KR20060130580A

KR20060130580A - 연조직 형태 복원을 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20060130580A
Application number: KR1020067011107A
Authority: KR
Inventors: 행크 씨 케이 우
Original assignee: 셀룰라 바이오엔지니어링 인코포레이티드; 우. 행크 씨 케이
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2006-12-19
Also published as: WO2005061019A3; AU2004305574B2; WO2005061019A2; EP1696976A2; AU2004305574A1; JP2007521114A; CA2549182A1; US7753955B2; CN1913929A; US20070270948A1

Abstract

본 발명은, 이전에는 외과적으로 절제하던 유륜과 같은 대체되는 피부형태의 틀을 수용하고, 예를 들어, 유두와 유륜과 같은 연조직 형태의 크기와 형상으로 재형성하며, 생체적합성 생체고분자 골격 내부로의 세포융합이 가능할 뿐만 아니라, 전기 골격 물질로의 주변 신경섬유의 침윤이 가능한 전기 고분자를 덮는 피부세포의 상피조직화를 허용하는 능력을 가지는 고분자 또는 전기 골격을 작제함으로써, 환자가 천연조직에서 나타나는 동일한 크기와 형태를 갖을 뿐만 아니라 감각기능도 갖는 복원된 연조직 형태의 장점을 갖는, 입술, 유륜 및 많은 다른 형태의 다양한 연조직 형태의 복원에 유용한 조성물 및 방법을 개시한다.

연조직, 복원

Description

연조직 형태 복원을 위한 조성물 및 방법{Method and Composition for Soft Tissue Feature Reconstruction}

본 특허출원은 2003년 10월 10일자 출원된 미국 가특허출원 제 60/528,064호를 우선권으로 하며, PCT/US2004/032934와 PCT/US2004/033194의 일부계속출원이고, 이들 문헌은 전체적으로 본 명세서의 참고문헌으로 포함하였다.

본 특허출원은 손가락끝, 귀나 유륜(areola) 또는 유두를 복원하기 위하여 특정 피부나 연조직 또는 보다 바람직하게는 유방을 대체하는 용도로, 비활성 조직(enervated tissue)을 제공하여 합성 또는 생합성된 골격(scaffold)에서 배양된 인간 세포의 배양 및 이식을 기술한다.

미국의 여성 8명 중 1명은 유방암 진단을 받게 될 것이다. 유방암 치료는 대부분 유방절제술, 1/4의 유방암 절제(quadrantectomy), 또는 다른 종류의 절제술을 포함한 외과용 수술에 머물고 있다. 유방암 수술은 복원시술자가 최선의 노력을 다했음에도 불구하고 외관이 상당히 훼손되어질 수 있다. 유방의 유두와 유륜 부위는 유방 절제술 동안 대개 제거되고, 이 부위의 복원은 매우 어려웠었다. 현 재까지는 복원 노력이 외관뿐만이 아니라, 유두 및 유륜의 감각까지 효과적으로 재생할 수 없다.

조직배양 기술은 조직 및 기관 등가물(equivalent)의 발생에 있어 성공적으로 사용되고 있다. 이러한 기술의 기초는 콜라겐 기질구조(collagen matrix structure) 및 골격(scaffold)을 포함하며, 이는 살아 있는 세포, 영양분 및 배양조건의 적절한 결합에 의해서 기능적인 조직 및 기관으로 재형성되는 것이 가능하다. 조직 등가물은 미국특허 제 4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346; 4,837,379; 및 5,827,641호 등 많은 특허에서 심도있게 기술되어 있고, 이들 문헌은 본 명세서에서 참고문헌으로 포함하였다. 조직 등가물의 성공적인 응용으로는 살아 있는 피부 등가물을 들 수 있으며, 이는 실제 인간 피부와 유사한 형태를 지니고 있다. 살아 있는 피부 등가물은 더 두꺼운 부분을 덮는 분화되고 성층화된(stratified) 인간 상피 케라티노사이트(human epidermal keratinocyte)로 구성된 상층 부위와, 콜라겐 기질에서 인간 진피섬유 모세포(human deraml fibroblast)의 하층 부위의 두 층으로 구성되어 있다(참조: Bell, et al., “Recipes for Reconstruction Skin,” J. of Biochemical Engineering, 1991; 113: 113-119).

세포이식은 눈, 뇌, 간, 피부, 연골 및 혈관에서의 질병치료를 포함하는 다양한 치료적 요구에 부응하여, 전체 기관의 대체를 위한 대안으로서 제안되었다(참조: JP Vacanti et al., J. Pediat. Surg., Vol. 23, 1998, pp. 3-9; P Aebischer et al., Brain Res. Vol. 488, 1998, pp. 364-368; CB Weinberg and E. Bell, Science, Vol. 231, 1986, pp. 397-400; IV Yannas, Collagen III, ME Nimni, ed., CRC Press, Boca Raton, 1988; GL Bumgardner et al., Hepatology, Vol. 8, 1988, pp. 1158-1161; AM Sun et al., Appl. Bioch. Biotech., Vol. 10, 1984, pp. 87-99; AA Demetriou et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 83, 1986, pp. 7475-7479; WT Green Jr., Clin. Orth. Rel. Res., Vol. 124. 1977, pp. 237-250; CA Vacanti et al., J. Plas. Reconstr. Surg., 1991; 88:753-9; PA Lucas et al., J. Biomed. Mat. Res., Vol. 24, 1990, pp. 901-911). 조직배양에서 인간 세포를 생산하는 능력은 상실된 조직기능을 복구하는 치료방식으로서 세포이식의 전망을 밝게 할것이다. 신경관(neral crest) 조직으로부터 인간의 배양된 세포를 생산하는 것은 그 기원으로부터 유도된 조직 또는 기관이 보통 성체가 된 이후에 손상으로부터 자신을 복구할 수 없기 때문에 특히 중요하다.

실험실 조건에서 세포성장에 유용한 통상적인 조직배양 실험용기는 배양물에서 포유동물 세포의 부착 및 증식을 증대시키기 위하여 일반적으로 음전하로 코팅된다. 그러나, 통상적인 조직배양표면을 가지는 포유동물의 신경세포를 충분하게 부착, 유지 및 증식시키는 것은 예전부터 큰 어려움을 겪어 왔다. 콜라겐 겔의 층을 첨가함으로써 조직배양용 플레이트 및 디쉬상에 래트의 EHS 종양세포에 의해 분비된 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 장착 또는 보완하여 신경세포의 부착 및 증식이 증대되도록 하였다. 그러나, 이러한 기술은 세포가 접종되기 바로 전에 상기 물질이 짧은 시간동안 배양표면에서 층을 형성하여야만 한다는 단점에 의하여 이용될 수 없었다.

