (5:1); x - conjugado de colágeno sulfato de dermatán-KELNLVYTGC (DS-KELN) (1:1); A - conjugado de colágeno sulfato de dermatán-KELN (5:1); • - colágeno péptido KELNLVYTGC (KELN).

FIGURA 9. Medición del módulo de corte de las muestras de gel (1,5mg/ml de colágeno III, colágeno 5:1: tratamiento) en un reómetro AR-G2 con una geometría de placa paralela de acero inoxidable de 20 mm (TA Instruments, New Castle, DE), y la geometría de la placa paralela de acero inoxidable de 20 mm se redujo a una distancia de separación de 500 pm usando un control de fuerza normal de 0,25N. ♦ - sin tratamiento, es decir, colágeno III solo; ■ - colágeno sulfato de dermatán (1:1); - colágeno sulfato de dermatán (5:1); x - conjugado de colágeno sulfato de dermatán-GSIT (DS-GSIT) (1:1); a - colágeno sulfato de dermatan -conjugado GSIT (5:1); • - colágeno péptido GSITTIDVPWNVGC (GSIT).

FIGURA 10. Medición de la turbidez. Las soluciones de gel se prepararon como se describe en el EJEMPLO 15 (colágeno 4 mg/ml y 10:1 de colágeno para el tratamiento, a menos que se indique lo contrario) y se añadieron 50 ml/pocillo a 4°C a una placa de 384 pocillos. La placa se mantuvo a 4°C durante 4 horas antes de iniciar la formación de fibrillas. Se usó un SpectraMax M5 a 37°C para medir la absorbancia a 313 nm a intervalos de 30 s durante 6 horas. Col, sin tratamiento, es decir, colágeno solo; DS, colágeno sulfato de dermatán; decorina, colágeno decorina; DS-SILY, conjugado colágeno sulfato de dermatan-SILY.

FIGURA 11. Imágenes de microscopía electrónica de crio-barrido de la estructura del gel con un aumento de 5000. Se formaron geles para crio-SEM, como se describe en el EJEMPLO 18 (1 mg/ml de colágeno (Tipo III), colágeno 1:1: tratamiento), directamente en la etapa SEM. Se tomaron imágenes de regiones con orientación similar para la comparación entre tratamientos. Panel a, colágeno, sin tratamiento, es decir, colágeno solo; Panel b, colágeno sulfato de dermatán; Panel c, conjugado colágeno sulfato de dermatán-KELN; Panel d, conjugado colágeno sulfato de dermatán-GSIT.

FIGURA 12. La fracción de espacio vacío promedio medida a partir de las imágenes Crio-SEM mostradas en la Figura 11. a) Colágeno, sin tratamiento, es decir, solo colágeno; b) colágeno sulfato de dermatán; c) conjugado de colágeno sulfato de dermatán-KELN; d) conjugado de colágeno sulfato de dermatán-GSIT. Todas las diferencias son significativas con p = 0,05.

FIGURA 13. Medición de la absorbancia a 343 nm antes del tratamiento de heparina oxidada conjugada a PDPH, y después del tratamiento con SILY, que libera 2-piridiltiol del conjugado y permite la determinación de la proporción de péptido SILY conjugado con heparina oxidada. El AA medido corresponde a 5,44 moléculas SILY/heparina oxidada.

FIGURA 14. Caracterización de la conjugación DS-SILY. Después de 2 horas, un AA343nm final correspondió a 1,06 moléculas SILY agregadas a cada molécula DS. Tenga en cuenta que t = 0 es un punto de tiempo aproximado de cero debido al ligero retraso entre la adición de SILY al DS-PDPH y la medición de la solución a 343 nm.

FIGURA 15. Conjugación de Dcl3 a DS. La producción de piridina-2-tiona medida por un aumento en la absorbancia a 343 nm indica 0,99 péptidos Dc13 por cadena de polímero DS.

FIGURA 16. Unión de fluorescencia de microplaca de DS-ZDc13 al colágeno. DS-ZDc13 se unió específicamente a la superficie del colágeno de una manera dependiente de la dosis.

FIGURA 17. Fibrilogénesis de colágeno por mediciones de turbidez. DS-Dc13 retrasa la fibrilogénesis y disminuye la absorbancia general de una manera dependiente de la dosis. El péptido Dc13 libre, por el contrario, parece tener poco efecto sobre la fibrilogénesis en comparación con el colágeno solo en la proporción molar alta de colágeno:aditivo de 1:1.

FIGURA 18. Diámetro medio de fibrillas de Crio-SEM. A. La decorina y los peptidoglicanos sintéticos disminuyen significativamente el diámetro de las fibrillas sobre el colágeno o el colágeno DS. B. En comparación con el colágeno solo, el péptido libre Dc13 no afecta el diámetro de las fibrillas, mientras que SILY produce una disminución en el diámetro de las fibrillas.

FIGURA 19. Compactación en gel. A. y B. Días 3 y 5, respectivamente: la decorina y los peptidoglicanos son significativos en relación con el colágeno y el DS, * indica que el DS-Dc13 y el DS no son significativos en el día 3. Las barras no indican ningún significado. C. Día 7: La decorina es significativa contra todas las muestras, n° DS es significativa en comparación con el colágeno. D. Día 10: + el colágeno y el DS son significativos, $ DS-Dc13 es significativo en comparación con la decorina y el colágeno.

FIGURA 20. Estimado de elastina por ensayo Fastin. A. DS-SILY aumentó significativamente la producción de elastina en todas las muestras. DS y DS-Dc13 disminuyeron significativamente la producción de elastina sobre el colágeno. Las muestras de control de geles de colágeno sin células no mostraron producción de elastina. B. Los péptidos libres dieron como resultado una ligera disminución en la producción de elastina en comparación con el colágeno, pero ningún punto fue significativo.

FIGURA 21. Imágenes SEM de portaobjetos incubadas con plasma rico en plaquetas. Las flechas en el tratamiento con heparina-SILY indican estructuras similares a las fibrillas únicas de este tratamiento. Barra de escala = 100 pm.

FIGURA 22. Densidad de fibrillas de Crio-SEM. Densidad de fibrillas, definida como la relación entre el área que contiene las fibrillas y el espacio vacío. DS-SILY y el péptido SILY libre tenían una densidad de fibrillas significativamente mayor, mientras que el colágeno tenía una densidad de fibrillas significativamente más baja. DS-Dc13 no fue significativo en comparación con el colágeno.

FIGURA 23. Módulo de almacenamiento (G') de geles de colágeno. Ensayos mecánicos reológicos de geles de colágeno formados con cada aditivo a A. 5:1 B. 10:1 y C. Relación molar 30:1 de colágeno:aditivo. Se realizaron barridos de frecuencia de 0,1 Hz a 1,0 Hz con una tensión controlada de 1,0 Pa. Se presentan G'avg ± S.E.

FIGURA 24. Ensayos de proliferación celular y citotoxicidad. No se encontraron diferencias significativas entre todos los aditivos en A. CyQuant B. Ensayos vivos y C. Muertos.

FIGURA 25. Imágenes crio-SEM para densidad de fibrillas. Geles de colágeno formados en presencia de cada aditivo a 10:1 proporción molar de colágeno:aditivo. A. DS, Decorin, o peptidoglicanos. B. Péptidos libres. Las imágenes se toman a 10.000x, barra de escala = 5 pm.

FIGURA 26. Imágenes de AFM de geles de colágeno. Se formaron geles de colágeno en presencia de cada aditivo en una proporción molar de 10:1 de colágeno:aditivo. Se observa banda D para todos los aditivos. Las imágenes son de 1 pm2

FIGURA 27. Inhibición de la activación plaquetaria. Medida determinando la liberación de los factores de activación Factor plaquetario 4 (PF-4) y p-tromboglobulina (Nap-2). El colágeno inmovilizado en la superficie de una placa de 96 pocillos se incubó previamente con cada tratamiento y posteriormente se incubó con plasma rico en plaquetas (PRP). Los valores se informan como un porcentaje del factor de activación liberado por el tratamiento en comparación con la cantidad de factor de activación liberado por el tratamiento de control (solución salina tamponada con fosfato, PBS). El * indica que la diferencia es significativa en comparación con la superficie de colágeno sin tratamiento (solución salina tamponada con fosfato, PBS). Dex, dextrano; Dex-SILY9, conjugado de dextrano-(SILY)g; Hep, heparina; Hep-SILY, conjugado de heparina-SILY; HA, hialuronano; HA-SILY, conjugado hialuronano-SILY; Péptido SILY, SILY. Debido a los límites de solubilidad, se incubaron Hep, Hep-SILY, HA y HA-SILY a 25 pm. Todos los demás tratamientos se realizaron a 50 pm (una vez eliminado el tratamiento, las placas se lavaron con PBS <1 min, antes de la adición de PRP). Los conjugados de Hep y HA (ácido hialurónico) contenían aproximadamente 4 péptidos por polisacárido.

FIGURA 28. Inhibición de la activación plaquetaria. Medida determinando la liberación de los factores de activación Factor plaquetario 4 (PF-4) y p-tromboglobulina (Nap-2). El colágeno inmovilizado en la superficie de una placa de 96 pocillos se incubó previamente con cada tratamiento y posteriormente se incubó con plasma rico en plaquetas (PRP). Los valores se informan como un porcentaje del factor de activación liberado por el tratamiento en comparación con la cantidad de factor de activación liberado por el tratamiento de control (solución salina tamponada con fosfato, PBS). Dex, dextrano; Dex-SILY6, conjugado de dextrano-(SILY)6; Hep, heparina; Hep-GSIT, conjugado de heparina-GSIT; GSIT, péptido GSIT; SILY, péptido SILY. Los valores medidos para todos los tratamientos son significativos frente a ^p B^s . Dex, SILY y Dex-SILY6 están a 25 pm, todos los demás tratamientos son a 50 pm. El ** indica que el valor para el tratamiento con Hep-GSIT fue significativo en comparación con los valores para el tratamiento de Hep, similarmente el valor para el tratamiento con Dex-SILY6 fue significativo en comparación con el valor para el tratamiento con Dex para PF4. (Una vez eliminado el tratamiento, las placas se enjuagaron durante 20 minutos). Los conjugados de Hep contenían aproximadamente 4 péptidos por polisacárido.

FIGURA 29. Inhibición de la unión de plaquetas al colágeno mediante un ensayo colorimétrico. El colágeno inmovilizado en la superficie de una placa de 96 pocillos se incubó previamente con cada tratamiento y posteriormente se incubó con plasma rico en plaquetas (PRP). El ensayo de microplacas preparado como se describe se preincubó con tratamientos con colágeno, solo PBS; Dextrano; Dex-SILY6, dextrano-(SILY)6; Péptido SILY, SILY. * Significativo vs. colágeno (sin tratamiento).

FIGURA 30. Imagen de fluorescencia de plaquetas adheridas. Las plaquetas adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y la actina plaquetaria se marcó con faloidin-AlexaFluor 488. Se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas utilizando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI. Sin tratamiento, es decir, colágeno tratado con PBS.

FIGURA 31. Imagen de fluorescencia de plaquetas adheridas. Las plaquetas adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y la actina plaquetaria se marcó con faloidin-AlexaFluor 488. Se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas utilizando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI. Tratamiento: dextrano.

FIGURA 32. Imagen de fluorescencia de plaquetas adheridas. Las plaquetas adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y la actina plaquetaria se marcó con faloidin-AlexaFluor 488. Se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas utilizando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI. Tratamiento: conjugado de dextrano-SILY9.

FIGURA 33. Imagen de fluorescencia de plaquetas adheridas. Las plaquetas adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y la actina plaquetaria se marcó con faloidin-AlexaFluor 488. Se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas utilizando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI. Tratamiento: hialuronano. Figura 34. Imagen de fluorescencia de plaquetas adheridas. Las plaquetas adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y la actina plaquetaria se marcó con faloidin-AlexaFluor 488. Se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas utilizando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI. Tratamiento: conjugado hialuronano-SILY.

FIGURA 35. Imagen de fluorescencia de plaquetas adheridas. Las plaquetas adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y la actina plaquetaria se marcó con faloidin-AlexaFluor 488. Se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas utilizando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI. Tratamiento: heparina. FIGURA 36. Imagen de fluorescencia de plaquetas adheridas. Las plaquetas adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y la actina plaquetaria se marcó con faloidin-AlexaFluor 488. Se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas utilizando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI. Tratamiento: conjugado heparina-SILY.

FIGURA 37. Imagen de fluorescencia de plaquetas adheridas. Las plaquetas adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y la actina plaquetaria se marcó con faloidin-AlexaFluor 488. Se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas utilizando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI. Tratamiento: péptido SILY.

FIGURA 38. Degradación del colágeno determinada por hidroxiprolina. Tratamientos: Ctrl, sin células añadidas; Col, colágeno sin tratamiento adicional; DS, sulfato de dermatan; Decorin; DS-SILY, conjugado de dermatan sulfato-SILY; DS-Dc13, conjugado de dermatan sulfato Dc13; SILY, péptido SILY; Dcl3, péptido Dc13.

FIGURA 39. Inhibición de la activación plaquetaria. Medida determinando la liberación de los factores de activación Factor Plaquetario 4 (PF-4) y p-tromboglobulina (Nap-2). Los geles de colágeno tipo I y III en la superficie de una placa de 96 pocillos se preincubaron con cada tratamiento y posteriormente se incubaron con PRP. La activación de las plaquetas se midió mediante la liberación de los factores de activación PF-4 y Nap-2. Tratamientos: PBS, tampón solo; Dex, dextrano; Dex-SILY, conjugado de dextrano-SILY; Dex-GSIT, conjugado de dextrano-GSIT; Dex-KELN, conjugado de dextrano-KELN; Dex-Dcl3, conjugado de dextrano-Dcl3; SILY, péptido SILY; GSIT, péptido GSIT; KELN, péptido KELN; Dc13, péptido Dc13; Dex-SILY Dex-GSIT; combinación de conjugado dextrano-SILY y conjugado de dextrano-GSIT; SILY GSIT; Combinación de péptido SILY y péptido GSIT. * Indica que los resultados son significativos en comparación con la superficie de colágeno sin tratamiento (PBS). ** Indica que los resultados también son significativos en comparación con la superficie de colágeno con Dex. *** Indica que los resultados también son significativos en comparación con la superficie de colágeno con el control de péptidos correspondiente. Todos los peptidoglicanos causaron una disminución significativa en la liberación de NAP-2 en comparación con ningún tratamiento (PBS) o tratamiento con dextrano, mientras que Dex-GSIT también disminuyó la liberación sobre su control de péptidos (GSIT). Dex-GSIT y Dex-KELN disminuyeron significativamente la liberación de PF-4 en relación con ningún tratamiento (PBS) y el tratamiento con dextrano, mientras que Dex-Dc13 disminuyó significativamente la liberación de PF-4 sobre ningún tratamiento (PBS).

