JP2018513879A - バイオコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、グリカンおよびグリカンに結合している１から約５０のペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、ペプチドは、コラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、ＩＣＡＭ結合単位、ＶＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を含むバイオコンジュゲート、バイオコンジュゲートを含有する組成物、ならびにその使用が提供される。本発明は、例えば、グリカンおよび少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、前記ペプチドは、コラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、ＩＣＡＭ結合単位、ＶＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介して前記グリカンに結合している、バイオコンジュゲートを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年４月１７日に出願された米国仮出願第６２／１４９，４２８号、２０１５年１０月１３日に出願された米国仮出願第６２／２４１，０５７号、および２０１５年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／２４４，６６５号の米国特許法第１１９条（ｅ）のもとの利益を主張し、それぞれの内容は、全体において本明細書中に参照によって組み込まれる。
本明細書では、グリカンおよびそれに結合した１から約５０のペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、ペプチドは、コラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、ＩＣＡＭ結合単位、ＶＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を含むバイオコンジュゲート、バイオコンジュゲートを含有する組成物、ならびにその使用が提供される。
組織では、細胞は、様々な巨大分子、例えば、バイオコンジュゲート、コラーゲン、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチンなどを含有する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）によって囲まれる。哺乳動物では、バイオコンジュゲートは細胞外マトリックスの主要な構成成分であり、そこでそれらは、他のバイオコンジュゲート、ヒアルロン酸および線維性マトリックスタンパク質（コラーゲンなど）と大きな複合体を形成する。哺乳動物が加齢するに従い、および一部の疾患状態では、体のある特定の場所（例えば、滑膜関節、硝子体液、椎間板、皮膚など）の細胞外マトリックスは劣化し、様々な形の関節炎、失明などの望ましくない症状を引き起こす可能性がある。さらに、血管損傷、角膜損傷および皮膚創傷などの一部の組織損傷は、細胞外マトリックスおよび／またはコラーゲンおよびヒアルロン酸を含むその構成成分の曝露をもたらす。
以前に、ペプチドをコンジュゲートするために使用されるアルデヒド官能基を提供するために、グリカン骨格の中のサッカライド環の１つまたは複数を切断する酸化化学によって、バイオコンジュゲートを合成した。
本開示は、グリカン、ならびに−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（すなわち、ヒドラジド−カルボニル）連結を介してグリカンに共有結合している、コラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、セレクチン、ＩＣＡＭおよび／またはＶＣＡＭ受容体結合単位を含む１から５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートを提供する。本明細書に記載するバイオコンジュゲートは、ペプチドがヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合しており、ここで、ヒドラジド−カルボニルのカルボニル基はグリカンに存在する環外のカルボニル基であるという点で、当該技術分野で公知のものと構造的に異なる。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートでは、ヒドラジド−カルボニルのカルボニル基は、グリカンの中のサッカライド環上のペンダント、例えば、限定されずに、Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸である。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートが示す有益な作用（結合親和性の増加など）は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有していないグリカンに少なくとも部分的によるものと考えられている。別の企図された有益な効果は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有しないバイオコンジュゲートの改善された安定性である。したがって、ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、酸化されていないグリカン、および／またはそのペプチドが、切断されたサッカライドから生じる官能基にコンジュゲートしていないグリカンであるグリカンを含む。ある特定の実施形態では、グリカンは、化学改変されたグリカン誘導体、例えば部分的Ｎ−脱硫酸化グリカン誘導体、部分的Ｏ−脱硫酸化グリカン誘導体、部分的Ｏ−カルボキシメチル化グリカン誘導体またはその任意の組合せである。
ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。他の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端カルボニル基とグリカンのヒドラジド基の間にある。
一実施形態では、本開示はグリカンおよび１から５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、ペプチドは、コラーゲン結合単位および／またはヒアルロン酸結合単位を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している、バイオコンジュゲートに関する。
一実施形態では、本開示は、グリカンおよびコラーゲン結合単位を含む１から５０ペプチド、およびヒアルロン酸結合単位を含む１から５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、ペプチドはヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している、バイオコンジュゲートに関する。
他の実施形態では、本開示はグリカンおよび約１から約５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、ペプチドは、セレクチン、ＩＣＡＭおよび／またはＶＣＡＭ結合単位を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している、バイオコンジュゲートに関する。
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを含む組成物、およびその使用方法も提供する。一態様では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを含む組成物が提供され、ここで、グリカンに結合しているペプチド数は異なる。例えば、組成物は、それに結合しているペプチドの数がグリカンあたりの平均として、例えば約５から約２０ペプチドと計算される、バイオコンジュゲートを含むことができる。
本明細書では、ａ）グリカンおよびヒアルロン酸結合単位を含む少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲート；ｂ）グリカンおよびセレクチン結合単位を含む少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲート；ｃ）グリカンおよびＩＣＡＭ結合単位を含む少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲート；ｄ）グリカンおよびＶＣＡＭ結合単位を含む少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲート；ｅ）グリカンおよびコラーゲン結合単位を含む少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲート、ならびにその組合せからなる群から選択される１つまたは複数のバイオコンジュゲートを含む組成物も提供される。
ある特定の実施形態、特に１つを超えるタイプの結合単位を有する異なるペプチドを含む実施形態（例えば、コラーゲン結合単位を有するペプチドおよびヒアルロン酸結合単位を有するペプチドを含むバイオコンジュゲート）では、１つのペプチドだけがヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合していてもよい。
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを含む医薬組成物、またはバイオコンジュゲートおよび１つまたは複数の希釈剤もしくは担体（生理食塩水など）を含有する組成物も提供される。
本明細書に記載されるペプチド官能基化ポリマーの生物学的機能は、グリカン骨格および／またはそれに付着したペプチドの変化によって調整することができる。例えば、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、血管傷害および／または炎症と関連するものなどの疾患を治療および／または予防するために使用することができる。
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物は、それを必要とする患者において冠状動脈疾患および／または末梢動脈疾患を治療および／または予防するために使用することができる。冠状動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の両方における動脈遮断の治療の一形態として、バイパスグラフトが使用される。およそ５００，０００件の冠状動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）術、および７０，０００件を超える末梢バイパスグラフト術が毎年米国で実行される。最も一般的には、しばしば伏在静脈から、自家血管グラフトを採取する。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、自家静脈グラフトによる外科的バイパスを受ける心血管疾患患者のための静脈グラフト保存溶液として使用することができる。
本明細書で、血管傷害または介入の前、その間および／またはその後に、患者において血管を治療する方法であって、本明細書に記載されるバイオコンジュゲート、またはバイオコンジュゲートを含む組成物の有効量を血管に適用することを含む方法も提供される。
本明細書では、それを必要とする患者において内腔（例えば、大腿膝窩動脈）の中の狭窄または閉塞を治療する方法であって、バルーン血管形成術の前、その間および／またはその後に、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物の有効量を含む溶液を内腔の内壁に適用することを含む方法も提供される。
関節炎を治療する方法も提供され、この方法では、治療することは関節炎に関連した１つまたは複数の症状を低下させることを含むことができる。疼痛、硬直、圧痛、炎症、腫脹、発赤、ほてりおよび可動性の低下を非限定的に含む、様々な症状が関節炎に関連することが当分野で公知である。様々な実施形態では、関節炎は変形性関節炎または関節リウマチである。
本明細書では、グリカンおよび１から５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートを作製する方法であって、任意選択で活性化剤の存在下でグリカンを、ペプチドの十分な量と接触させることを含み、ここで、ペプチドがヒドラジド基を含み、カップリング反応条件下でバイオコンジュゲートを提供し、ペプチドは、コラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、ＩＣＡＭ結合単位、ＶＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を含み、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にあるヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している、方法も提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、グリカンを活性化剤と接触させて、少なくとも１つの活性化カルボン酸部分を有する活性化グリカンを提供することを含む。他の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端カルボニル基とグリカンのヒドラジド基の間にある。
本開示のある特定の態様は、添付の図面によって考察することができる。以下のものが含まれる：
図１Ａ〜１Ｄは、（１Ａ）ペプチドのないビオチン標識コンドロイチン硫酸（対照）；（１Ｂ）酸化性サッカライド開環化学およびＢＭＰＨリンカーを介してＣＳに結合しているＧＡＨペプチドを有するバイオコンジュゲート；（１Ｃ）ヒドラジド−カルボニル連結を介してＣＳに結合しているＧＡＨペプチドを有するバイオコンジュゲート；および（１Ｄ）ヒドラジド−カルボニル連結を介してＣＳに結合しているＳＴＭペプチドを有するバイオコンジュゲートへのヒアルロン酸結合親和性を示す（実施例５を参照）。
図２は、ｅＤＳ−ＳＩＬＹ（本明細書に記載されるバイオコンジュゲート）対ｏｘＤＳ−ＳＩＬＹ（酸化グリカンを利用して合成されたバイオコンジュゲート）の安定性を経時的に表す（実施例１１を参照）。
それらは当然ながら異なることができるので、この開示は記載される特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲だけによって限定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載することだけのためであり、限定するものではないことも理解すべきである。
１．定義
特に説明されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この開示が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれることに留意すべきである。したがって、例えば、「ペプチド」への言及には、複数のペプチドが含まれる。
本明細書で使用される場合、以下の用語および略記号は以下の意味を有する。
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本明細書で使用される場合、用語「含んでいる」または「含む」は、組成物および方法は列挙された要素を含むが、他を排除しないことを意味するものとする。組成物および方法を規定するために使用されるとき、「から事実上なる」は、明記される目的のために組合せにいかなる本質的な重要性を有する他の要素も排除することを意味するものとする。したがって、本明細書に規定される要素から事実上なる組成物は、請求される基本的および新規特徴に実質的に影響しない他の材料またはステップを排除しない。「からなる」は、他の成分の微量元素および実質的な方法ステップより多くを排除することをいう。これらの移行用語の各々によって規定される実施形態は、この開示の範囲内である。
数値指定、例えば、範囲を含む温度、時間、量および濃度の前に使用されるとき、用語「約」は、（＋）または（−）１０％、５％または１％変動することができる近似値を表す。
本明細書で使用される場合、用語「バイオコンジュゲート」、「ペプチドグリカン」および「プロテオグリカン」および「合成プロテオグリカン」は互換的に使用され、グリカンおよびそれに共有結合している１つまたは複数のペプチドを含む合成コンジュゲートを指す。グリカン部分は合成的に作製することができるか、または動物性供与源に由来してもよい。ペプチドは、ヒドラジド−カルボニル連結（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）を介してグリカンに共有結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。他の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端カルボニル基とグリカンのヒドラジド基の間にある。一部の実施形態では、用語バイオコンジュゲートはペプチドグリカンを含む。
本明細書で使用される場合、用語「グリカン」は、多数のグリコシド連結した単糖を有する化合物を指す。ある特定の実施形態では、グリカンは、ウロン酸と交互に連結した２−アミノ糖を含み、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、ケラチンおよびデルマタンなどのポリマーを含む、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。したがって、本明細書に記載される実施形態で使用することができるグリカンの非限定例には、アルギネート、アガロース、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸（ＨＡ）が含まれ、その誘導体も含まれる。別の実施形態では、グリカンの分子量はバイオコンジュゲートの作用を調整するために変化させられる（例えば、Radek, K. A.ら、Wound Repair Regen.、２００９年、１７巻：１１８〜１２６頁；およびTaylor, K. R.ら、J. Biol. Chem.、２００５年、２８０巻：５３００〜５３０６頁を参照）。一実施形態では、グリカンは酸化およびアルカリ脱離によって分解されて（例えば、Fransson, L. A.ら、Eur. J. Biochem.、１９８０年、１０６巻：５９〜６９頁を参照）、より低い分子量（例えば、約１０ｋＤａから約５０ｋＤａ）を有する分解されたグリカンを与える。一部の実施形態では、グリカンは未改変である。ある特定の実施形態では、グリカンは、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有せず、含有していない。ある特定の実施形態では、グリカンは誘導体化される。
本明細書で使用される場合、用語「誘導体化されたグリカン」は、グリカンの誘導体を含むものとする。例えば、誘導体化されたグリカンは、例えば、限定されずに、部分的Ｎ−脱硫酸化誘導体、部分的Ｏ−脱硫酸化誘導体および／または部分的Ｏ−カルボキシメチル化誘導体などの、１つまたは複数の化学的誘導体化を含むことができる。例えば、本明細書で使用される場合、用語「ヘパリン」は、ヘパリンおよびその誘導体、例えば、限定されずに、部分的Ｎ−および／または部分的Ｏ−脱硫酸化ヘパリン誘導体、部分的Ｏ−カルボキシメチル化ヘパリン誘導体、またはその組合せを含むものである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは酸化されていないヘパリン（すなわち、酸化的に切断されたサッカライド環を含有しない）であり、アルデヒド官能基を含有しない。
本明細書で使用される場合、用語「結合している」および「共有結合している」は互換的に使用することができ、２つの原子による１対または複数対の電子の共有を指すことができる。
ある特定の実施形態では、ペプチド配列は、スペーサーを介してグリカンに結合している。本明細書で使用される場合、用語「スペーサー」は、結合単位またはペプチドをヒドラジド−カルボニル結合に連結する、バイオコンジュゲートの任意選択の部分を指すものである。本明細書に記載される実施形態のいずれでも、ペプチドのいずれか１つまたは複数は、１から約５個のアミノ酸を含むスペーサー配列を有することができる。スペーサー配列がペプチドの意図される結合を有意に妨害しない限り、天然または非天然である任意のアミノ酸をスペーサー配列で使用することができると考えられる。例示的なスペーサーには、１から５個のグリシン単位（例えば、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧまたはＧＧＧＧＧ）を含み、任意選択でシステイン（例えば、ＧＣ、ＧＣＧ、ＧＳＧＣまたはＧＧＣ）および／またはセリン（例えば、ＧＳＧ、ＳＧＧまたはＧＳＧＳＧ）を含む、または１から５個のアルギニン単位（例えば、Ｒ、ＲＲ、ＲＲＲなど）を含む短い配列が限定されずに含まれる。スペーサーは、追加のアミノ酸スペーサーの有無にかかわらず、非アミノ酸部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、６−アミノヘキサン酸、コハク酸またはその組合せを含むこともできる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド配列はＧＳＧ−ＮＨＮＨ２部分をさらに含む。一般的に、ＧＳＧ−ＮＨＮＨ２部分は、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかに結合している。
一実施形態では、本開示のバイオコンジュゲートは、コラーゲンに直接または間接的に結合している。本明細書で使用する場合、用語「結合」または「結合する」は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、等温滴定熱量測定、ファージディスプレイ、親和性クロマトグラフィー、流体力学または免疫組織化学を使用して検出することができる分子の間の相互作用を含むものである。本用語は、分子の間の「結合」相互作用を含むものでもある。結合は、「直接的」または「間接的」であってもよい。「直接的」結合は、分子の間の直接の物理的接触を含む。分子の間の「間接的」結合は、１つまたは複数の分子との同時の直接的物理的接触を有する分子を含む。この結合は、相互作用する分子を含む「複合体」の形成をもたらすことができる。「複合体」は、共有結合もしくは非共有結合、相互作用または力によって合体される２つまたはそれ超の分子の結合を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」および「ペプチド配列」は、ペプチド（またはアミド）結合によって連結されるアミノ酸の直鎖または分枝鎖を指すものである。一実施形態では、ペプチドは、約３から約１２０アミノ酸、または約３から約１１０アミノ酸、または約３から約１００アミノ酸、または約３から約９０アミノ酸、または約３から約８０アミノ酸、または約３から約７０アミノ酸、または約３から約６０アミノ酸、または約３から約５０アミノ酸、または約３から約４０アミノ酸、または約５から約１２０アミノ酸、または約５から約１００アミノ酸、または約５から約９０アミノ酸、または約５から約８０アミノ酸、または約５から約７０アミノ酸、または約５から約６０アミノ酸、または約５から約５０アミノ酸、または約５から約４０アミノ酸、または約５から約３０アミノ酸、または約５から約２０アミノ酸、または約５から約１０アミノ酸を含む。
本明細書に記載される様々な実施形態では、ペプチド（または、結合単位）は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換の組入れによって改変することができる。当業者にとって周知のように、置き換えアミノ酸の側鎖は類似の結合を形成することができるはずであり、置き換えられたアミノ酸の側鎖と接触するので、保存的置換によってペプチドの任意の重要でないアミノ酸を変更することは、そのペプチドの活性を有意に変更しないはずである。それらがペプチドの結合活性（すなわち、セレクチン、ＩＣＡＭおよび／またはＶＣＡＭ結合親和性）に実質的に影響しない限り、非保存的置換も可能である。
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」は、２つのペプチドの間または２つの核酸分子の間のアミノ酸残基またはヌクレオチドの同一性のレベルを指す。比較される配列での位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されるときには、分子はその位置で同一である。ペプチド（またはポリペプチドもしくはペプチド領域）は、別の配列とある特定の百分率（例えば、少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有するとは、整列させたとき、２つの配列を比較したときにその百分率の塩基（または、アミノ酸）が同じであることを意味する。本出願で開示される任意の配列（「参照配列」）に関し、参照配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列も本開示の範囲内にあることに注意する。同様に、本開示は、参照配列と比較してアミノ酸残基またはヌクレオチドの１、２、３、４または５つの置換、欠失または付加を有する配列も含む。ある特定の実施形態では、本明細書に明示される配列のいずれか１つまたは複数では、配列は各々その１つ、２つまたは３つのアミノ付加、欠失および／または置換を有することによって改変することができる。
本明細書で使用される場合、用語「細胞外マトリックス」は、周辺細胞に構造的および生化学的支持を提供する組織の細胞外部分を指す。
本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、その任意の固体の形態を含む、少なくとも１つの薬学的活性成分を含有する治療目的のための意図する患者への投与に適する調製物を指す。組成物は、適する担体などの、化合物の改善された製剤を提供するための少なくとも１つの薬学的に許容される構成成分を含むことができる。ある特定の実施形態では、組成物は、フィルム、ゲル剤、パッチ剤または液体溶液として製剤化される。本明細書で使用される場合、用語「局所的に」は、局所作用のために、治療される組織および／または器官（内部または一部の場合には外部）の表面に組成物を非全身的に投与することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、使用される量および／または治療される疾患もしくは状態およびそれぞれの投与経路を考慮して、それなりに慎重な医師に患者への投与を回避させる特性を指示される材料が有しないことを表す。一般的な薬学的に許容される材料は、事実上無菌である。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、１つの器官または体の部分から、別の器官または体の部分への、任意の補助剤または組成物またはその構成成分の運送または輸送に関与するか、または静脈の内面に薬剤を送達するための、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材を指す。
本明細書で使用される場合、用語「製剤化された」または「製剤」は、１つまたは複数の薬学的活性成分を含む異なる化学物質が組み合わされて剤形を生成する過程を指す。ある特定の実施形態では、２つまたはそれ超の薬学的活性成分を単一の剤形もしくは組み合わせた投薬単位に同時製剤化するか、または別々に製剤化し、その後組み合わせた投薬単位に合わせることができる。持続放出製剤は長期間にわたって体内に治療剤を徐々に放出するように設計されている製剤であるが、即時放出製剤は、より短い期間、体内に治療剤を速やかに放出するように設計されている製剤である。
本明細書で使用される場合、用語「送達」は、その所望の治療効果を安全に達成するために必要に応じて体内の医薬組成物を輸送するための経路、アプローチ、製剤、テクノロジーおよび系を指す。送達の経路は、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経皮、皮内および表皮内経路を限定されずに含む、任意の適する経路であってよい。
本明細書で使用される場合、用語「溶液」は、溶液、懸濁液、乳剤、滴剤、軟膏、液体洗浄液、噴霧剤およびリポソームを指し、それらは当技術分野で周知である。一部の実施形態では、液体溶液は、少量の酸または塩基が追加されるときにｐＨの変化に抵抗する水性ｐＨ緩衝剤を含有する。ある特定の実施形態では、液体溶液は、潤滑増強剤を含有する。
本明細書で使用される場合、用語「ポリマー」、「ポリマーマトリックス」または「ポリマー剤」は、生体適合性のポリマー材料を指す。本明細書に記載されるポリマー材料は、例えば、糖（マンニトールなど）、ペプチド、タンパク質、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、イオン性および非イオン性の水溶性ポリマー；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリビニルアルコール；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマーまたは天然および合成の他のポリマー剤を含むことができる。
ある特定の実施形態では、ポリマーマトリックスは、例えばコラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリジオキサノンおよびカプロラクトンなどのように被吸収性である。本明細書で使用される場合、用語「被吸収性」は、体に吸収される材料の能力を指す。他の実施形態では、ポリマーは、例えばポリプロピレン、ポリエステルまたはナイロンなどのように、被吸収性でない。
本明細書で使用される場合、用語「ｐＨ緩衝剤」は、少量の酸または塩基がそれに追加されるときのｐＨの変化に抵抗する水性緩衝溶液を指す。ｐＨ緩衝溶液は、弱酸およびその共役塩基の混合物、またはその逆も一般的に含む。例えば、ｐＨ緩衝溶液は、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム十二水和物、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸水素二カリウムなどのリン酸塩；ホウ酸およびホウ酸塩、例えば、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム；クエン酸およびクエン酸塩、例えば、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸二ナトリウム；酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウム；炭酸塩、例えば、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどを含むことができる。ｐＨ調整剤は、例えば、塩酸、乳酸、クエン酸、リン酸および酢酸などの酸、ならびに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ塩基を含むことができる。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（すなわち、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび、一部の製剤では、塩化カリウムおよびリン酸カリウムを含有する）である。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」は、血管傷害または介入の前、その間および／またはその後に、疾患または障害の１つまたは複数の臨床症状を予防、治癒、好転、軽減、緩和、最小化、阻害、抑制および／または停止することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「並行して」は、同時（すなわち、併用して）の投与を指す。一実施形態では、投与は、その任意の固体の形態を含む２つまたはそれ超の薬学的活性成分が一度に一緒に送達されるように同時投与である。
本明細書で使用される場合、用語「逐次的に」は、別々の（すなわち、異なる時点での）投与を指す。一実施形態では、投与は、その任意の固体の形態を含む２つまたはそれ超の薬学的活性成分が異なる時点で別々に送達されるようにずれている。
コラーゲン結合ペプチド
「コラーゲン結合ペプチド」は、１つまたは複数のコラーゲン結合単位（または、配列）を有する１から約１２０個のアミノ酸を含むペプチドである。本明細書で使用される場合、用語「コラーゲン結合単位」は、コラーゲンに結合するペプチドの中のアミノ酸配列を指すものである。「コラーゲン結合」は、化合物がコラーゲンと好都合に結合または相互作用するように、疎水性、イオン性（荷電）および／またはファンデルワールス相互作用を含むことができる、コラーゲンとの相互作用を表す。この結合（または、相互作用）は、コラーゲンにペプチドが結合するその官能基を含有する任意の種とペプチドが相互作用するように、共有結合および一般的な官能基との非特異的相互作用から区別されるものである。当技術分野で公知の任意の方法を使用して、コラーゲンへの結合についてペプチドを試験し、評価することができる。例えば、Li, Y.ら、Current Opinion in Chemical Biology、２０１３年、１７巻：９６８〜９７５頁、Helmes, B.A.ら、J. Am. Chem. Soc.、２００９年、１３１巻、１１６８３〜１１６８５頁、およびPetsalaki, E.ら、PLoS Comput Biol、２００９年、５巻（３号）：ｅ１０００３３５頁を参照。一実施形態では、ペプチドまたはペプチドのコラーゲン結合単位は、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でコラーゲンに結合する。
