MX2011010780A - Andamios novedosos basados en peptido para la regeneracion de cartilagos y metodos para su uso. - Google Patents

Abstract

Se dan a conocer en este documento moléculas y composiciones de anfifilo péptido novedosas compuestas de una secuencia de péptidos que se enlazan no covalentemente al factor de crecimiento TGF-ß1. También se dan a conocer métodos para usar estos anfifilos péptidos para crear un andamio de gel in situ que aumenta la regeneración del cartílago articular cuando se usa en combinación con microfractura. La mejora significativa en la calidad del tejido y los registros histológicos de O´Driscoll totales se observaron en conejos con defectos de cartílago articular de espesor total tratados con el anfifilo péptido de enlace a TGF. El gel puede servir adicionalmente como un vehículo de suministro para el factor de crecimiento de proteína TGF-ß1 recombinante. Los andamios que localizan y retienen los factores de crecimiento condrogénicos pueden aumentar sinérgicamente la reparación del cartílago cuando se combinan con la microfractura, al inducir las células madre mesenquimatosas de la médula ósea en la diferenciación condrogénica. Esta invención representa un procedimiento biomimético nuevo prometedor para mejorar las técnicas actuales de regeneración de cartílago articular en la instalación clínica.

Description

ANDAMIOS NOVEDOSOS BASADOS EN PÉPTIDO PARA LA REGENERACIÓN DE CARTÍLAGOS Y MÉTODOS PARA SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a nuevos geles basados en péptido y su uso terapéutico para aumentar la regeneración de cartílago articular. Más particularmente, la presente invención se refiere a una mezcla de anfifilos péptidos (PA) de auto-ensamble que tienen una secuencia de epítopo peptídico capaz de enlazarse no covalentemente al factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß?) . Los andamios de hidrogel compuestos de este anfifilo péptido y células autólogas se muestran por aumentar la regeneración de cartílago articular en un modelo de conejo in vivo. Esto es el primer ejemplo de un gel de anfifilo péptido de auto-ensamble que se puede usar solo o como una terapia para aumentar las estrategias ortopédicas actuales usadas clínicamente para la reparación de defecto de cartílago, como en el contexto de microfactura o trasplante de condrocitos autólogos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las técnicas de ingeniería de tejidos que emplean andamios biocompatibles proporcionan alternativas viables para materiales usados actualmente en la cirugía protésica y reconstructiva. Estos materiales también mantienen la promesa en la formación de tejido o equivalentes de órganos para reemplazar tejidos enfermos, defectuosos o lesionados. Además, se pueden usar andamios biocompatibles para formar materiales biodegradables que se pueden usar para la liberación controlada de materiales terapéuticos (por ejemplo material genético, células, hormonas, fármacos o profármacos) en un área predeterminada. Sin embargo, la mayoría de polímeros usados en la actualidad para crear estos andamios, tales como ácido poliláctico, poliortoésteres y polianhídridos, son difíciles de controlar y dan por resultado, entre otras cosas, adhesión celular deficiente e integración deficiente en el sitio donde se usa el material de ingeniería de tejidos. Por consiguiente, el enfoque ha cambiado a andamios formados de biomoléculas sintéticas, más particularmente andamios biomiméticos capaces del auto-ensamble in situ.

La preparación de cualquier material sintético con estructura en la nanoescala que imita el tejido natural es un problema difícil. Un procedimiento ha sido preparar moléculas que se ensamblan espontáneamente en fibrillas similares en morfología a las proteínas y proteoglicanos que componen la matriz extracelular natural. En contraste a la mayoría de polímeros sintéticos, el uso de moléculas de auto-ensamble, pequeñas facilita el control de las propiedades químicas y estructurales de estos ensambles macromoleculares.1-12 Para ese fin, se ha mostrado que los anfifilos péptidos se auto-ensamblan bajo condiciones adecuadas para formar micelas similares a fibrillas (referidas en la técnica como "nanofibras" ) , tales como nanofibras que tienen utilidad particular como andamios biocompatibles, más particularmente en el área de la ingeniería de tejidos.13"26 Se han descrito anfifilos péptidos previamente dados a conocer por tener secuencias de péptidos identificadas a través de la metodología de expresión en fago que son capaces de enlazarse no covalentemente a los factores de crecimiento.27 [Solicitud de Patente de E.U.A. 11/005,552, "Self-assembling anfifilos péptidos and related methods for growth factor delivery", la totalidad de la cual se incluye en este documento a manera de referencia] . Es un objetivo de la presente invención proporcionar anfifilos péptidos novedosos que son superiores a los compuestos previamente reportados, incluyendo modificaciones que inducen menor citotoxicidad y mayor compatibilidad con tipos de células condrogénicas , péptido más homogéneo que se mezcla y gelifica bajo condiciones fisiológicas, mientras que retiene la capacidad previamente identificada de enlazarse al factor de crecimiento condrogénico TGF-ß?.27 Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar un método para usar el TGF-ß? mejorado que se enlaza a los anfifilos péptidos para reparar o regenerar defectos en el cartílago articular in vivo.49 Este método representa un tratamiento terapéutico novedoso y potencialmente benéfico para pacientes con lesiones (defectos ) de cartílagos sobre sus superficies articulares que resultan de lesión aguda o degeneración crónica.

Las lesiones de cartílago articular no tratadas conducen a dolor, disfunción y osteoartritis acelerada. Las lesiones condrales focales de espesor total pueden progresar a osteoartritis, un desorden que tiene un impacto económico estimado que se aproxima a 65 billones en los Estados Unidos, cuando se consideran costos de atención médica, pérdidas de salarios y costos de impacto social.28 Las lesiones condriales se encuentran en una amplia gama de la población, incluyendo tanto el cohorte atlético como los pacientes activos mayores. En una revisión retrospectiva de 31,516 artroscopias de rodilla, Curl y colaboradores, descubrieron 53,569 lesiones de cartílago en 19,827 pacientes que se someten a la artroscopia (2.7 lesiones por rodilla, prevalencia = 63%).29 En un estudio prospectivo de 993 artroscopias de rodilla consecutivas, Aroen y colaboradores descubrieron un 11% de incidencia de lesiones condriales focales.30 En las rodillas que tuvieron cualquier lesión de cartílago articular, 20% fueron lesiones condriales focales de espesor total.

Las lesiones de cartílago articular focal tienen potencial regenerativo limitado. Varias modalidades de tratamiento están actualmente en uso clínico. El potencial regenerativo del cartílago articular no tratado se limita a la formación de una cicatriz de fibrocartílago . Las estrategias quirúrgicas para regenerar el cartílago articular de hialina o similar a hialina incluyen artroplastia por abrasión; microfractura ; implantación de células, tejidos, tejido, sintéticos; y tapones osteocondrales . Los estudios de resultado clínico e histológico de estas técnicas han mostrado que varían, y confunden frecuentemente los resultados clínicos. Los estudios histológicos a largo plazo han mostrado que la mayoría del tejido regenerado en todas estas técnicas es fibroso en el menor de los casos parcial, frecuentemente sin cartílago de hialina producido.31 La capacidad de autosanacion limitada del cartílago articular es probablemente debido a la naturaleza del tejido. En primer lugar, la vascularidad del cartílago articular no puede soportar la formación de un coágulo de fibrina. En tejidos vascularizados , este coágulo sirve como una matriz temporal y una fuente de factores de crecimiento para estimular la sanación natural, como se observa en los tejidos tales como en la piel y hueso. En segundo lugar, la matriz extracelular densa (ECM) del cartílago articular restringe la migración de condrocitos al espacio de defecto. En tercer lugar, los condrocitos tienen baja actividad mitótica, lo cual da por resultado proliferación celular insuficiente y síntesis de matriz para la regeneración completa. Con esta capacidad de sanación natural limitada, la intervención clínica es necesaria para prevenir la degradación del cartílago articular adicional y la progresión temprana de la osteoartritis degenerativa.

La microfractura es un procedimiento clínico común usado para la reparación de defectos del cartílago. Los beneficios propuestos de la microfractura son que es un procedimiento de una sola cirugía, relativamente simple y económica con baja morbilidad del paciente, e implica las células madre mesenquimatosas del propio paciente (MSCs) como una fuente de células para facilitar la regeneración del cartílago. Sus indicaciones clínicas actuales son en pacientes no obesos con un defecto focal contenido de espesor total, pequeño. Otro beneficio propuesto de microfractura es que no evita el uso de otras técnicas de restauración de cartílago en un tiempo posterior. El proceso regenerativo en la microfractura implica un coágulo de MSCs multipontentes que se adhieren al hueso subcondral. La evaluación histológica de la microfractura en modelos animales y prueba clínica ha mostrado que a través del tiempo la mayoría de las lesiones se consolidan en cartílago fibroso con colágeno Tipo I predominante y colágeno Tipo II limitado. Adicionalmente, existe clínicamente una disminución significativa en el resultado funcional 18 meses después de la cirugía, así como también en pacientes que son de más de 40 años de edad.32 Esto sugiere que existe de actividad, cantidad, calidad deficiente y retención del fenotipo de células de condrocitos dentro del defecto. Adicionalmente, puede haber una escases en la cantidad de la matriz extracelular y disponibilidad de los factores de crecimiento endógenos para inducir la diferenciación de condrocitos.

El trasplante osteocondral (aloinjerto y autoinjerto) es otro método mediante el cual se usan tapones de injerto osteocondral para crear la superficie condral. Mientras que el cartílago similar a hialina se ha observado en pocos reportes, existe una alta tasa de integración fallida del injerto con el cartílago circundante.33 La morbilidad del sitio donador para autoinjertos así como también otros problemas inherentes con el aloinjerto ( inmunogenicidad, resistencia del hueso subcondral, viabilidad de condrocitos, potencial de sanación, integración ósea, costo) han afectado los resultados clínicos e histológicos .3 -36 Otras técnicas para la regeneración del cartílago incluyen implantación de células, con o sin constructos de ingeniería de tejidos. Las investigaciones clínicas han implicado la cosecha de células, expansión en la monocapa y combinación con una matriz o andamio, seguido por la implantación. Estas técnicas requieren una cirugía de dos etapas, con un costo significativamente superior y morbilidad incrementada del sitio de cosecha. Actualmente, ensayos clínicos han evaluado retrospectiva y prospectivamente estas técnicas más avanzadas con microfractura y han mostrado resultados equívocos. En un ensayo de control aleatorizado prospectivo a largo plazo, Knutsen y colaboradores descubrieron una proporción de falla del 23% en cada grupo en 5 años y más fallas en el grupo ACI que la microfractura en dos años.37 33% de paciente en 5 años tuvieron evidencia radiográfica de artritis. En una revisión sistemática reciente del tratamiento de defectos del cartílago articular de la rodilla focal Magnussen y colaboradores concluyen que no existe una técnica que sea superior a otras en la valuación clínica o histología38. Claramente no se ha descubierto una solución clínica que pueda proporciona un gran porcentaje de pacientes con excelentes resultados en seguimiento a largo plazo.