FIGURA 40. Inhibición de la unión de plaquetas al colágeno (adhesión) mediante un ensayo colorimétrico. Tratamientos: PBS, tampón solo; Dex, dextrano; Dex-SILY, conjugado de dextrano-SILY; Dex-GSIT, conjugado de dextrano-GSIT; Dex-KELN, conjugado de dextrano-KELN; Dex-Dc13, conjugado de dextrano-Dc13; SILY, péptido SILY; GSIT, péptido GSIT; KELN, péptido KELN; Dc13, péptido Dc13; Dex-SILY Dex-GSIT; combinación de conjugado dextrano-SILY y conjugado de dextrano-GSIT; SILY GSIT; Combinación de péptido SILY y péptido GSIT. * Superficie significativa frente a colágeno sin tratamiento (PBS). ** También significativo contra la superficie de colágeno con Dex. ***También significativo contra la superficie de colágeno con el control peptídico correspondiente. Dex-SILY y Dex-KELN tuvieron una disminución significativa de la adherencia de las plaquetas en comparación con ningún tratamiento (PBS) o tratamiento con Dextran, mientras que Dex-GSIT también disminuyó la adherencia de las plaquetas sobre su tratamiento de control de péptidos (GSIT).

FIGURA 41 muestra la purificación de DS-BMPH. El número de reticuladores de BMPH unidos a DS se determina calculando el exceso de BMPH que luego se resta de la cantidad conocida añadida, que produce la cantidad que reacciona con el DS oxidado. La excelente separación de las dos especies moleculares se logra bajo los procedimientos de purificación, lo que se demuestra por la amplia separación de los picos. FIGURA 42 muestra la oxidación del peryodato. Al aumentar la cantidad de meta-peryodato de sodio durante la oxidación de DS, el número de reticulantes BMPH por cadena de DS aumenta linealmente.

FIGURA 43 muestra la afinidad de unión a peptidoglicano. Los peptidoglicanos marcados con biotina DS-SILY4 y DS-SILY18 se sintetizaron e incubaron en una superficie de colágeno fibrilar. Después del lavado, se detectó el peptidoglicano unido y se ajustaron las curvas de unión de saturación para calcular las afinidades de unión. DS-SILY4 y DS-SILY18 se unen al colágeno con K^d = 118 nM y 24 nM respectivamente, lo que demuestra que al aumentar el número de péptidos unidos aumenta la afinidad del peptidoglicano al colágeno. Además, un mayor número de péptidos aumenta la cantidad de peptidoglicano que se une a la superficie, lo que se observa por el aumento de la absorbancia. Nota DS-SILY18 no contiene más péptidos marcados con biotina que DS-SILY4.

FIGURA 44 muestra el porcentaje de disminución en la liberación de los factores de activación PF4 y NAP2 en comparación con las superficies de colágeno no tratadas (NT). DS, SILY o DS-SILY se incubaron durante 15 minutos a una concentración de 50 |jm y luego se enjuagaron de la superficie de colágeno durante 24 horas. * indica significado para NT, ** indica significado para NT, y DS, y SILY a = 0,05.

FIGURA 45 muestra la inhibición de la activación plaquetaria. Las superficies de colágeno fibrilar se incubaron con concentraciones variables de peptidoglicano DS-SILY18. El peptidoglicano no unido se enjuagó de la superficie durante 24 horas. Las plaquetas humanas se incubaron en la superficie y la activación se midió mediante la liberación de PF-4 y Nap-2 siguiendo las pautas de la FDA. La inhibición máxima de la activación plaquetaria se logró en 10 jm concentraciones.

FIGURA 46 muestra la difusión de DS-SILY18 desde una superficie de colágeno fibrilar. El DS-SILY18 etiquetado se unió a una superficie de colágeno como se describe y se incubó a 37°C con un enjuague extenso durante hasta 11 días. La detección del peptidoglicano en varios puntos temporales mostró que se difunde desde la superficie a lo largo del tiempo, pero incluso después de 1 semana, el equivalente de aproximadamente 10 nM permaneció unido.

FIGURA 47 muestra la proliferación de células endoteliales. La proliferación se midió en presencia de concentraciones variables de peptidoglicano para determinar si el peptidoglicano tenía un efecto adverso sobre el recrecimiento endotelial. En la concentración más alta ensayada, se observó un aumento significativo en la proliferación celular. * indica significancia a = 0,05, n = 6, presentada como promedio estándar. dev. FIGURA 48 muestra la migración endotelial en las superficies de colágeno tratadas. Para imitar más de cerca el ambiente de un vaso desnudo con colágeno expuesto, se analizó el crecimiento endotelial en colágeno con concentraciones variables de peptidoglicano unido. A concentraciones más altas de peptidoglicanos hubo un aumento significativo en la migración de células endoteliales. * indica significancia a = 0,05, n = 6, presentada como promedio desarrollo estándar.

FIGURA 49 muestra la unión de las plaquetas al colágeno bajo flujo. Se analizó plasma humano rico en plaquetas bajo flujo para la fijación de plaquetas en superficies de colágeno fibrilar. Las condiciones de tratamiento Las superficies de colágeno tratadas con DS-SILY (Panel A) o no tratadas (Panel B) muestran significativamente menos plaquetas unidas en la superficie tratada con peptidoglicano.

FIGURA 50 muestra una representación esquemática de la inhibición por peptidoglicano de la unión de las plaquetas y la activación en el colágeno del endotelio denudado.

FIGURA 51 muestra la cuantificación de la unión plaquetaria inhibida por vasoespasmo. El panel A muestra un perfil de angiografía representativa de los vasos lesionados con balón tratados y no tratados. El vasoespasmo es evidente en el vaso no tratado, mientras que el tratamiento con peptidoglicano no presenta vasoespasmo. El panel B muestra el vasoespasmo cuantificado midiendo el % de oclusión del vaso utilizando datos de angiografía. Se analizaron un total de 12 lesiones por balón, 7 no tratadas y 5 tratadas. * indica importancia en comparación con p = 0,005 sin tratar.

FIGURA 52 muestra la evaluación histológica de los vasos lesionados por balón utilizando la tinción de Verhoff-Van Gieson. La hiperplasia íntima es evidente en el control simulado (panel A) como se observa por el crecimiento de la lámina elástica interna. En los vasos tratados con peptidoglicano, la hiperplasia de la íntima está ausente (panel B).

FIGURA 53 muestra las arterias denudadas incubadas con Ix PBS (Panel A: Control) o peptidoglicano marcado (Panel B: Peptidoglicano (10 jm DS-SILY18-biotina)).

FIGURA 54 muestra la inhibición por DS-SILY18 de la unión de la sangre total al colágeno bajo flujo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

[0014] Tal como se utiliza de acuerdo con esta invención, un "peptidoglicano sintético de unión a colágeno" significa un conjugado de un glicano de unión con un péptido sintético colágeno. Los "peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno" pueden tener una homología de aminoácidos con una porción de una proteína o un proteoglicano que normalmente no participa en fibrilogénesis del colágeno o puede tener una homología de aminoácidos con una porción de una proteína o un proteoglicano que normalmente participa en la fibrilogénesis del colágeno.

[0015] Estos proteoglicanos sintéticos de unión a colágeno se pueden usar en procedimientos de intervención vasculares incluyendo, por ejemplo, para evitar que una cualquiera o una combinación de enlace de plaquetas a colágeno expuesto del endotelio denudado, activación de plaquetas, trombosis, inflamación resultante de denudación del endotelio, hiperplasia intimal, y vasoespasmo. Los peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno descritos en el presente documento también pueden estimular la proliferación de células endoteliales y pueden unirse a colágeno en un vaso denudado.

[0016] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, los peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno descritos comprenden péptidos sintéticos de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoácidos. En algunas realizaciones, estos péptidos tienen homología con la secuencia de aminoácidos de un pequeño proteoglicano rico en leucina, una secuencia del receptor de plaquetas o una proteína que regula la fibrilogénesis del colágeno. El péptido sintético es una secuencia de aminoácidos de RRANAALKAGELYKSILY y una secuencia de aminoácidos con una homología del 80%, 85%, 90%, 95% o 98% con la secuencia de aminoácidos. En una divulgación que no está dentro del alcance de la invención, el péptido sintético también puede ser cualquier péptido de 5 a 40 aminoácidos seleccionados de péptidos que tienen actividad de unión a colágeno y que son 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 100% homólogo con el (los) dominio(s) de unión a colágeno del factor de von Willebrand o un receptor de colágeno plaquetario como se describe en Chiang, et al., J. Biol. Chem. 277: 34896-34901 (2002), Huizinga, et al., Structure 5:1147-1156 (1997), Romijn, et al., J Biol. Chem. 278: 15035-15039 (2003), y Chiang, et al., Cardio. & Haemato. Disorders-Durg Targets 7: 71-75 (2007).

[0017] El glucano (por ejemplo glicosaminoglicanos, GAG abreviada, o polisacárido) unido al péptido sintético se puede seleccionar del grupo que consiste de alginato, agarosa, dextrano, condroitina, dermatano, sulfato de dermatano, de heparano, heparina, queratina, y hialuronano. En una realización, el glicano se selecciona del grupo que consiste en sulfato de dermatán, dextrano y heparina. En otra realización ilustrativa, el glicano es sulfato de dermatán. El proteoglicano sintético de unión al colágeno en cualquiera de estas realizaciones puede usarse para inhibir la unión de las plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación plaquetaria, la trombosis, la inflamación resultante de desnudar el endotelio, la hiperplasia de la íntima y el vasoespasmo durante un procedimiento de intervención vascular. Los peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno descritos en el presente documento también pueden estimular la proliferación de células endoteliales y pueden unirse a colágeno en un vaso denudado.

[0018] En un aspecto ilustrativo, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede esterilizarse. Como se usa en este documento, "esterilización" o "esterilizar" o "esterilizado" significa desinfectar los peptidoglicanos sintéticos que se unen al colágeno mediante la eliminación de contaminantes no deseados, incluidas las endotoxinas y los agentes infecciosos.

[0019] En diversas realizaciones ilustrativas, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede desinfectar y/o esterilizar utilizando técnicas de esterilización convencionales que incluyen óxido de propileno o tratamiento con óxido de etileno, esterilización con plasma de gas, radiación gamma, haz de electrones, y/o esterilización con un perácido, como el ácido peracético.

Se pueden usar técnicas de esterilización que no afectan adversamente la estructura y las propiedades biotrópicas del peptidoglicano sintético que se une al colágeno. Técnicas ilustrativas de esterilización son la exposición del peptidoglicano sintético de unión al colágeno al ácido peracético, a la irradiación gamma de 1-4 Mrads (o a 1-2,5 Mrads de la irradiación gamma), al tratamiento con óxido de etileno, a la filtración estéril o a la esterilización con gas plasma. En una realización, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede someterse a uno o más procesos de esterilización. Otra realización ilustrativa es someter el proteoglicano sintético de unión al colágeno a filtración estéril. El peptidoglicano sintético de unión al colágeno puede envolverse en cualquier tipo de recipiente que incluye una envoltura de plástico o una envoltura de aluminio, y puede esterilizarse más.

[0020] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, el colágeno de unión se puede combinar con minerales peptidoglicanos sintéticos, aminoácidos, azúcares, péptidos, proteínas, vitaminas (tales como ácido ascórbico), o laminina, colágeno, fibronectina, ácido hialurónico, fibrina, elastina, o agrecano, o factores de crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento transformante beta o factor de crecimiento de fibroblastos, y glucocorticoides como dexametasona o agentes alteradores viscoelásticos, como polímeros iónicos y no iónicos solubles en agua.; polímeros de ácido acrílico; polímeros hidrófilos tales como óxidos de polietileno, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno y alcohol polivinílico; polímeros celulósicos y derivados poliméricos celulósicos tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa ftalato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa y celulosa eterificada; ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácidos láctico y glicólico, u otros agentes poliméricos tanto naturales como sintéticos.

[0021] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, un kit se proporciona comprendiendo uno o más peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno. El kit en sí puede estar dentro de un contenedor de cualquier tipo, y el kit puede contener instrucciones para el uso de los componentes del kit. En una realización, el kit comprende un recipiente, vial, recipiente, bolsa o envoltura, por ejemplo, que contiene un peptidoglicano sintético que se une al colágeno. En otra realización, el kit comprende un recipiente o recipientes separados (por ejemplo, un vial, recipiente, bolsa o envoltura), cada uno de los cuales contiene uno de los siguientes componentes: un tampón y uno o más tipos de peptidoglicanos sintéticos que se unen al colágeno. En cualquiera de estas realizaciones, los kits pueden comprender además un tampón, un agente de esterilización o desinfección, proteínas o polisacáridos no colágenos y/o materiales de instrucción que describen métodos para usar los reactivos del kit. En cualquiera de estas realizaciones, el kit puede contener un componente seleccionado del grupo que consiste en un catéter, un stent, un globo y una combinación de los mismos. El peptidoglicano sintético que se une al colágeno se puede liofilizar, por ejemplo, en un tampón o en agua.

[0022] En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede ser un compuesto de la siguiente fórmula

(PnL)xG en la que n es de 1 a 7;

en donde x es 1 a 10;

en donde P es un péptido sintético de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoácidos que comprende una secuencia de RRAn Aa LKAGELYKSILY; en donde L es un enlazador; y

en donde G es un glicano.

[0023] En la fórmula descrita anteriormente, n puede ser de 1 a 5.

[0024] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, un peptidoglicano sintético de unión a colágeno que comprende un péptido sintético de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoácidos con homología de secuencia de aminoácidos a un péptido de unión a colágeno (por ejemplo, una porción de una secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a colágeno o proteoglicano) conjugado con alginato, agarosa, dextrano, condroitina, dermatán, sulfato de dermatán, heparán, heparina, queratina y hialuronano. En una realización, el glicano se selecciona del grupo que consiste en sulfato de dermatán, dextrano, hialuronano y heparina. En otra realización ilustrativa, el glicano es sulfato de dermatán. En otra realización más, el glicano es sulfato de dermatano con 18 péptidos de la secuencia RRANAALKAGELYKSILYGC unido al glicano (es decir, DS-SlLY-ia). En otra realización más, el glicano es sulfato de dermatán con 18 péptidos que comprenden la secuencia RRANAALKAGELYKSILY unida al glicano. El proteoglicano sintético de unión a colágeno en cualquiera de estas realizaciones puede usarse para inhibir la unión de plaquetas al colágeno expuesto del endotelio desnudo, inhibir la unión de otras células en la sangre al colágeno expuesto del epitelio desnudo, inhibir la activación de las plaquetas, inhibir la trombosis, inhibir la inflamación como resultado de desnudar el endotelio, inhibir la hiperplasia de la íntima e/o inhibir el vasospasmo. Los peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno descritos en el presente documento también pueden estimular la proliferación de células endoteliales y pueden unirse a colágeno en un vaso denudado. En cualquiera de estas realizaciones, estos efectos mencionados anteriormente pueden ocurrir durante un procedimiento de intervención vascular, como un procedimiento basado en catéter. En cualquiera de estas realizaciones, puede usarse cualquiera de los compuestos descritos anteriormente.

[0025] En otra realización ilustrativa, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente como realizaciones A, B, o C o realizaciones alternativas A o B puede inhibir plaquetas de unión a colágeno expuesto del endotelio denudado, activación de plaquetas, trombosis, inflamación resultante de denudar el endotelio, hiperplasia de la íntima y/o vasoespasmo, o puede estimular la proliferación de células endoteliales o puede unirse al colágeno en un vaso denudado. En otra realización ilustrativa, durante un procedimiento de intervención vascular, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente como realizaciones A, B o C o realizaciones alternativas A o B, puede inhibir la unión de las plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación de las plaquetas, la trombosis, la inflamación resultante de desnudar el endotelio, la hiperplasia de la íntima y/o el vasoespasmo, o puede estimular la proliferación de células endoteliales o puede unirse al colágeno en un vaso denudado. En otra realización ilustrativa, durante un procedimiento de intervención vascular, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente como realizaciones A, B o C o realizaciones alternativas A o B, puede inhibir la unión de las plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación de las plaquetas, la hiperplasia íntima y/o vasoespasmo, o puede unirse al colágeno en un vaso denudado.

