CN1913929A - 用于软组织特征重建的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于各种软组织特征重建的方法和组合物，所述特征如唇，乳晕，和很多其他特征，其取要被替换的皮肤特征的模型，例如乳晕，再造该软组织特征的大小和形状，例如乳头和乳晕，所制备的聚合体或生物聚合物支架是生物相容性的，能够允许皮肤细胞在聚合体的上面上皮形成，有细胞整合入支架体内的能力，和周围的神经纤维渗透入支架材料中的能力，因此患者可以获得的软组织特征重建的益处不仅是与天然的组织有相同的大小和形状和外观，而且有功能感觉。

Description

用于软组织特征重建的方法和组合物

本专利申请要求2003年12月10日申请的系列号为：60/528,064的美国临时专利申请的优先权，属于PCT/US2004/032934和PCT/US2004/033194的系列申请，这里均全文引用作为参考。

发明背景

1.发明领域

本专利申请描述了培养的人细胞在合成或生物合成的支架上的培养和移植，以提供对衰弱组织的置换用于置换特定皮肤和软组织特征例如手指尖，耳朵，或更优选乳房以重建乳晕或乳头。

2.现有技术

在美国1/8的女人将经诊断患有乳腺癌。乳腺癌的治疗依然首选是外科手术包括乳房切除术，四分之一切除术，或其他形式的切除术。尽管整型外科医师为重建作了最大的努力，乳腺癌手术仍高度毁损外貌。在乳房切除术中乳房的乳头和乳晕区域经常被切除，并且对此区域的重建是非常困难的。目前，重建的效果既不能有效再生乳头和乳晕的外观，也不能有效再生乳头和乳晕的感觉。

组织培养技术已经成功开发出组织和器官的等同物。这些技术的基础涉及到胶原基质结构或支架，它们通过采用活细胞、营养素和培养条件的适当组合可经过塑造进入功能组织和器官。组织等同物在很多专利中已经被广泛地描述，包括U.S.Pat.Nos.4,485,096；4,485,097；4,539,716；4,546,500；4,604,346；4,837,379；和5,827,641，此处均全文引用作为参考。此组织等同物的一个成功申请是活皮肤等同物，它在形态学上类似于真实的人的皮肤。此活的皮肤等同物由两层组成：上面的部分由分化的和分层的人表皮角化细胞制成，在胶原基质中它覆盖一较厚的，较低的人的真皮纤维原细胞层。Bell，等，“Recipes for Reconstituting Skin，”J.of Biochemical Engineering，113：113-119(1991)。

细胞移植作为一种可选择的方法被建议用于有多种治疗需要的所有器官移植上面，包括治疗眼睛，脑部，肝脏，皮肤，软骨和血管的疾病。参见，例如，JP Vacanti等，J.Pediat.Surg.，Vol.23，1988，pp.3-9；PAebischer等，Brain Res.Vol.488，1998，pp.364-368；CB Weinberg和E.Bell，Science，Vol.231，1986 pp.397-400；IV Yannas，Collagen III，ME Nimni，ed.，CRC Press，Boca Raton，1988；GL Bumgardner等，Hepatology，Vol.8，1988，pp.1158-1161；AM Sun等，Appl.Bioch.Biotech.，Vol.10，1984，pp.87-99；AADemetriou等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，Vol.83，1986，pp.7475-7479；WT QreenJr.，Clin.Orth.Rel.Res.，Vol 124.1977，pp.237-250；CA Vacanti等，J.Plas.Reconstr.Surg.，1991；88：753-9；PA Lucas等，J.Biomed.Mat.Res.，Vol.24，1990，pp.901-911。在组织培养中产生人的细胞系的能力将增强细胞移植作为恢复丢失的组织功能的治疗方式的前景。特别重要的是从神经嵴组织中能够制造出人的培养细胞系，以前在个体进入成人期后得自此来源的组织或器官通常不能从损伤中修复自己。

供细胞体外生长使用的常规组织培养实验器皿，通常带一层负电荷以增加培养的哺乳动物细胞的粘附性，有时用以增加其繁殖。然而，常规组织培养物表面很难使哺乳动物神经元细胞获得理想的粘附性，保持性，和繁殖性。增加胶原凝胶层则起到了改善作用或使大鼠EHS癌细胞分泌的细胞外基质在组织培养板或培养皿上沉降以有利于神经元细胞的粘附和繁殖。然而，这些技术也有缺陷，即材料必须在细胞接种之前尽可能短的时间内在培养表面完成分层。

