KR20070100948A - 세포의 캡슐화 방법 및 조성물 - Google Patents

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사무엘 아이. 스터프
존 에이. 케슬러
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노오쓰웨스턴 유니버시티
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Abstract

본 발명은 세포 (예를 들면, 신경 전구세포 및 뉴런)의 분화 및 성장을 변경 (예를 들면, 증대 또는 촉진)하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 자기조립 펩티드 친양쪽성체(amphiphile) (예를 들면, 용액 중에 또는 (예를 들면, 자기조립되는) 나노섬유 (예를 들면, 세포를 캡슐화하고, 세포 분화를 촉진할 수 있는 (예를 들면, 신경돌기 발생))를 생성함)를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 연구, 임상 (예를 들면, 치료) 및 진단 세팅에 용도를 발견한다.

Description

세포의 캡슐화 방법 및 조성물{Methods and compositions for encapsulation of cells}
본 출원은 전체적으로 본원에 원용에 의해 포함된, 미국 가특허출원 제60/645,668호 (2005년 1월 21일 출원)에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 미국 에너지부 (원조 DE-FG02-00ER45810/A001), NIH (원조 NS20778, NS20013, 및 NS34758), 및 NSF (DMPv-010-8342)에 의해 부분적으로 지원되었다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가질 수 있다.
기술 분야
본 발명은 세포 (예를 들면, 신경 전구세포 및 뉴런)의 분화 및 성장을 변경 (예를 들면, 증대 또는 촉진)하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 자기조립 펩티드 친양쪽성체(amphiphile) (예를 들면, 용액 중에 또는 (예를 들면, 자기조립되는) 나노섬유 (예를 들면, 세포를 캡슐화하고, 세포 분화를 촉진할 수 있는 (예를 들면, 신경돌기 발생))를 생성함)를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 연구, 임상 (예를 들면, 치료) 및 진단 세팅에 용도를 발견한다.
세포를 저장 또는 유인하는데 3 차원 골격이 존재하지만, 이들은 종종 몇 가지 영역이 결핍된다. 예를 들면, 분화하도록 유도된 세포는 원하지 않는 세포 유형을 포함하는 종종 다양한 세포 유형으로 분화한다. 이는 신경 축삭 (예를 들면, 상행 감각 축삭 및 하강 운동 축삭)의 생성 및 성장 및 성상교세포증 (예를 들면, 성상교세포 성장 및 흉터 형성)의 저해를 원할 때 특히 문제된다. (신경 축삭 (예를 들면, 상행 감각 축삭 및 하강 운동 축삭)의 생성 및 성장을 촉진하고, 동시에 성상교세포 성장 및/또는 흉터 형성을 저해하는) 생활성 물질의 전달을 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 요구가 당업계에 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 세포 (예를 들면, 신경 전구세포 및 뉴런)의 분화 및 성장을 변경 (예를 들면, 증대 또는 촉진)하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 자기조립 펩티드 친양쪽성체(amphiphile) (예를 들면, 용액 중에 또는 (예를 들면, 자기조립되는) 나노섬유 (예를 들면, 세포를 캡슐화하고, 세포 분화를 촉진할 수 있는 (예를 들면, 신경돌기 발생))를 생성함)를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 연구, 임상 (예를 들면, 치료) 및 진단 세팅에 용도를 발견한다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물과 뉴런을 접촉시키는 것을 포함하는 뉴런의 발생을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 뉴런의 발생의 변경은 축삭 성장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 축삭 성장은 하강 운동 섬유 성장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 축삭 성장은 상행 감각 섬유 성장을 포함한다. 특정 구현예에서, 발생의 변경은 병터 자리를 통해 일어난다. 특정 구현예에서, 뉴런의 발생의 변경은 감소된 성상교세포증을 동반한다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 IKVAV 서열 및/또는 기타 라미닌 에피토프를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런은 손상을 받은 척수에서 뉴런이다. 특정 구현예에서, 상기 척수는 외상 척수 손상에 의해 손상되었다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런은 감각 뉴런이다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런은 운동 뉴런이다. 특정 구현예에서, 뉴런의 발생의 변경은 뉴런의 발생을 촉진하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 뉴런의 발생의 변경은 손상된 뉴런의 발생을 재생하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 상기 조성물은 또한 성장인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 성장인자는 신경영양인자를 포함한다. 본 발명은 특정 신경영양인자에 제한되지 않는다. 실제로, 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 신경영양인자가 본 발명에 유용한 것으로 고려된다: 신경성장인자 (NGF), 뇌유래 신경영양인자 (BDNF), 신경영양인자-3 (NT-3), 신경영양인자-4/5 (NT-4/5), 섬모 신경영양인자 (CNTF), 백혈병 저해인자=콜린성 신경분화 인자 (LDP/CDF), 카디오트로핀(Cardiotrophin)-1, 염기성 섬유모세포성장인자 (bFGF), 산성 섬유모세포성장인자 (aFGF), 섬유모세포성장인자-5 (FGF-5), 인슐린, 인슐린유사성장인자 I (IGF-I), 인슐린유사성장인자 II (IGF-II), 전환성장인자 βl (TGFβl), 전환성장인자 β2 (TGFβ2), 전환성장인자 β3 (TGFβ3), 액티빈, 신경교세포유래 신경영양인자 (GDNF), 미드카인헤파린 결합 신경영양인자 (HBNF), 플레이오트로핀, 표피성장인자 (EGF), 전환성장인자 α (TGFα), 신경초종유래 성장인자, 헤레굴린 (뉴레귤린, ARIA), 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 축삭 리간드-1 (Al-1), elf-1, ehkl-L, 및 LERK2. 특정 구현예에서, 상기 뉴런은 신경돌기이다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 대상을 치료하는 방법을 제공한다: 대상에게 손상된 신경을 제공하는 단계, 및 뉴런 성장이 대상에서 일어나도록 하는 조건하에 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계. 특정 구현예에서, 상기 뉴런 성장은 축삭 성장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 축삭 성장은 하강 운동 섬유 성장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 축삭 성장은 상행 감각 섬유 성장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런 성장은 손상된 신경의 자리에서 축삭 성장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런 성장은 대상에서 감소된 성상교세포증을 동반한다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런 성장은 대상에서 감소된 흉터 형성을 동반한다. 바람직한 구현예에서, 상기 감소된 성상교세포증 및 상기 감소된 흉터 형성은 신경 손상의 자리에서 일어난다. 특정 구현예에서, 상기 손상된 신경은 손상 받은 척수에서 신경이다. 특정 구현예에서, 상기 손상된 신경은 외상 척수 손상에 의해 손상 받았다. 특정 구현예에서, 상기 손상된 신경은 손상된 감각 뉴런을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 손상된 신경은 손상된 운동 뉴런을 포함한다. 특정 구현예에서, 뉴런 성장은 손상된 뉴런의 발생을 재생하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물은 또한 성장인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 성장인자는 신경영양인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 투여는 펩티드 친양쪽성체의 수용액의 비경구 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 상기 손상된 신경과 접촉시 나노섬유 겔을 형성한다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 형광 물질을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 형광 물질은 피렌부틸 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물은 하나 이상의 기타 물질과 함께 동시투여된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 기타 물질은 신경영양인자, 신경성장저해제의 저해제, 신경성장유인제 및 신경성장저해제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 신경성장저해제의 저해제는 Nogo, Ryk, Ryk 유사 저해제, sFRP, sFRP 유사 물질, MAG, Omgp, Wnt 또는 CSPG의 발현 및/또는 활성을 저해한다.
본 발명은 또한 IKVAV 서열 및/또는 기타 라미닌 에피토프를 포함하는 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 대상에서 뉴런 성장을 변경하도록 배치된다. 특정 구현예에서, 뉴런 성장의 변경은 뉴런 성장의 촉진을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 SLSL 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 SLSL 서열은 치료학적으로 유용한 펩티드 친양쪽성체의 자기조립을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 A3 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 A3 서열은 치료학적으로 유용한 펩티드 친양쪽성체의 자기조립을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 헤테로원자를 포함한다. (예를 들면, 하나의 펩티드 친양쪽성체를 또 다른 것으로부터 구별하기 위해) Br, I 또는 F 헤테로원자를 포함하나, 이에 제한되지 않는 복수의 헤테로원자가 본 발명에 유용한 것으로 고려된다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 분지기(branching group)을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 분지기는 상기 펩티드 친양쪽성체 내에 존재하는 펩티드 에피토프의 유용성을 개선한다. 특정 구현예에서, 상기 분지기는 이의 N-말단에 변형된 라이신 잔기를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 펩티드-친양쪽성 (PA) 조성물을 포함하는 나노섬유 골격(scaffold) 내에 캡슐화된 신경 전구세포를 제공한다. 상기 캡슐화된 신경 전구세포는 고밀도로 세포에 대한 생활성 펩티드의 제시에 특정 용도를 가진다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신경 전구세포 분화를 유도하는 생활성 펩티드의 전달에 용도를 가진다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 복수의 신경 전구세포; 및 나노섬유 구조를 포함하는 시스템을 제공하는데, 상기 나노섬유 구조는 펩티드-친양쪽성체를 포함하며, 상기 복수의 신경 전구세포는 나노섬유 구조 내에 캡슐화된다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드는 생활성 펩티드 (예를 들면, 신경 전구세포 분화 또는 발생를 유도함)이다. 특정 구현예에서, 상기 생활성 펩티드는 성장인자, 호르몬, 또는 분화 인자이다. 특정 구현예에서, 상기 생활성 펩티드는 생활성 에피토프 (예를 들면, IKVAV 또는 기타 라미닌 에피토프)를 포함한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 복수의 신경 전구세포; 및 복수의 펩티드-친양쪽성체를 제공하는 단계; 및 상기 신경 전구세포가 나노섬유 구조 내에 캡슐화되도록 하는 조건하에 신경 전구세포에 펩티드-친양쪽성체를 전달하는 단계로서, 상기 나노섬유 구조는 펩티드-친양쪽성체를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드는 생활성 물질 (예를 들면, 호르몬, 성장인자, 또는 분화 인자)이다. 바람직한 구현예에서, 상기 신경 전구세포의 캡슐화는 높은 국부적인 농도로 펩티드의 전달을 초래한다. 특정 구현예에서, 상기 캡슐화는 세포의 선택적인 분화를 초래한다. 특정 구현예에서, 상기 생활성 펩티드는 생활성 에피토프 (예를 들면, IKVAV 또는 기타 라미닌 에피토프)를 포함한다.
본 발명은 부가적으로 복수의 신경 전구세포; 및 복수의 펩티드-친양쪽성체를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 펩티드는 생활성 펩티드 (예를 들면, 세포 분화 또는 발생을 유도함)이다. 특정 구현예에서, 상기 생활성 펩티드는 성장인자, 호르몬, 또는 분화 인자이다. 특정 구현예에서, 상기 생활성 펩티드는 생활성 에피토프 (예를 들면, IKVAV)를 포함한다.
본 발명은 또한 펩티드 친양쪽성체 및 신경영양물질을 포함하는 키트를 제공한다.
정의
본원에 이용된, 용어 "다능성"은 복수의 상이한 유형의 세포 (예를 들면, 최종 분화된 세포)로 분화하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들면, 다능성 세포는 3가지 주요한 배엽: 내배엽, 외배엽, 및 중배엽으로 분화할 수 있는 것을 포함한다.
본원에 이용된, 용어 "전구세포"는 특정 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포를 말한다.
본원에 이용된, 용어 "이식 세포" 및 "그라프트 물질"은 그라프팅된, 이식된(implanted) 또는 이식된(transplanted) 성분 (예를 들면, 조직 또는 세포)을 폭넓게 말한다. 본원에 이용된, 용어 "이식"은 대상의 하나의 부분에서 동일한 대상, 또는 또 다른 대상의 또 다른 부분으로 조직 또는 세포의 전달 또는 그라프팅, 또는 신체 내로 또는 신체 상에 생체적합성 물질의 도입을 말한다. 본원에 이용된, 특정 구현예에서, 이식된 조직은 동일 또는 유사한 조성, 또는 생물체 (예를 들면, 증여자)로부터 유래된, 또는 시험관 내 배양물 (예를 들면, 조직 배양 시스템)로부터 유래된 세포의 집합을 포함할 수 있다.
본원에 이용된 용어 "이식된 세포의 수용자"는 이식을 경험하고, 이식된 세포를 수용하는 대상을 폭넓게 말한다.
본원에 이용된, 용어 "세포 배양물"은 연속적인 세포주 (예를 들면, 무한증식 표현형을 가짐), 일차 세포 배양물, 및 유한 세포주 (예를 들면, 비형질전환된 세포)를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포의 시험관 내 배양물을 말한다.
용어 "시험관 내"는 인공적인 환경 및 인공적인 환경 내에 일어나는 과정 또는 반응을 말한다. 용어 "생체 내"는 천연 환경 (예를 들면, 동물 또는 세포) 및 천연 환경 내에 일어나는 과정 또는 반응을 말한다. 생체 내 시스템에 대한 시험관 내의 정의는 연구 중인 시스템에 대해 특정된다. 본원에 이용된, 시험관 내 시스템은 조직 배양 용기 및 장치와 같은 인공적인 환경에서 세포 또는 과정의 연구를 말하는 반면, 생체 내 환경에서 동일한 시스템의 연구는 래트, 마우스 또는 인간과 같은 생물체 내의 세포 또는 과정의 연구를 말한다.
본원에 이용된, 용어 "일차 세포" 또는 "일차 배양물"은 생물체, 기관, 또는 조직으로부터 직접 체외이식된 세포 또는 세포 배양물을 말한다. 일차 배양물은 전형적으로 형질전환되거나 무한증식되지 않는다.
본원에 이용된 용어 "조직 배양물"은 실험실에서 세포의 성장 및 유지 기술의 집합을 말한다. 상기 기술은 당업계에 공지된 조직 배양 디쉬 또는 기타 용기, 인큐베이터 및 멸균 오염관리 장치를 포함할 수 있다.
본원에 이용된, 용어 "외인성"은 이의 천연 공급원과 다른 특정 공급원으로부터 오는 물질을 언급하기 위해 용어 "이종의"와 상호교환하여 이용된다. 예를 들면, 용어 "외인성 단백질," 또는 "외인성 세포"는 비천연 공급원 또는 위치 유래이며, 생물학적 시스템에 인공적으로 공급되는 단백질 또는 세포를 말한다. 대조적으로, 용어 "내인성 단백질," 또는 "내인성 세포"는 생물학적 시스템, 종 또는 개인에 천연적인 단백질 또는 세포를 말한다.
본원에 이용된, 용어 "줄기 세포"는 자가 재생 및 복수 혈통으로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기 세포는 예를 들면, 배아 공급원 ("배아 줄기 세포") 또는 성인 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,843,780호(Thompson에게 허여)에는 인간 배아 유래의 줄기 세포주의 제조가 기재되어 있다. PCT 공개공보 WO 00/52145 및 WO 01/00650에는 줄기 세포주를 제조하기 위해 핵 전달 절차에 성인 유래의 이용이 기재되어 있다.
성체 줄기 세포의 예는 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 및 골수 간질 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 줄기 세포는 지방세포, 연골세포, 골세포, 근육세포, 골수 간질 세포, 및 흉선 기질 (중간엽 줄기 세포); 간세포, 혈관세포, 및 근육세포 (조혈 줄기 세포); 근육세포, 간세포, 및 신경교세포 (골수 간질 세포) 및, 정말로, 모든 3가지 배엽 유래의 세포 (성체 신경 줄기 세포)를 포함하는 다양한 세포 유형으로 분화하는 능력을 증명하였다.
용어 "배아 줄기 세포" ("ES 세포")는 자가 재생하며, 성숙한 동물에 존재하는 세포 유형의 많은 또는 모든 것을 생산하는 능력을 갖는 포유동물 포배로부터 유래된 세포를 말한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 이용하기에 적합한 인간 배아 줄기 세포주는 하기 단체에 의해 제조된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: BresaGen, Inc., Athens, Georgia; CyThera, Inc., San Diego, California; ES Cell International, Melbourne, Australia; Geron Corporation, Menlo Park, California; Goteborg University, Goteborg, Sweden; Karolinska Institute, Stockholm, Sweden; Maria Biotech Co. Ltd. - Maria Infertility Hospital Medical Institute, Seoul, Korea; MizMedi Hospital - Seoul National University, Seoul, Korea; National Centre for Biological Sciences/ Tata Institute of Fundamental Research, Bangalore, India; Pochon CHA University, Seoul, Korea; Reliance Life Sciences, Mumbai, India; Technion University, Haifa, Israel; University of California, San Francisco, California; and Wisconsin Alumni Research Foundation, Madison, Wisconsin. 국립보건원에 의해 생성된 인간 배아 줄기 세포 등록부에 열거된 인간 ES 세포는 본 발명의 방법 및 조성물에 용도를 발견한다. 그러나, NIH 등록부에 열거되지 않은 인간 ES 세포 또한 본 발명의 구현예에 용도를 발견한다 (예를 들면, 비인간 유래 물질로 ES 오염을 막는 것이 바람직한 경우).
본원에 이용된 용어 "영양세포(feeder cell)"는 조직 배양 시스템에서 성장 지지체로서 이용되는 세포를 말한다. 바람직한 구현예에서, 용어 "영양세포"는 배아 "줄무늬체(striatum) 세포"를 말하는 반면, 기타 구현예에서, 용어 "영양세포"는 간질세포를 말한다.
본원에 이용된, 용어 "펩티드 친양쪽성체" 및 "PA" 및 "친양쪽성체"는 기능성 영역 (예를 들면, 펩티드 에피토프 (예를 들면, IKVAV 및/또는 YIGSR 서열) 포함)에 연결된 구조 영역 (예를 들면, 펩티드 친양쪽성체의 팩킹 및 자기 조립을 변경 및/또는 영향을 줄 수 있는 서열(예를 들면, β-시트)을 포함)에 연결된 소수성 영역 (예를 들면, 선형 펩티드 사슬 (예를 들면, 팔미토일기) 또는 소수성 고리 구조 (예를 들면, 피렌부틸))을 포함하는 유기 모이어티를 포함하는 조성물을 말한다. 상기 펩티드 모이어티는 펩티드 친양쪽성체의 전하를 결정할 수 있는 하나 이상의 기타 영역 (예를 들면, 하전된 아미노산 또는 이의 서열 (예를 들면, 소수성 영역, 구조 영역 또는 기능성 영역에 인접함))을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 것 외에, 본 발명에 이용될 수 있는 펩티드 친양쪽성체는 이의 각각이 전체적으로 원용에 의해 본원에 포함되는 미국특허출원 20050272662, 20050209145, 20050208589, 20040258726, 20040022718, 20040018961, 20040001893, 및 국제출원 WO/05056576, WO/05056039, WO/05003292, WO/04106359, WO/04072104, WO/04046167, WO/04018628, WO/04003561, WO/03090255, WO/03084980, WO/03070749, 및 WO/03054146에 기재된다.
본원에 이용된, 물질 (예를 들면, 세포)과 관련하여 사용될 때 용어 "분리된"은 이의 천연 공급원에 통상적으로 관련된 하나 이상의 성분 또는 오염물질로부터 동정되고 분리된 물질을 말한다. 분리된 물질은 자연에서 발견된 것과 상이한 형태 또는 세팅으로 존재한다.