ペプチドは、コラーゲン原線維形成に通常関与するかまたは通常関与しないタンパク質の一部と、アミノ酸相同性を有することができる。一部の実施形態では、これらのペプチドは、小さいロイシンに富んだバイオコンジュゲートのアミノ酸配列、血小板受容体配列またはコラーゲン原線維形成を調節するタンパク質と相同性または配列同一性を有する。様々な実施形態では、ペプチドは、
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 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、コラーゲンに結合することが可能である配列から選択されるアミノ酸を含む。
ある特定の実施形態では、各々参照により本明細書に組み込まれる、Chiang, T.M.ら、J. Biol. Chem.、２００２年、２７７巻：３４８９６〜３４９０１頁、Huizinga, E.G.ら、Structure、１９９７年、５巻：１１４７〜１１５６頁、Romijn, R.A.ら、J. Biol. Chem.、２００３年、２７８巻：１５０３５〜１５０３９頁およびChiangら、Cardio. & Haemato. Disorders-Drug Targets、２００７年、７巻：７１〜７５頁に記載のように、ペプチドは、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）または血小板コラーゲン受容体のコラーゲン結合ドメインと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。非限定例は、ｖＷＦに由来するＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号１８）である。
コラーゲン結合親和性（または、コラーゲン結合ドメイン／単位）についてペプチド配列をスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野でルーチンである。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法で使用することができる、コラーゲン結合親和性（または、コラーゲン結合単位）を有することが示されている他のペプチド配列には、限定されずに、
Figure 2018513879
 などであって、式中、Ｂｉｐはビフェニルアラニンであり、βＡはベータアラニンである（Abd-Elgaliel, W.R.ら、Biopolymers、２０１３年、１００巻（２号）、１６７〜１７３頁を参照）、
Figure 2018513879
 などであって、式中、Ｏは４−ヒドロキシプロリンである（Raynal, N.ら、J. Biol. Chem.、２００６年、２８１巻（７号）、３８２１〜３８３１頁を参照）、ＨＶＷＭＱＡＰＧＧＧＫ（配列番号２８）（Helms, B.A.ら、J. Am. Chem. Soc.２００９年、１３１巻、１１６８３〜１１６８５頁を参照）、ＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号１８）（Takagi, J.ら、Biochemistry、１９９２年、３１巻、８５３０〜８５３４頁を参照）、ＷＹＲＧＲＬ（配列番号２９）など（Rothenfluh D.A.ら、Nat Mater.２００８年、７巻（３号）、２４８〜５４頁を参照）、
Figure 2018513879
 など（米国特許出願公開第２００７／０２９３６５６号を参照）、ＳＴＷＴＷＮＧＳＡＷＴＷＮＥＧＧＫ（配列番号３３）、ＳＴＷＴＷＮＧＴＮＷＴＲＮＤＧＧＫ（配列番号３４）など（ＷＯ／２０１４／０５９５３０を参照）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号３５）、環状ＣＶＷＬＷＥＮＣ（配列番号３６）、環状ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号３５）、（Depraetere H.ら、Blood.１９９８年、９２巻、４２０７〜４２１１頁およびDuncan R.、Nat Rev Drug Discov、２００３年、２巻（５号）、３４７〜３６０頁を参照）、ＣＭＴＳＰＷＲＣ（配列番号３７）など（Vanhoorelbeke, K.ら、J. Biol. Chem.、２００３年、２７８巻、３７８１５〜３７８２１頁を参照）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号３８）（Muzzard, J.ら、PLoS one.４（ｅ５５８５）Ｉ〜１０を参照）、ＫＬＷＬＬＰＫ（配列番号３９）（Chan, J. M.ら、Proc Natl Acad Sci U.S.A.、２０１０年、１０７巻、２２１３〜２２１８頁を参照）およびＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ（配列番号８）など（米国特許出願公開第２０１３／０２４３７００号を参照）、Ｈ−Ｖ−Ｆ／Ｗ−Ｑ／Ｍ−Ｑ−Ｐ／Ａ−Ｐ／Ｋ（Helms, B.A.ら、J. Am. Chem. Soc.、２００９年、１３１巻（３３号）、１１６８３〜１１６８５頁）が含まれ、各々は参照により全体を本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法で使用することができる、コラーゲン結合親和性（または、コラーゲン結合単位）を有することが示されている追加のペプチド配列には、限定されずに、
Figure 2018513879
 が含まれる（Fredrico, S.、Angew. Chem. Int. Ed.２０１５年、３７巻、１０９８０〜１０９８４頁を参照）。
ある特定の実施形態では、ペプチドは、
Figure 2018513879
 からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
コラーゲン結合ペプチドの場合も同様に、コラーゲンのために選択されるファージディスプレイライブラリーに由来するペプチドを生成することができる。ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ、ＩＴＣ、親和性クロマトグラフィーまたは当該技術分野で公知の他の技術などの技術のいずれかによって、ペプチドを合成し、コラーゲンに対する結合について評価付けることができる。例は、固定化されたコラーゲンを含有するマイクロプレートでインキュベートされるビオチン改変ペプチド配列（例えば、ＳＩＬＹビオチン）であろう。コラーゲンに結合するペプチドの能力を判定するために、ストレプトアビジン−発色団を使用して用量応答結合曲線を生成することができる。
一実施形態では、ペプチドは、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶ型のいずれか１つまたは複数に結合する１つまたは複数のコラーゲン結合単位を含む。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＩ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＩＩ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＶ型コラーゲンに結合する。
ヒアルロン酸結合ペプチド
「ヒアルロン酸結合ペプチド」は、１つまたは複数のコラーゲン結合単位（または、配列）を有する１から約１２０アミノ酸を含むペプチドである。本明細書で使用される場合、「ヒアルロン酸結合単位」は、ヒアルロン酸に結合するペプチドの中のアミノ酸配列を指すものである。「ヒアルロン酸結合」は、化合物がヒアルロン酸と好都合に結合または相互作用するように、疎水性、イオン性（荷電）および／またはファンデルワールス相互作用を含むことができる、ヒアルロン酸との相互作用を表す。この結合（または、相互作用）は、ヒアルロン酸にペプチドが結合するその官能基を含有する任意の種とヒアルロン酸結合ペプチドが相互作用するように、共有結合および一般的な官能基との非特異的相互作用から区別されるものである。例えば、Becerra, S.P.ら、J. Biol. Chem.、２００８年、２８３巻：３３３１０〜３３３２０頁を参照。一実施形態では、ペプチドまたはヒアルロン酸結合単位は、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒアルロン酸に結合する。
ある特定の実施形態では、合成バイオコンジュゲートのヒアルロン酸結合単位は、ヒアルロナン媒介運動性受容体（ＲＨＡＭＭ）（例示的な配列には、ＮＰ＿００１１３６０２８、ＮＰ＿００１１３６０２９、ＮＰ＿０３６６１６およびＮＰ＿０３６６１７が限定されずに含まれる）に由来するアミノ酸配列を含むことができる。
本明細書に記載される様々な実施形態では、合成バイオコンジュゲートのヒアルロン酸結合ペプチド構成成分は、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に結合することが可能である配列から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートのペプチド構成成分として含めることができる追加のペプチドには、Ａｒｇ−Ａｒｇ（Ｒ−Ｒ）モチーフを有するペプチド、例えば、
Figure 2018513879
 （例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Amemiyaら、Biochem. Biophys. Acta、２００５年、１７２４巻、９４〜９９頁を参照）；またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に結合することが可能である配列から選択される１つまたは複数のペプチドが含まれる。別の実施形態では、ペプチドは、
Figure 2018513879
 （例えば、Yang, B.ら、EMBO Journal、１９９４年、１３巻、２８６〜２９６頁およびGoetinck, P.F.ら、J. Cell. Biol、１９８７年、１０５巻、２４０３〜２４０８頁を参照、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）；またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に結合することが可能である配列から選択される。
ペプチドは、ヒアルロン酸への結合の正の選択を利用して、ファージディスプレイによって選択することもできる。ヒアルロン酸結合ペプチドは、ヒアルロン酸とのその相互作用によって判定することができ、分子相互作用を評価するために使用される技術（表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、等温滴定熱量測定、親和性クロマトグラフィー、流体力学および／または免疫組織化学など）のいずれかによって測定することができる。「ヒアルロン酸結合」と考えられるペプチドは、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸含有組織と相互作用することができ、そのため、その相互作用は公知の化学的反応基に帰されない。相互作用は、ペプチドのアミノ酸残基から生じる疎水性および電荷相互作用によることができる。相互作用は、マイクロプレートにヒアルロン酸を固定化し、ヒアルロン酸結合ペプチドとインキュベートし、その後、発色団を使ったビオチン−アビジンなどの検出技術によって測定することができる。相互作用は、ヒアルロン酸結合ペプチドと、またはヒアルロン酸結合ペプチドを含有する合成バイオコンジュゲートとインキュベートされた、ヒアルロン酸を含有する流体、ゲルまたは組織に対する機械的影響によって測定することもできる。
ペプチドを同定するために、ファージディスプレイから選択されるペプチド、またはタンパク質中のヒアルロン酸結合モチーフから同定されるものを合成し、ヒアルロン酸とのその相互作用について評価することができる。例えば、Ｂ−Ｘ７−Ｂ配列は、Ｎ末端のビオチン改変で合成することができ、ヒアルロン酸でコーティングされたマイクロプレートでインキュベートすることができる。ヒアルロン酸に結合するペプチドの能力を判定するために、用量応答結合曲線を生成することができる。一実施形態では、ペプチドは、約３から約１２０個のアミノ酸、または約３から約１１０個のアミノ酸、または約３から約１００個のアミノ酸、または約３から約９０個のアミノ酸、または約３から約８０個のアミノ酸、または約３から約７０個のアミノ酸、または約３から約６０個のアミノ酸、または約３から約５０個のアミノ酸、または約３から約４０個のアミノ酸、または約５から約１２０個のアミノ酸、または約５から約１００個のアミノ酸、または約５から約９０個のアミノ酸、または約５から約８０個のアミノ酸、または約５から約７０個のアミノ酸、または約５から約６０個のアミノ酸、または約５から約５０個のアミノ酸、または約５から約４０個のアミノ酸、または約５から約３０個のアミノ酸、または約５から約２０個のアミノ酸、または約５から約１０個のアミノ酸を含む。
ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよびセレクチン結合ペプチド
「ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン結合ペプチド」は、１つまたは複数のコラーゲン結合単位（または、配列）を有する１から約１２０アミノ酸を含むペプチドである。本明細書で使用される場合、用語「ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン結合単位」は、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン受容体の１つまたは複数に結合するペプチドの中のアミノ酸配列を指すものである。結合は、化合物がＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン受容体と好都合に結合または相互作用するように、疎水性、イオン性（荷電）および／またはファンデルワールス相互作用を含むことができる、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン受容体との相互作用を表す。この結合（または、相互作用）は、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン結合ペプチドまたは単位が、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン受容体にペプチドが結合するその官能基を含有する任意の種と相互作用するように、共有結合および一般的な官能基との非特異的相互作用から区別されるものである。一実施形態では、ペプチドまたは結合単位は、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン受容体に結合する。
有用なペプチドの例には、セレクチンに結合することができる以下のペプチド配列（または、単位）が含まれる：
Figure 2018513879
 およびその組合せ。セレクチンは、Ｓ−、Ｐ−またはＥ−セレクチンであってよい。Ｅ−セレクチン結合親和性（または、Ｅ−セレクチン結合単位）についてペプチド配列をスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野でルーチンである。（例えば、Martens, C. L.ら、J. Biol. Chem.１９９５年、２７０巻（３６号）、２１１２９〜２１１３６頁；およびKoivunen, E.ら、J. Nucl. Med.１９９９年、４０巻、８８３〜８８８頁を参照）。
本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法で使用することができる、Ｅ−セレクチン結合親和性（または、Ｅ−セレクチン結合単位）を有することが示されている他のペプチド配列には、限定されずに、
Figure 2018513879
 （例えば、Martens, C. L.らJ. Biol. Chem.１９９５年、２７０巻（３６号）、２１１２９〜２１１３６頁を参照）、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号１３７）（例えば、Koivunen, E.らJ. Nucl. Med.１９９９年、４０巻、８８３〜８８８頁を参照）、
Figure 2018513879
 （例えば、Simanek, E. E. Chem. Rev.１９９８年、９８巻、８３３〜８６２頁を参照）、またはその組合せが含まれ、各々は参照により全体を本明細書に組み込まれる。
ＩＣＡＭ結合親和性（または、ＩＣＡＭ結合単位）についてペプチド配列をスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野でルーチンである。（例えば、Martens, C. L.らJ. Biol. Chem.１９９５年、２７０巻（３６号）、２１１２９〜２１１３６頁；およびKoivunen, E.らJ. Nucl. Med.１９９９年、４０巻、８８３〜８８８頁を参照）。ＩＣＡＭに結合することができる有用なペプチド配列の例には、以下のものが含まれる：
Figure 2018513879
 およびその組合せ。
本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法で使用することができる、ＩＣＡＭ結合親和性（または、ＩＣＡＭ結合単位）を有することが示されている他のペプチド配列には、限定されずに、ＥＷＣＥＹＬＧＧＹＬＲＹＣＡ（配列番号１５８）（例えば、Welply, J. K.らProteins: Structure, Function, and Bioinformatics １９９６年、２６巻（３号）：２６２〜２７０頁を参照）、ＦＥＧＦＳＦＬＡＦＥＤＦＶＳＳＩ（配列番号１５９）（例えば、米国特許出願公開番号ＷＯ２０１４０５９３８４を参照）、
Figure 2018513879
 （例えば、米国特許第８，９２６，９４６号を参照）、
Figure 2018513879
 （例えば、Koivunen, E.らJ. Nucl. Med.１９９９年、４０巻、８８３〜８８８頁を参照）、ＧＲＧＥＦＲＧＲＤＮＳＶＳＶＶ（配列番号１７１）（例えば、ＣＮ公開番号ＣＮ１３９２１５８を参照）、
Figure 2018513879
 （例えば、Tibbetts, S. A.らPeptides ２１〜２０００巻１１６１〜１１６７頁を参照）、およびその組合せが含まれ、各々は参照により全体を本明細書に組み込まれる。
ＶＣＡＭ結合親和性（または、ＶＣＡＭ結合単位）についてペプチド配列をスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野でルーチンである（例えば、Martens, C. L.らJ. Biol. Chem.１９９５年、２７０巻（３６号）、２１１２９〜２１１３６頁；およびKoivunen, E.らJ. Nucl. Med.１９９９年、４０巻、８８３〜８８８頁を参照）。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法で使用することができる、ＶＣＡＭ結合親和性（または、ＶＣＡＭ結合単位）を有することが示されている他のペプチド配列には、限定されずに、
Figure 2018513879
 （例えば、欧州特許出願公開番号ＥＰ１８０２３５２を参照）、およびその組合せが含まれ、それは参照により全体を本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、任意の１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４または５アミノ酸）がそこで付加、欠失または置換されるように、本明細書に記載される任意の配列を改変することができる。一部の実施形態では、配列は、任意の１つまたは複数のアミノ酸がアラニンで置き換えられるように改変される。一部の実施形態では、配列は、任意の１つまたは複数のｌ−アミノ酸が対応するｄ−アミノ酸スキャンで置き換えられるように改変される。一部の実施形態では、配列は、任意の１つまたは複数のバリンがロイシンで置き換えられ、任意の１または複数のグルタミン酸がグルタミンで置き換えられ、任意の１つまたは複数のアスパラギン酸がアスパラギンで置き換えられ、および／または任意の１つまたは複数のアルギニンがグルタミンで置き換えられるように改変される。
本明細書に記載される実施形態のいずれでも、コラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、ＩＣＡＭ結合単位、ＶＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を有するペプチドは、前の段落に記載される任意のアミノ酸配列、または、これらのアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される合成バイオコンジュゲートのペプチド構成成分は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換の組入れによって改変することができる。当業者にとって周知のように、置き換えアミノ酸の側鎖は類似の結合を形成することができるはずであり、置き換えられたアミノ酸の側鎖と接触するので、保存的置換によってペプチドの任意の重要でないアミノ酸を変更することは、そのペプチドの活性を有意に変更しないはずである。
当技術分野で周知であるように、アミノ酸の「保存的置換」またはペプチドの「保存的置換変異体」は、以下を維持するアミノ酸置換を指す：１）ペプチドの二次構造；２）アミノ酸の電荷または疎水性；および３）側鎖のかさ高性またはこれらの特徴のいずれか１つもしくは複数。例示すると、周知の用語「親水性残基」は、セリンまたはトレオニンに関する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンなどを指す。「正電荷の残基」は、リシン、アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンに関する。「負電荷の残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を指す。「かさ高い側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンなどを指す。例示的な保存的アミノ酸置換のリストを、表１に示す。
Figure 2018513879
一部の実施形態では、ペプチド配列は、１つまたは複数のグルタミン酸残基をグルタミンで、および／または１つまたは複数のアスパラギン酸残基をアスパラギンで置き換えるように改変される。
２．バイオコンジュゲート
本明細書で、グリカン、ならびに−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（すなわち、ヒドラジド−カルボニル）連結を介してグリカンに共有結合している、コラーゲン結合単位および／またはヒアルロン酸結合単位、セレクチン、ＩＣＡＭおよび／またはＶＣＡＭ受容体結合単位を含む１から５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートが提供される。
以前に、グリカンにアルデヒド結合部位を提供するためにグリカン骨格の中のサッカライド環の１つまたは複数を切断する酸化化学を利用することによって、デルマタン硫酸などのグリカンにペプチドを結合した。次に、アルデヒド結合部位は、ペプチドを（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ結合を介して）コンジュゲートするために使用された。
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、ペプチドがヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合しており、ここで、ヒドラジド−カルボニルのカルボニル基はグリカンに存在する環外のカルボニル基であるという点で、当該技術分野で公知のものと構造的に異なる。環外のカルボニル基は天然のグリカンに存在することができ、あるいはグリカンはそのような官能基を含むように改変することができる。そのような方法は、下でさらに詳述される。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートが示す有益な作用（結合親和性の増加など）は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有していないグリカンに少なくとも部分的によるものと考えられている。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、任意の単一のまたは組合せのモノマー単位で構成されるポリマー骨格（例えば、グリカン以外の生体適合性のポリマー）を含むことができ、ただし、本明細書に記載されるペプチドがそれに共有結合することができるように、少なくとも１個、場合によっては１から約５０個の適する官能基がそこに存在する。ポリマーは、線状、分岐状であるか、または側鎖（例えば、１から５０個のペプチド以外の）を含有することができる。ポリマーは、中性、カチオン性、アニオン性または双性イオン性であってよい。ある特定の実施形態では、ポリマーは糖ポリマーである。ポリマーは、例えば式Ａ−Ｂ−Ａのブロックコポリマーを含むコポリマーであってよい。そのようなポリマーを提供する方法は当技術分野で公知であり、例えば生体重合を含む。一実施形態では、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。別の実施形態では、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）でない。ある特定の実施形態では、ポリマーは、グリカンでもナノ粒子でもない。ある特定の実施形態では、ポリマーはグリカンである。
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートのある特定の実施形態では、グリカンは、アルギネート、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デキストラン、デキストラン硫酸またはヒアルロナンであってよい。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸でない。別の実施形態では、グリカンはコンドロイチン硫酸である。別の実施形態では、グリカンはヘパリンである。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートでは、ヘパリンの様々な分子量、例えば、約６５０〜７００Ｄａの単一の二糖単位から約５０ｋＤａのグリカンを使用することができる。一部の実施形態では、ヘパリンは、約１０から約２０ｋＤａである。一部の実施形態では、ヘパリンは、最大で約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０ｋＤａである。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶ型の１つまたは複数に結合するコラーゲン結合単位を有するペプチドを含む。一実施形態では、コラーゲン結合単位は、コラーゲンに結合した後に、原線維形成を促進または阻害する。一実施形態では、コラーゲン結合単位は、コラーゲンに結合した後に、原線維形成を促進も阻害もしない。一部の実施形態では、ペプチドはＩ型コラーゲンに結合する。他の実施形態では、ペプチドはＩＶ型コラーゲンに結合する。ある特定の実施形態では、コラーゲンへの特定された結合親和性を有する１つまたは複数のペプチドを、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートで使用することができる。例えば、合成バイオコンジュゲートは、Ｉ型コラーゲンに結合親和性を有する少なくとも１つのペプチドおよびＩＶ型コラーゲンに結合親和性を有する少なくとも１つのペプチドを含むことができる。別の実施形態では、ペプチドは、Ｉ型コラーゲンに結合親和性を有する。別の実施形態では、ペプチドは、ＩＶ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＩＩ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＩＩＩ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは１つを超える型のコラーゲンに結合し、各コラーゲン型への相対的親和性は異なることができる。一実施形態では、コラーゲン結合単位は、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でコラーゲンに結合する。
さらに、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、１つを超える結合単位を有するペプチドを含むことができ、結合単位は同じであってもまたは異なってもよい。例えば、ある特定の実施形態では、ペプチドは２つまたはそれ超のコラーゲン結合単位を含み、これらのコラーゲン結合単位は同じである。別の実施形態では、ペプチドは２つまたはそれ超のコラーゲン結合単位を含み、これらのコラーゲン結合単位は異なる。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、式（Ｉ）または（ＩＩ）のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のペプチドを含み：
（Ｘ）ｎ−ＹＫＳ−（Ｘ）ｍ （Ｉ）
（Ｘ）ｎ−ＹＫＣ−（Ｘ）ｍ （ＩＩ）
上式で、
ｎは、０から５０であり；
ｍは、０から５０であり；
各Ｘは、天然または非天然のアミノ酸から独立して選択される。ある特定の実施形態では、各Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＳ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＣ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＳ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＣ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＳ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＣ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、アミノ酸配列ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲ（配列番号５８）、またはこの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に約１ｍＭ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、アミノ酸配列ＳＴＭＭＳＲＳＨＫＴＲＳＨＨＶ（配列番号５９）、またはこの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に約１ｍＭ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
したがって、一部の実施形態では、バイオコンジュゲートは、式（ＩＡ）または（ＩＩＡ）のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のペプチドを含み：
（Ｘ）ｎ−ＹＫＳ−（Ｘ）ｍ−ＧＳＧ （ＩＡ）
（Ｘ）ｎ−ＹＫＣ−（Ｘ）ｍ−ＧＳＧ （ＩＩＡ）
上式で、
ｎは、０から５０であり；
ｍは、０から５０であり；
各Ｘは、天然または非天然のアミノ酸から独立して選択される。一部の実施形態では、各Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、各Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシンおよびチロシンからなる群から独立して選択される。
一部の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＡおよびＩＩＡのいずれの中のｎも、０から約５０、または０から約４０、または０から約３０、または０から約２０、または０から約１５、または０から約１０、または０から約５である。一部の実施形態では、ｎは、１から約４０、または１から約３０、または１から約２０、または１から約１５、または１から約１０、または１から約５である。一部の実施形態では、ｎは、０から約５０、または０から約４０、または０から約３０、または０から約２０、または０から約１５、または０から約１０、または０から約５である。一部の実施形態では、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。