本发明预期使用3类聚合物制造用于细胞生长和穿透的支架：生物聚合物(活的生物体中形成的聚合物：胶原，明胶，等)，合成的聚合物(在体外化学合成的：丙烯酸酯，聚乙烯醇，等)和生物合成的聚合物的组合物。本发明预期使用这些聚合物作为支持粘附、生长的支架，最后作为移植过程中支持细胞的载体。这一用途对细胞置换治疗的成功是至关重要的，尤其是在脑部和眼底，这些部位的细胞衍生于神经嵴源，在衰老过程中经常损坏。有七大类生物聚合物：多核苷酸，聚酰胺，多聚糖，聚异戊二烯，木质素，多磷酸盐和聚羟基链烷酸酯。参见如美国专利6,495,152。生物聚合物范围从胶原IV到聚硅氧烷组合物，其表面可植入碳粒，或用初级胺和任意肽处理，或用含初级胺或羧基的硅烷或硅氧烷固化，(美国专利4,822,741)，或如其他已知的改良胶原(美国专利6,676,969)，其中包含天然软骨原料，经过脱脂和其他处理去除胶原II原料和粘多糖，或可选择地将净化胶原II的纤维与粘多糖和任意其它添加剂混合。此类额外的添加剂，可包括如有助于软骨细胞粘附在胶原II纤维上的软骨粘连蛋白或锚定蛋白II以及诸如软骨诱导因子(CIF)，胰岛素样生长因子(IGF)和转化生长因子(TGFβ)的生长因子。

发明简述

本发明一方面涉及支架(scaffold)的用途，其中涉及在外科切除术前取要被替换的皮肤特征的模型，例如乳晕，再造该软组织特征的大小和形状，例如乳头和乳晕，使用具有下列特征的支架：a)生物相容性；b)皮肤组织能在支架上的上皮形成能力；c)细胞整合入支架体的能力；d)神经纤维渗透入支架材料的能力，使患者软组织特征重建后得到的益处不仅是与天然的组织有相同的大小和形状和外观，而且有功能感觉。

本发明的一个重要方面是使用由聚合物或生物聚合物组成的定制成形的支架，促进神经渗透入要被替换或重建的软组织特征。促进神经繁殖和功能的能力非常重要并且是现有技术中还没有完全解决的问题。

本发明的另一个重要方面是生成专门的粘附和存活支架，在细胞移植过程中用于粘附多种人细胞类型，包括上皮细胞，神经元细胞和微载体上的其他细胞。本发明所用的支架可以涂上一层本领域已知的标准物质，例如胶原，层粘连蛋白，和聚-L-赖氨酸，并且也可以是其它细胞如肿瘤细胞分泌的细胞外基质(ECM)蛋白质，它们分泌在培养物表面上，之后细胞将细胞去除。我们已经发现金刚石样碳(DLC)是一种新的可用于培养人细胞的基质。DLC涂层可以沉积在微载体上包括玻璃，塑料，生物高分子凝胶，胶原和明胶，GAGS，合成的聚合物，和金属。DLC层可以添加在其他的涂层的上面例如细胞外基质(ECM)，粘性分子，和生长因子。

DLC薄膜的力学和摩擦学特性(在空气中摩擦系数大约是0.1，硬度达到大约是80GPa，和弹性模数接近600GPa)与金刚石非常接近。而且，这些薄膜在多数侵蚀性环境中是化学惰性的，并且以接近金刚石的密度沉积。然而，与碳蒸汽沉积，金刚石相比，DLC薄膜可以在室温中常规制造，使它们尤其适用于那些物质不能承受升高的温度的地方。

本发明另一方面是教导在支架表面的DLC或其他形式的涂层沉积，依次支持人和哺乳动物上皮细胞，神经细胞和其他形式细胞的粘附和生长。

除了生物聚合物可以制造本发明的支架外，支架也可以由天然的或合成来源的聚合物组成。天然的生物聚合物包含胶原和其他公知的聚合物。对于合成的聚合物，它们可以是丙烯酸和衍生物或共聚物如聚甲基丙烯酸甲酯，聚-N-异丙基丙烯酰胺或聚-2-羟基异丁烯酸酯，聚乙烯醇和衍生物和共聚物。支架可以是薄片也可以是微粒的形式。为了增强支架支持生长的特性，粘附或生长促进因子在合成过程中可以植入或导入组合物中。而且，一种适合支持神经细胞生长和复制的包含一种半固体支架的三维培养基也可以涂覆DLC以增强支持神经元生长和保持的能力。支架也可以包含壳聚糖或藻酸钠“可能聚合物(may polymer)”。

本发明这些那些的目的，也包括其伴随的很多优点，在对下述优选实施方式作详细描述时将变得更加清楚。

详细描述和优选实施方式

在描述本发明的实施方式时，为了清楚的目的将采用特定的术语。但是，本发明不应受因此而选的特定术语的限制，并且显然每个特定术语均包括所有的技术等同语，它们以相似的方式完成相似的作用。

本发明的另一个主要方面是聚合物/生物聚合物支架有效恢复软组织特征的形状和外表的用途。这种恢复包括软组织特征三维形状造模和之后人上皮细胞在生物聚合物/聚合物支架上的接种和生长。

软组织特征重建所必须的要素是通过支架中感觉神经细胞和神经束的渗透和生长后在重建区域恢复感觉。聚合物/生物聚合物支架是可渗透的，因此感觉神经可以在支架里面生长并且在一段时间后削弱。结果是在重建的软组织部分至少恢复了部分感觉。

可以预料到使用本发明的组合物和方法许多不同的软组织特征可以被复制和重建。例如，除了乳晕外，可以预料到其他部分如眼睑，指尖，唇，外生殖器，部分耳朵和鼻子和许多其他软组织特征可以用这里描述的方法建造。