본원에 이용된, 용어 "정제된" 또는 "정제하는 것"은 시료로부터 성분 (예를 들면, 오염물질)의 제거를 말한다.
본원에 이용된, 용어 "대상"은 인간, 비인간 영장류, 설치류 등 (특정 치료 (예를 들면, 본 발명의 친양쪽성체의 투여)의 수용자임)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 동물 (예를 들면, 포유동물)을 말한다. 용어 "대상" 및 "환자"는 본원에 다르게 지정되지 않는다면, 인간 대상에 관하여 상호교환하여 이용된다.
본원에 이용된, 용어 "비인간 동물"은 설치류, 비인간 영장류, 양, 소, 반추동물, 토끼목, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 조류 등과 같은 척추동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 모든 비인간 동물을 말한다.
용어 "시험 화합물" 및 "후보 화합물"은 신체 기능의 질환, 병, 손상 (예를 들면, 척수 손상), 병듬, 또는 질병 (예를 들면, 퇴행성신경질환)을 치료 또는 예방하기 위해 이용되는 후보인 임의의 화학적 실체, 약학, 약물 등을 말한다. 후보 화합물은 공지된 및 잠재적인 치료 화합물 양자 (예를 들면, 뉴런 성장을 촉진 또는 저해하는 것으로 알려진 물질뿐만 아니라 신경 세포 성장에 대한 이의 효과가 아직 결정되지 않은 물질 (예를 들면, 본 발명의 시스템 및 방법을 이용함))를 포함한다. 후보 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 스크리닝에 의해 치료제로 결정될 수 있다.
본원에 이용된, 용어 "유전자 전달 시스템"은 핵산 서열을 포함하는 조성물을 세포 또는 조직에 전달하는 임의의 수단을 말한다. 예를 들면, 유전자 전달 시스템은 벡터 (예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 및 기타 핵산 기재 전달 시스템), 노출된 핵산의 미세주입, 중합체 기재 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀 기재 및 금속 입자 기재 시스템), 바이오리스틱(biolistic) 주입 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에 이용된, 용어 "바이러스 유전자 전달 시스템"은 원하는 세포 또는 조직에 시료의 전달을 용이하게 하는 바이러스 성분 (예를 들면, 본래의 바이러스, 변형된 바이러스 및 핵산 및 단백질과 같은 바이러스 성분)을 포함하는 유전자 전달 시스템을 말한다. 본원에 이용된, 용어 "아데노바이러스 유전자 전달 시스템"은 아데노비리대 과에 속하는 본래의 또는 변경된 바이러스를 포함하는 유전자 전달 시스템을 말한다.
본원에 이용된, 용어 "핵산 분자"는 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는 분자를 포함하는 임의의 핵산을 말한다. 상기 용어는 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체를 포함하는 서열을 포함한다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드, 전구체, 또는 RNA (예를 들면, rRNA, tRNA)의 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들면, DNA) 서열을 말한다. 상기 폴리펩티드는 전장 또는 단편의 원하는 활성 또는 기능적 성질 (예를 들면, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달, 면역원성 등)이 유지되는 한, 전장 코딩 서열 또는 상기 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 코딩될 수 있다. 상기 용어는 또한 구조 유전자의 코딩 영역 및 상기 유전자가 전장 mRNA의 길이에 해당하도록 양 말단에 약 1 kb 이상의 거리에 대해 5' 및 3' 말단에서 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함한다. 상기 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 비번역 서열로서 언급된다. 상기 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고, mRNA 상에 존재하는 서열은 3' 비번역 서열로서 언급된다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 양자를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 비코딩 서열로 명명되는 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"로 차단된 코딩 영역을 포함한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 절편이며; 인트론은 인핸서와 같은 조절 성분을 포함할 수 있다. 인트론은 핵 또는 일차 전사체로부터 제거되거나 또는 "스플라이싱 아웃(spliced out)"되며; 인트론은 그러므로 전령 RNA (mRNA) 전사체에 존재하지 않는다. mRNA는 초기 폴리펩티드에서 서열 또는 아미노산의 순서를 지정하기 위해 번역 동안 기능한다.
용어 "이종 유전자"는 이의 자연적인 환경에 존재하지 않는 유전자를 말한다. 예를 들면, 이종 유전자는 한 종에서 또 다른 종으로 도입된 유전자를 포함한다. 이종 유전자는 또한 특정 방식으로 변경된 생물체에 자연적인 유전자 (예를 들면, 돌연변이된, 복수의 카피로 부가된, 비천연 조절 서열에 연결된 등)를 포함한다. 이종 유전자는 이종 유전자 서열이 염색체에서 유전자 서열과 자연적으로 연관되어 발견되지 않거나 또는 자연에서 발견되지 않는 염색체의 부분과 연관된 DNA 서열 (예를 들면, 유전자가 통상적으로 발현되지 않는 유전자 좌에서 발현되는 유전자)에 전형적으로 연결된다는 점에서 내인성 유전자와 구별된다.
본원에 이용된, 용어 "유전자 발현"은 유전자에 코딩된 유전자 정보를 유전자의 "전사"를 통해 (즉, RNA 중합효소의 효소 작용을 통해) RNA (예를 들면, mRNA, rRNA, tRNA, 또는 snRNA)로 전환하는 과정, 및 단백질 코딩 유전자에 대해, mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환하는 과정을 말한다. 유전자 발현은 상기 과정에서 많은 단계에서 조절될 수 있다. "상향 조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 산물(예를 들면, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 말하는 반면, "하향 조절" 또는 "억제"는 생산을 감소시키는 조절을 말한다. 상향 조절 또는 하향 조절에 관련된 분자 (예를 들면, 전사 인자)는 종종 각각 "활성제" 및 "억제제"로 불린다.
인트론을 포함하는 것 외에, 유전자의 게놈 형태는 또한 RNA 전사체 상에 존재하는 서열의 5' 및 3' 말단 양자에 위치하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열은 "플랭킹" 서열 또는 영역으로 언급된다 (상기 플랭킹 서열은 mRNA 전사체 상에 존재하는 비번역 서열의 5' 또는 3'에 위치한다). 상기 5' 플랭킹 영역은 유전자의 전사를 조절 또는 영향을 주는 프로모터 및 인핸서와 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 상기 3' 플랭킹 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 포함할 수 있다.
용어 "야생형"은 천연적으로 발생하는 공급원으로부터 분리된 유전자 또는 유전자 산물을 말한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 자주 관찰되므로, 임의로 유전자의 "통상적인" 또는 "야생형" 형태로 표시되는 것이다. 대조적으로, 용어 "변형된" 또는 "돌연변이체"는 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교하여 서열 및/또는 기능적 성질에서 변형 (예를 들면, 변경된 특성)을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 말한다. 천연적으로 발생하는 돌연변이체가 분리될 수 있으며; 이는 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교하여 변경된 특성 (변경된 핵산 서열 포함)을 가진다는 사실에 의해 확인된다는 것을 주목한다.
본원에 이용된, 용어 "코딩하는 핵산 분자," "코딩하는 DNA 서열," 및 "코딩하는 DNA"는 데옥시리보핵산의 가닥을 따라 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 말한다. 상기 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 그리하여, 상기 DNA 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
본원에 이용된, 용어 "유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드" 및 "유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드"는 유전자의 코딩 영역을 포함하는 핵산 서열 또는 즉 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 코딩 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 (즉, 센스 가닥) 또는 이중가닥일 수 있다. 적당한 조절 요소, 예를 들면, 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합부 (splice junction), 폴리아데닐화 신호 등이 필요시 유전자의 코딩 영역에 근접하여 위치하여, 전사의 적절한 개시 및/또는 1차 RNA 전사체의 올바른 가공을 허용할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 발현 벡터에 이용된 코딩 영역은 내인성 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합부, 개재 서열, 폴리아데닐화 신호 등 또는 내인성 및 외인성 조절 요소의 조합을 포함할 수 있다.
"아미노산 서열" 및 "폴리펩티드" 또는 "단백질"과 같은 용어는 아미노산 서열을 인용된 단백질 분자와 관련된 완전하고, 천연 아미노산 서열로 제한할 의미는 아니다.
본원에 이용된 용어 "천연 단백질"은 단백질이 벡터 서열에 의해 코딩되는 아미노산 잔기를 포함하지 않는다는 것을 나타내기 위함인데; 즉, 상기 천연 단백질은 천연에 존재할 때, 상기 단백질에서 발견되는 아미노산을 단지 포함한다. 천연 단백질은 재조합 수단에 의해 제조될 수 있거나 또는 천연적으로 발생하는 공급원으로부터 분리될 수 있다.
단백질에 관하여 본원에 이용된 용어 "부분"은 ("제시된 단백질의 부분"에서와 같이) 상기 단백질의 단편을 말한다. 상기 단편은 4개의 아미노산 잔기에서 전체 아미노산 서열 마이너스 하나의 아미노산의 크기의 범위일 수 있다.
용어 "과발현" 및 "과발현하는" 및 문법상의 동등물은 대조군 도는 비트랜스제닉 동물에서 제시된 조직에서 관찰된 것보다 대략 3배 높은 (또는 큰) 발현 수준을 나타내는 mRNA 수준에 관하여 이용된다. mRNA 수준은 노던 블롯 분석을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 수많은 기술을 이용하여 측정된다. 분석되는 각 조직으로부터 로딩된 RNA 양에서 차이를 조절하기 위해 적당한 대조군이 노던 블롯 상에 포함된다 (예를 들면, 각 시료에 존재하며, 모든 조직에서 동일한 양으로 본질적으로 존재하는 풍부한 RNA 전사체인 28S rRNA의 양이 노던 블롯 상에 관찰된 mRNA 특이적인 신호를 정상화 또는 표준화하는 수단으로서 이용될 수 있다). 올바르게 스플라이싱된 트랜스진 RNA에 대한 크기에 해당하는 밴드에 존재하는 mRNA의 양이 정량화될 수 있으며; 트랜스진 유전자에 혼성화하는 기타 미량 종의 RNA는 일반적으로 트랜스제닉 mRNA의 발현의 정량화에서 고려되지 않는다.
본원에 이용된, 용어 "선택 마커"는 다른 방법으로 필수 영양분일 수 있는 것이 부족한 배지에서 성장하는 능력을 부여하는 효소 활성을 코딩하는 유전자 (예를 들면, 효모 세포에서 HIS3 유전자)의 이용을 말하며; 또한, 선택 마커는 선택 마커가 발현되는 세포에 대해 항생제 또는 약물 내성을 부여할 수 있다. 선택 마커는 "우성"일 수 있으며; 우성 선택 마커는 임의의 진핵 세포주에서 검출될 수 있는 효소 활성을 코딩한다. 우성 선택 마커의 예는 포유동물 세포에서 약물 G418에 대한 내성을 부여하는 박테리아 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼라제 유전자 (또한 neo 유전자로서 언급됨), 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 박테리아 하이그로마이신 G 포스포트랜스퍼라제 (hyg) 유전자 및 미코페놀산의 존재하에 자라는 능력을 부여하는 박테리아 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자 (또한 gpt 유전자로서 언급됨)를 포함한다. 기타 선택 마커는 관련 효소 활성이 부족한 세포주와 함께 이용되어야 하는 점에서 우성이 아니다. 비우성 선택 마커의 예는 tk- 세포주와 함께 이용되는 티미딘 키나아제 (tk) 유전자, CAD 결핍 세포와 함께 이용되는 CAD 유전자 및 hprt- 세포주와 함께 이용되는 포유동물 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (hprt) 유전자를 포함한다. 포유동물 세포주에서 선택 마커의 이용의 검토는 [Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp.16.9-16.15]에 제공된다.
용어 "벡터"는 DNA 절편(들)을 하나의 세포에서 또 다른 세포로 전달하는 핵산 분자를 말한다. 용어 "운반체"는 종종 "벡터"와 상호교환하여 이용된다. 벡터는 발현 카세트를 세포로 전달하기 위해 이용될 수 있으며; 부가적으로 또는 대안적으로, 벡터는 마커 단백질 (이에 의해 세포 트랜스펙션이 측정될 수 있음), 선택 단백질 (이를 통해 트랜스펙션된 세포가 비트랜스펙션된 세포로부터 선발될 수 있음), 또는 리포터 단백질 (이를 통해 리포터 단백질의 발현 또는 활성 또는 기능에 대한 효과가 모니터링될 수 있음)을 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는 부가적인 유전자를 포함할 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 원하는 코딩 서열 및 시험관 내 또는 생체 내 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적당한 핵산 서열을 포함하는 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 DNA 분자를 말한다. 시험관 내 발현은 전사 시스템 및 전사/번역 시스템에서 발현을 포함한다. 생체 내 발현은 특정 숙주 세포 및/또는 생물체에서 발현을 포함한다. 원핵 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에서 발현에 필요한 핵산 서열은 통상적으로 종종 기타 서열과 함께, 프로모터, 작동유전자 (선택적), 및 리보좀 결합 자리를 포함한다. 진핵세포 시험관 내 전사 시스템 및 세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 당업계에서 전사 주형으로서 언급되는, 박테리아 RNA 중합효소를 통한 발현에 필요한 핵산 서열은 원하는 RNA 서열의 상보체가 뒤따르는 중합효소 프로모터 영역을 갖는 주형 DNA 가닥을 포함한다. 전사 주형을 생성하기 위해, 상보적 가닥은 주형 가닥의 프로모터 부분에 어닐링된다.
용어 "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 말한다.
용어 "siRNA"는 짧은 간섭 RNA를 말한다. 특정 구현예에서, siRNA는 약 18-29 뉴클레오티드 길이의 두가닥 또는 이중가닥 영역을 포함하며; 종종 siRNA는 각 가닥의 3' 말단에 약 2 내지 4개의 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함한다. siRNA의 두가닥 또는 이중가닥 영역의 적어도 하나의 가닥은 표적 RNA 분자에 실질적으로 상동성 또는 실질적으로 상보적이다. 표적 RNA 분자에 상보적인 가닥은 "안티센스 가닥"이며; 표적 RNA 분자에 상동성인 가닥은 "센스 가닥"이며, 또한 siRNA 안티센스 가닥에 상보적이다. siRNA는 또한 부가적인 서열을 포함할 수 있으며; 상기 서열의 비제한적인 예는 연결 서열, 또는 루프뿐만 아니라 스템 (stem) 및 기타 폴딩된 구조를 포함한다.
본원에 이용된, 용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 유리한 또는 원하는 결과 (예를 들면, (예를 들면, 본 발명의 방법을 이용하여) 뉴런 성장을 달성하기 위해)를 달성하기에 충분한 양의 화합물 (예를 들면, 펩티드 친양쪽성체 또는 이를 포함하는 용액)을 말한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며, 특정 제형물 또는 투여 경로에 제한될 의도는 아니다.
본원에 이용된, 용어 "투여" 및 "투여하는"은 세포 또는 대상 (예를 들면, 대상 또는 생체 내, 시험관 내, 또는 생체 외 세포, 조직, 및 기관)에게 약물, 전구약물, 시험 화합물 또는 기타 물질, 또는 치료학적 처리 (예를 들면, 본 발명의 조성물)을 제공하는 행위를 말한다. 인체에 대한 투여의 전형적인 경로는 눈 (안과), 입 (경구), 피부 (경피), 코 (코), 폐 (흡입), 구강 점막 (볼), 귀, 직장, 주사 (예를 들면, 정맥내로, 피하로, 종양내로, 복막내로 등) 등을 통할 수 있다.
본원에 이용된, 용어 "동시 투여" 및 "동시 투여하는"은 세포 또는 대상에 적어도 2가지 물질(들) (예를 들면, 펩티드 에피토프의 하나의 유형을 포함하는 펩티드 친양쪽성체 (예를 들면, IKVAV) 및 하나 이상의 기타 물질 (예를 들면, 제2 유형의 펩티드 친양쪽성체 (예를 들면, YIGSR)를 포함하는 펩티드 친양쪽성체)를 포함하는 조성물의 투여 또는 치료를 말한다. 특정 구현예에서, 2 이상의 물질 또는 치료의 동시 투여는 동시에 발생한다. 기타 구현예에서, 제1 물질/치료는 제2 물질/치료 전에 투여된다. 당업자는 이용된 다양한 물질 또는 치료의 투여 제형물 및/또는 경로가 변할 수 있다. 동시 투여에 대한 적당한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 물질 또는 치료가 동시 투여될 때, 각각의 물질 또는 치료는 이의 단독 투여에 적합한 것보다 더 낮은 투여량으로 투여된다. 그리하여, 동시 투여는 물질 또는 투여의 동시 투여가 잠재적으로 해로운 (예를 들면, 독성) 물질(들)의 필요한 투여량을 낮출 때, 및/또는 2 이상의 물질의 동시 투여가 기타 물질의 동시 투여를 통해 물질 중의 하나의 유리한 효과에 대해 대상의 민감화를 초래하는 구현예에서 특히 바람직하다.
본원에 이용된, 용어 "신경돌기"는 성장 과정에 있는 뉴런을 말한다. 그리하여, 용어 "신경돌기 성장" 또는 "신경돌기 발생"은 뉴런으로부터 축삭 과정의 연장 (예를 들면, 세포체)을 말한다.
본원에 이용된, 용어 "접촉" 또는 "접촉하는"은 본 발명의 조성물 (예를 들면, 본 발명의 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 용액 또는 나노섬유 겔)이 뉴런의 성장을 매개 또는 변경 (예를 들면, 자극, 확대, 저해 등)할 수 있는 위치에 오는 임의의 방식을 말한다. 예를 들면, "접촉하는"은 PA를 포함하는 용액을 뉴런이 존재하는 영역에 주입하는 것을 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명
중추신경계는 뇌 및 척수를 포함한다. 신체에서 모든 기타 신경은 말초신경계를 포함한다. 날신경은 중추신경계에서 신체의 모든 부분 (말초)에 메시지를 전달하는 반면, 들신경은 말초에서 중추신경계로 통증 강도와 같은 정보를 전달한다. 2가지 유형의 날신경이 있다: 골격근으로 가는 체신경 및 평활근, 샘 및 심장을 가는 자율신경. 전기적 활성 형태의 메시지는 신경 섬유 또는 축삭을 따라 수행된다. 축삭 말단 및 신경이 조절하는 (자극하는) 근육 또는 샘 사이에, 시냅스 또는 연접틈새라 불리는 갭이 있다. 인가된 전기충격 (활동전위)이 신경 말단에 도달할 때, 신경전달물질이라 불리는 화학물질의 방출을 야기한다. 상기 화학물질은 연접틈새를 가로질러 확산되며, 연접후 막 상에 특정 구조 (수용체)와 반응한다. 상기 수용체는 이어서 활성화 또는 여기되며, 이의 활성화는 궁극적으로 근육 수축과 같은 생물학적 반응을 야기하는 일련의 화학 사건을 야기한다. 신경전달물질 방출, 확산 및 수용체 활성화를 포함하는 과정은 집합적으로 전달로 불린다. 많은 유형의 전달이 있으며, 이는 관련된 구체적인 신경전달물질에 대해 명명된다. 그리하여, 콜린성 전달은 신경전달물질인 아세틸콜린의 방출, 및 시냅스 후 수용체의 활성화를 포함한다. 수용체에 결합하고 활성화하는 것은 작용제라 불린다. 그리하여, 아세틸콜린은 모든 콜린성 수용체에 대한 내인성 작용제이다.
