CN116570758A - 可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,该抗菌水凝胶是由改性重组III型人源化胶原蛋白和接枝二氢咖啡酸的壳聚糖组成的水凝胶,改性重组III型人源化胶原蛋白水凝胶具有三维网络结构,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖均匀分布在改性重组III型人源化胶原蛋白水凝胶的三维网络结构结构中;所述改性重组III型人源化胶原蛋白由具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白经光引发交联形成。本发明还提供了该抗菌水凝胶的制备方法及其在创面修复中的应用。本发明可在满足抗菌性能的基础之上改善材料的促进伤口愈合的能力,同时提高了材料对不规则伤口的适用性。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,涉及可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
皮肤作为人体最大的组织,是维持内部环境稳定、防止微生物入侵的屏障。具有体温调节、体液平衡以及免疫监测等重要功能。但由于各种外伤、疾病、自我老化等原因,全层皮肤缺损难以快速愈合。因此,开发具有促进皮肤愈合作用,并能抑制细菌感染的材料,对于临床治疗具有至关重要的意义。
Ⅲ型胶原蛋白是人体皮肤中主要的胶原蛋白,存在于表皮层和真皮层之间。重组人源化III型胶原蛋白是将人类基因植入酵母菌发酵得到的,与人体内III型胶原蛋白具有相同的修复、补水功能,同时拥有来源稳定产量大的优势,是一种理想的皮肤修复材料。但是,重组人源化III型胶原蛋白由于力学性能差、体内外降解快、抗菌性能不足等原因,使其应用领域受限。壳聚糖是一种天然生物高分子,主要来源于甲壳素的脱乙酰反应。壳聚糖具有优异的细胞相容性、生物降解性、无毒性支持、伤口愈合和抑菌作用。因此,将壳聚糖引入重组人源化III型胶原蛋白体系中,可改善重组人源化III型胶原蛋白的抗菌性能和降解性能。
现有技术将重组人源化III型胶原蛋白与羧化壳聚糖共混后,用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)进行化学交联,使得重组人源化III型胶原蛋白的氨基与羧基化壳聚糖的羧基反应形成酰胺键而转变成凝胶,冷冻干燥后得到多孔支架材料。一方面,该多孔支架材料呈固态,用于皮肤修复时,难以与伤口部位完美贴合,特别是应用于复杂形状的伤口时,难以全方位地覆盖和贴合复杂形状伤口,因而其用于复杂形状伤口修复时具有一定的局限性;另一方面,该多孔支架材料促进细胞增殖与铺展的能力以及促进伤口愈合的性能还有待提高。因此,如何基于重组人源化III型胶原蛋白在皮肤修复和壳聚糖在抗菌性能方面的优势,在满足生物降解和和抑菌功能的基础上,提供具有更好的促进伤口愈合能力、无生物毒性,更适用于不规则伤口修复的伤口敷料,在皮肤修复材料领域仍然是一项挑战,也是本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶及其制备方法与应用,以在满足抗菌性能的基础之上改善材料的促进伤口愈合的能力,并提高材料对不规则伤口的适用性。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,该抗菌水凝胶是由改性重组III型人源化胶原蛋白和接枝二氢咖啡酸的壳聚糖组成的水凝胶,改性重组III型人源化胶原蛋白水凝胶具有三维网络结构,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖均匀分布在改性重组III型人源化胶原蛋白水凝胶的三维网络结构结构中;该抗菌水凝胶中,改性重组III型人源化胶原蛋白与接枝二氢咖啡酸的壳聚糖的质量比为(8~11):1;所述改性重组III型人源化胶原蛋白由具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白经光引发交联形成。
上述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的技术方案中,该抗菌水凝胶由含具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白、接枝二氢咖啡酸的壳聚糖和光引发剂的凝胶前驱液经光引发交联形成。
上述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的技术方案中,所述具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白优选为甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白。甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白是由甲基丙烯酸酐与重组人源化III型胶原蛋白的氨基通过酰化反应形成的,反应后甲基丙烯酸酐占据了重组人源化III型胶原蛋白上大部分的氨基官能团位点。