如上面所描述，可以预料到用于所要重建的软组织特征的生物支架可以由多种原料制成，例如，天然生物聚合物其中包含胶原和其他公知的聚合材料。支架也可以由合成的聚合物合成，如丙烯酸和它的衍生物或共聚物如聚甲基异丁烯酸酯，聚-N-异丙基丙烯酰胺或聚-2-羟基异丁烯酸酯，聚乙烯醇和衍生物和共聚物。聚合物支架可以是薄片也可以是微粒的形式。而且支架聚合物可以用标准细胞支持蛋白涂覆像层粘连蛋白或胶原，也可以使用DLC和其他涂层以增强上皮细胞层的粘附。

本发明的方法涉及粘附蛋白在支架内或支架上的用途，如纤维蛋白，层粘连蛋白，RGDS，胶原IV型，与聚合碳(聚合碳)共轭的bFGF，和与聚合碳共轭的EGF。聚合碳是一种轻度交联的聚合物。交联剂是二乙烯基乙二醇。聚合碳也是一种包括作为负电荷的来源的多羧基的弱聚—酸。这些酸根允许氢和细胞表面结合。聚合碳和粘液素都有在水中吸收40至60倍自身重量的能力而且通常被用作非处方的泻药(Equalactin，Konsyl Fiber，Mitrolan，Polycarb)(Park H，等，J.ControlRelease 1985；2：47-57)。聚合碳是很大的分子因此它是不能被吸收的。它也是非致免疫的，甚至在实验室中也不能产生对该聚合物的抗体。

最近调查者已经报道了将生物活性分子栓在聚合物支架上用于组织再生。参见L.Griffith Cima，″Polymer substrates for controlled biologicalinteractions，″J.Cell.Biochem.，vol.56，pp.155-161(1994)；和P.R.Kuhl等，″Tethered epidermal growth factor as a paradigm for growth factor-inducedstimulation from the solid phase，″Nature Med.，vol.2，pp.1022-1027(1996)。通过将上皮生长因子(EGF)共价连接到星—聚(乙烯氧)(PEO)栓(tether)上并随后将栓锚定到生物可降解支架的表面，观察到小鼠肝细胞的粘连和转移增加了40％。参见L.Griffith-Cima，″Tissue engineered scaffolds forliver regeneration，″发表于Molecular Engineering of Polymers Society：生物反应指引，美国化学团体，1996年11月。此外，DNA的细胞内合成已显示出与不含EGF培养基相当的水平。

支架的其他各种实施方式可以与上皮细胞一起使用用于组织重建。例如，美国专利No.5,986,043公开了光聚合的生物可降解水凝胶用于减少手术后细胞粘连的形成，在组织表面局部给药，粘合患者的组织表面。美国专利No.5,906,828公开了生长效应器分子，包括生长因子和细胞外基质分子，由支链栓有弹性地连接到支持介质；以及利用组合物刺激支持细胞组织生长的用途。美国专利No.5,836,313公开了双层复合材料，组成包括薄层组织和水凝胶，在保持水凝胶的澄明度，弹性和扩散率时提供了适合角膜上皮细胞的生长的基质。特别地，美国专利No.6,689,165描述了PHEMA/MAA水凝胶的用途。聚合的水凝胶在溶剂溶液中用光聚作用系统与水交换而膨胀不变，对角膜上皮的培养是有益。

另外，美国专利Nos.5,830,504和5,654,267公开了αγβ3整连蛋白(integrin)配体和生长因子受体配体在基质中混合形成的组合物，据称有益于促进伤口恢复和组织再生。美国专利Nos.5,760,176和5,120,829公开了用它的疏水域将肽连接在固体培养基上的方法。美国专利No.5,716,633公开了胶原—水凝胶构成的人造透镜，它可以促进上皮细胞的生长。美国专利No.5,677,276公开了与透明质酸盐聚合物共轭的肽可用于促进伤口愈合和组织再生。美国专利No.5,512,474公开了一种包含表面带有正电荷分子组合物的支持材料和细胞粘合因子的细胞培养系统。美国专利No.5,278,063公开了以化学方法嫁接肽到表面以增强细胞-表面粘合的方法从而优化细胞培养系统和改善细胞生物对各种材料制成的表面的粘合。美国专利No.5,171,264.公开了水凝胶的产生是通过共价将聚环氧乙烷星形分子固定在支持表面上。以上所有的专利文件均全文引用作为参考。

本发明的一个实施方式公开了一种自支撑聚合物，在其合成过程中它被植入或已经被整合入支架，一种附加混合物包含下列的一种或多种：纤维蛋白，层粘连蛋白，RGDS，与聚合碳共轭的bFGF，与聚合碳共轭的EGF，和硫酸肝素。支架可以塑造成任何期望的形状，将培养的人上皮细胞将植入表面并且允许增生扩散直至融合。