Una solución propuesta a los retos anteriores es un procedimiento de una etapa que tenga morbilidad limitada, simplicidad técnica, y promueva la retención del fenotipo de condrocitos en un defecto articular al proporcionar tanto un andamio tridimensional como factores de crecimiento condrogénicos apropiados con un alto grado de bioactividad. El andamio maximizaría idealmente la integración, viabilidad y función de los condrocitos y el factor de crecimiento.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones y métodos para usar anfifilos péptidos (PA) de auto-ensamble como andamios o matrices para promover la regeneración de tejido asemejándose más estrechamente a las propiedades histológicas, bioquímicas y arquitectónicas del cartílago de hialina. Los PA que tienen una secuencia de péptido con una propensión para enlace específico, fuerte al factor de crecimiento transformante (TGFJ-ß? se examinaron en combinación con la microfractura para la reparación de defectos de cartílago articular en un modelo de conejo. Entre todas las secuencias de péptido 7-mer posibles, el péptido HSNGLPL (SEQ ID N0:1) se identificó usando la metodología de expresión en fago como una secuencia de enlace específico, fuerte, para el TGF-ß? recombinante .27,3 ' 40 En la técnica de expresión en fago, el péptido se muestra en el bacteriófago con el His en la N-terminal libre y el Leu C-terminal se acopla a la capa de proteínas del fago a través de un péptido espaciador GGGS (SEQ ID NO:2). En una modalidad preferida de la presente invención, el péptido "de enlace a TGF" y el péptido espaciador se unen adicionalmente a un péptido formador de beta-hoja, que se conjuga a un ácido graso que promueve la agregación y el auto-ensamble de beta-hoja del péptido, dando por resultado en consecuencia una matriz nanoestructural fibrilar. Aunque no se proponga ser limitado por la teoría, esta estructura puede servir para imitar la presentación del péptido de enlace a TGF sobre el bacteriófago, pero usando una estructura de péptido totalmente sintética. Este andamio de auto-ensamble, sintético se puede usar como un vehículo de suministro para el TGF-ß? humano recombinante, exógeno (rhTGF-ß?), localizando y prologando la biodisponibilidad; o se puede usar como una matriz de gel in vivo para concentrar y proteger el TGF-ß? endógeno liberado por las células en un defecto del cartílago durante la microfractura o procedimientos ACI. Las mismas nanofibras de anfifilos péptidos pueden también servir como un andamio para promover la formación de coágulos, retención, supervivencia y diferenciación de células, células madre mesenquimatosas (MSCs) o condrocitos autólogos.

El TGF-ß? tiene una función significativa en la red reguladora de los factores de crecimiento que mantiene el cartílago articular en el fenotipo diferenciado.41 Adicionalmente, el TGF-ß? es un factor necesario y crítico para inducir la condrogénesis en las MSCs derivadas de la médula ósea.42 En la ingeniería de tejidos de cartílago articular, se ha mostrado que el TGF-ß? incrementa la producción de colágeno y proteoglicano inhibe el rompimiento de la matriz.43 Aunque no se proponga ser limitado por la teoría, la adición de un péptido de enlace a TGF a un andamio de nanofibras de anfifilos péptidos pueden aumentar la influencia condrogénica del andamio in vivo. Como se muestra en este documento, cuando un andamio de péptido auto-ensamblado se aplica a un defecto de cartílago articular después de la microfractura, que permite que la médula ósea contenga MSCs para infiltrar el defecto, el andamio promueve exitosamente la producción de matriz de cartílago y la regeneración de cartílago similar a hialina.

Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proporcionar andamios de auto-ensamble para la regeneración de cartílago, tales como andamios que toman la forma de una matriz nanofibrosa o gel compuesto de una mezcla acuosa de moléculas de anfifilos péptidos (PA) "de enlace a TGF" y otras moléculas de anfifilos péptidos no especificas (llamadas en este documento Pas "rellenadoras" ) . Los anfifilos péptidos de enlace a TGF-ß? de la presente invención incluyen, en un mínimo, los siguientes segmentos: (1) un segmento de péptido de enlace al factor de crecimiento seleccionado de uno o más péptidos relacionados identificados a través de la metodología de expresión en fago; (2) un segmento espaciador que confiere tanto solubilidad como flexibilidad al péptido; (3) un segmento de péptido estructural que confiere a la molécula con la capacidad de formar una estructura secundaria de beta-hoja, y (4) un segmento lipofílico, compuesto en general de una cadena de alquilo individual.

Se entenderá por aquellas personas expertas en la técnica que uno o más aspectos de esta invención pueden cumplir ciertos objetivos, mientras que uno o más de otros aspectos pueden cumplir ciertos otros objetivos. Cada objetivo no se puede aplicar igualmente, en todos sus aspectos, a cada aspecto de esta invención. Como tal, los siguientes objetivos se pueden observar en la alternativa con respecto a cualquier aspecto de esta invención.

Mientras que es un objetivo de la presente invención proporcionar una composición de anfifilos péptidos que se enlaza al factor de crecimiento TGF-ß?, se entenderá por aquellas personas expertas en la técnica que, debido a la homología de secuencia variante entre las proteínas de señalización extracelulares en la superfamilia TGF, un anfifilo péptido que se enlaza a TGF-ß? también se puede enlazar más o menos fuerte a otras isoformas TGF-ß, así como también un intervalo de otras proteínas, incluyendo proteínas morfogénicas óseas (BMPs), factores de diferenciación de crecimiento (GDFs) , activinas, inhibinas, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) , Nodal y Lefty.44 Se anticipa que una o más de estas proteínas pueden encontrar uso en sistema descrito, se suministran exógenamente , proteínas recombinantes o factores endógenos cuya actividad biológica es afectada o alterada por la presencia del anfifilo péptido. Por lo tanto, las referencias en este documento a "enlace a TGF" no se deben considerar para limitar el alcance de la invención descrita a una sola proteína o factor de crecimiento.

Es, adicionalmente, un objetivo de la presente invención proporcionar una molécula de anfifilo péptido (PA) como se describe en lo anterior, en donde el segmento espaciador incluye la secuencia de aminoácidos " (Gly) mXaa (Xbb) n", en donde m y n son números enteros que varían independientemente entre 0 y 5, de manera preferente entre 1 y 3, donde Xaa es cualquier aminoácido (serina en una modalidad preferida) , y en donde Xbb es un residuo de aminoácido seleccionado de aquellos con cadenas laterales ácidas, incluyendo, por ejemplo, ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D) . El uso de este segmento de péptido espaciador facilita la mezcla homogénea con otros anfifilos péptidos que contienen residuos de aminoácido con cadenas laterales ácidas, y proporciona fuerte gelificación adecuada bajo condiciones fisiológicas.

En una modalidad alternativa, el segmento espaciador puede contener un componente no de péptido, tal como un segmento de alquilo (por ejemplo ácido 6-aminohexanoico) o un segmento de polietilenglicol (PEG) . Este espaciador no de péptido puede modificar la velocidad de solubilidad o degradación del compuesto in vivo.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar moléculas de anfifilo péptido como se describe en lo anterior, en donde el segmento de péptido estructural incluye la secuencia de aminoácidos " (Ala) p (Val) q", en donde p y q son números enteros que varían independientemente entre 0 y 6, más de manera preferente entre 2 y 4. Es todavía otro objetivo de la presente invención proporcionar moléculas de anfifilo péptido como se describe en lo anterior en donde el segmento lipofílico es un alcano saturado que varía de seis a veintidós carbonos en longitud, y es más de manera preferente doce a dieciséis carbonos en longitud.

Un compuesto particularmente preferido que es bien adecuado para el uso como un andamio para la regeneración del cartílago tiene la siguiente secuencia de péptidos: HSNGLPLGGGSEEEAAAVVVK (SEQ ID NO : 3 ) Cuando se conjuga a un componente lipofílico preferido, el anfifilo péptido que contiene esa secuencia tiene la siguiente estructura: HSNGLPLGGGSEEEAAAVVV (K) -CO (CH2) 10CH3 (SEQ ID NO:4) En esta modalidad, el péptido de enlace a TGF (HSNGLPL) (SEQ ID NO: 1) es presentado en la N-terminal de la secuencia de péptidos, con el residuo de histidina como una amina libre; el segmento espaciador es GGGSEEE (SEQ ID N0:5); el segmento formador de beta-hoja es AAAVVVK (SEQ ID NO: 6), y el segmento lipofílico es un ácido graso saturado de dodecilo (doce carbonos) conjugado con la épsilon-amina en la cadena lateral de la lisina C-terminal (K) . Esta estructura se muestra esquemáticamente en la Figura la.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar mezclas del anfifilo péptido de enlace a TGF y un anfifilo péptido "rellenador" no específico. La mezcla en esta forma permite que la concentración de los péptidos de enlace a TGF sea variada independientemente y de una manera controlada de la concentración total de las nanofibras de anfifilo péptido. Mientras que no se proponga ser limitado por la teoría, el mezclado o "dilución" del péptido de enlace a TGF con un PA rellenador puede facilitar el ensamble de nanofibra y el factor de crecimiento. Que se enlaza a la estructura auto-ensamblada. Adicionalmente, la selección apropiada del PA "rellenador" puede conducir a biocompatibilidad mejorada con los tipos de células condrogénicas, enlace más homogéneo con el PA de enlace a TGF y gelificación mejorada bajo condiciones fisiológicas; sin embargo, la determinación de la combinación óptima implica solo experimentación de rutina y de esta manera está muy dentro de la experiencia ordinaria. En una modalidad preferida, el PA rellenador tiene la siguiente estructura: H3C (CH2) nC0- (Xxx) x- (Xyy) y- (Xzz) z donde Xxx y Xyy son aminoácidos con cadenas laterales no polares, Xzz es un aminoácido con una cadena lateral ácida, n es un número entero que varía de 4 a 20, y x, y, y z son números enteros que pueden variar independientemente de 2 a 6. En una modalidad más preferida, Xxx es valina, Xyy es alanina, Xzz es ácido glutámico y n = 14. Una modalidad aún más preferida del PA rellenador tiene la secuencia de péptidos VVVAAAEEE (SEQ ID N0:7). Cuando se conjuga a un segmento lipofílico preferido este anfifilo péptido tiene la siguiente estructura: H3C (CH2) 14CO-VVVAAAEEE (SEQ ID N0:8) En esta modalidad, el segmento lipofílico es ácido palmitico, que se conjuga a la N-terminal del péptido. La C-terminal del péptido es un ácido libre. La estructura de este compuesto se ilustra esquemáticamente mostrada en la Figura Ib.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar una composición compuesta de uno o más anfifilos péptidos auto-ensamblados para formar una o más micelas no esféricas, por ejemplo micelas cilindricas, ejemplos de las cuales se incluyen, pero no se limitan a, nanofibras . La composición puede incluir una mezcla de anfifilos péptidos de enlace a TGF y anfifilos péptidos "rellenadores" , como se describe en lo anterior. Estos anfifilos se pueden mezclar en principio en cualquier relación, aunque en una modalidad preferida se mezclan en una relación molar de 1:9 (es decir una molécula de PA de enlace a TGF por nueve moléculas rellenadoras ) . La composición también puede tomar la forma de un substrato proporcionado con micelas no esféricas auto-ensambladas sobre por lo menos una porción del substrato, por ejemplo por un recubrimiento de nanofibras dispuestas en el mismo. Este substrato puede consistir de un implante ortopédico, andamio u otro dispositivo propuesto para el uso de la reparación o reemplazo de tejidos musculoesqueléticos .

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar geles biocompatibles, biodegradables compuestos de anfifilo péptido y/o composiciones de anfifilos péptidos, tales como geles que se usan en la creación de andamios o matrices, que pueden o no incluir células aisladas, en un paciente humano para crear o inducir que el cuerpo cree un equivalente de tejido. Estos geles pueden promover el injerto de células y proporcionar plantillas tridimensionales para la regeneración del cartílago. El tejido resultante se espera que sea similar en composición e histología al tejido de cartílago de origen natural, en contraste con el fibrocartílago del tejido de cicatrización que da por resultado en general la ausencia de intervención, durante el proceso de sanación natural del cuerpo después de la creación de un defecto del cartílago articular de espesor total.

Para ese fin, la presente invención proporciona en una modalidad una solución de anfifilo péptido de auto-ensamble que se puede inyectar directamente en un sitio objetivo dentro de un paciente humano, en donde el gel de anfifilo péptido de auto-ensamble se organiza en un andamio o matriz fibrilar. En una modalidad, la solución de péptido de auto-ensamble se puede mezclar con médula ósea derivada de MSCs in situ para formar un coágulo de gel. En otra modalidad, las células tales como condrocitos autólogos se pueden suspender en un gel de anfifilo péptido auto-ensamblado que se preforma en una matriz fuera del cuerpo, el cual luego se puede implantar en un paciente humano. Finalmente, el gel de anfifilo péptido auto-ensamblado se degrada, dejando solamente el tejido resultante. En todavía otra modalidad de la presente invención, el anfifilo péptido de la presente invención se usan en conjunción con otros materiales de ingeniería de tejidos, ya sea como un gel, sólido, o líquido y se usan para formar en plantilla el crecimiento de tejido del cartílago en una o más de las superficies articulares de una articulación en un paciente humano .