본 발명은 세포성장과 침투를 위한 골격을 생산하기 위해 3가지 종류의 고분자를 고려하였다: 생체고분자(살아 있는 기관에서 형성된 고분자: 콜라겐, 젤라틴 등), 합성고분자(생체외에서 화학적으로 합성된 고분자: 알킬레이트, 폴리비닐 알콜 등) 및 생합성된 고분자의 조합물. 본 발명에서는 부착 및 성장을 지지하기 위한 골격(scaffold)으로 궁극적으로 이식과정에서 세포를 지지하는 담체(vehicle)로서 이러한 고분자의 사용을 고려하였다. 이러한 사용은, 특히 노화가 진행되는 동안 신경관으로부터 유래된 세포가 종종 손상되어지는 뇌와 눈의 후부(back of the eye)에서, 세포 이식 치료(cell replacement therapy)의 성공에 중요하다. 생체고분자는 7가지 종류가 있다: 폴리뉴클레오티드, 폴리아미드, 폴리이소프렌, 리그닌, 폴리포스페이트 및 폴리히드록시알카노에이트(참조: 미국특허 제 6,495,152호). 생체고분자로는 콜라겐 IV, 표면에 탄소입자가 함입되거나 일차아민 및 선택적인 펩티드로 처리되거나 또는 일차 아민기 또는 카르복시기를 포함하는 실란 또는 실록산(참조: 미국특허 제 4,822,741호)과 함께 경화되는(co-cured) 폴리오르가노실록산 조성물, 또는 예를 들어, 지방제거 및 다른 처리를 수행하여 글리코사미노글리칸과 함께 콜라겐 II를 생성하는 천연 연골물질을 포함하는 다른 변형 콜라켄이거나(참조: 미국특허 제 6,676,969호), 또는 대안으로서 글리코사미노글리칸 및 다른 어떠한 필요첨가물과 혼합될 수 있는 순수분리된 콜라겐 II의 섬유를 포함한다. 이러한 추가적 첨가물은 예를 들어, 콜라겐 II 섬유에 연골세포(chrondocyte)의 부착을 도와주는 콘드로넥틴 또는 앵커린 II를 포함할 수 있고, 연골 유도인자(CIF), 인슐린-유사 성장인자(IGF) 및 변형성장인자(transforming growth factor, TGF-ß) 와 같은 성장인자를 포함할 수도 있다.

발명의 요약

본 발명의 일측면은 유두 및 유륜에서의 외과적인 절제, 연조직 형태의 크기 및 모양의 재생에 앞서 유륜과 같은 대체되는 피부 형태의 틀을 취하고, a) 생체적합성; b) 골격에 걸친 피부조직의 상피형성 능력; c) 골격의 체내로의 세포동화(cell integration)능력; d) 및 골격의 본체내로의 신경섬유 침투능력을 가지는 골격을 사용함으로써, 환자가 동일한 크기와 형태 및 원래 조직으로서 외관 뿐만 아니라, 감각능력도 갖는 복원된 연조직 형태의 장점을 가지게 되는 것을 포함한다.

본 발명의 중요한 측면은 대체되거나 복원되는 연조직 형태에 신경의 침투를 촉진시키는 고분자/생체고분자로 구성된 맞춤형 골격의 사용을 하는 것이다. 종래기술에서 적절하게 소개된 바 없는 결정적인 중요성을 가지고, 신경의 증식 및 기능을 촉진하는 능력은 결정적인 중요성을 가지고, 종래기술에서 적절하게 소개된 바 없는 문제점이다.

본 발명의 다른 중요한 측면은 세포이식 단계 중 미세담체에 상피세포, 뉴런세포(neuronal cell) 및 다른 세포를 포함하는, 여러 인간 세포 종류의 부착을 위한 특성화된(specialized) 부착 및 살아 남는(survival) 골격을 생성하는 것이다. 본 발명에서 사용된 골격은 상기 기술에서 알려진 콜라겐, 라미닌 및 폴리-L-리신과 같은 표준물질(standard substance)로 코팅될 수 있고, 종양 세포와 같은 다른 세포에 의해 분비되는 세포외 기질 단백질도 될 수 있는데, 상기 단백질은 세포의 배양 표면으로 분비되고 난 후 그 세포는 제거된다. 본 발명자들은 다이아몬드-유사 탄소(DLC)가 인간 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 새로운 기질임을 확인하였다. DLC 코팅은 미세담체에 증착될 수 있으며, 이는 유리, 플라스틱, 생체고분자 겔, 콜라겐 및 젤라틴, GAGS, 합성 고분자 및 금속으로 구성된다. DLC 코트는 세포외 기질, 부착성 분자(adhesive molecule) 및 성장 인자와 같은 다른 종류의 코팅 위에도 가해질 수 있다.

DLC 필름(공기 중에서의 마찰계수 약 0.1, 경도 약 80GPa 이상 및 탄성율 약 600GPa)의 기계적 및 마찰 특성은 다이아몬드의 특성과 매우 밀접하다. 아울러, 이들 필름은 가장 반응성이 높은 환경에서도 화학적으로 불활성되고, 다이아몬드와 유사한 밀도로 증착될 수 있다. 그러나, 탄소 기화 증착(carbon vapor deposition)과는 대조적으로 다이아몬드, DLC 필름은 상온에서도 흔히 생산될 수 있는데, 이는 기질이 상승된 온도에 처하는 응용분야에서 매우 매력적이다.

본 발명의 다른 측면은 골격의 표면위에 DLC 또는 다른 종류의 증착을 제공하는 것인데, 이는 차례로 인간 및 포유동물의 상피 및 신경세포 뿐만 아니라 다른 세포 유형에 있어서도 부착 및 성장을 도모한다.

더욱이, 본 발명의 골격을 구성하는데 사용된 생체고분자 이외에도, 기원의 측면에서 골격은 천연 또는 합성물 고분자로 구성될 수 있다. 천연 생체고분자는 콜라겐 및 그외의 잘 알려진 고분자 물질을 포함한다. 합성 고분자로서는 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴 아미드 또는 폴리-2-히드록시메타크릴레이트, 폴리비닐 알콜 및 그의 유도체 또는 공중합체와 같은 아크릴 및 그의 유 도체 또는 공중합체가 될 수 있다. 상기 골격은 박막(thin sheet) 또는 미세입자형태일 수 있다. 성장도모 특성을 향상시키기 위하여, 부착 및 성장 촉진인자가 합성 중에 그의 구조물 내부로 함입 또는 투입될 수 있다. 게다가, 반고체(semi-solid) 생체고분자를 포함하는 신경세포의 성장 및 복제를 도모하기에 적합한 3차원 성장배지(three dimensional growth medium)는 뉴런의 성장 및 유지를 도모하는 기능을 향상시키기 위하여 DLC로 코팅될 수 있다. 또한, 상기 생체고분자는 키토산 또는 소듐 알긴산염(sodium alginate)인 "메이폴리머(may polymer)"를 포함할 수도 있다.

본 발명의 목적 뿐만 아니라, 이들이 수반하는 장점은 하기의 바람직한 실시 태양의 상세한 설명을 참조하여 보다 명확하게 설명될 것이다.

본 발명의 바람직한 실시태양을 기술함에 있어, 명료하게 할 목적으로 특정 용어가 재분류될 것이다. 그러나, 본 발명은 선택된 특별한 단어에 제한되지 않고, 각각의 특정한 용어는 유사한 목적을 달성하기 위한 유사한 방법에서 다루어지는 모든 기술적인 등가물을 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명의 주요한 측면은 연조직 형태의 모양 및 외관을 복원해내는 고분자/생체고분자 골격의 사용이다. 이러한 복원은 연조직 형태의 3차원적 모양의 성형화 및 그후의 생체고분자/고분자 골격에 걸친 인간 상피의 파종(seeding) 및 성장을 포함한다.

상기 연조직 형태의 복원에 필수적인 요소는 골격에서 감각뉴런 및 신경로(nerve tract)의 침투 및 성장을 통한 복원된 부위에서의 감각의 복원이다. 상기 고분자/생체고분자 골격은 투과성을 지니고 있어서 감각 신경이 골격내에서 성장할 수 있고, 일정 기간 이상 골격을 비활성화(enervate)시킬 수 있다. 그 결과는 복원된 연조직 부분에서 느끼는 최소한 어느 정도 감각의 복원인 것이다.