将上皮细胞植入支架表面前，将预先确定的含有纤连蛋白(在PBS中范围从0.1μg至500μg/ml)，层粘连蛋白(在PBS中0.1μg至500μg/ml)，RGDS(在PBS中是0.01μg至100μg/ml)，胶原IV型(在0.1M醋酸中范围从0.1μg至1000μg)的吸附蛋白混合物加入到被剥离的(denuded)表面(得斯密氏膜)并且在4℃孵化大概5至60分钟。在孵化后去除剩余的蛋白混合物，角膜用PBS冲洗三次并且内皮面向上地置于特氟纶模具(Teflon mode)上。

将培养的人上皮细胞从装有0.05％胰酶和0.02％ EDTA的盐溶液的培养皿中转移出来。细胞悬浮液用库尔特粒度仪计数器计数(Z1型，Beckman-Coulter)，并且将大约50,000至500,000细胞/ml，优选是大约200,000细胞在200μl培养基中(带有5％胎小牛血清的DME-H16或含有吸附蛋白例如纤连蛋白，层粘连蛋白和成纤维细胞生长因子混合物的无血清培养基(以10ng至400ng/ml))的制备物小心地添加到成型的生物支架上。将1％的透明质酸钠层，如Healon^(先进的医学光学，SantaAna，CA)以大约0.1至0.5ml铺在细胞悬浮液上成层作为保护剂。移植的上皮细胞随后在37℃含10％ CO₂的孵化器中孵化10分至24小时。可选择地，将包衣上皮细胞孵化20分钟并且将晕区(the areola)用PBS在25℃冲洗三次准备移植。

可选择地，在培养中保存人上皮细胞，扩展乳晕上皮细胞，和制备粘附蛋白的方法可用于涂覆由聚合物凝胶组合物制成的人造乳晕模具的生物支架。

简要地，聚—凝胶模具可以被塑造成乳晕形状，细胞侧面(上皮)用粘附蛋白和生长因子的混合物处理，例如纤连蛋白(在PBS中范围是0.1至500μg/ml)，层粘连蛋白(在PBS中范围是0.1至500μg/ml)，RGDS(在PBS中范围是0.01至100μg/ml)，胶原IV型(在0.1M醋酸中范围是0.1μg至1000μg)，FGF(在PBS中是10至400ng/ml)，EGF(在PBS中是10至400ng/ml)，或TGFβ(在PBS中是1至100ng/ml)。在4℃中孵化10分到2小时后，将人造模具用PBS冲洗三次，将在培养基(含5％ FCS的DMA-H16或含有纤连蛋白，层粘连蛋白，RGDS，和胶原IV型的吸附蛋白的混合物)密度大约是50,000至大约10⁶细胞/ml优选是大约150,000至250,000细胞/200ml培养的人乳晕上皮细胞添加到乳晕模型中。将一层(10mg/mL的透明质酸钠，0.1至0.5ml)应用在细胞层上作为保护剂，其余将在37℃ 10％ CO₂中被孵化10分钟到24小时。人造乳晕用PBS冲洗3次。

本发明描述的方法允许用DLC和类似的涂层涂覆聚合物表面以使其用作衍生自上皮来源的细胞的载体。支架可以是生物可降解的部分。支架可以是薄片形式，微粒形式，也可以是半固体块。支架用等离子枪涂布，它将以200至400的厚度在目的培养物表面沉积一层碳等离子。

与金刚石样碳(DLC)涂层类似，无定形氮化碳(C-N)薄膜是非常坚硬和耐磨的。它们可以作为解决整个髋替换无菌松弛问题的侯选。Du等已报道，造骨细胞在硅上的形态学行为，DLC-涂覆硅和无定形C-N薄层一在器官培养物中沉积的硅用电子显微镜扫描方法进行研究。硅晶片上的细胞能粘附，但是不能沿着此粘附物伸展。相反地，细胞在DLC涂层和无定形C-N薄膜上粘附，伸展和增生扩散而细胞生理机能没有明显损伤。在涂层和薄膜上的细胞形态学的发展与对照细胞类似。此结果支持本发明中的DLC涂层的生物相容性和促进无定形C-N薄膜的潜在的生物医学应用(C.Du等，Biomaterials.1998 Apr-May；19(7-9)：651-8。

DLC涂层的过程如下：

等离子设备包含由劳伦斯伯克利国家实验室，伯克利，CA制造的真空电弧等离子枪，它以重复—脉冲模式运行从而将高电功率和热负荷量减到最小。安装在碳阴极，等离子枪形成一个以大约20eV定向流动能量的纯碳等离子体的密集羽流。将等离子体注入到90°磁性过滤器中(弯曲的螺线管)从而从阴极去除任意的微粒物质，并且然后传送通过一个大的多孔构型的永久磁铁从而使游离等离子体的轮廓平整；用这种方式碳等离子体沉积物空间均匀地分布在一个大的沉积区域上。

为进一步提高薄膜的均匀性，将要用DLC涂覆的基质放置在缓慢旋转的圆盘中，因而消除和方位角的不同。采用所述仪器形成大约2至4000厚度的DLC薄膜，优选大约是200-400厚度。