중추신경계를 떠난 후에, 골격근에 대한 체신경은 신경 말단 및 근육 사이에 자극하는 단지 하나의 시냅스를 가진다. 상기 시냅스에서 신경전달물질은 아세틸콜린이다. 그리하여, 상기 미오-(근육용)-신경 연접은 콜린성 전달의 하나의 자리이다. 상기 연접 후 수용체는 운동종판이라 불린다. 체신경과 대조적으로 자율신경은 중추신경계 및 자극된 구조 (말단 기관) 사이에 부가적인 시냅스를 가진다. 상기 시냅스는 신경절이라 불리는 구조에 있으며, 이는 신경-대-말단 기관 연접 대신에 신경-대-신경 연접이다. 그러나, 체신경처럼, 자율신경은 또한 최종 신경-대-말단 기관 시냅스를 가진다. 자율 신경절에서 신경전달물질은 또한 아세틸콜린이므로; 이는 콜린성 전달의 또 다른 자리를 나타낸다. 운동종판 및 신경절 수용체는 또한 외적으로 부가된 니코틴에 의해 활성화될 수 있다. 그리하여, 니코틴은 니코틴성, 콜린성 수용체라 불리는 콜린성 수용체의 특정 서브패밀리에 대한 작용제이다.
자율신경계의 2가지 해부학적으로 및 기능저으로 별개의 부류가 있다: 교감 신경 및 부교감 신경. 2가지 신경의 신경절이전섬유는 기능적으로 동일하며, 이는 신경절이후섬유에서 활동전위를 개시하기 위해 신경절에서 니코틴성, 콜린성 수용체를 자극한다. 그러나, 부교감 신경의 신경절이후섬유는 콜린성이다. 교감 신경의 신경절이후섬유는 항상 노르에피네프린을 분비하지는 않지만 일반적으로, 분비한다. 자율신경계의 부교감 신경의 신경절이후섬유에 의해 자극된 콜린성 수용체는 또한 독버섯인 아마니타 무스카리아 (Amanita muscaria)에서 소량 발견되는 작용제인 외부적으로 첨가된 무스카린에 의해 활성화될 수 있다. 이는 무스카린성 콜린성 수용체라 불리는 제2 서브세트의 콜린성 수용체를 구성한다.
신경절에서 수용체 및 운동종판 양자가 니코틴에 반응하지만, 이는 실제로 2가지 독특한 서브그룹의 니코틴 수용체를 구성한다. 콜린성 수용체의 3가지 패밀리의 각각은 내인성 아세틸콜린 또는 첨가된 작용제에 의해 이의 활성화를 막기 위해 특정 수용체 길항제에 의해 차단될 수 있다. 그리하여, 자율신경계의 부교감 신경의 신경절이후섬유에 의해 자극된 콜린성, 무스카린성 수용체, 교감 및 부교감 신경절 양자에서 콜린성, 니코틴성 수용체, 및 체신경계의 미오신경 연접 (운동종판)에서 콜린성 니코틴성 수용체에 대한 특정 차단제가 알려져 있다. 상기 수용체가 차단될 때, 이의 정상적인 및 연속적인 활성화와 연관된 계속적인 생물학적 활성이 상실된다. 예를 들면, 운동종판의 차단은 보편화된, 이완 마비를 초래한다.
자율신경계의 교감신경에서 특정 이상 섬유가 존재한다. 예를 들면, 땀샘으로 가는 교감 신경절이후 신경은 대부분의 기타 교감 섬유처럼 아드레날린성 대신에 콜린성이며, 이는 무스카린성 수용체를 자극한다. 부신에 대한 교감 신경은 모든 자율 신경절처럼 니코틴성이 수용체를 자극하나, 신경절이후섬유가 없다. 상기 샘 자체는 신경절이후 교감 섬유와 유사하나, 신경전달물질을 분비하는 대신에, 혈류로 에피네프린 및 노르에피네프린을 분비하며, 거기에서 호르몬으로서 기능한다. 상기 호르몬은 신체를 통해 아드레날린성 수용체를 활성화시킨다.
척수는 말초신경계 (예를 들면, 체신경 및 자율신경 모두)에서 뇌로 감각 정보를 전도하며, 또한 뇌에서 다양한 효과기 (예를 들면, 골격근, 심근, 평활근, 또는 샘)로 운동 정보를 전도한다. 척수는 또한 중요하지 않은 반사 중심으로서 이용된다.
뇌는 척수뿐만 아니라 이의 자신 (예를 들면, 뇌) 신경 (예를 들면, 삼차신경, 속귀 신경, 후각 및 시신경)으로부터 감각 자극을 받으며, 이의 부피 및 계산능의 대부분을 이의 다양한 감각 자극을 가공하고, 적당한 조절된 운동 출력을 개시하는데 기여한다. 척수 및 뇌 양자는 백색 물질 (예를 들면, 미엘린 수초로 각각 코팅된 축삭 다발) 및 회색 물질 (예를 들면, 시냅스로 각각 덮힌 수상돌기 및 세포체의 덩이)를 포함한다.
척수 및 뇌 양자는 수막으로서 알려진 연결조직의 3가지 연속 시트에 덮힌다. 바깥쪽에서부터, 척추동물의 내부의 뼈 표면에 대해 압착된 경질막 및 두개골; 거미막; 및 연질막이 있다. 거미막 및 연질막 사이의 영역은 뇌척수액 (CSF)으로 채워진다.
중추신경계의 상기 CSF는 유일하다. 중추신경계의 세포는 신체의 나머지에서 세포의 ECF로서 이용되는 유체와 상이한 CSF에 잠긴다. 뇌에서 모세관을 떠나는 유체는 모세관의 내피 세포 사이의 밀착결합의 시스템인 혈액-뇌 장벽 때문에 "정상적인" 것보다 훨씬 적은 단백질을 포함한다. 상기 장벽은 많은 치료 약물이 뇌에 도달하는 것을 막기 때문에 의약에서 문제를 야기한다. 상기 뇌척수액 (CSF)은 맥락막총의 분비이다. CSF는 척수의 중추 뇌척수관을 통해 및 뇌에서 4개의 심실의 상호연결된 시스템을 통해 중추신경계를 통해 차단되지 않고 흐른다. CSF는 뇌에서 빠져나가는 정맥을 통해 혈액으로 되돌아간다.
척수는 척수와 정렬되는 31 쌍의 척수신경을 포함한다. 이는 각각이 감각 및 운동 축삭 양자를 포함하므로 "혼합" 신경이다. 그러나, 척주 내에, 감각 축삭은 이의 세포체가 위치하는 후근신경절 내로 통과한 후, 척수 자체 내로 통과하는 반면, 운동 축삭은 혼합 신경을 형성하기 위해 감각 축삭과 합쳐지기 전에 전근으로 들어간다.
상기 척수는 2가지 주요 기능을 가진다. 이는 말초신경계의 대부분을 뇌에 연결한다. 감각 뉴런을 통해 척수에 도달하는 정보 (예를 들면, 신경충격)은 뇌로 전달된다. 뇌의 운동 영역에서 발생하는 신호는 척수로 다시 여행하고 운동 뉴런에서 떠난다. 척수는 또한 회피반사처럼 일부 간단한 반사에 관련된 중요하지 않은 조절 중심으로서 작용한다. 일부 뇌신경 (예를 들면, 시신경 및 후각 신경)은 단지 감각 축삭을 포함하는 반면, 일부 뇌신경 (예를 들면, 눈돌림신경 (예를 들면, 안구 근육을 조절))은 단지 운동 축삭을 포함한다.
신호는 척수로 위로 횡단한다. 예를 들면, 신체의 왼쪽에서 척수에 도달하는 충격은 결국 뇌의 오른쪽까지 뻗쳐 있는 길로 통과하며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 특정 경우에, 상기 횡단은 충격이 척수에 들어가자 마자 일어난다. 기타 경우에, 이는 길이 뇌 자체에 들어갈 때까지 일어나지 않는다.
뇌신경은 뇌의 신경 조직에서 나온다. 이의 표적에 도달하기 위해, 이는 결국 두개골에 있는 구멍을 통해 두개골을 출입한다. 그리하여, 이의 이름은 두개골과의 이의 연관으로부터 유래된다. 뇌신경의 기능은 척수와 관련된 신경인 척수신경과 유사하다. 뇌신경의 운동 성분은 뇌에 위치한 세포로부터 유래된다. 상기 세포는 결국 근육 (예를 들면, 눈 운동, 횡경막 근육, 자세에 이용되는 근육 등), 샘 조직 (예를 들면, 침샘), 또는 전문화된 근육 (예를 들면, 심장 또는 위)을 조절하는 두개골에서 축삭 (예를 들면, 뇌 밖의 축삭 다발, 신경을 스스로 포함하는 다발)을 보낸다.
뇌신경의 감각 성분은 뇌 밖에 위치하는 세포의 집합으로부터 유래한다. 신경 세포체의 상기 집합은 감각 신경절이라 불린다. 이는 척수와 연관된 후근절과 기능적으로 및 해부학적으로 유사하다. 일반적으로, 뇌신경의 감각 신경절은 2가지로 분류되는 가지에서 나온다: 뇌로 들어가는 가지 및 감각 기관에 연결된 가지. 감각 기관의 예는 피부에서 압력 또는 통증 센서이며, 혀의 맛 수용체와 같은 더욱 전문화된 센서이다. 전기충격은 신경절을 통해 감각 기관에서 뇌로 들어가는 감각 가지를 통해 뇌로 전달된다. 요약하면, 뇌신경의 운동 성분은 신경충격을 뇌에서 뇌 밖의 표적 조직으로 전달한다. 감각 성분은 신경충격을 감각 기관에서 뇌로 전달한다.
그리하여, CNS는 상행 감각 경로 (예를 들면, 뇌 중심으로 올라가는 체감각 경로) 및 하강 운동 또는 조절 경로 (예를 들면, 뇌에서 척수로 내려가는 신체 운동을 조절)에 의해 연결된다.
말초신경계와 달리, 중추신경계 축삭 (예를 들면, 척수 축삭)에 대한 손상은 지금까지 복구가능하지 않아, 신경 기능의 영원한 손상 (예를 들면, 마비)을 초래한다.
척수 손상은 척주관 내의 뉴런의 임의의 손상을 일반적으로 말한다. 척수 손상은 다양한 사건 (예를 들면, 척주 또는 척수 자체에 대한 외상 또는 질환)으로부터 발생할 수 있다. 대부분의 척수 손상은 뼈의 골절을 야기하는 척주에 대한 외상 또는 척수의 조임을 생성하는 골주의 전위와 함께 인대의 찢어짐의 결과이다. 부러진 목 및 부러진 등, 또는 척추 골절의 대부부은 임의의 척수 손상을 야기하지 않으나; 척추 외상이 발생하는 경우의 10-14%에서, 상기 손상은 매우 심각하여, 척수에 대한 손상을 초래한다.
척수 손상을 갖는 환자는 종종 사지마비 (바람직하게는 사지마비) 또는 하반신마비를 갖는 것으로 진단된다. 사지마비는 경추 척수에 대한 손상을 말하며, 하반신마비는 경추 척수 아래의 손상을 말한다. 사지마비를 갖는 환자는 하반신마비를 갖는 환자보다 약간 더 흔하다.
사고 현장에서 죽는 사람을 포함하지 않는 척수 손상 (SCI)의 매년 발생은 미국에서 인구 100만명당 대략 40 케이스 또는 매년 대략 11,000 새로운 케이스라고 평가된다. 오늘날 살아서 SCI를 갖는 미국 사람의 수는 인구 100만명당 721 내지 906 명으로 평가된다. 이는 183,000 내지 230,000명에 해당한다.
척수 손상을 갖는 환자에 대한 치료 선택은 제한된다. 다양한 접근이 제한된 성공으로 SCI를 치료하기 위해 이용되어 왔다 (예를 들면, Richardson et al, Nature 284, 264-265 (1980); Bradbury et al., Nature 416, 636-40 (2002); Schnell and Schwab, Nature 343, 269-72 (1990); GrandPre and Strittmatter, Nature 417, 547-51 (2002); Liu et al., J Neurosci 19, 4370-87 (1999); Lu et al., J Neurosci 24, 6402-9 (2004); Qiu et al., Neuron 34, 895-903 (2002); Nikulina et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 8786-90 (2004); Pearse et al., Nat Med 10, 610-6 (2004); McDonald et al., Nat Med 5, 1410-2 (1999); Shaw et al, J Craniofac Surg 14, 308-16 (2003); Teng et al, Proc Natl Acad Sci USA 99, 3024-9 (2002) 참고). 종종, SCI를 갖는 환자는 심각한 영원한 장애로 남게 된다. 척수 손상 및 기타 손상 또는 신경 세포 손상을 초래하는 질환의 치료는 상행 (예를 들면, 체감각)뿐만 아니라 하행 (예를 들면, 운동) 축삭 섬유를 재생하기 위한 치료 및 처리의 불능으로 인해 제한되어 왔다. 더욱이, 척수의 전방-후방 (A-P) 축을 따라 축삭을 유도하는 분자 기작이 알려져 있지 않다.
축삭 연결은 수많은 뉴런을 뒤얽힌 망으로 감는 A-P 및 등-배 (D-V) 신경축을 따라 패터닝된다. D-V 축을 따른 축삭 유도는 최근에 수많은 실험 시스템에서 연구의 주요 촛점이었다. 4 부류의 축삭 유도 분자가 기재되어 왔다 (예를 들면, Tessier-Lavigne and Goodman, 1996 참고): 원거리 유인제, 원거리 기피제, 접촉 매개 유인제 및 접촉 매개 기피제.
등 척수 맞교차 뉴런은 몇 가지 상행 체감각 경로, 예를 들면, 뇌에 통증 및 온도 감각을 보내는 척수시상로를 형성한다. 맞교차 뉴런의 세포체는 등 척수에 위치한다. 배아 발생 동안, 맞교차 뉴런은 축삭을 배 중간선에 튀어 나오게 한다. 일단 마루판에 도달하면, 이는 중간선과 교차하며, 척수의 맞은편으로 들어간다. 중간선 교차 후에, 맞교차 축삭은 뇌 쪽으로 현저하게 예리한 전방 회전을 한다. 척수의 전방-후방 길이를 따라 모든 등 척수 맞교차 축삭은 중간선 교차 후에 전방으로 돌출된다. 맞교차 축삭의 초기 배 성장은 확산가능한 화학유인제인 Netrin-1의 구배에 의해 조절된다 (예를 들면, Serafini et al., 1994; Kennedy et al., 1994; Serafini et al., 1996 참고). 축삭이 중간선을 교차할 때, 이는 Netrin-1에 대한 반응성을 상실한다 (예를 들면, Shirasaki et al., 1998 참고). 흥미롭게도, 중간선 교차 동안 Netrin-1에 대한 반응성을 상실하는 반면, 맞교차 축삭은 중간선 및 배 척수에 위치한 몇 가지 화학기피제에 대한 반응성을 얻는다 (예를 들면, Zou et al., 2000 참고). 상기 기피제는 축삭이 반대편 배 척수로 빗나가고, 마루판을 재교차하는 것을 막음으로써 중간선으로부터 축삭을 축출하고, 축삭을 이의 등-배 곡선에서 전방-후방 축을 따른 경도 경로로 전환하는 것을 도우므로; 축삭은 이의 경도 경로로 "압착"된다 (예를 들면, Zou et al., 2000 참고).
성상교세포증(예를 들면, 성상세포 증식 및 흉터 형성)을 동시에 저해하면서 뉴런 성장 및 재생 (예를 들면, SCI 또는 기타 손상 형태를 따름)을 변경하는 (촉진 또는 저해) 신규 조성물 및 방법이 요구된다. 뉴런 성장 및 재생에 대한 신규 조성물 및 방법은 또한 뉴런 기능장애를 포함하는 기타 질환, 예를 들면, 신경퇴행성 질환을 갖는 환자의 치료에 적용될 수 있었다. 구체적으로, 치료학적으로 이용될 수 있는 (예를 들면, 손상 또는 질환에 따르는 대상에서 마비를 막기 위해) 상행 및 하행 축삭 성장 (예를 들면, 척수에 대한 손상을 따름)을 개선할 수 있는 조성물 및 방법이 요구된다.
따라서, 본 발명은 세포 (예를 들면, 신경 전구세포 및 뉴런)의 분화 및 성장을 변경 (예를 들면, 확대 또는 촉진)하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 자기조립 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물 (예를 들면, (예를 들면, 세포를 캡슐화하고, 세포 분화를 촉진할 수 있는 (예를 들면, 신경돌기 성장) 나노 섬유를 생성하는 (예를 들면, 자기 조립하는) 또는 용액 중에) 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 연구, 임상 (예를 들면, 치료) 및 진단 세팅에 용도를 발견한다.
생물학에서 리간드 및 수용체 사이의 분자 인식은 에피토프의 적당한 현시를 요한다. 펩티드 에피토프 (예를 들면, 부착 리간드)는 세포 부착, 부착 및 세포 신호전달 경로 (예를 들면, 세포 증식, 분화 및 조절 대사 활성의 유지를 초래하는 경로)의 촉진에 중요한 역할을 한다. 최근에, 생물학적 사건을 야기하기 위해 인공적인 에피토프를 갖는 세포 구조를 모방하는 골격를 디자인하는데 큰 관심이 있어 왔다 (예를 들면, 재생 의약 또는 표적화된 화학요법에 이용하기 위해). 세포 반응에서 차이가 상기 인공적인 세포 골격 상에 신호의 분포 및 구조 현시에서 변화와 함께 보고되었다. 예를 들면, 세포 부착 리간드 사이에 나노스케일 분리를 변화하는 것은 세포의 신호 인식 및 이은 증식을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 생물질을 합성하기 위해 이용되는 다양한 방법 중에서, 자기 조립은 세포를 캡슐화하고, 인 시투 또는 생체 내 조립하는 분자 용액으로부터 골격을 생성하기 위한 특히 매력적인 도구이다.
세포를 저장 또는 유인한 후, 세포 증식 및 분화를 이끄는 인공적인 3차원 (3D) 골격은 재생 의약, 약물 스크리닝, 및 연구 용도에서 용도를 발견한다. 초기 연구는 생체 내에서 골격을 이식함으로써 또는 이를 생물반응기에서 유지한 후 이식함으로써 세포 접종 인공 골격을 이용한 조직 재생이 가능하다는 것을 입증하였다 (예를 들면, Langer and Vacanti, Science 260, 920 (1993); Lendlein, R. Langer, Science 296, 1673 (2002); Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 3024 (2002); Lu et al, Biomaterials 21, 1837 (2000); Niklason., Science 284, 489 (1999); Nehrer et al., J. Biomed. Mater. Res. 38, 95 (1997); Atala et al., J. Urol. 150, 745 (1993); WaId et al., Biomaterials 14, 270 (1993); Yannas, Science 215, 174(1982) 참고). 대부분의 이전의 연구에서 이용된 골격 물질은 생분해성이며, 비생활성 중합체, 예를 들면, 폴리(L-락트산) 및 폴리(글리콜산) (예를 들면, Mooney et al., Biomaterials 17, 1417 (1996); Mikos et al., Biomaterials 15, 55 (1994) 참고)뿐만 아니라, 생체중합체, 예를 들면, 콜라겐, 피브린, 및 알기네이트 (예를 들면, Lavik et al., Methods Mol. Biol. 198, 89 (2002); Hsu et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2404 (2000); Chamberlain et al., J. Neurosci. Res. 60, 666 (2000); Butler et al., Br. J. Plast. Surg. 52, 127 (1999); Orgill et al., Plast. Reconstr. Surg. 102, 423 (1998); Chang et al., J. Biomed. Mater. Res. 55, 503 (2001); Atala et al., J. Urol. 150, 745 (1993) 참고)이었다. 상기 중합체 골격은 전형적으로 재생되는 조직의 세포를 이용하여 접종된 미리제작된 다공성 물체, 직물, 또는 필름이다. 생체중합체의 경우에, 골격의 통상적인 형태는 세포가 캡슐화될 수 있는 무정형 겔이다 (예를 들면, Lim and Sun, Science 210, 908 (1980); Hortelano et al., Blood 87, 5095 (1996); Xu and Liu, FASEB J. 16, 213 (2002) 참고).