여러 다른 연조직 형태가 본 발명의 조성물과 방법을 이용하여 제조되거나 복원되었을 것이라 생각된다. 예를 들면, 유륜 뿐만 아니라, 눈꺼플, 손가락끝, 입술, 외부 성기와 같은 다른 부분 및 귀, 코의 일부 및 여러 다른 연조직 형태가 설명된 형태로 만들어질 수 있다.

상술하였듯이, 연조직 형태의 복원에 사용되는 생체골격은 다양한 물질, 예를 들면, 콜라겐 및 잘 알려진 다른 고분자 물질을 포함하는 천연 생체고분자로 만들어진다. 상기 골격은 아크릴 및 그의 유도체 또는 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴 아미드 또는 폴리-2-히드록시메타크릴레이트, 폴리비닐 알콜 및 그의 유도체와 같은 공중합체등의 합성고분자로부터 합성될 수 있다. 상기 고분자 골격은 박막 또는 미세입자형태일 수 있다. 아울러, 상기 골격 고분자는 상피 세포층의 부착을 향상시키기 위한 DLC 및 다른 코팅제의 사용뿐만 아니라, 라미닌 또는 콜라겐과 같은 표준 세포내 부착성 단백질(standard cellular adhesion protein)로 코팅될 수 있다.

본 발명에의 접근은 골격내 또는 위에 피브로넥틴, 라미닌, RGDS, 콜라겐 IV, 폴리카보필과 결합된 bFGF, 폴리카보필과 결합된 EGF 및 헤파린 설페이트과 같은 부착성 단백질의 사용을 포함한다. 폴리카보필은 약간의 가교 고분자이다. 상기 가교제는 디비닐 글리콜(divinyl glycol)이다. 또한 폴리카보필은 그것의 음전하인 다중 카르복실 라디칼을 포함하는 약다중산(weak poly-acid)이다. 이러한 산성 라디칼은 세포 표면과 수소 결합을 가능하게 한다. 폴리카보필은 그 무게의 40 내지 60배의 물을 흡수하는 뮤신(mucin)의 능력을 가지며, 일반적으로 시판용 완화제로 사용된다(Equalactin, Konsyl Fiber, Mitrolan, Polycarb)(참조: Park H, et al., J. Control Release 1985, 2:47-57). 폴리카보필은 매우 큰 분자여서 잘 흡수되지 않는다. 또한 비면역적(non-immunogenic)이며, 실험실에서조차 항체를 고분자로 합성하는 것이 불가능하였다.

최근에 연구자들은 생물학적으로 활성인 분자를 조직재생을 위한 고분자 골격으로 속박(tethering)하는 이용을 보고하였다(참조: L. Griffith Clima, "Polymer Substrates for Controlled Biological Interactions," J. Cell. Biochem., vol. 56, pp. 155-161 (1994); P. R. Kuhl et al., "Tethered Epidermal Growth Factor as a Paradigm for Growth Factor-induced Stimulation from the Solid Phase," Nature Med., vol. 2, pp. 1022-1027 (1996)). 상피성장인자(EGF)를 스타폴리(star-poly), 즉 에틸렌옥사이드(ethylene oxide) 테더(tether) 위에 공유결합으로 연결하고, 생분해가능한 골격의 표면 위에 상기 테더를 고정함으로써, 래트 간세포의 부착 및 이동에 있어서 40%의 증가를 보였다(참조: L. Griffith-Clima, "Tissue Engineered Scaffolds for Liver Regeneration,"Presented at Molecular Engineering of Polymers Workshop: Directing Biological Response, American Chemical Society, November 1996). 게다가, 세포내에서의 DNA 합성은 EGF가 없는 배지에서의 합성 정도와 비교된다.

골격형성의 다른 다양한 실시태양에 의하면, 조직의 복원에 상피세포가 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제 5,986,043호에는, 환자의 수술후 세포 부착 형성을 감소시키고, 조직 표면에 국부적으로 약을 적용하며, 조직 표면을 환자에게 부착시키는 용도로 사용하는 광중합성 생분해성 히드로겔(photopolymerizable biodegradable hydrogels)이 개시되어 있다. 미국특허 제 5,906,828호에는, 지지체에 분지된 고리(tether)에 의해 유연하게 연결된, 성장인자 및 세포외 기질분자를 포함하는 성장 효과기(growth effector) 분자와 세포와 조직의 성장을 촉진하고 지지하기 위한 조합의 용도가 개시되어 있다. 미국특허 제 5,836,313호에는, 히드로겔의 명료성, 유연성 및 열확산률을 유지하는 한편, 각막 상피세포 성장에 적절한 기질을 제공하도록 설계된 얇은 층의 조직으로 히드로겔로 구성된 두층의 복합물질이 개시되어 있다. 특히, 미국특허 제 6,689,165호는 PHEMA/MAA 히드로겔의 용도에 대하여 기술하고 있다. 각막 상피 배양에 유용한 히드로겔의 중합은 팽윤(swelling) 없이 물과 교환되는 용매하에 광중합반응 시스템을 이용하여 수행되었다.

그외에도, 미국특허 제 5,830,504호 및 제 5,654,267호에는 기질(matrix)에 결합된 αγβ3 인테그린 리간드 및 성장인자 수용체 리간드의 조성물이 개시되어 있고, 이는 상처치료 및 조직재생을 촉진하는데 유용하다고 알려져 있다. 펩티드의 소수성 영역(domain)을 이용하여 펩티드를 고형물에 부착하는 방법은 미국특허 제 5,760,176호 및 제 5,120,829호에 개시되어 있다. 상피세포 성장을 촉진할 수 있는, 인공 수정체(lens)로 만들어진 콜라겐-히드로겔은 미국특허 제 5,716,633호에 개시되어 있다. 상처치료 및 조직재생을 촉진하기 위해 사용되기도 하는 히알우론산(hyaluronate) 고분자와 결합된 펩티드가 미국특허 제 5,677,276호에 개시되어 있다. 양성 전하로 된 분자와 세포 부착인자(cell adhesion factor)의 결합을 함유한 표면과 함께 지지물로 구성되어 있는 세포 배양 시스템은 미국특허 제 5,512,474호에 개시되어 있다. 세포배양 시스템을 최적화함으로써 세포표면 부착력을 향상시키고, 다양한 물질로 구성된 표면으로 세포의 생체부착력(cell bioadhesion)을 개선하기 위해 펩티드를 표면에 화학적으로 융합(graft)시키는 방법은 미국특허 제 5,278,063호에 개시되어 있다. 폴리에틸렌 옥사이드 스타 분자를 지지 표면에 공유결합으로 고정화함으로써 생산된 히드로겔은 미국특허 제 5,171,264호에 개시되어 있다. 이들 특허들은 전체적으로 본 명세서의 참고문헌으로 포함하였다.

본 발명의 실시태양에 있어서, 고분자 합성 도중 골격내에 함입되거나 포함되는 자가-지지(self-sustaining) 고분자를 개시하며, 피브로넥틴, 라미닌, RGDS, 폴리카보필이 결합된 bFGF, 폴리카보필이 결합된 EGF 및 헤파린 설페이트의 한 가지 또는 그 이상을 포함하는 부착제 혼합물이 있다. 상기 골격은 어떤 바람직한 모양으로도 성형화될 수 있고, 배양된 인간 상피세포는 상기 표면에 도입되고, 밀집할 때까지 증식되도록 할 것이다.