Una persona de experiencia en la técnica reconocerá fácilmente que un gel o sólido compuesto de nanofibras bajo condiciones fisiológicas de pH, temperatura y tonicidad da la oportunidad de usar este material para una amplia gama de propósitos y en una variedad de diferentes aplicaciones biomédicas potenciales y de ingeniería de tejidos.

Por consiguiente en una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un paciente con material de ingeniería de tejidos que incluye la etapa de administrar una composición de anfifilo péptido a un sitio objetivo en el paciente en necesidad de un material de ingeniería de tejidos.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar métodos y composiciones para alterar (por ejemplo, aumentar o estimular) la diferenciación y el crecimiento de células (por ejemplo, células madre mesenquimatosas y condrocitos) . En particular, la presente invención se refiere a composiciones compuestas de uno o más anfifilos péptidos de auto-ensamble (por ejemplo, en solución) que generan (por ejemplo, auto-ensamble en) nanofibras que son capaces de encapsular células y promover la condrogénesis y la expresión de matriz del cartílago subsecuente (por ejemplo, regeneración del cartílago) y métodos para usar los mismos. Las composiciones y métodos de la presente invención encuentran uso en la investigación e instalaciones clínicas (por ejemplo, terapéuticas) . Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar composiciones farmacéuticas compuestas de uno o más anfifilos péptidos, tales como aquellos descritos en la Figura 1.

Estos y otros objeticos y características de la invención serán más totalmente evidentes cuando la siguiente descripción detallada se lea en conjunción con las Figuras acompañantes y los ejemplos. Sin embargo, se va a entender que tanto el sumario de la invención anterior y la siguiente descripción detallada son de una modalidad preferida, y no restrictiva de la invención u otras modalidades alternas de la invención. En particular, mientras que la invención se describe en este documento con referencia a una variedad de modalidades especificas, se apreciará que la descripción es ilustrativa de la invención y no se considera como limitante de la invención. Pueden ocurrir varias modificaciones aplicaciones a aquellas personas quienes son expertas en la técnica, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, como se describe por las reivindicaciones adjuntas. Del mismo modo, otros objetivos, características, beneficios y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de este sumario y ciertas modalidades descritas a continuación, y serán fácilmente evidentes para aquellas personas expertas en la técnica que tienen el conocimiento de varios compuestos anfifílicos, técnicas de auto-ensamble y síntesis de péptido. Estos objetivos, características, beneficios y ventajas serán evidentes a partir de lo anterior como tomado en conjunción con los ejemplos acompañantes, datos, figuras y todas las inferencias razonables que se derivan de las mismas, solos o con consideración de las referencias incorporadas en este documento .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Varios aspectos y aplicaciones de la presente invención serán evidentes al artífice experto en consideración de la breve descripción de las figuras y la descripción detallada de la presente invención y sus modalidades preferidas que sigue; La Figura 1 representa las estructuras químicas del anfifilos péptidos (PA) referidos en este documento como el "PA de enlace a TGF" (SEQ ID NO: 4) y el "PA rellenador" (SEQ ID NO: 8) .

La Figura 2 representa los resultados de la espectroscopia de masa MALDI-TOF de un PA de enlace a TGF (SEQ ID NO:4) y un PA rellenador (SEQ ID NO:8). La masa esperada se observa para cada compuesto como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 3 muestras cromatografías de HPLC analíticas de un PA de enlace a TGF (SEQ ID NO: 4) ay PA rellenador (SEQ ID NO: 8), que muestra la pureza del péptido de los dos compuestos, y se plantea en el Ejemplo 3.

La Figura 4 muestra fotografías que documentan: (a) la creación quirúrgica de un defecto del cartílago articular en la rodilla de un conejo; (b) el procedimiento de microfractura y sangre de la médula resultante liberada del hueso osteocondral en el sitio de defecto; y (c) el relleno de uno o más de los dos defectos (indicados por una flecha) con un gel de anfifilo péptido de auto-ensamble compuesto del PA de enlace a TGF y PA rellenador.

La Figura 5 (a) -Figura 5(d) son fotografías representativas de animales en el grupo 1 al 4 de tratamiento (de izquierda a derecha) , que muestra la superficie articular de la tróclea de conejo después del sacrificio en el punto final de doce semanas del estudio. Los defectos del cartílago circular, quirúrgicamente creados son indicados por las flechas pequeñas. Las imágenes (c) y (d) muestran el tejido significativamente más similar a hialina que rellena los defectos en animales tratados con el PA de enlace a TGF.

La Figura 6 (a) -Figura 6(d) son micrografías representativas que muestran la tinción histológica de Safranin-0 de secciones de tejido de animales en el Grupo 1 de tratamiento (izquierda superior) , Grupo 2 (derecha superior) , Grupo 3 (izquierda inferior) y Grupo 4 (derecha inferior) . Cada sección es a través del centro de un defecto del cartílago, cosechadas en 12 semanas. Las flechas pequeñas indican los bordes aproximados del defecto original en cada imagen. La tinción roja indica la presencia de glicosoaminoglicanos (GAG) , principalmente hialuronano, que es indicativo del cartílago similar a hialina.

La Figura 7 (a) -Figura 7(d) son micrografías representativas que muestran la tinción inmunohistoquímica de tipo-II de colágeno de secciones de tejido de animales en el Grupo 1 de tratamiento (izquierda superior) , Grupo 2 (derecha superior), Grupo 3 (izquierda inferior y Grupo 4 (derecha inferior) . Cada sección es a través del centro de un defecto del cartílago, cosechado en 12 semanas. Las flechas pequeñas indican los bordes aproximados del defecto original en cada imagen. La tinción café indica la presencia de colágeno de tipo II, un marcador para el cartílago similar a hialina maduro, como es distinto del fibrocartílago, que expresó principalmente colágeno de tipo I.

La Figura 8 muestra una gráfica de los registros histológicos O'Driscoll para los cuatro grupos de tratamiento examinados. Cada punto de datos (círculos) representa el registro promedio de tres evaluadores ciegos de tratamiento para un defecto del cartílago particular. Los registros posibles varían de 0 (sin tejido de reparación similar a hialina y de generación extensiva) a 24 (cartílago similar a hialina completamente normal). Las barras de erros representan 95% de intervalos de confidencia para el registro medio en cada grupo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento se pueden usar en la práctica o prueba de las modalidades de la presente invención, los métodos, dispositivos, y materiales preferidos ahora se describen. Sin embargo, antes de que los presentes materiales y métodos se describan, se va a entender que esta invención no se limita a las moléculas, composiciones, metodologías o protocolos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar de acuerdo con la experimentación y optimización de rutina. También se va a entender que la terminología usada en la descripción es para el propósito de describir las versiones o modalidades particulares solamente, y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención que se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado como es tendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual estás invención pertenece. Sin embargo, en caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, se controlará. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, las siguientes definiciones aplican: Como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "un" y "el", "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. De esta manera, la referencia a una "célula" es una referencia a una o más células y equivalentes de la misma conocidos por aquellas personas expertas en la técnica, y asi sucesivamente .

Como se usa en este documento, el término "nanofibra" se refiere a un filamento alargado o similar al hilo que tiene un diámetro de igual a o menos que 100 nanómetros .

Como se usa en este documento, el término "micela cilindrica" se refiere a un agregado coloidal con una forma de alta proporción dimensional, no esférica (longitud/diámetro > 10), compuesta de moléculas anfifilicas en las cuales la parte hidrofóbica (o lipofilica) de la micela tienden a localizarse lejos de la fase polar (por ejemplo agua) mientras que las partes polares de la molécula (grupos) tienen a localizarse en la interfase de micela-solvente .

Como se usa en este documento, el término "condiciones fisiológicas" se refiere al intervalo de condiciones de temperatura, pH y tonicidad (u osmolalidad) encontradas normalmente dentro de los tejidos en el cuerpo de un humano viviente.

Como se usa en este documento, los términos "auto-ensamble" y "auto-ensamblaje" se refiere a la formación de una estructura agregada, no aleatoria, discreta de partes componentes; en ensamble que se lleva a cabo espontáneamente a través de movimientos aleatorios de los componentes (por ejemplo moléculas) debido únicamente a las propiedades químicas o estructurales inherentes de estos componentes.

Como se usa en este documento, los términos "andamio" y "matriz" se refiere intercambiablemente a una estructura natural o sintética o red de estructuras con porosidad abierta que se extiende en el espacio y proporciona mecánica u otro soporte para el crecimiento de tejido viviente, ya sea en el cuerpo o in vitro.

Como se usa en este documento, el término "gel" se refiere a un material viscoelástico, semisólido (capaz de resistir algunas tensiones mecánicas sin deformación) , que se forma por la coagulación de un líquido coloidal, compuesto de una matriz fibrosa e intersticios llenados con fluido.

Como se usa en este documento, el término "péptido-anfifilo" se refiere a una molécula que, en un mínimo, incluye un segmento lipofílico no de péptido, y un segmento de péptido que tiene por lo menos seis residuos de aminoácido. El anfifilo péptido puede expresar una carga neta en pH fisiológico, ya sea una carga neta positiva o negativa, o puede ser zwitteriónico (es decir, que lleva cargas tanto positivas como negativas).

Como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, el término "segmento lipofilico" se refiere a la porción de hidrocarbono dispuesta en o aproximadamente la terminal del anfifilo péptido. Este segmento lipofilico puede ser referido en este documento en cualquier lugar como componente hidrofóbico o segmento hidrofóbico. El segmento lipofilico debe ser de una longitud deficiente para proporcionar un comportamiento anfifilico y la formación de mácelas en agua u otro sistema de solvente polar .

Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, el segmento lipofilico se compone de manera preferente de una cadena de alquilo lineal, saturada, individual de la fórmula: CnH2n-iO-, donde n = 6 - 22. En una modalidad preferida, este segmento lipofilico se puede enlazar covalentemente a través de un enlace de péptido a la amina N-terminal del péptido, o a la épsilon amina de un residuo de lisina C-terminal.

Como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, el término "segmento espaciador" se refiere a una secuencia de aminoácidos intermedia de la molécula de anfifilo péptido que confiere tanto solubilidad como flexibilidad al péptido. En una modalidad preferida, el segmento espaciador incluye la secuencia de aminoácidos " (Gly) mXaa (Xbb) n", en donde m y ri son números enteros que varían de 0 y 5, más de manera preferente entre 1 y 3, en donde Xaa es cualquier aminoácido (serina en una modalidad más preferida) , y en donde Xbb esi un residuo de aminoácido seleccionado de aquellos con cadenas laterales acidas, incluyendo, por ejemplo ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D) . En el contexto de la presente invención, un segmento espaciador particularmente preferido tiene la secuencia de aminoácidos GGGSEEE (SEQ ID NO: 5) .. Este segmento espaciador se usa en el anfifilo péptido ejemplar SEQ ID NO: , que tiene la siguiente estructura: HSNGLPLGGGSEEEAAAVVV (K) -C0 (CH2) i0CH3 El incremento o disminución de la longitud de la cadena lateral del residuo de aminoácido ácido también puede modificar la solubilidad del anfifilos péptidos que contienen ese residuo, como puede cambiar el número de grupos de ácido carboxílico en la cadena lateral. Por consiguiente, la presente invención contempla una molécula de anfifilo péptido en donde Xbb (como se describe, en lo anterior) es un aminoácido sustituido ' alfa con ,1 a 5, de manera más preferente 1 a 3 átomos de carbono entre el alfa-carbono y uno o más residuos de ácido carboxílico. En una modalidad preferida, X se selecciona de ácido aminomalónico (Ama), ácido aspártico (Asp) , ácido : glutámico (Glu) , ácido aminoadipico (Aib) , ácido aminoheptanodioico (Apm) o ácido gammacarboxi-glutámico -(Gla) .

