CN1915438A - 新型多肽神经组织工程支架材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种新型多肽神经组织工程支架材料，其结构为：C₁₆H₃₁O－Ala－Ala－Ala－Gly－Gly－Gly－Gly－Asp－Asp－Ile－lys－Val－Ala－Val－COOH。它克服了现有用于神经组织工程的支架材料中①无机材料，其机械强度过高，粘弹性差，生物降解困难；②有机高分子材料，其降解后生物利用度低，或降解产物对生物体有害等缺点。本发明多肽神经组织工程支架材料具有①粘弹性好，②易于运输，可以通过注射技术运送到靶位点，③降解性好及生物利用度高，④很少引起毒副反应及免疫反应等优点。本发明还同时公开了这种多肽神经组织工程支架材料的制备方法和在制药中的应用。

Description

新型多肽神经组织工程支架材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生命科学领域，它涉及一种设计合成的新型多肽神经组织工程支架材料及其制备方法和在脊髓损伤治疗中的应用。

背景技术

神经系统(nervous system，NS)由于病变或损伤，导致大量的神经元发生变性坏死，轴突崩解，抑制性因子如炎性因子，软骨素酶ABC(Chondroitmase ABC)等大量存在，神经细胞不能再生，软组织屏障，如胶质疮痕阻断神经通路连接，因而其治疗及康复效果不理想。

神经组织工程包括三要素：①支架材料，②种子细胞，如雪旺氏细胞(SchwannCells，SCs)，神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)等，③各种细胞因子或生长因子及信号肽。支架材料主要恢复神经的三维结构，为各种神经细胞的黏附、生长及细胞外基质的沉积提供足够大的表面积及空间，对神经细胞起支撑、诱导及营养作用，有利于血管的长入。

将组织工程运用于NS疾病的治疗，重构其支架结构(解剖结构)与营养支持，促进各种神经细胞的再生，恢复神经纤维连接与信号通路的完整与通畅，促进轴突的再生与长入及髓鞘化，促进血管的再生，减少抑制因子的产生及胶质疤痕的形成。支架材料发挥维持中枢神经系统(central nerve system，CNS)三维结构及调控CNS的神经细胞在支架材料的生长，迁延、分化。

现有用于神经组织工程的支架材料有两类：①无机材料，其机械强度过高，粘弹性差，生物降解困难；很少用于神经组织工程；②有机高分子材料，其降解后生物利用度低，或降解产物对生物体有害等缺点，主要用于制作周围神经的导管。以上两类材料本身固有的缺点限制它们在中枢神经组织工程(NerveTissue Engineering，NTE)中的应用。

多肽在液体环境中有三种状态：可溶性液态，溶解性差的沉淀物及胶体状物质。自组装技术运用于多肽，在水相离子环境中或生理盐溶液触发形成三维支架材料凝胶，它具有以下优点：①粘弹性好，与脑及脊髓组织有相近的压缩模量(compressive modulus)，②易于运输，可以通过注射技术运送到靶位点，③降解性好及生物利用度高，降解产物为氨基酸单体，作为生物体营养物质的来源，④很少引起毒副反应及免疫反应。使多肽自组装凝胶成为一种新型的组织工程支架材料。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，而提供一种新型多肽神经组织工程支架材料。

本发明的另一个目在于提供上述新型多肽神经组织工程支架材料的制备方法。

本发明的再一个目在于提供上述新型多肽神经组织工程支架材料在治疗脊髓损伤药物中的应用。

本发明的目的是通过如下措施来达到的：新型多肽神经组织工程支架材料，其特征在于多肽结构序列为：C₁₆H₃₁O-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ile-lys-Val-Ala-Val-COOH(其中Ala，A-丙氨酸；Gly，G-精氨酸；Asp，D-天冬氨酸；Ile，I-异亮氨酸；lys，K-赖氨酸；Val，V-缬氨酸)。简写为C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV。