상피세포를 골격표면에 도입하기 전에, 피브로넥틴(PBS 1㎖당 0.1㎍ 내지 500㎍농도범위), RGDS(PBS 1㎖당 0.01㎍ 내지 100㎍), 콜라겐 Ⅳ(0.1M의 아세트산에 0.1㎍ 내지 1000㎍농도범위)를 포함하는 부착 단백질의 결정된 혼합물은 데스메막(Descemet's membrane)이라는 깨끗한 표면에 첨가될 것이고, 5 내지 60분 동안 배양된다. 잔여 단백질 혼합물은 배양 기간 후 제거될 것이고, 각막을 PBS로 세 차례 헹구고 난 다음 테프론 틀의 상피 쪽을 위로 해서 위치시킨다.

배양된 인간 상피세포는 0.05%의 트립신과 0.02%의 EDTA가 포함된 식염수로 조직배양 디쉬로부터 제거될 것이다. 상기 세포 현탁액은 쿠울터 입자계수(Coulter Particle Counter, Z1 model, Beckman-Coulter)로 계수할 수 있을 것이며, 1㎖당 약 50,000 내지 500,000개의 세포, 바람직하게는 배양배지(피브로넥틴, 라미닌 및 섬유아세포 성장인자와 같은 부착 단백질의 혼합물(1㎖당 10ng 내지 400ng)을 포함하는 5% 우태혈청(fetal calf serum) 또는 무혈청 배지를 포함한 DME-H16) 200㎕당 약 200,000개의 세포를 성형화된 생체골격위에 조심스럽게 가할 수 있을 것이다. 헤알론^®(Healon^®, Advanced Medical Optics, Santa Ana, CA)과 같은, 대략 0.1 내지 0.5㎖ 분량의 1% 히알우론산 나트륨(sodium hyaluronate)층이 보호제(protectant)로서 세포 부유물 위에 막을 형성하게 될 것이다. 상기 이식된 상피세포는 37℃, 10% CO₂ 배양기에서 10분에서 24시간까지 배양될 것이다. 선택적으로, 코팅된 상피세포는 20분동안 배양되고, 유륜은 25℃에서 PBS로 세 차례 헹궈지고 난 다음에 이식될 수 있을 것이다.

선택적으로, 배양물에서의 인간 상피세포의 유지, 유륜 상피세포의 확장 및 부착 단백질(attachment protein)의 제조는 고분자-겔 조성물로 만들어진 인공적인 유륜 틀 생체골격을 코팅하기 위해 사용될 수 있다.

간단히 요약하면, 폴리-겔 틀(poly-gel mold)은 유륜 모양으로 성형화될 수 있고, 세포 바깥(상피세포)에 피브로넥틴(PBS 1㎖당 0.1㎍ 내지 500㎍농도범위), RGDS(PBS 1㎖당 0.01㎍ 내지 100㎍), 콜라겐 Ⅳ(0.1M의 아세트산에 0.1㎍ 내지 1000㎍농도범위), FGF(PBS 1㎖당 10 내지 400ng), EGF(PBS 1㎖당 10 내지 400ng), TGFβ(PBS 1㎖당 1 내지 100ng)과 같은 성장 인자와 부착 단백질의 혼합물이 처리될 것이다. 10분에서 2시간 정도 4℃에서 배양한 후, 상기 인공틀을 PBS로 세 차례 헹구고, 배양배지(5% FCS 또는 피브로넥틴, 라미닌, RGDS 및 콜라겐 Ⅳ를 포함하는 부착 단백질의 혼합물을 포함한 DMA-H16) 200㎖당 약 50,000 내지 106개, 바람직하게는 약 150,000 내지 250,000개의 세포 밀도에 해당되는 배양된 인간 유륜 상피 세포가 유륜 틀에 첨가될 것이다. 10㎎/㎖ 히알우론산 0.1 내지 0.5㎖의 막은 보호제로서 세포층 위로 조심스럽게 적용되고, 상기 버튼(button)은 37℃, 10% CO₂ 배양기에서 10분 내지 24시간 정도 배양될 것이다. 상기 인공 유륜은 PBS로 세 차례 헹궈지게 된다.

본 발명에서 기술된 방법은 고분자 표면에 DLC를 코팅하거나 유사한 코팅을 하여 상피세포 기원으로부터 유도된 세포가 담체로서 유용하도록 해 줄 것이다. 상기 골격은 생분해가능한 부분일 수 있다. 상기 골격은 박판의 형태뿐만 아니라, 미세입자 형태 또는 반고형 블록(semi-solid block)으로서도 가능하다. 상기 골격은 플라즈마건에 의해 코팅되며, 탄소 플라즈마의 얇은 층은 만들어진 배양 표면상에 200 내지 400Å의 두께로 장착된다.

다이아몬드-유사 탄소(DLC) 코팅과 유사하게, 비정형 탄소 질화물(C-N) 필름은 극도로 단단하고 마모 저항적일 수 있다. 그것들은 전체 힙(hip) 이식의 느슨해지는 것에 있어 방부제의 문제점에 대한 해결의 실마리로 사용될지도 모른다. Du et al.,에 의해 조직 배양에서 실리콘, DLC 코팅된 실리콘 및 비정형 C-N 필름이 장착된 실리콘에서의 골아세포(osteoblast)의 형태학적인 행동(morphological behavior)이 주사형 전자현미경(scanning electron microscopy)에 의해 연구되어졌음이 보고되었다. 실리콘판 상의 세포들은 부착할 수는 있으나, 부착을 따라 퍼져 나갈 수는 없었다. 반면에, 상기 DLC 코팅되거나 C-N 필름이 코팅된 실리콘 상에서는 세포의 생리 기능의 뚜렷한 손상 없이 부착, 전파 및 증식하였다. 상기 코팅이나 필름 위에서의 세포의 형태상의 발생은 대조군(control)에서의 세포의 형태와 유사하였다. 그 결과는 DLC 코팅의 생체적합성을 지지하고, 본 발명에서의 비정형 C-N 필름의 생물의학적 적용의 가능성을 도모하고 있다(참조: C. Du et al., Biomaterials. 1998 Apr-May; 19(7-9): 651-8).

상기 DLC 코팅공정은 다음과 같다:

플라즈마 장치는 로렌스 버클리 국립연구소(Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA)에서 제작된 진공 아크 플라즈마 건(vacuum arc plasma gun)으로 구성되는데, 이 장치와 관련된 고전압과 열적 부하를 최소화하도록 반복 펄스 모드로 조작된다. 탄소양극이 구비된 플라즈마 건은 약 20eV의 방향성 흐름 에너지를 갖는 순수 탄소 플라즈마의 응집체를 형성한다. 상기 플라즈마는 양극으로부터 모든 입자물질을 제거하기 위하여, 90°자기 필터(굽은 솔레노이드)에 주입되어, 방사상의 플라즈마 형태를 평평하게 하는 거대 영구자석 다공성 구조체를 통하여 운반되며; 이러한 방법으로 상기 탄소 플라즈마 증착이 넓은 증착영역에서 공간적으로 균일하게 된다.

필름의 균일성을 추가적으로 향상시키지는 않지만, DLC 코팅된 기판은 저속으로 회전하는 디스크 상에 위치하여, 방위각의(azimuthal) 불균등성(inhomogeneity)을 해소한다. 상술한 장치는 약 2 내지 4,000Å의 두께, 바람직하게는 약 200 내지 400Å 두께의 DLC 필름을 형성하는데 사용된다.