一种可行的甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白的制备方法如下:
(1)将重组人源化III型胶原蛋白(rhCol III)溶解于Na2CO3-NaHCO3缓冲液中,得到rhCol III溶液。将甲基丙烯酸酐加入rhCol III溶液中,在35~45℃搅拌反应2~4h。
(2)将步骤(1)所得反应液转入透析袋中,用超纯水透析,冷冻干燥,得到甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白。
制备过程中,通过调整甲基丙烯酸酐与重组人源化III型胶原蛋白的比例关系,可以调整甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白中甲基丙烯酸酐的接枝率。
进一步地,上述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的技术方案中,具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白中甲基丙烯酸酐的接枝率为65%~100%。
上述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的技术方案中,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖由二氢咖啡酸的羧基与壳聚糖的氨基经酰胺化反应形成,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖中,二氢咖啡酸的接枝率优选为10%~30%。二氢咖啡酸是咖啡酸的代谢物,具有强大的抗氧化特性,利用二氢咖啡酸接枝改性壳聚糖,能够增强壳聚糖的抗氧化和抗菌性能。
上述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的技术方案中,一种可行的制备接枝二氢咖啡酸的壳聚糖的方法如下:
(1)将壳聚糖用盐酸水溶液溶解形成壳聚糖溶液;将二氢咖啡酸(HCA)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶解于乙醇-水溶液中,得到HCA-EDC混合液;
(2)调节壳聚糖溶液的pH值至5.4~5.6,在搅拌条件下将HCA-EDC混合液滴加至壳聚糖溶液中,调节所得混合液的pH值至5.4~5.6,在室温搅拌10~15h;
(3)将步骤(2)所得反应液置于透析袋中,用pH值为3.9~4.1的去离子水透析,冷冻干燥,得到接枝二氢咖啡酸的壳聚糖。
制备过程中,壳聚糖溶液与HCA-EDC混合液的浓度以及比例关系,根据对拟制备的接枝二氢咖啡酸的壳聚糖中的二氢咖啡酸的接枝率进行确定。
本发明还提供了上述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
将具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白、接枝二氢咖啡酸的壳聚糖和光引发剂溶于水中,去除所得溶液中的气泡,得到凝胶前驱液,在蓝光照射条件下引发具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白发生交联反应,即得可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶。
上述制备方法的技术方案所述的凝胶前驱液中,具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白与接枝二氢咖啡酸的壳聚糖的质量比为(8~11):1。
上述制备方法的技术方案所述的凝胶前驱液中,具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白与接枝二氢咖啡酸的壳聚糖的总浓度为80~120mg/mL。
上述制备方法的技术方案中,所述具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白优选为甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白。
上述制备方法的技术方案所述凝胶前驱液中,光引发剂的含量为0.5wt%~2wt%。进一步地,可行的光引发剂为能用蓝光引发交联反应的光引发剂,例如可以是苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)。
本发明提供的可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶具有优异的促进皮肤愈合能力、抗菌抗氧化能力以及生物相容性,在体内可降解。本发明对该抗菌水凝胶进行了理化性质表征,体外细胞增殖与迁移实验,抗菌实验,以及动物皮肤修复实验,结果表明:
(1)理化实验表明:本发明提供的抗菌水凝胶具有良好的力学性能,储能模量可以达12KPa;具有良好的吸水能力,能在3min内完成快速吸水,达到最大溶胀的85%以上,且具有较好的平衡溶胀性能,有利于对血液、渗出液等的快速吸收,有利于在伤口部位维持稳定的形态;还具有优异的降解性能,在PBS缓冲液环境下6天可降解约70%,能充分适应不规则伤口在变形、恢复过程中的变化。
(2)体外细胞增殖与迁移实验表明:本发明提供的抗菌水凝胶具有优异的生物相容性,与共培养的第1天相比,共培养的第3天可达35%的细胞迁移程度与3倍的细胞增殖程度。
(3)抗菌实验表明:本发明提供的抗菌水凝胶具有优异的抗菌性能,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均有良好的抑制作用。
(4)动物皮肤修复实验表明:本发明提供的抗菌水凝胶具有优异的促进皮肤愈合能力,对小鼠全层皮肤缺损进行修复时,在修复的第12天时可达到92%的愈合度,高于空白对照组70%的愈合度及现有技术82%左右的愈合度。
基于以上实验结果,本发明提供的可注射抗菌水凝胶可在制备创面修复材料、抗菌材料、负载细胞、药物或其他生物活性物质的医用材料中应用。
本发明还提供了上述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶在创面修复中的应用,应用时将由含具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白、接枝二氢咖啡酸的壳聚糖和光引发剂的凝胶前驱液注射至待修复的创面处,施加蓝光照射引发交联反应将凝胶前驱液转变成凝胶状态将待修复部位完全覆盖,以对待修复的创面进行修复。
与现有技术相比,本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果:
1.本发明提供了一种可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,是由改性重组人源化III型胶原蛋白和接枝二氢咖啡酸的壳聚糖组成的水凝胶,改性重组人源化III型胶原蛋白水凝胶具有三维网络结构,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖均匀分布在改性重组人源化III型胶原蛋白水凝胶的三维网络结构结构中。该可注射抗菌水凝胶由含具有光固化性能的重组人源化III型胶原蛋白、接枝二氢咖啡酸的壳聚糖和光引发剂的凝胶前驱液经光引发交联形成。本发明通过引入二氢咖啡酸接枝改性的壳聚糖,使得以重组人源化III型胶原蛋白为基础的皮肤修复材料拥有了优异的抗菌性能,改善了现有重组胶原基皮肤修复材料的抑菌性欠佳不利于创面修复等问题。同时,通过对重组人源化III型胶原蛋白进行改性赋予了其光固化特性,因而在应用时,可以先将凝胶前驱液体注射至待修复的创面部位,再施加适当的光照条件让其凝胶化,这样就拓宽了本发明所述抗菌水凝胶对不同形态的创面的适用性,特别是可以适用于复杂的不规则伤口的修复与保护。可以有效解决现有重组胶原-壳聚糖复合皮肤修复材料需要使用模具定型且呈固态而难适用于不规则伤口修复的问题。
2.本发明所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶中,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖分布在改性重组人源化III型胶原蛋白水凝胶的三维网络结构中。一方面,改性重组人源化III型胶原蛋白水凝胶的三维网络结构有利于细胞的黏附、增殖与扩散,另一方面,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖与改性重组人源化III型胶原蛋白之间主要是物理共混的,两者之间并未发生明显的化学键合,因而接枝二氢咖啡酸的壳聚糖更容易从水凝胶中释放出来,这有利于接枝二氢咖啡酸的壳聚糖更好地发挥作用,例如可以更好地促进与创面愈合相关细胞的生长、促进巨噬细胞产生有助于创面愈合的活性因子,促进皮肤创伤组织的微血管再生等,为皮肤细胞生长提供有利环境。这两方面的因素使得本发明提供的水凝胶具有优异的创面修复能力。
3.本发明通过体外细胞增殖与迁移实验表明:本发明提供的抗菌水凝胶具有优异的生物相容性,与共培养的第1天相比,共培养的第3天可达35%的细胞迁移程度与3倍的细胞增殖程度。通过抗菌实验表明:该抗菌水凝胶具有优异的抗菌性能,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均有良好的抑制作用。本发明还通过动物皮肤修复实验表明:本发明提供的抗菌水凝胶具有优异的促进皮肤愈合能力,对小鼠全层皮肤缺损进行修复时,在修复的第12天时可达到92%的愈合度。与现有技术对比,在相同的90%愈合度下,本发明的抗菌水凝胶在修复12天内可达到,现有相似技术在修复14天仍未达到,且本发明同期愈合率高出10%左右。与空白对照组对比,在相同的70%愈合度下,本发明的抗菌水凝胶在修复8天可达,空白对照组需要修复12天才能达到,且本发明同期愈合率高出10%~30%。