Como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, el término "segmento de péptido estructural" se refiere a la secuencia de aminoácidos intermedia de la molécula de anfiifilo péptido compuesta en general de tres a diez residuos de aminoácido con cadenas laterales no cargada, no polares, seleccionadas por su propensión para formar una estructura secundaria de beta-hoja. Ejemplos de residuos de aminoácido adecuados seleccionados de los veinte aminoácidos de origen natural incluyen Met (M) , Val '(V), lie (I), Cys (C) , Tyr (Y), Phe (F), Gln (Q)> , Leu (L), Thr (T), Ala (A), Gly (G) , (listados en orden de su propensión para.: formar beta hojas) . Sin embargo, también se pueden usar aminoácidos de origen no natural de propensión formadora de beta-hoja similar. En una modalidad más preferida, un formador de beta-hoja fuerte y débil se usan en combinación, por ejemplo tomando la forma de (XA) Na (XB) Mb (Xc) NC, donde XA y XB se seleccionan de A, L, V y G, Xc es aminoácido, Na y Nb son 2, 3 o 4 y Nc varia de 0 a 3. Ejemplos ilustrativos incluyen (SEQ ID NOs:9-20) VVVAAA AA'AVVV LLLAAA VVVVVV VVVLLL LLLVVV AAÁAAA AAAAGGG LLLLLL AAAGGG LLLGGG AAALLL En una modalidad preferida, Xc es un residuo de aminoácido con una cadena lateral amino-terminada , que incluye pero no se limita a lisina u ornitina, en donde la funcionalidad de la amina de la cadena lateral f cil.it;¡ la unión del segmento lipofilico al péptido. En el contexto de la presente invención, un segmento de péptido estructural particularmente preferido .tiene la secuencia de aminoácidos AAAVVVK (SEQ ID NO: 6) : Este segmento estructural se usa en el anfifilo péptido ejemplar SEQ ID NO: 4, que tiene la siguiente estructura: HSNGLPLGGGSEEEAAAWV (K) -CP (CH2) 10CH3 Como se usa en este documento, el término "factor de crecimiento" se refiere a la amplia clase de polipéptidos bioactivos que controlan y regulan una variedad de procesos biológicos endó jenos y celulares, tales como progresión da ciclo celular, diferenciación celular, función reproductiva, desarrollo, motilidad, adhesión crecimiento neuronal, morfogénesis ósea, sanación de heridas, vigilancia inmune y apoptosis celular. Lós factores de crecimiento operan típicamente al enlazarse a los sitios receptores específicos sobre la superficie de las células objetivo. Los factores de crecimiento incluyen, pero no se limitan a, citocinas, quimiocinas, hormonas de polipéptido y los antagonistas de enlace al receptor de los mismos. Ejemplos de factores de crecimiento bien conocidos incluy«:n pero no se limitan a: • Factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß) ; • Proteina Morfogénica Ósea (BMP) ; • Interleucina-17 ; • Factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a) ; Proteina de matriz oligomérica de cartílago (COMP) ; • Factor de Señalización de Densidad Celular (CDS); • Factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF) ; • Factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; • Eritropoyetina (EPO) ; • Factor de crecimiento de fibroblasto (FGF); • Factores Neurotróficos Derivados de Células Gliales (GDNF) ; • Factor de estimulación de colonia de granulocitos (G-CSF) ; • Factor de . estimulación de colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) ; • Factor de diferenciación de crecimiento (GDF) ; • Miostatina (GDF- 8 ) ; • Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF] ; • Factor de crecimiento similar a insulina (IGF); • Citocina - 1 inhibidora de macrófago (MIC-1) ; • Factor de crecimiento de placenta (PIGF); Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; • Concentrado de trombocitos (PRP) ; • Trombopoyetina (TPO) ; • Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; • Activina e Inhibina; • Coagulógeno ; • Foli tropina ; • Gonadotropina y Lutropina; • Sustancia Inhibidora Mülleriana (MIS) también llamada: Hormona anti-Mülleriana (AMH) , factor inhibidor Mülleriano (MIF) y hormona inhibidora Mülleriana (MIH) ; • Nodal y Lefty;. y • Noggin.

Las moléculas' terapéuticas que regulan, inducen o participan en los procesos biológicos útiles en el cuerpo, incluyendo aquellos listados en lo anterior, son categorizados o clasificados frecuentemente de acuerdo con su estructura particular o función. Por ejemplo, las proteínas inmunoreguladoras secretadas por células del sistema inmune, tales como interleucina e interferón, son referidas frecuentemente como citocinas. Otras categorías de moléculas reguladoras incluyen, pero no se limitan a: - morfógenos (por ejemplo, moléculas que regulan o controlan la formación y diferenciación de tejidos y órganos) ; - quimiocinas (por ejemplo, cualquiera de un grupo de citocinas producidas por varias células, como en los sitios de inflamación, que estimulan la quimiotaxis en los glóbulos blancos tales como neutrófilos y células T) ; hormonas (por ejemplo, un producto de células vivientes que circula en los fluidos corporales tal como sangre y produce un efecto estimulador frecuente, especifico en la actividad de las células, remotas usualmente de su punto de origen) ; - receptores (por ejemplo, una molécula presente sobre una superficie celular o en el interior de la célula que tiene una afinidad para una entidad química específica, incluyendo ambas sustancias endógenas tales como hormonas y ligandos así como materiales extraños, tales como partículas virales, que sirve como un intermediario entre el agente estimulador y la respuesta fisiológica o farmacológica cadena abajo de la misma ) ; - agonistas de enlace de receptor (por ejemplo, una sustancia química . capaz de combinarse con un receptor específico sobre una célula e iniciar la misma reacción o actividad producida típicamente por la sustancia de en lace endógena (tal como una hormona) ) ; y - agonistas de enlace al receptor (por ejemplo, una sustancia química que reduce la actividad fisiológica de otra sustancia química (tal como una hormona) al combinarla con y al bloquear uno o más receptores asociados con la misma.

Aunque la presente invención encuentra uso particular en relación con el factor de crecimiento TGF-ß?, aquellas personas expertas en la técnica sabrán que los principios de la presente invención se pueden aplicar fácilmente a enlace de otros factores de crecimiento.

Como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, el término "péptido de enlace al factor de crecimiento" se refiere a una secuencia de péptidos N-terminalmente dispuesta compuesta de 7 residuos de aminoácidos, en donde el péptido se identifica corno una secuencia de enlace fuerte y específica para un factor de crecimiento particular que usa metodología de expresión en fago. En el auto-ensamble, en péptido de enlace al factor de crecimiento se expone en la superficie de la nanofibra, sirviendo en consecuencia como una señal bioactiva presentada al medio ambiente.

Ejemplos de secuencias de péptido de enlace al factor de crecimiento adecuadas para el uso en el contexto del anfifilo péptido de la presente invención incluyen, pero no se limitan a aquellas descritas en la solicitud de Patente de E.U.A. 2005-0209145, "Sel f-assembling peptide amphiphiles and related methods for grow factor delivery" como secuencias de enlace para TGF-ß? derivado usando la expresión en fago (SEQ ID NOs :21-29) : HSNGLPL SHSYNRL TPLHRYV TDWTSVR HIWRPAP ATPSTTR STPPYKG ATVSKWA KQI PSPL En principio, las secuencias derivadas de la expresión en fago pueden ser capaces de enlazarse a un factor de crecimiento en orientación' ya sea C-terminal o N-terminal. La reversión de la polaridad de las secuencias anteriores genera un segundo conjunto.de péptidos de enlace al factor de crecimiento (SEQ ID NOs- : 30-38): LPLGNSH LRNYSHS VYRHLPT R.VSTWDT PAPRWIH RTTSPTA GKYPPTS AWKSVTA LPSPIQK Como se entenderá por una persona experta en la técnica de la química de péptido, otras variaciones en la ¦ secuencia de enlace al factor de crecimiento son posibles y pueden conducir al anfifilos péptidos con resistencia y selectividad incrementada o disminuida para enlazarse al factor de crecimiento TGF-ß?. Estos incluyen sustituir uno o más de los residuos de aminoácido no polares (L, I, V, G o A), con otros, residuos similarmente no polares, o sustituir un residuo R positivamente cargado con un residuo a K (o vice versa). Además, los péptidos cíclicos, formados a través de la reticulación de dos o más residuos de aminoácido en los péptidos descritos en lo anterior, pueden ser útiles para las aplicaciones descritas en lo anterior. En una modalidad preferida, un grupo funcional amina del péptido HSNGLPL (SEQ ID NO: 1), por ejemplo la amina N-terminal, la cadena lateral de histidina, o asparagina, se pueden reticular con un grupo funcional hidroxilo en otra parte en el péptido, por ejemplo en cualquiera de la serina o residuos de ácido glutámico en SEQ ID NO: 4. Mientras que no se proponga ser limitado por la teoría, esta reticulación da por resultado la presentación cíclica del dominio de enlace TGF-ß?, que a su vez puede proteger el residuo N-terminal de la degradación enzimática por aminopeptidasas, y de esta manera da por resultado la señalización biológica aumentada o enlace de proteína por el péptido.

Las secuencias de péptido de la presente invención incluyen residuos de aminoácidos que se pueden someter a modificación o síntesis. Por ejemplo, la desamidación de la asparagina, Asn (N) , a través de un intermediario de succinimida es una modificación de proteínas postraduccional común que da por resultando la transformación de la cadena lateral Asn a aquella del ácido aspártico, Asp (D), o ácido isoaspártico, isoAsp (D*) . Esta modificación asociada en algunos casos con un efecto alterando (aumentado o reducido) sobre la actividad biológica de .'la proteína de substrato. Por otra parte, los péptidos sintéticos que contienen residuos de Asn pueden · someterse a la desamidación durante la manufactura, particularmente cuando . se exponen a pH alcalino y a temperaturas elevadas. En el caso de los péptidos terapéuticos, este proceso puede conducir a eficacia alterada (aumentada o reducida) . De esta manera una modalidad de la presente invención es modificar las secuencias de enlace a TGF-ß? anteriores tal que los residuos de Asn se reemplazan con Asp o isoAsp, tal como HSDGLPL (SEQ ID NO. 39) o HSD *GLPL (SEQ ID NO . 0) , donde D es ácido isoaspártico. En una modalidad preferida, estas secuencias modificadas se incorporan en un anfifilo péptido como se describe previamente, tal como HSDGLPLGGGSEEEAAAVVV ( K) -CO ( CH2 ) i0CH3. (SEQ ID NO. 41) Los aminoácidos · útiles en el anfifilos péptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos de origen natural y aminoácidos artificiales. La incorporación de aminoácidos artificiales tales como beta o gamma aminoácidos y aquellos que contienen cadenas latearles no naturales, y/u otro monómeros similares tales como hidroxiácidos también se contemplan, con el efecto de que el componente correspondiente es- similar a péptido en este aspecto .

Las moléculas de anfifilo péptido y composiciones de la presente invención se pueden sintetizar usando técnicas preparatorias bien conocidas - por aquellas personas expertas en el campo, de manera preferente, por síntesis de péptido de fase sólida estándar, con la adición de un ácido graso en lugar de un aminoácido estándar en la N-terminal del péptido, en la épsilon amina de una cadena lateral de lisina, usando grupos protectores ortogonales, como sería sabido por una persona experta en la técnica. El ácido graso se enlaza típicamente de manera covalente a . la amina a través de un enlace de peptidilc. La síntesis inicia típicamente de la C-terminal, a la cual los aminoácidos se agregan secuencialmente usando ya sea una resina de amida Rink (que da por resultado -un grupo -NH2 en la C-terminal del péptido después de la escisión de la resina), o una resina Wang (que da por resultado un . grupo -OH en la C-terminal) . Por consiguiente, la presente invención abarca anfifilos péptidos que tienen una porción C-terminal que se puede seleccionar el grupo que consiste de -H, -OH, -COOH, -CONH2, y -NH2.