制备上述新型多肽神经组织工程支架材料，它包括如下步骤：肽链合成采用芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)/苯并三唑-1-三氧吡咯烷磷基六氟磷酸(Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate，PyBOP)方法：①取100mg芴甲氧羰基-缬氨酸-Wang树脂(Fmoc-Val-wang resin)在二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)溶液中浸泡20分钟，用30％六氢吡啶脱去Fmoc，②3摩尔的PyBOP和芴甲氧羰基-丙氨酸-羟基苯并三唑(Fmoc-Ala-OH HOBt)加入到①中的缬氨酸-Wang树脂(Val-wangresin)，室温反应1小时，③重复上述①和②的步骤，并不断的更加Fmoc-(A，G，G，G，G，D，D，I，K，V，A，V)(A-丙氨酸，G-甘氨酸，D-天冬氨酸，I-异亮氨酸，K-赖氨酸，V-缬氨酸)，最后加脂酸C₁₆H₃₂O₂，一直到肽链结束，④用三氟乙酸∶硅烷∶水＝95∶2.5∶2.5将多肽(C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV)从树脂上切落。纯化，收集纯化的肽冻干，取小样做质谱仪(Mass Spectrograph，MS)分析。将肽溶于氢氧化钠(NaOH)溶液中，PH＝9.0，浓度为1wt％。加入等体积DMEM/F₁₂自组装成凝胶，凉干，磷钨酸染色，TEM观察。

本发明新型多肽神经组织工程支架材料在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

本发明新型多肽神经组织工程支架材料具有以下优点：①含有长链的烷基尾C₁₆H₃₁O，该结构可提高肽对氢离子敏感度。烷基尾逐渐缩短到无烷基尾时，肽对氢离子触发的自组装能力下降，最终不能自组装成凝胶。该烷基尾可在纳米尺度上调整自组装纳米纤维的直径、长度。②A₃G₄(AAAGGGG)，一方面与烷基起协同效应，另一方面使其后部的活性区域IKVAV伸出到纤维表面，从而暴露多肽的活性区域。③D₂，肽在PH＝9.0的环境中带有负电荷，保证其可溶性，自组装后其凝胶内部PH值为7.2～7.4左右。若D₂换成D或E，肽溶解，PH值必须达到10～11的范围，自组装形成三维凝胶，其内部的PH值可达9.5左右，不适于细胞在该环境生长。④含IKVAV，它来源于层粘连蛋白(laminin)核心序列。IKVAV序列促进神经干细胞(neural stem cells，NSCs)粘附、迁移、突触的再塑。⑤反应条件简单，可由达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基[dulbecco’s modifiedeagle’s medium，DMEM]触发，也可置于盐酸蒸气的环境。⑥凝胶粘弹性好，易于运输。⑦凝胶多孔结构，为细胞提供足够的空间及表面积。⑧降解产物可被机体吸收，无免疫反应及毒性反应。⑨肽序列易于人工设计与修改以满足特定需求。

附图说明

图1为C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV的质谱图。

图2为C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV的高效液相色谱图(HPLC)，多肽保留时间为8.118，对应于表1的第7峰号，表1峰号7示肽纯度为95.22％。