附图说明
图1是实施例1、2制备的改性rhCol III、改性CS以及采用的原料rhCol III、CS的傅里叶红外光谱图。
图2是实施例1制备的改性rhCol III与采用的原料rhCol III的核磁共振氢谱图。
图3是实施例1制备的改性CS与采用的原料CS的核磁共振氢谱图。
图4是实施例3制备的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhColIII-CS3、rhCol III-CS4经冷冻干燥后内部孔隙结构的扫描电镜测试结果。
图5是rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhColIII-CS4经冷冻干燥后的溶胀曲线。
图6是rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhColIII-CS4的储能模量曲线。
图7是rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhColIII-CS4的降解曲线。
图8是rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhColIII-CS4对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌性能测试结果。
图9的(a)图为细菌/水凝胶样品上的细菌分布情况,(b)图为每个水凝胶的细菌计数结果,其中两组柱状图的下方的A、B、C、D、E、F分别代表对照组、rhCol III-CS0、rhColIII-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4,(c)图为活死染色结果的SLSM测试结果,(d)图为SEM下的细菌形态。
图10是L929细胞在rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4中的细胞增殖情况图。
图11是L929细胞在rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4中培养不同时间后的激光共聚焦扫描电镜图。
图12是rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhColIII-CS4的细胞划痕实验测试结果,其中的(A)(B)两图分别为倒置显微镜观察结果和创面愈合率结计算果。
图13是rhCol III-CS0、rhCol III-CS2小鼠全层皮肤缺损实验中的修复效果,其中的(A)(B)(C)图分别为伤口大体观图、伤口愈合率以及伤口愈合过程中的形态和面积变化情况。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶及其制备方法作进一步说明。有必要指出,以下实施例只用于对本发明作进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施,仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中,制备甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白,步骤如下:
(1)将重组人源化III型胶原蛋白(rhCol III)加入缓冲液中,并在室温下搅拌至溶液澄清透明,得到rhCol III溶液。将甲基丙烯酸酐(MA)加入rhCol III溶液中,在搅拌条件下于在40℃反应3h。
该步骤中,所述缓冲液为Na2CO3-NaHCO3缓冲液,其中Na2CO3的浓度为8mg/mL、NaHCO3的浓度为14.7mg/mL;rhCol III溶液的浓度为130mg/mL,rhCol III溶液与MA的体积比为30:1。
(2)将步骤(1)所得反应液转入2000Da透析袋中,在超纯水下透析72h,透析过程中频繁更换超纯水,透析结束后将所得产物冷冻干燥,得到甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白,记作改性rhCol III。
本实施例制备的改性rhCol III以及采用的原料rhCol III的傅里叶红外光谱图如图1所示,由图1可知:相比于原料rhCol III,改性rhCol III在1022cm-1的出峰明显减弱,形成了较弱的双峰,由此可判断MA主要与胶原蛋白中赖氨酸的氨基发生反应;改性rhColIII在925cm-1处有新的出峰,判断其为RC=CH2结构的碳氢的面外弯曲(变形)振动峰;在1629cm-1、1540cm-1峰强度明显增强,这是由两种缔合了氢键的C=O基团的振动引起的。由此可见,MA与rhCol III中的赖氨酸残基的伯氨反应,C=C、C=O被成功地修饰在了rhColIII的分子链上。