En soluciones acuosas, las moléculas de PÁ se auto-ensamblan en núcelas cilindricas que entierran el segmento lipofílico en su núcleo y expresan el péptido de enlace al factor de crecimiento sobre la superficie. El péptido estructural se somete a h'idrógeno intermolecular que se une para formar beta-hojas que se orientan en paralelo al eje largo de la micela. Las micelas cilindricas (también referidas como nanofibras) pueden formar geles en agua o varios medios acuosos bajo condiciones fisiológicas en concentraciones que varían típicamente de 0.5 a 4% en peso.

Para inducir el auto-ensamble de una solución acuosa de anfifilos péptidos, el pH de la solución se puede cambiar (elevar o disminuir) o iones multivalentes o polímeros cargados u otras macromoléculas se pueden agregar a la solución. Aunque no se propone ser limitado por la teoría, el auto-ensamble se facilita en el presente caso por la naturalización o clasificación (reducción) de repulsión electrostática entre cadenas laterales ionizadas en el segmento de péptido funcional. Estas micelas cilindricas formadas por auto-ensamble se pueden observar como fibrillas o nanoestructuras de alta proporción dimensional en las cuales el segmento de · péptido funcional se expresa repetitivamente sobre la superficie de la micela.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar' a un paciente con un material de ingeniería de tejidos que incluye la etapa de administrar una composición de anfifilo péptido a. un sitio objetivo, particularmente un defecto de espesor total en el componente cartilaginoso de una o más superficies articulares de una articulación en un paciente humano que es tratado por síntomas de esta lesión de cartílago. Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar métodos y composiciones para alterar (por ejemplo, aumentar o estimular) la diferenciación y crecimiento de las células (por ejemplo, células madre mesenquimatosas y condrocitos ) . En particular, la presente invención se refiere a composiciones compuestas de uno o más de anfifilos péptidos de auto-ensamble (por ejemplo, en solución) que generan (por ejemplo, auto-ensamble en) nanofibras que son capaces de encapsular células y promover la condrogénesis y expresión de matriz de cartílago subsecuente (por ejemplo, regeneración del cartílago) y métodos para usar los mismos. Las composiciones y métodos de la presente invención encuentran uso en la investigación e instalaciones clínicas (por ejemplo, terapéuticas) . Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar composiciones farmacéuticas compuestas de uno o más anfifilos péptidos.

En una modalidad alternativa, la composición de anfifilo péptido se puede' administrar para tratar un defecto o deficiencia del cartílago en un animal no humano. Por ejemplo, este método contempla el uso veterinario en el tratamiento de defectos del cartílago en las articulaciones de rodilla de caballos, sin embargo otros mamíferos grandes (perros, ovejas, cabras, vacas) se pueden beneficiar de este tratamiento.

La composición se puede administrar en cualquier forma adecuada para dirigir la composición de anfifilo péptido al sito de un defecto o deficiencia del cartílago, incluyendo por la colocación directa de un gel preformado durante una artrotomía abierta o durante un procedimiento artroscópico mediante la inyección de una solución acuosa que contiene el anfifilos péptidos. El defecto o deficiencia del cartílago puede ser debido a lesión aguda de la superficie de la unión articular, una condición degenerativa tal como osteoartritis , o una combinación de ambas. El gel se puede formar ín situ en un paciente humano o animal no humano, o se puede preformar fuera del cuerpo al combinar uno o más componentes líquidos. Estos componentes líquidos se usan para disolver el anfifilos péptidos y para inducir el auto-ensamble, y pueden incluir componentes para cambiar el pH de la solución o incluir iones multivalentes (incluyendo pero no limitados a cloruro de calcio) , polímeros cargados u otras macromoléculas cargadas-. Los componentes líquidos también se pueden combinar fuera del cuerpo (in vitro) con células. Estas células se pueden obtente de sangre, aspirado de médula ósea, u otro tejido autólogo del paciente propuesto. Una vez formado, el gel se puede colocar en un defecto del cartílago o de otra manera aplicar a la superficie articular del paciente. En una modalidad preferida, la composición se administra mediante inyección directa o a rt roscópicamente .

La composición de anfifilo péptido se puede administrar solo o en conjunción con otro procedimiento quirúrgico ortopédico, tal como uno propuesto para reparar, restaurar o regenerar cartílago dañado o perdido. Por ejemplo, la composición se puede usar para aumentar otra estrategia clínica para reparar el efecto del cartílago, particularmente después del desbridamiento de una lesión sobre la superficie articular de una articulación en un paciente .

En una modalidad preferida, la composición de anfifilo péptido se administra adecuadamente como un adyuvante a un procedimiento de microfactura que libera sangre y células derivadas de la médula de hueso subcondrial en el sitio de defecto del cartílago. En este contexto, la composición se mezcla con la sangre autóloga y células liberadas del hueso osteocondrial o médula durante el procedimiento de microfractura para formar un coágulo de gel adecuado para la regeneración del cartílago.

En una modalidad alterna, la composición de anfifilo péptido se administra adecuadamente como un adyuvante para la implantación de condrocitos (ACI) . En este contexto, la composición se puede combinar con condrocitos autólogos para formar un andamio de gel que retiene las células benéficas en el sitio de la lesión.

En todavía- una modalidad adicional, la composición de anfifilo péptido se administra adecuadamente como un adyuvante a un trasplante de aloinjerto osteocondral abierto (OATS). En este contexto, la composición se puede usar para formar un gel en el sitio de la lesión.

En otra modalidad, la invención se dirige a kits que comprenden un anfifilo péptido de la presente invención. El kit puede permitir ya sea la formación in vivo de micelas de auto-ensamble o el auto-ensamble in vitro de micelas formadas de anfifilo péptido para la inserción en el paciente. Un kit dirigido a la formación in vivo de micelas se compilará para permitir que el profesional ensamble los componentes en una formulación inyectable para la administración al paciente. Este kit puede comprender una jeringa, un contenedor del anfifilo péptido, y opcionalmente un contenedor de un factor de crecimiento, tal como TGF-ß?, u o otro reactivo para inducir la gelificación, tal como cloruro de calcio. Opcionalmente, el anfifilo péptido está contenido en una jeringa pre-llenada a la cual el TGF-ß? se agrega subsecuentemente. Además, el kit in vivo puede comprender demás una jeringa para extraer células del paciente, las células que' se pueden combinar con el anfifilo péptido, factores de crecimiento u otros componentes para formar la formulación inyectable. Un kit dirigido a la administración in vitro del anfifilo péptido puede comprender el anfifilo péptido, un contenedor que comprende uno o más componentes acuosos usados para disolver y subsecuentemente inducir el auto-ensamble del anfifilo péptido (tal como a través del cambio del pH de la solución o a través de la presencia de iones multivalentes , polímeros cargados u otras macromoléculas cargadas) , y opcionalmente el factor de crecimiento, TGF-ß?. Opcionalmente, el kit puede contener un substrato sobre el cual se recubre con las micelas auto-ensambladas antes de la inserción en el paciente. Opcionalmente, el kit in vitro puede comprender además una jeringa para extraer células del paciente, las células que se pueden combinar con el anfifilo péptido, componente acuoso, y TGF-ß? . Cada uno de los componentes en los kits se puede mantener de manera adecuada en contenedores separados hasta que el profesional esté listo para preparar la formulación para la administración en el paciente.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el primer ejemplo de un gel de anfifilo péptido de auto-ensamble que se puede usar solo o en el contexto de microfractura o trasplante de condrocitos autólogos.

A partir de. ahora, la presente invención se describe con más detalle por referencia a los ejemplos. Sin embargo, los siguientes materiales, métodos y ejemplos ilustran solamente aspectos' de la invención y no se proponen de ninguna manera limitar el alcance de la presente invención. Como tal, los métodos y materiales similares equivalentes a aquellos descritos en este documento se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Síntesis Automatizada y Purificación de Anfifilos péptidos que Contienen el Segmento de Enlace a TGF HSNGLPL (SEQ ID NO: 1) , incluyendo SEQ ID NO: 4 1.1 Reactivos : Los siguientes reactivos, o equivalentes, se usaron como se recibieron: HBTU (hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il ) -1,1,3, 3-tetrametiluronio ) , piperidina, DIEA (n, n, -diisopropiletilamina) , DMF (n, n-dimetilformamida ) , DCM (diclorometano) , . TFA (ácido trifluoroacético) , TIS ( triisopropilsilano ) .. Todo el agua se purificó por osmosis inversa y se filtró usando un sistema MilliporeMR a una resistividad de 18.2 Mohm-cm. Aminoácidos protegidos con 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y Fmoc-Lys (Mtt ) -OH ortogonalmente protegidos se compararon de EMD Biosciences (La Jolla, CA) . Los péptidos se sintetizaron sobre resina de amida Rink (carga de 0.6-0.75 mmol/g). 1.2 Síntesis del Péptido: Los péptidos se sintetizaron a través de la metodología de fase sólida sobre un sintetizador de péptido automatizado (CS Bio Co. modelo 136XT) , usando un recipiente de reacción de vidrio de 250 mL que se invirtió 180° cada dos segundos durante la duración de cada etapa de reacción, a fin de exponer completamente la resina a cada reactivo. La resina primero se hinchó en DCM y DMF, y luego se realizó la desprotección de Fmoc con' 30% en volumen de piperidina en solución DMF durante 10 minutos, se repitió dos veces. Los acoplamientos de aminoácidos se hicieron con 4.0 equivalentes del aminoácido protegido con Fmoc (0.5 M en DMF), 3.8 equivalentes de HBTU (0.475 M en DMF) y 6.0 equivalentes de DIEA (0.75 M en DMF) durante 1 hora por acoplamiento. Cada solución se combinó y se pre-activó por burbujeó con gas nitrógeno de alta pureza durante 3 minutos antes de ser agregados al recipiente de reacción que contiene resina. Cada acoplamiento se realizó una vez. Para una escala de reacción de 1 mmol, se usaron 30 mL de solución para cada etapa de d sprotección y lavado. Todos los reactivos se almacenaron y las reacciones se realizaron bajo gas nitrógeno de alta pureza. Las etapas de lavado de DCM y DMF múltiples se hicieron entre cada etapa de reacción. El primer aminoácido acoplado a la resina de amida Rink fue un Fmoc-Lys (Mtt ) -OH ortogonalmente protegido. Después del acoplamiento, el grupo protector Mtt se removió selectivamente con TFA al 1% en DCM. El componente lipofilico de ácido graso del anfifilo péptido se acopló a la épsilon amina de la Lys como se describe en lo anterior, excepto .2.0 equivalentes del ácido dodecanoico se disolvieron en una mezcla de 50/50 de DMF/DCM y se combinaron con 1.9 equivalentes de HBTU y 3.0 equivalentes de DIEA en DMF. Este acoplamiento se repitió tres veces, después de lo cual el producto se verificó para aminas libres por la reacción de ninhidrina (también conocida como la "prueba de Kaiser") y la reacción se repitió si fuera necesario para obtener un resultado negativo para aminas libres. Después de que se unió el ácido graso, la secuencia de péptido restante se analizó como se describe, progresando de C- a N-terminal. Después de que la porción de péptido de la molécula se sintetizó como se describe, la N-terminal del péptido se desprotegió y se dejó como una amina libre. 1.3 Escisión de la Resina: Resina cargada ¦ con péptidos se transfirió a un recipiente agitador de vidrio de 200 mL, donde la escisión y la desprotección de la resina se llevó a cabo de aproximadamente 50 mL de una mezcla de TFA:TIS:agua en relación de 95.0:2.5:2.5 durante 3 horas. Las solución de anfifilo péptido luego se decantó en un matraz de fondo redondo y el TFA se removió por evaporación giratoria mientras que se calienta la solución a 40°C, usando un recolector a -78°C (hielo seco/isopropanol ) y una presión final de aproximadamente 20 mtorr. La evaporación giratoria se detuvo antes de completar la sequedad, la solución de péptido viscoso restante (típicamente < 1 mL) se trituró con aproximadamente 200 mL de éter dietilico frió (-20°C) . La solución se agitó para asegurar un buen mezclado luego se volvió a enfriar a -20 °C¦ durante toda la noche para permitir la precipitación completa. El anfifilo péptido precipitado resultante se recolectó en un embudo de vidrio de frita medio, se lavó tres veces con éter frío (aproximadamente 200 mL) y se secó bajo vacío (< 20 en Hg) . 1. Purificación : Los anfifilos péptidos se disolvieron en 20 mg/mL en solución acuosa con suficiente hidróxido de amonio para obtener un pH de 9. Esta solución se purificó en 5 mL de alícuotas usando una HPLC preparativa modelo 1100 Agilent, Inc. Equipada con una columna C18 de 5pm Phenomenex, Inc. GeminiMR (100 x 30 mm) . Se usó un gradiente de elución de agua y acetonitrilo (que contiene cada uno 0.1% en volumen de solución amortiguadora de. hidróxido de amonio) . La velocidad de flujo fue de 15 mL/min, y la fase móvil se precalentó a aproximadamente 45°C usando un calentador de columna TL105 de Timberline Instrument. Se supervisó la absorción de UV a 220 nm de longitud de onda, y se. recolectó el eluyente del pico primario. 1.5 Liofilización : Para remover el agua y el acetonitrilo después de la HPLC, se transfirieron las soluciones de anfifilo péptido a un matraz de liofilización de vidrio, se congelaron en concha en un baño de hielo seco/isopropanol a -78 °C, y se liofilizaron durante por lo menos 48 horas en un secador por congelación que opera a una' temperatura de colector de -80°C y a una presión de < 0.100 mbar. Los rendimientos típicos del anfifilo péptido purificado fueron de 60-75% del rendimiento teórico, con una escala de reacción de 1 mmol típica que produce aproximadamente 1.0 - 1.5 g de material con una pureza de péptido de aproximadamente 90% . 1.6 Ajuste de pH : El polvo de anfifilo péptido liofilizado se pesó y se redisolvió en agua de grado farmacéutico USP en una concentración de 10 mg/mL. Una solución de hidróxido de sodio 1 M (NaOH) , se preparó de NaOH y agua de grado farmacéutico USP, se filtró a través de filtro de jeringa PTFE de 0.2 mieras estéril. El pH de la suspensión se ajustó por la adición de pequeñas alícuotas de la solución de NaOH a un intervalo de pH 7.0 - 8.0, haciendo que el péptido vaya rápidamente en la solución.