본 발명의 발달 과정 동안 수행된 실험은 세포 분화를 유도하며, 펩티드 친양쪽성체의 수용액으로부터 자기 조립에 의해 형성되는 것으로 알려진 펩티드 서열을 혼입하는 고체 골격의 형성(예를 들면, 생체 내)을 입증하였다. 특정 구현예에서, 상기 골격은 양친성 분자의 응집에 의해 형성된 나노섬유 망을 포함한다 (예를 들면, 수용액에 신경 전구세포 현탁액의 첨가에 의해 또는 뇌척수액에 노출에 의해 야기됨). 상기 나노섬유는 특정 세포 반응을 위해 펩티드 서열을 통해 맞추어질 수 있으며, 상기 시스템에 의해 형성된 골격은 간단히 액체 (예를 들면, 펩티드 친양쪽성체 용액)을 주입함으로써 살아있는 세포 및/또는 조직에 전달될 수 있다. 실험은 추가로 인공 골격이 성상세포 분화를 억제하면서 신경 전구세포의 뉴런으로 분화를 유도할 수 있다는 것을 입증하였으며 (예를 들면, 실시예 1-8 참고), 또한 본 발명의 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물의 손상 받은 척수를 갖는 대상에 투여 (예를 들면, 손상 받은 척수 내로 주입)가 손상 자리에서 성상교세포증을 감소시키고, 감각 및 운동 섬유의 실질적인 재생을 촉진시키고, 행동 회복을 현저하게 증진시킨다는 것을 입증하였다 (예를 들면, 상기 치료 전에 마비된 팔다리의 운동성 (예를 들면, 실시예 9-13 참고)).
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 표적 (예를 들면, 신경 전구세포, 뉴런 또는 기타 세포 표적)에 펩티드 에피토프의 전달 및/또는 현시를 위한 펩티드 친양쪽성체 (PA)를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 펩티드 에피토프의 전달 및/또는 현시는 뉴런 성장 (예를 들면, 신경돌기 성장 (예를 들면, 하강 (예를 들면, 운동) 및/또는 상승 (예를 들면, 감각) 섬유의 생성 (예를 들면, 병터를 통해)) 및/또는 증식을 촉진한다. 기타 바람직한 구현예에서, 본 발명은 뉴런 (예를 들면, 생체 내, 생체 외, 또는 시험관 내)을 제공하는 단계 및 상기 뉴런에 본 발명의 PA를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 뉴런 성장을 변경하는 (예를 들면, 촉진, 용이 또는 촉진) 방법을 제공한다. 특정 바람직한 구현예에서, PA를 포함하는 조성물은 뉴런과 접촉할 때 나노섬유 겔을 형성한다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런은 척수 (예를 들면, 손상된 척수 (예를 들면, 외상 척수 손상에 의해 손상된 척수)) 내의 뉴런이다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런은 감각 뉴런이다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런은 운동 뉴런이다. 특정 구현예에서, PA를 포함하는 상기 조성물은 동시에 뉴런 (예를 들면, 운동 또는 감각 섬유) 성장을 촉진하면서 성상교세포 성장 및 흉터 형성을 저해한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 PA를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것은 대상에서 행동 개선을 초래한다 (예를 들면, 상기 대상은 치료 전에 마비된 팔다리 (예를 들면, 다리 또는 팔)을 움직일 수 있다). 특정 구현예에서, PA를 포함하는 상기 조성물은 하나 이상의 기타 물질 (예를 들면, 성장인자 (예를 들면, 신경영양인자) 또는 축삭 성장의 저해제의 저해제)을 포함한다.
본 발명의 전형적인 방법 및 조성물은 하기에 더욱 상세히 기재된다. 그러나, 본 발명은 본원에 기재된 조성물 및 방법에 제한되지 않는다. 당업자는 부가적인 조성물 및 용도가 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 이해한다.
I. 펩티드-친양쪽성체 조성물
본 발명에 이용된 펩티드-친양쪽성체 (PA) 조성물은 당업자에게 주지된 제조 기술을 이용하여 합성될 수 있으며 - 바람직하게는, 펩티드의 N- 또는 C-말단에 부착된 소수성 모이어티, 모노 또는 디-알킬 모이어티를 갖는 펩티드 성분의 N-말단의 알킬화 또는 기타 변형을 갖는 표준 고체상 화학은 합성 및 천연 시스템 양자에서 물에 이의 응집 및 이차 구조에 영향을 줄 수 있다. 베타-가닥 입체형태에 대한 선호를 갖는 이온성 펩티드에 커플링된 충분한 수의 탄소 원자를 갖는 소수성, 탄화수소 및/또는 알킬 꼬리 성분은 특정 구현예에서 나노섬유 구조로 조립 (예를 들면, 생체 내)하는 친양쪽성체를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 상기 친양쪽성체의 원뿔 모양은 또한 상기 조립에 효과를 가질 수 있다. 자기 조립은 체액 (예를 들면, 뇌척수액)에 의해 야기될 수 있다.
본 발명은 이용된 펩티드 친양쪽성체(들)에 의해 제한되지 않는다. 정말로, 본원에 기재된 것뿐만 아니라 (예를 들면, 실시예 1-13, 및 도 6, 및 14-17) 미국특허출원 20050272662, 20050209145, 20050208589, 20040258726, 20040022718, 20040018961, 20040001893, 및 국제출원 WO/05056576, WO/05056039, WO/05003292, WO/04106359, WO/04072104, WO/04046167, WO/04018628, WO/04003561, WO/03090255, WO/03084980, WO/03070749, WO/03054146 (이의 각각은 본원에 전체적으로 원용에 의해 포함됨)에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 펩티드 친양쪽성체가 본 발명에 유용한 것으로 고려된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드 친양쪽성체 (PA)는 기능성 영역 (예를 들면, 펩티드 에피토프 (예를 들면, IKVAV 및/또는 YIGSR 서열) 포함)에 연결된 구조 영역 (예를 들면, 펩티드 친양쪽성체의 팩킹 및 자기 조립을 변경 및/또는 영향을 줄 수 있는 서열 (예를 들면, β-시트) 포함)에 연결된 유기 모이어티 (예를 들면, 소수성 영역 (예를 들면, 선형 펩티드 사슬 (예를 들면, 팔미토일기) 또는 소수성 고리 구조 (예를 들면, 피렌부틸) 포함)를 포함한다. 상기 펩티드 모이어티는 펩티드 친양쪽성체의 전하를 결정할 수 있는 하나 이상의 기타 영역 (예를 들면, 하전된 아미노산 또는 이의 서열 (예를 들면, 소수성 영역, 구조 영역 또는 기능성 영역에 인접함)을 포함할 수 있다. 트리거 (trigger)의 적용 또는 노출시 (예를 들면, pH 또는 이온 농도의 변화 (예를 들면, 뇌척수액, 세포 배양 배지 등에 노출을 동반함)), PA 분자는 수성 매질에서 나노섬유로 자기 조립한다. 특정 구현예에서, 반대 전하의 PA는 인 시투로 혼합되어 정전기적으로 안정화된 겔 (예를 들면, 하나 또는 하나 이상의 유형의 펩티드 에피토프)을 생성할 수 있다.
다양한 바람직한 구현예에서, 상기 화합물 또는 조성물의 소수성 성분은 양친성 양상 및 나노섬유 조립/형성 (예를 들면, 생체 내 또는 생리적 pH에서)을 제공하기에 충분한 길이이다. 전형적으로, 상기 성분은 기타 소수성, 탄화수소 및/또는 알킬 성분이 당업자에게 주지될 수 있는 바와 같이 유사한 구조적 또는 기능적 효과를 제공하기 위해 이용될 수 있지만, 약 C6 이상의 탄화수소 모이어티일 수 있다. 상기 소수성 성분은 제한 없이 콜레스테롤, 비페닐 및 p-아미노벤조산을 포함한다.
특정 PA는 뇌척수액과 접촉할 때, 강한, 실제적으로 순간적인 겔을 형성한다 (예를 들면, 도 14의 상단에 보여준 PA). 본 발명의 발달 동안, 마우스 척수 내로 상기 분자의 희석액을 주입하려는 시도는 이용된 작은 구멍 바늘의 막힘을 초래하였다. 따라서, 상기 문제는 더 느린 자기 조립을 촉진하는 노력에서 몇 가지 변형을 함으로써 극복되었다. 먼저, A4 섹션이 SLSL 서열로 대체되었다. 상기 교대의 극성-비극성 서열은 자기 조립에 대한 소수성 추진력을 줄이고, 팩킹을 더욱 어렵게 하기 위해 의도되었다. 상기 휘기 쉬운 G3 서열은 다시 팩킹을 방해하기 위해 더욱 뻣뻣한 A3로 대체되었다 (예를 들면, 도 15, 상단 및 하단 PA 참고). 상기 PA의 겔화는 실제로 시각적 관찰 및 진동하는 유변물성 측정기술에 의해 측정된 바와 같이, 원래의 PA 분자의 것보다 실제로 더 느리고 (약 3-5분), 덜 튼튼하였다. 도 15의 바닥 상의 PA는 팔미틸 꼬리에 대해 피렌부틸 꼬리의 치환을 제외하고, 도 15의 상단에 도시된 것과 동일하다. 상기 변화는 PA 분자를 형광으로 만들므로, 조직학적 섹션에서 PA를 추적하는데 적합하다. 그리하여, 특정 구현예에서, 상기 PA는 가시적 및 추적 목적을 위해 형광 영역 (예를 들면, 피렌부틸 꼬리)를 포함할 수 있다.
부가적으로, PA는 동시조립되는 또 다른 PA로부터, 또는 생리학적 환경에서 기타 펩티드 및 단백질로부터 특정 PA를 구별하기 위해 태그를 제공하기 위해 헤테로원자 (예를 들면, Br, I, 또는 F)의 포함과 함께 배치될 수 있다. 예를 들면, 도 16은 3가지 상기 PA를 보여준다. 예를 들면, 도 16의 상단에 도시된 PA는 4번 탄소 상의 히드록실기를 브롬 원자로 대체하는 타이로신 대신에 브로모페닐알라닌을 포함한다. 도 16의 중간에서 PA는 고리 상의 3 및 5번 위치에 부가된 요오드를 가진다. 특정 구현예에서, 브롬 및 요오드는 x-선 산란 특성으로 인해 이용될 수 있다. 도 16의 바닥에 도시된 PA는 6개의 발린 감마 양성자의 불소 원자로의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 불소는 천연 조직에서 이의 희귀성으로 인해 이용되며, EDX를 이용하여 확인될 수 있다.
대안적으로, PA는 하나 이상의 분지기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, PA 내의 분지기는 펩티드 에피토프(예를 들면, 표적 (예를 들면, 뉴런)에 대한)의 유용성 및/또는 노출을 개선한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 분지기를 갖는 PA는 이의 N-말단에 변형된 라이신 잔기를 가진다 (예를 들면, 엡실론 탄소에 펩티드 결합에 의해 부착된 팔미틸 꼬리를 가짐). 특정 구현예에서, 상기 N-말단은 상기 영역에서 더욱 소수성을 유지하기 위해 유리 아민보다 아미드인 것으로 선택된다. 특정 구현예에서, 베타-시트 촉진 A3L3 서열은 라이신에 이은 펩티드 에피토프 (예를 들면, IKVAV 또는 YIGSR) 서열이 부착되는 제2 변형된 라이신의 C-말단에 부착된다. 그리하여, 상기 구현예에서, V보다 I가 반대의 합성 반응에서 적당한 키랄성을 유지하기 위해 꼬리로부터 가장 멀다. 도 17의 상단에 도시된 PA는 상기 PA의 전형이며, N-말단에 상기 분자의 주요 골격에 첨가된 유리 라이신을 가지는 반면, 도 17의 바닥에 도시된 PA는 상기 라이신에 첨부된 YIGSR 서열을 보여준다. 특정 구현예에서, 상기 방식으로 제형화된 PA는 강한 양전하이며, 낮은 pH에서 조금 가용성이므로; pH가 생리적 범위로 조정될 때, 이는 겔을 형성한다.
특정 구현예에서, PA를 포함하는 조성물은 또한 하나 이상의 성장인자 (예를 들면, 신경영양인자 (예를 들면, 대상에 투여될 때 (예를 들면, PA를 포함하는 용액의 주사를 통해), PA는 상기 신경영양인자를 포함하는 나노섬유 겔을 형성하도록))를 포함하거나 또는 상기 인자로 투여될 수 있다. 신경영양인자는 중추신경계 (CNS) 및 말초신경계의 뉴런의 발생 및 생존을 조절하는 5가지 폭넓은 세트의 펩티드 성장인자이다 (예를 들면, Huang and Reichardt. 2001 Annu. Rev. Neurosci. 24:677-736; Neet et al., 2001 Cell. Mol. Life Sci. 58:1021-1035 참고). 본 발명은 이용된 상기 유형의 성장인자에 의해 제한되지 않는다. 신경 성장인자 (NGF), 뇌유래 신경영양인자 (BDNF), 신경영양인자-3 (NT-3), 신경영양인자-4/5 (NT-4/5), 섬모 신경영양인자 (CNTF), 백혈병 저해인자 = 콜린성 신경분화 인자 (LEF/CDF), 카디오트로핀-1, 염기성 섬유모세포성장인자 (bFGF), 산성 섬유모세포성장인자 (aFGF), 섬유모세포성장인자-5 (FGF-5), 인슐린, 인슐린유사성장인자 I (IGF-I), 인슐린유사성장인자 II (IGF-II), 전환성장인자 βl (TGFβl), 전환성장인자 β2 (TGFβ2), 전환성장인자 β3 (TGFβ3), 액티빈, 신경교세포유래 신경영양인자 (GDNF), 미드카인헤파린 결합 신경영양인자 (HBNF), 플레이오트로핀, 표피성장인자 (EGF), 전환성장인자 α (TGFα), 신경초종유래 성장인자, 헤레굴린 (뉴레귤린, ARIA), 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 축삭 리간드-1 (Al-1), elf-1, ehkl-L, 및 LERK2뿐만 아니라, 임상 시험에서 평가된 인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 신경영양인자가 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, PA를 포함하는 조성물은 또한 신경성장저해제의 활성 및/또는 발현을 저해 (예를 들면, 차단)하는 하나 이상의 물질 (예를 들면, 대상에 투여될 때 (예를 들면, PA를 포함하는 용액의 주사를 통해), 상기 PA는 신경성장저해제의 저해를 포함하는 나노섬유 겔을 형성하도록)을 포함하거나 또는 상기 물질로 투여될 수 있다. 본 발명은 이용된 상기 유형의 저해제에 의해 제한되지 않는다. 정말로, 미엘린 저해제, Nogo, Ryk 및 Ryk 유사 저해제, sFRP 및 sFRP 유사 물질, MAG, Omgp, 및 Wnt 저해제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 저해제가 이용될 수 있다. 아교 흉터에 존재하는 기타 저해제, 예를 들면 CSPG가 또한 축삭 생성을 저해할 수 있다. CSPG가 축삭 재생의 저해제에 대한 실질적인 활성 성분인지 또는 CSPG와 연관되는 기타 분자가 활성 성분인지 충분히 이해되지 않는다. 정말로, 본 발명은 손상 후에 축삭 성장을 막는 임의의 저해제를 저해하는 것을 고려한다. 당업자는 상기 저해제가 차단될 수 있는 많은 방식이 있으며, 본원에 포함된 하기 교시에 의해, 본 발명의 명세서에서 상기 저해제를 차단하는 수단을 개발할 수 있을 것이라는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 축삭 성장 저해제의 저해제는 상기 저해제에 대해 특이적인 항체 및/또는 siRNA (예를 들면, 본 발명의 PA를 포함하는 조성물에 포함된 발현 벡터 또는 카세트로부터 발현됨)를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, PA를 포함하는 조성물은 또한 Wnt, Netrin, Shh, 세포 부착 분자, Ig 슈퍼패밀리 멤버, 카드헤린, 인테그린, EphrinB, ECM 분자 또는 HGF를 포함하나, 이에 제한되지 않는 뉴런 성장을 유인하는 하나 이상의 물질을 포함하거나 또는 상기 물질로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, PA를 포함하는 조성물은 또한 Semiphorin, Netrin, Slit, Wnt, BMP, Ephrin 또는 Ig 슈퍼패밀리 멤버를 포함하나, 이에 제한되지 않는 뉴런 성장을 기피하는 하나 이상의 물질을 포함하거나 또는 상기 물질로 투여될 수 있다.
부가적으로, 축삭 유도에 역할을 하는 많은 단백질 유인제 및 기피제가 존재한다. 또한, 많은 상기 축삭 유도 분자는 이작용기성이다: 반응하는 성장 원뿔에서 수용체 조성물에 의존하여, 하나의 유형의 축삭에 대해 유인적이며, 또 다른 것에 대해서 기피적이다.
수많은 분자가 발생 동안 축삭 성장을 유도한다. 상기 화합물은 배아 발생에 중요한 역할을 하며, 성인 CNS에서 동일 또는 유사한 방식으로 기능할 수 있다.
유인제 및 기피제는 2가지 일반적인 부류인 확산성 및 비확산성으로 분류될 수 있다. 확산성 유인제는 Netrins, Shh, Wnts, 및 HGF를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 확산성 기피제는 분비된 Semaphorin, Netrin, Slit, Wnt, 및 BMP를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비확산성 유인제는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 세포 부착 분자, 예를 들면, Ig 슈퍼패밀리 멤버, 카드헤린, 및 인테그린; Ephrin; 및 ECM 분자. 비확산성 기피제는 Ephrin, Ig 슈퍼패밀리 멤버, 및 막 결합 Semaphorin를 포함하나, 이에 제한되지 않는다
당업자는 본 발명의 명세서에서 상기, 및 임의의 기타 유인제 또는 기피제를 이용할 수 있다. 예를 들면, 당업자는 하나 이상의 상기 물질을 포함하는 PA를 포함하는 조성물을 생성할 수 있다. 더욱이, 상기 조성물은 대상에서 신경돌기 성장을 촉진시키기 위해 대상에 투여될 수 있었다 (예를 들면, 손상 (예를 들면, 척수 손상) 또는 질환 (상기 질환에 의해 야기된 뉴런 분해 (예를 들면, 당뇨병) 자리).