세포성장 또는 부착을 도모하는 생체고분자의 능력을 향상시키기 위하여, 다음의 하나 또는 그 이상을 포함하는 부착 혼합물이 생체고분자의 합성 중에 그의 구조물 내부로 함입 또는 투입될 것이다: 고분자 겔 1㎖당 1㎍ 내지 500㎍ 농도범위의 피브로넥틴, 고분자 겔 1㎖당 1㎍ 내지 500㎍ 농도범위의 라미닌, 고분자 겔 1㎖당 0.1 내지 100㎍ 농도범위의 RGDS, 고분자 겔 1㎖당 1ng 내지 500ng 농도범위의 폴리카보필과 결합된 bFGF, 고분자 겔 1㎖당 1ng 내지 1,000ng 농도범위의 NGF 및 고분자 겔 1㎖당 1㎍ 내지 500㎍ 농도범위의 헤파린 설페이트.

바람직한 실시태양에서, 박막 또는 미세입자 형태의 코팅된 생체고분자는 신경세포성장을 위한 담체 및 세포이식 과정중의 세포분배를 위한 운반체로서 사용된다. 반고체 고분자 블록 형태는 신경 자극 검출기로서 기능을 수행하는 통합된 회로칩 또는 CCD칩과 결합된 신경세포 유지장치로서 사용될 수 있다. 코팅된 표면은 배양된 송아지 각막 내피세포에 의하여 증착된 세포외 기질로 코팅되고, 그런 다음, 순차적으로 DLC 코팅으로 덮는 방법에 의하여 추가로 개량될 수 있다.

실시예 1: 시트 형태의 생체고분자 골격의 DLC 코팅

바람직하게는 약 2 cm x 2 cm의 어떠한 형태로도 될 수 있는 본 발명의 생체고분자 시트는, 회전 디스크에 고정되고 저속으로 회전하는 모터의 상단부에 구비된 DLC 코팅챔버에 위치하게 된다. 플라즈마 장치는 약 20eV의 방향성을 갖는 흐름 에너지를 갖는 사출건을 통하여 밀집된 순수 탄소 플라즈마 응집체를 발생시킬 것이다. 상기 플라즈마는 90°자기필터로 주입되어, 고품질의 수소가 없는 다이아몬드-유사 탄소를 형성하는 모든 입자물질을 제거한다. 방사상의 플라즈마 형태를 평평하게 하는 거대 영구자석 다공성 구조체를 통하여 운반될 때, 탄소 플라즈마 증착물은 넓은 증착영역에서 공간적으로 균질화 될 것이다. 탄소 플라즈마 응집체가 고분자 시트를 고정하는 저속회전 디스크에 접근함에 따라, DLC의 균일한 필름은 상기 시트의 표면을 코팅하게 될 것이다. 상기 시트는 상피세포와 같은 많은 종류의 세포를 성장시키는데 사용될 수 있고, 자외선 조사 또는 70% 알코올 세척을 이용한 멸균과정 이후에 세포 이식을 위한 운반체로서 사용될 수 있다.

실시예 2: 미세입자 형태의 생체고분자 골격의 DLC 코팅

생체고분자 미세입자는 회전하는 챔버의 내부에 위치하게 될 것이고, 탄소 플라즈마의 융기는 실시예 1에서 기술한 바와 같이 발생된다. 플라즈마 건은 세로 축에서 저속으로 회전하는 동안 상기 챔버내부로 DLC 스프레이를 도입할 것이다. 미세담체(microcarrier) 비드는 코팅챔버내에서 공기의 흐름에 의하여 유지되고, 상기 플라즈마 건이 모든 면에 균일하게 코팅되도록 가동되는 동안, 상기 비드는 수회에 걸친 바뀐 공기흐름에서 상승하고 하강하게 된다. 이러한 공정은 모든 입자 표면의 균일하고도 완전하게 도포되도록 2-3시간에 걸쳐서 수행될 것이다. DLC 박막은 전체적인 구상표면에 약 200 내지 400Å의 균일한 두께로 증착된다. 그런 다음, 전기 생산물은 자외선 조사 또는 알코올 세척에 의하여 멸균되고, 포장 및 밀봉된 다음, 사용할 때까지 보관된다.

실시예 3: 합성도중 그의 조성에 함입 또는 투입되는 부착 및 성장 촉진인자를 가지며, 이후 DLC로 코팅되는 생체고분자 골격

본 발명의 골격은 합성도중 그의 조성에 다음의 하나 또는 그 이상을 포하하는 부착 또는 성장촉진인자가 함입되거나 또는 투입될 수 있다: 고분자 겔의 1 내지 500㎍/㎖ 농도범위의 피브로넥틴, 고분자 겔의 1 내지 500㎍/㎖ 농도범위의 라 미닌, 고분자 겔의 0.1 내지 100㎍/㎖ 농도범위의 RGDS, 고분자 겔의 1 내지 500ng/㎖ 농도범위의 폴리카보필과 결합된 bFGF, 고분자 겔의 10 내지 1,000ng/㎖ 농도범위의 폴리카보필과 결합된 EGF, 고분자 겔의 1 내지 1,000ng/㎖ 농도범위의 NGF 및 고분자 겔의 1 내지 500㎍/㎖ 농도범위의 헤파린 설페이트. 그런 다음, 상기 골격은 박막 시트 또는 반고체 블럭형태로 만들고, 실시예 1에 기술한 바와 같이 DLC 증착을 수행한다. 또는, 상기 고분자는 미세입자 또는 구형 형태로 만들 수 있고, 실시예 2에 기술한 바와 같이 DLC 증착을 수행할 수 있다.

실시예 4: 배양된 송아지 각막 내피세포에 의하여 증착된 세포외 기질을 이용한 골격의 코팅 및 DLC를 이용한 시트 또는 미세입자의 후속 코팅

고분자 또는 생체고분자 시트 및 미세입자 블럭을 배양표면 상에 DLC로 증착하기 전에 세포외 기질로 먼저 코팅할 수 있다. 이를 수행하기 위하여, 송아지 각막 내피(bovine corneal endothelial, BCE) 세포는 전기 시트 또는 블럭의 표면상에 낮은 밀도(약 2,000 내지 150,000 세포/㎖, 바람직하게는 20,000세포/㎖)로 접종하거나 또는 미세입자의 표면에 부착시킨다. 상기 BCE 세포를 10% 송아지 혈청, 5% 우태아혈청, 2% 덱스트란(40,000MV) 및 50ng/㎖ bFGF가 첨가된 DME-H16을 포함하는 배양배지에서 유지한다. 상기 세포를 7일동안 37℃, 10% CO₂에서 배양하고, 그동안 50ng/㎖ 농도의 bFGF를 매일 첨가한다. 상기 BCE 세포를 5분 동안 20mM 암 모늄 히드록시드로 고분자 시트, 블럭 또는 미세결정을 처리하여 제거한다. 그런 다음, 세포외 기질로 코팅된 상기 생체고분자를 충분한 부피의 PBS로 세척한다. 건조한 다음, 상기 ECM 코팅 고분자 시트 또는 블럭은 실시예 1에서 기술한 바와 같이 DLC 증착을 수행하는 반면, 상기 ECM 코팅 미세입자는 실시예 2에서 기술한 바와 같이 DLC 증착을 수행한다. ECM과 DLC로 순차적으로 코팅한 다음, 고분자 시트, 블럭 또는 미세입자를 자외선 조사 또는 알코올 세척에 의하여 멸균하고, 신경세포 성장 또는 세포 이식용 운반체로서 사용한다.