Ejemplo 2 : Síntesis del Anfifilo péptido Rellenador Ci6H310-WVAAAEEE (SEQ. ID NO: 8) El PA rellenador se sintetizó a través de la síntesis de péptido de fase sólida automatizada como se describe en lo anterior, excepto que se usó una resina de Wang de ácido glutámico precargada. · Los aminoácidos adicionales se acoplaron como se describe, procediendo de C-o N-terminal. Después del acoplamiento de la valina N-terminal, el péptido se terminó con una porción de palmitoilo, que se logró como se describe en el Ejemplo 1.2 Al sustituir el ácido palmítico por ácido dodecanoico. La escisión del péptido de la resina, purificación por HPLC, filtración aséptica y liofilización se realizaron como se describe en los Ejemplos 1.3 - 1.6.

Ejemplo 3: Caracterización química de péptido Anfifilos péptidos Los anfifilos péptidos se caracterizaron para identidad y pureza usando la espectroscopia de masa (MS), cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , y análisis de aminoácido (AAA) , como se describe a continuación. 3.1 Espectroscopia de Masas La identidad de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 8 se confirmó por la espectroscopia de masas de tiempo de vuelo de desorción-desionización de láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), usando un instrumento de DE-PRO Vdyager que opera en modo de ión positivo, con matriz CHCA. 1 uL de una solución de 1 mg/mL se colocaron sobre la placa MALDI . Los espectros de masa se muestran en la Figura 2.

SEQ ID. NO:4 m/z esperado = 2201.22 m/z Encontrado m/z = 2203.90 [M+H+] · . 226.48 [M-H+Na'] 243.22 [M-H+K+] 248.90 [M-H+2Na+] SEQ ID. NO:8 m/z esperado = 1153.68 m/z Encontrado m/z = 1176.78 [M-H+Na1] 1198.91 [M-H+2Na+ ] 1198.92 [M-H+3Na+] 1076.23 supresión de Valina 3.2 HPLC Analítica La HPLC de fase inversa, analítica se realizó para determinar la pureza del péptido de las moléculas sintetizadas. La HPLC se hizo usando un sistema HPLC analítico Agilent 1100 equipado con una columna C18 de fase inversa 110A de 5 um Gemini de Phenomenex Inc. (150x4.6 mm) se calentó a 60°C. Se realizó una elución gradiente usando una fase móvil binaria de (A) H20 que contiene 2% v/v de CH3CN; 0.10% v/v de NH4OH; NH„HC02 20 mM y (B) CH3CN que contiene 2% v/v de H20; 0.07% v/v de NH40H. El gradiente se corrió de 10-100% de B durante 30 minutos a una velocidad de flujo de 1.25 mL/min. Se verificó la absorción de UV a 220 nm de longitud de ondas después de la inyección entre uL de una solución de 1 mg/mL del anfifilo péptido PA en agua. Bajo estas condiciones de elución, la' SEQ ID NO: 4 exhibió un tiempo de retención de 11.34 minutos y la SEQ ID NO: 8 exhibió un tiempo de retención de 16.88 min. La pureza del péptido de ambos compuestos fue de 90% como se determina con base en el área bajo la curva integrada del pico de elución principal. Las cromatografías para ambos anfifilos péptidos se muestran en la Figura 3. 3.3 Análisis de Aminoácido El contenido del péptido y la composición del aminoácido se determinaron por el análisis de aminoácido. Una alícuota de cada anfifilo péptido se hidrolizó en HC1 6N de fase gaseosa a Í10°C durante 65 horas. Después de la hidrólisis, la alícuota se secó y se redisolvió en una solución amortiguadora de carga de carga de borato, y se sometió a análisis cromatográ f ico para determinar los picomoles de cada aminoácido presente, asnado un estándar de proteína de albúmina de suero bovino (BSA) para comparación.

El contenido de péptido de. SEQ ID NO: 4 se descubrió que es 77% en peso, con la composición de aminoácido proporcionada en la T.abla 1. Los resultados fueron consistentes con la secuencia esperada dentro de la resolución del instrumento usado.

Tabla 1. AAA de PA de enlace a TGF Residuo de Aminoácido Residuos esperados/mol Residuos encontrados/mol His 1.0 0.77 Ser 2.0 1 .48 As(x) 1 .0 0.95 Gly 4.0 4.10 Leu 2.0 2.02 Pro 1.0 1 .00 Glu 3.0 3.26 Ala 3.0 3.37 Val 3.0 3.22 Lys 1 .0 1 .09 El contenido de péptido de SEQ ID NO: 8 se descubrió que es 73% en peso, con la composición de aminoácido listado en la Tabla 2. Los resultados fuente consistentes con la secuencia esperada dentro de la resolución del instrumento usado.

Ejemplo 4.

Caracterización In vivo del Anfifilos péptidos como un Adyuvante para la Microfactura para Aumentar la Regeneración del Cartílago 4.1 Creación del Defecto de Cartílago Articular en el Modelo de Conejo.

Se condujo un estudio animal en Northwestern University (Chicago, IL) de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad (ACUC) . Diez (10) Conejos blancos en Nueva Zelanda machos (pesando 3-3.5 kg) se anestesiaron mediante inyección intramuscular de cetamina a 30-40 mg/kg y xilazina 5-7 mg/kg. Se suministraron isoflourano (1-3%) y oxígeno mediante una máscara facial hasta que el animal se indujo a sedación y a anestesia general para el procedimiento completo. La supervisión del mantenimiento de vida se supervisó por veterinarios en el Centro para Medicina Comparativa de la Universidad de Northwestern (CCM, Chicago, IL) . Bajo técnica aséptico estéril, se hizo una incisión de 2-cm de linea media con la rodilla flexionada a 20 grados y subsecuentemente se realizó una capsulotomía parapatelar media y la patela se trasladó lateralmente para exponer la superficie articular de la tróclea. Dos defectos condrales de espesor total de 2-mm de diámetro se crearon en la tróclea (próxima-media y distal-lateral) usando curetas. El cartílago articular, incluyendo la capa de cartílago calcificado, se removió completamente y el hueso subcondrial se expuso usando una microcureta como se muestra en la Figura 4a. Se tomó cuidado de no interrumpir el hueso subcondral, y se crearon bordes agudos en la zona de transición con el cartílago intacto circundante. Se realizó la microfractura dentro de los defectos al crear 3 agujeros igualmente separados, y 2-mm de profundidad al hueso subcondral con un micropunzón. Se observó emerger sangre de la médula de cada agujero de microfractura y se dejó infiltrar el defecto del cartílago (véase la Figura 4b) , que luego se trató como se describe en el Ejemplo 4.2 mediante la aplicación del- gel de anfifilo péptido de enlace a TGF, o un gel de control, con o sin la adición de zGF-ß? recombinante exógeno .

A cada conejo se le proporcionó pos-operativamente antibióticos intramusculares (IM) (Baytril 72 horas de duración) y una medicina para el dolor IM (Buprenex 24 horas de duración) . Los signos de la infección local o sistémica se registraron asi como también la salud general y la recuperación de los conejos. Los conejos también se evaluaron por su capacidad de llevar peso y movilidad dentro de las jaulas. A 12 semanas pos-cirugía los conejos se sacrificaron mediante inyección de pentobarbital intravenosamente con una medición secundaria de toracotomía bilateral.