본 발명의 명세서에서, 천연 유인제 또는 기피제가 이용될 수 있다. 또한, 상기 유인제 또는 기피제의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 돌연변이체, 및/또는 모방물이 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, PA를 포함하는 조성물은 하나 이상의 펩티드 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명은 이용된 상기 유형의 펩티드 에피토프에 의해 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 에피토프는 라미닌 내에 존재하는 임의의 신경생활성 에피토프이다 (본원에 예를 들면, 뉴런의 발생을 촉진하는 "라미닌 에피토프"로서 언급됨). 특정 구현예에서, 상기 펩티드 에피토프는 IKVAV 서열이다. IKVAV는 포유동물 뉴런과 상호작용하는 것으로 알려진 라미닌 서열이다. IKVAV는 포유동물 뉴런에서 신경돌기 성장을 촉진한다. 본 발명은 IKVAV의 이용에 제한되지 않는다. 기타 적당한 생활성 에피토프는 본 발명의 방법에서 용도를 발견한다 (예를 들면, YGSIR 서열). 본 발명의 펩티드 성분 (예를 들면, 펩티드 에피토프)은 바람직하게는 천연적으로 발생하는 아미노산을 포함한다. 그러나, 베타 또는 감마 아미노산과 같은 공지된 인공 아미노산 및 비천연 측쇄, 및/또는 히드록시산과 같은 기타 유사한 단량체를 포함하는 것의 혼입이 해당 성분이 이에 대해 펩티드 유사라는 효과와 함께 또한 고려된다.
특정 구현예에서, 라미닌 에피토프의 모방물이 이용된다. 본원에 이용된, "라미닌 에피토프의 모방물"은 천연 라미닌 에피토프와 동등한 생물학적 호라성의 허용가능한 수준을 유지할 수 있는 라미닌 천연 서열 (예를 들면, IKVAV) 이외의 임의의 분자를 말할 의도이다.
"라미닌 에피토프의 모방물"의 정의에 고유한 개념은 분자의 정의된 부분 내에 행해질 수 있고, 동등한 생물학적 활성 (예를 들면, 뉴런 성장 및 재생을 조절하는 IKVAV 서열의 능력)의 허용가능한 수준을 갖는 분자를 초래할 수 있는 변화의 수에 제한이 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 그리하여 "라미닌 에피토프의 모방물"은 본원에 폴리펩티드가 본원에 기재된 용도의 명세서에서 실질적으로 유사한 활성을 보유하는 한, 일부 또는 대부분의 아미노산이 치환될 수 있는 임의의 라미닌 에피토프 폴리펩티드로서 정의된다. 당연히, 상이한 치환을 갖는 복수의 독특한 단백질/폴리펩티드/펩티드가 용이하게 제조될 수 있으며, 본 발명에 따라서 이용될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 명세서에서, 라미닌 에피토프의 모방물은 인간 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 종 또는 생물체 유래의 라미닌 에피토프 동족체 폴리펩티드일 수 있다. 당업자는 많은 라미닌 에피토프의 모방물이 존재할 수 있으며, 통상적인 유용한 기술을 이용하여 확인될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
라미닌 에피토프의 아미노산 서열 돌연변이체는 또한 본 발명에 포함된다. 인간 및 마우스 라미닌 에피토프와 같은 임의의 종의 라미닌 에피토프의 아미노산 서열 돌연변이체는 본 발명에 고려된다. 라미닌 에피토프의 아미노산 서열 돌연변이체는 치환 돌연변이체 또는 삽입 돌연변이체일 수 있다. 삽입 돌연변이체는 전형적으로 펩티드에서 비말단 포인트에서 물질의 부가를 포함한다. 이는 몇 개의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다: 면역반응성 에피토프; 또는 단지 단일 잔기. 상기 부가된 물질은 메틸화, 아세틸화 등과 같이 변형될 수 있다. 부가적인 잔기가 상기 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있다.
아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성에 기초한다 (예를 들면, 이의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등). 아미노산 측쇄 치환기의 크기, 모양 및 유형의 분석은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 모두 양전하 잔기이며; 알라닌, 글리신 및 세린이 모두 유사한 크기이며; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 모두 일반적으로 유사한 모양이라는 것을 나타낸다.
변화를 할 때, 아미노산의 친수도 지수 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 친수도 지수가 할당되었으며, 이는 하기이다: 이소루신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글라타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질에 대한 상호작용 생물학적 기능을 부여할 때 친수도 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다 (예를 들면, 본원에 전체적으로 원용에 의해 포함된 Kyte and Doolittle, 1982 참고). 특정 아미노산이 유사한 친수도 지수 또는 스코어를 가지며, 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 기타 아미노산으로 치환될 수 있다는 것은 알려져 있다. 친수도 지수에 기초한 변화를 할 때, 친수도 지수가 +2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, +1 이내인 것은 특히 바람직하며, +0.5 이내인 것이 더 더욱 특히 바람직하다.
아미노산이 유사한 친수성 값을 가지며, 여전히 생물학적으로 동등한 단백질을 수득하는 또 다른 것으로 치환될 수 있다고 이해된다. 본원에 전체적으로 원용에 의해 포함된 미국특허 제4,554,101호에 상술한 바와 같이, 하기 친수성 값은 아미노산 잔기에 대해 할당되었다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0+1); 글라타메이트 (+3.0+1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5+1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루신 (-1.8); 이소루신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
유사한 친수성 값에 기초하여 변화할 때, 이의 친수성 값이 +2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, +1 이내인 것은 특히 바람직하며, +0.5 이내인 것이 더 더욱 특히 바람직하다.
특정 구현예에서, PA를 포함하는 조성물은 또한 하나 이상의 신경보호 물질 (예를 들면, 뇌졸중, 두부외상 및 척수 손상의 후유증을 감소시키는 것으로 알려진 버키볼 유형 물질)을 포함하거나 또는 상기 물질로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, PA 조성물은 1) 극성 또는 수용액 및/또는 본원에 기재된 하나 이상의 친양쪽성체 화합물 또는 조성물을 포함하고, 및 2) 중성 또는 생리적 조건하에 조립 겔화의 응집을 유도하기에 충분한 인자 또는 시약을 포함하는 졸-겔 시스템을 형성한다. 다양한 PA 조성물의 미셀 나노섬유로 겔화 및/또는 자기 조립은 건조, 1가 또는 다가 금속 이온의 도입 및 또는 상이하게 하전된 친양쪽성체의 조합을 통해 실질적으로 중성 및/또는 생리적 pH 조건하에 달성될 수 있다.
II. 본 발명의 펩티드 친양쪽성체 (PA)를 포함하는 조성물을 이용하는 방법
본 발명의 발달 과정 동안 수행된 실험은 신경 전구 세포가 본 발명의 방법을 이용하여 효율적으로 뉴런으로 분화될 수 있다는 것을 입증하였다 (예를 들면, 실시예 1-8 참고). 상기 세포는 현저한 양의 성상세포의 형성 없이 분화를 입증하였다 (예를 들면, 실시예 6 및 11 참고). 더욱이, 실험은 본 발명의 PA를 포함하는 조성물의 손상된 척수를 갖는 대상에 투여 (예를 들면, 손상된 척수 내로 주사)는 손상의 자리에서 성상교세포증을 감소시키고, 감각 및 운동 섬유의 실질적인 재생을 촉진시키고, 행동 회복 (예를 들면, 상기 치료 전에 마비된 팔다리의 운동성 (예를 들면, 실시예 1, 9-13 참고))을 현저하게 증진시킨다는 것을 입증하였다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 다양한 세포 유형의 캡슐화에서 용도를 발견한다. 본 발명은 특정 세포 유형에 제한되지 않는다. 예는 일차 세포 배양물, 줄기 세포 (예를 들면, 인간 또는 비인간) 및 기타 다능성 세포주, 전구세포, 신경돌기 및 상이한 발생 단계의 기타 뉴런, 및 무한증식 세포주를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 펩티드-친양쪽성체 조성물은 또한 조직 및 동물에 대한 이용에 적합하다. 본 발명의 조성물로 처리 (예를 들면, 투여된) 세포는 손상된 세포 (예를 들면, 손상된 뉴런) 또는 일반적으로 건강한 세포 (예를 들면, 뉴런 (예를 들면, 정상적인 축삭 신호전달 (예를 들면, 운동 또는 감각) 능력보다 더 큰 뉴런을 생성하기 위해 처리된 뉴런))일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 줄기 세포의 캡슐화에 이용된다. 본 발명의 방법은 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 줄기 세포에 이용하기에 적합하다. 배아 줄기 세포는 배아 줄기 세포주 및 하나의 구현예에 따라, 생식샘 조직, 생식능선, 창자간막 또는 인간 배아의 배아 난황주머니으로부터 분리된 원시생식세포 (PGCS) 유래의 배아 생식세포주를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다 (예를 들면, 미국특허 제6,562,619호 참고). 배아 줄기 세포는 또한 전술한 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 상업적인 또는 연구 공급원으로부터 수득될 수 있다. 성체 줄기 세포는 본원에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 세포 유형으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 캡슐화된 세포는 세포 (예를 들면, 신경돌기)의 증식 및 분화에 용도를 발견한다. 전술한 바와 같이, 나노섬유 겔 (예를 들면, 본 발명의 PA를 포함하는 조성물을 이용하여 자기 조립된)의 성질은 높은 국부 (예를 들면, 반데르발스 근처) 농도에서 생활성 물질 (예를 들면, 분화 또는 증식을 유도하는)의 전달을 허용한다. 높은 국부 농도를 형성하기에 바람직한 임의의 생활성 물질 (예를 들면, 펩티드)는 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 전달될 수 있다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 호르몬 (예를 들면, 펩티드), 성장인자, 분화 인자, 또는 기타 단백질 또는 소분자는 본 발명의 PA를 포함하는 조성물 내로 혼입된다 (예를 들면, 생활성 물질을 포함하는 나노섬유 겔을 생성하기 위해). 당업자는 기타 물질 (예를 들면, 펩티드)이 본 발명의 방법 및 조성물에 대해 이용될 수 있다는 것을 인식한다.
본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료된 상태 (예를 들면, 손상 또는 질환)에 의해 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신경 손상 (예를 들면, 외상 손상 (예를 들면, 척수 손상)에 의해 야기된)을 치료하기 위해 이용된다. 특정 구현예에서, 치료는 축삭 성장 (예를 들면, 재생)이 발생하는 조건하에 PA를 포함하는 조성물 (예를 들면, IKVAV 포함)을 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 대상은 척수 질환을 가질 수 있다. 임의의 척수 질환은 본 발명에 의해 고려된다. 특정 구현예에서, 상기 척수 질환은 외상 척수 손상 (전술함)이다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 척수 손상에 따른 운동 축삭 및 감각 축삭의 재생을 촉진한다 (예를 들면, 실시예 12 및 13, 도 11 및 12 참고). 특정 구현예에서, 척수 손상을 갖는 대상에서 운동 축삭 및 감각 축삭의 재생은 치료된 대상 (예를 들면, 치료 전에 마비된 (예를 들면, 부분적으로 또는 완전히) 팔다리의 운동)에서 해부학적 개선을 초래한다 (예를 들면, 실시예 13 및 도 13 참고). 상기 외상 척수 손상은 상기 대상의 마비를 초래 또는 초래하지 않을 수 있다. 상기 신경 기능장애는 임의의 기작에 의할 수 있다. 예를 들면, 세포 사멸은 급성 외상 손상 또는 퇴화의 결과일 수 있다.
신경 기능장애가 일어나는 임의의 질환 또는 상태가 본 발명에 의해 고려된다. 척수 손상 외에, 기타 예는 도파민신경세포가 퇴화를 겪는 파킨슨병 및 운동 시스템에서 신경이 퇴화를 겪는 ALS를 포함한다. 상기 경우에, 줄기 세포는 중뇌 및 척수로 이식될 수 있도록, 이의 표적과 거주하고, 적당한 연결을 할 수 있도록 개발되어 왔다. 신규 연결의 확립은 상기 신경 줄기 세포로부터 축삭의 성장을 요한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 상기 줄기 세포로부터 축삭의 재생의 성장 및 유도에 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료된 신경 손상은 신경계의 병터 또는 질환 또는 기능장애와 관련된다. 특정 구현예에서, 상기 신경 손상은 척수 손상, 두부외상 또는 뇌졸중에 기인한다. 특정 구현예에서, 상기 신경 손상은 신경퇴행성 질환에 기인한다. 특정 구현예에서, 상기 신경 손상은 화학 손상 또는 화학요법의 결과에 기인한다. 특정 구현예에서, 상기 신경 손상은 당뇨병신경병증이다.
당뇨병신경병증은 당뇨병에 의해 야기되는 신경 질환의 부류이다. 당뇨병을 갖는 사람들은 시간이 갈수록 신체 전체적으로 신경에 대한 손상을 가질 수 있다. 신경병증은 손, 팔, 발, 및 다리에서 저린감 및 종종 통증 및 쇠약을 초래한다. 문제는 또한 소화관, 심장, 및 성 기관을 포함하는 모든 기관계에서 일어날 수 있다. 당뇨병을 갖는 사람은 임의의 시간에 신경 문제를 발생할 수 있으나, 사람이 당뇨병을 갖는 시간이 길수록, 위험은 더 커진다. 당뇨병신경병증은 말초, 자율, 근위, 및 국소로서 분류될 수 있다. 각각은 상이한 방식으로 신체의 상이한 부분에 영향을 준다.
말초 신경병증은 발가락, 발, 다리, 손, 및 팔에서 통증 또는 감각 상실을 야기한다. 자율 신경병증은 소화, 창자 및 방광 기능, 석 반응, 및 호흡에 변화를 야기한다. 이는 또한 심장에 이용되며, 혈압을 조절하는 신경에 영향을 줄 수 있다. 자율 신경병증은 또한 사람이 더 이상 저혈당증의 경고 신호를 경험하지 못하는 상태인 저혈당증 (낮은 혈액 당) 무인식을 야기할 수 있다. 근위 신경병증은 대퇴부, 히프, 또는 둔부의 통증을 야기하며, 다리의 쇠약을 초래한다. 국소 신경병증은 근육 쇠약 또는 통증을 야기하면서, 하나의 신경 또는 신경 그룹의 급격한 쇠약을 초래한다. 신체에서 임의의 신경이 영향을 받을 수 있다. 그리하여, 특정 구현예에서, 본 발명은 당뇨병신경병증을 치료하고/하거나 (예를 들면, 당뇨병의 결과로서 손상된 신경에 대한 신경 기능을 재생) 당뇨병신경병증의 신호 및 증상을 치료 (예를 들면, 포만감, 구역, 구토, 설사, 또는 변비와 같은 소화 문제, 방광 기능을 갖는 문제, 성, 현기증 또는 실신을 갖는 문제, 저혈당의 경고 신호의 상실, 증가된 또는 감소된 땀 또는 눈이 빛 및 어둠에 반응하는 방법의 변화)하는 조성물 (예를 들면, PA 함유) 및 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 세포 이식 또는 기타 전략과 함께 이용되어 이의 치료 효능을 증진시킨다 (예를 들면, Wald et al, Biomaterials 14, 270 (1993); Yannas, Science 215, 174(1982); Mooney et al., Biomaterials 17, 1417 (1996); Mikos et al., Biomaterials 15, 55 (1994); Lavik et al., Methods Mol. Biol. 198, 89 (2002); Hsu et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2404 (2000); Chamberlain et al., J. Neurosci. Res. 60, 666 (2000); Butler et al., Br. J. Plast. Surg. 52, 127 (1999); Powell et al., J. Neurosci. Res. 61, 302 (2000); Cornish et al., Mol. Cell. Neurosci. 20, 140 (2002) 참고).
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 혀 신경 손상을 치료하기 위해 (예를 들면, 혀 신경 기능에 대한 신경 기능을 재생하기 위해) 이용된다. 혀 신경 상처 또는 손상은 입의 혀 및 내부 점막에서 무감각 (무감각 혀), 감각이상 (저림), 또는 감각장애 (통증 및 화상)을 초래할 수 있다. 이는 사랑니 (제삼대구치)의 발치 또는 감각, 크라운에 대한 치과 마취 주사 (신경 차단)의 합병증에 기인할 수 있다. 이는 만성 통증 증후군 또는 신경병증을 초래한다. 아래이틀 신경이 관련된다면, 입술의 저린감이 초래될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 아래이틀 신경에 대한 손상을 치료하기 (아래이틀 신경에 대한 신경 기능을 재생하기 위해) 위해 이용된다. 상기 아래이틀 신경에 대한 손상은 턱, 아래입술, 및 아래턱의 무감각, 감각이상, 또는 감각장애를 초래할 수 있다. 상기 신경은 주사에 의해 손상될 수 있으나, 사랑니 발치 동안 더욱 흔하게 손상된다. 이는 또한 치근관 절차, 기타 발치 및 임플란트의 장착에 의해 손상될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 말초 신경 차단의 합병증인 신경 손상을 치료하기 위해 (예를 들면, 상기 합병증에 대한 신경 기능을 재생하기 위해) 이용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 하나 이상의 뇌신경의 손상을 치료하기 위해 (예를 들면, 상기 뇌신경에 대한 신경 기능을 재생하기 위해) 이용된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 청각 신경병증을 치료하기 위해 (예를 들면, 청각 신경병증의 결과로서 손상된 신경에 대한 신경 기능을 재행하기 위해) 이용된다. 몇 가지 유형의 신경 손상은 국소 일차 탈수초화, 확산 일차 탈수초화, 축삭 상실, 및 이차 탈수초화 및 재수초화를 갖는 축삭 상실을 포함하는 청각 신경병증을 동반한다. 신경병증을 갖는 청각 신경 방출의 변화는 확산 일차 탈수초화 및 이차 탈수초화 및 재수초화를 갖는 축삭 상실에 대한 일시적인 동시성을 포함한다. 시간 인코딩의 변화는 연설 이해, 소리원의 국부화, 및 간격 검출과 같은 시간 자극의 정확한 인코딩을 요하는 청각 작업에 대한 대상의 손상을 설명한다. 신경병증은 또한 방출 속도를 제한하는 신경 섬유 흥분성의 변화와 관련된다. 축삭 및 탈수초화 질환 양자는 탈수초화 질환에서 행동 차단 및 축삭 질환에서 과다분극인 극도로 영향 받은 섬유의 손상된 흥분성을 동반한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 CNS, 뇌, 및/또는 척수의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 이용된다. 상기 질환은 신경학적 또는 심리학적 질환일 수 있다. 상기 질환 또는 장애는 뇌 질환, 예를 들면, 알츠하이머병, 파킨슨병, 레비소체치매, 다발경화증, 간질, 소뇌조화운동불능, 진행성 핵상마비, 근육위축가쪽경화증, 정동장애, 불안장애, 강박반응성 장애, 인격장애, 주의력결핍장애, 주의력결핍과다활동장애, 뚜렛증후군, 테이 삭스, 니만 픽크, 및 기타 지질 저장 및 유전적 뇌 질환 및/또는 정신분열병을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 뇌 또는 척수에서 뇌졸중과 같은 뇌혈관질환, 수막염 및 HIV를 포함하는 CNS 감염, 뇌 및 척수의 종양, 또는 프리온 질환 유래의 신경 손상으로 고생하거나 또는 위험이 있는 대상을 치료하기 위해 이용된다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 통상적인 노화 (예를 들면, 후각상실증 또는 일반적인 화학물질 감각의 상실), 또는 임의의 종류의 뇌 손상으로부터 초래되는 CNS 질환을 반격하기 위한 물질을 전달하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 근치 골반 수술 (예를 들면, 전립샘절제, 특히, 근치후 전립샘절제, 여기에서 신경 조직 (예를 들면, 해면 신경 조직 및/또는 골반 신경 조직)이 손상됨)에 따른 신경 조직 손상을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
그리하여, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신경 생존 및 재생을 촉진하며, 또한 예를 들면, 손상된, 상처 받은, 질환을 가진, 또는 이식된 조직의 신경분포를 지지하므로, 수술에 따른 관련된 기능장애 (예를 들면, 발기기능장애, 방광 배뇨)의 치료 및 개선을 함께 제공하면서, 신경 조직의 복구를 허용한다.