本实施例制备的改性rhCol III与采用的原料rhCol III的核磁共振氢谱图如图2所示,其中的(A)(B)两图分别为原料rhCol III和改性rhCol III的核磁共振氢谱。由图2可知,MA改性后的谱图在5~6ppm处出现了新的特征峰,判断其为双键特征峰,说明MA成功枝接在了rhCol III上。基于核磁共振氢谱计算本实施例制备的改性rhCol III中的MA的接枝率,约为66.7%。通过调整制备时rhCol III与MA的比例关系,可以调整改性rhCol III中的MA的接枝率在65%~100%之间。改性rhCol III的结构如下式所示:
实施例2
本实施例中,制备接枝二氢咖啡酸的壳聚糖,步骤如下:
(1)将壳聚糖(CS)加入去离子水中,用0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至2.5,室温下搅拌至CS完全溶解形成黄色透明溶液,得到CS浓度为15mg/mL的CS溶液。
将二氢咖啡酸(HCA)和EDC溶解于45mL乙醇-水溶液中,得到HCA-EDC混合液。该HCA-EDC混合液中,HCA的浓度为21mg/mL,EDC的浓度为66.67mg/mL,所述乙醇-水溶液中,乙醇与水的体积比为1:1。
(2)用0.1mol/L的NaOH水溶液调节CS溶液的pH值至5.5,在搅拌条件下将HCA-EDC混合液滴加至CS溶液中,用0.1mol/L的NaOH水溶液调节所得混合液的pH值至5.5,在室温搅拌12h。该步骤中,控制HCA-EDC混合液与CS溶液的体积比为0.45:1。
(3)将步骤(2)所得反应液置于8000-12000Da透析袋中,用pH值为4.0的去离子水透析72h,透析结束后将所得产物冷冻干燥,得到接枝二氢咖啡酸的壳聚糖,记作改性CS。
本实施例制备的改性CS与采用的原料CS的傅里叶红外光谱图如图1所示,由图1可知,改性CS在1520cm-1附近出现新的吸收峰,判断是二氢咖啡酸C=C的伸缩振动引起的,证明二氢咖啡酸成功接枝到了壳聚糖上。
本实施例制备的改性CS与采用的原料CS的核磁共振氢谱图如图3所示,其中的(A)(B)两图分别为原料CS和改性CS的核磁共振氢谱,由图3可知,改性CS在6~7ppm处出现了新的特征峰,判断其为N-H特征峰,说明二氢咖啡酸成功枝接在了壳聚糖上。基于核磁共振氢谱计算本实施例制备的改性CS中的二氢咖啡酸的接枝率,约为14.5%。通过调整制备时壳聚糖与二氢咖啡酸的比例关系以及壳聚糖的分子量,可以调整改性CS中的二氢咖啡酸的接枝率在10%~30%之间。改性CS的结构如下式所示:
实施例3
本实施例中,制备可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,步骤如下:
(1)将实施例1制备的改性rhCol III与实施例2制备的改性CS溶解于超纯水中,充分混匀,得到改性rhCol III与改性CS的混合溶液,该混合溶液中,改性rhCol III与改性CS的总浓度为100mg/mL,改性rhCol III与改性CS质量比为10.4:1。
(2)向步骤(1)所得改性rhCol III与改性CS的混合溶液中加入光引发剂LAP并充分混匀,除去其中的气泡,得到凝胶前驱液,该凝胶前驱液中光引发剂的浓度为0.5wt%。
(3)将步骤(2)所得凝胶前驱液经过蓝光(365nm)照射固化,得到可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,记作rhCol III-CS2。
(4)按照步骤(1)~(3)同样的操作,改变步骤(1)中改性rhCol III与改性CS的质量比为1:0,混合溶液的浓度不变,将制备得到的水凝胶记作rhCol III-CS0。
(5)按照步骤(1)~(3)同样的操作,改变步骤(1)中改性rhCol III与改性CS的质量比为21.9:1,混合溶液的浓度不变,将制备得到的水凝胶记作rhCol III-CS1。
(6)按照步骤(1)~(3)同样的操作,改变步骤(1)中改性rhCol III与改性CS的质量比为6.6:1,混合溶液的浓度不变,将制备得到的水凝记作rhCol III-CS3。
(7)按照步骤(1)~(3)同样的操作,改变步骤(1)中改性rhCol III与改性CS的质量比为4.7:1,混合溶液的浓度不变,将制备得到的水凝胶记作rhCol III-CS4。
对本实施例制备的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4进行冷冻干燥,然后进行喷金处理,置于扫描电子显微镜下扫描,结果如图4所示,由图4可知,具有三维网络结构的交联水凝胶都具有相互贯通的孔隙结构,该结构有利于实现营养物质的快速渗透,也有利于细胞的生长。
实施例4
本实施例中,测试实施例3制备的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4的溶胀率。
将rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4进行冷冻干燥,之后称重,然后浸没于超纯水水中,置于室温吸水溶胀,每隔一段时间取出称重,计算溶胀率:溶胀率=(Wt-Wo)/Wo,其中,Wo为置于超纯水水之前(冷冻干燥之后)的重量,Wt为在超纯水中浸没一段时间后取出称重时的重量。
根据不同时间点的溶胀率,绘制溶胀曲线,结果如图5所示,由图可知,冷冻干燥之后的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4能在3min内完成快速吸水,达到最大溶胀的85%以上,且具有较好的平衡溶胀性能,有利于对血液、渗出液等的快速吸收,有利于在伤口部位维持稳定的形态。随着材料中改性CS含量的增加,材料的最大溶胀率逐渐上升,说明改性CS对材料的吸水性有促进作用。
实施例5
本实施例中,测试实施例3制备的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4的储能模量。
采用动态热机械分析法(DMA)测试rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4的储能模量,结果如图6所示。由图6可知,随着水凝胶中改性CS含量的增加,水凝胶的储能模量会降低,但总体而言,这些水凝胶的力学性能均可满足作为伤口修复的应用需求。
实施例6
本实施例中,测试实施例3制备的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4的生物降解性能。
将rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4冷冻干燥,称重,浸没于PBS缓冲液中,放置在20℃的恒温条件下进行降解,每隔一段时间取出,冷冻干燥后称重,计算降解率,降解率=(Wo-Wt)/Wo,其中,Wo为置于PBS缓冲液之前的重量,Wt为降解一段时间后取出冷冻干燥后的重量。
根据不同时间点的降解率,绘制降解曲线,结果如图7所示。由图7可知,rhColIII-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4均具有生物降解性能,可在PBS缓冲液的作用下生物降解,有利于组织的再生修复。
实施例7
采用大肠杆菌(E.coli,ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 25923)评价实施例3制备的各水凝胶(rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhColIII-CS4)的抗菌活性。
将单菌落接种于10mL胰酶大豆肉汤(TSB)中,37℃培养12h。然后将1×104CFUs于1mL菌悬液中与分别与各灭菌水凝胶均匀混合并静置培养。12h后,将混合培养液稀释105倍,均匀涂布于胰酶解胨大豆琼脂(TSA)上,培养24h。最后记录各组的单菌落数。对照组不添加凝胶,只添加菌悬液。计算细菌存活率和抑菌率。
细菌存活率(%)=N1/N0×100%,其中N1是每个水凝胶中的细菌数量,N0是只用菌悬液作为对照组的细菌数量,抑菌率(%)=1-细菌存活率(%)。
细菌存活率如图8所示,图8中两组柱状图的下方的A、B、C、D、E分别代表rhColIII-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4。由图8可知,rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4对大肠杆菌(E.coli,ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 25923)的抑菌率均在96%以上,且rhCol III-CS3对大肠杆菌(E.coli,ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 25923)的抑菌率达99%以上,具有较好的抑菌效果。
此外,获得的细菌/水凝胶样品通过Live/Dead背光细菌活性试剂盒染色,并通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM,Leica TCS SP2,徕卡显微系统,德国)进行可视化检测,CLSM检测结果中,绿色荧光代表活菌,红色荧光代表死菌。使用梯度乙醇脱水后,使用扫描电子显微镜(SEM,HITACHI S-800,日本)观察各水凝胶中细菌的微观形态。结果如图9所示,图9的(a)图为细菌/水凝胶样品上的细菌分布情况,(b)图为每个水凝胶的细菌计数结果,其中两组柱状图的下方的A、B、C、D、E、F分别代表对照组、rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhColIII-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4,(c)图为活死染色结果的SLSM测试结果,(d)图为SEM下的细菌形态。