图3中A瓶装1wt％肽，B瓶为DMEM/F₁₂，C为空，D为自组装凝胶(倒置)。

图4自组装凝胶由交互排列的纳米纤维构成，纤维直径有3～5纳米，长度100纳米～1500纳米。

图5 2.5wt％寡肽自组装凝胶为有孔隙的板层状排列。

图6相差显微镜示原代细胞聚集为球形。

图7免疫组化示Nestin阳性的细胞(黄色)。

图8细胞在凝胶表面长出突起。

图9细胞在盖波片仅形成球。

图10Nestin(+)的细胞在凝胶表面聚集呈球。

图11细胞在凝胶表面分化为有突起的NF(+)的红色荧光神经元。

图12细胞在凝胶表面分化为有突起的GFAP(+)的绿色荧光胶质细胞。

图13合并荧光为黄色。

图14Nestin(+)的未分化细胞。

图15细胞在无血清的凝胶表面长出突起。

图16细胞在有血清的凝胶表面长出突起。

图17细胞在无血清的多聚赖氨酸包被表面形成球。

图18细胞在有血清的多聚赖氨酸包被表面长出突起。

图19Nestin(+)的细胞(A1亚组)。

图20Nestin(+)的细胞(B1亚组)。

图21NF(+)的红色荧光的神经元。

图22GFAP(+)的绿色荧光的星形细胞。

图23合并荧光为黄色。

图24Nestin(+)的细胞(C亚组)。

图25NF(+)的红色荧光的神经元(D亚组)。

图26GFAP(+)的绿色荧光的星形细胞(D亚组)。

图27合并荧光为黄色。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的实施情况。

本发明新型多肽神经组织工程支架材料，多肽结构序列为：C₁₆H₃₁O-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ile-lys-Val-Ala-Val-COOH。(其中Ala，A-丙氨酸；Gly，G-精氨酸；Asp，D-天冬氨酸；Ile，I-异亮氨酸；lys，K-赖氨酸；Val，V-缬氨酸)。简写为C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV。

制备上述多肽神经组织工程支架材料，它包括如下步骤：

合成

肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc的脱帽用30％六氢吡啶的DMF溶液。肽链从树脂上的切落用切肽试剂(三氟乙酸/硅烷/水＝95/2.5/2.5)。称取1000mgFmoc-Val-wang resin，依次按下列量加入各种Fmoc-氨基酸

                                 Mwt(分子量)mg(毫克)

1：Fmoc-Ala-OH-----------------------311.34----934.1

2：Fmoc-Ala-OH-----------------------311.34----934.1

3：Fmoc-Ala-OH-----------------------311.34----934.1

4：Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31----892.0

5：Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31----892.0

6：Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31----892.0

7：Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31----892.0

8：Fmoc-Asp-OH-----------------------297.31----892.0

9：Fmoc-Asp-OH-----------------------311.34----934.1

10：Fmoc-Ile-OH----------------------311.34----934.1

11：Fmoc-lys-OH----------------------311.34----934.1

12：Fmoc-Val-OH----------------------311.34----934.1

13：Fmoc-Ala-OH----------------------311.34----934.1

14：Fmoc-Val-OH----------------------383.44----828.3

15：C₁₆H₃₁O₂----------------------256.44----553.9

每步接肽反应加入

PyBOP         Mwt：520.30                     1123.9[mg/coupling]

HOBt+H₂O(1)  Mwt：153.10                     4320[micro-L/coupling]

                   0.50[mmol/mL DMF]

NMM(1)             109.95[mL/mol](×1.50eq)   3240[micro-L/coupling]

                   1.00[mmol/mL DMF]

脱帽反应加入

六氢吡啶           30％                       9000×2[micro-L/coupling]

洗涤时用

DMF                                           9000×5[micro-L/coupling]

DMF                                           9000×5[micro-L/coupling]

接肽在431A型多肽自动合成仪(Applied biosystems，USA)(美国应用生物系统公司)上进行，接完的树脂全部转移至茄形瓶中，加入事先配好并预冷的切肽试剂[三氟乙酸/硅烷/水/(95/2.5/2.5)]200ml。25℃下搅拌反应2小时。过滤，收集滤液。树脂用少量三氟乙酸洗3次。将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷却，然后加入1000ml冷乙醚使多肽沉淀。离心收集，真空干燥。得粗品约660mg。

纯化

使用碳18(C18)反相柱子，条件为：A相为95％的水(甲醇配比)，B相为95％的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1％的TFA，常规条件：从A相到B相为20分钟梯度。检测波长：220nm，流速：10ml/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱20min，收集目标肽的洗脱液，冻干。

新型多肽结构序列为：C₁₆H₃₁O-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ile-lys-Val-Ala-Val-COOH(其中Ala，A-丙氨酸，Gly，G-精氨酸，Asp，D-天冬氨酸，Ile，I-异亮氨酸，lys，K-赖氨酸，Val，V-缬氨酸)，简写为C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV。