본 발명은 신경 손상이 발생한 질환 또는 손상의 치료 및 예방 양자에 대해 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하는 것을 고려한다. 치료학적 내용에서, 상기 상황은 CNS의 손상 또는 질환 상태의 경우에 당뇨병과 같은 물리적 손상 또는 질환 상태에 의해서와 같은 말초 신경 손상, 척수에 대한 물리적 손상, 뇌 외상, 뇌졸중, 망막 및 시신경 병터, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경퇴행성질환, 신경근육병, 신경계의 자가면역질환, 중추신경계의 종양, 근육위축가쪽경화증과 같은 상태로 발생하는 운동 신경에 대한 손상, 및 색소성망막염 및 나이 관련 황반변성과 같은 망막의 퇴행성질환을 포함하는 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료되는 (예를 들면, 축삭 성장의 촉진을 통해) 신경 손상의 임의의 특정 자리에 제한되지 않는다. 정말로, 치료되는 신경, 및 상기 신경에 의해 신경지배되는 신체의 기능의 회복은 예를 들면, 대상의 척추, 손, 다리, 팔, 등, 손가락, 얼굴, 머리, 목, 혀, 귀, 페니스, 발, 발가락, 눈, 또는 입에서 발견되는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 뉴런 (예를 들면, 발생의 임의의 단계 (예를 들면, 신경돌기 또는 성숙 뉴런))의 성장을 변경 (예를 들면, 조절)하기 위해 이용될 수 있다. 뉴런의 성장의 조절 방법은 특정 구현예에서, 뉴런의 성장 촉진 방법, 손상된 뉴런의 재생 방법, 또는 뉴런의 성장 유도 방법일 수 있다.
조절되는 뉴런은 임의의 뉴런일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 뉴런은 손상된 척수에서 뉴런이다. 예를 들면, 상기 척수는 외상 척수 손상에 의해 손상될 수 있다. 상기 손상은 뉴런의 손상된 기능을 초래할 수 있었다.
특정 구현예에서, 상기 뉴런의 성장 조절 방법은 대상에서 뉴런의 성장 조절 방법이다. 임의의 대상이 본 발명에 의해 고려되지만, 특정 구현예에서, 상기 대상은 척수 질환을 갖는 대상일 수 있다. 상기 척수 질환은 외상 척수 손상과 같은 임의의 질환일 수 있다. 상기 외상 척수 손상은 대상의 마비를 초래하거나 초래하지 않을 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 환자는 신경퇴행성질환을 갖는 환자이다. 조절되는 뉴런은 감각 또는 운동 뉴런일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 연구 적용에 이용될 수 있다 (예를 들면, 세포 (예를 들면, 신경 전구, 신경돌기 또는 기타 신경 세포) 분화 및 증식에 대한 펩티드의 효과를 이해하기 위해). 기타 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 약물 스크리닝에 이용될 수 있다 (예를 들면, 후보 펩티드를 스크리닝하기 위해).
예를 들면, 본 발명은 세포 (예를 들면, 뉴런, 신경돌기 또는 기타 유형의 신경 세포)의 성장을 조절하는 능력에 대한 후보 물질을 스크리닝하는 것을 고려한다. 특히, 바람직한 후보 물질은 척수 내의 축삭 성장을 촉진하는데 유용한 것일 것이다. 본 발명의 스크리닝 분석에서, 상기 후보 물질은 먼저 기본적인 생화학적 활성에 대해 스크리닝된 후, 세포, 조직 또는 전체 동물 수준에서 활성을 조절하는 이의 능력에 대해 시험한다 (예를 들면, 본 발명의 PA를 포함하는 조성물 (예를 들면, PA를 포함하는 조성물 및 후보 물질로부터 자기 조립된 나노섬유 겔) 내에 위치할 때). 특정 구현예에서, 배양된 척수 섹션을 이용한 분석과 같은 체외이식 분석이 스크리닝 방법에서 이용될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 방법이 스크리닝 분석을 수행하기 위해 본 발명에서 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 뉴런의 성장 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 후보 물질을 수득하는 방법에 관한 것이다: 본 발명의 PA와 함께 후보 물질을 조합 또는 동시 투여하는 단계; 상기 후보 물질과 뉴런을 접촉시키는 단계 (예를 들면, 본 발명의 PA와 조합 또는 동시 투여); 및 상기 뉴런의 성장 (예를 들면, 축삭 (예를 들면, 운동 또는 감각) 성장)의 조절을 측정하는 단계. 특정 구현예에서, 후보 물질은 뉴런 성장의 저해제 또는 활성제로서 확인될 수 있다. 본 발명에 따른 저해제는 뉴런의 성장에 저해 효과 (예를 들면, 본원에 개시된 방법에 의해 측정됨)를 갖는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 활성제는 뉴런의 성장에 촉진 효과를 갖는 것일 수 있다.
본원에 이용된, 용어 "후보 물질"은 뉴런의 재생을 잠재적으로 조절 (예를 들면, 촉진 또는 저해)할 수 있는 임의의 분자를 말한다. 상기 후보 물질은 단백질 또는 이의 단편, 폴리펩티드, 펩티드, 소분자 저해제, 또는 심지어 핵산 분자 (예를 들면, 발현 벡터에 의해 발현됨)일 수 있다. 가장 유용한 약리학적 화합물은 본원에 기재된 뉴런 (예를 들면, 축삭 성장)의 활성제 및 저해제와 상호작용하는 화합물과 구조적으로 관련된 화합물, 또는 활성제 및 저해제와 관련된 신호전달 경로에 영향을 주는 화합물일 것이라는 사실이 입증될 수 있다. 상기 분자의 작용을 생성 및 조사하는 것은 "합리적 의약 디자인"으로서 알려지며, 표적 분자의 구조에 관한 예상을 하는 것을 포함한다.
합리적 의약 디자인의 목적은 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 표적 화합물의 구조 유사체를 제조하는 것이다. 상기 유사체를 생성함으로써, 변경에 대한 상이한 감수성을 가지며, 다양한 기타 분자의 기능에 영향을 줄 수 있는 천연 분자보다 더욱 활성이거나 또는 안정한 의약을 만드는 것이 가능하다. 하나의 접근에서, 공지된 활성제 또는 저해제 (예를 들면, 본원에 기재된 것)에 대한 3차원 구조를 생성한 후, 활성제 또는 저해제와 상호작용하는 이의 능력에 대해 분자를 디자인할 수 있다. 대안적으로, 활성제 또는 저해제의 부분적으로 기능성 단편 또는 유사 물질 (결합할 수 있으나, 활성은 없음)을 디자인하여, 경쟁 저해제를 생성할 수 있었다. 이는 x-선 결정학, 컴퓨터 모델링 또는 양자 접근의 조합에 의해 달성될 수 있었다.
또한, 표적 화합물 또는 저해제의 구조를 확인하기 위해 항체를 이용하는 것이 가능하다. 원칙적으로, 상기 접근은 부차적인 의약 디자인이 기초할 수 있는 골격군 (pharmacore)을 생성한다. 기능성, 약리학적으로 활성인 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 생성함으로써 단백질 결정학을 완전히 우회하는 것이 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-이디오타입의 결합 자리는 원래 항원의 유사체일 것으로 예상될 수 있다. 항-이디오타입은 이어서 화학적으로 또는 생물학적으로 제조된 펩티드 은행으로부터 펩티드를 확인 및 분리하기 위해 이용될 수 있다. 선택된 펩티드는 이어서 골격군으로서 이용될 수 있다.
다른 한편으로는, 다양한 상업적 공급원으로부터, 유용한 화합물을 확인하기 위한 노력에서 유용한 의약에 대한 기본적인 기준을 만족시키는 것으로 생각되는 소분자 라이브러리를 간단히 수득할 수 있다. 조합적으로 생성된 라이브러리 (예를 들면, 펩티드 라이브러리)를 포함하는 상기 라이브러리의 스크리닝은 활성에 대해 많은 수의 관련된 (및 비관련된) 화합물을 스크리닝하는 신속하고 효율적인 방식이다. 조합 접근은 또한 스스로 활성이나, 그렇지 않으면 바람직하지 않은 화합물로 모델링된 제2, 제3 및 제4 생성 화합물의 생성에 의해 잠재적인 의약의 신속한 진화를 하게 한다.
후보 화합물은 천연적으로 발생하는 화합물의 단편 또는 부분을 포함할 수 있거나 또는 그렇지 않으면 불활성인 공지된 화합물의 활성 조합으로서 발견될 수 있다. 동물, 박테리아, 진균, 잎 및 껍질을 포함하는 식물 공급원, 및 해양 시료와 같은 천연 공급원으로부터 분리된 화합물은 잠재적으로 유용한 약학 물질의 존재에 대한 후보로서 분석될 수 있다는 것이 제안된다. 스크리닝되는 약학 물질은 또한 화학 조성물 또는 인조 화합물로부터 유래 또는 합성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그리하여, 본 발명에 의해 확인된 후보 물질은 뉴런 성장의 공지된 조절제로부터 출발하는 합리적 의약 디자인을 통해 디자인될 수 있는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 소분자 저해제 또는 임의의 기타 화합물일ㄹ 수 있다는 것을 이해한다.
기타 적당한 저해제는 안티센스 분자 (예를 들면, siRNA (예를 들면, 발현 벡터로부터 발현됨), 리보자임, 및 항체 (단일 사슬 항체 포함)를 포함한다.
당연히, 본 발명의 모든 스크리닝 방법은 효과적인 후보가 발견될 수 없다는 사실에도 불구하고 그 자체로 유용하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 오로지 후보를 찾는 방법이 아닌 상기 후보를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데, 여기에서 상기 펩티드 친양쪽성체는 뉴런 (예를 들면, 신경돌기) 성장을 변경 (예를 들면, 촉진)하도록 배치된다. 본 발명의 펩티드 친양쪽성체의 임의의 유형의 약학 제제 (예를 들면, 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물, 또는 펩티드 친양쪽성체 및 하나 이상의 기타 물질 (예를 들면, 뉴런 성장의 공지된 촉진제 또는 저해제, 성장인자, 신경영양인자, 활성제 또는 저해제인 것으로 본 발명의 방법에 의해 확인된 화합물)을 포함하는 조성물)가 본 발명에 의해 고려된다. 당업자는 유용한 폭넓은 범위의 유형의 약학 제제에 대해 친숙할 것이며, 상기 약학 제제를 생성하기 위해 필요한 기술에 친숙할 것이다.
특정 구현예에서, 상기 약학 제제는 수성 조성물 (예를 들면, 실시예 1, 3 및 11에 기재된 것 (예를 들면, 글루코스 용액에 희석된 것))일 것이다. 본 발명의 수성 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 (예를 들면, 글루코스 또는 염수 용액) 또는 수성 매질에 용해 또는 분산된 유효량의 펩티드 친양쪽성체를 포함한다.
본원에 이용된, "약학 제제"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅액, 항박테리아 및 항진균 물질, 등장 및 흡수 지연 물질 등을 포함한다. 약학 활성 물질에 대한 상기 매질 및 물질의 이용은 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 성분 (예를 들면, 펩티드 친양쪽성체)과 비상용성인 것을 제외하고, 치료 조성물에 이의 이용이 고려된다. 보조 활성 성분은 또한 상기 조성물 내로 혼입될 수 있다 (예를 들면, 본원에 기재된 것 (예를 들면, 성장인자, 신경영양인자, 및 뉴런 성장의 저해제의 저해제)). 인간 투여를 위해, 제제는 FDA Office of Biologies standards에 의해 요구되는 멸균, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 만족시켜야 한다.
상기 생물학적 물질은 일반적으로 눈 (안과), 입 (경구), 피부 (경피), 코 (코), 폐 (흡입), 구강 점막 (볼), 귀, 직장, 주사에 의해 (예를 들면, 정맥내로, 피하로, 종양내로, 복막내로 등) 등을 통한 것과 같은 임의의 알려진 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 성분 또는 활성 성분으로서 본원에 개시된 본 발명의 활성 물질 (예를 들면, 펩티드 친양쪽성체)를 포함하는 수성 조성물의 제제는 본 개시의 면에서 당업자에게 공지될 것이다.
본 발명의 물질은 중성 또는 염 형태로 조성물 내로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 (단백질의 유리 아미노기와 함께 형성되고), 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 또는 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성되는 산부가염을 포함한다. 당업자는 염 형태의 생성 기술에 대해 친숙할 것이다. 상기 담체는 또한 물, 에탄올, 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물, 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
본 발명은 비경구 주사 또는 임의의 기타 경로에 의한 적용에 대해 멸균 용액인 약학 제제일 하나 이상의 펩티드 친양쪽성체를 고려한다. 당업자는 주사 또는 적용용 멸균 용액을 생성하는 기술에 대해 친숙할 것이다. 멸균 주사액은 당업자에게 친숙하고, 본원에 개시된 다양한 기타 성분과 함께 적당한 용매 중에 필요량의 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다.
제형화시, 용액은 투여 제형물과 혼화성이며, 치료학적으로 효과적인 양인 방식으로 투여될 것이다. 상기 제형물은 전술한 주사액 유형과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 뉴런과 접촉할 때 (예를 들면, 손상된 척수 내로 주사할 때) 나노섬유 겔을 형성하는 펩티드 친양쪽성체 용액을 포함하는 조성물을 제공하는데, 상기 나노섬유 겔은 대상 내에 일정 기간 동안 (예를 들면, 2일 이상 동안, 1주 동안, 1 내지 2주 동안, 2주 이상 동안, 2 내지 4주 동안, 또는 4주 이상 동안 (예를 들면, 실시예 10 및 도 9 참고)) 존재할 수 있는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 수용액에서 비경구 투여를 위해, 예를 들면, 상기 용액은 필요시 적당하게 완충되어야 하며, 액체 희석제가 먼저 충분한 염수 또는 글루코스를 이용하여 등장액이 되어야 한다. 상기 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 대해 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시의 면에서 당업자에게 공지될 것이다. 뇌척수액 내로 요추천자를 통한 투여용 제형물이 또한 본 발명에 의해 고려된다.
본원에 개시된 활성 물질은 치료학적 혼합물 내에 투여당 약 0.0001 내지 1.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 약 10 밀리그램 가량 포함되도록 제형화될 수 있다. 복수의 투여량이 또한 투여될 수 있다. 뉴런 성장을 생성할 수 있는 투여량은 본원에 기재된다 (예를 들면, 실시예 1, 3, 8 및 10 참고).
유효량의 치료 또는 예방 물질은 의도한 목적, 예를 들면, 축삭 성장에 기초하여 결정된다. 치료 횟수 및 투여량에 따라 투여되는 양은 치료되는 대상, 대상의 상태 및 원하는 보호에 의존한다. 치료학적 조성물의 정확한 양은 또한 의사의 판단에 의존하며, 각 개인에 특이적이다.
특정 구현예에서, 환자에게 치료학적 조성물의 연속적인 공급을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 외상 척수 손상에 따라, 치료학적 물질의 연속적인 투여는 손상의 자리 내로 또는 손상 자리 근처의 뇌척수액 내로 직접 주사와 같이 지정된 기간 동안 투여될 수 있다. 목적 영역의 연속적인 관류가 바람직할 수 있다. 기타 구현예에서, 본 발명의 PA를 포함하는 조성물은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상 (예를 들면, 8-52) 주에 걸쳐 1회, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 투여될 필요가 있도록 배치된다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 유효성을 증가시키기 위해, 본원에 기재된 신경 손상 또는 질환의 치료에 효과적인 방식으로 투여될 수 있는, 다양한 물질을 하나 이상의 약학 조성물 내로 조합하는 것이 바람직할 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 논의된 바와 같이, 당업자는 뉴런에 대한 신경 유인, 기피, 저해 및/또는 저해 차단 물질의 조합을 적용하여 적당한 뉴런 성장 및/또는 기능을 촉진하기를 원한다. 이는 뉴런 또는 척수를 동시에 상기 물질(들)과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는 뉴런 또는 척수를 단일 조성물 또는 복수의 물질을 포함하는 약리학적 제형물 (예를 들면, 하나 이상의 펩티드 친양쪽성체, 또는 하나의 펩티드 친양쪽성체 및 하나 이상의 기타 물질을 포함하는 조성물을 포함)과 접촉시키거나, 또는 상기 세포를 2가지 독특한 조성물 또는 제형물과 동시에 (예를 들면, 하나 이상의 별도의 조성물로 동시투여된 본 발명의 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물) 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 물질은 수분에서 수주 간격으로 일련으로 또는 연속하여 뉴런 또는 척수에 적용될 수 있다. 2가지 물질이 별도로 뉴런 또는 척수에 적용되는 구현예에서, 각 전달 시간 사이에 현저한 기간이 만료되지 않아, 상기 물질이 뉴런(들)에 대한 유리하게 조합된 효과를 발할 것이라고 확신하기를 원할 수 있다. 상기 경우에, 우리는 서로의 약 12-24 시간 내에, 더욱 바람직하게는 서로의 약 6-12 시간 내에 양자의 방식을 갖는 세포를 접촉시키는 것을 고려한다. 특정 상황에서, 치료 기간을 현저하게 연장하는 것이 바람직할 수 있으나, 각각의 투여 사이에 수 일 (2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상) 내지 수 주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상) 경과하는 것이 바람직하다. 기타 구현예에서, 2 이상의 물질은 물질이 뉴런에 대해 유리한 치료학적 효과를 발할 수 있는 방식으로 별도로 뉴런 또는 척수에 적용된다. 상기 경우에, 세포를 양자의 방식으로 접촉시키는 것이 고려된다.
전형적인 구현예에서 다양한 조합이 이용될 수 있다. 예를 들면, 임의의 수의 계획이 하기 기재된 바와 같이 이용될 수 있는데, 여기에서 "A"는 본 발명의 펩티드 친양쪽성체이며, "B"는 상이한 펩티드 친양쪽성체, 성장인자, 신경영양인자, 신경 성장에 유인제 또는 기피제 유도를 제공하는 화합물, 신경 성장의 저해제, 신경 성장의 저해제의 차단제 또는 본원에 기재된 기타 물질이다:
A/B/A, B/A/B, B/B/A, A/A/B, A/B/B, B/A/A, A/B/B/B, B/A/B/B, B/B/B/A, B/B/A/B, A/A/B/B, A/B/A/B, A/B/B/A, B/B/A/A, B/A/B/A, B/A/A/B, A/A/A/B, B/A/A/A, A/B/A/A, 및 A/A/B/A.