실시예 5: 조직배양 실험용기의 배양 표면에서의 DLC 증착

디쉬, 필터 삽입체, 챔버 슬라이드, 시트 및 블럭과 같은 단일층(flat) 배양 표면의 경우에는, 배양 표면을 가지는 용기를 플라즈마 건에 진공 챔버의 위쪽으로 노출시키고, 상술한 방법으로 코팅공정을 수행한다. 미세담체 비드의 경우에는, 모든 면에 고르게 코팅되도록, 챔버내부로 흘러가도록 유도한다. 플라스크 및 튜브와 같이 둥근 표면의 경우에는 특별히 개조된 플라즈마 건이 관의 내부로 삽입되어 목적하는 표면을 코팅한다. DLC의 박막을 약 20 내지 4,000Å, 바람직하게는 200 내지 400Å의 균일한 두께로 배양 표면에 증착시킨다. 그런 다음, 상기 생산물을 자외선 조사 또는 알코올 세척으로 멸균하고, 포장, 밀봉 및 사용할 때까지 보관한다.

실시예 6: 배양된 송아지 각막 내피세포로부터 분비된 ECM을 이용한 배양 표면의 순차적 코팅 및 DLC 증착

본 실시예에서, 송아지 각막 내피세포의 희박배양물(sparse culture)(약 1,000 내지 50,000세포/㎖, 바람직하게는 2,000 내지 5,000세포/㎖)을 디쉬, 플라스크, 튜브, 필터삽입체, 챔버 슬라이드, 미세담체 비드, 로울러 바틀(roller bottle), 수집기(harvester), 시트 및 블럭을 포함하는 목적하는 실험용기의 배양표면상에 접종하였다. 상기 세포는 10% 송아지 혈청, 5% 우태아혈청, 2% 덱스트란(40,000MV) 및 50ng/㎖ bFGF가 첨가된 DME-H16을 포함하는 배양배지에서 유지한다. 상기 송아지 각막 내피세포를 bFGF를 이틀에 한번씩 50ng/㎖ 농도로 첨가하면서, 밀집(confluence)할 때까지 7 내지 10일동안 성장시킨다. 그런 다음, 배양 배지를 제거하고, 상기 세포를 충분한 양의 증류수에 용해된 20mM 암모늄 히드록시드로 3 내지 30분 동안 처리한다. 이어, 상기 표면을 충분한 양의 PBS로 10회 세척하여 잔여 암모늄 히드록시드를 제거하고, 멸균된 층 기류(laminar flow) 후드에서 건조한다. 그런 다음, 세포외 기질의 상단 부위에 DLC 코팅을 전술한 바와 같이 수행할 수 있다. 이어, 상기 실험용기를 자외선 조사 또는 알코올 세척으로 멸균하고, 포장 및 밀봉하며, 사용할 때까지 보관한다.

실시예 7: DLC 증착에 의해 연속되는 부착 또는 성장 촉진제에 의한 배양표면의 순차적 코팅

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 부착 또는 성장 촉진제의 하나 또는 그 이상은 1 내지 500㎍/㎖ 농도범위의 피브로넥틴, 1 내지 500㎍/㎖ 농도범위의 라미닌, 0.1 내지 100㎍/㎖ 농도범위의 RGDS, 1 내지 400ng/㎖ 농도범위의 폴리카보필과 결합된 bFGF, 10 내지 1,000ng/㎖ㅍ 농도범위의 폴리카보필과 결합된 EGF를 포함한다. 상기 부착 또는 성장 촉진제를 배양 표면에 가하고, 그런 다음, 20분 내지 2시간 동안 4℃에서 배양한다. 이어, 상기 표면을 PBS로 3회 세척하고, 멸균된 층 기류 후드에서 건조시킨다. 그런 다음, 생산물을 배양 표면위의 부착 또는 성장 촉진제의 위에 DLC 층으로 증착시킨다. 이어, 상기 실험용기를 자외선 조사 또는 알코올 세척으로 멸균하고, 포장 및 밀봉하며, 사용할 때까지 보관한다.

실시예 8: 코팅된 미세담체에 RPE 및 다른 신경세포의 부착 및 배양

망막색소 상피세포(retinal pigmented epithelial cell, RPE)를 송아지 각막 내피세포로부터 유도된 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)로 이미 코팅된 60mm 조직배양용 디쉬에서 성장시켰다. 상기 RPE 세포를 15% 우태아혈청(fetal calf serum, FCS) 및 100ng/ml 농도의 bFGF를 포함하는 배양용 배지를 이틀에 한번씩 공급하며 배양하였다. 밀집되었을 때, 상기 배지를 5ml의 신선한 배지로 교환하였다. 그런 다음, DLC 또는 다른 조합으로 이미 코팅된 5 내지 10 X 10⁶개의 미 세담체 비드를 전기 디쉬에 추가하였다. 상기 디쉬는 8자 모양(figure 8-motion)으로 8 내지 10회 소용돌이치게 하여, 대부분의 비드가 잘 분산되도록 하게 하고, 그런 다음, 10% CO₂의 조건하에서 37℃에서 배양하며, 상기 미세담체를 RPE 세포와 직접적으로 접촉하고 있는 저면으로 침전시킨다. 100ng/ml 농도의 bFGF 용액을 배양물에 이틀에 한번씩 가하고, 가능한한 적은 량의 미세담체만이 분산되도록 매우 조심스럽게 상단부로부터 주의하여 배양액 2.5ml을 빨아낸다. 상기 디쉬의 RPE 세포층은 점차적으로 미세담체 비드에 부착되고, 상기 비드가 배양용 디쉬에 투입된지 7 내지 10일이 경과하면 상기 미세담체 비드의 모든 표면영역을 한 층으로 피복할 때까지 미세담체 비드 주변에서 성장하기 시작한다. 그런 다음, 상기 미세담체들을 세포층으로부터 부드럽게 이탈시키고, 3일 동안 로울러 바틀에서 추가로 배양한 후, 세포이식을 위한, 뇌간(brain-stem)으로 주입되도록 준비된다.

실시예 9: 유두(nipple) 복원을 위한 생합성 고분자 또는 하이드로겔 골격에서의 신경재생(nerve regeneration)

0.5 내지 5% 젤라틴을 포함하는 N-폴리이소프로필아크릴아미드(N-polyisopropylacylamide, NIPAAM)/젤라틴 상호침투(interpenetrating) 네크워크를 다음의 공정에 따라 합성하였다. 농축된 NIPAAM 용액은 3.98g NIPAAM, 0.068g N.N'-메틸렌비스(아크릴아미드)(N,N'-methylenebis(acrylamide)) 및 0.122ml N,N,N',N'-테트라메틸렌 디아민(N,N,N',N'-tetramethylene diamine)을 충분한 량의 2차 증류수에 용해시켜서 총 25ml을 제조하였다. 2차 증류수에 용해된 5.16%(w/w) 젤라틴 수용액은 2차 증류수에 충분한 량의 젤라틴을 용해시켜서 제조하였다. 포타슘 퍼설페이트(KPS) 용액은 5ml의 2차 증류수에 0.12g의 포타슘 퍼설페이트를 용해시켜서 제조하였다. 상기 용액들을 사용할 때까지 4 내지 6℃에서 보관하였다.