[0026] En otra realización ilustrativa, DS-SlLY-ia puede inhibir unión de plaquetas a colágeno expuesto del endotelio denudado, activación de plaquetas, trombosis, inflamación resultante de denudación del endotelio, la hiperplasia de la íntima, y/o vasoespasmo, o puede estimular la proliferación de células endoteliales o puede unirse al colágeno en un vaso denudado. En otra realización ilustrativa, durante un procedimiento de intervención vascular, DS-SlLY-ia puede inhibir la unión de las plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación plaquetaria, la trombosis, la inflamación resultante de la denudación del endotelio, la hiperplasia intimal y/o el vasoespasmo, o puede estimular la proliferación de células endoteliales o puede unirse al colágeno en un vaso denudado. En otra realización ilustrativa, durante un procedimiento de intervención vascular, DS-SILY18 puede inhibir la unión de las plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación de las plaquetas, la hiperplasia de la íntima y/o los vasos sanguíneos, o puede unirse al colágeno en un vaso denudado.

[0027] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, los péptidos sintéticos descritos en este documento pueden ser modificados mediante la inclusión de una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Como es bien sabido por los expertos en la técnica, la alteración de cualquier aminoácido no crítico de un péptido mediante una sustitución conservadora no debería alterar significativamente la actividad de ese péptido porque la cadena lateral del aminoácido de reemplazo debería poder formar enlaces similares y contactos con la cadena lateral del aminoácido que ha sido reemplazado.

[0028] Son posibles sustituciones no conservadoras, siempre que éstas no afecten excesivamente la actividad de unión de colágeno del péptido y/o reducir su eficacia en la inhibición de la activación de plaquetas, unión de plaquetas a colágeno expuesto del endotelio denudado, activación de plaquetas, trombosis, inflamación como resultado de desnudar el endotelio, la hiperplasia de la íntima y/o el vasoespasmo, o su efectividad para estimular la proliferación de las células endoteliales o para unirse al colágeno en un vaso denudado.

[0029] Como es bien conocido en la técnica, una "sustitución conservadora" de un aminoácido o una "variante de sustitución conservadora" de un péptido se refiere a una sustitución de aminoácidos que mantiene: 1) la estructura secundaria del péptido; 2) la carga o hidrofobicidad del aminoácido; y 3) el volumen de la cadena lateral o una o más de estas características. Ilustrativamente, las terminologías bien conocidas "residuos hidrófilos" se refieren a serina o treonina. Los "residuos hidrófobos" se refieren a leucina, isoleucina, fenilalanina, valina o alanina. Los "residuos cargados positivamente" se refieren a lisina, arginina, omitina o histidina. Los "residuos cargados negativamente" se refieren al ácido aspártico o al ácido glutámico. Los residuos que tienen "cadenas laterales voluminosas" se refieren a fenilalanina, triptófano o tirosina. En la Tabla 1 se proporciona una lista de sustituciones de aminoácidos conservativas ilustrativas.

TABLA 1

[0030] En las diversas realizaciones de sustitución conservadoras de aminoácidos descritos en este documento, un peptidoglicano sintético de unión a colágeno que comprende un péptido sintético de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de homología a un péptido de unión a colágeno (por ejemplo, una porción de una secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a colágeno o proteoglicano) conjugada a un glicano seleccionado del grupo que consiste en alginato, agarosa, dextrano, condroitina, dermatán, sulfato de dermatán, heparina, heparina, queratina, y se puede usar hialuronano. En una realización, el glicano se selecciona del grupo que consiste en sulfato de dermatán, dextrano, hialuronano y heparina. En otra realización ilustrativa, el glicano es sulfato de dermatán. En otra realización más, el glicano es sulfato de dermatano con 18 péptidos de la secuencia RRANAALKAGELYKSILYGC unido al glicano y esta secuencia puede estar sustituida de forma conservadora. El proteoglicano sintético de unión a colágeno en cualquiera de estas realizaciones de sustitución conservativa puede usarse para inhibir la unión de plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación de plaquetas, la trombosis, la inflamación resultante de la denudación del endotelio, la hiperplasia intimal y el vasoespasmo. Los peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno descritos en el presente documento con sustituciones conservativas de aminoácidos también pueden estimular la proliferación de células endoteliales y pueden unirse al colágeno en un vaso denudado. En cualquiera de estas realizaciones, estos efectos mencionados anteriormente pueden ocurrir durante un procedimiento de intervención vascular, como un procedimiento basado en catéter. En cualquiera de estas realizaciones de sustitución conservativa, se puede usar cualquiera de los compuestos descritos anteriormente.

[0031] En otra descripción ilustrativa, cualquiera de los compuestos seleccionados del grupo que consiste en RRANAALKAGELYKSILYGC, RLDGNEIKRGC, AHEEISTTNEGVMGC, NGVFKYRPRYFLYKHAYFYPPLKRFPVQGC, CQDSETRTFY, TKKTLRTGC, GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHMGC, SQNPVQPGC, SYIRIADTNITGC, SYIRIADTNIT, KELNLVYT, KELNLVYTGC, GSITTIDVPWNV, GELYKSILYGC, GSITTIDVPWNVGC y GCGGELYKSILY que tienen sustituciones conservativas de aminoácidos pueden usarse. En cualquiera de estas realizaciones, los compuestos con sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden inhibir la unión de las plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación de las plaquetas, la trombosis, la inflamación resultante de desnudar el endotelio, la hiperplasia intima 1 y/o el vasoespasmo, o pueden estimular las células endoteliales. proliferación o puede unirse al colágeno en un vaso denudado. En otra realización ilustrativa, durante un procedimiento de intervención vascular, cualquiera de estos compuestos con sustituciones de aminoácidos conservadoras puede inhibir la unión de las plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación de las plaquetas, la trombosis, la inflamación resultante de la denudación del endotelio, la hiperplasia intimal y/o el vasoespasmo, o puede estimular la proliferación de células endoteliales o puede unirse al colágeno en un vaso desnudo. En otra realización ilustrativa, durante un procedimiento de intervención vascular, cualquiera de los compuestos con sustituciones de aminoácidos conservadoras descritas en este párrafo puede inhibir la unión de las plaquetas al colágeno expuesto del endotelio denudado, la activación de las plaquetas, la hiperplasia de la íntima y/o el vasoespasmo, o puede unirse colágeno en un recipiente desnudado.

[0032] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, el péptido sintético se sintetiza de acuerdo con los protocolos de síntesis de péptidos en fase sólida que son bien conocidos por los expertos en la técnica. En una realización, un precursor peptídico se sintetiza sobre un soporte sólido de acuerdo con el protocolo de Fmoc bien conocido, se escinde del soporte con ácido trifluoroacético y se purifica por cromatografía de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica.

[0033] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, el péptido sintético se sintetiza utilizando los métodos de la biotecnología que son bien conocidos para las personas expertas en la técnica. En una realización, una secuencia de ADN que codifica la información de la secuencia de aminoácidos para el péptido deseado se liga mediante técnicas de ADN recombinante conocidas por los expertos en la técnica en un plásmido de expresión (por ejemplo, un plásmido que incorpora una etiqueta de afinidad para la purificación por afinidad de péptido), el plásmido se transfecta en un organismo huésped para su expresión, y el péptido se aísla luego del organismo huésped o del medio de crecimiento de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, mediante purificación por afinidad). Los métodos de tecnología de a Dn recombinante se describen en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), y son bien conocidos por los expertos en la materia.

[0034] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, el péptido sintético se conjuga con un glicano por reacción de un grupo amino libre del péptido con una función aldehído del glicano en presencia de un agente reductor, utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, para producir el péptido glicano conjugado. En una realización, se forma una función aldehído del glicano (por ejemplo, polisacárido o glicosaminoglicano) haciendo reaccionar el glicano con metaperyodato de sodio de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica.

[0035] En una realización, el péptido sintético se conjuga con un glicano por reacción de una función aldehído del glicano con 3-(2-piridilditio) hidrazida de propionilo (CPPD) para formar un glicano intermedio y hacer reaccionar adicionalmente el glicano intermedio con un péptido que contiene un grupo tiol libre para producir el péptido glicano conjugado. En otra realización más, la secuencia del péptido puede modificarse para incluir un segmento de glicinacisteína para proporcionar un punto de unión para un glicano o un conjugado de enlazador de glucano.

[0036] En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el péptido sintético se conjuga con un glicano por reacción de una función aldehído del glicano con un reticulante, por ejemplo, 3-(2-piridilditio) propionil hidrazida (CPPD), para formar un glicano intermedio y reaccionar adicionalmente el glicano intermedio con un péptido que contiene un grupo tiol libre para producir el conjugado de péptido glicano. En cualquiera de las diversas realizaciones descritas en el presente documento, la secuencia del péptido puede modificarse para incluir un segmento de glicina-cisteína para proporcionar un punto de unión para un glicano o un conjugado de glucano-enlazador. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el reticulante puede ser N-[ácido pmaleimidopropiónico]hidrazida (BMPH).

[0037] Aunque las realizaciones específicas se han descrito en los párrafos anteriores, los peptidoglicanos sintéticos de unión de colágeno descritos en este documento pueden realizarse mediante el uso de cualquier método reconocido en la técnica para la conjugación del péptido al glicano (por ejemplo, polisacárido o glicosaminoglicano). Esto puede incluir enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno, ya sea directa o indirectamente a través de un grupo de enlace, como un enlazador divalente. El conjugado se forma típicamente mediante un enlace covalente del péptido al glicano a través de la formación de los enlaces amida, éster o imino entre los grupos ácido, aldehído, hidroxi, amino o hidrazo en los componentes respectivos del conjugado. Todos estos métodos son conocidos en la técnica o se describen con más detalle en la sección de Ejemplos de esta solicitud o en Hermanson GT, Bioconjugate Techniques, Academic Press, pp,169-186 (1996). El enlazador comprende típicamente de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 átomos de carbono, más típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono. Típicamente se emplean enlazadores de bajo peso molecular (es decir, aquellos que tienen un peso molecular aproximado de aproximadamente 20 a aproximadamente 500).

[0038] Además, las modificaciones estructurales de la porción de ligador de los conjugados se contemplan en el presente documento. Por ejemplo, los aminoácidos pueden incluirse en el enlazador y se pueden hacer varias sustituciones de aminoácidos a la porción enlazadora del conjugado, incluidos los aminoácidos naturales, así como los disponibles de los métodos sintéticos convencionales. En otro aspecto, pueden usarse beta, gamma y aminoácidos de cadena más larga en lugar de uno o más aminoácidos alfa. En otro aspecto, el enlazador puede acortarse o alargarse, ya sea cambiando el número de aminoácidos incluidos en el mismo, o incluyendo más o menos aminoácidos beta, gamma o de cadena más larga. De manera similar, la longitud y la forma de otros fragmentos químicos de los enlazadores descritos en este documento pueden modificarse.

[0039] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, el enlazador puede incluir uno o más fragmentos bivalentes seleccionados independientemente en cada caso entre el grupo que consiste en alquileno, heteroalquileno, cicloalquileno, cicloheteroalquileno, arileno y heteroarileno, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido.

Como se usa en este documento, heteroalquileno representa un grupo resultante de la sustitución de uno o más átomos de carbono en un grupo alquileno lineal o ramificado con un átomo seleccionado independientemente en cada caso del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre.

[0040] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, un peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede administrar a un paciente (por ejemplo, un paciente en necesidad de tratamiento para inhibir la activación de las plaquetas, tal como el implicado en la trombosis, plaquetas de unión a colágeno expuesto del endotelio denudado, trombosis, inflamación resultante de desnudar el endotelio, hiperplasia de la íntima o vasoespasmo). En diversas realizaciones, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede administrar por vía intravenosa o en el músculo, por ejemplo. Las vías adecuadas para la administración parenteral incluyen administración intravascular, intravenosa, intraarterial, intramuscular, cutánea, subcutánea, percutánea, intradérmica e intraepidérmica. Los medios adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluidas las microagujas), técnicas de infusión y administración basada en catéter.

[0041] En una realización ilustrativa, las formulaciones farmacéuticas para su uso con peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno para la administración parenteral o el suministro basado en catéter que comprende: a) una cantidad farmacéuticamente activa del peptidoglicano sintético de unión a colágeno; b) un agente de tamponamiento del pH farmacéuticamente aceptable para proporcionar un pH en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente pH 9; c) un agente modificador de la fuerza iónica en el rango de concentración de alrededor de Oto alrededor de 300 milimolar; y d) agente modificador de la viscosidad soluble en agua en el rango de concentración de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 10% del peso total de la fórmula o cualquier componente individual a), b), c) o d) o cualquier combinación de a), b), c) y d) se proporcionan.

[0042] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, los agentes tamponadores del pH para su uso en las composiciones y métodos descritos en este documento son aquellos agentes conocidos por el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, acetato, borato, carbonato, citrato y tampones de fosfato, así como ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, óxido de magnesio, fosfato monopotásico, bicarbonato, amoníaco, ácido carbónico, ácido clorhídrico, citrato de sodio, ácido cítrico, ácido acético, fosfato de hidrógeno disódico, bórax, ácido bórico, hidróxido de sodio, ácido dietil barbitúrico y proteínas, así como varios tampones biológicos, por ejemplo, TAPS, Bicine, Tris, Tricine, HEPES, TES, MOPS, PIPES, cacodilato o MES.

[0043] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, los agentes iónicos de modificación de la resistencia incluyen aquellos agentes conocidos en la técnica, por ejemplo, glicerina, propilenglicol, manitol, glucosa, dextrosa, sorbitol, cloruro de sodio, cloruro de potasio, y otros electrolitos.

[0044] Los agentes moduladores de la viscosidad útiles incluyen polímeros solubles en agua iónica iónicos y no; polímeros de ácido acrílico reticulados tales como la familia de polímeros "carbómero", por ejemplo, carboxipolialquilenos que pueden obtenerse comercialmente bajo la marca registrada Carbopol®; polímeros hidrófilos tales como óxidos de polietileno, copolímeros de polioxietileno - polioxipropileno y alcohol polivinílico; polímeros celulósicos y derivados poliméricos celulósicos tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa ftalato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa y celulosa eterificada; gomas tales como tragacanto y goma xantana; alginato de sodio; gelatina, ácido hialurónico y sus sales, quitosanos, gelán o cualquier combinación de los mismos.

[0045] Típicamente, los agentes no ácidos potenciadores de la viscosidad, tales como un agente neutro o básico se emplean con el fin de facilitar la consecución del pH deseado de la formulación.

[0046] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, las formulaciones parenterales se pueden formular adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma seca a usar junto con un vehículo adecuado tal como agua estéril, libre de pirógenos. La preparación de las formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, mediante liofilización, pueden lograrse fácilmente usando técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.