构建的多肽序列：C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV，HPLC(图l，表1)示其纯度为95％以上，MS(图2)示分子量为1438.2，与理论分子量相吻合。

表1峰号7示肽纯度为95.22％

No	Remain Time	Height	Areas	Content
					12345678910	3.6854.5854.8836.4207.3507.7128.1189.34011.11511.398	136.76147.9907606.121508.583836.625945.923639120.8131709.549740.864345.681	813.814182.791176155.93814521.07921193.70615530.3156125258.50061977.3167560.8169507.707	0.01270.00282.73840.22570.32950.241495.22060.96350.11750.1478
Total		651998.910	6432701.981	100.00

多肽构建三维凝胶支架材料

①寡肽溶液在DMEM/F₁₂触发下，数秒钟于小瓶内形成透明粘弹性凝胶，倒置玻璃小瓶，凝胶贴附于小瓶底部，无滑脱(图3)

②盖玻片上寡肽溶液置于10M HCL蒸气中，半小时开始形成凝胶，2小时后完全形成具有一定厚度的透明薄层凝胶，盖玻片任意改换位置，其上的凝胶不会变形脱落。

③盖玻片上溶液置于37℃的密闭箱中，在盖玻片上发现多肽的固体残迹，未见自组装凝胶形成。

④透射电镜显示：寡肽自组装为凝胶，形成编织状纳米纤维，纤维直径有3～5纳米，长度100纳米～1500纳米，寡肽浓度增加，其纳米纤维排列愈密(图4)。

⑤扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)显示2.5wt％寡肽自组装凝胶呈板层状排列，层层间有规则的孔隙(图5)。

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)在自组装凝胶的生长及分化

NSCs在自组装凝胶表面的生长及分化(二维凝胶)

取乳鼠，常规消毒，剪除头部皮肤及颅骨，剔除脑膜、血管及小脑，弯镊夹取双侧大脑皮质，放入置有磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)溶液中的小烧杯中，用火焰抛光的玻璃吸管吹打，200目滤网过滤，过滤液置于25ml玻璃培养瓶中，加入无血清DMEM/F₁₂+重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bovine basic fibroblast growth factor，bFGF)(20ng/ml)+表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)(20ng/ml)+B₂₇(2％)，在37℃5％CO₂及95％空气培养箱培养。三天后换液。待NSCs形成透明球状并布满瓶底，传代。

NSCs鉴定：神经干细胞以1×10⁵/ml，接种于包被有多聚赖氨酸的盖玻片表面，无血清培养3天。4％多聚甲醛固定半小时，免疫组织化学SABC法鉴定。

倒置相差显微镜示单个细胞呈圆形，胞浆透明胞核圆形淡染，细胞悬浮生长，2～3d后，神经干细胞逐渐聚集形成发光的悬浮生长的细胞球，可见核分裂相，细胞球布满于瓶底，须及时传代(图6)。免疫组化SABC法显示，细胞聚集呈球形，巢蛋白(nestin)染色强阳性(黄色)(图7)

取200ul1wt％多肽液，置于3×3cm²盖玻片上，加入200ul DMEM/F₁₂，数秒钟即可形成二维透明质软凝胶薄膜，可用注射器抽吸，检测薄膜渗液PH为7.4。实验组：NSCs接种于二维自组装凝胶薄膜表面，分A及B亚组，无血清培养(DMEM/F₁₂)；对照组：NSCs接种于多聚赖氨酸包被盖玻片表面，分C及D亚组，无血清培养(DMEM/F₁₂)；实验组对照组的细胞均置于培养板中，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，倒置相差显微镜观察。

接种7天后，将实验组与对照组吸出培养液，4％多聚甲醛4℃固定30分钟，PBS缓冲液浸洗3次，室温晾干，采用免疫细胞化学技术。室温下封闭血清反应20min，滴入一抗后4℃过夜，加入二抗，室温下作用半小时，一抗为多克隆兔抗鼠Nestin，多克隆兔抗鼠神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，单克隆鼠抗人神经微丝(neurofilament，NF)，二抗：标记有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)羊抗兔IgG(FITC-IgG)，四乙基若丹明异硫氰酸盐(tetraethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC)的羊抗鼠IgG(TRITC-IgG)，A及C组检测Nestin，B及D组检测NF与GFAP。激光共聚焦显微镜观察。