一部の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＡおよびＩＩＡのいずれの中のｍも、０から約５０、または０から約４０、または０から約３０、または０から約２０、または０から約１５、または０から約１０、または０から約５である。一部の実施形態では、ｍは、１から約５０、１から約４０、または１から約３０、または１から約２０、または１から約１５、または１から約１０、または１から約５である。一部の実施形態では、ｍは、０から約５０、または０から約４０、または０から約３０、または０から約２０、または０から約１５、または０から約１０、または０から約５である。一部の実施形態では、ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、最大で約４０個のアミノ酸を含む１つまたは複数のペプチドを含む。したがって、ある特定の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＡおよびＩＩＡのいずれの中のｎおよびｍの合計も、約１２０、または約１１０、または約１００、または約９０、または約８０、または約７０、または約６０、または約５０、または約４０、または約３０、または約２５、または約２０、または約１５、または約１０、または約５、または約３、または約２である。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＳ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＣ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＳ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＣ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＳ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＣ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、アミノ酸配列ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＳＧ（配列番号３５７）、またはこの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に約１ｍＭ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する配列を含む１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、アミノ酸配列ＳＴＭＭＳＲＳＨＫＴＲＳＨＨＶＧＳＧ（配列番号３５８）、またはこの配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８３％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に約１ｍＭ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する配列を含む１つまたは複数のペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸への特定された結合親和性を有する１つまたは複数のペプチドを、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートで使用することができる。さらに、本明細書で使用される場合、ペプチドは、１つを超えるヒアルロン酸結合単位を含むことができ、これらの結合単位は同じであってもまたは異なってもよい。
さらに、ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、少なくとも１つのヒアルロン酸結合単位および少なくとも１つのコラーゲン結合単位を含む１つまたは複数のペプチドを含む。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、少なくとも１つのヒアルロン酸結合単位および少なくとも１つのコラーゲン結合単位を含む１つまたは複数のペプチドを含み、ここで、コラーゲン結合単位は、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶ型の１つまたは複数に結合する。
本開示は、セレクチン、ＩＣＡＭおよび／またはＶＣＡＭ結合単位を含む、１から約５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートにも関する。ペプチドはヒドラジド−カルボニル結合を介してデルマタン硫酸などのグリカン（例えば、グリコサミノグリカンまたはＧＡＧ）にコンジュゲートされ、バイオコンジュゲートは１から約３個の疎水性テール（例えば、アルキルテール）を含むこともできる。
そのようなバイオコンジュゲートは、血管の内皮細胞内膜を傷害、尿毒症、酸化ストレスおよび炎症から保護することができる。バイオコンジュゲートは、外科的影響を受けた血管ならびにカテーテル処置された血管の内皮細胞内膜の保護のために特に有用である、Ｓ／Ｅセレクチン結合およびＩＣＡＭ結合抗好中球／単球内腔内膜（すなわち、ＥＣ−ＳＥＡＬ）を形成することができる。
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、バイオコンジュゲートがセレクチン、ＩＣＡＭおよび／またはＶＣＡＭに結合することが可能なように、１つまたは複数のタイプのペプチドを含むことができる。例えば、本明細書には、セレクチン結合ペプチドおよびＩＣＡＭ結合ペプチドの両方を含むバイオコンジュゲートが含まれる。セレクチン結合ペプチドおよびＶＣＡＭ結合ペプチドの両方を含むバイオコンジュゲート、またはＩＣＡＭ結合ペプチドおよびＶＣＡＭ結合ペプチドの両方を含むバイオコンジュゲートも含まれる。さらに、ペプチドは、１つまたは複数のセレクチン、ＩＣＡＭおよび／またはＶＣＡＭ結合単位（または、配列）を単一のペプチドの中に含むことができる。したがって、一実施形態では、セレクチン結合単位およびＩＣＡＭ結合単位の両方を有するペプチドを含むバイオコンジュゲートが本明細書で開示される。セレクチン結合単位およびＶＣＡＭ結合単位の両方を有するペプチドを含むバイオコンジュゲートも含まれる。ＩＣＡＭ結合単位およびＶＣＡＭ結合単位の両方を含むバイオコンジュゲートも含まれる。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはその組合せからなる群から選択される１つまたは複数のペプチドまたは結合単位を含む。
他の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはその組合せからなる群から選択される１つまたは複数などの、セレクチン結合単位を含む１つまたは複数のペプチドを含む。
他の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＩＣＡＭ結合単位を含む１つまたは複数のペプチドを含む。したがって、ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、
Figure 2018513879
 またはその組合せからなる群から選択される１つまたは複数のＩＣＡＭ結合単位を含む。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法で使用することができる、ＩＣＡＭ結合親和性（または、ＩＣＡＭ結合単位）を有することが示されている他のペプチド配列には、限定されずに、
Figure 2018513879
 またはその組合せが含まれる。
他の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＶＣＡＭ結合単位を含む１つまたは複数のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＶＣＡＭ結合単位は、
Figure 2018513879
 またはその組合せからなる群から選択される。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つまたは複数のＶＣＡＭ結合、ＩＣＡＭ結合および／またはセレクチン結合ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つまたは複数のＩＣＡＭ結合ペプチドおよび１つまたは複数のセレクチン結合ペプチドを含む。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つまたは複数のＶＣＡＭ結合単位、ＩＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を含むペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つまたは複数のＩＣＡＭ結合単位および１つまたは複数のセレクチン結合単位を含むペプチドを含む。
バイオコンジュゲートの所望の特性によって、グリカンに結合しているペプチドの総数は変化することができる。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートに存在するペプチドの総数は、約１から約５０、または約１から約４０、または約１から約３０、または約１から約２５、または約２から約３０、または約２から約２５、または約３から約２５、または約４から約２５、または約５から約２５、または約５から約３０、または約１から約２５、または約２から約２５、または約１１から約１４、または約１から約８、または約１から約５、または約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８ペプチドである。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１０から約４０ペプチドを含む。他の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約５から約３０ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約２０未満のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１８未満のペプチドを含む。様々な実施形態では、バイオコンジュゲートは、約４から約１８ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１５未満のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１０未満のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約３０未満のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約２５ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約５から約４０、または約１０から約４０、または約５から約２０、または約４から約１８、または約１０、または約１１、または約１８、または約２０ペプチド、または約２５ペプチド、または約３０ペプチド、または約４０ペプチド、または約５０ペプチドを含む。
本明細書に記載されるペプチドは、ペプチドへのコンジュゲーションのためのヒドラジド部分をさらに含む。ヒドラジド基は、任意の適する付着点、例えば、Ｃ末端、Ｎ末端に、またはアミノ酸の側鎖を介してペプチドに結合させることができる。例えば、ペプチドがペプチドのアミノ酸の側鎖を介してグリカンに結合している場合、その側鎖はグルタミン酸またはアスパラギン酸である。ヒドラジドは、ペプチド配列のアミノ酸に存在するカルボニル基（例えば、Ｃ末端のカルボニル基）に結合しているヒドラジン（−ＮＨＮＨ２）の間で形成することができる。
ある特定の実施形態では、ヒドラジド基は、スペーサーを介してペプチドに結合している。スペーサーは、任意の適切に官能基化された線状または分枝状の部分であってよく、約４から約１００原子を一般的に有する。一実施形態では、スペーサーは、１つまたは複数、または１から１０、または１から５、または１から３のアミノ酸を含む。アミノ酸は任意のアミノ酸であってよく、一部の場合には、無極性アミノ酸、例えばアラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンである。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、アルギニンおよびセリンからなる群から選択される。一実施形態では、スペーサーは、グリシン、グリシン−グリシン、グリシン−セリン−グリシン、アルギニン−アルギニン、アルギニン−グリシン−セリン−グリシンおよびリシン−グリシン−セリン−グリシンからなる群から選択される。スペーサーは、追加のアミノ酸スペーサーの有無にかかわらず、非アミノ酸部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、６−アミノヘキサン酸、コハク酸またはその組合せを含むこともできる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド配列は、ＧＳＧ−ＮＨＮＨ２部分をさらに含む。一般的に、ＧＳＧ−ＮＨＮＨ２部分は、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかに結合している。
ある特定の実施形態では、１つを超えるペプチド配列がそれに結合することにより、分枝状構築物を作り出すことができるように、スペーサーは１つを超える結合部位（線状または分枝状であってよい）を含む。さらに、ペプチドは、グリカンに末端または非末端アミノ酸部分を介して結合することができるので、グリカンに非末端アミノ酸部分を介して結合している場合、ペプチドは分枝状である。スペーサーにおける結合部位は同じであっても異なってもよく、所望のペプチド配列が（例えばアミド結合を介して）それに結合することができるように、アミンまたはカルボン酸部分などの任意の適する結合部位であってよい。したがってある特定の実施形態では、スペーサーは、１つまたは複数のリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基を含有する。そのような構築物は、式ＰｎＬの１つを超えるコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸結合単位を有するペプチドを提供することができ、ここで、Ｐはコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸結合単位であり、Ｌはスペーサーであり、ｎは２から約１０、または２から８、または２から６、または２から５、または２から４、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０の整数である。例えば、スペーサーＬは、ＫＧＳＧ（配列番号３５９）、ＫＫＧＳＧ（配列番号３６０）またはＫＫＫＧＳＧ（配列番号３６１）などのアミノ酸配列であってよく、それぞれ、２、３または４つの結合部位を提供する。
ある特定の実施形態では、さらなる分枝を作り出すために、スペーサーまたはその組合せを使用することができる。例えば、スペーサーは、追加のペプチドまたはコラーゲン結合単位を連結することが可能な側鎖を含有する、１つまたは複数のアミノ酸を含むことができる。そのようなスペーサーに含ませるための例示的なアミノ酸には、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸などが限定されずに含まれる。ある特定の実施形態では、スペーサーは、２から６個のアミノ酸または３、もしくは４個のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、スペーサーは式ＫＸＸの１つまたは複数のアミノ酸配列を含み、ここで、各Ｘは独立して天然または非天然アミノ酸である。分枝状構築物を作製するために単独または組合せで使用することができるスペーサーの具体例には、ＫＲＲ、ＫＫＫ、（Ｋ）ｎＧＳＧおよび（ＫＲＲ）ｎ−ＫＧＳＧが限定されずに含まれ、ここで、ｎは０から５、または１、２、３、４もしくは５である。一実施形態では、スペーサーは、ＧＳＧＫＲＲＧＳＧ（配列番号３６２）である。
ペプチドに結合したこれらのスペーサーの概略図は、下の表に示す。
Figure 2018513879
例示的なコラーゲン結合構築物には、限定されずに、
Figure 2018513879
 が含まれる。
ある特定の実施形態では、ヒドラジド基は、ペプチドＮ末端に結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド基は、ペプチドＣ末端に結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド基は、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸などのペプチド中のアミノ酸の側鎖に結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド基は、スペーサーを介してペプチドＣ末端に結合している。スペーサーは、任意の適する結合を介してペプチドに結合していてもよい。一部の実施形態では、スペーサーは、アミド結合を介してペプチドに結合していてもよい。
一実施形態では、ヒドラジド基は、グリシン、アラニン、アルギニンおよびセリンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むスペーサーを介して、Ｃ末端に結合している。一実施形態では、スペーサーは、グリシン、グリシン−グリシンおよびグリシン−セリン−グリシンからなる群から選択される。様々な実施形態では、ペプチドは、グリシン−セリン−グリシン（ＧＳＧ）、ＫＲＲＧＳＧ（配列番号３８４）またはＧＳＧＫＲＲＧＳＧ（配列番号３６２）などのアミノ酸スペーサーを含む。
本明細書に記載される実施形態のいずれでも、グリカンあたりのペプチドの数は平均であり、組成物中のある特定のバイオコンジュゲートは、グリカンあたりより多くのペプチドを有することができ、ある特定のバイオコンジュゲートはグリカンあたりより少ないペプチドを有する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドの数は、バイオコンジュゲートの組成物中の平均である。例えば、ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンあたりのペプチドの平均数が約５である組成物である。他の実施形態では、グリカンあたりのペプチドの平均数は、約６、または約７、または約８、または約９、または約１０、または約１１、または約１２、または約１３、または約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０、または約２５、または約３０である。
ある特定の実施形態では、グリカンあたりのペプチドの数は、グリカン骨格上のペプチドと官能基化する二糖単位のパーセントに基づく「パーセント（％）官能基化」で記載することができる。例えば、グリカンに存在する利用可能な二糖単位の総数は、単一の二糖単位の分子量（または、平均分子量）（例えば、約５５０〜８００Ｄａ、または約６５０〜７５０Ｄａ）を、グリカンの分子量（例えば、約２５ｋＤａから最大で約７０ｋＤａ、またはさらに約１００ｋＤａ）で割ることによって計算することができる。グリカンが従来の「二糖単位」（例えば、アルギン酸）を含有しない実施形態では、本明細書に提示される計算で使用されるグリカンに存在する利用可能な二糖単位の総数は、単一のサッカライド単位の分子量（または、平均分子量）をグリカンの分子量によって割り、２を掛けることによって計算することができる。
一部の実施形態では、グリカンに存在する利用可能な二糖単位の数は、約１０から約８０、または約１０から約７０、または約１５から約７０、または約２０から約７０、または約３０から約７０、または約３５から約７０、または約４０から約７０、または約１０から約７５、または約１５から約７５、または約２０から約７５、または約３０から約７５、または約３５から約７５、または約４０から約７５、または約１０から約５０、または約２０から約５０、または約２５から約５０、または約１０から約３５、または約１５から約３５、約２０から約３５、または約１０から約３０、または約１５から約３０、または約２０から約３０、または約１５、または約２０、または約２５、または約３０、または約３５、または約４０、または約４５、または約５０、または約５５、または約６０、または約６５、または約７０である。
したがって、ある特定の実施形態では、グリカンは、約１から約５０、または約５から約３０％の官能基化、または約２５％の官能基化を含み、ここで、パーセント（％）官能基化は、ペプチドと官能基化するグリカン上の二糖単位のパーセントによって判定される。一部の実施形態では、グリカンのパーセント（％）官能基化は、約１％から約５０％、または約３％から約４０％、または約５％から約３０％、または約１０％から約２０％、または約１％、または約２％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約１００％である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびペプチドを含む組成物が提供され、ここで、ペプチドはバイオコンジュゲートに（例えば、イオン結合を介して）緊密に関連している。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲート凝集体は、それによって形成することができる。バイオコンジュゲート凝集体（バイオコンジュゲートおよび非共有結合したペプチドを含む）は、１％から２００％の官能基化（ペプチドと官能基化するグリカン上の二糖単位のパーセントによって判定される）を含むことができると考えられる。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートのパーセント（％）官能基化は、約１％から約５０％、または約３％から約４０％、または約５％から約３０％、または約１０％から約２０％、または約１％、または約２％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％または約１００％である。
本明細書に記載される様々な実施形態では、アルギネート、アガロース、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸（ＨＡ）を限定されずに含む、任意のグリカンを利用することができると考えられる。グリカンは、天然に存在するか、または限定されずに部分的Ｎ−脱硫酸化誘導体、部分的Ｏ−脱硫酸化誘導体および／または部分的Ｏ−カルボキシメチル化誘導体などのように、化学的に誘導体化されてもよい。
一部の実施形態では、グリカンは未改変である。ある特定の実施形態では、グリカンは、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートが示す有益な作用は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有していないグリカンに少なくとも部分的に帰することができると考えられている。例えば、ヒアルロン酸結合単位を有する本明細書に開示されるバイオコンジュゲートは、当技術分野で公知のヒアルロン酸結合バイオコンジュゲートと比較したときに増加した結合親和性を示す（例えば、実施例５を参照）。
そのような連結は、ペプチドのヒドラジド基およびグリカンのカルボニル基（例えば、カルボン酸基またはその活性化誘導体）を、または代わりにグリカンのヒドラジド基およびペプチドのカルボニル基（例えば、カルボン酸基またはその活性化誘導体）をカップリングすることからもたらすことができる。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。
一実施形態では、グリカンはヘパリンであり、このヘパリンはヘパリン誘導体、例えば、限定されずに、部分的Ｎ−および／または部分的Ｏ−脱硫酸化ヘパリン誘導体、部分的Ｏ−カルボキシメチル化ヘパリン誘導体、またはその組合せを含むことができる。ある特定の実施形態では、ヘパリンは酸化されていないヘパリン（すなわち、酸化的に切断されたサッカライド環を含有しない）であり、アルデヒド官能基を含有しない。部分的Ｎ−脱硫酸化ヘパリンおよび／または部分的Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（すなわち、２−Ｏおよび／または６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン）などのヘパリン誘導体および／またはヘパリン誘導体を提供するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Kariyaら、J. Biol. Chem.、２０００年、２７５巻：２５９４９〜５９５８頁；Lapierreら、Glycobiology、１９９６年、６巻（３号）：３５５〜３６６頁を参照）。部分的Ｏ−カルボキシメチル化ヘパリン（または、任意のグリカン）誘導体、例えば、Prestwichら（米国特許出願公開第２０１２／０１４２９０７号；米国特許出願公開第２０１０／０３３０１４３号）に従って調製することができるものを、本明細書に開示されるバイオコンジュゲートを提供するために使用することができることも企図されている。
ある特定の実施形態では、グリカンの分子量はバイオコンジュゲートの作用を調整するために変化させられる（例えば、Radek, K. A.ら、Wound Repair Regen.、２００９年、１７巻：１１８〜１２６頁；およびTaylor, K. R.ら、J. Biol. Chem.、２００５年、２８０巻：５３００〜５３０６頁を参照）。別の実施形態では、グリカンは酸化およびアルカリ脱離によって分解されて（例えば、Fransson, L. A.ら、Eur. J. Biochem.、１９８０年、１０６巻：５９〜６９頁を参照）、より低い分子量（例えば、約１０ｋＤａから約５０ｋＤａ）を有する分解されたグリカンを与える。
一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸（ＤＳ）である。ＤＳの生物学的機能は広範囲にわたり、内皮細胞およびケラチノサイトの増殖および移動を促進させる増殖因子ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７およびＦＧＦ−１０の結合および活性化が含まれる。一部の実施形態では、デルマタン硫酸の重量範囲は、約１０ｋＤａから約７０ｋＤａである。一実施形態では、デルマタン硫酸の分子量は、約４６ｋＤａである。別の実施形態では、デルマタン硫酸は酸化およびアルカリ脱離によって分解されて（例えば、Fransson, L. A.ら、Eur. J. Biochem.、１９８０年、１０６巻：５９〜６９頁を参照）、より低い分子量（例えば、約１０ｋＤａ）を有する分解されたデルマタン硫酸を与える。
別の実施形態では、グリカンはヘパリンである。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートでは、ヘパリンの様々な分子量、例えば、約６５０〜７００Ｄａの単一の二糖単位から約５０ｋＤａを使用することができる。一部の実施形態では、ヘパリンは約１０から約２０ｋＤａである。一部の実施形態では、ヘパリンは、最大で約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０ｋＤａである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、サッカライド環の１つまたは複数を切断しない条件下で酸化することができる（例えば、Wangら、Biomacromolecules ２０１３年、１４巻（７号）：２４２７〜２４３２頁を参照）。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１０または約７のペプチドを含み、ここで、ペプチドは
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはヘパリンである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約２０ペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１０または約７のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはヘパリンである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約２０ペプチドを含み、ペプチドは
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１０または約７のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはヘパリンである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートはグリカンおよび約２０ペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、デルマタン硫酸および
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含む約１から約５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートではなく、ペプチドは、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１０または約７のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはヘパリンである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートはグリカンおよび約２０ペプチドを含み、ここで、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約１から約５または約１から２のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはヘパリンである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１０のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはコンドロイチン硫酸である。ある特定の実施形態では、コンドロイチン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１０のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはコンドロイチン硫酸である。ある特定の実施形態では、コンドロイチン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートはグリカンおよび約１から約２０のペプチドを含み、ここで、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列、および
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。一実施形態では、グリカンはコンドロイチン硫酸である。ある特定の実施形態では、コンドロイチン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約１から約２０のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列、および
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。一実施形態では、グリカンはコンドロイチン硫酸である。ある特定の実施形態では、コンドロイチン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートはグリカンおよび約５から約１５のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１５のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１５のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１５のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１５のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列、および
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、グリカンにヒドラジド−カルボニル連結を介して結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にある。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。ある特定の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化的に切断されたサッカライド環を含有せず、したがって、アルデヒド官能基を含有しない。
３．バイオコンジュゲートの合成
本明細書で使用するペプチドは、民間の供給元から購入することができるか、または、当技術分野で周知である方法（例えば、化学的および／または生物工学的方法）を使用して部分的または完全に合成することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドは、当技術分野で周知である固相ペプチド合成プロトコールによって合成される。別の実施形態では、ペプチドは周知のＦｍｏｃプロトコールによって固体支持体において合成され、トリフルオロ酢酸によって支持体から切断され、当業者に公知である方法に従ってクロマトグラフィーによって精製される。他の実施形態では、ペプチドは、当業者に周知であるバイオテクノロジーの方法を利用して合成される。一実施形態では、所望のペプチドのためのアミノ酸配列情報をコードするＤＮＡ配列は、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術によって発現プラスミド（例えば、ペプチドの親和性精製のための親和性タグを組み込むプラスミド）にライゲーションされ、プラスミドは発現のために宿主生物体にトランスフェクトされ、次にペプチドは、例えば親和性精製によって宿主生物体または成長培地から単離される。組換えＤＮＡ技法は、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、（２００１年）に記載され、当業者に周知である。