[0047] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, la solubilidad de un peptidoglicano sintético de unión a colágeno utilizado en la preparación de una formulación parenteral puede incrementarse mediante el uso de técnicas de formulación apropiadas, como la incorporación de composiciones que mejoran la solubilidad, tales como manitol, etanol, glicerina, polietilenglicoles, propilenglicol, poloxómeros y otros conocidos por los expertos en la técnica.

[0048] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, las formulaciones para administración parenteral pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen formulaciones de liberación retardada, sostenida, pulsada, controlada, dirigida y programada. Por lo tanto, un peptidoglicano sintético que se une al colágeno se puede formular como un líquido sólido, semisólido o tixotrópico para la administración como un depósito implantado que proporciona una liberación modificada del compuesto activo. Los ejemplos ilustrativos de tales formulaciones incluyen stents recubiertos con fármacos y microesferas de ácido copolímero (dl-láctico, glicólico) (PGLA). En otra realización, los peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno o composiciones que comprenden peptidoglicano sintético de unión a colágeno pueden administrarse continuamente, cuando sea apropiado.

[0049] En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se pueden administrar por vía intravascular en el paciente (por ejemplo, en una arteria o vena) de cualquier manera adecuada. En diversas realizaciones descritas en el presente documento, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede administrar en un vaso de un paciente antes, durante o después de la intervención vascular. En diversas realizaciones, las intervenciones vasculares, como la intervención coronaria percutánea (ICP), pueden incluir, por ejemplo, colocación de stent, aterectomía, injerto y angioplastia, como la angioplastia con balón. Ilustrativamente, la intervención vascular puede ser una que implique ocluir temporalmente una arteria, como una arteria coronaria o una vena (por ejemplo, angioplastia con balón), o una que no implique ocluir temporalmente una arteria o una vena (por ejemplo, procedimientos de angioplastia no con balón, procedimientos de colocación de stents que no impliquen angioplastia con balón, etc.). Los modos ilustrativos de administración pueden incluir un catéter, administración parenteral, un recubrimiento en un balón, a través de un balón poroso, un stent revestido, y cualquier combinación de los mismos o cualquier otro método conocido de administración de medicamentos durante un procedimiento de intervención vascular. En una realización ilustrativa, el vaso diana puede incluir una arteria coronaria, por ejemplo, cualquier vaso sanguíneo que suministre sangre al tejido cardíaco de un paciente, incluidas las arterias coronarias nativas, así como las que se han injertado en el paciente, por ejemplo, en un procedimiento anterior de derivación de la arteria coronaria.

[0050] En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el vaso diana en el que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno es para ser administrado y en donde el procedimiento de intervención vascular se va a realizar puede contener un bloqueo, tal como una estenosis o alguna otra forma de bloqueo completo o parcial que causa un flujo sanguíneo reducido a través del vaso. De este modo, el peptidoglicano sintético que se une al colágeno se puede administrar al vaso a través de un catéter (por ejemplo, un catéter de dilatación, un catéter de balón de angioplastia sobre el alambre, un catéter de infusión, un catéter de intercambio rápido o monorriel, o cualquier otro dispositivo de catéter conocido en la técnica) que se inserta por vía percutánea en el paciente y que se enrosca a través de los vasos sanguíneos del paciente al vaso diana. En la técnica se conocen diversos dispositivos basados en catéteres, incluidos los descritos en la patente de EE.UU. n° 7,300,454. En varias realizaciones descritas en el presente documento donde se usa un catéter, el catéter usado para administrar el peptidoglicano sintético que se une al colágeno puede ser el mismo catéter a través del cual se realizará la intervención vascular, o puede ser un catéter diferente (por ejemplo, un catéter diferente) que se inserta por vía percutánea en el paciente a través de la misma o una incisión cutánea diferente y/o que se enrosca a través de los vasos sanguíneos del paciente al vaso diana a través de la misma o una ruta diferente). En otra realización, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede inyectar directamente en el vaso diana. En otra realización, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede administrarse sistémicamente (es decir, no administrado directamente al vaso diana, pero administrado por administración parenteral sin administración basada en catéter).

[0051] En el caso en el que el recipiente contiene una obstrucción (por ejemplo, una estenosis), la administración puede llevarse a cabo mediante la entrega del peptidoglicano sintético de unión a colágeno directamente al vaso diana en el sitio de la obstrucción o distal a la obstrucción o ambos. En otra realización, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede administrarse a uno o más sitios próximos al bloqueo. Ilustrativamente, la punta del catéter se puede mantener estacionaria mientras se administra el peptidoglicano sintético de unión al colágeno, o la punta del catéter se puede mover mientras se está administrando el peptidoglicano sintético de unión al colágeno (por ejemplo, en una dirección proximal desde una posición que es inicialmente distal al bloqueo, hacia o a través del bloqueo, o hacia una posición que sea proximal al bloqueo).

[0052] Como se ha indicado anteriormente, en una realización, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede administrar directamente en el vaso del paciente en un momento antes de la intervención vascular, por ejemplo, intervención coronaria percutánea. Por ejemplo, la administración del peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede realizar justo antes de la intervención vascular (por ejemplo, dentro de aproximadamente 1 hora, como dentro de aproximadamente 30 minutos, dentro de aproximadamente 15 minutos y/o dentro de

unos 5 minutos antes de la intervención vascular). Opcionalmente, el suministro del peptidoglicano sintético de unión al colágeno directamente al vaso diana se puede continuar durante todo o parte del procedimiento de intervención vascular y/o después de la finalización de dicho procedimiento, o el suministro del peptidoglicano sintético de unión al colágeno directamente al valo diana se puede detener antes del inicio del procedimiento de intervención vascular y no volver a iniciarse posteriormente. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el suministro del peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede ser continuo o puede efectuarse a través de una única o múltiples administraciones. Antes, durante y/o después de que el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se administre al vaso diana, se puede administrar el mismo peptidoglicano sintético de unión a colágeno o uno o más peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno diferentes.

[0053] En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede administrarse solo o en combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticos adecuados. Los ingredientes diluyentes o portadores utilizados en la formulación de peptidoglicano sintético de unión a colágeno pueden seleccionarse de manera que no disminuyan los efectos deseados del peptidoglicano sintético de unión a colágeno. La formulación de peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede estar en cualquier forma adecuada. Los ejemplos de formas de dosificación adecuadas incluyen soluciones acuosas del peptidoglicano de unión a colágeno, por ejemplo, una solución en solución salina isotónica, 5% de glucosa u otros vehículos líquidos farmacéuticamente aceptables bien conocidos tales como alcoholes, glicoles, ésteres y amidas.

[0054] Las dosificaciones adecuadas del peptidoglicano sintético de unión a colágeno pueden ser determinadas por métodos estándar, por ejemplo mediante el establecimiento de las curvas de dosis-respuesta en modelos animales de laboratorio o en ensayos clínicos. Ilustrativamente, las dosis adecuadas de peptidoglicano sintético de unión a colágeno (administradas en un solo bolo o con el tiempo) incluyen de 1 ng/kg a aproximadamente 10 mg/kg, 100 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 500 pg/kg, o de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 400 pg/kg. En cada una de estas realizaciones, dosis/kg se refiere a la dosis por kilogramo de masa o peso corporal del paciente. En otros aspectos ilustrativos, las dosis efectivas pueden variar desde aproximadamente 0,01 pg hasta aproximadamente 1000 mg por dosis, 1 pg hasta aproximadamente 100 mg por dosis, o desde aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 50 mg por dosis, o desde aproximadamente 500 pg a aproximadamente 10 mg por dosis o de aproximadamente 1 mg a 10 mg por dosis, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg por dosis, o de aproximadamente 1 mg a 5000 mg por dosis, o de aproximadamente 1 mg a 3000 mg por dosis, o de aproximadamente 100 mg a 3000 mg por dosis, o de aproximadamente 1000 mg a 3000 mg por dosis.

[0055] Intervención vascular, como la intervención coronaria percutánea, puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento convencional antes de, durante, o después de la administración del peptidoglicano sintético de unión a colágeno. Los ejemplos de procedimientos de intervención vascular contemplados para su uso junto con el método de la presente invención incluyen la colocación de stents, la aterectomía y la angioplastia, como la angioplastia con balón. El procedimiento de intervención vascular puede ser uno que implique la oclusión temporal del vaso (p. ej., angioplastia con balón), o uno que no implique la oclusión temporal del vaso (p. ej., procedimientos de angioplastia sin balón, procedimientos de colocación de stents que no impliquen angioplastia del balón, etc.). Los modos ilustrativos de administración pueden incluir un catéter, administración parenteral, un recubrimiento en un balón, a través de un balón poroso, un stent revestido, y cualquier combinación de los mismos o cualquier otro método conocido de administración de medicamentos durante un procedimiento de intervención vascular.

[0056] En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, los kits para llevar a cabo la intervención vascular, tales como los kits descritos anteriormente, se contemplan. Los kits pueden incluir un catéter o un stent y un peptidoglicano sintético que se une al colágeno. El peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede proporcionar en cualquiera de las formulaciones analizadas anteriormente y en la cantidad necesaria para llevar a cabo nuestra intervención vascular única, como de 1 ng/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de 100 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 500 pg/kg, o de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 400 pg/kg. En cada una de estas realizaciones, dosis/kg se refiere a la dosis por kilogramo de masa o peso corporal del paciente. En diversas realizaciones aquí descritas, las dosis efectivas proporcionadas en las formulaciones pueden variar desde aproximadamente 0,01 pg hasta aproximadamente 1000 mg por dosis, 1 pg hasta aproximadamente 100 mg por dosis, o desde aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 50 mg por dosis, o de aproximadamente 500 pg a aproximadamente 10 mg por dosis o de aproximadamente 1 mg a 10 mg por dosis, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg por dosis, o de aproximadamente 1 mg a 5000 mg por dosis, o de aproximadamente 1 mg a 3000 mg por dosis, o de aproximadamente 100 mg a 3000 mg por dosis, o de aproximadamente 1000 mg a 3000 mg por dosis. También se contemplan artículos de fabricación para cualquiera de estas realizaciones.

[0057] En cualquiera de las realizaciones de kit o artículos de fabricación descritas en este documento, el kit o artículo de fabricación puede comprender una dosis o múltiples dosis de peptidoglicano sintético de unión a colágeno. El peptidoglicano sintético que se une al colágeno puede estar en un contenedor primario, por ejemplo, un vial de vidrio, como un vial de vidrio ámbar con un tapón de goma y/o un sello de aluminio desprendible. En otra realización, el recipiente primario puede ser de plástico o aluminio, y el recipiente primario se puede sellar. En otra realización, el recipiente primario puede estar contenido dentro de un recipiente secundario para proteger adicionalmente la composición de la luz.

[0058] En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el kit o artículo de fabricación que pueden contener instrucciones de uso. Otros componentes adecuados del kit o artículo de fabricación incluyen excipientes, desintegrantes, aglutinantes, sales, anestésicos locales (p. ej., lidocaína), diluyentes, conservantes, agentes quelantes, tampones, agentes de tonicidad, agentes antisépticos, agentes humectantes, emulsionantes, dispersantes, estabilizadores. Estos componentes pueden estar disponibles por separado o mezclados con el peptidoglicano sintético de unión al colágeno. Cualquiera de las realizaciones de composición descritas en el presente documento se puede usar para formular el kit o artículo de fabricación.

[0059] En diversas realizaciones aquí descritas, el kit puede contener más de un catéter o un stent y una pluralidad de recipientes separados, conteniendo cada uno esterilizar formulaciones de peptidoglicano sintéticos de unión a colágeno en una cantidad necesaria para llevar a cabo una o varias intervenciones vasculares. Se puede incluir cualquier tipo de stent o catéter con el kit, incluidos, por ejemplo, catéteres de dilatación, catéteres de balón de angioplastia sobre el alambre, catéteres de infusión, catéteres de intercambio rápido o monorriel.

[0060] También se contempla que cualquiera de las formulaciones descritas en este documento pueden usarse para administrar el peptidoglicano sintético de unión a colágeno (por ejemplo, uno o más tipos) o bien en la ausencia o la presencia de un dispositivo basado en catéter. El proteoglicano sintético que se une al colágeno se puede formular en un excipiente. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el excipiente puede tener una concentración que oscila entre aproximadamente 0,4 mg/ml y aproximadamente 6 mg/ml. En diversas realizaciones, la concentración del excipiente puede oscilar entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml y aproximadamente 2 mg/ml a alrededor de 4 mg/ml.

[0061] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, la dosis de peptidoglicano sintético de unión a colágeno, puede variar significativamente dependiendo de la condición del paciente, el estado de enfermedad a tratar, la vía de administración y distribución en los tejidos, y la posibilidad de co-uso de otros tratamientos terapéuticos. La cantidad efectiva que debe administrarse a un paciente se basa en el área de la superficie corporal, el peso o la masa del paciente y la evaluación médica del estado del paciente. En varias realizaciones ejemplares, una dosis efectiva puede variar de aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 10 mg/kg, 100 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 500 pg/kg, o desde aproximadamente 100 pg/kg hasta aproximadamente 400 pg/kg. En cada una de estas realizaciones, dosis/kg se refiere a la dosis por kilogramo de masa corporal o peso corporal del paciente. En otros aspectos ilustrativos, las dosis efectivas pueden variar desde aproximadamente 0,01 pg hasta aproximadamente 1000 mg por dosis, 1 pg hasta aproximadamente 100 mg por dosis, o

de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 50 mg por dosis, o de aproximadamente 500 pg a aproximadamente 10 mg por dosis o de aproximadamente 1 mg a 10 mg por dosis, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg por dosis, o de aproximadamente 1 mg a 5000 mg por dosis, o de aproximadamente 1 mg a 3000 mg por dosis, o de aproximadamente 100 mg a 3000 mg por dosis, o de aproximadamente 1000 mg a 3000 mg por dosis. En cualquiera de las diversas realizaciones descritas en el presente documento, las dosis efectivas pueden variar desde aproximadamente 0,01 pg hasta aproximadamente 1000 mg por dosis, 1 pg hasta aproximadamente 100 mg por dosis, aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 1,0 mg, aproximadamente 50 pg hasta aproximadamente 600 pg, aproximadamente 50 pg a aproximadamente 700 pg, aproximadamente 100 pg a aproximadamente 200 pg, aproximadamente 100 pg a aproximadamente 600 pg, aproximadamente 100 pg a aproximadamente 500 pg, aproximadamente 200 pg a aproximadamente 600 pg, o de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 50 mg por dosis, o de aproximadamente 500 pg a aproximadamente 10 mg por dosis o de aproximadamente 1 mg a 10 mg por dosis. En otras realizaciones ilustrativas, las dosis efectivas pueden ser 1 pg, 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg, 100 pg, 125 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 275 pg, 300 pg, 350 pg, 400 pg, 450 pg, 500 pg, 550 pg, 575 pg, 600 pg, 625 pg, 650 pg, 675 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1,0 mg, 1,5 mg, 2,0 mg, 10 mg, 100 mg, o 100 mg a 30 gramos.

[0062] Cualquier régimen eficaz para la administración del peptidoglicano sintético de unión a colágeno puede ser utilizado. Por ejemplo, el peptidoglicano sintético de unión a colágeno se puede administrar como una dosis única o como un régimen diario de dosis múltiples. Además, se puede usar un régimen escalonado, por ejemplo, de uno a cinco días por semana como alternativa al tratamiento diario.