倒置相差显微镜观察：试验组中，在二维凝胶材料表面，细胞聚集为球形，以后细胞球变大，部分细胞长出突起，可与周围细胞突起形成突触(图8)，对照组中，细胞仅形成细胞球，未见突起(图9)。

激光共聚焦显微镜观察：试验组中，神经干细胞聚集成球形，荧光显绿色，Nestin阳性(图10)；NSCs可分化为有突起的神经元及星形胶质细胞，双标为强的红色荧光，NF(+)(图11)，较弱绿色荧光，GFAP(+)(图12)，合并荧光为黄色(图13)。对照组中，神经干细胞聚集成球，荧光显绿色，Nestin阳性(图14)，细胞未发生明显的分化。

NSCs在自组装凝胶内部的生长及分化(三维凝胶)

实验组：分A1、A2、B1及B2亚组，取密度为1×10⁵/ml NSCs的DMEM/F₁₂悬液，滴加于四块盖玻片上，各加入等体积1wt％多肽液，数秒钟形成透明的0.4×3×3cm³凝胶，30分钟后吸出凝胶渗液，PH＝7.4，A1及A2亚组加入DMEM/F₁₂，B1及B2亚组加入DMEM/F₁₂+1％肽牛血清(fetal calf serum，FCS)。

对照组：分C及D亚组，密度为1×10⁵/ml NSCs的DMEM/F₁₂悬液，滴加于多聚赖氨酸包被两块盖玻片上，C亚组加入DMEM/F₁₂，D亚组加入DMEM/F₁₂+1％FCS。

将实验组及对照组置于培养板中，在37℃5％CO₂及95％饱和湿度空气中培养。倒置相差显微镜(Inverted Phase Contrast Microscope，IPCM)观察。

培养7天后，4％多聚甲醛4℃固定30分钟，PBS缓冲液浸洗3次。采用免疫细胞化学法，室温下封闭血清20min，滴入一抗后4℃过夜，加入二抗，室温下作用半小时，一抗为多克隆兔抗鼠Nestin，多克隆兔抗鼠GFAP，单克隆鼠抗人NF，二抗：标记有FITC羊抗兔IgG(FITC-IgG)，TRITC的羊抗鼠IgG(TRITC-IgG)，A1、B1及C亚组检测Nestin，A2、B2及D亚组检测NF与GFAP。激光共聚焦显微镜(LaserConfocal Microscopy，LCM)观察。

IPCM观察：实验组中，NSCs在材料内部接种3天，聚集呈球形。7天后，细胞长出突起，A1、A2、B1及B2亚组细胞形态无明显差异，表明自组装三维凝胶可诱导细胞分化，与1％FCS无关；对照组中，NSCs在多聚赖氨酸包被盖玻片表面接种3天，聚集呈球形。7天后，C亚组细胞未长出突起，D亚组细胞球长出较短突起。在A2，B2及D亚组(图15，16，18)，细胞长出突起，C亚组仅形成球(图17)

LCM观察：试验组中，A1、B1亚组接种后3天，细胞聚集成球形，荧光显绿色，Nestin阳性。A2、B2亚组接种后7天，NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞，双标为强的红色荧光，NF(+)，较弱绿色荧光，GFAP(+)，合并荧光为黄色。对照组中，C组细胞聚集成球，荧光显绿色，Nestin阳性。D组细胞分化为神经元及星形胶质细胞，双标为红色荧光的NF(+)，绿色荧光的GFAP(+)，合并荧光为黄色。

LCM示：图19，20为Nestin(+)的细胞(A1及B1亚组)；A2及B2亚组细胞均分化，与1％FCS无关，NF(+)的红色荧光的神经元(图21)及GFAP(+)的绿色荧光的星形细胞(图22)及合并荧光为黄色(图23)；C亚组(图24)为Nestin(+)的细胞；D亚组NF(+)的红色荧光的神经元(图25)及GFAP(+)的绿色荧光的星形细胞(图26)及合并荧光为黄色(图27)