NIPAAM의 중합: 상기 젤라틴 용액을 젤라틴이 완전히 녹을 때까지 교반하면서, 55℃로 가열하였다. 상기 젤라틴 용액을 30 내지 35℃로 냉각시킨 후, 젤라틴 용액 1.53ml을 1.47ml의 2차 증류수와 혼합하고, 그런 다음 3.0ml의 NIPAAM 용액을 가하였다. 상기 혼합물을 몇분동안 교반하고, 그런 다음 0.12ml의 KPA를 상기 혼합물에 가하였다. 그런 다음, 즉시 상기 혼합물을 사람의 유두형태를 갖는 틀(mold)에 주입하였다. 상기 틀은 봉입된 용기(sealed vessel)에 위치시켰다. 최소한 3회에 걸친 질소를 이용한 반복적인 탈기(degassing)에 의하여 상기 혼합물로부터 산소를 제거하였다. 상기 혼합물을 실온에서 최소한 2시간 동안 중합시켰다.

젤라틴의 가교(cross-linking): 완전한 중합된 후, 상기 겔을 상기 틀로부터 제거하고, PNIPAAM 겔의 내부에 젤라틴 체인을 형성하게 하는 0.5% 글루타르 디알데히드(glutaric dialdehyde)의 수용액에 침지하여 가교를 형성하였으며, 이에 의하여 상호침투 네트워크를 형성하였다. 최종 산물인 겔 유두 골격을 며칠동안 2차 증류수로(매일 물을 교체하면서) 세척하여, 잔류하는 작은 분자 및 반응하지 않은 NIPAAM 단량체를 제거하였다. 세척된 겔 유두 골격을 4 내지 6℃에서 보관하였다.

이식 및 임상적 평가. 표준 유방 복원시술에 따라, 상기 생체합성 PNIPAAM/젤라틴 유두 골격을 복원된 유방에 봉합시키고, 시술후 7일동안은 매일 진찰하였으며, 그 후에는 매주 진찰하였다. 유두 접촉 감각정도(touch sensitivity)를 유두의 5개소에서 코체-보넷 에스테시오메터(Cochet-Bonnet esthesiometer)(Handaya, Tokyo)에 의하여 측정하였다. 요약하면, 미세한 필라멘트를 상기 장치에서 유두에 접촉할 때까지 연장시키고, 환자의 감각반응을 기록하였다. 처음에는, 긴 필라멘트 연장선을 사용하여 매우 부드러운 접촉을 수행하고, 그런 다음, 상기 환자가 선명한 반응을 나타낼 때까지 짧고 강도가 강한(더욱 강하고, 더욱 견고한) 것을 사용하여 수행하였다. 상기 연장선을 접촉-감각정도의 역치로서 기록하였다.

실시예 10: 복원된 유륜(areola)내로의 신경재생(neuronal regeneration)

신경영양성 인자(neurotrophic factor)가 말초신경의 재생을 촉진함을 보여준다. 생합성 골격 유두에 적용할 수 있는 상기 수용성 인자는 이에 제한되지 않으나, 산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor, aFGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 신경교 성장인자(glial growth factor, GGF), 뇌로부터 유도된 신경영양성 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 모양체 신 경영양성 인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF), 혈소판으로부터 유도된 신경영양성 인자(platelet-derived neurotrophic factor, PDGF) 및 인슐린-유사 성장인자 1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)을 포함한다.

PNIPAAM/젤라틴 겔 유두 골격을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 그런 다음, 작은 분자 및 반응하지 않은 NIPAAM 단량체가 소모되었을 때, 상술한 성장인자를 상기 겔에 추가하였다. 그런 다음, 상기 성장인자가 농축된 겔 유두를 이식에 요구될 때까지 4 내지 6℃에 보관하였다.

실시예 11: 변형된 생체고분자 골격의 구현

실시예 1에 기술된 제조방법 이후에, 폴리(n-이소프로필아크릴아미드)는, 아크릴레이트(acrylate), 아크릴산(acrylic acid), 메타크릴레이트(methacrylate), 메타크릴산(methacrylic acid), 아크릴아미드(acrylamide), 메타크릴아미드(methacrylamide), 비닐아세테이트(vinyl acetate), 스티렌(styrene) 및 이들의 유도체로부터 선택되는 단량체의 공중합에 의하여, 변형될 수 있다. 이는 다양한 생분해성 고분자 및 생물학적 기원의 고분자를 본 발명의 아크릴아미드 고분자를 대신하여 치환할 수 있다는 것으로 이해되어야 할 것이다.

실시예 12: 젤라틴 기반 골격

변형된 실시예에 따라, 실시예 10에 개시된 제조방법 이후에, 젤라틴을 콜라겐 또는 젤라틴과 콜라겐의 조합에 의하여 치환하였다. 그 이후의 제조방법은 실시예 10에 개시된 바와 동일하다.

본 발명을 상세한 설명에 있어서, 이들의 다양한 변형은 첨부된 특허청구범위의 범위에 의하여 정의되는 본 발명의 기술적 사상으로부터 벗어남이 없이 관련됨은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. 상기 인용된 미국특허, 특허출원 및 모든 다른 참고문헌 전체는 본 명세서에서 인용문헌으로 삽입되었다.

Claims

(ⅰ) 고분자/생체고분자 또는 이들의 조합을 포함하는 골격(scaffold)을 포함하고;

(ⅱ) 전기 골격의 합성도중 부착제 또는 성장촉진제가 전기 골격의 내부로 함입 또는 투입되며; 및,

(ⅲ) 전기 골격은 시술받는 포유동물의 피부상피 형태 또는 영역의 형상으로 성형되는 것을 특징으로 하는, 포유동물 연조직 형태 또는 영역의 미용적 복원(cosmetic reconstruction)을 위한 생체적합성 물질.
(ⅰ) 고분자/생체고분자 또는 이들의 조합을 포함하는 골격(scaffold)을 포함하고;

(ⅱ) 전기 골격의 합성도중, 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), RGDS, 폴리카보필과 결합된 bFGF, 폴리카보필과 결합된 EGF 및 헤파린 설페이트 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 부착제 또는 성장촉진제가 전기 골격의 내부로 함입 또는 투입되며; 및,

(ⅲ) 전기 골격은 시술받는 포유동물의 피부상피 형태 또는 영역의 형상으로 성형되는 것을 특징으로 하는, 포유동물 연조직 형태 또는 영역의 미용적 복원(cosmetic reconstruction)을 위한 생체적합성 물질.
제 1항에 있어서,

전기 복원되는 연조직 형태는 인간의 귀, 유륜(areola), 코, 입술, 성기(genitalia), 손가락끝(fingertip) 및 조상(nail bed)과 같은 모든 연조직 형태가 될 수 있는 것을 특징으로 하는

생체적합성 물질.
제 1항에 있어서,

전기 골격은 (ⅰ) 이에 제한되지 않으나, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 피브린 및 알긴산을 포함하는 천연고분자; (ⅱ) 이에 제한되지 않으나, 폴리아크릴산과 그의 유도체, 폴리에틸렌옥시드와 그의 공중합체, 폴리비닐알코올, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리펩티드, PNIPAAM/젤라틴, NIPAAM을 포함하는 합성고분자; 및, (ⅲ) (ⅰ)의 천연고분자 및 (ⅱ)의 합성고분자의 혼합물을 포함하는 추가적인 조성물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

생체적합성 물질.
(ⅰ) 환자의 연조직 영역의 3차원적 틀(mold)을 작제하는 단계;

(ⅱ) 합성도중 부착제 및/또는 성장촉진제가 그의 내부로 함입 또는 투입된 골격을 포함하는 생체적합성 물질을 수득하는 단계;

(ⅲ) 전기 생체적합성 물질을 복원하려는 환자의 연조직 영역의 해부학적 복제물(anatomic replica)인 연조직 영역의 형태로 성형하도록, 전기 환자의 연조직 영역의 3차원적 틀(mold)에 위치시키는 단계;