[0063] En diversas realizaciones descritas en el presente documento, el paciente se trata con múltiples inyecciones del peptidoglicano sintético de unión a colágeno. En una realización, se inyecta al paciente varias veces (por ejemplo, aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50 veces) con el peptidoglicano sintético de unión a colágeno, por ejemplo, a intervalos de 12-72 horas o a intervalos de 48-72 horas. Se pueden administrar al paciente inyecciones adicionales de peptidoglicano sintético que se une al colágeno en un intervalo de días o meses después de las inyecciones iniciales.

[0064] En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, es de entenderse que una combinación de dos o más peptidoglicanos sintéticos de unión a colágeno, que difieren en la parte de péptido, la porción de glicano, o ambos, puede ser utilizado en lugar de un solo peptidoglicano sintético de unión al colágeno.

[0065] También se apreciará que en las realizaciones anteriores, ciertos aspectos de los compuestos, composiciones y métodos se presentan en la alternativa en listas, tales como, de manera ilustrativa, las selecciones para uno cualquiera o más de G y P. Por tanto, debe entenderse que varias realizaciones alternativas de la invención incluyen miembros individuales de esas listas, así como los diversos subconjuntos de esas listas. Cada una de esas combinaciones debe entenderse que se describe en el presente documento a través de las listas.

[0066] En los siguientes ejemplos ilustrativos, los términos "peptidoglicano sintético" y "conjugado" se usan sinónimamente con el término "peptidoglicano sintético de unión a colágeno."

EJEMPLO 1

Síntesis de péptidos

[0067] Todos los péptidos se sintetizaron utilizando un sintetizador de péptidos Symphony (Protein Technologies, Tucson, AZ), utilizando un protocolo de Fmoc en una resina de Knorr. El péptido crudo se liberó de la resina con TFA y se purificó por cromatografía de fase inversa en un AKTAexplorer (GE Healthcare, Piscataway, NJ) utilizando una columna de fase reversa Grace-Vydac 218TP C-18 y un gradiente de agua/acetonitrilo al 0,1% de TFA. Los péptidos modificados con dansilo se prepararon añadiendo una etapa de acoplamiento adicional con dansilo-Gly (Sigma) antes de la liberación de la resina. Las estructuras peptídicas fueron confirmadas por espectrometría de masas. Los siguientes péptidos se prepararon como se describe anteriormente: RRANAALKAGELYKSILYGC, SYIRIADTNIT, Dansilo-GRRANAALKAGELYKSILYGC, y Dansilo-GSYIRIADTNIT. Estos péptidos se abrevian SILY, SYIR, Z-SILY y Z-SYIR. Un péptido Z-SYIR marcado con biotina también se ha sintetizado utilizando protocolos conocidos en la técnica y el péptido está terminado en amida. Se prepararon péptidos adicionales, KELNLVYTGC (abreviado KELN) y GSITTIDVPWNVGC (abreviado GSIT) como se describe anteriormente o se compraron (GenScript, Piscataway, NJ). EJEMPLO 2

Conjugación de SILY a sulfato de dermatán

Adjunto de PDPH a oxDS

[0068] La CPPD reticulante bifuncional (Pierce), reactiva frente a grupos sulfhidrilo y amina, se usó para conjugar SILY a oxDS. En el primer paso de la reacción, se disolvió oxDS en un tampón de acoplamiento (fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,25 M, pH 7,2) hasta una concentración final de 1,2 mM. Se añadió PDPH en un exceso molar de 10 veces, y la reacción procedió a temperatura ambiente durante 2 horas. El exceso de PDPH (MW 229 Da) se separó por filtración en gel en un Purificador Akta utilizando una columna XK 26-40 empaquetada con medio Sephadex G-25 y equilibrada con agua MilliQ. El eluyente se controló a 215 nm, 254 nm y 280 nm. El primer pico de elución que contenía DS-PDPH se recogió y se liofilizó para conjugarlo con SILY.

Conjugación de SILY

[0069] El péptido se disolvió en un exceso molar 5:1 en tampón de acoplamiento a una concentración final de péptido de aproximadamente 1 mM (limitado por la solubilidad del péptido). La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante la noche, y se separó el péptido en exceso y se aisló el conjugado DS-SILY mediante filtración en gel como se describe anteriormente. Consulte la Figura 14 que muestra una relación SILY/DS de 1,06 después del acoplamiento.

EJEMPLO 3

Conjugación de Z-SILY a sulfato de dermatán

[0070] Sulfato de dermatán se conjugó con Z-SILY de acuerdo con el método del Ejemplo 2.

EJEMPLO DE REFERENCIA 4

Conjugación de keln a sulfato de dermatán

[0071] Sulfato de dermatán se conjugó a keln según la método del Ejemplo 2.

EJEMPLO DE REFERENCIA 5

Conjugación de GSIT a sulfato de dermatán

[0072] Sulfato de dermatán se conjugó a GSIT de acuerdo con el método del Ejemplo 2.

EJEMPLO DE REFERENCIA 6

Conjugación de Z-SYIR a sulfato de dermatán

[0073] Sulfato de dermatán se conjugó a Z-SYIR utilizando un método similar al descrito en el EJEMPLO 2.

EJEMPLO 7

Conjugación de SILY a heparina

[0074] Heparina oxidada (oxHep) (MW = 19,7kDa) que contiene 1 aldehído por molécula (adquirido de Celsus Laboratories, Cincinnati, OH). Se formaron aldehídos adicionales mediante oxidación adicional en meta-peryodato de sodio como sigue. oxHep se disolvió en acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5, a una concentración de 10 mg/ml. Luego se añadió metaestadato de sodio a una concentración de 2 mg/ml y se dejó reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente protegida de la luz. El exceso de meta-peryodato de sodio se eliminó mediante desalinización utilizando una columna de exclusión de tamaño HiTrap (GEHealthcare) y el oxHep se liofilizó protegido de la luz hasta la conjugación con PDPH.

[0075] El oxHep se conjugó a PDPH mediante el método descrito para la conjugación DS-PDPH, EJEMPLO 2. La PDPH se hizo reaccionar en un exceso molar de 50 veces. Para lograr una mayor concentración de PDPH, se disolvieron 10 mg de PDPH en 75 pL de DMSO y se mezclaron con 1 ml de tampón de acoplamiento que contenía oxHep. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 2,5 horas y el exceso de PDPH se eliminó por desalinización. La heparina que contenía PDPH (Hep-PDPH) se almacenó como un polvo liofilizado hasta que reaccionó con SILY.

[0076] Se hizo reaccionar SILY en un exceso molar de 10 veces con Hep-PDPH como se describe para la conjugación DS-SILY en el EJEMPLO 2. La reacción se controló como se describe para DS-SILY en el EJEMPLO 2 y mostró 5,44 péptidos SILY conjugados por molécula de heparina como se muestra en la Figura 13.

EJEMPLO DE REFERENCIA 8

Conjugación de GSIT con heparina

[0077] La heparina se conjugó con GSIT de acuerdo con el método del EJEMPLO 7 (abreviado Hep-GSIT).

EJEMPLO 9

Conjugación de SILY a dextrano

[0078] El dextrano se conjugó con SILY de acuerdo con el método del EJEMPLO 7 que reemplaza la heparina con dextrano. Modificación de las condiciones para la oxidación de dextrano con meta-peryodato de sodio en el primer paso para permitir la preparación de conjugados con diferentes relaciones molares de SILY a dextrano. Por ejemplo, se prepararon conjugados dextrano-SILY con una relación molar de SILY a dextrano de aproximadamente 6 y un conjugado de dextrano-SILY con una relación molar de SILY a dextrano de aproximadamente 9 (abreviado Dex-SILY6 y Dex-SILY9).

EJEMPLO 10

Conjugación de SILY a hialuronano

[0079] El hialuronano se conjugó a SILY de acuerdo con el método de Ejemplo 7 (abreviado HA-SILY).

EJEMPLO 11

Unión SILY a Colágeno (Biacore)

[0080] Se realizaron estudios Biacore en un Biacore 2000 usando un chip CM-3 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ). El chip CM-3 está recubierto con dextrano carboximetilado covalentemente unido, que permite la unión del sustrato de colágeno a través de grupos de aminas libres. Se utilizaron células de flujo (FCs) 1 y 2, con FC-1 como célula de referencia y FC-2 como célula inmovilizada con colágeno. Cada FC se activó con EDC-NHS, y se inmovilizaron 1500 RU de colágeno sobre FC-2 haciendo fluir 1 mg/ml de colágeno en acetato de sodio, pH 4, tampón a 5 pL/min durante 10 min. Los sitios de éster de NHS sin reaccionar se cubrieron con etanolamina; El control FC-1 se activó y se cubrió con etanolamina.

[0081] Para determinar la afinidad de unión de péptidos, SILY se disolvió en tampón 1x HBS-EP (Biacore) en diferentes concentraciones de 100 pm a 1,5 pm en diluciones de 2 veces. El caudal se mantuvo a 90 pL/min, que está en el rango sugerido por Myska para determinar la cinética de unión (Myska, 1997). Las primeras 10 inyecciones fueron inyecciones de tampón, que ayudan a cebar el sistema, seguidas de inyecciones de muestra aleatorias, que se realizan por triplicado. El análisis se realizó con el software BIAevaluation (Biacore). Las curvas de asociación/disociación representativas se muestran en la Figura 3, demostrando que el péptido SILY se une de forma reversible con el colágeno. K^d = 1,2 pm se calculó a partir de la cinética de unión encendido-apagado.

EJEMPLO 12

Unión de Z-SILY al colágeno

[0082] Los ensayos de unión se realizaron en una placa de alta unión de 96 pocillos, negra con un fondo transparente (Costar). El colágeno se comparó con los pocillos no tratados y los pocillos recubiertos con BSA. El colágeno y BSA se inmovilizaron a 37°C durante 1 hora incubando 90 pl/pocillo a concentraciones de 2 mg/ml en HCl 10 mM y 1xPBS, respectivamente. Cada pocillo se lavó 3x con 1xPBS después de incubar. Z-SILY se disolvió en 1 x PBS a concentraciones de 100 |jm a 10 nM en diluciones de 10 veces. Los pocilios se incubaron durante 30 minutos a 37°C y se enjuagaron 3X con PBS y luego se llenaron con 90 j l de IxPBS. Las lecturas de fluorescencia se tomaron en un espectrofotómetro Spectramax M5 (Molecular Devices) en longitudes de onda de excitación/emisión de 335 nm/490 nm, respectivamente. Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5. Kd = 0,86 jm se calculó a partir de la cinética de equilibrio.

EJEMPLO 13

Caracterizar DS-SILY

[0083] Para determinar el número de moléculas SILY conjugados con DS, la producción de piridina-2-tiona se midió utilizando un protocolo modificado proporcionado por Pierce. Se disolvió sulfato de dermatán con 1,1 moléculas de PDPH unidas en tampón de acoplamiento (fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,25 M) a una concentración de 0,44 mg/ml y se midió la absorbancia a 343 nm utilizando un SpectraMax M5 (Molecular Devices). SILY se hizo reaccionar en un exceso molar de 5 veces y las medidas de absorbancia se repitieron inmediatamente después de la adición de SILY y después de dejar reaccionar durante 2 horas. Para asegurarse de que SILY no se absorba a 343 nm, se midió el tampón de acoplamiento que contenía 0,15 mg/ml de SILY y se comparó con la absorbancia del tampón solo.

[0084] El número de moléculas SILY conjugados con DS se calculó el coeficiente de extinción de piridina-2-tiona usando la siguiente ecuación (Abs343/8080) X (MWDs/DSmg/ml). Los resultados se muestran en la FIGURA 14.

EJEMPLO 14

Enlace de colágeno, datos de fluorescencia - DS-SILY

[0085] Con el fin de determinar si el conjugado de péptido mantuvo su capacidad de unirse a colágeno después de su conjugación con DS, se realizó un ensayo de unión fluorescente. Se sintetizó una versión marcada con fluorescencia de SILY, Z-SILY, agregando dansilglicina al término amina. Este péptido se conjugó con DS y se purificó utilizando los mismos métodos descritos para SILY.

[0086] Los ensayos de unión se realizaron en una placa de alta unión de 96 pocillos, negra con un fondo transparente (Costar). El colágeno se comparó con los pocillos no tratados y los pocillos recubiertos con BSA. El colágeno monomérico (Advanced Biomatrix Cat. N° 5010) y BSA se inmovilizaron a 37°C durante 1 h incubando 90 jL/pocillo a concentraciones de 2 mg/ml en HCl 10 mM y 1xPBS respectivamente. Cada pocillo se lavó 3x con 1xPBS después de incubar.

[0087] Los pocillos se preincubaron con DS a 37°C durante 30 minutos para eliminar la unión no específica de DS a colágeno. Los pocillos se enjuagaron 3x con 1xPBS antes de incubación con DS-Z-SILY. DS-Z-SILY se disolvió en 1 x PBS a concentraciones de 100 jM a 10 nM en diluciones de 10 veces. Los pocillos se incubaron durante 30 min a 37°C y se enjuagaron 3x y luego se llenaron con 90 j l de 1xPBS. Las lecturas de fluorescencia se tomaron en un espectrofotómetro Spectramax M5 (Molecular Devices) en longitudes de onda de excitación/emisión de 335 nm/490 nm, respectivamente.

[0088] La unión de fluorescencia de DS-Z-SILY en colágeno inmovilizado, BSA, y pocillos no tratados se comparan en la FIGURA 7. Los resultados muestran que DS-Z-SILY se une específicamente a los pocillos tratados con colágeno frente a pocillos BSA y los no tratados. Los pocillos no tratados de la placa de alta unión se diseñaron para ser un control positivo, aunque se observó poca unión en relación con los pocillos tratados con colágeno. Estos resultados sugieren que SILY mantiene su capacidad de unirse al colágeno después de su conjugación con DS. La preincubación con DS no impidió la unión, lo que sugiere que el conjugado se une por separado a la DS sola.

EJEMPLO 15

Preparación de geles de colágeno tipo I

[0089] Los geles se prepararon con colágeno de Nutragen (Inamed, Freemont, CA) a una concentración final de 4 mg/ml de colágeno. La reserva de Nutragen es 6,4 mg/mL en HCl 10 mM. La preparación del gel se realizó en hielo y se hicieron muestras frescas antes de cada prueba. La solución de colágeno se ajustó al pH fisiológico y la concentración de sal, agregando volúmenes apropiados de PBS 10x (solución salina tamponada con fosfato), 1xPBS y NaOH 1M. Para la mayoría de los experimentos, se agregaron muestras de DS, decorina, DS-SILY o DS-SYIR a una relación molar de muestra de colágeno 10:1 mediante una adición final de 1xPBS (volúmenes iguales a lo largo de los tratamientos) en las que las muestras de prueba se disolvieron a concentraciones adecuadas. De esta manera, las muestras se mantienen constantemente a pH 7,4 y la concentración de sal fisiológica. Las muestras de colágeno solo recibieron una adición de 1xPBS sin ninguna muestra disuelta. La fibrilogénesis se inducirá incubando soluciones de colágeno neutralizadas a 37°C durante la noche en una cámara humidificada para evitar la deshidratación. Las soluciones de gel con colágeno: proporciones molares de muestra distintas de 10:1 se prepararon de manera similar.