NSCs具有自我更新能力，主要位于脊髓的室管膜区，大脑的室下区，海马及齿状区，在一定条件下分化为神经元、胶质细胞等，NSCs可选作神经组织工程的种子细胞。选取乳鼠大脑皮层的NSCs，优点：①可去除脑膜及血管，无上皮细胞及其它细胞的污染，细胞较为单一，②所需乳鼠的量较小，③易于操作，可获取大量皮质NSCs，④细胞活力好，胚胎鼠NSCs需求量大，操作困难，细胞活力与乳鼠干细胞无差异；成年鼠皮质干细胞活力差，主要向胶质细胞分化，⑤机械分离，不需胰蛋白酶或EDTA消化培养出乳鼠NSCs，有效保护细胞膜。

三维凝胶包裹NSCs，其纳米纤维表面的IKVAV与细胞膜的受体结合，可诱导NSCs分化为神经元及胶质细胞。IPCM观察：试验组中，A2及B2的细胞长出突起，与血清无明显相关；对照组中，1％FCS可诱导多聚赖氨酸包被的盖波片上细胞发生分化。采用免疫细胞化学法，试验组中，NSCs接种7天后发生分化，NF(+)，GFAP(+)；D亚组细胞NF(+)，GFAP(+)。表明自组装凝胶可诱导NSCs分化为神经元及胶质细胞的能力。

本发明成功构建两亲性肽序列-C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV，MS证明其分子量与理论肽的分子量一致，在DMEM/F₁₂的触发下自组装为三维多孔的凝胶结构，TEM证明其为多孔的交织排列的纳米纤维，IPCM及LCM观察：该凝胶对细胞起支撑，而且诱导细胞分化为神经元及胶质细胞。表明肽自组装凝胶可作为神经组织工程优良的支架材料，可包裹工程化的细胞、活性分子或药物，靶向导入组织及器官，逃避机体的免疫反应，在局部发挥作用。

需要说明的是对于本专业普通的技术人员来说，在不改变本发明原理的情况下，还可以对本发明做出适当的改变和变形，这同样属于本发明的保护范围。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>新型多肽神经组织工程支架材料及其制备方法和应用

<130>无

<160>1

<170>Patentln version 3.1

<210>1

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>LIPID

<222>(1)..(1)

<223>PALMITATE

<400>1

Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Asp Asp Ile Lys Val Ala Val

1               5                   10

Claims (3)

1.一种新型多肽神经组织工程支架材料，其特征在于其结构为：C₁₆H3_1O-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ile-lys-Val-Ala-Val-COOH。

2.制备权利要求1所述一种新型多肽神经组织工程支架材料的方法，其特征在于它包括如下步骤：

肽链合成采用芴甲氧羰基/苯并三唑-1-三氧吡咯烷磷基六氟磷酸方法，

①取100mg芴甲氧羰基-缬氨酸-Wang树脂在二甲基甲酰胺溶液中浸泡20分钟，用30％六氢吡啶脱去Fmoc；

②3摩尔的PyBOP和芴甲氧羰基-丙氨酸-羟基苯并三唑加入到①中的缬氨酸-Wang树脂，室温反应1小时；

③重复上述①和②的步骤，并不断的更加Fmoc-A，G，G，G，G，D，D，I，K，V，A，V，最后加脂酸C₁₆H₃₂O₂，到肽链结束；

④用三氟乙酸∶硅烷∶水＝95∶2.5∶2.5将多肽C₁₆H₃₁O-A₃G₄D₂IKVAV从树脂上切落，纯化，收集纯化的肽冻干，即得新型多肽神经组织工程支架材料。

3.一种新型多肽神经组织工程支架材料的应用，其特征在于该新型多肽神经组织工程支架材料在治疗脊髓损伤药物中的应用。

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