Subsecuentemente, el fémur distal se cosechó y se procesó para análisis histológico. 4.2 Aplicación del Gel de Anfifilo péptido al Defecto del Cartílago Se crearon- dos defectos de espesor total en cada rodilla, dando por resultado 4 defectos por conejo (o 40 defectos totales para 10 conejos estudiados). Las rodillas del conejo se dividieron en 4 grupos, con ambos defectos en cada rodilla que recibe el mismo tratamiento, y la rodilla contralateral que sirve como un control para tomar en cuenta cualquier efecto sistémico. Un volumen total de 10 microlitros (uL) de las' soluciones de prueba se administraron directamente a cada defecto del cartílago mediante micropipteta, usando puntas de plástico desechables, estériles. El tratamiento recibido por cada grupo se resume como sigue: Grupo 1: 10 uL de PBS con 1 ng de rhTGF-ß? Grupo 2: 8 uL' de PBS con 1 ng de rhTGF-ß? y 0.10 mg de PA rellenador + 2 uL de CaCl2 0.5M Grupo 3: 8 uL de PBS con 1 ng de rhTGF-ß?, 0.0175 mg de PA de enlace a TGF, y 0.0825 mg de PA rellenador + 2 uL de CaC12 0.5M Grupo 4 : 8 uL de PBS con 0.0175 mg de PA de enlace a TGF, y 0.0825 mg de PA rellenador (sin rhTGF-ß?) + 2 uL de CaCl20.5M A fin de inducir la gelificación de las soluciones de anfifilo péptido in . situ en el sitio de defecto se administraron 8 uL de 12.5 mg/mL de una solución de PA en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) seguido inmediatamente por 2 uL de CaCl2 0.5 M (en agua), dando por resultado una concentración final de 10 mg/mL del anfifilo péptido y CaCl2 100 mM. El TGF- ß 1 humano recombinante ( rhTGF-ß?, Peprotech Inc.) se incluyó en las soluciones de PA para el Grupo 1, 2 y 3, en una concentración de 100 nm/mL, dando por resultado una dosis total de 1 ng por defecto en la dosis de tratamiento de 10 uL.' Para los animales que reciben el anfifilo péptido de enlace a TGDF (SEQ ID NO: 4) esta molécula se mezcló a 10% en mol con el anfifilo péptido rellenador (SEQ ID N0:8) (una relación molecular de 1:9) . Cada defecto recibió 0.1 mg anfifilo péptido total (10 mg/mL en una dosis de 10 uL) , cada PA rellenador solo (Grupo 2) o PA rellenador más PA de enlace a TGF (Grupo 3 y 4) . 4.3 Análisis Histológico de Articulaciones de Conejo Después los animales se sacrificaron y el tejido se cosechó a 12 semanas, los especímenes de fémur extraídos se fijaron en formalina amortiguada neutra al 10% se descalcificaron durante 24 horas, . y el tejido se procesó para la incrustación en parafina. Se obtuvieron secciones de 4 pm de espesor desde las secciones transversales centrales de los defectos (1 mm desde el borde de defecto) y se tiñeron histoquímicamente para hemotoxilina y eosina (H&E) , Safranina-O/Fast Green; y colágeno tipo II inmunohistoquímicamente teñido. La clasificación histológica de la reparación del cartílago se realizó por 3 observadores ciegos, independientes, usando una' escala de 24 puntos por O'Driscoll y colaboradores.45 4.4 Análisis Estadístico y Determinación del tamaño de la Muestra La determinación del tamaño de la muestra se basó en un análisis de potencia a priori de estudios de regeneración del cartílago in vivo relacionados que usan grupos de control y experimentales similares con criterios de clasificación histológica y visual similares. El tamaño de la muestra mínima por grupo experimental se determinó con los siguientes parámetros: alfa < 0.05· (CI > 95%); 1-ß > 0.8. Para el error de Tipo II mínimamente aceptado establecido, un tamaño de muestra mínimo de cinco (defectos) se requirió por grupo.

La importancia de diferencia entre los grupos de tratamiento se evaluó con un análisis de una vía de prueba de varianza (ANOVA, F < 0.05) con una prueba post-hoc de Diferencia de Importancia Mínima (LSD) (p < 0.05). La prueba ANOVA multivariada se realizó también la prueba de dos o más variables (factor de crecimiento, tipo PA) entre dos grupos (p < 0.05). Cada defecto se " consideró una muestra independiente. Este método de muestreó es apoyado por estudios previos sobre la correlación del tipo de tejido opuesto dentro de cada defecto con base en la ubicación dentro de la articulación.46 4.5 Observación Animal y Patología Macroscópica En el examen macroscópico, bajo sedación antes del sacrificio, cada conejo tuvo un rango total de movimiento de la rodilla. Se observó que la rodilla de un conejo que tiene dislocación de la rótula no se reconoció hasta el día del sacrificio. Esa rodilla no se incluyó en análisis. Todos los conejos sobrevivieron hasta el punto final del estudio. Ninguno de los conejos en cualquiera de los grupos desarrolló degeneración macroscópicamente evidente o hipertrofia sinovial de la articulación.

No hubo diferencias macroscópicas obvias en 12 semanas entre los Grupos 1 y 2 (rhTGF-ß? soló o con PA rellenador) con respecto al relleno del tejido o apariencia del tejido reparado. Hubo, sin embargo, mejora observable en animales que reciben el PA de enlace a TGF, con o sin rhTGF-ß? exógeno (Grupo 3 y 4) . Como se muestra en la Figura 5, estos grupos exhibieron mayor relleno de defecto con tejido, similar a hialina, y una apariencia reducida del limite del defecto, indicativo de mejor indicación con el tejido circundante. 4.6 Evaluación Histológica de la Regeneración del Cartílago La evaluación cualitativa de las secciones histológicas mostró una mejora obvia en la morfología del tejido en animales tratados con el PA de enlace a TGF (Grupos 3 y 4) comparado con los controles (Grupos 1 y 2). Hubo mayor relleno de tejido, tinción con Safranina-0 y tinción de colágeno Tipo II en los defectos tratados con una mezcla de 9:1 del PA rellenador y PA de enlace a TGF, con o sin la adición de factor de crecimiento exógeno (rhTGF-ß?) (véase las Figuras 6 y 7) . Una mayoría de los defectos en los Grupos 3 y 4 tuvo relleno casi completo del área de defecto y el tejido contenido . se asemeja estrechamente a aquel del cartílago similar a hialina. En algunos casos, los límites del defecto no se podrían identificar a un debido a la similitud cercana en la morfología al cartílago circundante. Aunque la mayoría de los defectos en los grupos 1 y 2 mostró evidencia de la formación del tejido dentro de los defectos, pocos tuvieron relleno completo del área de defecto, y la tinción con Safranin-0 y colágeno tipo II fue típicamente no uniforme o no presente a lo largo del tejido reparado.

Una evaluación histológica semi-cuantitativa con base en el método de registro de O'Driscoll bien establecido45 se realizó por los observadores ciegos de tratamiento. Los resultados se resumen para cada grupo de tratamiento en la Tabla 3. En este método, la naturaleza del tejido, estructura, densidad celular y condición del tejido adyacente se evalúan y se clasifican con criterios definidos que determinan la asignación de cada registro. Los registros en cada categoría varían en general de 0 (tejido gravemente comprometido) a 3 (tejido .normal), aunque algunas categorías se registran 0-2 o 0- (véase la Tabla 3) . La evaluación no reveló diferencia significativa ente los Grupos 1 y 2, con los registros de O'Driscoll de 15.5 ± 4.7 y 15.1 ± 3.7, respectivamente. Estos valores son consistentes con los resultados de la literatura que · examinan el tratamiento de microfractura solo en el modelo de conejo.47 A partir de estos datos los inventores concluyeron que 1 nanogramo de dosis de rhTGF-ß? solo o en combinación con el PA rellenador, no parece que tiene un efecto benéfico (o perjudicial) sobre la regeneración del cartílago en este modelo animal.

En contraste, ambos grupos que reciben el anfifilo péptido (PA) de enlace a TGF tuvo un registro histológico de O'Driscoll significativamente mayor que el grupo que recibe el factor de crecimiento solo (Grupo 1) o el PA rellenador más el factor de crecimiento (Grupo 2) . El Grupo 4, el cual recibió el PA de enlace a . TGF más el PA rellenador, tuvo un registro histológico de' 21.9 + 1.2, y el Grupo 3, que recibió la misma mezcla de PA más rhTGF-ß?, tuvo un registro histológico de 20.8 ± 2.1, de un registro posible máximo de 24 (que representa cartílago similar a hialina sano y bien integrado, normal) .' Un análisis univariante de los datos mostró un efecto significativo de tratamiento (p < 0.0001) en el registro histológico. Las pruebas post-hoc revelaron diferencia significativas entre el¦ Grupo 1 comparado con el Grupo 3 (p < 0.0001) o Grupo 4 (p < 0.001), así como también entre el Grupo 2 comparado con el Grupo 3 (p < 0.0001) o Grupo 4 (p < 0.0006). Ño hubo diferencia significativa entre los Grupos 3 y 4 (véase la Figura 8) .

TABLA 3. Registros (método de O'Driscoll) de Defectos de Cartílago Articular de Espesor Total de Conejo.

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 rhTGF-ß? PA rellenador + PA rellenador + PA rellenador + rhTGF-ß? PA de enlace a PA de enlace a TGF + TGF rhTGF-ß? Criterios Medio ± SD Medio ±SD Medio ±SD Medio ± SD Evaluativos (n=9) (n=8) (n=9) (n=10) (registro como se indica) Morfología 2.56±1.43 2.07 ± 1.38 3.93+0.22 3.80 ± 0.45 Celular (registro = 0, 2 o 4) Tinción de 1.48 ±0.60 1.21 ± 0.67 2.44 ± 0.24 2.30 + 0.58 Safranin-O de matriz (registro = 0, 1, 2 o 3) Regularidad 2.00 ± 0.80 1.67 ± 0.69 2.41 ± 0.49 2.37 ± 0.51 Superficial (registro = 0, 1, 2 o 3) Integridad 1.07 ± 0.62 . 0.88 ±0.40 1.70 ±0.31 1.57 ± 0.32 Estructural (registro = 0, 1 o2) Espesor 1.15 ±0.60 1.29 ±0.55 1.85±0.18 1.77 ± 0.32 (registro = 0, 1 o2) Enlace al 1.33 ±0.53 1.13 ± 0.62 1.81 ± 0.18 1.80 ± 0.23 cartílago adyacente (registro = 0, 1 o 2) Hipocelularidad 1.96 ±0.72 2.08 ± 0.53 2.89 ± 0.17 2.63 ± 0.40 (registro = 0, 1 , 2 o 3) Agrupamiento 1.26 ± 0.40 1.46 ± 0.25 1.93 ±0.15 1.73 ± 0.31 de condrocitos (registro = 0, 1 o 2 ) Cambios 2.70 ± 0.35 2.75 ±0.24 2.89 ±0.33 2.83 ±0.24 degenerativos (registro = 0, 1 , 2 o 3) Total (registro 15.52 ± 4.74 15.13 ± 3.66 21.85 1 1.19 20.80 ± 2.06 máximo = 24) 4.6.1 Espesor. 1 de 9 defectos en el Grupo 1 (rhTGF-ß?) tuvo <50% de espesor comparado con el cartílago circundante. Los 8 defectos restantes tuvieron >50% pero <100% de relleno comparado con el cartílago normal circundante. De manera similar en el Grupo 2 ( A rellenador + rhTGF-ß?), 1 de 8 defectos tuvo < 50% de espesor y los 7 defectos restantes tuvieron 50% - 100% de espesor comparado con el cartílago circundante. En contraste, todos los defectos en el Grupo 3 (PA de enlace a TGF + PA rellenador + rhTGF-ß?) contuvieron tejido que se rellenó a 100% del espesor relativo con el cartílago adyacente normal, y 7 de 10 defectos en el Grupo 4 ( PA de enlace TGF + PA rellenador) se rellenaron completamente de manera similar. 4.6.2 Enlace al Cartílago Adyacente. En el Grupo 1, solo 3 de 9 defectos mostraron tejido regenerado que se enlazó completamente al cartílago adyacente, y de manera similar en el Grupo 2 solo 2 de 8 se enlazaron completamente, con los defectos restantes que se enlazan parcialmente o no se enlazan completamente. En contraste, todos los defectos en los Grupos 3, y 9 de 10 defectos en el Grupo 4 se enlazaron completamente al cartílago adyacente. 4.6.3 Hipocelularidad. Solo 2 de 9 defectos en el Grupo 1 (y 2 de 8 en el Grupo 2) tuvieron celularidad normal en el tejido regenerado, con el resto que exhibe hipocelularidad ligera a grave. En contraste, todos los defectos en el Grupo 3 (y 8 de 10 en el Grupo 4) exhibieron celularidad normal. 4.6.4 Agrupamiento de Condrocitos . En el Grupo 1, 7 de 9 defectos tuvieron agrupamiento de condrocitos leve. En el Grupo 2, 1 de 8 .defectos tuvieron agrupamiento moderado, mientras que la mayoría tuvo agrupamiento de condrocitos mínimo a nada. No se observó agrupamiento de condrocitos del Grupo 3, y solo 3 de 10 defectos tuvieron agrupamiento mínimo en el Grupo . 4.6.5 Liberación de Cambios Degenerativos en el Cartílago Adyacente. Poco a nada de cambios degenerativos en el cartílago adyacente, se observaron a través de todos los grupos de tratamiento, con cambios leves observados en solo 1 o 2 defectos por grupo.