为提高支架支持细胞生长或粘附的能力，将包含以下一种或多种的粘附混合物在合成时植入或整合入组合物中：在聚合物凝胶中浓度范围从1μg至500μg/ml的纤连蛋白，在聚合物凝胶中浓度范围从1μg至500μg/ml的层粘连蛋白，在聚合物凝胶中浓度范围从0.1μg至100μg/ml的RGDS，在聚合物凝胶中浓度范围从1ng至500ng/ml的与聚合碳共轭的bFGF，在聚合物凝胶中浓度范围从10ng至1000ng/ml的与聚合碳共轭的EGF，在聚合物凝胶中浓度范围从1ng至1000ng/ml的NGF和在聚合物凝胶中浓度范围从1μg至500μg/ml的硫酸肝素。

以薄片或微粒的形式，有涂层的支架在另一个实施方式中被用作上皮或神经细胞生长的载体和在细胞移植过程中细胞递送的载体。半固体聚合物块形式可以被用作神经细胞的保持装置，其与集成电路片或CCD晶片相连作为神经刺激检测器发挥功能。包衣的表面可以通过涂覆由培养的牛角膜内皮细胞分泌的细胞外基质作并且然后用DLC涂层覆盖可以进一步改良。

实施例1：用DLC涂覆片形式的生物聚合物支架。

生物聚合物片可以是任意尺寸，本发明中优选大约是2cm×2cm，将其固定在旋转圆盘中并依次装置在缓慢旋转的电动机上面的DLC涂覆腔内。等离子体设备通过喷射枪以大约20eV定向流动的能量产生纯碳等离子体的密集羽流。等离子体被注入到90°磁性过滤器中从而去除任意的微粒物质以形成高质量，无氢的金刚石样碳。当通过一个大的多孔构型的永久磁铁传送从而使游离等离子体的轮廓平整，碳等离子体沉积物空间均匀地分布在在一个大的沉积区域上。随着碳等离子体羽流接近保存有聚合物片的缓慢旋转的圆盘，DLC的均匀薄膜将涂覆在此片的表面。此片可以用来生长很多种细胞，例如上皮细胞，或在UV照射或70％酒精漂洗灭菌后作为细胞移植的载体。

实施例2：用DLC涂覆微粒形式的生物聚合物支架。

生物聚合物微粒将被放置在专用的旋转室中并且如前述实施例1中描述的那样生成碳等离子体的羽流。当它在垂直轴方向缓慢转动时等离子枪将DLC喷雾引入于室中。微粒珠将通过气流的诱导悬浮在涂覆腔中，当等离子枪在运转时此珠在交互的气流中将上升和下降很多次以确保均匀涂覆在所有的侧面。这个过程将持续大约2-3小时以确保均匀和完全覆盖所有粒子的表面。均匀厚度大约为200-400的DLC薄层将被沉积在整个球面上。产物然后通过UV照射或酒精漂洗灭菌，包装和密封，储存在架子上直至使用。

实施例3：带有在其合成过程中植入或导入其组合物中粘附或生长促进因子，并随后由DLC涂覆的生物聚合物支架。

本发明的支架在合成中可以被植入，或导入其组合物中粘附或生长促进因子，所述因子包含下列的一种或多种：在聚合物凝胶中浓度范围从1μg至500μg/ml的纤连蛋白，在聚合物凝胶中浓度范围从1μg至500μg/ml的层粘连蛋白，在聚合物凝胶中浓度范围从0.1μg至100μg/ml的RGDS，在聚合物凝胶中浓度范围从1ng至500ng/ml的与聚合碳共轭的bFGF，在聚合物凝胶中浓度范围从10ng至1000ng/ml的与聚合碳共轭的EGF，在聚合物凝胶中浓度范围从1ng/ml至1000ng/ml的NGF和在聚合物凝胶中浓度范围从1μg至500μg/ml的硫酸肝素。支架然后被制成薄片或半固体块，DLC沉积可以按照前述实施例1的描述实现。或聚合物可以被制成微粒或球体，DLC沉积可以按照前述实施例2的描述得到。

实施例4：用培养的牛角膜内皮细胞沉积的细胞外基质涂覆支架并且然后用DLC涂覆此片或微粒。

DLC沉积在培养物表面前，生物聚合物或聚合物片，和微粒块可先用细胞外基质(ECM)涂覆。为了达到此目的，将牛角膜内皮细胞(BCE)以低密度(大约2000至150,000细胞/ml，优选大约20,000细胞/ml)播种在片或块的表面，或允许粘附在微粒的表面。BCE细胞保存在含DME-H16的培养基中，其中还加入10％牛血清，5％胎牛血清，2％右旋糖苷(40,000MV)和50ng/ml的bFGF。细胞在在37℃ 10％ CO₂中孵化7天，在此过程中每隔一天加入浓度为50ng/ml的bFGF。通过用20mM氢氧化铵处理聚合物片，块或微粒BCE细胞5分钟去除BCE细胞。然后带有细胞外基质涂层的生物聚合物用足够量的PBS冲洗十次。干燥后，经ECM涂覆的聚合物片或块如先前实施例1描述用DLC沉积处理，而ECM涂覆的微粒如实施例2描述用DLC沉积处理。在用ECM和DLC连续涂覆后，聚合物片，块或微粒将通过UV照射或酒精漂洗灭菌，并且用于神经细胞的生长或作为细胞移植的载体。