スキーム１で示すように、本明細書に記載されるペプチドは、カルボン酸部分を介してグリカン（例えば、ヘパリン）１Ａに共有結合させて、本明細書に開示されるバイオコンジュゲート１Ｂを提供することができる。ペプチドカップリング反応で一般的であるように、反応を容易にするために活性化剤を使用することができる。適するカップリング剤（または、活性化剤）は当該技術分野で公知であり、例えば、カルボジイミド（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロペンチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ−メチルカルボジイミド（ＢＭＣ）、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＢＥＣ）、１，３−ビス（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イルメチル）カルボジイミド（ＢＤＤＣ）など）、無水物（例えば、対称形、混合されたまたは環式の無水物）、活性化エステル（例えば、フェニル活性化エステル誘導体、ｐ−ヒドロキサム活性化エステル、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）など）、アシルアゾール（ＣＤＩを使用するアシルイミダゾール、アシルベンゾトリアゾールなど）、アシルアジ化物、酸ハロゲン化物、ホスホニウム塩（ＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰ、ＨＯＡｔなど）、アミニウム／ウロニウム塩（例えば、テトラメチルアミニウム塩、ビスピロリジノアミニウム塩、ビスピペリジノアミニウム塩、イミダゾリウムウロニウム塩、ピリミジニウムウロニウム塩、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−Ｎ’−フェニル尿素に由来するウロニウム塩、モルホリノをベースとしたアミニウム／ウロニウムカップリング試薬、アンチモン酸ウロニウム塩など）、有機リン試薬（例えば、ホスフィン酸およびリン酸誘導体）、有機硫黄試薬（例えば、スルホン酸誘導体）、トリアジンカップリング試薬（例えば、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４メチルモルホリニウム塩化物、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４メチルモルホリニウムテトラフルオロホウ酸など）、ピリジニウムカップリング試薬（例えば、ムカイヤマ試薬、ピリジニウムテトラフルオロホウ酸カップリング試薬など）、ポリマー支持試薬（例えば、ポリマーに結合したカルボジイミド、ポリマーに結合したＴＢＴＵ、ポリマーに結合した２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン、ポリマーに結合したＨＯＢｔ、ポリマーに結合したＨＯＳｕ、ポリマーに結合したＩＩＤＱ、ポリマーに結合したＥＥＤＱなど）などが含まれる（例えば、El-Fahamら、Chem. Rev.、２０１１年、１１１巻（１１号）：６５５７〜６６０２頁；Hanら、Tetrahedron、２００４年、６０巻：２４４７〜２４６７頁を参照）。
一実施形態では、ペプチドカップリング反応は、グリカンのカルボン酸部分をカップリング剤（例えば、カルボジイミド試薬、例えば、限定されずに、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）など）と反応させて、Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成することによって、活性化グリカン中間体を介して進行する。そのようなカルボジイミド化学は当技術分野で周知であり、適するカップリング剤は民間の供給元から購入することができる。Ｏ−アシルイソ尿素中間体を所望のペプチドと接触させることは、バイオコンジュゲートを与える。グリカンは、ペプチドの前、またはその存在下で活性化剤と接触させることができる。一部の実施形態では、反応はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその誘導体の存在下で実行される。ある特定の実施形態では、ペプチド配列は、グリカンまたはそのＯ−アシルイソ尿素中間体とのカップリング反応を助けるために、反応性部分（例えば、ヒドラジド官能基）を含むことができる。一部の実施形態では、ペプチド配列は、結合単位と末端アミノ酸（例えば、末端グリシン）または反応性部分（すなわち、ヒドラジド官能基）の間のスペーサーとして作用する１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。例えば、グリカンのための付着点を提供するために、セリン−グリシン（ＳＧ）、グリシン−セリン−グリシン（ＧＳＧ）またはグリシン−セリン−グリシン−セリン−グリシン（ＧＳＧＳＧ）スペーサーを追加することができる。さらに、ペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸が反応性官能基（例えば、カルボン酸側鎖）を含有するある特定の場合には、１つまたは複数の側鎖を保護してカップリング反応を容易にするために、標準の保護基化学を使用することができる。さらに、非アミノ酸スペーサーを単独で、またはアミノ酸スペーサー（例えば、アミノヘキサン酸）と組み合わせて用いることもできる。
スキーム１。バイオコンジュゲートの合成
Figure 2018513879
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは改変されたグリカン誘導体（例えば、ヘパリン）に由来する（スキーム２）。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートで使用するのに適する、例えば部分的Ｎ−脱硫酸化ヘパリンおよび部分的Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（すなわち、２−Ｏおよび／または６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン、例えば、Kariyaら、J. Biol. Chem.、２０００年、２７５巻：２５９４９〜５９５８頁；Lapierreら、Glycobiology、１９９６年、６巻（３号）：３５５〜３６６頁を参照）などの様々なグリカン誘導体が当該技術分野で公知である。例示的な方法が、下でスキーム２に示される。スキーム２に示すように、１つまたは複数の脱硫酸化グリカン誘導体２Ａを提供するために、グリカン（例えば、ヘパリン）１Ａを適する脱硫酸化剤、例えば塩基（例えば、ＮａＯＨ）またはシリル化試薬（例えば、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＴＳＡ）、Ｎ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＴＳＴＦＡ）など）と反応させることができる。当業者にとって明らかであるように、グリカン誘導体２Ａは、部分的、完全なまたは混合物の脱硫酸化グリカン誘導体２Ａが得られるように、用いる試薬および反応条件によって調整することができる。次に、脱硫酸化グリカン誘導体２Ａは、スキーム１のために上に記載される通り、任意選択でカップリング剤の存在下で、バイオコンジュゲート２Ｂを提供する一般的なペプチドカップリング反応条件下でペプチドと反応させることができる。さらに、スキーム２に示すように、少なくとも１つのヒドロキシル基（例えば、６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン）を有するグリカン誘導体を、Ｏ−カルボキシメチル化グリカン誘導体（例えば、６−Ｏ−カルボキシメチル化ヘパリン）２Ｃに変換することができる（例えば、Prestwichら、米国特許出願公開第２０１２／０１４２９０７号および米国特許出願公開第２０１０／０３３０１４３号を参照）。スキーム１のために上に記載される通りの、任意選択でカップリング剤の存在下での、一般的なペプチドカップリング反応条件下でのペプチドとの２Ｃの反応は、バイオコンジュゲート２Ｄおよび／または２Ｅを提供することができる。
スキーム２。バイオコンジュゲートの代わりの合成
Figure 2018513879
スキーム１および２と対照的に、スキーム３は、当技術分野で公知であるバイオコンジュゲートの合成を示す。スキーム１に示すように、グリカン（例えば、コンドロイチン硫酸「ＣＳ」）は過ヨウ素酸試薬、例えば過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化されて、ペプチドをグリカンに共有結合するためにグリカン（例えば、「ｏｘ−ＣＳ」）のアルデヒド官能基を提供する。次に酸化されたグリカン（例えば、「ｏｘ−ＣＳ」）のアルデヒド官能基をＮ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）と反応させてグリカン中間体（例えば、「ＢＭＰＨ−ＣＳ」）を形成し、グリカン中間体を少なくとも１つの遊離チオール基（すなわち、−ＳＨ基）を含有するペプチドとさらに反応させて合成ペプチドグリカンを与えることによって、ペプチドはグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸「ＣＳ」）に共有結合される。
スキーム３。ＣＳ−ＢＭＰＨ−ペプチドｎの合成
Figure 2018513879
４．使用方法
４．１ コラーゲン結合バイオコンジュゲートの使用方法
一実施形態では、血小板の活性化を阻害する方法が記載され、本方法は、コラーゲンと接触させるためにコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを提供するステップを含み、ここで、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートはコラーゲンと結合し、血小板の活性化が阻害される。別の実施形態では、血小板のコラーゲンへの接着を阻害する方法が記載され、本方法は、コラーゲンと接触させるためにコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを提供するステップを含み、ここで、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートはコラーゲンと結合し、血小板のコラーゲンへの接着が阻害される。コラーゲン結合バイオコンジュゲートを使用する他の方法が、下で議論される。
ａ．冠状動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）
本開示の一実施形態は、外科的バイパス術の成功率を改善するおよび／またはその失敗を低減するための方法および関連する組成物を提供する。冠状動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の両方における動脈遮断の治療の形態として、バイパスグラフトが使用される。およそ５００，０００件の冠状動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）術、および７０，０００件を超える末梢バイパスグラフト術が毎年米国で実行される。最も一般的には、しばしば伏在静脈から、自家血管グラフトを採取する。
血流を回復するための自家静脈グラフトによる外科的バイパスの普及にもかかわらず、ＣＡＤおよびＰＡＤの両方で多数の静脈グラフト不全（ＶＧＦ）がある。末梢単独では、静脈グラフト不全率は、５年以内に５０％の不全のレベルに到達する。静脈グラフトの５％から１０％が技術的因子および急性血栓症により移植直後に失敗するが、中間時点での失敗（３から２４ヵ月時点）が別の２０％から３０％の症例で起こり、高コストのサーベイランス、再介入手順および切断につながる可能性がある。Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌでの２０年の経験の間のＣＬＩ患者（ｎ＝１２１９）における静脈グラフト不全の１２ヵ月発生率は、２９％であった。静脈グラフト不全の結果は、再発性の虚血性症状、衰弱性の手術および四肢喪失を含めて、患者のためにしばしば重大である。現在まで、薬物療法および技術革新は、静脈グラフト不全の低減にほとんど影響していない。
静脈グラフト採取、保存媒体、バイパスに備えての過剰な操作、または虚血および再かん流傷害によって引き起こされようと、静脈グラフト管の脆弱性内皮層への傷害は、移植後の血管壁の中での血小板媒介性の炎症応答をもたらすと考えられている。そのような内皮傷害およびＥＣＭ−血小板活性化カスケードは、急性炎症および血栓症による初期のＶＧＦまたは新生内膜過形成による遅延型のＶＧＦをもたらすことができる。したがって、静脈グラフト内皮下マトリックスの曝露を移植後の循環血小板に限定することは、急性血管壁炎症を低減し、再上皮形成を改善し、血管閉塞およびＶＧＦにつながることがある過剰な新生内膜過形成を制限するのを助けることができる。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、自家静脈グラフトによる外科的バイパスを受ける心血管疾患患者のための静脈グラフト保存溶液として使用することができる。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物は、それを必要とする患者において冠状動脈疾患および／または末梢動脈疾患を治療および／または予防するために使用することができる。
したがって、本開示の一実施形態により、血管の切片の内壁を本開示の合成バイオコンジュゲートを含有する溶液と接触させることによって血管グラフト（例えば、静脈グラフト）を調製するための方法が提供される。接触を実行する１つの方法は、溶液に切片を浸漬することである。この接触の条件は異なることができるが、内壁に結合する合成バイオコンジュゲートの適量が存在するように、合成バイオコンジュゲートの濃度および血管の特徴によって容易に決定することができる。そのような方法で調製される血管グラフトも、本開示の範囲内である。
グラフトが調製されると、それを必要とする患者にグラフトを移植することができる。外科的バイパス術は、医療専門家が容易に実行することができる。移植されると、グラフト（grant）の内壁に結合した合成バイオコンジュゲートは、急性の血管壁炎症を低減し、グラフトの再上皮形成を改善し、グラフトの過剰な新生内膜過形成を制限するのを助け、グラフト不全の低減をもたらすことができる。
一実施形態では、バイパス術の間またはその後にグラフトを前記のように合成バイオコンジュゲートで処置したとき、合成バイオコンジュゲートがグラフトの内壁に結合するように、合成バイオコンジュゲートの溶液をグラフトの内腔に注射することができる。一態様では、血流が回復されるかまたはグラフトを通して開始される前に、注射が実行される。別の態様では、血流が回復または開始された直後に（例えば、１０分以内、５分以内、または１分以内に）、注射は実行される。
一部の実施形態では、本方法は、血管の負の再構築を阻害するのに効果的である。虚血性または冠状動脈心疾患としても公知の冠状動脈疾患は、冠状動脈（心筋に血液を供給する動脈）の内側の平滑な弾性内膜の一部がアテローム硬化症を起こし、心臓への血流を実際上制限するときに起こる。アテローム硬化症または動脈硬化としても公知の末梢動脈疾患は、循環系の動脈で起こる障害である。負の再構築には、血管径および内腔径の低減をもたらす刺激に対する、血管の生理的または病的な応答が含まれる。そのような刺激は、例えば、血流の変化または血管形成手順によって提供されるかもしれない。一部の実施形態では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物の注射は、注射なしでの血管径と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９５％のいずれかまたはそれを超える血管径の増加につながる。負の再構築は、例えば、病変部位（または、疾患部位）でのパーセント直径狭窄として血管造影的に定量化することができる。再構築の程度を判定する別の方法は、血管内超音波（ＩＶＵＳ）を使用して病変内の外弾性板面積を測定することを含む。ＩＶＵＳは、外弾性板ならびに血管内腔を画像化することができる技術である。一部の実施形態では、負の再構築は、血管介入手順、例えば血管形成術、ステントまたはアテレクトミーに関連している。したがって、本明細書に記載されるように、バイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物は、血管介入手順の前、間および／または後に注射することができる。ある特定の実施形態では、それを必要とする患者において大腿膝窩動脈の中の狭窄または閉塞を治療する方法であって、バルーン血管形成術の前、その間および／またはその後に、溶液を内腔の内壁に適用することを含み、その溶液は、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物の有効量を含む方法が提供される。
したがって、本開示は、それを必要とする個体で血管（例えば、動脈）の負の再構築を阻害する方法であって、血管壁または血管壁を囲む組織に、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物の有効量を注射することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートまたは組成物は、潜在的または実際の負の再構築の部位またはそれに隣接して（例えば、部位から約２、１または０．５ｃｍ以下離れて）注射される。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、潜在的または実際の負の再構築の部位から離れて（例えば、部位から少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｃｍのいずれか離れて）注射される。一部の実施形態では、注射は針付きのカテーテルによる。一部の実施形態では、部位は冠状動脈または末梢動脈である。一部の実施形態では、動脈は、腎臓動脈、大脳動脈、肺動脈および脚の動脈からなる群から選択される。一部の実施形態では、動脈は、バルーン傷害を受けた動脈である。さらなる例には、腹大動脈、前脛骨動脈、大動脈弓、弓状動脈、腋窩動脈、上腕動脈、頸動脈、腹腔動脈、回旋腓骨動脈、総肝臓動脈、総腸骨動脈、大腿深動脈、深掌動脈弓、背側指動脈、背側中足動脈、外頸動脈、外腸骨動脈、顔面動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈、内部腸骨動脈、腸管動脈、外側下膝動脈、外側上膝動脈、掌側指動脈、腓骨動脈、膝窩動脈、後脛骨動脈、大腿深動脈、肺動脈、橈骨動脈、腎臓動脈、脾臓動脈、鎖骨下動脈、浅掌動脈弓、上腸間膜動脈、上尺側側副動脈および／または尺骨動脈が限定されずに含まれる。ある特定の実施形態では、動脈は冠血管系の一部である。
一実施形態では、上述の方法で使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約５から約１０または約７のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンに結合している。
ｂ．血管治療
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよび組成物は、血管傷害または介入の前、その間および／またはその後に、患者において血管を治療するために使用することができる。血管介入には、限定されずに、ステント、グラフト血管、アテレクトミーおよび血管アクセス機能不全を有するおよび有しない血管形成術、または他の外科的処置を含めることができる。
本明細書に記載される様々な実施形態では、バイオコンジュゲートまたはその組成物は、血小板活性化、例えば血栓形成に関与するもの、剥離した内皮（ｄｅｎｕｄｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）の露出したコラーゲンへの血小板結合、内皮が剥離されることからもたらされる炎症、内膜過形成または血管痙攣を阻害するために、治療を必要とする患者に投与することができる。
様々な実施形態では、バイオコンジュゲートは、例えば、静脈内または筋肉内に投与することができる。非経口投与のための他の適する経路には、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経皮、皮内および表皮内送達が含まれる。非経口投与のための適する手段には、針（顕微針を含む）注射器、注入技術およびカテーテルベースの送達が含まれる。カテーテルベースの送達には、バルーンに対するコーティングとしての、多孔質バルーンによる、またはステントに対するコーティングとしてのバイオコンジュゲートの送達を含めることができる。別の実施形態では、バイオコンジュゲートは全身的に送達することができる（すなわち、標的の血管に直接的に送達されるのではなく、非経口投与によって送達される）。
これらのバイオコンジュゲートは、物理的ペプチド−コラーゲン相互作用を介して、露出したコラーゲンと局所的に結合する。コラーゲンに結合したとき、バイオコンジュゲートは、１）血小板付着／活性化の障壁として作用すること、２）ＭＭＰアクセスを阻害することによってコラーゲンを分解から保護すること、および３）増殖因子ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７およびＦＧＦ−１０を隔離し、このように内皮および上皮細胞増殖および移動を促進することを含むいくつかの機能を有する。
バイオコンジュゲートはコラーゲン上の血小板結合部位について競合し、血小板の結合および活性化を予防することができる。バイオコンジュゲートのグリカン骨格は負に荷電し、水分子に結合することができ、血小板およびタンパク質接着を予防する親水性障壁をコラーゲン表面に生成する。正常な血小板機能を阻害するよりも、露出したコラーゲンをマスキングすることによって、バイオコンジュゲートは炎症および内膜過形成へのカスケードの初期ステップに対処する局所処置を提供することができる。
一実施形態では、本開示は、血液透析を受けている患者において血管アクセス機能不全の満たされていない必要に対処する新しいアプローチを提供する。一実施形態では、このアプローチは、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートから設計される内腔血管コーティングの生成を伴う。例えば動静脈瘻（ＡＶＦ）では、新生内膜過形成はＡＶＦの静脈部分で大部分起こる。内膜過形成の初期の機構は動脈および静脈で類似しているが、結果として生じる病変に差がある。末梢血管疾患の場面では、静脈新生内膜過形成は動脈内膜過形成より攻撃的な病変になり、血管形成術への応答がより不良になる傾向がある。動脈傷害で血小板結合および内膜過形成を予防する開示されたバイオコンジュゲートの能力は、新生内膜過形成を低減または予防するその能力に寄与すると考えられる。
したがって、一部の実施形態では、本開示は、血液透析を必要とする患者において動静脈瘻（ＡＶＦ）の成熟を改善するための、あるいは開存性を改善するための、静脈の内径を拡大するための、狭窄を低減するための、新生内膜過形成を低減するための、血行力学ストレスを低減するための、内皮もしくは平滑筋細胞傷害を低減するための、血管アクセス機能不全を低減するための、またはＡＶＦで凝固もしくは炎症を低減するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、溶液をＡＶＦの内腔の内壁に適用すること；およびＡＶＦ内の血流を回復または開始することを伴い、溶液は本開示のバイオコンジュゲートであるか、または溶液は本開示のバイオコンジュゲートの有効量を含む。
露出したコラーゲンと特異的に結合する合成ポリマー内腔コーティングを使用する局所処置が開示され、ここで、コーティングは血管壁への血小板接着をブロックすることができ、したがって、血栓形成および内膜過形成での開始事象を阻害することができる。さらに、コーティングは血管壁の迅速な再内皮化を促進することができ、より速い治癒をもたらす。生成の間の天然の動静脈瘻への開示されたバイオコンジュゲートの適用は、有意により少ない狭窄およびより大きな直径の瘻をもたらすと考えられる。
一部の実施形態では、血流が開始される前の新たに形成されるＡＶＦのために、血流が開始される約１０分未満前に溶液が適用される。一部の実施形態では、溶液は、血流が開始される約２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３もしくは２分未満前、または６０、４５、３０、２０、１０もしくは５秒未満前に適用される。一部の実施形態では、溶液は、血流が開始される少なくとも１分前、または少なくとも２、３、４、５分前に適用される。一部の実施形態では、溶液は、血流が回復されてから少なくとも１分後、または少なくとも２、３、４、５分後に適用される。一部の実施形態では、溶液の送達を可能にするために、血流が開始され、その後停止される。一部の実施形態では、溶液は、吻合の生成の前、吻合の生成の間、またはその後に血管に適用される。一部の実施形態では、溶液は、吻合の生成の前、吻合の生成の間、およびその後に血管に適用される。
一部の実施形態では、溶液は、例えば針、カテーテルまたは他の薬物送達器具によりＡＶＦを通してフラッシュされる。一実施形態では、本方法は、ＡＶＦに溶液をフラッシュした後にＡＶＦを閉じることをさらに伴う。一部の実施形態では、上記の溶液の適用に加えて、または代わりに、確立されたＡＶＦの近位の静脈および動脈を圧迫することによって生成される封入された内腔に、溶液は注射される。
一実施形態では、溶液は、静脈拡張または静脈の内径を拡大するために使用されるＡＶＦの静脈部分の摩擦の約５分以内（あるいは、１０、９、８、７、６、４、３または２分以内）に適用される。静脈内部の機械的に拡張させたまたは摩擦した表面に溶液を適用することは、摩擦の間の表面のバイオコンジュゲートの損失を低減することができる。
開示される組成物および方法は、患者において血管アクセスを確立するために使用できることがさらに企図され、この方法は、本開示の溶液を血管アクセスで血管壁に適用すること；および血管アクセスで血流を回復または開始することを伴うことがある。一部の実施形態では、壁は血管の内壁であるが、それは任意の血管の外壁であってもよい。
一部の実施形態では、血管アクセスは、動静脈瘻（ＡＶＦ）、動静脈グラフト（ＡＶＧ）または非経口栄養、化学療法もしくは血漿交換法のために使用される永続的な血管アクセスである。溶液は、血小板への壁の曝露を低減すると考えられる。一部の実施形態では、壁は、傷害または外科的処置のために血流に曝露した細胞または組織を含む。溶液の適用は、開存性を改善し、生存を改善し、血流を改善し、血管内径を拡大し、またはＡＶＦおよびＡＶＧなどの血管アクセスで狭窄を低減することが示されている。
一実施形態では、本開示は、血液透析を必要とする患者において動静脈瘻（ＡＶＦ）の成熟を改善するための、あるいは開存性を改善するための、静脈の内径を拡大するための、狭窄を低減するための、新生内膜過形成を低減するための、血行力学ストレスを低減するための、内皮もしくは平滑筋細胞傷害を低減するための、血管アクセス機能不全を低減するための、またはＡＶＦで凝固もしくは炎症を低減するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、溶液をＡＶＦの内腔の内壁に適用すること；およびＡＶＦ内の血流を回復または開始することを伴い、溶液は本開示のバイオコンジュゲートの有効量を含む。
バイオコンジュゲートは、患者の血管の内部に経皮的または静脈内に投与することができると考えられる。経皮的または静脈内送達は、外科的瘻生成の後の患者の治療を可能にする。バイオコンジュゲートは、血管の治療、血管の維持または瘻の失敗の予防のために送達することができる。
一部の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の維持適用、例えばバルーン支援成熟、バルーン血管形成術、アテレクトミーまたは脱凝固手順を実行することをさらに含む。さらに、一部の実施形態では、血液透析時の、特に、特に高い流速が内皮に損傷を与えるときの手順の後の予防的送達、およびグラフトまたは瘻内の注射は、狭窄の維持および予防のために有益であると考えられる。
一実施形態では、上述の方法で使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約５から約１０または約７のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンに結合している。ある特定の実施形態では、ヘパリンは未分画ヘパリン（ＵＦＨ）または低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である。
一実施形態では、上述の方法で使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよびペプチドとの約５から約２０％の官能基化を含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンに結合している。
Ｃ．血管介入
経皮的冠動脈介入などの血管介入は、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの投与の前、その間、またはその後に、任意の従来の手順によって実行することができる。本発明の方法との併用を企図する血管介入手順の例には、ステント、アテレクトミーおよびバルーン血管形成術などの血管形成術が含まれる。血管介入手順は、血管を一時的に閉塞させることを含む手順（例えば、バルーン血管形成術）であることができるか、またはそれは血管を一時的に閉塞させることを含まない手順であってもよい（例えば、非バルーン血管形成手順、バルーン血管形成術を含まないステントなど）。送達の例示的な様式には、カテーテル、非経口投与、バルーンに対するコーティング、多孔性バルーンによるもの、コーティングされたステント、およびその任意の組合せまたは血管介入手順の間の薬物送達の任意の他の公知の方法を含めることができる。
別の例証的実施形態では、血管介入手順の間、保存的アミノ酸置換を有するこれらのバイオコンジュゲートのいずれも、剥離した内皮の露出したコラーゲンへの血小板結合、血小板活性化、血栓形成、内皮が剥離されることからもたらされる炎症、内膜過形成および／または血管痙攣を阻害することができるか、または内皮細胞増殖を刺激することができるか、または剥離した血管内でコラーゲンに結合することができる。別の例証的実施形態では、血管介入手順の間、この段落に記載される保存的アミノ酸置換を有するバイオコンジュゲートのいずれも、剥離した内皮の露出したコラーゲンへの血小板結合、血小板活性化、内膜過形成および／または血管痙攣を阻害することができるか、または、剥離した血管内でコラーゲンに結合することができる。
本明細書に記載される様々な実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、患者に投与することができる（例えば、血小板活性化、例えば血栓形成に関与するもの、剥離した内皮の露出したコラーゲンへの血小板結合、血栓形成、内皮が剥離されることからもたらされる炎症、内膜過形成または血管痙攣を阻害するために、治療を必要とする患者）。様々な実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、例えば、静脈内または筋肉内に投与することができる。非経口投与のための適する経路には、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経皮、皮内および表皮内送達が含まれる。非経口投与のための適する手段には、針（顕微針を含む）注射器、注入技術およびカテーテルベースの送達が含まれる。例証的実施形態では、ａ）コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの薬学的に活性な量；ｂ）約ｐＨ４．５から約ｐＨ９の範囲内のｐＨを提供する薬学的に許容されるｐＨ緩衝剤；ｃ）約０から約３００ミリモルの濃度範囲内のイオン強度改変剤；およびｄ）全式量の約０．２５％から約１０％の濃度範囲内の水溶性粘度改変剤、または任意の個々の構成成分ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）、またはａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の任意の組合せを含む、非経口投与またはカテーテルベースの送達のためのコラーゲン結合合成バイオコンジュゲート用の医薬製剤が提供される。
本明細書に記載される実施形態のいずれでも、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、任意の適する方法で患者の血管内に（例えば、動脈または静脈に）投与することができる。本明細書に記載される様々な実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、血管介入の前、その間またはその後に患者の血管に投与することができる。様々な実施形態では、経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）などの血管介入には、例えば、ステント、アテレクトミー、グラフトおよびバルーン血管形成術などの血管形成術を含めることができる。例示すると、血管介入は、動脈、例えば冠状動脈もしくは静脈を一時的に閉塞させることを含むもの（例えば、バルーン血管形成術）であってよいか、または、動脈もしくは静脈を一時的に閉塞させることを含まないもの（例えば、非バルーン血管形成手順、バルーン血管形成術を含まないステントなど）であってもよい。送達の例示的な様式には、カテーテル、非経口投与、バルーンに対するコーティング、多孔性バルーンによるもの、コーティングされたステント、およびその任意の組合せまたは血管介入手順の間の薬物送達の任意の他の公知の方法を含めることができる。例証的一実施形態では、標的血管は、冠状動脈を、例えば、生来の冠状動脈ならびに、例えば初期の冠状動脈バイパス術で患者にグラフトされたものを含む患者の心臓組織に血液を供給する任意の血管を含むことができる。本明細書に記載される実施形態のいずれでも、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートが投与される、および血管介入手順が実行される標的血管は、狭窄または血管を通る血流の低減を引き起こす完全もしくは部分的遮断の一部の他の形態などの遮断を含有することができる。したがって、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、患者に経皮的に挿入される、および患者の血管を通して標的血管に通されるカテーテル（例えば、拡張カテーテル、オーバーザワイヤ血管形成術バルーンカテーテル、注入カテーテル、迅速交換もしくはモノレールカテーテルまたは当技術分野で公知である任意の他のカテーテル器具）によって血管に送達することができる。様々なカテーテルベースの器具が当技術分野で公知であり、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３００，４５４号に記載されるものが含まれる。カテーテルが使用される本明細書に記載した様々な実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを送達するために使用されるカテーテルは、血管介入が実行されるのと同じカテーテルであってよいか、または異なるカテーテルであってもよい（例えば、同じか異なる皮膚切開を通して患者に経皮的に挿入される、および／または同じか異なる経路により患者の血管を通して標的血管に通される異なるカテーテル）。別の実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、標的血管に直接的に注射することができる。別の実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、全身的に送達することができる（すなわち、標的血管に直接的に送達されるのではなく、カテーテルベースの送達なしの非経口投与によって送達される）。