Aplicabilidad Industrial Las lesiones condrales de espesor total en las superficies de la unión articular (incluyendo la rodilla, cadera, hombro, codo y tobillo) conduce a dolor, disfunción, síntomas mecánicos, hinchazón, degeneración del cartílago adyacente, y osteoartritis en pacientes humanos. Las lesiones condrales afectan la capacidad de regresar al trabajo, actividad atlética así comú también actividades de vida diaria. Las opciones de tratamiento actuales incluyen microfractura artroscópica , trasplante de aloinjerto osteocondral abierto (OATS) , e implantación de condrocitos autólogos de dos etapas abierta (ACI). Un meta-análisis reciente ha mostrado que ninguna alternativa de tratamiento tuvo resultados consistentemente superiores en términos de un retorno a la función y actividad anterior.38 Adicionalmente , el análisis histológico no ha mostrado capacidad a largo plazo significativa de estas opciones de tratamiento para retener la habilidad de condrocitos significativa o la producción de colágeno tipo II, los procesos que son críticos a la promoción de la auto-sanación, el mantenimiento de la elasticidad de la articulación y la retención colectiva del cartílago in sltu.31 Las composiciones novedosas descritas en este documento se pueden usar en múltiples situaciones clínicas.

Las lesiones condriales, aunque más frecuentemente diagnosticadas en la rodilla, se observan en casi cada articulación en el cuerpo humano debido a lesiones traumáticas, incluyendo pero no limitado a: dislocaciones, impacto directo, inestabilidad ligamentosa, esfuerzo cortante, lesiones' atléticas, y mecanismos relacionados con el trabajo. Se ha mostrado que la microfractura funciona bien a corto plazo en pequeñas lesiones (<4 mm) con base en los registros de resultados clínicos; pero en general se forma el fibrocartílago y no el cartílago articular.48 Las lesiones más grandes se desempeñan típicamente de manera más deficiente después de la microfractura .38 En vista de las limitaciones anteriores de tratamientos actuales para las lesiones del cartílago, se ha desarrollado un andamio de gel de enlace a TGF que se puede usar como un adjunto a' la microfractura . Este andamio puede mejorar los resultados de las lesiones condrales más pequeñas por medio de promover la diferenciación de las células madre mesenquimatosas en condrocitos viables que producen y mantiene el cartílago articular (incluyendo predominantemente la expresión de colágeno de tipo II) . Adicionalmente , las lesiones más grandes se pueden desempeñar mejor cuando se usa un andamio de gel como un adjunto para la microfractura en cualquier articulación.

Esta terapia novedosa se puede usar como un procedimiento de primera- linea para la restauración/regeneración de cartílago con microfractura , en ya sea el asentamiento agudo o crónico de los defectos condrales. Adicionalmente, se puede usar como un procedimiento de revisión en la instalación de cuidados intensivos o crónicos de defectos condrales. Adicionalmente, se puede usar como un procedimiento de revisión en la instalación de artroplastia de abrasión fallida, microfractura, implantación de condrocitos autólogos, u OATS si estos métodos no han logrado mostrar- mejora clínica, atroscópica, o histológica.

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Todas las patentes y publicaciones mencionadas en este documento se incorporan a manera de referencia en su totalidad. Nada en este documento va a ser considerado como una admisión de que la invención se intitula para preceder esta descripción en virtud de la invención anterior.

Aunque la invención se ha descrito con detalle y con referencia a las modalidades especificas de la misma, se va a entender que la descripción anterior es ejemplar y explicativa en carácter y se propone para ilustra la invención y sus modalidades preferidas. A través de la experimentación de rutina, una persona experta en la técnica reconocerá fácilmente que varios cambios y modificaciones se pueden hacer en la misma sin apartarse del espíritu y alcance ce la invención. Por ejemplo, varios anfifilos péptidos se han descrito en conjunción con residuos de aminoácido específicos; sin embargo, otros residuos se pueden usar con la misma para promover un crecimiento y regeneración de tejido particular en las nanoestructuras preparadas a partir de los mismos. Del mismo modo, mientras que la presente invención se ha descrito como aplicable a uso de ingeniería biomédica o de tejidos,- otras ventajas y características serán evidentes a partir de las reivindicaciones presentadas a partir de ahora, con el alcance de estas reivindicaciones que se determinan por sus equivalentes razonables, como sería entendido por aquellas personas expertas en la técnica, de esta manera, la invención se propone para ser definida no por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims (42)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un péptido sintético, caracterizado porque comprende la secuencia HSNGLPL (SEQ ID N0:1), HSDGLPL (SEQ ID NO: 39) o HSD*GLPL (SEQ ID NO: 40), donde D* es un residuo de _ isoaspartato .

2. Un péptido sintético, caracterizado porque comprende la secuencia HSNGLPLGGGSEEE AAAVVV (SEQ ID NO: 3) .

3. Un anfifilo péptido, caracterizado porque consiste de los siguientes segmentos: (1) un segmento de péptido de enlace al factor de crecimiento seleccionado de entre SEQ ID NOs: 21-40; (2) un segmento espaciador; (3) un segmento de péptido estructural, formador de beta-hoja, y (4) un segmento lipofilico no de péptido.

4. El anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el segmento espaciador se selecciona de péptidos de la forma (Gly) mXaa (Xbb) n, en donde m y n son números enteros que varían independientemente entre 0 y 5, en donde Xaa.es cualquier aminoácido, y en donde Xbb es un residuo de aminoácido seleccionado de aquellos con cadenas laterales ácidas.

5. El anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque Xaa es serina, Xbb es ácido glutámico, m y n = 3, y de esta manera el segmento de péptido espaciador es GGGSEEE (SEQ ID NO: 5) .

6. El anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el segmento de péptido estructural se selecciona de péptidos de la forma (XA) Wa (XB) Nb (Xc) MC donde XA y XB se seleccionan de A, L, V y G, Xc es cualquier aminoácido, Na y Nb son 2, 3 o A y Nc es un número que varia de 0 a 3.

7. El anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque de péptido estructural es AAAVVVK (SEQ ID NO: 10) .

8. El anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el segmento lipofilico está comprendido de una cadena de alquilo lineal, saturada, individual de la fórmula: CnH2n-iO-, donde n = 6 - 22.

9. El anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el segmento lipofilico se enlaza covalentemente a la épsilon amina de un residuo de lisina C-terminal.

10. Un anfifilo péptido, caracterizado porque consiste de la siguiente estructura (SEQ ID NO:4):

11. Una composición, caracterizada porque comprende uno o más anfifilos péptidos seleccionados de los compuestos de conformidad con la reivindicación 3.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque se mezcla con uno o más anfifilos péptidos rellenadores y se dispersa en un medio acuoso .

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el anfifilo péptido rellenador es un compuesto sintético de la forma: CnH2n-iO-(Xxx) x- (Xyy) y- (Xzz) z, en donde Xxx y Xyy son aminoácidos con cadenas laterales no polares, Xzz es un aminoácido con una cadena lateral ácida, n es un número entero que varia de 4 a 20, y x, y, y z son números, enteros que varían independientemente de 2 a 6.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque Xxx es valina, Xyy es alanina, Xzz es ácido qlutámico n = 16.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque x, y, y z igual a 3, y de esta manera el péptido comprende la secuencia VVVAAAEEE (SEQ ID NO: 7), y el anfifilo péptido consiste de la siguiente estructura (SEQ ID NO: 8):

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el anfifilo péptido 0 rellenador se mezcla con el anfifilo péptido con la reivindicación 10 en una relación molar ratio seleccionada de aquella de 1% en mol a 20% de péptidos que comprenden la secuencia HSNGLPL ( SEQ ID NO:l).

17. La composición de conformidad con la 5 reivindicación 15, caracterizada porque el anfifilo péptido rellenador se mezcla con el . anfifilo péptido de la reivindicación 10 en una relación molar de 9:1, tal que de 10% en mol de péptidos comprende la secuencia HSNGLPL (SEQ ID NO.1) . 0

18. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la composición de anfif'ilo péptido comprende además una o más proteínas humanas recombinantes de la superfamilia de factor de crecimiento transformante (TGF) .

19. La composición 'de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la proteina recombinante es rhTGF-ß!.

20. Un método para tratar un defecto o lesión de cartílago articular en un paciente en necesidad del mismos, caracterizado porque ,el método comprende la etapa de administrar una composición de conformidad con la reivindicación 11 al paciente.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la composición se administra como un adyuvante a un procedimiento quirúrgico ortopédico propuesto para reparar, restaurar ¦ o regenerar cartílago dañado o perdido después del desbridamiento de una lesión en la superficie articular de una articulación en un paciente.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el procedimiento quirúrgico es microfractura , y la composición forma un coágulo de gel con sangre autóloga y células liberadas de hueso osteocondral o médula durante el procedimiento de microfractura .

23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el procedimiento quirúrgico es una implantación de condrocitos autólogos de dos etapas etapa abierta (ACI), en donde la composición se combina con los condrocitos autólogos y forma un andamio de gel que contiene las células en el sitio de lesión.

24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el procedimiento quirúrgico es una trasplantación de aloinjerto osteocondral abierta (OATS) , en donde la composición forma un gel en el sitio de lesión.

25. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la composición se administra artroscópicalmente .

26. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el pacientes humano.

27. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el paciente es un animal.

28. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el paciente es un caballo, perro, oveja, cabra, o vaca.

29. Un método para regenerar cartílago en un área de deficiencia de cartílago articular que se formó debido a una condición degenerativa tal como osteoartritis , caracterizado porque el método comprende la etapa de administrar un paciente en necesidad del mismo o una composición conformidad con la reivindicación 11.

30. Un método para suministrar TGF-ß? humano recombinante, exógeno (rhTGF-ß?) 'a. un área de deficiencia de cartílago particular que comprende la etapa de administrar a un paciente en necesidad del mismo una composición que comprende un anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 11.

31. Un método para concentrar y proteger el TGF-ß? endógeno liberado por las células en un área de deficiencia de cartílago articular, . caracterizado porque la etapa administrar a un paciente en necesidad del mismo una composición de conformidad con la reivindicación 11.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado, porque la etapa de administración se realiza durante un procedimiento de microfractura .

33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la etapa de administración se realiza durante un procedimiento ACI.

34. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 3, para el tratamiento de un defecto o lesión de cartílago articular en un paciente en necesidad del mismo, la composición administrada como un adyuvante a un procedimiento quirúrgico ortopédico propuesto para reparar, restaurar o regenerar cartílago dañado o perdido después del desbridamiento de una lesión sobre la superficie articular de una articulación en un paciente.

35. Un método para crear un gel in vitro al combinar una composición de anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 3 y uno o más componentes acuosos usados para disolver e inducir subsecuentemente el auto-ensamble del anfifilo péptido, caracterizado porque el método implica el uso de componentes que cambian el pH de la solución o la concentración de iones multivalentes , polímeros carqados u otras macromoléculas cargadas en los componentes acuosos .

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el componente acuoso incluye células .

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las células se obtienen de sangre, aspirado de médula ósea, u otro tejido autólogo de un paciente humano, y el gel se coloca en un defecto de cartílago o se aplica de otra manera a la superficie articular del paciente.

38. Un substrato, caracterizado porque se recubre con micelas auto-ensambladas formadas por la composición de anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 3.

39. Un kit para la formación in vitro de micelas auto-ensambladas para la administración en un paciente, caracterizado porque comprende una composición de anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 3, uno o más componentes acuosos usados para disolver los anfifilos péptidos suficientes para inducir el auto-ensamble o la formación de gel, el auto-ensamble que resulta de cambios en el pH de la solución o la presencia de iones multivalentes , polímeros cargados u otras mácromoléculas cargadas en los componentes .

40. El kit de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque comprende opcionalmente componentes adecuados para remover células en el paciente para la incorporación en la formulación, para la administración al paciente.

41. Un kit, caracterizado porque es para elaborar una formulación inyectable para la formación in vivo de micelas cilindricas en un paciente en necesidad del mismo que comprende una composición de anfifilo péptido de conformidad con la reivindicación 3.

42. El kit de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque comprende opcionalmente componentes adecuados para remover células en el paciente para la incorporación en la formulación · para la administración al paciente.