实施例5：DLC沉积在组织培养实验室器皿的培养物表面

如果是平坦的培养物表面例如盘，嵌入式过滤器，载玻片室(chamber slide)，薄片和块，在压力室中器皿的培养物表面向上对准等离子枪，涂覆过程可以按照先前描述的进行。在微载体珠的情况下，它们需要被诱导在室中流动以确保均匀涂覆在所有的面上。对于封闭表面像烧瓶和管子，一种特殊改良的等离子枪将伸进器皿中并且涂覆预器的表面。均匀厚度大约为20至大约4000，优选大约是200-400的DLC薄层将被沉积在培养物表面。产物然后通过UV照射或酒精漂洗灭菌，包装和密封，储存在架子上直至使用。

实施例6：用培养的牛角膜内皮细胞分泌的ECM连续涂覆培养物表面然后DLC沉积。

在此实施方式中，牛角膜内皮细胞的稀疏培养物(大约1000至50,000细胞/ml，优选2000-5000细胞/ml)接种在预期的实验室器皿中的培养物表面，包括盘子，烧瓶，管子，嵌入式过滤器，载玻片室(chamber slides)，微载体珠，滚筒瓶，细胞收获器(harvesters)，薄片，和块。细胞保存在含有的DME-H16基质中，其中还加入10％牛血清，5％胎牛血清，2％右旋糖苷(40,000MV)和50ng/ml的bFGF。牛角膜内皮细胞生长7-10天直至与每隔一天加入的50ng/ml的bFGF融合。然后去除培养基并用足够的20mM氢氧化铵在蒸馏水中处理细胞3至30分钟。然后用足量的PBS冲洗10次以去除剩余的氢氧化铵并且在无菌的层流净化橱中干燥。然后DLC涂层按照先前描述的涂覆在细胞外基质之上。产物然后通过UV照射或酒精漂洗灭菌，包装和密封，储存在架子上直至使用。

实施例7：用粘附或生长促进试剂连续涂覆培养物表面然后DLC沉积。

在此交替的具体实施方式中，一种或多种粘附或生长促进试剂包含浓度范围从1μg至500μg/ml的纤连蛋白，浓度范围从1μg至500μg/ml的层粘连蛋白，浓度范围从0.1μg至100μg/ml的RGDS，浓度范围从1ng至400ng/ml的与聚合碳共轭的bFGF，浓度范围从10ng至1000ng/ml的与聚合碳共轭的EGF。粘附或生长促进试剂将被加入到培养物表面，然后将在4℃孵化20分钟至2小时。然后表面用PBS冲洗三次并且在灭菌的层流净化橱中干燥。然后产物在培养表面粘附或生长促进剂顶上沉积DLC涂层。实验室器皿之后通过UV照射或酒精漂洗灭菌，包装和密封，储存直至使用。

实施例8：在涂覆的微载体之上的附属和培养RPE和其他神经元细胞。

视网膜色素上皮(RPE)细胞生长在先前由牛角膜内皮细胞分泌的细胞外基质(ECM)涂覆的60mm组织培养盘中。每隔一天用含有15％胎牛血清(FCS)和bFGF的浓度为100ng/ml的培养介质饲喂RPE细胞。在细胞融合时，更换培养基并且添加5ml新鲜的培养基。然后将5-10×10⁶微载体珠，已用DLC或其他组合物涂覆，加入到盘中。盘子以数字-8的动作旋转8-10次以使大部分珠粒很好的分布，然后在37℃ 10％ CO₂中孵化并且微载体允许置于底部与RPE细胞直接接触。每隔一天将浓度为100ng/ml的bFGF溶液加入到培养物中，2.5ml培养基从顶部被小心地吸出，小心翼翼地最小程度地扰动微载体。在珠粒被引入到盘中7至10天后，取自盘中的RPE细胞层将逐渐地接近微载体珠并且开始在它周围增生扩散直至它形成覆盖微载体珠整个表面区域的薄层。微载体从细胞层中被轻轻地分离并且在滚筒瓶中进一步培养3天，此后，它准备在细胞移植过程中注射入脑干使用。

实施例9：用于乳头重建的在生物合成的聚合物或水凝胶支架中神经的再生

含有0.5至5％明胶的N-聚异丙基丙烯醛酰胺/明胶互相贯穿的网状物通过以下步骤合成。通过将3.98g NIPAAM，0.068g N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)，和0.122mL的N，N，N′，N′-四亚甲基二胺溶解于足够的去离子水中得到总体积25mL的浓缩N-异丙基丙烯醛酰胺(NIPAAM)溶液。将适量的明胶溶于去离子水制得5.16％的明胶去离子水水溶液(w/w)。通过将0.12g过硫酸钾溶于5mL去离子水中制得过硫酸钾(KPS)溶液。溶液在4至6℃存储直至使用。