(ⅳ) (ⅲ) 단계의 생체적합성 물질을 이후의 복원수술 중에 환자의 적절한 조직에 이식하고, 제거가능한 봉합실(suture)로 고정시키는 단계;

(ⅴ) 그의 표면에 상피세포를 성장시켜 피부를 피복하도록 하고, 전기 생체적합성 물질에 의하여 제공된 전기 골격과 균일하게 융합시키는 단계; 및,

(ⅵ) 전기 생체적합성 물질에 신경 및 신경섬유를 성장시켜서, 감각기능을 갖는 전기 연조직 영역을 제공하는 단계를 포함하는, 포유동물 연조직 영역의 미용적 복원방법.
(ⅰ) 환자의 연조직 영역의 3차원적 틀(mold)을 작제하는 단계;

(ⅱ) 합성도중, 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), RGDS, 폴리카보필과 결합된 bFGF, 폴리카보필과 결합된 EGF 및 헤파린 설페이트 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 부착제가 그의 내부로 함입 또는 투입된 골격을 포함하는 생체적합성 물질을 수득하는 단계;

(ⅲ) 전기 생체적합성 물질을 복원하려는 환자의 연조직 영역의 해부학적 복 제물(anatomic replica)인 연조직 영역의 형태로 성형하도록, 전기 환자의 연조직 영역의 3차원적 틀(mold)에 위치시키는 단계;

(ⅳ) (ⅲ) 단계의 생체적합성 물질을 이후의 복원수술 중에 환자의 적절한 조직에 이식하고, 제거가능한 봉합실(suture)로 고정시키는 단계;

(ⅴ) 그의 표면에 상피세포를 성장시켜 피부를 피복하도록 하고, 전기 생체적합성 물질에 의하여 제공된 전기 골격과 균일하게 융합시키는 단계; 및,

(ⅵ) 전기 생체적합성 물질에 신경 및 신경섬유를 성장시켜서, 감각기능을 갖는 전기 연조직 영역을 제공하는 단계를 포함하는, 포유동물 연조직 영역의 미용적 복원방법.
제 5항에 있어서,

전기 복원되는 연조직 형태는 인간의 귀, 유륜(areola), 코, 입술, 성기(genitalia), 손가락끝(fingertip) 및 조상(nail bed)과 같은 모든 연조직 형태가 될 수 있는 것을 특징으로 하는

포유동물 연조직 영역의 미용적 복원방법.
제 5항에 있어서,

전기 생체적합성 물질은 (ⅰ) 이에 제한되지 않으나, 콜라겐, 젤라틴, 히알 루론산, 피브린 및 알긴산을 포함하는 천연고분자; (ⅱ) 이에 제한되지 않으나, 폴리아크릴산과 그의 유도체, 폴리에틸렌옥시드와 그의 공중합체, 폴리비닐알코올, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리펩티드, PNIPAAM/젤라틴, NIPAAM을 포함하는 합성고분자; 및, (ⅲ) (ⅰ)의 천연고분자 및 (ⅱ)의 합성고분자의 혼합물을 포함하는 추가적인 조성물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 생체고분자를 포함하는 것을 특징으로 하는

포유동물 연조직 영역의 미용적 복원방법.
(ⅰ) 환자의 귀 영역의 3차원적 틀(mold)을 작제하는 단계;

(ⅱ) 합성도중, 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), RGDS, 폴리카보필과 결합된 bFGF, 폴리카보필과 결합된 EGF 및 헤파린 설페이트 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 부착제가 그의 내부로 함입 또는 투입된 생체고분자를 포함하는 생체적합성 물질을 수득하는 단계;

(ⅲ) 전기 생체적합성 물질을 복원하려는 환자의 귀의 해부학적 복제물(anatomic replica)인 귀의 형태로 성형하도록, 전기 환자의 귀의 3차원적 틀(mold)에 위치시키는 단계;

(ⅳ) (ⅲ) 단계의 생체적합성 물질을 이후의 복원수술 중에 환자의 두피 조직(scalp tissue)에 이식하고, 제거가능한 봉합실(suture)로 고정시키는 단계;

(ⅴ) 그의 표면에 상피세포를 성장시켜 피부를 피복하도록 하고, 전기 생체 적합성 물질에 의하여 제공된 전기 골격과 균일하게 융합시키는 단계; 및,

(ⅵ) 전기 생체적합성 물질에 신경 및 신경섬유를 성장시켜서, 감각기능을 갖는 전기 귀를 제공하는 단계를 포함하는, 포유동물 귀 영역의 미용적 복원방법.
제 9항에 있어서,

전기 생체적합성 물질은 (ⅰ) 이에 제한되지 않으나, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 피브린 및 알긴산을 포함하는 천연고분자; (ⅱ) 이에 제한되지 않으나, 폴리아크릴산과 그의 유도체, 폴리에틸렌옥시드와 그의 공중합체, 폴리비닐알코올, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리펩티드, PNIPAAM/젤라틴, NIPAAM을 포함하는 합성고분자; 및, (ⅲ) (ⅰ)의 천연고분자 및 (ⅱ)의 합성고분자의 혼합물을 포함하는 추가적인 조성물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 생체고분자를 포함하는 것을 특징으로 하는

포유동물의 귀 영역의 미용적 복원방법.
(ⅰ) 환자의 유륜 및 유두 영역의 3차원적 틀(mold)을 작제하는 단계;

(ⅱ) 합성도중, 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), RGDS, 폴리카보필과 결합된 bFGF, 폴리카보필과 결합된 EGF 및 헤파린 설페이트 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 부착제가 그의 내부로 함입 또는 투입된 생체고분자를 포함하 는 생체적합성 물질을 수득하는 단계;

(ⅲ) 전기 생체적합성 물질을 복원하려는 환자의 유륜 및 유두 영역의 해부학적 복제물(anatomic replica)인 유륜 및 유두의 형태로 성형하도록, 전기 환자의 유륜 및 유두의 3차원적 틀(mold)에 위치시키는 단계;

(ⅳ) (ⅲ) 단계의 생체적합성 물질을 이후의 복원수술 중에 환자의 유방 조직(breast tissue)에 이식하고, 제거가능한 봉합실(suture)로 고정시키는 단계;

(ⅴ) 그의 표면에 상피세포를 성장시켜 피부를 피복하도록 하고, 전기 생체적합성 물질에 의하여 제공된 전기 골격과 균일하게 융합시키는 단계; 및,

(ⅵ) 전기 생체적합성 물질에 신경 및 신경섬유를 성장시켜서, 감각기능을 갖는 전기 유륜 및 유두를 제공하는 단계를 포함하는, 포유동물 유륜 및 유두 영역의 미용적 복원방법.
제 11항에 있어서,

전기 생체적합성 물질은 (ⅰ) 이에 제한되지 않으나, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 피브린 및 알긴산을 포함하는 천연고분자; (ⅱ) 이에 제한되지 않으나, 폴리아크릴산과 그의 유도체, 폴리에틸렌옥시드와 그의 공중합체, 폴리비닐알코올, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리펩티드, PNIPAAM/젤라틴, NIPAAM을 포함하는 합성고분자; 및, (ⅲ) (ⅰ)의 천연고분자 및 (ⅱ)의 합성고분자의 혼합물을 포함하는 추가적인 조성물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 골격을 포함하는 것을 특징 으로 하는

포유동물의 귀 영역의 미용적 복원방법.