EJEMPLO 16

Caracterización viscoelástica del colágeno tipo III que contiene geles

[0090] Se prepararon geles que contenían colágeno tipo III como en el EJEMPLO 15 con las siguientes modificaciones: las soluciones de gel tratadas y sin tratar se prepararon utilizando una concentración de colágeno de 1,5 mg/ml (colágeno tipo III al 90% (Millipore), colágeno tipo I al 10%), se pipetearon muestras de 200 pl en superficies humectables de 20 mm de diámetro de portaobjetos impresos con material hidrofóbico. Estas soluciones se dejaron gelificar a 37°C durante 24 horas. Los geles se formaron a partir de colágeno solo, colágeno tratado con sulfato de dermatán (relación molar 1:1 y 5:1), y colágeno tratado con péptidos de unión a colágeno III solo (GSIT y KELN, relación molar 5:1) sirvieron como controles. Los geles tratados contenían los peptidoglicanos (DS-GSIT o DS-KELN a proporciones molares 1:1 y 5:1. Todas las proporciones son proporciones colágeno: compuesto de tratamiento. Los geles se caracterizaron como en el EJEMPLO 18, excepto que las muestras se analizaron a lo largo de rango de frecuencia de 0,1 Hz a 1,0 Hz con un estrés controlado de 1,0 Pa. Como se muestra en las Figuras 8 y 9, el conjugado de sulfato de dermatán-GSIT y el conjugado de sulfato de dermatán-KELN (peptidoglicanos sintéticos) pueden influir en las propiedades viscoelásticas de los geles formados con colágeno tipo III.

EJEMPLO 17

Fibrilogénesis

[0091] La fibrilogénesis del colágeno se monitorizó midiendo la absorbancia relacionada con la turbidez a 313 nm, proporcionando información sobre la tasa de fibrilogénesis y el diámetro de la fibrilla. Las soluciones de gel se prepararon como se describe en el EJEMPLO 15 (4 mg/ml de colágeno, 10:1 colágeno: tratamiento, a menos que se indique lo contrario) y se agregaron 50 uL/pocillo a 4°C a una placa de 384 pocillos. La placa se mantuvo a 4°C durante 4 horas antes de iniciar la formación de fibrillas. Se usó un SpectraMax M5 a 37°C para medir la absorbancia a 313 nm a intervalos de 30 s durante 6 horas. Los resultados se muestran en la Figura 10. Sulfato de dermatán-SILY disminuye la tasa de fibrilogénesis.

EJEMPLO 18

Mediciones Crio-SEM en Colágeno Tipo III

[0092] Se formaron geles para la crio-SEM, como en el Ejemplo 15, directamente en la etapa de SEM y se incubaron a 37° durante la noche con las siguientes modificaciones. La concentración de colágeno fue de 1 mg/ml (90% de colágeno tipo III, 10% de colágeno tipo I). La relación colágeno: DS fue 1:1 y la proporción colágeno: peptidoglicano fue 1:1. Las imágenes se registraron como en el EJEMPLO 19. La relación entre el volumen de vacío y el volumen de fibrillas se midió utilizando una variación del método del EJEMPLO 28. Los resultados se muestran en las Figuras 11 y 12. Sulfato de dermatán-KELN y sulfato de dermatán-GSIT disminuyen el vacío espacio (aumentar el diámetro de la fibrilla y la ramificación) en los geles de colágeno tratados.

EJEMPLO 19

Confirmación AFM de banda D

[0093] Soluciones de gel se prepararon como se describe en el Ejemplo 15 y 20 pL de cada muestra se pipetearon sobre un portaobjetos de vidrio y se dejó gelificar durante la noche en un incubador humidificado. Los geles se deshidrataron por tratamiento con soluciones de etanol graduadas (35%, 70%, 85%, 95%, 100%), 10 min en cada solución. Las imágenes de AFM se realizaron en modo de contacto, con una tasa de escaneo de 2 Hz (multimodo SPM, Veeco Instruments, Santa Barbara, CA, EE. UU., puntas de AFM punta de modo de contacto de nitruro de silicio k = 0,05N/m, Veeco Instruments) Valor nominal de desviación: 0-1 voltios. La banda D se confirmó en todos los tratamientos como se muestra en las Figuras 2 y 26.

EJEMPLO 20

Remodelación de colágeno

Preparación de muestras de tejido

[0094] Siguiendo un método por el Grassl, et al. (Grassl, et al., Journal of Biomedical Materials Research 2002, 60, (4), 607-612), se formaron geles de colágeno con o sin imitadores de PG sintéticos como se describe en el EJEMPLO 15. Células musculares lisas aórticas humanas (Cascade Biologies, Portland, OR) se sembraron dentro de geles de colágeno añadiendo 4 x 106 células/ml a la solución de colágeno neutralizada antes de la incubación. Las soluciones de colágeno celular se pipetearon en un portaobjetos Lab-Tek de 8 pocillos y se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C y 5% de CO2. Después de la gelificación, los geles de colágeno celular se cubrirán con 1 ml de Medio 231 según lo prescrito por Cascade. Cada 3-4 días, se eliminó el medio de las muestras y se midió el contenido de hidroxiprolina mediante un ensayo estándar de hidroxiprolina (Reddy, 1996).

Contenido de hidroxiprolina

[0095] Para medir el colágeno degradado en el medio sobrenadante, la muestra se liofilizó, la muestra hidrolizó en 2 M NaOH a 120°C durante 20 min. Después de enfriarse, la hidroxiprolina libre se oxidó agregando cloramina-T (Sigma) y reaccionando durante 25 minutos a temperatura ambiente. El reactivo de aldehído de Ehrlich (Sigma) se añadió y se dejó reaccionar durante 20 minutos a 65°C, y luego se leyó la absorbancia a 550 nm en un espectrofotómetro M-5 (Molecular Devices). El contenido de hidroxiprolina en el medio es una medida indirecta del potencial de remodelado de colágeno y tejido degradado. Los cultivos se incubaron hasta 30 días y se midieron tres muestras de cada tratamiento. Los geles incubados sin células añadidas se utilizaron como control. Los péptidos libres SILY y De13 dieron como resultado una mayor degradación del colágeno en comparación con el colágeno solo, medido por el contenido de hidroxiprolina en medio celular, como se muestra en la FIGURA 39.

Viabilidad celular

[0096] La viabilidad celular se determinó usando un kit vivo/muerto violeta viabilidad/vitalidad (Molecular Probes. El kit contiene mancha calceína-violeta (células vivas) y colorante reactivo aqua-fluorescente (células muertas). Las muestras se lavaron con 1 x PBS y se incubaron con 300 pl de solución de colorante durante 1 hora a temperatura ambiente. Para eliminar el colorante no unido, las muestras se enjuagaron con 1 x PBS. Las células vivas y muertas se contaron después de obtener imágenes de una porción 2-D con filtros 400/452 y 367/526 en un microscopio confocal Olympus FV 1000 con un objetivo de 20x. Los geles se escanearon en busca de regiones representativas y se tomaron 3 conjuntos de imágenes a distancias iguales en el gel para todas las muestras.

EJEMPLO DE REFERENCIA 21

Preparación de DS-Dc13

[0097] La secuencia del péptido DE13 es SYIRIADTNITGC y su forma marcada con fluorescencia es Zs YIR iADTNITGC, donde Z designa Dansilglicina. La conjugación con sulfato de dermatan utilizando el reticulante heterobifuncional PDPH se realiza como se describe para DS-SILY en el EJEMPLO 2. Como se muestra en la Figura 15, la relación molar de Dc13 a sulfato de dermatan en el conjugado (DS-Dc13) fue de aproximadamente 1.

Ejemplo 22

Ensayo de unión de fluorescencia para DS-ZSILY

[0098] La fluorescencia ensayos descritos para DS-ZSILY de unión se realizó con la secuencia de péptido ZSYIRIADTNITGC (ZDc13). Los resultados aparecen en la Figura 16, mostrando que DS-ZDc13 se une específicamente a la superficie del colágeno de una manera dependiente de la dosis, aunque la saturación no se logró a la tasa más alta ensayada.

EJEMPLO DE REFERENCIA 23

Ensayo de fibrilogénesis para DS-Dc13

[0099] Un ensayo de la fibrilogénesis como se describe para DS-SILY, Ejemplo 17, realizada con el DS-DC13 conjugado. Los resultados mostrados en la Figura 17 indican que el DS-Dc13 retrasa la fibrilogénesis y disminuye la absorbancia general de una manera dependiente de la dosis. El péptido Dc13 libre, por el contrario, tiene poco efecto sobre la fibrilogénesis en comparación con el colágeno solo en la proporción molar alta de colágeno:aditivo de 1 :1. EJEMPLO 24

Uso de Crio-SEM para medir los diámetros de fibrillas.

[0100] Usando una modificación del EJEMPLO 18, los diámetros de las fibrillas se midieron mediante 8crio-SEM. Los diámetros de las fibrillas de las imágenes crio-SEM tomadas a 20.000x se midieron utilizando el software ImageJ (NIH). Se midieron al menos 45 fibrillas para cada tratamiento. Los resultados se presentan como medio ± SE. El análisis estadístico se realizó utilizando el software DesignExpert (StatEase) con a = 0,05. Los resultados se muestran en la Figura 18. La decorina y los peptidoglicanos sintéticos disminuyen significativamente el diámetro de las fibrillas sobre el colágeno o colágeno sulfato de dermatán. En comparación con el colágeno solo, el péptido libre De13 no afecta el diámetro de la fibrilla, mientras que el SILY libre produce una disminución en el diámetro de la fibrilla.

EJEMPLO 25

Cultivo celular y compactación de gel

[0101] Las células musculares lisas de arteria coronaria humana (HCA SMC) (Cascade Biologics) se cultivaron en medio de crecimiento (Medio 231 suplementado con factor de crecimiento de músculo liso). Las células del pasaje 3 se utilizaron para todos los experimentos. Se utilizó medio de diferenciación (Medio 231 complementado con 1% de FBS y 1x pluma/estreptococo) para todos los experimentos, a menos que se indique lo contrario. Este medio difiere del protocolo del fabricante en que no contiene heparina.

[0102] Geles de colágeno se prepararon con cada aditivo como se ha descrito con la excepción de que la adición de la muestra 1x PBS se omitió para dar cabida a la adición de las células en medios. Después de incubarse en hielo durante 30 minutos, se añadieron HCA SMC en medio de diferenciación a las soluciones de gel hasta una concentración final de 1 x 106 células/ml. Los geles se formaron por cuadruplicado en placas tratadas con cultivo sin tejido de 48 pocillos (Costar) durante 6 horas antes de agregar 500 pL/medio de diferenciación de pocillo. Los geles se liberaron de los bordes del pozo después de 24 horas. El medio se cambió cada 2-3 días y las imágenes para compactación se tomaron en los mismos puntos de tiempo utilizando un Gel Doc System (Bio-Rad). El área de la sección transversal de los geles circulares que se correlaciona con el grado de compactación se determinó utilizando el software ImageJ (NIH). Los geles que no contenían células se utilizaron como control negativo y las células en geles de colágeno sin aditivos se utilizaron como control positivo. Los resultados se muestran en la Figura 19. El día 10, todos los geles se habían compactado hasta aproximadamente el 10% del área del gel original, y las diferencias entre los aditivos eran pequeñas. Los geles tratados con DS-Dc13 fueron leves, pero significativamente menos compactos que los geles tratados con decorina o colágeno, pero la compactación fue estadísticamente equivalente a la observada con los geles tratados con DS y SIL-SILY.

EJEMPLO 26

Medición de elastina

[0103] Los geles de colágeno sembrados con SMC de HCA se prepararon como se describe en el Ejemplo 25. El medio de diferenciación se cambió cada tres días y los geles se cultivaron durante 10 días. Se usaron geles de colágeno que no contenían células como control. Los geles se enjuagaron en 1xPBS durante la noche para eliminar la proteína sérica y los geles se analizaron para determinar el contenido de elastina utilizando el análisis de elastina Fastin según el protocolo de los fabricantes (Biocolor, County Atrim, Reino Unido). Brevemente, los geles se solubilizaron en ácido oxálico 0,25 M incubando a 100°C durante 1 h. La elastina se precipitó y las muestras se centrifugaron a 11.000 x g durante 10 min. El sobrenadante de colágeno solubilizado se eliminó y el sedimento de elastina se tiñó con reactivo de tinte Fastin durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 11.000 x g durante 10 minutos y se eliminó el colorante no unido en el sobrenadante. El colorante de los gránulos de elastina fue liberado por el reactivo de disociación Fastin Dye, y las muestras de 100 ml se transfirieron a una placa de 96 pocillos (Costar). La absorbancia se midió a 513 nm y el contenido de elastina se calculó a partir de una curva patrón de a-elastina. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 20. El tratamiento con DS-SILY aumentó significativamente la producción de elastina en todas las muestras. El tratamiento con DS y DS-Dc13 disminuyó significativamente la producción de elastina sobre el colágeno no tratado. Las muestras de control de geles de colágeno sin células no mostraron producción de elastina.

EJEMPLO 27

Efecto de la heparina o heparina-SlLY sobre la interacción plaquetaria

[0104] El colágeno se inmovilizó sobre portaobjetos de cubierta de vidrio (18 mm) mediante la incubación de portaobjetos con colágeno a 2 mg/ml en HCl 10 mM durante 1 hora a 37°C. Luego, los portaobjetos se lavaron con 1x PBS y se almacenaron a 4°C en 1x PBS durante 24 horas hasta que se realizaron más pruebas. Se utilizaron portaobjetos de cubierta de vidrio sin tratar como control negativo. Los portaobjetos se colocaron en una placa no tratada con cultivo de tejidos de 48 pocillos (Costar) con la superficie de colágeno hacia arriba. La heparina o la heparina-SlLY se disolvieron en 1x PBS a una concentración de 100 pm y se incubaron a 100 pL/pocillo durante 30 min a 37°C. Se aspiraron heparina no unida o heparina-SlLY y las superficies se lavaron con 1 ml de 1x PBS. Se utilizaron portaobjetos inmovilizados con colágeno incubados con 1x PBS que no contenía aditivo como control positivo.

[0105] La sangre humana total se centrifugó a 800 x g durante 15 min y 100 pL de plasma rico en plaquetas se retira de la capa de capa leucocítica y se añadió a cada pocillo. Después de incubarse durante 1 hora a 37°C, se extrajo plasma rico en plaquetas de los pocillos y los pocillos se lavaron suavemente con 1x PBS para eliminar las células no unidas. Los portaobjetos se fijaron con glutaraldehído al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente, se enjuagaron y se liofilizaron antes de la obtención de imágenes. Los portaobjetos se recubrieron por pulverización de oro durante 3 min y se tomaron imágenes a 200x en un JEOL 840 SEM. Los resultados se muestran en la Figura 21. Estas imágenes muestran que el tratamiento con el conjugado heparina-SlLY afecta la unión de las plaquetas al colágeno.