血管が遮断（例えば、狭窄）を含有する場合には、投与は、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを遮断部位、または遮断の遠位部または両方に、標的血管に直接的に送達することによって実行することができる。別の実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、遮断に近位の１つまたは複数の部位に送達することができる。例示すると、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートが送達される間、カテーテルチップは静止状態に維持することができるか、または、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートが送達される間、カテーテルチップを移動することができる（例えば、最初に遮断に遠位である位置から遮断へのもしくは遮断までの、または遮断に近位の位置への近位方向への）。
上記のように、一実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、血管介入、例えば経皮的冠動脈介入の前の時点に患者の血管に直接的に投与することができる。例えば、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの送達は、血管介入の直前に（例えば、血管介入より前の約１時間以内に、例えば約３０分以内に、約１５分以内におよび／または約５分以内に）実行することができる。任意選択で、標的血管へのコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの直接送達は、血管介入手順の全部もしくは一部の間および／もしくはそのような手順の完了後に継続することができ、または、標的血管へのコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの直接送達は、血管介入手順の開始前に中止することができ、その後再開されない。本明細書に記載される実施形態のいずれでも、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの送達は連続的であってよく、または、それは単回または複数回の投与を通して実行することができる。コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートが標的血管に投与される前、その間および／またはその後に、同じコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートまたは１つもしくは複数の異なるコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを投与することができる。
一実施形態では、上述の方法で使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約５から約１０または約７のペプチドを含み、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンに結合している。
ｄ．内皮機能不全
本開示は、一実施形態では、内皮機能不全に関連した疾患を患っている患者を治療するための組成物および方法を提供する。組成物は、一部の実施形態では、本開示の合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートを含む。
本明細書において、コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、急性および慢性疾患の両方で、内皮機能不全または傷害の炎症性影響を低減することができることが発見される。そのようなバイオコンジュゲートは、機能不全内皮への血小板結合を阻害または低減し、したがって、血小板媒介炎症を低減すると考えられる。炎症は血小板−血小板結合、血小板−白血球結合、白血球漏出の促進、または単に局所および領域性サイトカインの血小板からの放出などの血小板過程を通して、活性化される可能性がある。
さらに、露出した内皮細胞内で、コラーゲン結合バイオコンジュゲートが炎症誘発性サイトカインの分泌ならびにＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの発現を減少させることが発見される。さらに、これらのバイオコンジュゲートは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の存在下でさえ、内皮細胞の増殖および移動を増加させ、ＩＬ−６分泌および血管傷害マーカーの生成を減退させることができる。コラーゲン結合バイオコンジュゲートの投与によってもたらされるこれらの作用の一部または全ては、機能不全内皮での炎症の低減に寄与すると考えられる。
一部の実施形態では、内皮機能不全を患っている血管部位において炎症を予防または低減するための方法も提供される。本方法は、本開示の合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートを含む医薬組成物をその部位に投与することを伴う。
用語「内皮機能不全」は、「内皮細胞（ＥＣ）機能不全」、「機能不全内皮」または「機能不全内皮細胞」とも呼ばれる。内皮機能不全は、内皮細胞の細胞表面でのＩＣＡＭおよびＶＣＡＭ受容体またはセレクチン受容体のアンマスキングまたは曝露で判定することができる。Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、損傷および炎症のために細胞表面で一時的に発現され、機能不全内皮で慢性的に発現される、曝露されるセレクチン受容体の例である。
一部の実施形態では、内皮機能不全は、透過する内皮内膜または損傷を受けた内皮細胞で特徴付けられる。一部の実施形態では、内皮機能不全は、グリコカリックスの喪失によって特徴付けられる。一部の実施形態では、内皮機能不全は、内皮細胞の表面で発現され、循環に曝露されるセレクチンタンパク質によって特徴付けられる。一部の実施形態では、部位は炎症を患う。
一態様では、血管部位は物理的手段によって剥離されず、血管介入手順からの回復を受けていない。血管介入手順の非限定例には、経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）が含まれる。
「機能不全内皮細胞」または「内皮細胞（ＥＣ）機能不全」は、内皮細胞の細胞表面でのＩＣＡＭおよびＶＣＡＭ受容体ならびにセレクチン受容体のアンマスキングまたは曝露を意味する。Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、損傷および炎症のために細胞表面で一時的に発現され、機能不全内皮で慢性的に発現される、曝露されるセレクチン受容体の例である。慢性的機能不全内皮細胞による疾患状態の一例は、糖尿病である。
内皮細胞は機能的毛細管の維持に関与するので、内皮の機能不全は広域の疾患の発病で重要な役割を演ずる。
例えば、内皮は、末梢血管疾患、脳卒中、心疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓および重度のウイルス感染疾患に直接的に関与する（Rajendranら、Int. J. Biol. Sci.、９巻：１０５７〜１０６９頁、２０１３年）。
本明細書で使用する場合、「内皮機能不全に関連した疾患」は、内皮機能不全によって少なくとも一部引き起こされるかまたは内皮機能不全を誘導する、ヒト疾患または状態を指す。したがって、内皮機能不全に関連する疾患を治療することは、疾患の治療、機能不全内皮を回復する、または機能不全内皮から生じる状態もしくは症状、例えば炎症、内膜過形成および血栓形成を予防もしくは寛解することを指す。
本発明者は、コラーゲン結合バイオコンジュゲートを、ヒト患者の任意の器官に効果的に送達することができることを実証した。したがって、コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、器官のいずれかで起こり、以下の疾患または状態のいずれかに関連した内皮機能不全を治療するために使用することができる。
血管疾患。コラーゲン結合バイオコンジュゲートで好適に治療することができる血管疾患には、アテローム硬化性疾患（末梢動脈疾患、冠状動脈疾患、脳卒中、頸動脈疾患、腎臓動脈狭窄）、静脈血栓性疾患（深部または浅静脈血栓症）および医原性大血管傷害（血管形成術、ステント留置を伴う血管形成術、アテレクトミー、血栓摘出、透析アクセス生成、バイパスのための静脈採取、脳または大動脈瘤の治療）が限定されずに含まれる。
腎臓疾患。コラーゲン結合バイオコンジュゲートで好適に治療することができる腎臓疾患には、急性尿細管壊死、糖尿病性慢性腎不全、ループス腎炎、腎臓線維症および急性糸球体腎炎が限定されずに含まれる。
肺疾患。コラーゲン結合バイオコンジュゲートで好適に治療することができる肺疾患には、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患、喘息および気腫が限定されずに含まれる。
血液疾患。コラーゲン結合バイオコンジュゲートで好適に治療することができる血液疾患には、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）が限定されずに含まれる。
さらに、全身性硬化症などの皮膚疾患、リウマチ性疾患、例えば脈管炎障害（ループス）、関節リウマチおよび他の炎症性関節炎（痛風）、炎症性腸疾患を含む胃腸疾患、肝炎、および肝臓線維症、腫瘍増殖、腫瘍転移、ウイルスおよび細菌性敗血症を含む感染性疾患、多発性硬化症、認知症および筋萎縮性側索硬化症を含む神経性疾患、黄斑変性症、緑内障およびブドウ膜炎を含む眼科疾患、糖尿病などの内分泌疾患、ならびに複合領域疼痛症候群（ＣＲＰＳ）を、本開示のコラーゲン結合バイオコンジュゲートで治療することもできる。
バイオコンジュゲートは、治療する疾患および影響を受ける機能不全内皮の位置により最適化された治療のために、ペプチドの同一性、グリカンに付着するペプチドの数、およびＧＡＧ骨格の同一性に関して調整することができると考えられる。したがって、標的の作用を最適化するために、いくつかの分子設計パラメータを工学的に操作することができる。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、コラーゲン結合ペプチドが付着したデルマタン硫酸（ＤＳ）を含む。ＤＳは、上皮細胞の移動および増殖を促進するその能力のために有用である。
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートの他の変異体も、機能不全内皮で炎症を阻害することが可能であると考えられる。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、「ＳＩＬＹ」と呼ばれる
Figure 2018513879
 などのコラーゲン結合ペプチドを含む。
ｅ．組織接着
本発明の方法は、組織接着、例えば心臓、腹部または骨盤接着に関係する様々な適用において有用である。本発明の方法は、これらの持続的な欠陥または再発性の傷害を治療および／または予防するのに有用だろうと考えられる。
ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において腹部または骨盤接着を治療および／または予防する方法であって、器官の異様に露出した組織に医薬組成物を適用することを含む方法を提供する。一実施形態では、組成物は、そのグリカンに結合した約１から約８０個のコラーゲン結合ペプチドを有するグリカンを含むバイオコンジュゲートを含む。「露出した組織」は、正常で健康な条件下で見られる新しい環境に曝露される組織もしくは表面を、または、正常で健康な条件下の異なる器官の細胞もしくは組織に曝露されないが、疾患もしくは傷害により、または医療処置の間に曝露される組織（すなわち、異様に露出した組織」）を指すことができる。
接着は、通常は連結していない組織および／または器官に異常に結合する帯状の線維性瘢痕組織である。接着は、各種の傷害または組織障害、例えば、手術、外傷、感染症、化学療法、放射線、異物またはがんに応答して起こる。
腹部および骨盤接着は、腹部外科的処置の一般的な合併症である。腹部接着は、重度の臨床上の問題および／または疼痛を引き起こすことができる。例えば、腹部接着に関連した臨床上の問題には、小腸閉塞、続発性女性不妊症、異所性妊娠、慢性的腹部および骨盤疼痛、ならびに困難で危険な再手術を含めることができる（Diamond, M. P.、Freeman, M. L.、Eur. Soc. Human. Repro. Embryo.、２００１年；７巻（６号）：５６７〜５７６頁）。腹部接着は、通常は連結されていない組織および／または器官を繋ぎ、神経の牽引を引き起こすことによって、疼痛を引き起こすことができる。腸がふさがれると、膨張が疼痛を引き起こす。したがって、腹部接着は、腸管障害および腸の閉塞または遮断を引き起こすことができる。極度の場合には、腹部接着は、血流を抑え、組織死につながる線維帯を腸のセグメント周囲に形成することができる。
上記の臨床上の問題および／または疼痛を引き起こす腹部および骨盤接着の標準治療は、外科的介入である。しかし、外科的介入は、さらなる腹部接着およびさらなる合併症の危険を負う。したがって、それを必要とする患者において腹部接着を治療および／または予防するのに、腹部接着のための代替の治療および／または予防オプションが有益だろう。
一態様では、腹部の組織または器官への外傷は、腹部の組織および／または器官の間で線維組織帯の形成をもたらす。本明細書に記載される方法は、前記腹部接着を治療および／または予防するのに有用だろうと考えられる。
本明細書で提供される合成バイオコンジュゲートは、保護水和層を提供して疼痛を最小にし、腹部の組織および／または器官のコラーゲンを分解から保護し、上皮移動および上皮増殖を促進すると考えられる。
ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において腹部接着を治療および／または予防する方法であって、腹部器官の露出した組織に医薬組成物を適用することを含む方法を提供する。一実施形態では、組成物は、そのグリカンに結合した約１から約８０個のコラーゲン結合ペプチドを有するグリカンを含むバイオコンジュゲートを含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において腱−腱鞘接着を治療および／または予防する方法であって、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたは組成物を異様に露出した腱および／または腱鞘に適用することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において心臓接着を治療および／または予防する方法であって、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたは組成物を異様に露出した心臓組織に適用することを含む方法を提供する。
一部の態様では、組織は、手術、外傷、感染症、化学療法、放射線、異物またはがんのために曝露される。一態様では、組織は外科的に曝露される。
一部の態様では、組成物は噴霧剤として適用される。一部の態様では、組織は腹膜組織である。
本開示の組成物および方法は、例えば手または指の手術の間に、整形の接着を低減または予防するのに有用であると考えられてもいる。
一部の実施形態では、本方法は、組織を囲むメッシュの使用などの接着を低減または予防するのに、当技術分野で公知の他の方法をさらに含むことができる。
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、それを必要とする患者において、腹部組織および／または器官の細胞外マトリックス構成成分を標的にする合成バイオコンジュゲートを患者に投与することによって、腹部接着を治療および／または予防するために使用することができる。本明細書で提供される合成バイオコンジュゲートは、腹部組織の血管化を促進するために、ペプチドの同一性、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）骨格に付着するペプチドの数、およびＧＡＧ骨格の同一性に関して調整することができると考えられる。したがって、標的の作用を最適化するために、いくつかの分子設計パラメータを工学的に操作することができる。
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、組織接着を予防または低減するために、手術での付属物として使用することができる。手術中に、潜在的に接着原性である組織または器官に合成バイオコンジュゲートを送達することができる。そのような投与は、術後癒着を予防および／または低減するのを助けると考えられる。一実施形態では、この開示は、術後の癒着を減少または予防するための方法であって、本明細書で提供される合成バイオコンジュゲートを手術部位に送達することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、腹腔鏡下腹部手術などの腹部処置で有用である。さらなる実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、潜在的に接着原性である組織または器官に腹腔鏡によって送達することができる。合成バイオコンジュゲートＤＳ−ＳＩＬＹによる治療は、傷害区域に結合し、保護水和層を提供して疼痛を最小にし、腹部組織および／または器官のコラーゲンを分解から保護し、上皮移動および上皮増殖を促進することによって、腹部接着を治療および／または予防すると考えられる。ＤＳ−ＳＩＬＹは傷害区域で持続し、そのため、１日に複数回の治療は必要でないとさらに考えられる。
一実施形態では、ペプチドグリカンは、コラーゲン結合ペプチドが付着したデルマタン硫酸（ＤＳ）を含む。ＤＳは、上皮細胞の移動および増殖を促進するその能力のために腹部接着への適用で有用である。
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートの他の変異体も、Ｉ型コラーゲンへの結合を介して血小板活性化を阻害することが可能である。一実施形態では、提供される合成バイオコンジュゲートは、コラーゲン結合ペプチド（例えば、「ＳＩＬＹ」と呼ばれる
Figure 2018513879
 ）を介してペプチドグリカンのグリカン部分が傷害部位に繋がれることを可能にすることによって、腹部接着を治療および／または予防する。
別の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ヘパリン（Ｈｅｐ−ＳＩＬＹ）、デルマタン硫酸（ＤＳ−ＳＩＬＹ）またはデキストラン（Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ）を含むグリカンにコンジュゲートさせたコラーゲン結合ペプチド（例えば、ＳＩＬＹ）を含む。
本開示の組成物は、開腹手術中に、または腹腔鏡によって、または手術部位へのアクセスを可能にする任意の装置によって投与することができる。
ｆ．胃食道傷害
本開示は、一実施形態では、患者において胃食道傷害を治療または予防するための満たされていない必要に対処するための新しいアプローチを提供する。一般に、新しいアプローチは、傷害を受けた胃−食道組織または細胞に本開示の合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートを含む医薬組成物を適用することを伴う。
組成物のそのような適用は、合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートのコーティングを生成することができる。合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、物理的ペプチド−コラーゲン相互作用を介して、食道組織に曝露されたコラーゲンに結合することができる。コラーゲンに結合するとき、バイオコンジュゲートは、１）血小板付着／活性化の障壁として作用すること、２）ＭＭＰアクセスを阻害することによってコラーゲンを分解から保護すること、ならびに３）増殖因子ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７およびＦＧＦ−１０を隔離し、このように、内皮および上皮細胞の増殖および移動を促進し、組織の修復および回復に導くことを含むいくつかの機能を有する。
コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、一実施形態では、コラーゲン結合ペプチドが共有結合している多糖骨格を含む。合成バイオコンジュゲートは、コラーゲン上の血小板結合部位について競合し、血小板の結合および活性化を予防することができる。グリカン骨格は負に荷電して、水分子に結合することができ、血小板およびタンパク質接着を予防する親水性障壁をコラーゲン表面に生成する。正常な血小板機能を阻害するよりも、露出したコラーゲンをマスキングすることによって、バイオコンジュゲートは炎症および内膜過形成へのカスケードの初期ステップに対処する局所処置を提供することができる。
この新しいアプローチは、ＧＥＲＤまたは医原性介入によって引き起こされるものを非限定的に含む、胃食道傷害を治療するのに有用であると考えられる。以下のカテゴリーの患者がこのアプローチから恩恵を受けることができるとさらに考えられる：
−食道胃十二指腸鏡（ＥＧＤ）アブレーションを必要とするＧＥＲＤ関連の食道病変
−ＥＧＤ拡張を必要とする食道狭窄症
−ＥＧＤ治療を必要とする消化性潰瘍疾患（ＰＵＤ）。
医薬組成物（pharmaceutically composition）は、傷害を受けた胃−食道組織の１つまたは複数の病変に局所的に適用することができる。組織の限られたアクセス性を考慮すると、送達器具の使用が有益であると考えられる。例えば、組成物は、食道胃十二指腸鏡検査（ＥＧＤ）処置の間に、または食道胃十二指腸鏡を使用して送達することができる。
パリフェルミンは、口腔粘膜炎治療のために有用なケラチノサイト増殖因子である。本開示のバイオコンジュゲートはコラーゲンに結合し、パリフェルミンなどの内因性または外因性の増殖因子にも結合する。したがって、そのような製剤は、パリフェルミンの標的化送達を提供する。一部の実施形態では、この開示は、パリフェルミンを送達する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、それを必要とする患者にバイオコンジュゲートおよびパリフェルミンを含む組成物を適用することを含む。他の実施形態では、この開示は、患者において口腔粘膜炎を治療する方法であって、それを必要とする患者にバイオコンジュゲートおよびパリフェルミンを含む組成物を適用することを含む方法を提供する。
溶液で提供されるバイオコンジュゲートは、傷害を受けた胃−食道組織の回復を促進するために、ペプチドの同一性、グリカンに付着するペプチドの数、およびＧＡＧ骨格の同一性に関して調整することができると考えられる。したがって、標的の作用を最適化するために、いくつかの分子設計パラメータを工学的に操作することができる。
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、コラーゲン結合ペプチドが付着したデルマタン硫酸（ＤＳ）を含む。ＤＳは、上皮細胞の移動および増殖を促進するその能力のために有用である。
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートの他の変異体も、Ｉ型コラーゲンへの結合を介して血小板活性化を阻害することが可能である。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、「ＳＩＬＹ」と呼ばれる
Figure 2018513879
 などのコラーゲン結合ペプチドを含む。別の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ヘパリン（Ｈｅｐ−ＳＩＬＹ）、デルマタン硫酸（ＤＳ−ＳＩＬＹ）またはデキストラン（Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ）などのグリカンにコンジュゲートさせたコラーゲン結合ペプチド（ＳＩＬＹ）を含む。
さらに別の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび１から５つの分枝状コラーゲン結合ペプチド、例えば
Figure 2018513879
 を含む。
ｇ．創傷治癒
本明細書に記載される方法および組成物は、慢性創傷および急性創傷、結合組織での創傷、ならびに筋肉、骨および神経組織での創傷を含む、組織の完全性が損傷を受けた任意の状態を治療するために使用することができる。「創傷」には、本明細書で使用する場合、外科的切開、火傷、酸およびアルカリによる焼け、冷温火傷（凍傷）、日焼け、潰瘍、圧迫傷、切り傷、擦過傷、裂傷、物理的外傷によって引き起こされる創傷、先天性障害によって引き起こされる創傷、歯周部疾患によって引き起こされるかまたは歯科手術の後の創傷、ならびにがん組織または腫瘍に伴う創傷が含まれる。本明細書に記載されるように、創傷は、急性または慢性の創傷を含むことができる。
急性創傷はインタクトな皮膚への外部の損傷によって引き起こされ、外科的創傷、咬創、火傷、切り傷、裂傷、擦過傷などを含む。慢性創傷は、例えば、皮膚または上皮組織の完全性を損なう内因性機構、例えば、脚潰瘍、足潰瘍および圧迫傷によって引き起こされる創傷を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれでも、創傷治癒を促進するためのまたは瘢痕形成を減少させるための組成物は、慢性または急性の創傷を治療するためにいかなるときでも使用することができる。例えば、外科的切開に伴う急性創傷は、患者において創傷治癒を促進するおよび／または瘢痕形成（foraiation）を減少させるために、手術の前、手術中または手術の後に治療することができる。様々な例示的な態様では、本明細書に記載される組成物は、創傷治癒を促進するためおよび／または瘢痕形成を減少させるために、必要に応じて１用量または複数回用量で患者に投与することができる。
本明細書で使用する場合、「瘢痕形成を減少させること」は、瘢痕の極限引張強さの増加および／または可視的瘢痕長の減少を含む。本明細書で使用する場合、瘢痕形成の減少は、患者での瘢痕形成の完全な阻害、または可視的瘢痕化の完全な排除も含む。
本明細書で使用する場合、「創傷治癒を促進すること」は、慢性もしくは急性の創傷の部分的もしくは完全な治癒を引き起こすこと、または急性もしくは慢性の創傷によって引き起こされる症状のいずれかを低減することを意味する。そのような症状には、疼痛、出血、組織壊死、組織潰瘍化、瘢痕形成、および急性または慢性の創傷から生じることが公知の任意の他の症状が含まれる。
本明細書に記載される実施形態のいずれでも、創傷治癒を促進する方法が提供される。本方法は、患者にコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを投与するステップを含み、ここで、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは患者において創傷の治癒を促進する。本明細書に記載される様々な実施形態のいずれでも、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、異常なコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートであってもよく、またはコラーゲン原線維形成を通常は調節するバイオコンジュゲートのアミノ酸配列の一部へのアミノ酸相同性を有する、線維原性のコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートであってもよい。
本明細書に記載される実施形態のいずれでも、瘢痕形成を減少させる方法が提供される。本方法は、患者にコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを投与するステップを含み、ここで、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは患者において瘢痕形成を減少させる。本明細書に記載される様々な実施形態のいずれでも、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、異常なコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートであってもよく、またはコラーゲン原線維形成を通常は調節するバイオコンジュゲートのアミノ酸配列の一部へのアミノ酸相同性を有する、線維原性のコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートであってもよい。
本明細書に記載される実施形態のいずれでも、創傷治癒を促進するためのおよび／または瘢痕形成を減少させるための組成物は、綿、紙、不織布、織布および編物、単繊維、フィルム、ゲル、スポンジなどを含む、創傷への組成物の送達のために適する任意の材料に含浸させることができる。例えば、綿、紙、不織布、織布、編物、フィルムおよびスポンジの形の外科縫合糸（単繊維、撚り糸または編糸）、吸収性のパッド、経皮パッチ、包帯、火傷被覆帯および詰め物を使用することができる。
４．２ セレクチン、ＩＣＡＭ／ＶＣＡＭ結合バイオコンジュゲートの使用方法
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、内皮への血小板結合を阻害し、露出した上皮への血液中の他の細胞の結合を阻害し、血小板活性化を阻害し、血栓形成を阻害し、内皮が剥離されることからもたらされる炎症を阻害し、内膜過形成を阻害し、および／または血管痙攣を阻害するために使用することができる。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、内皮細胞増殖を刺激することもでき、血管の表面に結合することもできる。これらの実施形態のいずれでも、これらの前記の作用は、カテーテルをベースとした手順などの血管介入手順の間に起こることができる。これらの実施形態のいずれでも、少なくとも１つのＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン結合単位を有するペプチドを含む上記のバイオコンジュゲートのいずれも使用することができる。
本開示は、一実施形態では、内皮機能不全に関連した疾患を患っている患者を治療するための組成物および方法を提供する。本開示は、内皮への血小板結合、血小板活性化、血栓形成、内皮が剥離されることからもたらされる炎症、内膜過形成および／もしくは血管痙攣の１つまたは複数を阻害すること、または、それを必要とする患者に本明細書で提供される組成物の有効量を投与することを含む、内皮細胞増殖の刺激もしくは剥離した血管への結合におけるその有効性にも関する。
本明細書で提供されるＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン結合バイオコンジュゲートは、急性および慢性疾患の両方で、内皮機能不全または傷害の炎症性影響を低減することができる。そのようなコンジュゲートは、機能不全内皮への血小板結合を阻害または低減し、したがって、血小板媒介炎症を低減すると考えられる。炎症は、血小板−血小板結合、血小板−白血球結合、白血球漏出の促進、または単に局所および領域性サイトカインの血小板からの放出などの血小板過程を通して、活性化される可能性がある。
一部の実施形態では、内皮機能不全を患っている血管部位において炎症を予防または低減するための方法も提供される。本方法は、本開示のＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン結合バイオコンジュゲートを含む医薬組成物をその部位に投与することを伴う。
本明細書に記載されるように、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン結合バイオコンジュゲートは、血流に曝露される内皮セレクチンおよびＩＣＡＭ／ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン受容体を標的にし、ここで、それらは剥離した内皮への血小板結合を予防するのに十分な量の時間結合したままであることができ、その結果として、血小板活性化、血栓形成、内皮が剥離されることからもたらされる炎症、内膜過形成および血管痙攣を予防することができる。したがって、これらのバイオコンジュゲートは、機能不全内皮細胞でセレクチンまたはＩＣＡＭ／ＶＣＡＭの生成を阻害することによって、炎症応答を阻害することができる。
用語「内皮機能不全」は、「内皮細胞（ＥＣ）機能不全」、「機能不全内皮」または「機能不全内皮細胞」とも呼ばれる。内皮機能不全は、内皮細胞の細胞表面でのＩＣＡＭおよびＶＣＡＭ受容体またはセレクチン受容体のアンマスキングまたは曝露で判定することができる。Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、損傷および炎症のために細胞表面で一時的に発現され、機能不全内皮で慢性的に発現される、曝露されるセレクチン受容体の例である。