환자에 상기 물질의 투여는 당업자에게 공지되고 본원에 기재된 투여에 대한 일반적인 절차를 따를 것이다. 치료 주기는 필요시 반복될 수 있다고 예상된다. 또한, 다양한 표준 치료뿐만 아니라, 수술 중재가 상기 물질의 적용과 조합되어 적용될 수 있다는 것이 고려된다.
도 l(A)는 IKVAV 함유 펩티드 친양쪽성체 분자 및 나노 섬유로 이의 자기 조립의 분자 그래픽 예시를 보여준다. 도 1(B)는 펩티드 친양쪽성체 수용액에 세포 배지 (DMEM)를 첨가함으로써 형성된 IKVAV 나노섬유 망의 주사전자현미경 사진을 보여준다. 도 1(C 및 D)는 (C) 세포 배양 배지 및 (D) 뇌척수액에 IKVAV 펩티드 친양쪽성체 용액을 첨가함으로써 형성된 겔의 현미경사진을 보여준다. 도 1(E)는 펩티드 친양쪽성체 용액의 안구내 주사 후에 제핵 래트 눈으로부터 수술하여 추출된 IKVAV 나노섬유 겔의 현미경사진을 보여준다.
도 2는 IKVAV-PA 겔에서 캡슐화되거나 또는 폴리-(D-라이신) (PDL)-코팅된 덮개 유리 상에서 배양된 NPC의 세포 생존 및 형태를 보여준다. 세포 생존을 시험관 내에서 (A) 1 일, (B) 7 일, 및 (C) 22 일에 측정하였다. 도 2(D)는 총 세포의 백분율로서 표시된 세포 생존의 정량화를 보여준다. 도 2(E)는 IKVAV-PA 겔에서 분화된 뉴런의 세포체 영역이 1일 및 7일 양자에서 대조군의 것보다 현저하게 크다는 것을 보여준다 (*P < 0.05, **P < 0.01). 도 2(F)는 7일에 IKVAV-PA 겔에서 캡 슐화된 NPC의 TEM을 보여준다.
도 3은 나노섬유 망 (newwork) 내에서 세포 이동의 정량화를 보여준다. 도 3(A)는 IKVAV-PA 겔에서 캡슐화된 3가지 대표적인 신경구 유래의 NPC의 이동의 정량화를 보여준다. 도 3(B)는 (A)에서 데이타가 시험관 내에서 1일 (상단) 및 14일 (바닥)에 모인 3가지 신경구를 보여준다. 도 3(C)는 도말 후 24시간 내에 IKVAV-PA 겔에서 캡슐화된 NPC 신경구의 명시야 이미지를 보여준다.
도 4 (A 및 B)는 상이한 실험 조건하에 배양된 NPC를 보여준다. 도 4(C)는 7일에 IKVAV-PA 나노섬유 망에서 캡슐화된 NPC 신경구의 면역세포화학을 보여준다. 도 4(D)는 1일에 라미닌 코팅된 덮개 유리 상에서 배양된 NPC를 보여준다. 도 4(E)는 7일에 라미닌 코팅된 덮개 유리 상에서 배양된 NPC를 보여준다. 도 4(F)는 뉴런 (β-튜불린)으로 분화된 총 세포 백분율을 보여준다. 도 4(G)는 성상세포 (GFAP+)로 분화된 총 세포 백분율을 보여준다. 도 4H는 상이한 양의 IKVAV-PA 및 EQS-PA를 포함하는 나노섬유 망에서 (실선) 및 상이한 양의 가용성 IKVAV 펩티드가 첨가된 EQS-PA 나노섬유 망에서 (점선) 1일 후에 뉴런으로 분화된 총 세포 백분율을 보여준다.
도 5는 IKVAV-PA 나노섬유로 코팅된 기질 및 IKVAV 펩티드로 코팅된 기질 상에서 2차원 배양에서 뉴런으로 분화된 총 세포 백분율을 보여준다.
도 6은 PAl 및 PA2의 구조 및 특성규명을 보여준다. (a) 본 발명의 수개의 PA의 화학 구조. 상기 펩티드 서열은 팔미틸 꼬리 (PAl) 또는 형광 버전에서 피렌부틸 꼬리(PA2)를 갖는 N-말단에서 종결된다. 상기 펩티드 서열은 다른 곳에서 기 재된 것으로부터 변형되며 (예를 들면, Nomizu, M. et al., FEBS Lett 365, 227-31 (1995) 참고), 겔화의 느린 동력학으로 인해 이용되었다. (b) PAl (좌측) 및 PA2 (우측)의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼. 양자의 경우에 모 피크로부터 -30 및 -60의 피크는 세린 측쇄로부터 CH2=OH(+)의 상실에 기인한다. (c) 응집을 최소화하기 위해 dTFA에서 취한 PAl (좌측) and PA2 (우측)의 1H-NMR 스펙트럼. ppmO-6으로부터의 영역은 가시화를 위해 확대된다. 6 초과의 영역은 PAl의 스펙트럼에서 나타나는 피레닐 양성자로 인한 방향족 피크, 및 양자의 스펙트럼에서 교환가능한 아미드 양성자로부터의 작은 폭넓은 피크를 제외하고는 비어 있다.
도 7은 원자간력 현미경기술 및 유동학 데이타를 이용한 나노섬유 겔의 규명을 보여준다. 도 7(a)는 겔화된 상태로 더 느리게 겔화하는 PAl (팔미틸-IKVAV-PA 섬유)를 보여주는 원자간력 현미경기술 이미지를 보여준다. 폭이 약 7nm인 개별 섬유는 부분적인 섬유 망과 함께 이의 이미지에서 볼 수 있다. 도 7(b) 내지 (d)는 PAl 및 PA2 (피렌-IKVAV-PA 또는 형광 IKVAV-PA 겔)에 대한 유동학 데이타를 제공한다. 보여준 데이타는 4.22Hz 및 3% 변형 (strain)에서 취했으며, 이는 모든 3가지 PA에 대한 선형 점탄성 계획에 해당한다. 오차막대는 1 표준 편차이다. 도 7(b)는 복소탄성계수를 보여준다. PAl 및 PA2 변종은 강성에서 필적할 만하다. 도 7(c)는 복소점도를 보여준다. 도 7(d)는 2가지 PA에 대한 감쇠인자 (G"/G')를 보여준다. 양자의 물질은 DMEM의 첨가로 겔화되었다 (G"/G' <0.2).
도 8은 IKVAV 겔이 시험관 내 출생후 신경 전구세포에 의한 성상세포 혈통 결정 (lineage commitment)을 감소시킨다는 것을 보여준다. 폴리-D-라이신 (PDL)/ 라미닌 코팅된 덮개 유리 상에서 배양된 세포에 비해 IKVAV 겔에서 캡슐화된 출생후 신경 전구세포로부터 더 적은 수의 성상세포 (GFAP+ 세포)가 생성된다. t 테스트에 의해 *p<0.01.
도 9는 IKVAV 펩티드 친양쪽성체 (PA) 용액이 생체 내에서 자기 조립되며, 아교세포 흉터 형성을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 9(a)는 겔을 생성하기 위해 상호꼬인 나노섬유 다발 내로 조립된 개별 PA 분자를 보여주는 모식도를 보여준다. 도 9(b)는 나노섬유의 망을 보여주는 주사전자현미경사진을 보여준다. 스케일바: 200nm. 도 9(c)는 주사 후 24시간에 손상된 척수에서 형광 IKVAV 겔을 보여주는 종단면을 보여준다. 도 9(d)는 주사 트랙 (화살촉) 근처, 그러나 또한 주사 자리로부터 멀리서 (형광 이미지에서 긴 수직 화살표) 5주의 겔을 보여주는 척수의 종단면을 보여준다 (c 및 d에서 스케일바: 200㎛). 도 9 (e) 및 (f)는 IKVAV 겔이 척수 손상에 따른 생체 내 성상교세포증을 약화시킨다는 것을 보여준다. 도 9(e)는 GFAP 면역형광이 대조군과 비교하여 겔 처리된 동물의 병터 자리에서 감소된다는 것을 보여준다. 스케일바: 20㎛. 도 9(f)는 대조군 및 겔 주사된 그룹이 4일에 상이하지 않으나, 77일에 겔 주사된 척수에서 GFAP 면역형광 수준은 대조군과 비교하여 현저하게 감소된다는 것을 보여준다 (t 테스트에 의해 *p< 0.04).
도 10은 척수 손상이 초기 비대 아교세포 반응, 그러나 이후에 과다형성 아교세포 반응을 초래한다는 것을 보여준다. 섹션의 대표적인 공초점 Z-스택(stack)은 비손상된 척수뿐만 아니라 척수 손상 후 4일 및 11주에 병터 자리를 보여주는 GFAP에 대해 면역염색하였다. 손상 후 4일에 반응성 성상세포 (화살촉)의 비대 형태 및 손상 후 11주에 GFAP+ 세포의 명백한 증가를 주목한다. 스케일바; 20㎛.
도 11은 IKVAV 겔이 척수 손상에 따라 운동 축삭의 재생을 촉진한다는 것을 보여준다. 운반체-주사된 및 겔-주사된 동물에서 병터에 대한 입쪽 500㎛의 거리 내에 BDA-표지된 하강 운동 섬유의 대표적인 Neurolucida 추적. 회색 점선은 상기 병터의 경계를 분명히 한다. 막대 그래프는 표지된 피질척수 축삭이 병터를 통과하는 정도를 보여준다. 11주까지 겔 주사된 그룹 (흑색 막대)에서 축삭의 50%가 병터 내로의 길의 반에 연장하였으며, 겔 주사된 그룹에서 축삭의 40%가 꼬리 척수 내로 병터를 넘어서 성장하였다. 대조적으로, 어떤 축삭도 운반체 주사된 동물 (적색 막대)에서 병터 내로의 길의 심지어 25%를 교차하여 발견되지 않았다. * 그룹 (130 개별 축삭의 추적을 나타냄)은 Wilcoxon 랭크 테스트(rank test)에 의해 p <0.03에서 서로 상이하다. 보여준 모든 섹션에서, 입쪽은 상단에 있으며, 등은 좌측에 있다. 모든 스케일바: 100㎛.
도 12는 IKVAV 겔이 척수 손상에 따른 감각 축삭의 재생을 촉진시킨다는 것을 보여준다. 운반체-주사된 및 겔-주사된 동물에서 병터에 대한 꼬리 500㎛의 거리 내에 BDA-표지된 상행 감각 섬유의 대표적인 Neurolucida 추적. 막대 그래프는 표지된 축삭이 병터에 들어가고, 통과하는 정도를 보여준다. 손상 후 2주에, 단지 적은 수의 섬유가 병터에 들어가며, 각 그룹에서 어떤 섬유도 병터를 가로지는 길의 25%만큼 통과하지 못하였다. 11주까지 대조군 동물 (적색 막대)에서 섬유의 단지 약 20%외 비교하여 겔 주사된 그룹 (흑색 막대)에서 표지된 축삭의 대략 60%가 병터에 들어갔다. 11주에, 현저하게 더 많은 축삭이 운반체 주사된 그룹 (적색 막대)에서보다 겔 주사된 동물 (흑색 막대)에서 병터를 통과하였으며, 단지 겔 주사된 그룹에서 섬유는 병터 내로 또는 넘어서 50% 성장한다. ** 그룹은 Wilcoxon 랭크 테스트(rank test)에 의해 p <0.05에서 서로 상이하다.
도 13은 IKVAV 겔이 BBB 개방 시야 운동(locomotor) 스케일에 의해 분석된 바와 같이 기능성 회복을 촉진시킨다는 것을 보여준다. 도 13(a)는 평균 마우스 BBB 운동 스코어를 보여주는 그래프이다. 상기 그룹은 반복된 측정을 갖는 ANOVA에 의해 p<0.04에서 서로 상이하다. * Tukey's HSD 사후 t 테스트는 스코어가 손상 후 5주 및 그 후에 모든 시간 포인트에서 p<0.045에서 상이하다는 것을 보여주었다. 도 13(b)는 평균 래트 BBB 운동 스코어를 보여주는 그래프이다. 반복된 측정을 갖는 ANOVA는 상기 그룹이 서로 상이하다는 것을 보여주었다 (p< 0.03). Tukey's HSD 사후 t 테스트는 모방 및 운반체 처리된 동물 사이의 차이를 보여주지 않았으나, 겔 주사된 그룹은 5주 (*p<0.03) 및 그 후 모든 시간 (**p<0.02)에 기타 그룹과 상이하였다.
도 14는 본 발명의 펩티드 친양쪽성체를 보여준다.
도 15는 본 발명의 느리게 겔화하는 펩티드 친양쪽성체를 보여준다.
도 16은 본 발명의 헤테로원자 도판트(dopant)를 포함하는 다양한 펩티드 친양쪽성체를 보여준다.
도 17은 본 발명의 분지기를 포함하는 펩티드 친양쪽성체를 보여준다.
실험
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구현예 및 양태를 증명하고 추가로 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
재료 및 방법
세포 배양 및 IKVAV-PA 나노-망에서 시험관 내 캡슐화. 신경 전구세포 (NPC)를 이전에 기재된 바와 같이 배양하였다 (예를 들면, Zhu et al., J. Neurosci. Res. 59, 312 (2000) 참고). 간단히, E13 마우스 배아의 피질을 해부하고, bFGF (10 ng/ml)로 보충된 DMEM/F12 배지에서 미처리된 페트리 디쉬에서 도말하였다. 4일 후에, 기계적으로 및 효소학적으로 분리된 NPC 및 미분리된 신경구 (예를 들면, 미분리된 NPC 응집물)를 적당한 기질 (예를 들면, IKVAV-펩티드 친양쪽성체 (PA), EQS-PA, 또는 알기네이트 겔에서 캡슐화되거나, 또는 라미닌, 폴리-D-라이신, 또는 IKVAV 펩티드 코팅된 덮개 유리에서 배양됨) 상에 도말하였다. 모든 경우에, 이는 시험관 내에서 0일로서 취하였다.
IKVAV- 및 EQS-PA 망에서 NPC의 캡슐화는 24 웰 배양 플레이트에서 12 mm 덮개 유리 상에 100 ㎕의 PA 용액을 먼저 분취하고, 자가 포함된 방울을 형성함으로써 달성되었다. 배양 배지 중의 100 ㎕의 세포 현탁액을 이어서 PA 용액의 방울 내로 피펫팅하고, 세포 현탁액이 도입될 때 피펫 팁을 부드럽게 휘젓고, PA 겔을 형성하였다. 겔을 2시간 이상 동안 인큐베이터 (37℃ 및 5% CO2, 95% 습도)에서 교란되지 않은 채 가라않게 한 후, 300 ㎕의 NPC 배양 배지를 웰에 첨가하고, PA 겔을 완전히 가라않게 하였다. 플레이트를 이어서 인큐베이터로 다시 가지고 왔다. 대조군 12 mm 덮개 유리를 PDL (Sigma, 1 mg/50 ml DMEM) 또는 라미닌/PDL (Sigma, 1 mg/100 ml DMEM)로 코팅하고, 플로우 후드에서 1시간 이상 동안 가라않게 하고 건조하였다. 가용성 IKVAV 펩티드를 덮개 유리 상에 스핀 코팅하고, 밤새 건조시켰다. 2차원 대조군에 대해, 300 ㎕의 NPC 배양 배지를 웰에 첨가하고, 100 ㎕의 NPC 세포 현탁액을 덮개 유리의 중심에 분취한 후, 배양 플레이트를 수동으로 진탕하여 웰 분포된 세포 밀도를 확신하였다. 1 wt% 의 알기네이트 용액을 100 ml의 생리식염수 (PBS) 중에 1 g의 알기네이트를 혼합함으로써 제조하고, 진탕기에서 밤새 가라앉게 하여 용해하도록 하였다. 100 ㎕의 1 wt% 알기네이트를 외래 칼슘 (알기네이트 겔화를 유도하기 위해 통상적으로 요구됨)을 포함하지 않는 배양 배지 중의 100 ㎕의 NPC 세포 현탁액과 혼합하여, 0.5 wt% IKVAV-PA 실험 겔과 직접적인 비교를 허용하는 0.5 wt% 알기네이트 겔을 수득하였다. 알기네이트 중의 캡슐화된 NPC를 2시간 이상 동안 인큐베이터로 다시 가져왔으며, 그 때 약하나 안정한 겔을 형성하였다. 배양 웰을 이어서 알기네이트 겔을 잠기게 하기에 충분한 300 ㎕의 배양 배지로 충전하고, 인큐베이터로 다시 가져왔다.
세포 생존능/세포독성 분석. 세포 생존능/세포독성을 Molecular Probes LIVE/DEAD 세포 분석 (Molecular Probes)을 이용하여 평가하였다. NPC에 대해 최적화된 에티디움 동종이합체-1 (EthD) 및 칼세인의 작동 농도를 Molecular Probes 사에 의해 지시된 바와 같이 측정하고, 각각 0.5 and 8 μM로 측정되었다. 상기 배양 배지를 웰에서 제거하고, PBS 중의 충분한 EthD/칼세인 용액을 웰에 첨가하여 PA 겔의 잠수를 확인하였다. 배양 플레이트를 20분 동안 인큐베이터로 다시 가져온 후, EthD/칼세인 용액을 제거하고, 세포를 PBS로 1회 세정하였다. EthD 및 칼세인 형광을 각각 Nikon TE-2000 형광 현미경 상에서 FITC 및 TRITC 필터를 이용하여 이미징하였다.
면역세포화학. 캡슐화된 NPC 유래의 배양 배지를 제거하고, 상기 캡슐화된 세포를 전체 PA-겔을 고정액에 잠기게 함으로써 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 실온에서 고정하였다. 0.2% Triton-X (톡틸페녹시플리에톡시에탄올)을 이용하여 5분 동안 인큐베이션 전에 PBS로 2회 세정하였다. 이어서, 또 다른 PBS 2회 세정 및 4℃에서 밤새 5% 염소 또는 말 혈청을 포함하는 PBS 중의 1차 항체 인큐베이션 (1:400의 항-β-튜불린 III IgG 또는 1:400의 항-GFAP, Sigma)을 수행하였다. PBS로 3회 세정에 이어, 세포를 2시간 동안 실온에서 5% 염소 또는 말 혈청을 포함하는 PBS 중의 TRITC- 또는 FITC-접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. PBS를 이용한 또 다른 3회 세정 후, 모든 핵을 실온에서 10분 동안 Hoescht's Stain (1:5000, Sigma)으로 염색하여 β-튜불린 및 GFAP 음성 세포를 관찰하였다. 세포 이미징을 PC 작동하는 MetaView 이미징 소프트웨어와 인터페이싱된 Nikon TE-2000 형광 현미경에 부착된 고해상도 Cool Snap 카메라, 또는 PC 작동하는 AxioVision 이미징 소프트웨어와 인터페이싱된 Zeiss Axiovert 200 형광 현미경에 부착된 Axiocam 카메라를 이용하여 수행하였다.