NIPAAM的聚合：明胶溶液加热到大约55℃，搅拌直至明胶完全熔化。在明胶溶液冷却至30至35℃后，1.53mL明胶溶液与1.47mL去离子水混合，然后加入3.0mLNIPAAM溶液。混合物搅拌几分钟，然后将0.12mLKPS加入到混合物中。混合物然后立即注射入具有人乳头形状的模型中。模型置于密封器皿中。用氮使混合物脱气，至少重复三次除去氧气。混合物在室温下容许聚合至少二小时。

明胶的交联：完成聚合后，从模型中去除凝胶并且将其浸入0.5％戊二醛水溶液中促成PNIPAAM凝胶中的明胶链交联，从而形成互相贯穿的网状物。产物凝胶乳头支架在此过程几天后用去离子水冲洗(通过每天换水)以去除残存的小分子和未反应的NIPAAM单体。清洁的凝胶乳头支架在4至6℃储存。

移植和临床评估。依照标准乳房重建程序，生物合成的NIPAAM/明胶乳头支架缝合入重建的乳房中并且手术后每天检查持续7天然后是每周检查。乳头触觉灵敏性通过Cochet-Bonnet触觉测量器(Handaya，Tokyo)在乳头的五个点上被测量。简单来说，细丝从工具中伸长接触到乳头而且受试者的感觉反应被记录下来。最初，通过长丝伸长产生非常温和的接触，然后将长度逐渐缩短(变得更加坚硬并且接触更加坚定)直至受试者清楚地回应。此伸长被记录下来作为接触—灵敏度阈值。

实施例10：在重建的乳晕内神经元的再生

已经显示神经营养性因子刺激外围的神经再生。可适用于生物合成的支架乳头的可溶解的因子包括但是不局限于酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，神经生长因子(NGF)，神经胶原生长因子(GGF)，脑源神经营养因子(BDNF)，睫状神经营养性因子(CNTF)，血小板生成生长因子(PDGF)，和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。

PNIPAAM/明胶凝胶乳头支架按照实施例1的描述制备。当它去除小分子和未反应的NIPAAM单体时，将讨论的生长因子然后加入到凝胶中。生长因子富集的凝胶乳头然后在4至6℃储存直至需要移植。

实施例11：改良生物聚合物支架的实施方式

按照实施例1描述的制备方法，聚(n-异丙基丙烯酰胺)可以用选自以下组的单体通过共聚合作用被改良，包含丙烯酸酯，丙烯酸，甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸，丙稀酰胺，甲基丙烯酸胺，醋酸乙烯酯，苯乙烯，和它们的衍生物。可以理解生物可降解的聚合物和生物学来源的聚合物的变种可以被本发明的丙稀酰胺聚合物替代。

实施例12：明胶基支架

在可选择的具体方式中，按照实施例10描述的制备方法，用胶原或明胶和胶原的组合物取代明胶。此方法然后按照实施10进行。

由于已经对本发明进行了说明，本发明实质由所附权利要求的范围限定，显然本领域技术人员可以在不背离本发明的实质的情况下进行适当修改。美国专利，专利的应用，和以上其他上述引用文献公开的内容都此处均全文引用作为参考。

Claims (12)

1、一种生物相容性的基质，用于哺乳动物软组织特征或区域的美容重建，包括：

a)支架，其包括聚合物，生物聚合物或它们的组合；

b)在其合成过程中将粘附或生长促进剂植入或导入支架；和

c)其中将支架塑造成哺乳动物皮肤上皮特征或区域受体的形状。

2、一种生物相容性的基质，用于哺乳动物软组织特征或区域的美容重建，包括：

a)支架，其包括聚合物，生物聚合物或它们的组合；

b)在其合成过程中将粘附或生长促进剂植入或导入支架；粘附或生长促进剂包含下述一种或多种：层粘连蛋白，纤连蛋白，RGDS，与polycarbophyll共轭的bFGF，与polycarbophyll共轭的EGF，和硫酸肝素；和