由图9可知,rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4对大肠杆菌(E.coli,ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 25923)都具有明显的抑制作用。
实施例8
本实施例中,测试实施例3制备的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4的生物相容性。
将相同尺寸的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4用紫外光照灭菌,浸泡于无菌PBS缓冲液中过夜,将L929细胞用胰酶消化,以每个水凝胶样品5×103个细胞的密度,分别将细胞悬液滴加于各水凝胶上,在培养箱中静置30min,之后补充培养基,置于培养箱中在37℃、5%的CO2的条件下培养,培养期间,每隔一天更换一次培养基。
所述培养基是在DMEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液和胎牛血清得到,DMEM培养基中青霉素和链霉素混合液的质量浓度为1%,胎牛血清的质量浓度为10%,青霉素和链霉素混合液由HyClone公司提供。
培养1天、3天后取出水凝胶,使用CCK-8测试其中细胞增殖的情况,结果如图10所示,图10的两组柱状图的下方的A、B、C、D、E分别代表rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhColIII-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4。培养1天、3天后,取出水凝胶,用PBS缓冲液清洗2遍,将清洗后的水凝胶浸没于含有FDA和PI的PBS溶液中染色约1min,通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察细胞的生长状态和分布情况,结果如图11所示。
由图10、11可知,L929细胞在rhCol III-CS2中生长情况良好,在rhCol III-CS2中的增殖情况比其他组更好,增殖情况明显,说明rhCol III-CS2的细胞相容性最佳。而L929细胞在rhCol III-CS0中的增殖较慢,且出现了团聚生长的现象。说明当水凝胶中改性CS的含量适当时,可促进细胞在水凝胶上的铺展和增殖。
实施例9
本实施例中,进行实施例3制备的rhCol III-CS0、rhCol III-CS1、rhCol III-CS2、rhCol III-CS3、rhCol III-CS4的细胞划痕实验。
用无血清的培养基培养,使用48孔板,每孔种植1×104个L929细胞,培养12h后,用无菌移液管头处理创面,PBS冲洗3次,然后用水凝胶孵育。分别于孵育0h和24h后在倒置显微镜下对细胞进行拍照,并计算创面愈合率(wound Closure(%)),wound Closure(%)=(A0-A24)/A0×100%,其中A0为孵育0h时的创面面积,A24为孵育24h后的创面面积。结果如图12所示,其中的(A)(B)两图分别为倒置显微镜观察结果和创面愈合率结计算果。由图12可知,rhCol III-CS2的创面恢复效果优于其他组。
实施例10
本实施例中,测试实施例3制备的rhCol III-CS0、rhCol III-CS2作为皮肤修复材料的应用效果。
采用雄性BALB/c小鼠(体重25g±5g,6-8周龄)。小鼠在手术前被饲养一周以适应环境,所有手术器械都经过高温高压灭菌处理。将小鼠随机分为三组,即rhCol III-CS0组、rhCol III-CS2组和空白对照组(Blank)。
手术时先腹腔注射5%水合氯醛(7.5mL/1kg)麻醉小鼠并将其背部朝上固定在手术台上。接着将小鼠背部备毛干净,并用穿孔器在小鼠背部的两侧各造直径为10mm的圆形全层皮肤缺损。将实施例3制备的rhCol III-CS0组滴加在rhCol III-CS0组小鼠的伤口处,将实施例3制备的rhCol III-CS2滴加在rhCol III-CS2组小鼠的伤口处,空白对照组不向伤口处滴入任何材料,使用蓝光手电照射30s,用弹力绷带绕腰腹部一圈固定。术后将小鼠饲养在适宜的环境中,第4、8、12天后牺牲小鼠,记录皮肤伤口大体观和面积,并计算伤口修复率。rhCol III-CS0组、rhCol III-CS2组和空白对照组在每个时间点同时进行3个缺损实验。