一部の実施形態では、内皮機能不全は、透過する内皮内膜または損傷を受けた内皮細胞で特徴付けられる。一部の実施形態では、内皮機能不全は、グリコカリックスの喪失によって特徴付けられる。一部の実施形態では、内皮機能不全は、内皮細胞の表面で発現され、循環に曝露されるセレクチンタンパク質によって特徴付けられる。一部の実施形態では、部位は炎症を起こす。
本明細書で使用する場合、「内皮機能不全に関連した疾患」は、内皮機能不全によって少なくとも一部引き起こされるかまたは内皮機能不全を誘導する、ヒト疾患または状態を指す。したがって、内皮機能不全に関連する疾患を治療することは、疾患の治療、機能不全内皮を回復すること、または機能不全内皮から生じる状態もしくは症状、例えば炎症、内膜過形成および血栓形成を予防もしくは寛解することを指す。
開示されるように、一部の実施形態では、バイオコンジュゲートは、炎症性疾患を治療、阻害または軽減させるために機能不全内皮細胞を阻害することができる。機能不全内皮細胞は、Ley、「The role of selectins in inflammation and disease」、９巻、Elsevier Science（２００３年）によって立証されているように、炎症および他の炎症性疾患と関連する。他の炎症性疾患および自己免疫性疾患の例には、アテローム硬化症、冠状動脈疾患、真性糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、緑内障、尿毒症、敗血症および臓器不全が含まれる。
セレクチン受容体の生成を阻害し、ＶＣＡＭ／ＩＣＡＭ受容体をマスキングすることによって、これらの一時的または慢性的疾患を患っている患者を治療するためにバイオコンジュゲートを使用することができる。これらの疾患の阻害または軽減に関連したセレクチン阻害の証拠は、Ridingsら、「A dual-binding antibody to E- and L-selectin attenuates sepsis-induced lung injury」、１５２巻、American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine、（１９９５年）、Weyrichら、「In Vivo Neutralization of P-Selectin Protects Feline Heart and Endothelium in Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury」、９１巻、The American Society for Clinical Investigation、（１９９３年）で裏付けされており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。一部のがんは炎症および慢性炎症に関連することも当技術分野で公知であり、したがって、腫瘍性細胞増殖を治療し、阻害し、または軽減させるために、バイオコンジュゲートを使用することができる。
例証的実施形態では、本開示のＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよび／またはセレクチン結合バイオコンジュゲートは、例えば、剥離した内皮への血小板結合、血小板活性化、血栓形成、内皮が剥離されることからもたらされる炎症、内膜過形成および血管痙攣のいずれか１つまたはその組合せを予防することを含む、血管介入手順で使用することができる。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、機能不全内皮細胞でセレクチンまたはＩＣＡＭ／ＶＣＡＭの生成を阻害することによって、炎症応答を阻害することもできる。
一実施形態では、上記の方法で使用されるバイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５から約１５ペプチドを含み、ペプチドは、
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 の少なくとも１つの配列、および
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。一実施形態では、グリカンはデルマタン硫酸である。
４．３ ヒアルロン酸結合バイオコンジュゲートの使用方法
ａ．軟骨代用
本明細書に記載される一実施形態では、生体材料軟骨代用組成物のための添加剤が提供される。添加剤は、既存の生体材料軟骨代用材料への添加のためのヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートを含む。ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートの以前に記載された実施形態は、本明細書に記載される添加剤に適用可能である。
本明細書で使用する場合、「既存の生体材料軟骨代用材料」というフレーズは、体において損傷を受けた、欠陥のある、または欠落した軟骨の代用のために利用することができる、生体適合性の組成物を意味する。各種の既存の生体材料軟骨代用組成物が当技術分野で周知であり、企図されている。例えば、既存の生体材料軟骨または骨の代用組成物には、ＤｅＮｏｖｏ（登録商標）ＮＴ天然組織グラフト（Ｚｉｍｍｅｒ）、ＭａｉｏＲｅｇｅｎ（商標）（ＪＲＩ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、またはＢｉｏｍｅｔによって生産される低温保存された骨関節組織のコレクションが含まれる。
一実施形態では、生体材料または骨の軟骨代用物を調製する方法が提供される。本方法は、合成バイオコンジュゲートと既存の生体材料または骨の軟骨代用材料を組み合わせるステップを含む。ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートの以前に記載された実施形態は、本明細書に記載される方法に適用可能である。
一実施形態では、患者の関節炎の治療方法が提供される。本方法は、患者にヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートを投与するステップを含み、ここで、合成バイオコンジュゲートは関節炎に関連する１つまたは複数の症状を低下させる。ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートの以前に記載された実施形態は、本明細書に記載される方法に適用可能である。
様々な実施形態では、関節炎の治療方法で使用される合成バイオコンジュゲートは、関節炎に関連した１つまたは複数の症状を低下させる。疼痛、硬直、圧痛、炎症、腫脹、発赤、ほてりおよび可動性の低下を非限定的に含む、様々な症状が関節炎に関連することが当分野で公知である。関節炎の症状は、関節、腱または体の他の部分に存在してもよい。本明細書で使用する場合、「低下させる」は、関節炎の症状を予防する、または完全もしくは部分的に緩和することを意味する。
様々な実施形態では、関節炎は変形性関節炎または関節リウマチである。変形性関節炎および関節リウマチの病因および臨床症状は、当技術分野で周知である。この方法の一実施形態では、合成バイオコンジュゲートは、投与の後に潤滑剤として作用するか、または軟骨の喪失を予防する。別の実施形態では、合成バイオコンジュゲートは、患者において骨の接合を予防する。例えば、合成バイオコンジュゲートは、軟骨が減少したかまたは損傷を受けた患者において、骨同士の関節接合を阻害する。
一実施形態では、患者においてＥＣＭ構成成分の分解を低減または予防する方法が提供される。例えば、患者の軟骨においてＥＣＭ構成成分の分解を低減または予防する方法が提供される。本方法は、患者にヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートを投与することを含む。ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートの以前に記載された実施形態は、本明細書に記載される方法に適用可能である。一実施形態では、合成バイオコンジュゲートは、マトリックスメタロプロテアーゼ、例えばアグレカナーゼに耐性である。
別の実施形態では、患者においてヒアルロン酸の分解を低減または予防する方法が提供される。本方法は、患者にヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートを投与することを含む。ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートの以前に記載された実施形態は、本明細書に記載される方法に適用可能である。
別の実施形態では、コラーゲンの分解を低減または予防する方法が提供される。本方法は、コラーゲンの存在下でヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートをヒアルロン酸と接触させるステップ、およびコラーゲン分解を低減または予防するステップを含む。ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートの以前に記載された実施形態は、本明細書に記載される方法に適用可能である。
別の実施形態では、コンドロイチン硫酸の分解を低減または予防する方法が提供される。本方法は、コラーゲンの存在下でヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートをヒアルロン酸と接触させるステップ、およびコンドロイチン硫酸の分解を低減または予防するステップを含む。ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートの以前に記載された実施形態は、本明細書に記載される方法に適用可能である。
「ＥＣＭ構成成分の分解を低減する」、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンまたはコンドロイチン硫酸の分解を低減するは、それぞれヒアルロン酸、コラーゲンまたはコンドロイチン硫酸の分解を完全に、または部分的に低減することを意味する。
一実施形態では、患者において「ヒアルロン酸の分解を低減する」は、ヒアルロン酸の分解速度を低下させることを意味する。一実施形態では、「コラーゲン分解を低減する」は、コラーゲンの分解速度を低下させることを意味する。一実施形態では、「コンドロイチン硫酸の分解を低減する」は、コンドロイチン硫酸の分解速度を低下させることを意味する。
本明細書に記載される一実施形態では、患者において組織の欠陥を補正または修正するための方法が提供される。本方法は組織欠陥にヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートを投与することを含み、ここで、欠陥は補正または修正される。ヒアルロン酸結合合成バイオコンジュゲートの以前に記載された実施形態は、本明細書に記載される方法に適用可能である。一実施形態では、組織欠陥は、美容上の欠陥である。
一実施形態では、上述の方法で使用されるバイオコンジュゲートは、コンドロイチン硫酸および約５から約１０ペプチドを含み、ペプチドは、ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲ（配列番号５８）またはＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＳＧ（配列番号３５７）の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してコンドロイチン硫酸に結合している。
４．４ 他
ａ．角膜創傷
本発明の方法は、角膜創傷の治癒に関する様々な適用において有用である。一実施形態では、治療を必要とする角膜創傷状態は、角膜への外傷の結果である（Chiapella, A. P.、Rosenthal, A. R.、British Journal of Ophthalmology、１９８５年；６９巻：８６５〜８７０頁）。別の実施形態では、治療を必要とする創傷状態は眼科的処置によって引き起こされ、例えば、Ｅｐｉ−Ｌａｓｉｋは角膜損傷を誘導する（Tuft, S.J.ら、Br J Ophthalmol.１９９３年；７７巻：２４３〜２４７頁）。一部の場合には、持続的な欠陥または再発性の傷害が、治癒の欠如または不完全な治癒のために起こることができる（Kenyon, K. R.、Cornea and Refractive Atlas of Clinical Wisdom. S.A. MelkiおよびM. A. Fava編. SLACK, Inc.：New Jersey、US、２０１１年；３９頁）。本発明の方法は、これらの持続的な欠陥または再発性の傷害を治療するのに有用だろうと考えられる。
一態様では、角膜上皮への傷害は角膜障壁機能の侵害をもたらし、本明細書に記載される方法が前記傷害を治療するのに有用だろうと考えられる。
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、それを必要とする患者において、角膜創傷治癒に関係している特異的細胞外マトリックス構成成分を標的にする合成バイオコンジュゲートを患者に投与することによって、角膜創傷治癒を促進するために使用することができる。本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、角膜創傷治癒を促進するために、ペプチドの同一性、グリカンに付着するペプチドの数、およびグリカンの同一性に関して調整することができると考えられる。したがって、標的の作用を最適化するために、いくつかの分子設計パラメータを工学的に操作することができる。
デルマタン硫酸およびコラーゲン結合ペプチド（例えば、「ＳＩＬＹ」と呼ばれるＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号１））を含むバイオコンジュゲートによる治療は、傷害区域に結合し、疼痛を最小にするために保護水和層を提供し、角膜コラーゲンを分解から保護し、および／または上皮移動および／または上皮増殖を促進することによって、角膜創傷（would）治癒を増強すると考えられる。バイオコンジュゲートは傷害区域で持続し、そのため、１日に複数回の治療は必要でないとさらに考えられる。
ｂ．ルブリシン模倣体
本明細書に記載される合成バイオコンジュゲートは、軟骨、滑液および硝子体液などのコラーゲンおよびヒアルロン酸の両方を有する組織を置き換え、復活させ、または補充するのに有用であり得る。特に、コラーゲン結合およびヒアルロン酸結合ペプチドを有するペプチドグリカンは、ルブリシン模倣体として、ならびに下記の方法および用途で特に有用であり得る。
軟骨変性。関節軟骨のよく潤滑された表面は、滑膜関節の最適な機能性につながる。しかし、変形性関節炎で起こるように、潤滑の低下は軟骨の崩壊およびフィブリル化をもたらし、それは関節機能不全および疼痛に次に寄与する。潤滑の低下は、関節リウマチを含む他の形の関節炎での関節機能不全および疼痛にもつながる。
本明細書で提供される合成バイオコンジュゲートは、動物関節の内面に並んだ組織によって分泌される粘液性糖タンパク質、ルブリシンの機能のいくつかを模倣するために使用することができる。したがって、合成バイオコンジュゲートは、関節軟骨表面の潤滑を増強し、それによって軟骨の摩耗誘導浸食を低減する能力を有する。合成バイオコンジュゲートは、ヒアルロン酸およびＩＩ型コラーゲンなどの巨大分子を酵素誘導分解から保護する能力も有する。
したがって、患者において軟骨変性を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に本明細書に記載される細胞外マトリックス結合合成バイオコンジュゲートを含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、患者は、細胞外マトリックス結合合成バイオコンジュゲートを含む医薬組成物を滑膜空に注入することによって治療される。
合成バイオコンジュゲートは、関節軟骨マトリックスを外傷性のおよびサイトカイン誘導酵素分解から保護することによって、関節軟骨疾患を治療および／または予防するために使用することができると考えられてもいる。
硝子体液変性。硝子体液は、目の後部空洞を満たす、粘弾性のゲル様物質である。硝子体代用物は、例えば、硝子体の不透明化または物理的崩壊および液化が起こった場合に、ならびに網膜手術の間の一時的または恒久的な硝子体代用物として、機能不全の硝子体液を置き換えるために使用されてきた。適する硝子体代用物は透明で、生体適合性であるべきで、天然の硝子体に近い密度および屈折率を有するべきである。
したがって、患者において硝子体液変性を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に本明細書に記載される細胞外マトリックス結合合成バイオコンジュゲートを含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
髄核変性。髄核は、椎間板に存在するゲル様物質であり、圧縮荷重の下で水圧を各円板の中の全ての方向に分散する機能を果たし、軟骨細胞様細胞、コラーゲン原線維、およびヒアルロン酸鎖を介して凝集するバイオコンジュゲートアグレカンで構成される。髄核の変性は、荷重を椎体の間に均一および効率的に伝えるディスクの能力の低下をもたらし、線維輪として公知であるディスクの輪状領域の損傷につながる。輪での亀裂または断裂は、ヘルニアになるかまたは破裂するディスクになり、ディスクの領域の神経の侵害および最終的に腰痛または脚痛をもたらす。
髄核だけを置き換える試みも実行されている。髄核の置換は、関連する疼痛を含む変性過程が延期または予防され、脊椎骨セグメントに機械的機能が回復されるように、変性した核の初期の脱水を止め、ディスクを完全に水和した状態に戻すことが予想される。
本明細書に記載される合成バイオコンジュゲートは、線維輪に結合して保護すると考えられる。したがって、患者において線維輪の変性を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に本明細書に記載される細胞外マトリックス結合合成バイオコンジュゲートを含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。したがって、患者において髄核の変性を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に本明細書に記載される細胞外マトリックス結合合成バイオコンジュゲートを含む医薬組成物を投与することを含む方法も提供される。
一実施形態では、上述の方法で使用されるバイオコンジュゲートは、コンドロイチン硫酸および約１から約２０ペプチドを含み、ここで、ペプチドは、
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列、および
Figure 2018513879
 の少なくとも１つの配列を含む。
一実施形態では、上述の方法で使用されるバイオコンジュゲートは、コンドロイチン硫酸および約１から約２０ペプチドを含み、ここで、ペプチドは、
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 の少なくとも１つの配列、および
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 の少なくとも１つの配列を含む。
５．組成物
一実施形態では、バイオコンジュゲートは組成物中で投与される。本開示は、バイオコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。水または生理食塩水を含む、当業技術者に公知である薬学的に許容される担体を使用することができる。当技術分野で公知であるように、構成成分ならびにそれらの相対量は使用目的および送達方法によって決定される。組成物で用いられる希釈剤または担体は、それらがバイオコンジュゲートの所望の効果を減らさないように選択することができる。適する組成物の例には、水溶液、例えば、等張性生理食塩水、５％グルコース中の溶液が含まれる。アルコール、グリコール、エステルおよびアミドなどの他の周知の薬学的に許容される液体担体を用いることができる。ある特定の実施形態では、組成物は１つまたは複数の賦形剤、例えば、イオン強度改変剤、溶解性増強剤、糖、例えばマンニトールもしくはソルビトール、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、安定化ポリマー、保存剤および／または共溶媒を限定されずにさらに含む。
ある特定の実施形態では、組成物は水溶液である。製剤の容易さ、ならびに溶液を注ぐことによってそのような組成物を容易に投与する能力に基づき、水溶液は組成物製剤で使用するのに適する。ある特定の実施形態では、組成物は、懸濁剤、粘性もしくは半粘性のゲル剤、または他のタイプの固体もしくは半固体の組成物である。一部の実施形態では、組成物は、フォーム剤、軟膏剤、液体洗浄剤、ゲル剤、噴霧剤およびリポソーム剤の形であり、それらは当技術分野で周知である。あるいは、局所投与は、ポンプ−カテーテル系、連続的もしくは選択的放出器具または接着障壁から選択される器具による、治療部位への提供されたバイオコンジュゲートの注入である。ある特定の実施形態では、組成物は、静脈または動脈の内壁に直接的に適用されるかまたは接触する溶液である。一部の実施形態では、組成物はポリマーマトリックスを含む。他の実施形態では、組成物は被吸収性である。ある特定の実施形態では、組成物はｐＨ緩衝剤を含む。一部の実施形態では、組成物は、潤滑増強剤を含有する。
ある特定の実施形態では、組成物のための薬学的に許容される担体または支持体として、ポリマーマトリックスまたはポリマー材料が用いられる。本明細書に記載されるポリマー材料は、天然または非天然のポリマー、例えば、糖、ペプチド、タンパク質、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、イオン性および非イオン性の水溶性ポリマー；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリビニルアルコール；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマーまたは天然および合成の他のポリマー剤を含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、フィルム、ゲル剤、フォーム剤またはおよび他の剤形として製剤化される。
適するイオン強度改変剤には、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、グルコース、デキストロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび他の電解質が含まれる。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートの溶解性を増強する必要があり得る。そのような場合、溶解性は、適当な製剤技術、例えば、マンニトール、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポロキサマー（poloxomer）および当技術分野で公知である他のものなどの溶解性増強組成物の組込みなどを用いて高めることができる。
ある特定の実施形態では、組成物は、潤滑増強剤を含有する。本明細書で使用する場合、潤滑増強剤は、薬学的に許容される担体の粘度を改変することが可能な１つまたは複数の薬学的に許容されるポリマー材料を指す。適するポリマー材料には、限定されずに以下のものが含まれる：イオン性および非イオン性水溶性ポリマー；ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸およびその塩、デキストラン、ゼラチン、キトサン、ゲラン、他のバイオコンジュゲートまたは多糖、またはその任意の組合せ；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびエーテル化セルロース；コラーゲンおよび改変されたコラーゲン；ガラクトマンナン、例えばグアーガム、イナゴマメガムおよびタラガム、ならびに上述の天然ガム、および主な構造的構成成分としてマンノースおよび／またはガラクトース部分を含有する類似の天然または合成ガム（例えば、ヒドロキシプロピルグアー）に由来する多糖；トラガカントガムおよびキサンタンガムなどのガム；ゲランガム；アルギネートおよびアルギン酸ナトリウム；キトサン；ビニルポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリビニルアルコール；カルボキシビニルポリマーまたは架橋アクリル酸ポリマー、例えば、ポリマーの「カルボマー」ファミリー、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）商標の下で市販されているカルボキシポリアルキレン；ならびに様々な他の粘性または粘弾性物質。一実施形態では、潤滑増強剤は、ヒアルロン酸、デルマタン、コンドロイチン、ヘパリン、ヘパラン、ケラチン、デキストラン、キトサン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジノン、ポビドン、カルボマー９４１、カルボマー９４０、カルボマー９７１Ｐ、カルボマー９７４Ｐ、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。一実施形態では、潤滑増強剤は、バイオコンジュゲートと並行して適用される。あるいは、一実施形態では、潤滑増強剤は、バイオコンジュゲートに続いて適用される。一実施形態では、潤滑増強剤はコンドロイチン硫酸である。一実施形態では、潤滑増強剤はヒアルロン酸である。潤滑増強剤は、組成物の粘度を変えることができる。
上記の潤滑増強剤の構造、化学的特性および物理的特性に関するさらなる詳細に関しては、例えば、米国特許第５，４０９，９０４号、米国特許第４，８６１，７６０号（ゲランガム）、米国特許第４，２５５，４１５号、米国特許第４，２７１，１４３号（カルボキシビニルポリマー）、国際公開第９４／１０９７６号（ポリビニルアルコール）、国際公開第９９／５１２７３号（キサンタンガム）および国際公開第９９／０６０２３号（ガラクトマンナン）を参照されたい。一般的に、製剤の所望のｐＨの達成を容易にするために、非酸性潤滑増強剤、例えば中性または塩基性の薬剤が用いられる。
一部の実施形態では、バイオコンジュゲートは、無機物、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（アスコルビン酸など）、またはラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチンもしくはアグレカン、または上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータもしくは線維芽細胞増殖因子などの増殖因子、ならびに糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン、または粘弾性改変剤、例えばイオン性および非イオン性水溶性ポリマー；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリビニルアルコール；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマーまたは天然および合成の他のポリマー剤と組み合わせることができる。
本明細書の組成物で使用するのに適するｐＨ緩衝剤には、例えば、酢酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸およびリン酸緩衝液、ならびに塩酸、水酸化ナトリウム、酸化マグネシウム、リン酸一カリウム、重炭酸塩、アンモニア、炭酸、塩酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、リン酸水素二ナトリウム、ホウ砂、ホウ酸、水酸化ナトリウム、ジエチルバルビツール酸およびタンパク質、ならびに様々な生体緩衝液、例えば、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩またはＭＥＳが含まれる。ある特定の実施形態では、保管条件下のｐＨドリフトを予防するために、適当な緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）が組成物に追加される。一部の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（すなわち、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび、一部の製剤では、塩化カリウムおよびリン酸カリウムを含有する）である。用いられる薬剤によって、特定の濃度は異なる。ある特定の実施形態では、約ｐＨ４から約ｐＨ８、または約ｐＨ５から約ｐＨ８、または約ｐＨ６から約ｐＨ８、または約ｐＨ７から約ｐＨ８の範囲内にｐＨを維持するために、ｐＨ緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）が追加される。一部の実施形態では、約ｐＨ４から約ｐＨ８の範囲内にｐＨを維持するように緩衝液が選択される。一部の実施形態では、ｐＨは約ｐＨ５から約ｐＨ８である。一部の実施形態では、緩衝液は生理食塩水緩衝液である。ある特定の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ４から約ｐＨ８、または約ｐＨ３から約ｐＨ８、または約ｐＨ４から約ｐＨ７である。一部の実施形態では、組成物は、ポリマーマトリックス、ｐＨ緩衝剤、潤滑増強剤およびバイオコンジュゲートを含むフィルム、ゲル剤、パッチ剤または液体溶液の形であり、ここで、組成物は保存剤を任意選択で含有し；前記組成物のｐＨは、約ｐＨ４から約ｐＨ８の範囲内にある。
バイオコンジュゲートのより高い濃度を送達するために、組成物で界面活性剤が用いられる。界面活性剤は、阻害剤を可溶化し、コロイド分散液、例えばミセル溶液、マイクロエマルジョン、乳剤および懸濁剤を安定させる機能を果たす。適する界面活性剤は、ｃポリソルベート、ポロキサマー、ポリオシル４０ステアレート、ポリオキシルヒマシ油、チロキサポール、トリトンおよびソルビタンモノラウレートを含む。一実施形態では、界面活性剤は１２．４から１３．２の範囲内の親水性／親油性／バランス（ＨＬＢ）を有し、ＴｒｉｔｏｎＸ１１４およびチロキサポールなどの眼科使用に許容される。
ある特定の実施形態では、安定化ポリマー、すなわち、緩和剤が組成物に追加される。安定化ポリマーは、イオン性／荷電した例であるべきであり、より具体的には物理的安定性のために（−）１０〜５０ｍＶのゼータ電位を示すことができる負電荷をその表面に有し、水中で分散液を形成することが可能な（すなわち、水溶性の）ポリマーであるべきである。一実施形態では、安定化ポリマーは、約０．１％から約０．５％ｗ／ｗの範囲の、カルボマーおよびＰｅｍｕｌｅｎ（登録商標）、特にカルボマー９７４ｐ（ポリアクリル酸）などの架橋ポリアクリレートのファミリーからの、高分子電解質または１つを超えるならば複数の高分子電解質を含む。
一実施形態では、組成物は、血管の細胞外マトリックスへのバイオコンジュゲートの透過性を増加させる薬剤を含む。好ましくは、透過性を増加させる薬剤は、塩化ベンザルコニウム、サポニン、脂肪酸、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、脂肪酸のアルキルエステル、ピロリドン、ポリビニルピロリドン、ピルビン酸、ピログルタミン酸またはそれらの混合物から選択される。
エンドトキシンおよび感染因子を限定されずに含む望ましくない混在物質を除去するために、バイオコンジュゲートを滅菌することができる。バイオコンジュゲートの構造および生体向性（biotropic）特性に悪影響を与えない滅菌技術を、使用することができる。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、プロピレンオキシドもしくはエチレンオキシド処理、濾過滅菌法、ガスプラズマ滅菌、ガンマ線放射、電子ビームおよび／または過酢酸などの過酸による滅菌を含む、従来の滅菌技術を使用して消毒および／または滅菌することができる。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つまたは複数の滅菌過程にかけることができる。あるいは、バイオコンジュゲートは、プラスチックラップまたはホイルラップを含む任意のタイプの容器で包むことができ、さらに滅菌することができる。
一部の実施形態では、使用中の微生物汚染を予防するために、組成物に保存剤が追加される。組成物に追加されるのに適する保存剤は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、アルキルパラベン、安息香酸アルキル、クロロブタノール、クロロクレソール、セチルアルコール、ヘキサデシルアルコールなどの脂肪アルコール、水銀の有機金属化合物、例えば酢酸塩、硝酸もしくはホウ酸フェニル水銀、ジアゾリジニル尿素、アジピン酸ジイソプロピル、ジメチルポリシロキサン、ＥＤＴＡの塩、ビタミンＥおよびその混合物を含む。ある特定の実施形態では、保存剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、臭化ベンゾドデシニウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸（edentate）二ナトリウム、ソルビン酸またはポリクオタニウム−１から選択される。ある特定の実施形態では、組成物は保存剤を含む。一部の実施形態では、保存剤は約０．００１ｗ／ｖ％から約１．０ｗ／ｖ％のレベルで用いられる。ある特定の実施形態では、組成物は保存剤を含有せず、「保存剤無添加」と呼ばれる。一部の実施形態では、単位用量組成物は無菌であるが、保存剤無添加である。