c)其中将支架塑造成哺乳动物皮肤上皮特征或区域受体的形状。

3、权利要求1所述的生物相容性基质，其中重建的软组织特征可以是任意的软组织特征例如人耳朵，乳晕，鼻子，嘴唇，生殖器，指尖和指甲床。

4、权利要求1所述的组合物，其中支架选自：

a)天然聚合物，其中包括但不限于胶原，明胶，透明质酸盐，纤维蛋白和藻酸盐；

b)合成聚合物，其中包括但不限于聚丙烯酸和衍生物，聚环氧乙烷和共聚物，聚乙烯醇，聚磷腈，多肽，PNIPAAM/明胶；NIPAAM；和

c)进一步的组合物，其中包括a)中天然聚合物和b)中合成聚合物的混合物。

5、哺乳动物软组织区域美容重建的方法，包括步骤：

a)制作患者软组织区域的三维模型；

b)生成生物相容性基质，其包括在其合成过程中已经在支架中植入或导入粘附和/或生长促进剂的支架；

c)转移入所述患者软组织区域的三维模型中，使生物相容性基质具有软组区域的形状，从而成为需重建的患者软组织区域解剖学上的复制品；

d)在后来的重建手术中将步骤C的生物相容性基质植入患者适当的组织中，用可去除的缝合线锚定；

e)让上皮细胞在其表面生长以提供皮肤的覆盖物，使之与生物相容性基质提供的支架无缝结合；和

f)让神经和神经纤维长入生物相容性基质中，给软组织区域提供感觉。

6、哺乳动物软组织区域的美容重建方法，包括步骤：

a)制作患者软组织区域的三维模型；

b)生成生物相容性基质，其包括在其合成过程中已经在支架中植入或导入粘附剂的支架，粘附剂包括下面的一种或者多种：层粘连蛋白，纤连蛋白，RGDS，与polycarbophyll共轭的bFGF，与polycarbophyll共轭的EGF，和硫酸肝素；

c)转移入所述患者软组织区域三维模型中，使生物相容性基质具有软组织区域的形状，从而成为需重建的患者软组织区域解剖学上的复制品；

d)在后来的重建手术中将步骤C的生物相容性基质植入患者适当的组织中，用可去除的缝合线锚定；

e)让上皮细胞在其表面生长以提供皮肤的覆盖物，使之与生物相容性基质的支架无缝结合；和

f)让神经和神经纤维长入生物相容性基质中，给软组织区域提供感觉。

7、权利要求5的哺乳动物软组织区域美容重建的方法，其中被重建的软组织特征可以是任意的软组织特征例如人耳朵，乳晕，鼻子，嘴唇，生殖器，指尖和指甲床。

8、权利要求5的方法，其中生物相容的基质包含选自含有下列物质的组的生物聚合物：

a)天然聚合物，其中包括但不限于胶原，明胶，透明质酸盐，纤维蛋白和藻酸盐；

b)合成聚合物，其中包括但不限于聚丙烯酸和衍生物，聚环氧乙烷和共聚物，聚乙烯醇，聚磷腈，多肽，PNIPAAM/明胶；NIPAAM；和

c)进一步的组合物，其中包括a)中天然聚合物和b)中合成聚合物的混合物。

9、哺乳动物耳朵区域美容重建的方法，包含步骤：

a)制作患者耳朵区域的三维模型；

b)生成生物相容性基质，其包括在其合成过程中已经在支架中植入或导入粘附剂的支架，粘附剂包括下面的一种或者多种：层粘连蛋白，纤连蛋白，RGDS，与polycarbophyll共轭的bFGF，与polycarbophyll共轭的EGF，和硫酸肝素；

c)转移入所述患者耳朵的三维模型中，使生物相容性基质具有耳朵的形状，从而成为患者耳朵解剖学上的复制品；

d)在后来的重建手术中将步骤C的生物相容性基质植入患者的头皮组织中，用可去除的缝合线锚定；

e)让上皮细胞在其表面生长以提供皮肤的覆盖物，使之与生物相容性基质的支架无缝结合；和

f)让神经和神经纤维长入生物相容性基质中，为耳朵提供感觉。

10、权利要求7的方法，其中生物相容的基质包含选自含有下列物质的组的生物聚合物：

a)天然聚合物，其中包括但不限于胶原，明胶，透明质酸盐，纤维蛋白和藻酸盐；

b)合成聚合物，其中包括但不限于聚丙烯酸和衍生物，聚环氧乙烷和共聚物，聚乙烯醇，聚磷腈，多肽，PNIPAAM/明胶；NIPAAM；和

c)进一步的组合物，其中包括a)中天然聚合物和b)中合成聚合物的混合物。

11、哺乳动物乳晕和乳头区域的美容性重建的方法包含以下步骤：

a)制作患者乳晕和乳头区域的三维模型；

b)生成生物相容性基质，其包括在其合成过程中已经在支架中植入或导入粘附或生长促进剂的支架，粘附剂或生长促进剂包括下面的一种或者多种：层粘连蛋白，纤连蛋白，RGDS，与polycarbophyll共轭的bFGF，与polycarbophyll共轭的EGF，和硫酸肝素

c)转移入所述患者耳朵的三维模型中，使生物相容性基质具有耳朵的形状，从而成为患者乳头和乳晕区域解剖学上的复制品；

d)在后来的重建手术中将步骤C的生物相容性基质植入患者的乳房组织中，用可去除的缝合线锚定；

e)让上皮细胞生长在其表面生长以提供皮肤的覆盖物，使之与生物相容性基质的支架无缝结合；和

f)让神经和神经纤维长入生物相容性基质中，为乳晕和乳头提供感觉。

12、权利要求11的方法，其中生物相容的基质包含选自含有下列物质的组的生物聚合物：

a)天然聚合物，其中包括但不限于胶原，明胶，透明质酸盐，纤维蛋白和藻酸盐；

b)合成聚合物，其中包括但不限于聚丙烯酸和衍生物，聚环氧乙烷和共聚物，聚乙烯醇，聚磷腈，多肽，PNIPAAM/明胶；NIPAAM；和

c)进一步的组合物，其中包括a)中天然聚合物和b)中合成聚合物的混合物。