本实施例的测试结果如图13所示,其中的(A)(B)(C)图分别为伤口大体观图、伤口愈合率以及伤口愈合过程中的形态和面积变化情况,图13的(B)图三组柱状图的下方的A、B、C分别代表空白对照组,rhCol III-CS0组和rhCol III-CS2组。由图13可知,相对于空白对照组,rhCol III-CS0组和rhCol III-CS2组的伤口愈合速度更快,说明rhCol III-CS0和rhCol III-CS2能加速伤口的愈合,减少疤痕的产生,并且rhCol III-CS2的促进伤口愈合的效果更好。与空白对照组相比,rhCol III-CS2组在8、14天的伤口愈合率均高出至少20%,与rhCol III-CS0组相比,rhCol III-CS2组在8、14天的伤口愈合率均高出至少10%,rhCol III-CS2组在经过12天的修复后,伤口愈合率达到了90%以上,皮肤修复促进效果明显。
Claims (10)
1.一种可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,其特征在于,该抗菌水凝胶是由改性重组III型人源化胶原蛋白和接枝二氢咖啡酸的壳聚糖组成的水凝胶,改性重组III型人源化胶原蛋白水凝胶具有三维网络结构,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖均匀分布在改性重组III型人源化胶原蛋白水凝胶的三维网络结构结构中;该抗菌水凝胶中,改性重组III型人源化胶原蛋白与接枝二氢咖啡酸的壳聚糖的质量比为(8~11):1;所述改性重组III型人源化胶原蛋白由具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白经光引发交联形成。
2.根据权利要求1所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,其特征在于,该抗菌水凝胶由含具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白、接枝二氢咖啡酸的壳聚糖和光引发剂的凝胶前驱液经光引发交联形成。
3.根据权利要求1所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,其特征在于,所述具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白为甲基丙烯酸酐改性的重组人源化III型胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,其特征在于,所述具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白中,甲基丙烯酸酐的接枝率为65%~100%。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶,其特征在于,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖由二氢咖啡酸的羧基与壳聚糖的氨基经酰胺化反应形成,接枝二氢咖啡酸的壳聚糖中,二氢咖啡酸的接枝率为10%~30%。
6.权利要求1至5中任一权利要求所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白、接枝二氢咖啡酸的壳聚糖和光引发剂溶于水中,去除所得溶液中的气泡,得到凝胶前驱液,在蓝光照射条件下引发具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白发生交联反应,即得可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶。
7.根据权利要求6所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的制备方法,其特征在于,凝胶前驱液中,具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白与接枝二氢咖啡酸的壳聚糖的质量比为(8~11):1。
8.根据权利要求6或7所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的制备方法,其特征在于,凝胶前驱液中,具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白与接枝二氢咖啡酸的壳聚糖的总浓度为80~120mg/mL。
9.根据权利要求6或7所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶的制备方法,其特征在于,凝胶前驱液中,光引发剂的含量为0.5wt%~2wt%。
10.权利要求1至5中任一权利要求所述可用于不规则伤口修复的可注射抗菌水凝胶在创面修复中的应用,其特征在于,应用将由含具有光固化性能的重组III型人源化胶原蛋白、接枝二氢咖啡酸的壳聚糖和光引发剂的凝胶前驱液注射至待修复的创面处,施加蓝光照射引发交联反应将凝胶前驱液转变成凝胶状态将待修复部位完全覆盖,以对待修复的创面进行修复。
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