一部の実施形態では、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤の別個のまたは逐次的な投与が、組成物の送達を容易にするのに必要である。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤は、異なる投薬頻度または間隔で投与することができる。例えば、バイオコンジュゲートは毎日投与することができるが、他の薬剤はより低い頻度で投与することができる。さらに、当業者にとって明らかであるように、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤は、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与されてもよい。
バイオコンジュゲートを投与するための任意の効果的レジメンを、使用することができる。例えば、バイオコンジュゲートは、単一の用量または複数回用量の日ごとのレジメンとして投与することができる。さらに、変則的レジメン、例えば、１週につき１〜５日を、日ごとの治療に代わるものとして使用することができる。
様々な実施形態では、バイオコンジュゲートは、フィルム、ゲル剤、パッチ剤または液体溶液剤などにより、局所的に投与することができる。実施形態の一部では、提供される組成物は、緩衝された無菌の水溶液中にある。ある特定の実施形態では、溶液剤は、約１から約１００センチポアズ（ｃｐｓ）、または約１から約２００ｃｐｓ、または約１から約３００ｃｐｓ、または約１から約４００ｃｐｓの粘度を有する。一部の実施形態では、溶液剤は、約１から約１００ｃｐｓの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液剤は、約１から約２００ｃｐｓの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液剤は、約１から約３００ｃｐｓの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液剤は、約１から約４００ｃｐｓの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液剤は、注射可能な液体溶液の形である。他の実施形態では、組成物は、粘性液体として、すなわち、数百から数千ｃｐｓの粘度のゲル剤または軟膏剤として製剤化される。これらの実施形態では、バイオコンジュゲートは、適当な薬学的に許容される担体に分散または溶解される。
カテーテルに基づく送達のためのバイオコンジュゲート用の例示的組成物は：ａ）本明細書に記載される合成バイオコンジュゲート；ｂ）薬学的に許容される担体；ｃ）ポリマーマトリックス；ｄ）約ｐＨ４から約ｐＨ８の範囲内のｐＨを提供するｐＨ緩衝剤；およびｅ）全式量の約０．２５％から約１０％の濃度範囲内の水溶性潤滑増強剤、または任意の個々の構成成分ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）、またはａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）の任意の組合せを含むことができる。
例示的な製剤は、ａ）本明細書に記載されるバイオコンジュゲート；ｂ）薬学的に許容される担体；ｃ）ポリマーマトリックス；およびｄ）約ｐＨ４から約ｐＨ８の範囲内のｐＨを提供するｐＨ緩衝剤を含むことができ、ここで、前記溶液は、液体溶液に関して約３から約３０ｃｐｓの粘度を有する。
本開示によって企図される例示的な組成物は、ゴマ油、トウモロコシ油、綿実油または落花生油、ならびにエリキシル剤、マンニトール、デキストロースまたは無菌の水溶液、および類似の医薬ビヒクルと一緒の水または油の懸濁液または乳剤を含め、注射による投与のためであってもよい。生理食塩水中の水溶液も注射のために従来使用されるが、本開示との関連ではより好ましくない。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど（および、その適する混合物）、シクロデキストリン誘導体、および植物油を用いることもできる。例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物活動の防止は、様々な抗細菌性および抗かび剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされることができる。
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分と一緒に、適当な溶媒に構成成分を必要な量で組み込み、続いて濾過滅菌を実施することによって調製される。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および上に列挙されるものから必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクルに、様々な滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合は、好ましい調製法は、前もって滅菌濾過したその溶液から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末を与える、減圧乾燥および凍結乾燥技術である。
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを含む医薬組成物の作製では、有効成分は賦形剤もしくは担体によって通常希釈され、および／またはカプセル、サシェ、紙または他の容器の形であってよいそのような担体の中に封入される。賦形剤が希釈剤としての役目をするとき、それは固体、半固体または液体の材料（上記のように）であってよく、それは有効成分のためのビヒクル、担体または媒体の働きをする。したがって、組成物は、例えば、最大で１０重量％の活性化合物を含有する、フィルム、ゲル剤、パッチ剤、散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアゾール剤（固体として、または液体媒体中の）、軟膏剤、ソフトおよびハードのゼラチンフィルム、ゲル剤、パッチ剤、無菌の注射可能な溶液剤および無菌の散剤包の形であってよい。
適する賦形剤の一部の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、無菌水、シロップおよびメチルセルロースが含まれる。製剤は：滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；保存剤、例えばメチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート；甘味料；ならびに着香剤をさらに含むことができる。
薬物送達のために使用されるフィルムは当技術分野で周知であり、溶脱可能な不純物、例えば多糖（例えば、セルロース、マルトデキストリンなど）を欠く無毒の非刺激性のポリマーを含む。一部の実施形態では、ポリマーは親水性である。他の実施形態では、ポリマーは疎水性である。フィルムは、それが適用される組織に接着し、約１週間にわたって体内に徐々に吸収される。本明細書に記載される薄膜剤形で使用されるポリマーは被吸収性であり、当技術分野で周知のように、十分な剥離、剪断および引張強度を示す。一部の実施形態では、フィルムは注射可能である。ある特定の実施形態では、フィルムは、外科的介入の前、その間または後に患者に投与される。
本明細書で、ゲルは、ソフトおよび弱いからハードおよび丈夫までの範囲内の特性を有することができる、固体のゼリー状の材料を指すために使用される。当技術分野で周知であるように、ゲルは、流体によってその全体積に拡大される非流体のコロイド状ネットワークまたはポリマーネットワークである。ヒドロゲルは、水が分散媒体であるコロイド状ゲルとして時々見出される、親水性のポリマー鎖のネットワークを含むゲルのタイプである。ヒドロゲルは高度に吸収性であり、例えば、高い程度の水、例えば９０％を超える水を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるゲルは、天然または合成のポリマーネットワークを含む。一部の実施形態では、ゲルは親水性ポリマーマトリックスを含む。他の実施形態では、ゲルは疎水性ポリマーマトリックスを含む。一部の実施形態では、ゲルは、天然の組織と非常に類似している程度の柔軟性を所有する。ある特定の実施形態では、ゲルは生体適合性で、被吸収性である。ある特定の実施形態では、ゲルは、外科的介入の前、その間または後に患者に投与される。
本明細書で用いる液体溶液は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、滴剤、軟膏剤、液体洗浄剤、噴霧剤、リポソーム剤を指し、それらは当技術分野で周知である。一部の実施形態では、液体溶液は、少量の酸または塩基が追加されるときにｐＨの変化に抵抗する水性ｐＨ緩衝剤を含有する。ある特定の実施形態では、液体溶液は、外科的介入の前、その間または後に患者に投与される。
例示的な製剤は、ａ）本明細書に記載される１つまたは複数のバイオコンジュゲート；ｂ）薬学的に許容される担体；およびｃ）マトリックスネットワークとして親水性ポリマーを含むことができ、ここで、前記組成物は、粘性液体として、すなわち、数百から数千ｃｐｓの粘度のゲル剤または軟膏剤として製剤化される。これらの実施形態では、バイオコンジュゲートは、適当な薬学的に許容される担体に分散または溶解される。
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物は、製剤化の前、その間またはその後に凍結乾燥される。したがって、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物を含む凍結乾燥組成物も本明細書で提供される。
６．投薬
バイオコンジュゲートの適する投薬量は、標準の方法によって、例えば実験動物モデルまたは臨床治験で用量反応曲線を確立することによって決定することができ、また、患者の状態、治療する疾患の状態、投与経路および組織の分布、ならびに他の治療的処置の同時使用の可能性によってかなり異なることができる。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重または質量および医師による患者の状態の評価に基づく。様々な例示的な実施形態では、用量は約０．０１μｇから約１０ｇの範囲内である。例えば、全身性送達のために、用量は約１０ｇ、または約５ｇ、または約１ｇであってよい。他の例示的な実施形態では、有効用量は、１用量につき約１００μｇから約１０ｇ、または１用量につき約１００μｇから約１ｇ、または１用量につき約１００μｇから約５００ｍｇ、１用量につき約０．０１μｇから約１００ｍｇ、または１用量につき約１００μｇから約５０ｍｇ、または１用量につき約５００μｇから約１０ｍｇ、または１用量につき約１ｍｇから１０ｍｇ、または１用量につき約１から約１００ｍｇ、または１用量につき約１ｍｇから５００ｍｇ、または１用量につき約１ｍｇから２００ｍｇ、または１用量につき約１０ｍｇから１００ｍｇ、または１用量につき約１０ｍｇから７５ｍｇ、または１用量につき約１０ｍｇから５０ｍｇの範囲、または１用量につき約１０ｍｇ、または１用量につき約２０ｍｇ、または１用量につき約３０ｍｇ、または１用量につき約４０ｍｇ、または１用量につき約５０ｍｇ、または１用量につき約６０ｍｇ、または１用量につき約７０ｍｇ、または１用量につき約８０ｍｇ、または１用量につき約９０ｍｇ、または１用量につき約１００ｍｇである。本明細書に記載される様々な実施形態のいずれでも、有効用量の範囲は、１用量につき約０．０１μｇから約１０００ｍｇ、１用量につき１μｇから約１００ｍｇ、約１００μｇから約１．０ｍｇ、約５０μｇから約６００μｇ、約５０μｇから約７００μｇ、約１００μｇから約２００μｇ、約１００μｇから約６００μｇ、約１００μｇから約５００μｇ、約２００μｇから約６００μｇ、または１用量につき約１００μｇから約５０ｍｇ、または１用量につき約５００μｇから約１０ｍｇ、または１用量につき約１ｍｇから約１０ｍｇである。
一部の実施形態では、組成物は複数回用量の形で包装される。したがって、使用中の微生物汚染を予防するために保存剤が必要とされる。ある特定の実施形態では、前記のような適する保存剤を組成物に追加することができる。一部の実施形態では、組成物は保存剤を含有する。ある特定の実施形態では、保存剤は約０．００１ｗ／ｖ％から約１．０ｗ／ｖ％のレベルで用いられる。一部の実施形態では、単位用量組成物は無菌であるが、保存剤無添加である。
（実施例１）
ＥＤＣ官能基化プロトコール（Ｈｅｐ−ＳＩＬＹ）
材料
適切な反応緩衝液を調製する（例えば、ブタノール、エタノール、塩化グアニジウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素または尿素などのカオトロピック剤を適当な濃度（例えば、尿素約５Ｍから約１０Ｍ）で含む２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ））。最終ｐＨは、１Ｎ ＨＣｌで約４．５から約６のｐＨに合わせる。
ペプチド（例えば、
Figure 2018513879
 （ＭＷ＝２２５３Ｄａ、以下に示した構造））を反応緩衝液中に３ｍｇ／ｍＬで溶解する。ペプチド溶液は一般的にカップリング反応の前に新たに調製する。
Figure 2018513879
ビオチン化ペプチド（例えば、
Figure 2018513879
 （ＭＷ＝２４７９Ｄａ））を反応緩衝液中に３ｍｇ／ｍＬで溶解する。得られた標識ペプチド溶液は一般的にカップリング反応の前に新たに調製する。
グリカン（例えば、ヘパリン（ＭＷａｖｇ＝１６ｋＤａ））は、反応緩衝液中に２０ｍｇ／ｍＬで溶解し、−２０℃で保管するかまたはカップリング反応の前に新たに調製する。
ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）は、グリカンに添加する直前に反応緩衝液中に７５ｍｇ／ｍＬで溶解する。
コンジュゲーション−ヘパリンを含有するバイオコンジュゲート（１００ｍｇ）
ヘパリンは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（５９．３ｍｇまたは０．７９ｍＬを水に７５ｍｇ／ｍＬで溶解）をヘパリンに対して５０モル過剰で添加することによって活性化した。出発材料を室温で約５分間反応させた。次に、標識ペプチドを活性化したヘパリンに１：１モル比（ヘパリン：標識ペプチド）（１５．３ｍｇまたは５．１ｍＬを反応緩衝液に３ｍｇ／ｍＬ）で添加した。次に、反応混合物を室温で約５分間振盪した。振盪しながらペプチドを１：７モル比（Ｈｅｐ：ペプチド）（９７．３ｍｇまたは３２．４ｍＬを反応緩衝液に３ｍｇ／ｍＬ）で添加した。次に、構成成分を室温で約２時間振盪しながら反応させた。一定時間後、室温で振盪しながら０．５Ｍ ＮａＯＨ（およそ４．５ｍＬ）で約３０分間かけてｐＨを８まで上昇させることによって反応を停止させた。
得られたＨｅｐ−ＳＩＬＹバイオコンジュゲートはダイアフィルター（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−ＭｉｄｉＫｒｏｓ ｍＰＥＳ １０Ｋ中空管フィルター）によって、反応緩衝液５カラム体積（ＣＶ）（およそ２５０ｍＬ）、次いで水１０ＣＶ（およそ５００ｍＬ）を使用して、流速３５ｍＬ／分、ＴＭＰおよそ１５ｐｓｉで精製した。保持液（すなわち、最終生成物）はその後−８０℃で凍結した。任意選択で、生成物は乾燥するまで凍結乾燥する。
（実施例２）
血小板第４因子（ＰＦ４）によって測定した血小板阻害
以下の方法は、本明細書で開示したバイオコンジュゲートの血小板阻害に対する効果を評価するために使用する。マイクロプレートを繊維性コラーゲンでコーティングし、その後１％ミルクでブロックした。バイオコンジュゲートを１×ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬから希釈を開始し、１×ＰＢＳで濃度因子１０倍を使用して希釈し、溶液５０μＬをコラーゲンコーティングウェルに添加した。処置液は室温で１５分間インキュベートした。その後、処置溶液を除去し、１×ＰＢＳで３回すすぐことによって、ウェルに結合していない処理液をすすいだ。
ヒト全血を健康なボランティアから静脈穿刺によって収集した。血液の最初の５ｍＬは廃棄し、その後およそ１５ｍＬをクエン酸入りガラス製採血管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に収集した。血液をガラス管中において２５℃、２００ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離した血液の上層、血小板が豊富な血漿を血小板実験のために使用した。
血小板が豊富な血漿（５０μＬ／ウェル）をマイクロプレートに添加し、室温で１時間置いた。１時間インキュベートした後、血小板が豊富な血漿４５ｍＬを各ウェルから除去し、血小板がさらに活性化するのを阻害するために５ｍＬ ＥＴＰ（ＥＤＴＡ １０７ｍＭ、テオフィリン１２ｍＭおよびプロスタグランジンＥ１ ２．８ｍＭ）を含有する微量遠心分離管に添加した。これらの分離管を４℃、２０００ｇで３０分間回転し、血小板をペレットにした。血小板活性化マーカーの存在を試験するＥＬＩＳＡ研究のために上清を収集した。各タンパク質を検出するためにサンドイッチＥＬＩＳＡを利用した。両サンドイッチＥＬＩＳＡのための構成成分は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、提供されたプロトコールに従った。アッセイの直線範囲内に値が収まるように、血小板血清を１×ＰＢＳに溶かした１％ＢＳＡで希釈することが必要であった。血小板活性化は、血小板第４因子（ＰＦ−４）の放出によって測定した。
（実施例３）
原線維形成アッセイ
以下の方法は、本明細書で開示したバイオコンジュゲートの原線維形成に対する効果を評価するために使用する。コラーゲン溶液は、ＨＣｌに溶かしたコラーゲン２ｍｇ／ｍＬを２×ＴＥＳ緩衝液（ＴＥＳ ６０ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ６０ｍＭ、ＮａＣｌ ３００ｍＭ）で１ｍｇ／ｍＬまで希釈することによって調製し、氷上で保った。バイオコンジュゲートを含有する試験試料を最終濃度０．６ｍｇ／ｍＬまで１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で溶解し、また氷上で保った。試験試料をコラーゲンに１：１（体積：体積）の比で添加し、したがって最終コラーゲン濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであった。その後、コラーゲン試験溶液をボルテックスすることによって徹底的に混合した。
原線維形成は、３７℃でインキュベートしている間に、コラーゲン試験溶液の濁度を（３１３ｎｍでの吸光度）でモニターすることによって測定した。試料は、ピペットによって９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加した。マイクロプレートリーダーを３７℃で保持、濁度を１分毎に６０分後までモニターした。
（実施例４）
コラーゲン結合プレートアッセイ
以下の方法は、本明細書で開示したバイオコンジュゲートのコラーゲンに対する結合親和性を評価するために使用する。その他の標的（例えば、ヒアルロン酸、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、セクレチン）の結合親和性を評価するためには類似のアッセイを用いる。
バイオコンジュゲート変種のコラーゲン結合は、コラーゲンを９６ウェルプレートにコーティングしたプレートアッセイによって比較した。コラーゲンは、０．０２Ｎ酢酸中５０μｇ／ｍＬを室温で１時間高結合プレートにコーティングした。結合しなかったコラーゲンは、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４ですすいだ。次に、プレートを１×ＰＢＳ溶液中１％ミルクで、室温で１時間ブロックした。
ビオチン化ペプチドを含有するバイオコンジュゲート変種は、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１％ミルクで最終濃度１ｍｇ／ｍＬになるまで溶解した。この溶液から、１０×系列希釈を実施した。次に、ブロックしたコラーゲンコーティングプレート上で分子をインキュベートし、室温で１５分間インキュベートした。次に、プレートを１％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回すすいだ。
結合した分子は、１％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで１：５００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰによって２００μＬ／ウェルで室温で２０分間インキュベートして検出した。ストレプトアビジン溶液はプレートから０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回すすいだ。その後、ＴＭＢ基質溶液を各ウェルに１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１５分間経った後発色を硫酸溶液（０．１６Ｍ）１００μＬで停止させた。次に、ウェル中の吸光度を４５０ｎｍで測定し、結合親和性を吸光度対濃度による用量応答曲線にプロットした。
（実施例５）
ヒアルロン酸結合バイオコンジュゲートの比較
この実施例は、本明細書で記載したようなヒアルロン酸結合単位を有するペプチドを含むバイオコンジュゲートが、米国特許出願公開第２０１４／０３０１９８３号で記載されたようなヒアルロン酸結合バイオコンジュゲートと比較したとき、ヒアルロン酸に対して予想外の結合親和性増強を示すことを示している。
バイオコンジュゲート
本明細書で記載したようなヒドラジド−カルボニル連結を有するヒアルロン酸結合バイオコンジュゲートは、コンドロイチン硫酸およびＧＡＨペプチド（すなわち、
Figure 2018513879
 ）およびＳＴＭペプチド（すなわち、
Figure 2018513879
 ）を使用して、上記の実施例１に従って調製した。ヒドラジド−カルボニル連結を有するヒアルロン酸結合バイオコンジュゲートのビオチン化変種も、コンドロイチン硫酸および標識ＧＡＨペプチド（すなわち、
Figure 2018513879
 ）および標識ＳＴＭペプチド（すなわち、
Figure 2018513879
 ）を使用して、上記の実施例１に従って調製した。
酸化コンドロイチン硫酸およびＧＧＧＣスペーサーを有するＧＡＨペプチド（すなわち、
Figure 2018513879
 ）を使用し、米国特許出願公開第２０１４／０３０１９８３号（参照により全体を本明細書に組み込む）で記載されたようなＢＭＰＨリンカーを介したヒアルロン酸結合バイオコンジュゲート。ビオチン化コンドロイチン硫酸を対照として使用した（図１Ａ）。
組み込みアッセイ
ヒアルロン酸に対するアグリカン模倣体の結合を評価付けるために、ＨｙＳｔｅｍハイドロゲルを製造者のプロトコール（ＥＳＩ ＢＩＯ）の通りに合成した。簡単に説明すると、Ｇｌｙｃｏｓｉｌ（チオール修飾ヒアルロン酸）、Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ−ｌｉｔｅ（ジアクリル酸ポリエチレングリコール、ＰＥＧＤＡ）および脱気した脱イオン水（ＤＧ）を室温に戻した。無菌条件下で、シリンジおよび針を使用してＤＧ水１．０ｍＬをＧｌｙｃｏｓｉｌバイアルに水平振盪機上で振盪しながら４０分かけて添加した。同様に、ＤＧ水０．５ｍＬをＥｘｔｒａｌｉｎｋ−Ｌｉｔｅバイアルに添加した。次に、Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ−ｌｉｔｅおよびＧｌｙｃｏｓｉｌを体積比１：４で混合した（Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ−Ｌｉｔｅ ０．２５ｍＬに対してＧｌｙｃｏｓｉｌ １．０ｍＬ）。混合液５０μｌをピペットでエッペンドルフから０．５ｍＬチューブキャップに移し、溶液を２時間かけてゲル化させた。次に、これらのヒドロゲルを２４ウェルプレート中でアグリカン模倣体溶液５００μｌと水平振盪機上で振盪しながら３時間インキュベートした。その後、ゲルを１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）で一晩インキュベートすることによって洗浄し、次いでストレプトアビジンＤｙＬｉｇｈｔ蛍光プローブ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して染色した。ストレプトアビジンＤｙＬｉｇｈｔは１×ＰＢＳで体積比１：２００に希釈し、水平振盪機上で１時間振盪しながらゲルに添加した。非特異的に結合した蛍光プローブは、ゲルを１×ＰＢＳ中で水平振盪機上で振盪しながら２０分間インキュベートすることによって洗浄した（２回反復）。次に、ゲルは分光共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ａ１＋）を使用して画像化した。
図１は、ヒドラジド−カルボニル連結を介してＣＳに結合したＧＡＨペプチドを有するバイオコンジュゲート（図１Ｃ）およびヒドラジド−カルボニル連結を介してＣＳに結合したＳＴＭペプチドを有するバイオコンジュゲート（図１Ｄ）が、酸化的糖開環化学反応およびＢＭＰＨリンカーを介してＣＳに結合したＧＡＨペプチドを有するバイオコンジュゲート（図１Ｂ）と比較して高いヒアルロン酸結合親和性を示すことを示す。
（実施例６）
標準的治療を変更しない瘻管へのバイオコンジュゲートの送達
この実施例は、本明細書で開示したバイオコンジュゲートが天然のＡＶＦにおける内膜過形成を予防するための血管内腔コーティングとして使用できることを示している。瘻はブタ大腿動脈および静脈に生じ、本明細書で開示したバイオコンジュゲートまたは対照である生理食塩水で処理する。バイオコンジュゲートは標準的治療を変更することなく効率的に瘻管に送達され、処理していない瘻よりも狭窄はかなり少なく、血管径が拡大するものと考えられる。
この実施例によって３つの送達方法：（１）血流直前の送達、（２）血流前に意図的に剥離させた瘻への送達、および（３）形成した瘻への血流再開後（例えば、５分後）の送達を試験することができる。
方法１が第１の送達方法と考えられ、方法２および３は単独で使用するか、または方法１では血管腔がバイオコンジュゲートによって十分に覆われない場合に方法１に追加して使用することができる。方法２では、血管の意図的な剥離は、ＡＶＦ形成中に拡張物質を臨床適用するのと同じように、静脈を鉗子で擦ることによって実施する。方法３は、瘻生成直後の静脈内の高い血流によって内皮細胞層に治療薬の初期送達では対処できない損傷が生じるかどうかを判定するために試すことができる。方法３では、血流が瘻を修復した後、近位の静脈および動脈をクランプすることによって血流を停止する。その後、瘻をバイオコンジュゲートでフラッシュし、血流を再開する。
いずれの場合においても、新たに生成した吻合の縫合を一目解き、先端を滑らかに丸めた供給針を使用してバイオコンジュゲートを瘻にフラッシュする。バイオコンジュゲート（例えば、およそ５ｍＬ）を瘻にフラッシュする。バイオコンジュゲート送達後（例えば、約２時間後）、動物を殺処分する。瘻を取り出し、生理食塩水で洗浄し、１０％ホルマリンで（例えば、約１０分間）固定する。
細胞はファロイジンを使用して染色する。バイオコンジュゲートがビオチンタグを有する場合、バイオコンジュゲートは蛍光標識したストレプトアビジンマーカーを使用して検出する。静脈は動脈から分離し、共焦点顕微鏡を使用して内腔面を調べることができるように両血管を切開する。
バイオコンジュゲートの送達は３つの方法全てにおいて効果的であると考えられる。非特異的結合は、バイオコンジュゲートに曝露していない動脈を試験することによって明らかで、すなわち、明白な染色はない。狭窄のレベルは、血管を視覚化し、画像によって血管の直径を測定できるように、ＣＴスキャン中に動物に造影剤を注射することによって判定する。
（実施例７）
大腿膝窩動脈内の狭窄または閉塞を治療するためのＨｅｐ−ＳＩＬＹ
以下は、大腿膝窩動脈内の狭窄または閉塞を治療するために、単純旧式バルーン血管形成術（ＰＯＢＡ）および生理食塩水（対照）に対するバルーン血管形成術および腔内Ｈｅｐ−ＳＩＬＹの安全性および有効性を評価して比較するために考案された臨床試験である。ヘパリン当たりおよそ６〜８ＳＩＬＹペプチドを有するＨｅｐ−ＳＩＬＹを実施例１に従って調製する。
この試験は、天然の大腿膝窩動脈における新規病変または再狭窄病変におけるバルーン血管形成術単独に対するバルーン血管形成術および腔内Ｈｅｐ−ＳＩＬＹの安全性および有効性の多施設共同盲検無作為化２群間並行比較試験を提案する。跛行または虚血性休息痛および患者の足への流出動脈の大腿膝窩動脈において血管造影的に重大な病変を提示するおよそ６６人の対象を無作為化し、この研究のために治療する。
重要な選択基準は、４０歳を上回ることおよび同意の意思があることである。重要な除外基準は妊娠、５年未満の平均余命、スクリーニング３ヵ月以内の出血性脳卒中の既往歴、心筋梗塞の既往歴、スクリーニング２週間以内の血栓溶解または狭心症およびヘパリンに対する公知の禁忌である。
対象にベースライン血管造影を受けさせ、大腿膝窩動脈における血管造影的に重大な病変を確認する。血管造影で確認しながらガイドワイヤーによって病変を上手く通過させた後、対象をＰＯＢＡおよびＳＢＣＶ治療（群１、Ｎ＝４４）対ＰＯＢＡ治療および生理食塩水（対照）（群２、Ｎ＝２２）２：１に無作為化する。群１にはバルーン血管形成術および１０ｍｌまでのＨｅｐ−ＳＩＬＹによるフラッシュを行い、一方群２にはバルーン血管形成術および１０ｍｌまでの生理食塩水によるフラッシュを行う。
研究期間は、４ヵ月の登録期間を含めて全体でおよそ１０ヵ月である（最初の対象が初めて来院してから最後の対象が最後に来院するまで）。個体の研究参加は、最初の手順からおよそ２４週間後で、スクリーニング来院は研究手順の１ヵ月前までである。
退院前ならびに４、８、１２、１８および２４週間後の経過観察通院時に様々なデータを収集する。主要評価項目は、盲検下の独立血管造影コアラボによって評価された治療後２４週目の分析部分（傷害部分ならびに５ｍｍの近位縁および遠位縁の全体長）における遠隔期血管径損失（ＬＬＬ）によって測定した有効性である。ＬＬＬは初回手順直後の最小血管径（ＭＬＤ）と経過観察後のＭＬＤとの間の差と定義する。
ＬＬＬは、手順後の血管造影図と比較した２４週間経過観察血管造影図を使用して測定する（慢性腎不全の対象については、ＬＬＬを測定するために二重ドプラ超音波検査を使用する）。
副次的評価項目は、治療により発生した有害事象（ＡＥ）の発生率、臨床検査室の評価、バイタルサインおよび身体検査による所見によって測定した安全性である。測定するべき特定の安全事象には、あらゆる原因による死、非切断（足首より上）生存率（ＡＦＳ）および標的血管血行再建（ＴＶＲ）が含まれる。
（実施例８）
新生内膜過形成または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を治療または予防するためのＨｅｐ−ＳＩＬＹ
新生内膜過形成は、本明細書で記載したようなバイオコンジュゲート（例えば、実施例１のＨｅｐ−ＳＩＬＹ）を送達するウサギの血管形成モデルにおいて評価する。複数（例えば、６匹）のウサギを研究に登録する。各動物の左右両方の腸骨動脈にバルーン血管形成術によって傷害を与える。動物を試験群（ヘパリン−ＳＩＬＹ）またはビヒクル対照群（１×ＰＢＳ）に分ける。各群において、両腸骨動脈に傷害を与え、バルーン傷害直後に試験物質または対照で治療する。
傷害を与えて所与の時間後（例えば、２８日後）、動物を安楽死させ、動脈部分を組織学的に評価した。一般的に、各血管から最も重度の新生内膜応答を示すいくつかの（例えば、３つの）組織学的切片を形態測定のために選択する。外弾性板（ＥＥＬ）、内弾性板（ＩＥＬ）および内腔の断面区域のモバット染色スライドをデジタル形態測定器（ＩＰＬａｂ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で測定する。新生内膜の厚さは、最小および最大部位におけるＩＥＬから内腔までの距離として測定し、その後平均化する。断面区域は、以下を計算するために使用する：
・中膜区域＝ＥＥＬ区域−ＩＥＬ区域
・新生内膜区域＝ＩＥＬ区域−内腔区域
・中膜〜内膜区域＝ＥＥＬ区域−内腔区域
・％狭窄＝［１−（内腔区域／ＩＥＬ区域）］＊１００
変数の平均は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して比較する。０．０５未満のｐ値は一般的に、統計学的に有意であると見なす。
本明細書で記載したようなバイオコンジュゲート（例えば、実施例１のＨｅｐ−ＳＩＬＹ）は、新生内膜過形成の阻害に効果的で、したがって末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の治療または予防に使用することができるものと考えられる。
（実施例９）
バイオコンジュゲート／ペプチド凝集形成
Ｈｅｐ−ＳＩＬＹは、精製手順に以下の変更を加えて実施例１に記載したように合成した。反応緩衝液５ＣＶ中で精製する前に、カオトロピック剤（例えば、尿素）濃度がおよそ３Ｍまで低下するように反応液を水で希釈した。その後、反応液を水１６ＣＶで精製した。
得られた生成物をサイズ排除クロマトグラフィーによって評価したところ、高分子量種の形成が示され、凝集形成が示唆された。Ｈｅｐ−ＳＩＬＹ複合体の性能は、イオン的に相互作用するＳＩＬＹペプチドを含有しない参照Ｈｅｐ−ＳＩＬＹと比較した。凝集を含有するＨｅｐ−ＳＩＬＹは、凝集を含有しないＨｅｐ−ＳＩＬＹと比較して高い親和性（低いＥＣ５０値）でコラーゲンと結合する。
（実施例１０）
バイオコンジュゲートで処理した静脈グラフト
以下の方法は、本明細書で記載したようなバイオコンジュゲートで処理した静脈グラフトは、バイパス手術で使用したとき、静脈グラフト不全を引き起こす可能性が低いことを確認するために使用することができる。この実施例はまた、静脈グラフトの調製条件を試験する。
Ａ．バイオコンジュゲート濃度の最適化
切除したウサギ血管組織に対する動脈の生体外研究は、薬物物質濃度および動物モデル研究を開始する前の浸漬期間を最適化するために実施する。生体外結合研究の情報を使用して、浸漬時間、薬物物質濃度および静脈グラフト保存溶液を作製するための製剤緩衝液を決定する。