EJEMPLO 28

Medición crio-SEM de la densidad fibrilar

[0106] Geles de colágeno se formaron en presencia de cada aditivo en una proporción de 10:1 molar, tal como se describe en el EJEMPLO 15, directamente en la etapa de SEM, se procesaron, y se formaron las imágenes como se describe. Las imágenes a 10.000x se analizaron para los cálculos de densidad de fibrillas. Las imágenes se convirtieron a 8 bits en blanco y negro, y los valores de umbral para cada imagen se determinaron utilizando el software ImageJ (NIH). El umbral se definió como el valor donde todas las fibrillas visibles son blancas, y todo el espacio vacío es negro. La proporción de área blanca a negra se calculó utilizando el software MatLab. Todas las mediciones se tomaron por triplicado y los umbrales fueron determinados por un observador cegado al tratamiento. Las imágenes de los geles se muestran en la Figura 25 y las densidades medidas se muestran en la FIGURA 22.

EJEMPLO 29

Caracterización viscoelástica de geles que contienen Dc13 o DS-Dc13

[0107] Se prepararon geles de colágeno, como en el EJEMPLO 15. La caracterización viscoelástico se realizó como se describe en el Ejemplo 16 en geles formados con relaciones variables de colágeno para aditivo (tratamiento). El tratamiento con sulfato de dermatan o conjugado de dermatan-Dc13 aumenta la rigidez del gel de colágeno resultante sobre el colágeno no tratado, como se muestra en la FIGURA 23.

EJEMPLO 30

Ensayo de proliferación celular y citotoxicidad

[0108] Las SMC de HCA, preparadas como en el EJEMPLO 25, se sembraron a 4,8 x 104 células/ml en medio de crecimiento en una placa de fondo negro/transparente de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Costar) y se dejaron adherir durante 4 horas. Se aspiró el medio de crecimiento y se agregaron a cada pocillo 600 pl de medio de diferenciación que contenía cada aditivo a una concentración equivalente a la concentración dentro de los geles de colágeno (1,4 x 10-6 M). Las células se incubaron durante 48 horas y luego se analizaron la citotoxicidad y la proliferación utilizando los ensayos vivos-muertos y CyQuant (Invitrogen), respectivamente, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usaron células en medio de diferenciación que no contenían aditivo como control. Los resultados se muestran en la Figura 24 que indica que ninguno de los tratamientos demostró efectos citotóxicos significativos.

EJEMPLO 31

Inhibición de la unión de las plaquetas y la activación de las plaquetas a colágeno tipo I

Preparación de microplacas

[0109] El colágeno fibrilar de tipo I (Chronolog, Havertown, PA) se diluyó en glucosa isotónica a una concentración de 20-100 pg/ml. Se añadieron 50 pl de solución de colágeno a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de alta unión. La placa se incubó durante la noche a 4°C y luego se enjuagó 3X con 1X PBS.

[0110] El peptidoglicano se diluyó en PBS IX a concentraciones de solución de 25 pm a 50 pm y 50 pm se añadió a los pocillos recubiertos de colágeno. Los controles de GAG, péptido o PBS también se agregaron a los pocillos recubiertos con colágeno como controles. Los tratamientos se incubaron a 37°C con agitación a 200 rpm durante 30 min. Luego, los pocillos se enjuagaron 3X con IX PBS, incluido un enjuague de 20 minutos con 200 rpm de agitación para eliminar la molécula de tratamiento no unida.

Preparación y activación de plaquetas

[0111] Se extrajo sangre humana de voluntarios sanos mediante venopunción siguiendo el protocolo aprobado de Purdue IRB y con el consentimiento informado. Los primeros 5 ml de sangre se descartaron, ya que se pueden contaminar con colágeno y otras proteínas, y luego se recogieron aproximadamente 15 ml en vacutainers de vidrio citratado (BD Bioscience). La sangre se centrifugó en el tubo de vidrio durante 20 minutos a 200 x g a 20°C. La capa superior de la sangre centrifugada, el plasma rico en plaquetas (PRP), se usó para experimentos de plaquetas. Se añadió PRP (50 uL/pocillo) a la microplaca y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente sin agitación.

[0112] Después de 1 hora de incubación, el PRP se retiró de cada pocillo y se añadió a un tubo de microcentrífuga que contiene 5 pL ETP (EDTA 107 mM, teofilina 12 mM, y 2,8 m E1 M prostaglandina) para inhibir aún más la activación de plaquetas. Estos tubos se hicieron girar a 4°C durante 30 minutos a 1900 x g para sedimentar las plaquetas. El sobrenadante (suero plaquetario) se recogió para estudios ELISA para evaluar la presencia de marcadores de activación plaquetaria PF-4 y Nap-2.

Adherencia plaquetaria

[0113] Después de que el PRP se retiró de los pocilios de las placas de colágeno/tratamiento recubiertos, se enjuagaron los pocillos 3 veces con NaCl al 0,9% durante 5 min cada agitación a 200 rpm. La adherencia plaquetaria se cuantificó colormétricamente o se visualizó por fluorescencia.

Ensayo Colormétrico

[0114] Se añadieron 140 pl de un tampón de citrato de sodio/ácido cítrico (0,1 M, pH 5,4) que contenía Triton X-100 al 0,1% y 1 mg/ml de fosfato de p-nitrofenil a cada pocillo. La absorbancia de fondo se midió a 405 nm. La placa se incubó luego durante 40 minutos a temperatura ambiente con agitación a 200 rpm. El Triton X-100 crea poros en las células, lo que permite que el fosfato de p-nitrofenil interactúe con la fosfatasa ácida en las plaquetas para producir pnitrofenol. Después de 40 minutos de incubación, se agregaron 100 pl de 2 M NaOH a cada pocillo. El cambio de pH detiene la reacción al inactivar la fosfatasa ácida y también transforma el p-nitrofenol en un compuesto ópticamente activo. Luego se leyó la absorbancia a 405 nm y se correlacionó con el número de plaquetas adheridas. Los resultados se muestran en la Figura 29.

Ensayo de fluorescencia

[0115] Las plaquetas adheridas se fijaron mediante incubación con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las plaquetas se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 5 min. La actina plaquetaria se marcó mediante incubación con faloidina-AlexaFluor 488 (Invitrogen) que contenía BSA al 1% durante 30 min. Los pocillos se enjuagaron 3X con IX PBS, y se tomaron imágenes de las plaquetas adheridas usando un microscopio de fluorescencia vertical utilizando un filtro DAPI.

[0116] Ver las FIGURAS 30 a 39 para los resultados. La agregación de plaquetas en las superficies de colágeno no tratadas se indica mediante imágenes borrosas que resultan de las plaquetas agrupadas. Sin estar limitado por la teoría, se cree que el agrupamiento de plaquetas en la dirección z (perpendicular a la superficie de la placa) evita la captura de imágenes en un plano focal. En las superficies tratadas, la agregación plaquetaria reducida produce menos aglomeraciones (menos plaquetas en la dirección z) y las imágenes enfocadas se pueden capturar en la superficie de la placa. Estas imágenes muestran que el tratamiento con los peptidoglicanos sintéticos reduce la adhesión de las células plaquetarias al colágeno.

Detección de marcadores de activación plaquetaria

[0117] Se utilizó el sobrenadante (suero de plaquetas) obtenido después de la granulación las plaquetas para determinar los factores de activación liberados. El factor plaquetario 4 (PF-4) y la p-tromboglobulina (Nap-2) son dos proteínas contenidas en los gránulos alfa de plaquetas que se liberan tras la activación de las plaquetas. Sandwich ELISA se utilizaron para detectar cada proteína. Los componentes para ambos ELISA de emparedado se adquirieron en (R&D Systems) y se siguieron los protocolos proporcionados. Las muestras de suero de plaquetas se diluyeron 1:10.000 - 1:40.000 en BSA al 1% en IX PBS, por lo que los valores cayeron dentro de un rango lineal. Los resultados mostrados en las Figuras 27 y 28 muestran que el tratamiento con peptidoglicanos sintéticos disminuye la activación de las plaquetas por el colágeno tipo I.

EJEMPLO 32

La inhibición de unión de plaquetas y la activación plaquetaria a colágeno Tipo III y Tipo I

[0118] El método de acuerdo con el Ejemplo 31 se utilizó con la siguiente modificación.

Preparación de la microplaca

[0119] Colágeno de tipo I (colágeno de cola de rata, BD Biosciences) y colágeno de tipo III (Millipore) se combinaron en hielo con NaOH, 1X PBS, y 10X PBS a las condiciones fisiológicas. La concentración total de colágeno fue de 1 mg/ml con 70% de colágeno tipo I y 30% de colágeno tipo III. Se pipetearon 30 ml de la solución de colágeno en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. La placa se incubó a 37°C en una incubadora humidificada durante una hora, permitiendo que se formara un gel compuesto de colágeno fibrilar en los pocillos. Los pocillos se enjuagaron 3X con 1X PBS.

[0120] El peptidoglicano se diluyó en 1X PBS en concentraciones de solución 25vpm y 50vpm se añadió a los pocillos recubiertos de colágeno. Los controles de GAG, péptido o PBS también se agregaron a los pocillos recubiertos con colágeno como controles. Las combinaciones de peptidoglicano o péptido estaban compuestas por 25 pm de cada molécula en 1X PBS. Los tratamientos se incubaron a 37°C con agitación a 200 rpm durante 30 min. Los pocillos se enjuagaron luego 3X con 1X PBS, incluido un enjuague de 10 minutos con 200 rpm agitando para eliminar la molécula de tratamiento no unida.

[0121] Los resultados de las mediciones de inhibición de la activación de plaquetas que se muestran en la Figura 39 demuestran que los peptidoglicanos sintéticos inhiben la activación de células de plaquetas por una mezcla de colágeno de tipo I y tipo III.

[0122] Los resultados mostrados en la Figura 40 demuestran que los peptidoglicanos inhiben la unión a mezclas de colágeno tipo I y de tipo III de células de plaquetas.

EJEMPLO 33

Síntesis de peptidoglicano

[0123] Los péptidos utilizados para sintetizar los peptidoglicanos descritos en este Ejemplo y los siguientes Ejemplos se sintetizaron por GenScript (Piscataway, Nueva Jersey). El peptidoglicano se sintetizó como se describe con modificaciones. El sulfato de dermatan (DS) se oxidó mediante oxidación con peryodato, en la que el grado de oxidación se controló mediante cantidades variables de meta-peryodato de sodio. Después de oxidarse a temperatura ambiente durante 2 horas protegidas de la luz, el DS oxidado se desaló en 1xPBS pH 7,2 por cromatografía de ^{exclusión de tamaño usando una columna empaquetada con Bio-gel P}-6 (BioRad). El reticulante heterobifuncional BMPH (Thermo Fischer Scientific) se añadió a DS oxidado en un exceso molar de 30 veces a DS, y se hizo reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente protegida de la luz. El producto intermedio DS-BMPH se purificó luego del exceso de BMPH por exclusión de tamaño como se describe con 1xPBS pH 7,2 como tampón de funcionamiento. El número de reticuladores de BMPH unidos a DS se calculó mediante el consumo de BMPH determinado a partir del área del pico de 215 nm del pico de exceso de BMPH. Se generó una curva estándar de BMPH para calcular el exceso de BMPH. El péptido libre SILY se disolvió en agua a una concentración de 2 mg/ml y se añadió en un exceso molar al número de BMPHs unidos y se hizo reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto final DS-SILYn se purificó por exclusión de tamaño utilizando una columna empaquetada con medio Sephadex G-25 (GE Lifesciences) con agua Millipore como tampón de funcionamiento. El producto final se congeló inmediatamente, se liofilizó y se almacenó a -20°C hasta su posterior prueba.

[0124] Una versión marcada con biotina del peptidoglicano se sintetizó por reacción de 2 moles de SILYbiotina por mol de DS-BMPH durante 1 hora, seguido de la adición de SILY no marcado a un exceso 1 molar por BMPH adjunto. Después de agregar SILY sin marcar, la reacción continuó durante 2 horas a temperatura ambiente antes de la purificación. El peptidoglicano marcado con biotina se designa como DS-SILYn-biotina donde n es el número total de péptidos SILY por molécula. Para DS- SILY4-biotina solo se hizo reaccionar SILY marcada con SILY, en lugar de biotina sin marcar.

EJEMPLO 34

Purificación y caracterización de DS-BMPH.

[0125] DS oxidado se acopló a BMPH como se describe y se purificó del exceso de BMPH por cromatografía de exclusión de tamaño. Como se muestra en la Figura 41, la cantidad de BMPH en exceso se calcula integrando el pico de BMPH en exceso y comparando con una curva estándar para BMPH. Como se muestra en la Figura 42, al variar la cantidad de meta-peryodato de sodio, el número de reticuladores BMPH por cadena DS aumenta linealmente.

EJEMPLO 35

Afinidad de unión del peptidoglicano al colágeno

[0126] El colágeno fibrilar (Chronolog, Havertown, PA) se recubrió sobre la superficie de una placa de unión de 96 pocillos (Costar) a una concentración de 50 pg/ml diluida en glucosa isotónica. Las placas se cubrieron y se incubaron durante la noche a 4°C. El colágeno no unido se eliminó enjuagando 3 veces con 1xPBS pH 7,4. Las placas se bloquearon con BSA al 1% durante 3 horas a temperatura ambiente. El peptidoglicano se disolvió a concentraciones variables en 1xPBS pH 7,4 que contenía BSA al 1% y se añadió inmediatamente a las superficies de colágeno, y se dejó incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las placas se enjuagaron 3 veces con 1xPBS pH 7,4 que contenía BSA al 1%. Luego se añadió solución de estreptavidina-HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN) a las placas y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La estreptavidina no unida se enjuagó 3 veces con 1xPBS pH 7,4 y se añadieron a cada pocillo 100 ml/pocillo de solución de color (peróxido de hidrógeno estabilizado y tetrametilbencidina estabilizada, R&D Systems, Minneapolis, MN) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. La reacción de evolución del color se detuvo con 50 pL de ácido sulfúrico 2N y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro Vis M5 UV (Molecular Devices). Las imperfecciones de las placas (540 nm) se restaron de los valores de absorbancia.

[0127] Las afinidades de unión de peptidoglicanos marcados con biotina, etiquetados utilizando protocolos conocidos en la técnica, DS-SILY4 y DS-SILY18 se calcularon mediante el ajuste de la saturación de las curvas de unión y calculando el punto de inflexión. Como se muestra en la Figura 43, DS-SILY4 y DS-SILY18 se unen al colágeno de fibrilla con una Kd de 118 nM y 24 nM, respectivamente. Al aumentar el número de péptidos por esqueleto de DS, también es evidente que hay más moléculas capaces de unirse a la superficie del colágeno, lo que se observa por el aumento de la absorbancia de DS-SILY18 que no contiene más marcadores de biotina que DS-SILY4. Por consiguiente, se espera que DS-SILY18 muestre una mejor inhibición de las plaquetas, ya que puede formar una cubierta más densa de la superficie del colágeno.

EJEMPLO 36

Inhibición de la unión y activación de las plaquetas

[0128] El colágeno fibrilar de tipo I de Chronolog se diluyó en glucosa isotónica a una concentración de 50 pg/ml. Se añadieron 50 ml de solución de colágeno a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de alta unión. La placa se incubó durante la noche a 4°C y luego se enjuagó 3X con 1X PBS. Para los ensayos de microplacas, el peptidoglicano se diluyó en 1X PBS a concentraciones entre 0,0001 pm y 100 pm y se añadió una solución de 50 pL a los pocillos recubiertos con colágeno. DS, péptido o 1X PBS también se agregaron a los pocillos recubiertos de colágeno como controles. Los tratamientos se incubaron a 37°C con agitación a 200 rpm durante 15 min. A continuación, los pocillos se enjuagaron del tratamiento sin unir eliminando la solución de tratamiento, agregando PBS y agitando los pocillos durante 24 horas. Durante las 24 horas, la solución de PBS se cambió 3 veces.