まず、静脈に対するバイオコンジュゲートの結合は、バイオコンジュゲート濃度および浸漬時間の影響を調べるために定量化する。１匹のウサギから切除した静脈をおよそ１ｃｍ２の部分に切断し、２４ウェルプレートに入れる。緩衝生理食塩水中のバイオコンジュゲートの濃度の変化および処置時間の変化を試験する。組織小片は洗剤を含有する抽出媒体中でホモジナイズし、遠心分離して残渣をペレットにする。上清のタンパク質はビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）試薬によって、薬物物質はＥＬＩＳＡまたはＥＣＬ（ＭＳＤ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによる電気化学発光法）によってアッセイする。
さらに、広範な血管壁損傷が結合をどのように増強し得るかを判定するために、血管を小片に切断する前に血管をラバーポリスマンで優しく掻き取る第２の実験を含める。この手順は、外科医が移植前に静脈から弁を除去する方法を模倣する。
本明細書で記載したようなバイオコンジュゲートの定量に加えて、薬物物質が静脈の内腔に結合することを確認するために免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施する。２つの条件（濃度および浸漬時間）を前記実験に基づいて試験するために選択する。ウサギから頸静脈を取り出し、バイオコンジュゲート溶液でフラッシュして浸漬する。次に、この静脈を緩衝生理食塩水で３回すすぐ。組織を３つの部分に切断する。ある部分を中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で固定し、第２の部分は最適な切断温度（ＯＣＴ）で凍結保存し、第３の部分は急速凍結する。クリオスタットまたはホルマリン固定した組織切片、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本はＨ＆Ｅで染色し、既に調製した薬物物質に特異的な抗体を使用して免疫染色する。バイオコンジュゲートは血管上で曝露したいかなるコラーゲンにも結合するので、この実施例では、血管の内面をコーティングする薬物物質を見ることができることが予測される。
さらに、ヒト組織への手順の転換を確実にするために、ヒトの死体静脈を使用してＩＨＣ手順を実施する。静脈組織は、死亡して２４時間以内に死体から得る。
Ｂ．動物の静脈バイパス手術におけるバイオコンジュゲート溶液の評価
静脈グラフトモデルは雄のニュージーランドホワイトウサギである。静脈バイパスグラフトは、カフ付き吻合技術で行われる。外頸静脈を採取し、ヘパリン化生理食塩水または静脈グラフト保存溶液のいずれかの溶液中に適当な時間およびバイオコンジュゲート濃度で入れる。保管期間後、静脈末端を４Ｆ血管用イントロディーサーシースから形作ったポリウレタンカフに通し、次にカフの外側に折り返し、縫合してしっかりと留める。次に、頸動脈内腔を動脈切開術で１〜２ｃｍ曝露する。カフに裏返した静脈の末端を頸動脈内腔に挿し、動脈をカフの周りに縫合してしっかりと留める。一旦流れを再開すると、動脈の挿入部分は完全に分かれて静脈グラフト全体を拡張させる。グラフトの開存性は、グラフト内の拍動流を視覚化することによって確認する。
全部で２０匹の動物を使用する。動物１０匹は頸動脈にグラフトする前にヘパリン化生理食塩水中に浸漬した静脈を有し、動物１０匹は静脈グラフト保存溶液に浸漬した静脈を有する。動物は２８日間生存する。ヘパリン化生理食塩水は、通常、臨床の場で使用されるので対照群として選択する。
２８日目に、麻酔を導入し、血管の開存性を確認する。ヘパリンの静脈内ボーラス投与を行い、動物を殺処分する。静脈グラフトは、上行大動脈から１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）によって生体位灌流固定する。次に、静脈グラフトを切除し、ＮＢＦで浸漬固定してから切片作製および形態測定のためにパラフィン包埋する。異物である体内カフに隣接した組織を避けて静脈グラフトの長さに沿って静脈グラフトの少なくとも３つの異なる部分を分析する。
パラフィン包埋した６μｍの切片をモバットペンタクローム染色で染色し、Ａｐｅｒｉｏ顕微鏡で画像化する。内腔、内弾性板（ＩＥＬ）および外弾性板（ＥＥＬ）の周の輪郭を捉え、外周内の面積を計算する。新生内膜区域はＩＥＬ区域−内腔区域として計算する。
各群について静脈グラフトは１０カ所あり、各グラフト内で最小で３つの区域を調べる。各グラフト内の３つの測定値を平均化して、グラフト当たりの新生内膜区域平均値を得る。１０個の試料サイズは、測定内の標準偏差２０％で新生内膜過形成の２５％減少を検出するために十分な検出力（０．８、α＝０．０５）を生じる。この目的を成功させるための基準には、バイオコンジュゲートで処理した静脈グラフトにおける新生内膜過形成の２５％減少が含まれる。
Ｃ．液体安定性研究
バイオコンジュゲート化合物の設計および合成は、良く確立された対照で開発された方法で行う。室温および４℃で液体として保管したバイオコンジュゲートの安定性を判定するために安定性プログラムを完了させる。バイオコンジュゲート溶液は予め凍結乾燥形態で保管し、使用前に再構成する。このような溶液は３ヵ月間安定であることが見出された（今まで試験した時間）。こうして、４℃および室温で液体として保管したバイオコンジュゲートの公式の安定性プロトコールを開始する。液体製剤は、この設定では、バイオコンジュゲートの臨床的送達のために便利な形態である。
Ｄ．ラットにおける毒性研究
用量範囲を調べる研究を実施する。まず、２日後の急性毒性を確かめるために、ラットに４つの用量レベルで１回ＩＶ注射を行う。並行投与群に同様に投与し、時間を空けて血液試料を採集し、薬物動態パラメータを測定する。次に、回復期間を設けないラットにおける非ＧＬＰ試験で７日間の反復投与研究を実施する。この研究の結果は、最大耐用量を選択するために使用する。最後に、最大耐容量レベルを使用して、２８日間の回復期間を設けて２８日間の長期反復投与試験を実施する。
試験の評価項目には、死亡率、臨床的所見、投与前および剖検時の体重、投与前および剖検時の食物消費量、血液収集による毒物動態学的観察ならびに臨床病理が含まれる。標準的組織病理は標準器官で実施する。
毒性が観察されないことが予期される。いかなる毒性効果も見出される前に溶解限界に達することが予測される。
（実施例１１）
ｏｘＤＳ−ＳＩＬＹ対ｅＤＳ−ＳＩＬＹの安定性の比較
安定性研究は、酸化化学（すなわち、開環；ｏｘＤＳ−ＳＩＬＹ）または上記の実施例１に従って合成したＤＳ−ＳＩＬＹの安定性を比較するために、ヘパリン（すなわち、非開環；ｅＤＳ−ＳＩＬＹ）の代わりにデルマタン硫酸を使用して実行した。
簡単に説明すると、ｏｘＤＳ−ＳＩＬＹは以下の通りに調製した。デルマタン硫酸（ＤＳ）は、リン酸ナトリウム緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ５．５に溶解して、濃度２０ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。官能基化の程度は、過ヨウ素酸の濃度によって制御する。以下の表に従って過ヨウ素酸をリン酸ナトリウム緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ５．５に溶解することによって、様々な濃度の過ヨウ素酸溶液を調製した。
Figure 2018513879
ＤＳ溶液を過ヨウ素酸溶液と１：１（Ｖ：Ｖ）の比で室温で２時間混合して酸化ＤＳを形成し、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ６カラムを使用してリン酸緩衝生理食塩水で精製した。末端にＧＳＧ−ＮＨＮＨ２結合を有するＳＩＬＹペプチド（すなわち、
Figure 2018513879
 ）を水に溶解し、必要ならば超音波を使用して濃度１ｍｇ／ｍＬを実現した。ＳＩＬＹペプチドを室温でゆっくり酸化ＤＳに添加して、遮光しながら約２時間撹拌した。反応混合物のｐＨは６超に維持した。任意選択で、同様に官能基化したＳＩＬＹビオチン（ビオチン標識ペプチド）１モルをＤＳ１モルと反応させることができ、次に非標識ＳＩＬＹペプチドを予測したアルデヒドの数まで添加することができる（モル当量−１）。ＤＳ−ＳＩＬＹ２０はまた、非標識ＳＩＬＹ２０モルをＤＳ１モルに添加することによって調製した。生成物は水で精製して、所望のＤＳ−ＳＩＬＹを実現した。
試料を合成し、最大で８週間凍結保存した。ＨＰＬＣ−ＳＥＣは、０時点、４週目および８週目に測定した。ピーク区域を比較し、ピーク区域の減少は分解を示した。
結果によって、ｅＤＳ−ＳＩＬＹは８週間の試験期間中安定を維持するが、ｏｘＤＳ−ＳＩＬＹは時間が経つにつれて分解することが示される。主要ピークおよび高分子量関連ピーク（それぞれ、実線の棒および斜線の棒）はｏｘＤＳ−ＳＩＬＹでは８週間で減少するが、ｅＤＳ−ＳＩＬＹ値は比較的一定を保ち、時間が経っても減少しない（図２）。
（実施例１２）
胃食道傷害を治療するための臨床試験プロトコール
この実施例は、胃食道傷害の治療におけるＨｅｐ−ＳＩＬＹなどの本明細書で記載したバイオコンジュゲート、前記で述べたような枝分かれペプチドを含むその他のヘパリン含有バイオコンジュゲート、またはＤＳ−ＳＩＬＹから選択したバイオコンジュゲートの能力を試験するための臨床試験を提案する。被験薬は溶液またはジェル中で調製したバイオコンジュゲートである。胃食道傷害はかなりの罹患率を示し、患者および医療制度にとって負担となる。食道の開存性を維持するには、かなりの資源を消費する。
疾患標的は胃食道傷害で、ＧＥＲＤによる自然発症のものまたは介入による医原性のもののいずれかである。これは、胃食道傷害を治療するための食道胃十二指腸内視鏡検査（ＥＧＤ）によって投与された局所バイオコンジュゲートの多施設共同無作為化安全性および有効性試験である。
この治験の目的には、１）ＥＧＤ介入時に投与したＥＧＤ送達バイオコンジュゲート治療の全体的な安全性プロファイルを評価すること、および２）胃食道損傷における再狭窄率の低下におけるＥＧＤ送達バイオコンジュゲートの有効性を判定することである。
５０人の患者を治験に登録し、そのうち２５人にバイオコンジュゲート（ＥＧＤ送達）、２５人にビヒクル（ＥＧＤ送達）を投与する。
重要な選択基準には、（ａ）ＥＧＤアブレーションを必要とするＧＥＲＤ関連食道病変、（ｂ）ＥＧＤアブレーションを必要とする食道狭窄、および（ｃ）ＥＧＤ治療を必要とする消化性潰瘍疾患（ＰＵＤ）が含まれる。重要な除外基準には、既往の重篤なアレルギー疾患が含まれる。
通院は、１週、６週および１２週である。安全性評価には、（１）有害事象および重篤なＡＥ（ＳＡＥ）の確認、（２）身体検査／バイタル：局所所見に特別に注意を払う、および（３）バイオコンジュゲート抗体（投与前、１週、１２週および２４週）を含む臨床検査が含まれる。ＥＧＤ送達は、６および１２週に反復してもよい。
食道の開存性を測定するために、一定量のバリウム嚥下を治療前および研究終了時に実行する。
この治験の主要評価項目は、狭窄再発率の低下であり、副次的評価項目は経口食へ移行するまでの時間、狭窄再発までの時間およびＰＵＤスコアまたは症状の改善である。治験ではこれらの評価項目全てを完遂するものと考えられる。

Claims (86)

  1. グリカンおよび少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、前記ペプチドは、コラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、ＩＣＡＭ結合単位、ＶＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介して前記グリカンに結合している、バイオコンジュゲート。
  2. 前記グリカンが、アルギネート、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デキストラン、デキストラン硫酸およびヒアルロナン、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  3. 前記ペプチドがコラーゲン結合単位を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  4. 前記ペプチドの前記コラーゲン結合単位が、約１ｍＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でコラーゲンに結合する、請求項３に記載のバイオコンジュゲート。
  5. 前記ペプチドがヒアルロン酸結合単位を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  6. 前記ペプチドの前記ヒアルロン酸結合単位が、約１ｍＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒアルロン酸に結合する、請求項５に記載のバイオコンジュゲート。
  7. 少なくとも１つのコラーゲン結合単位を含むペプチド、ならびに少なくとも１つのヒアルロン酸結合単位を含むペプチド、ならびに／またはコラーゲン結合単位およびヒアルロン酸結合単位の両方を含む少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  8. ＩＣＡＭ結合単位を含む少なくとも１つのペプチドおよびセレクチン結合単位を含む少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  9. 前記ペプチドが、最大で約１２０個のアミノ酸、または最大で約１００個のアミノ酸、または最大で約５０個のアミノ酸、または最大で約４０個のアミノ酸を含む、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  10. 前記ペプチドが最大で約２５個のアミノ酸を含む、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  11. １から約２５ペプチド、または約５から約２５ペプチド、または約１１から約１４ペプチドを含む、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  12. １から約１０ペプチド、または約７〜８ペプチドを含む、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  13. 前記グリカンが約１から約７５パーセント（％）の官能基化を含み、前記パーセント（％）官能基化は、ペプチドと官能基化する前記グリカン上の二糖単位のパーセントによって判定される、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  14. 前記グリカンが約５から約３０パーセント（％）の官能基化、または約１０から約４０パーセント（％）の官能基化を含む、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  15. 前記グリカンが約２５パーセント（％）の官能基化、または約３０パーセント（％）の官能基化を含む、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  16. 前記グリカンが、酸化的に切断されたサッカライド単位を含有しない、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  17. 前記グリカンが、誘導体化されたグリカンである、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  18. 前記誘導体化されたグリカンが、部分的Ｎ−脱硫酸化誘導体、部分的Ｏ−脱硫酸化誘導体、部分的Ｏ−カルボキシメチル化誘導体またはその任意の組合せである、請求項１７に記載のバイオコンジュゲート。
  19. 前記ペプチドが、
    Figure 2018513879
     またはこれらと少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＳ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  20. 前記ペプチドが、
    Figure 2018513879
     またはこれらと少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、少なくとも１つのＹＫＳ配列を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  21. 前記ペプチドが、アミノ酸配列
    Figure 2018513879
     またはこの配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に結合することが可能である配列を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  22. 前記ペプチドが、アミノ酸配列
    Figure 2018513879
     またはこの配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に結合することが可能である配列を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  23. 前記ペプチドが、
    Figure 2018513879
     またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に結合することが可能である配列のうちの少なくとも１つの配列、および
    Figure 2018513879
     またはこれらと少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、コラーゲンに結合することが可能である配列のうちの少なくとも１つの配列を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  24. 前記ペプチドが、
    Figure 2018513879
     またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、ヒアルロン酸に結合することが可能である配列のうちの少なくとも１つの配列、および
    Figure 2018513879
     またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、コラーゲンに結合することが可能である配列のうちの少なくとも１つの配列を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  25. 前記ペプチドが、ｉ）
    Figure 2018513879
     またはこれらの配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、ただし、セレクチン、ＩＣＡＭおよび／またはＶＣＡＭに結合することが可能である配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
  26. 前記ヒドラジド基が、任意選択でスペーサーを介して、前記ペプチドＣ末端に結合している、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  27. 前記ヒドラジド基が、任意選択でスペーサーを介して、前記ペプチドＮ末端に結合している、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  28. 前記ヒドラジド基が、グリシン、アラニン、アルギニン、リシンおよびセリンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むスペーサーを介してＣ末端に結合している、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
  29. 前記スペーサーが、グリシン、グリシン−グリシン、セリン−グリシン、リシン−アルギニン、アルギニン−アルギニンおよびグリシン−セリン−グリシンからなる群から選択される、請求項２７に記載のバイオコンジュゲート。
  30. １グリカンあたりのペプチドの平均数が約３０未満である、前記請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを含む組成物。
  31. １グリカンあたりのペプチドの平均数が約５から約３０である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物。
  32. １グリカンあたりのペプチドの平均数が約７である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物。
  33. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の組成物、ならびにコラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、ＩＣＡＭ結合単位、ＶＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を含む追加のペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが前記バイオコンジュゲートに非共有結合によって結合しており、さらに、前記組成物が前記グリカン中の二糖単位の数に対して１％から約２００％のペプチドを含む、組成物。
  34. 前記追加のペプチドが前記バイオコンジュゲートにイオン結合している、請求項３３に記載の組成物。
  35. 血管傷害または介入の前、その間および／またはその後に、患者において血管を治療するための方法であって、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記血管に適用することを含む方法。
  36. 前記バイオコンジュゲートが前記患者に非経口的に投与される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記非経口投与が、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経皮、皮内および表皮内からなる群から選択される経路による、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記バイオコンジュゲートが針または注入用器具を使用して非経口的に投与される、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. 前記バイオコンジュゲートが、前記患者にカテーテルで、バルーンに対するコーティングとして、多孔質バルーンにより、またはステントに対するコーティングとして投与される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記介入が血管形成術、アテレクトミー、ステントまたは他の外科的処置からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  41. 前記バイオコンジュゲートが前記患者の剥離した血管に結合する、請求項３５に記載の方法。
  42. 前記バイオコンジュゲートが血小板の活性化を阻害する、請求項３５に記載の方法。
  43. 前記バイオコンジュゲートが、剥離した血管への血小板結合を阻害する、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記バイオコンジュゲートが内膜過形成を阻害する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記バイオコンジュゲートが血栓形成を阻害する、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記バイオコンジュゲートが血管痙攣を阻害する、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記バイオコンジュゲートが内皮細胞増殖を刺激する、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記バイオコンジュゲートが、剥離した血管の露出したコラーゲンに結合する、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 患者において血管アクセスを確立するための方法であって、
    溶液を血管アクセスの血管壁に適用すること；および
    前記血管アクセスで血流を回復または開始すること
    を含み、
    前記溶液は、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を含む、方法。
  50. 血液透析を必要とする患者において動静脈瘻（ＡＶＦ）の成熟を改善するための方法であって、
    溶液をＡＶＦの内腔の内壁に適用すること；および
    ＡＶＦ内の血流を回復または開始すること
    を含み、
    前記溶液は、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を含む、方法。
  51. それを必要とする患者において組織接着を治療および／または予防する方法であって、器官の露出した組織に医薬組成物を適用することを含み、前記医薬組成物は、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を含む、方法。
  52. それを必要とする患者において腹部または骨盤接着を治療および／または予防する方法であって、腹部または骨盤器官の露出した組織に医薬組成物を適用することを含み、前記医薬組成物は、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を含む、方法。
  53. 内皮機能不全に関連した疾患を患っている患者を治療するための方法であって、前記患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
  54. 内皮機能不全に関連した前記疾患が、アテローム硬化症、冠状動脈疾患、真性糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、緑内障、尿毒症、敗血症および器官不全からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 患者の血管部位において炎症を予防または低減するための方法であって、前記部位は、（ａ）透過した内皮内膜または損傷を受けた内皮細胞を含み、（ｂ）血管介入手順からの回復を受けておらず、前記方法は、前記患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  56. 前記血管介入手順が経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）手順を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記疾患が、血管疾患、腎臓疾患、肺疾患、皮膚の疾患、リウマチ性疾患、胃腸疾患、腫瘍、血液疾患、感染性疾患、神経学的疾患、眼科疾患および内分泌疾患からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  58. 前記疾患が、関節リウマチ、糖尿病、尿毒症、細菌またはウイルスの感染症、アテローム硬化症、皮膚炎、糸球体腎炎、急性肺傷害、線維症、虚血性急性腎不全および喫煙による血管損傷からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  59. それを必要とする患者において角膜創傷治癒を促進する方法であって、前記患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
  60. 胃食道傷害を患っている患者において、食道開存性を維持する、再狭窄を低減する、創傷治癒を改善する、再発性の狭窄症を低減する、経口食事への移行を早める、または消化性潰瘍疾患（ＰＵＤ）症状を寛解させるための方法であって、医薬組成物を前記患者の傷害を受けた胃食道組織に局所的に適用することを含み、前記医薬組成物は、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を含む、方法。
  61. 患者において胃食道傷害を治療するための方法であって、医薬組成物を胃食道組織の病変に局所的に適用することを含み、前記医薬組成物は、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を含む、方法。
  62. 患者において関節炎を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
  63. 前記関節炎が変形性関節炎および関節リウマチからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 瘢痕形成を減少させる方法であって、それを必要とする個体に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
  65. 創傷治癒を促進するための方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
  66. 血管介入を受けた患者において狭窄症を治療する方法であって、患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  67. 患者においてヒアルロン酸の豊富な組織の分解を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  68. 患者において軟骨変性を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  69. 患者において軟骨変性を治療および／または予防する方法であって、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする患者の滑膜空に注入することを含む方法。
  70. 患者において硝子体液変性を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  71. 患者において髄核変性を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  72. それを必要とする患者において大腿膝窩動脈の中の狭窄または閉塞を治療する方法であって、バルーン血管形成術の前、その間および／またはその後に、溶液を内腔の内壁に適用することを含み、前記溶液は、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を含む方法。
  73. 患者において冠状動脈疾患および／または末梢動脈疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  74. バイパス手術のために血管グラフトを調製する方法であって、血管の切片の内壁を、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を含む溶液と接触させることを含む方法。
  75. 前記血管が静脈である、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記接触させることが、前記バイオコンジュゲートが前記内壁に結合することを可能にする条件下で実行される、請求項７４に記載の方法。
  77. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量に結合した内壁を含む血管の切片を含む血管グラフト。
  78. バイパスグラフト術を受けている患者においてグラフト不全を予防または低減するための方法であって、前記患者の循環系にグラフトを移植することを含み、前記グラフトは、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量に結合した内壁を含む、方法。
  79. バイパスグラフト術を受けている患者においてグラフト不全を予防または低減するための方法であって、前記患者の循環系にグラフトを移植すること、および移植の前、その間またはその後に、前記グラフトの内部に、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物の有効量を含む溶液を注入することを含む、方法。
  80. グリカンおよび１から５０ペプチドを含むバイオコンジュゲートを作製する方法であって、任意選択で活性化剤の存在下で前記グリカンをペプチドの十分な量と接触させることを含み、前記ペプチドは、ヒドラジド基を含み、カップリング反応条件下で前記バイオコンジュゲートを提供し、ペプチドは、コラーゲン結合単位、ヒアルロン酸結合単位、ＩＣＡＭ結合単位、ＶＣＡＭ結合単位および／またはセレクチン結合単位を含み、ペプチドの末端ヒドラジド基とグリカンのカルボニル基の間にあるヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している、方法。
  81. 前記バイオコンジュゲートがＹＫＳまたはＹＫＣの少なくとも１つの配列を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記活性化剤がカルボジイミド試薬である、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記活性化剤が、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドからなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
  84. 前記ヒドラジド基が、任意選択でスペーサーを介して、前記ペプチドＣ末端に結合している、請求項８０に記載の方法。
  85. 前記スペーサーが、グリシン、アラニン、アルギニン、リシンおよびセリンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記スペーサーが、グリシン、グリシン−グリシン、セリン−グリシン、アルギニン−アルギニン、リシン−アルギニン、リシン−アルギニン−アルギニンおよびグリシン−セリン−グリシンからなる群から選択される、請求項８４または８５に記載の方法。
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