[0129] Se recogió sangre entera humana de voluntarios sanos por punción venosa. Los primeros 5 ml de sangre se desecharon y luego se recogieron aproximadamente 20 ml en vacutainers de vidrio citratado (BD Bioscience). La sangre se centrifugó en el tubo de vidrio durante 20 minutos a 200 g a 25°C. La capa superior de la sangre centrifugada, el plasma rico en plaquetas (PRP), se usó para experimentos de plaquetas.

[0130] Se añadió PRP (50 uL/pocillo) a la microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente sin agitación. Después de 1 hora de incubación, se retiraron 45 pl de PRP de cada pocillo y se agregaron a un tubo de microcentrífuga que contenía 5 ml de ETP (EDTA 107 mM, teofilina 12 mM y prostaglandina E12,8 mM) para inhibir la activación plaquetaria adicional. Estos tubos se hicieron girar a 4°C durante 30 minutos a 2000 g para sedimentar las plaquetas. El sobrenadante (suero plaquetario) se recolectó para estudios ELISA para evaluar la presencia de marcadores de activación plaquetaria PF-4 y NAP2. Sandwich ELISA se utilizaron para detectar cada proteína. Los componentes para ambos ELISA de tipo sándwich se adquirieron de R&D Systems y se siguieron los protocolos proporcionados. El suero de plaquetas se diluyó 10.000 veces en BSA al 1% en 1X PBS para que los valores estuvieran dentro de un rango lineal.

[0131] La activación plaquetaria se midió mediante la liberación de factor plaquetario 4 (PF4) y p-tromboglobulina (NAP2). La Figura 44 muestra el % de disminución en la activación de las plaquetas por diferentes tratamientos. En concentraciones tan altas como 50 pm, DS y SILY tuvieron poco o ningún efecto sobre la inhibición de la activación plaquetaria. A diferencia del DS individual o SILY, el DS-SILY fue capaz de inhibir la activación plaquetaria mediada por el colágeno. A medida que el número de péptidos SILY por molécula de DS aumentó de 2 a 10, también aumentó la inhibición de la activación de las plaquetas. Dado que se espera que la alta relación SILY/DS proporcione una mayor afinidad de unión a la superficie del colágeno debido a múltiples interacciones, se prepararon peptidoglicanos con las mayores relaciones SILY/DS.

[0132] El número de péptidos por molécula DS se aumentó adicionalmente a 18 para crear el peptidoglicano DS-SILY18, y se ensayó la concentración de molécula necesaria para inhibir la activación plaquetaria. La Figura 45 muestra el grado de inhibición de la activación de las plaquetas por DS-SILY18. Los datos juntos sugieren que aumentar el número de péptidos por cadena DS inhibe aún más la unión de las plaquetas al colágeno y la activación de las plaquetas. Dentro de los límites de solubilidad, el número de péptidos se puede aumentar para lograr la máxima inhibición de las plaquetas, así como para reducir la difusión a lo largo del tiempo, donde se mantiene un nivel más alto de peptoglicilos en la pared del vaso desnudo.

EJEMPLO 37

Difusión de peptidoglicano a partir de la superficie de colágeno

[0133] El peptidoglicano DS-SILYi8.biotina se disolvió en 10 pm en 1 x PBS pH 7,4 con 2% de BSA y se incubó en placas recubiertas con colágeno fibrilar preparados como se describe. La placa se incubó a 37°C en un agitador orbital y se enjuagó abundantemente con 1xPBS pH 7,4. En varios puntos temporales hasta 11 días, se detectó DS-SILY18-biotina en la superficie como se describe para los estudios de afinidad de unión. La curva de difusión de peptidoglicano de la superficie de colágeno se ajustó utilizando un decaimiento hiperbólico.

[0134] La difusión del peptidoglicano DS-SILY18 desde una superficie de colágeno se midió mediante la incubación a 37°C y enjuagar ampliamente con el fin de imitar el flujo de sangre in vivo. El peptidoglicano se incubó en superficies de colágeno fibrilar y se detectó mediante los mismos métodos para calcular las afinidades de unión. Como se muestra en la Figura 46, el peptidoglicano se difunde en cierto grado desde la superficie del colágeno; sin embargo, después de 1 semana de enjuague extensivo, el equivalente de aproximadamente 10 nM permaneció unido a la superficie. Se estima que el recrecimiento completo de las células endoteliales se produce dentro de una semana después de la lesión del balón, y por lo tanto este marco de tiempo es útil para prevenir la unión de las plaquetas hasta que las células endoteliales vuelven a crecer y proporcionen una cubierta permanente al colágeno subyacente.

EJEMPLO 38

Proliferación de células endoteliales

[0135] El recrecimiento endotelial es esencial para restaurar el vaso sano y proporcionar una barrera permanente que cubra el colágeno subyacente. Los stents liberadores de fármacos actualmente disponibles, por ejemplo, previenen el recrecimiento endotelial y, en consecuencia, han demostrado un nuevo conjunto de complicaciones, como la trombosis tardía del stent. El peptidoglicano se probó a concentraciones variables para determinar si inhibía el recrecimiento del endotelio. El peptidoglicano se unió físicamente al colágeno a través de las interacciones péptido-colágeno, susceptibles de ser eliminados por unión competitiva, y así fue reemplazado por células endoteliales que volvieron a crecer sobre la capa de colágeno.

[0136] Las células endoteliales (CE) de la arteria coronaria humana (Lonza, Walkersville, MD) se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 1,5x103 células/pocillo. Se dejó que las células se adhirieran a la superficie durante 24 horas y las CE adherentes se tiñeron usando un rastreador de células verde (Invitrogen, Carlsbad, CA). El número de células inicial se determinó midiendo la fluorescencia de cada pocillo con una excitación de 492 nm y una emisión de 517 nm.

[0137] DS-SILY18 se solubilizó en agua a una concentración de 175 pm, y se diluyeron en agua de 10 veces para las concentraciones de 175, 17,5 y 1,75 pM. La solución DS-SILY se diluyó 5 veces con medio celular para concentraciones finales de 35, 3,5 y 0,35 mM. El control consistió en diluir agua 5 veces con medios celulares. Se añadieron 100 pl de medio con DS-SILY a cada pocillo y se determinó el número de células 48 horas más tarde mediante la medición de la fluorescencia. Se calculó el porcentaje de cambio en el número de células en cada pozo. Como se muestra en la Figura 47, en la concentración más alta ensayada, hubo un aumento significativo en la proliferación celular, lo que sugiere que el peptidoglicano promueve el recrecimiento endotelial en lugar de inhibir el recrecimiento.

EJEMPLO 39

Migración de células endoteliales

[0138] Para imitar el entorno real donde se denude un área de células endoteliales desarrolladas en colágeno, se realizó una segunda prueba de migración de células endoteliales. El colágeno fibrilar (Chronolog, Havertown, PA) se recubrió en pocillos del kit de migración de células Oris de 96 pocillos (Platypus Technologies, Madison, WI). Se insertaron tapones en la placa para bloquear una porción circular interna de la célula. Las células endoteliales (CE) de la arteria coronaria humana (Lonza, Walkersville, MD) se sembraron a 5x103 células/pocillo y se cultivaron hasta la confluencia en la parte exterior del pocillo. Una vez confluentes en la porción externa del pozo, las células se tiñeron con verde de seguimiento celular (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se retiraron los tapones de los pocillos y se incubó DS-^SILY18 solubilizado en 1X PBS sobre la superficie de colágeno expuesta en la porción interna del pocillo durante 15 minutos a 37°C. El DS-SILY sin unir se enjuagó de la superficie y los medios celulares se devolvieron a los pozos. Se permitió a las CE migrar desde la parte exterior de los pozos a la parte interna durante 48 horas. Las mediciones de fluorescencia del centro de cada pozo se midieron utilizando una máscara provista con el kit de migración, de modo que solo se midió la porción circular interior tratada del pozo.

[0139] Como se muestra en la Figura 48, se observó la misma tendencia de aumento del número de células en concentraciones crecientes de peptidoglicano. Junto con las tendencias de proliferación celular, los datos muestran que el recrecimiento endotelial no es inhibido por el tratamiento con pepidoglicano, pero que el peptidoglicano promueve el recrecimiento.

EJEMPLO 40

Unión de plaquetas a colágeno bajo flujo

[0140] Para imitar las condiciones fisiológicas con sangre que fluye, la unión de plaquetas a las superficies de colágeno en condiciones de flujo fue evaluada. Los kits de flujo se obtuvieron de Ibidi (Munchen, Alemania). Cada canal se recubrió con colágeno fibrilar (Chronolog). El exceso de colágeno se eliminó del canal de flujo empujando IX PBS a través del canal con una jeringa. DS-SILY18 se incubó en el canal a una concentración de 50 pm durante 15 min a 37°C, y el peptidoglicano no unido se enjuagó empujando IX PBS a través del canal con una jeringa. El canal de control consistió en colágeno no tratado con peptidoglicano.

[0141] El plasma rico en plaquetas se impulsó a través de los canales a 2 ml/h durante 1 hora, que corresponde a una tensión de cizallamiento de 3,55 dinas/cm2 y una velocidad de cizallamiento de 355 s-1. Las plaquetas no unidas se enjuagaron del canal presionando a través de IX PBS. Las plaquetas adheridas se fijaron en el canal con 10% de formaldehído. Las plaquetas se permeabilizaron y los filamentos de actina se tiñeron con faloidina-Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Las imágenes representativas de plaquetas adherentes se muestran en la Figura 49, que demuestran que un número significativamente menor de plaquetas se unen a la superficie tratada con peptidoglicano en comparación con el colágeno no tratado.

EJEMPLO 41

Estudios in vivo del cerdo Ossabaw

[0142] Los estudios in vivo se realizaron en cerdos Ossabaw para determinar el método de administración óptimo y la concentración del peptidoglicano, así como para determinar la eficacia preliminar del tratamiento con peptidoglicano. Los cerdos Ossabaw adultos sanos se sometieron a procedimientos PCI siguiendo los protocolos aprobados en la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana. En estos estudios, se colocó un catéter con balón de 10 mm en varias arterias con diámetros de aproximadamente 3 a 4 mm de diámetro. El globo fue inflado a 1 a 1,3 veces el diámetro del vaso para desnudar efectivamente el vaso, y fue seguido inmediatamente por un globo de administración ClearwayRX dimensionado al diámetro del vaso.

[0143] Arterias denudadas se trataron mediante la inyección a través del balón de entrega entre 2 y 10 ml de o bien solución salina de control o varias concentraciones de peptidoglicano disueltas en 1 x PBS pH 7,4. La angiografía con contraste se registró antes y después de cada tratamiento para monitorear la posición del globo y los diámetros de los vasos. Después de 14 días, se sacrificaron los cerdos y se recogieron los vasos para la evaluación histológica utilizando H&E y tinción de Verhoff-Van Gieson. Los cerdos fueron heparinizados durante los procedimientos de PCI, pero no recibieron terapia antiplaquetaria en ningún momento.

[0144] Vasos denudados tratados con el control simulado respondieron a la lesión de globo con vasoespasmo significativo. El vasospasmo se observa comúnmente en los cerdos y es una consecuencia directa de la unión y activación de las plaquetas en el endotelio denudado. El vasoespasmo se usó como una medida de la inhibición efectiva de la unión de las plaquetas y la inhibición de la activación de las plaquetas con el tratamiento con peptidoglicano. La gravedad del vasoespasmo corresponde al grado de deposición plaquetaria en el endotelio denudado. El grado de vasoespasmo se cuantificó midiendo el diámetro del vaso antes y después de la lesión del balón y el tratamiento con el software ImageJ, y se calculó el porcentaje de oclusión.

[0145] Como se muestra en la Figura 51, el tratamiento de peptidoglicano significativamente vasoespasmo inhibido y plaquetas de unión al endotelio denudado. A concentraciones más altas de 2,5 mg/ml o más, el vasoespasmo se inhibe casi por completo, lo que corresponde a estudios in vitro en los que esta concentración muestra una inhibición máxima de la activación de las plaquetas.

EJEMPLO 42

Evaluación histológica de vasos

[0146] La evaluación histológica se realizó en vasos lesionados por balón 14 días después de la lesión para evaluar la hiperplasia intimal. No se observaron respuestas adversas, y los resultados preliminares a altas concentraciones de peptidoglicano sugirieron que el peptidoglicano inhibe la hiperplasia de la íntima como se muestra en la Figura 52.

Administración:

[0147] Para la entrega óptima del tratamiento de peptidoglicano, la aplicación sobre el endotelio denudado debe ocurrir inmediatamente después de la lesión con balón. El peptidoglicano puede evitar que las plaquetas se unan al endotelio denudado. Un sistema en el que se puede usar un solo balón capaz de expandir el vaso y de administrar el tratamiento con peptidoglicano, sin embargo, la inhibición plaquetaria efectiva se logra bajo los protocolos de administración actuales.

EJEMPLO 43

Inmunohistoquímica

[0148] Las arterias carótidas frescas se recogieron de cerdos y se colocaron en 1x PBS frío, y se analizaron dentro de las 5 horas posteriores a la recolección. Las arterias se abrieron y se desnudaron con un policía de goma y luego se cortaron en segmentos de aproximadamente 4 mm y se colocaron en una placa de 96 pocillos. El peptidoglicano DS-SILY18-biotina marcado con biotina se incubó a 10 pm disuelto en 1x PBS pH 7,4 durante 15 min a temperatura ambiente. Las arterias de control se incubaron con 1x PBS pH 7,4. Las arterias se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido, se cortaron en secciones de 7 pm y se secaron al aire durante 45 min, luego se almacenaron a -20°C hasta la tinción. El tejido se fijó en acetona enfriada con hielo, se secó al aire y se lavó con agua DI. Las secciones se incubaron con estreptavidina-HRP durante 30 minutos, se lavaron con agua DI, se incubaron con DAB durante 10

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un peptidoglicano de unión a colágeno de fórmula (PnL)xG,

en el que n es de 1 a 7,

x es de 1 a 10,

P es un péptido sintético de hasta 40 aminoácidos que comprenden una secuencia de RRANAALKAGELYKSILY, L es un enlazador, y

G es glicano,

para uso en un método para tratar:

i) una lesión vascular; o

ii) hiperplasia intimal.

2. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto se administra a un paciente antes, durante o después de la intervención vascular.

3. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la intervención vascular es la angioplastia, particularmente la angioplastia con balón.

4. El peptidoglicano de unión al colágeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el peptidoglicano de unión al colágeno se administra por vía intravascular.

5. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el enlazador tiene un peso molecular de 20 a 500 Daltons.

6. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el glicano es un glicosaminoglicano.

7. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el glicano es alginato, agarosa, dextrano, condroitina, dermatán, sulfato de dermatán, heparán, heparina, queratina o hialuronano.

8. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el glicano es sulfato de dermatán.

9. El peptidoglicano de unión a colágeno para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el glicano es heparina.