세포 카운트. 무작위로 선발된 시야를 상이한 실험 조건에 대해 이미징하고, ImageJ (Scion Corporation) 형태적 (morphometric) 분석 소프트웨어를 이용하 여 세포를 카운트하였다. 이미지를 검사하여 필터 사이에 형광의 블리드 스루 (bleed-through)가 없다는 것을 확신하고, 세포를 ImageJ를 이용하여 반자동적으로 카운트하였다. 구체적으로, 제시된 필드 내의 총 세포수를 총 세포수의 자동 작동하는 카운트를 유지하는 마킹 도구를 이용하여 세포를 수동으로 선발함으로써 카운팅하였다. 세포 카운트의 정량적이며 통계학적 분석을 Matlab (Math works) 및/또는 Excel (Microsoft)을 이용하여 수행하였다.
척수 주사 절차. 래트를 45mg/kg Pentobarbital (NEMBUTAL)을 이용하여 마취시켰다. 척추후궁절제술을 수행하여 척추 단편 T13를 노출시키고, 32 게이지 바늘에 부착된 해밀턴 주사기를 갖는 정위 미세조작장치 (Kopf Instruments)를 이용하여 1.5 mm의 깊이에서 TlO으로 척수 내로 333nl/sec의 동일삼투질농도 글루코스 (운반체) 또는 펩티드 친양쪽성체 6㎕를 주사하였다. 상기 바늘을 각 주사 후 2분 동안 주사 자리 내에 유지하여 IKVAV-PA가 교란 없이 겔화되도록 하였다. 펩티드 친양쪽성체로 주사된 동물은 운동 양상 또는 일반적인 건강에서 변화를 보여주지 않았는데, 이는 펩티드 친양쪽성체의 주사가 독성 효과가 없다는 것을 나타낸다. 안구내
안내(intra-ocular) 주사. 모든 실험을 노스웨스턴 대학교의 Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) 및 Animal Care and Use Committee (ACUC)의 규정에 따라 수행하였다. 성체 Sprague-Dawley 래트 (200-25Og)를 소듐 펜타바비탈의 과량투여 또는 CO2 과량투여에 의해 희생하고, 이의 눈을 즉시 수술하여 핵을 제거하였다. 25 게이지 바늘을 갖는 100 ㎕ 해밀턴 주사기 를 80-100 ㎕의 IKVAV-PA 용액으로 미리 로딩하고, 핵을 제거한 눈을 Nikon SMZ-1000 입체 해부 현미경의 플랫폼에 위치하였다. 눈을 하부-망막 또는 각막 공간으로 대략 경사각으로 입체 현미경 하에 안와의 등 내로 IKVAV-PA 용액으로 수동으로 주사하고, MetaView 이미징 소프트웨어를 이용하여 Cool Snap 고해상도 카메라와 인터페이싱된 입체 현미경을 이용하여 이미징하였다.
IKVAV 신호 증폭의 계산. 고체상 인터페이스에서 단백질의 흡착은 전형적으로 1㎍/cm2 근처이다 (예를 들면, Ratner, Biomaterials Science: An introduction to materials in medicine (Academic Press, San Diego, 1996) 참고). 상기 값을 이용하고, 라미닌의 분자량이 80OkDa이라면 (예를 들면, Tunggal et al., Microsc. Res. Tech. 51, 214 (2000) 참고), 덮개 유리 또는 배양 플레이트와 같은 2차원 표면 상에서, 표면 상의 IKVAV 에피토프의 밀도는
Figure 112007052900243-PCT00001
이다 (단, 천연 라미닌- 1 분자 상의 IKVAV 에피토프의 수가 1이다).
나노섬유 표면의 제곱센티미터당 IKVAV 에피토프의 밀도는 또한 공지된 섬유 크기 및 분자 모델링을 이용하여 계산될 수 있다. 단일 나노섬유의 직경이 7 nm라면, 이의 원주는 18.8 nm (C=2πd)이다. 섬유가 50개의 PA 분자로 방사형으로 이루어지며, 1 cm = 107 nm라는 분자 크기로부터 평가할 때,
Figure 112007052900243-PCT00002
다르게 제한되지 않으면서, 상기 분자가 하나의 차원 또는 기타 차원을 따라 우선적으로 신장하지 않는다고 가정할 때, 이를 제곱하여 하기로서 나노섬유 표면의 제곱센티미터당 IKVAV 에피토프의 수를 발견할 수 있다:
Figure 112007052900243-PCT00003
상기 2개의 수는 나노섬유 상의 IKVAV 에피토프 대 2차원 표면 상의 것의 비율을 발견하기 위해 나누어지며, 밀접하게 패킹된 라미닌 분자의 2차원 표면에 대한 나노섬유 상의 IKVAV 에피토프의 증폭 인자를 수득한다:
Figure 112007052900243-PCT00004
2차원 배양. IKVAV 펩티드 실험을 위해, 3차원 실험에 이용된 동일한 12mm 덮개 유리를 에탄올 중에 침지하여 친수성을 증가시킨 후, 50㎕의 lmg/mL IKVAV 펩티드 용액으로 스핀 코팅하였다. IKVAV-PA 실험을 위해, 덮개 유리를 PDL로 코팅하고 (예를 들면, 흡착을 증진시키기 위해), 이어서 IKVAV-PA 용액으로 코팅하였다. 양자의 경우에, 상기 덮개 유리를 밤새 건조시킨 후, 증류수로 3회 세정하여 세포 현탁액의 첨가 전에 약하게 부착한 물질을 제거하였다. 1 DIV 후에 β-튜불린 염색 결과를 도 5에 보여준다.
마우스 척수 손상, 친양쪽성체 주사 및 동물 보호. 모든 동물 보호 및 수술 중재를 실험실 동물 보호 및 이용에 대한 지침인 실험실 동물의 인간적인 보호 및 이용에 관한 공중보건 서비스 정책 (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, 1996)에 따라 엄격하게 착수하였다. 실험동물관리위원회는 모든 수술 절차를 승인하였다. 암컷, 성체 129 SvJ 마우스 (10 주령; Jackson Labs, USA)를 복막내로 아베르틴을 이용하여 마취시켰다. 척추후궁절제술을 수행하였으며, 척수를 1분 동안 변형된 Kerr-Lougheed 동맥자루 클립(EEJOTA mouse clip, University Health Network, Canada)의 경막외 적용에 의해 T10에서 복배방향으로 압착하였다. 상기 피부를 AUTOCLIP (9mm, Becton Dickinson)를 이용하여 꿰매었다. 수술 후에, 동물을 체온을 유지하기 위해 열 램프하에 유지하였다. 염수의 1.0cc 주사를 피하로 제공하였으며, 이를 손상에 이어 첫주 동안 매일 반복하였다. 손상 후 24시간에 뒷다리 운동을 보이는 마우스를 연구로부터 제외하였다. 불쾌의 경우에, 부프레넥스 (2mg/kg SC, 1일 2회)를 투여하였다. 혈뇨(20 mg/kg)의 경우에 5일 동안 1일 1회 피하로 1일 1회 겐타마이신을 투여하였다.
펩티드 친양쪽성체 용액 또는 운반체를 보로실리케이트 유리 모세관 마이크로피펫 (Sutter Instruments) (OD; 100㎛)을 이용하여 척수 손상 후 24시간에 주사하였다. 피펫의 내부를 표면장력을 줄이기 위해 SIGMACOTE (Sigma)로 라이닝하였다. 모세관을 Micro4 마이크로주사기 펌프 컨트롤러 (WPI)에 의해 조절되는 female luer adaptor(WPI)를 이용하여 해밀턴 주사기 상에 로딩하였다. 상기 친양쪽성체를 주사 직전에 글루코스 580μM 용액으로 1:1로 희석하고, 모세관 내로 로딩하였다. 마우스를 전술한 바와 같이 아베르틴 마취제를 이용하여 마취시켰다. 상기 자동클립을 제거하고, 상기 절개를 재개방하여 손상 자리를 노출시켰다. 마이크로피펫을 상기 척수의 등 표면으로부터 측정된 750㎛의 깊이로 수동으로 사입 하고, 2.5㎕의 희석된 친양쪽성체 용액 또는 운반체를 2.5㎕/min의 속도로 주사하였다. 상기 마이크로피펫을 250㎛의 간격으로 점차적으로 철수하여 상기 척수에서 나노섬유 겔의 자국 (배에서 등)을 남겼다. 주사 말기에, 상기 모세관을 부가적인 5분 동안 상기 척수에 남긴 후, 상기 피펫을 철수하고, 상처를 닫았다. 수술 후 보호를 제공하였다. 모든 실험을 위해, 실험자는 상기 동물의 실체에 대해 알 수 없게 하였다.
GFAP 정량화. 면역염색에 이어, GFAP 면역반응성의 형광 강도를 측정하여 상기 척수의 비손상된 부분에서 기준선 수준에 대해 상기 병터 부근의 GFAP 수준의 배수 증가를 평가하였다. 각 동물에 대해, 동등한 내측방의 깊이에서 섹션을 분석에 이용하였다. 상기 섹션을 이어서 Zeiss UVLSM-Meta 공초점 현미경 (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)을 이용하여 이미징하였다. 각각의 공초점 스캔을 동일한 레이저 파워, 게인 (gain) 및 오프셋 값을 이용하여 수행하였다. 상기 값을 병터 영역의 이미지에서 픽셀이 포화되지 않도록 설정하였다. 상기 스캔의 Z 스택을 LSM 이미지 브라우저 (Carl Zeiss)를 이용하여 재구성하였다. 형광 정량화를 전체 Z-스택을 단색 (.tif) 이미지로 전환한 후, 각 픽셀의 회색 수준을 측정함으로써 수행하였다. 각 픽셀은 0 내지 255 범위의 회색 스케일을 가진다. 각 스택의 총 픽셀 강도를 MetaMorph 2.6 소프트웨어를 이용하여 적분하였다. 각 개별 섹션에 대한 병터 영역에서의 강도 값을 증가된 GFAP 면역반응성의 영역의 가장자리로부터 500㎛ 이상 떨어진 (입쪽 및 꼬리 양자) 것으로 정의된 섹션의 비손상 부분에 대해 취한 스캔으로부터 유도된 기준선 값으로 표준화하였다. 각 섹션에 대해, 병터 영역에서 4개 자리 (병터 중심점에 대해 2개 입쪽 및 2개 꼬리) 및 비손상 영역에서 3개 (회색 및 백색 물질 양자를 횡단함)를 스캔하고, 총 강도 값을 각 그룹에 대해 평균하였다. 적어도 4개의 섹션을 상기 방식으로 각 동물에 대해 분석하였다. 최종 형광 값을 개별 섹션에 대한 기준선 (비손상 영역) 값에 대해 배 증가로서 표시하고, 이를 겔 및 운반체 주사된 그룹 사이의 비교를 위해 각 동물에 대해 그룹핑하였다.
신경로 추적. 손상 후 1 일 또는 9 주에, 마우스를 아베르틴으로 마취시키고, 당긴 유리 마이크로피펫으로 장착된 10 ㎕ 해밀턴 마이크로주사기를 이용하여 미니-루비-접합된 BDA (Molecular Probes, Eugene OR)로 주사하였다. 척주 표지를 위해, 2 ㎕를 L5 후근신경절 내로 주사하였다. 상기 피질척수로를 정수리점에 대해 0.5 mm 전방, 0.5 mm 후방, 및 1.0 mm 후방에서 중간선에 대해 1.0 mm 측면에서 및 피질 표면으로부터 0.5 mm의 깊이에서 제조된 3가지 주사 (각각 0.5 ㎕)를 통해 표지하였다. 동물을 14일 후에 CO2 흡입을 이용하여 희생하고, 관류하였다.
BDA 가공 및 신경로 추적. 부유하는 연속적인 섹션을 모으고, 1x PBS 및 0.1% Triton X-100에서 3회 세정하고, 아비딘 및 바이오티닐화된 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (Vectastain ABC Kit, Vector, Burlingame, CA)를 이용하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 1x PBS에서 다시 3회 세정한 후, 50 mM Tris 버퍼, pH7.6, 0.024% 과산화수소, 및 0.5% 염화니켈 중의 DAB와 반응시켰다. 섹션을 이어서 PBS로 옮기고, 현미경 슬라이드 상이 일련의 순서로 마운팅하고, 신경로를 Neurolucida 소프트웨어 (MicroBrightField, Inc.)를 이용하여 추적하였다.
래트 척수 손상, 친양쪽성체 주사 및 동물 보호. 체중이 150-200 g인 성체 Long Evans Hooded 수컷 래트를 펜토바비탈 마취제를 이용하여 마취시켰다. 척추후궁절제술을 수행하였으며, 척수를 MASCIS 임팩터를 이용하여 척추 절편 T13에서 타박상을 입혔다 (손상의 최대 심각도를 생성하는 10 gm 중량/50mm 방울). 체온 및 수화 상태를 전술한 바와 같이 유지하였다. 동물을 각 케이지에 단독으로 수용하였다. 겔 주사를 위해, 27 게이지 바늘을 이용하였으며, 상기 친양쪽성체를 전술한 바와 같이 희석하였다. 타박 손상 후 24시간에, 래트를 펜토바비탈 마취제를 이용하여 재마취시켰다. 손상 자리의 노출에 이어, 5 ㎕의 희석된 친양쪽성체를 1.5mm의 깊이에서 병터 중심점에 대해 0.5 mm 입쪽 및 꼬리에서 l㎕/min의 속도로 주사하였다. 주사 말기에, 상기 바늘을 부가적인 2분 동안 척수에 방치하고, 이어서, 이를 철수하고, 상처를 닫았다. 기타 동물은 운반체 (글루코스 용액)의 유사한 주사를 받았다. 제3 그룹 (모방 주사)에서, 상처를 재개방한 후, 임의의 주사 없이 다시 닫았다.
조직 가공 및 면역조직화학. 동물을 CO2 흡입을 이용하여 희생시키고, 인산완충염수 (PBS) 중의 4% 파라포름알데히드를 이용하여 경심 관류하였다. 상기 척수를 해부하고, 4% PFA 중의 30% 수크로스에서 밤새 고정하였다. 상기 척수를 이어서 Tissue-Tek 포매 화합물에서 냉동하고, Leica CM3050S 냉동미세절단기 상에서 섹션하였다. 20㎛ 두께 종단면을 취하였따. 섹션을 PBS로 2회 세정한 후, 실온에서 1시간 동안 항-GFAP [1:250] (Sigma, 마우스 단클론 IgGl)와 인큐베이션하였다. 이어서, 섹션을 PBS로 3회 세정하고, 실온에서 1시간 동안 alexa-fluor 접합된 항- 마우스 IgGl 2차 항체 [1:500] (Molecular Probes)와 인큐베이션하였다. 섹션을 최종적으로 PBS로 3회 세정한 후, 실온에서 10분 동안 Hoechst 핵 염색액과 인큐베이션하였다. PBS로 최종 세정에 이어, 이를 Prolong Gold 항-페이드 (anti-fade) 시약 (Molecular Probes)을 이용하여 마운팅하고, Zeiss UVLSM-Meta 공초점 현미경 (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)을 이용하여 이미징하였다.
IKVAV-PA에서 전구세포의 배양 및 면역세포화학. Pl (출생 후 1일) 마우스의 뇌실하 영역을 해부하고, EGF (20ng/ml), N2 및 B27 보충물, 헤파린, 페니실린, 스트렙토마이신 및 L-글루타민으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 키워 부유 구 (floating sphere)를 형성하였다. 세포를 1회 계대하고, 생성된 2차 구를 분석에 이용하였다. 세포를 분리하고, EGF (5 ng/ml)로 보충된 DMEM/F12 배지에서 적당한 기질 (예를 들면, IKVAV-PA에서 캡슐화 또는 폴리-d-라이신/라미닌 상에 배양) 상에 도말하였다. 모든 경우에, 이를 시험관 내 0일로서 취하였다. IKVAV-PA 망에서 전구세포의 캡슐화를 24 웰 배양 플레이트에서 12 mm 덮개 유리 상에 100㎕의 PA 용액을 먼저 분취하고, 자가 포함된 방울을 형성함으로써 달성하였다. 배양 배지 중의 100 ㎕의 세포 현탁액을 세포 현탁액이 도입될 때 피펫을 부드럽게 휘저으면서, PA 용액 방울 내로 피펫팅하고, PA 겔을 형성하였다. 상기 겔을 2 시간 이상 동안 인큐베이터 (37℃ 및 5% CO2, 95% 습도)에서 교란되지 않은 채 가라앉게 한 후, 300㎕의 배양 배지를 웰에 첨가하고, 부분적으로 상기 PA 겔을 잠기게 하였다. 플레이트를 이어서 인큐베이터로 다시 가져왔다. 대조군 배양을 위해, 12 mm 덮개 유리를 1시간 동안 폴리 D-라이신으로 코팅한 후, 증류수로 세정하고, 라미 닌(Sigma, 1 mg/100 ml DMEM)으로 밤새 코팅하였다. 세포를 갖는 500㎕의 배양 배지를 5xlO4 세포/ml의 도말 밀도로 웰에 첨가하였다. 면역세포화학을 위해, 캡슐화된 세포 유래의 배양 배지를 제거하고, IKVAV-PA에서 캡슐화된 세포를 전체 PA-겔을 고정액에 잠기게 함으로서 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 라미닌 상에 도말된 세포에 대해, 덮개 유리를 고정액에 위치하였다. 0.2% Triton-X 으로 5분 동안 인큐베이션 전에, PBS로 2회 세정하였다. 이어서 또 다른 2회 PBS 세정하고, 4℃에서 밤새 5% 염소 혈청을 포함하는 PBS 중의 1차 항체 (1:400의 항-β-튜불린 III IgG2a 또는 1:400의 항-GFAP IgGl, Sigma)로 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세정에 이어, 세포를 1시간 동안 실온에서 PBS 중의 TRITC- 또는 FITC-접합된 2차 항체와 인큐베이션하였다. PBS를 이용한 또 다른 3회 세정 후, 모든 핵을 실온에서 10분 동안 Hoescht's Stain (1:5000, Sigma)으로 염색하여 β-튜불린 및 GFAP 음성 세포를 포함하는 모든 세포의 핵을 관찰하였다. 세포 이미징을 PC 작동하는 AxioVision 이미징 소프트웨어 (Zeiss)와 인터페이싱된 Zeiss Axiovert 200 형광 현미경에 부착된 Axiocam 카메라를 이용하여 수행하였다.
펩티드 친양쪽성체의 유동 측정. 25mm 평행판 배치를 갖는 Paar Physica Modular Compact Rheometer를 이용하여 측정을 하였다. 0.1 내지 100 Hz 사이의 주파수 스윕(sweep)을 3% 염색에서 각 PA에 대해 취하였다.
실시예 2
자기 조립 골격 (scaffold)의 생성
뮤린 신경 전구세포 (NPC)를 이용하여 시험관 내에서 세포 분화를 유도하는 자기 조립 인공 골격의 용도를 연구하였다. NPC는 상실된 중추신경계 세포 (예를 들면, 퇴행성 또는 외상 손상)의 대체에서 용도를 발견한다 (예를 들면, Okano, J. Neurosci. Res. 69, 698 (2002); Storch and Schwarz, Curr. Opin. Invest. Drugs 3, 774 (2002); Mehler and Kessler, Arch. Neurol. 56, 780 (1999); Pincus et al., Neurosurgery 42, 858 (1998) 참고). 골격의 분자 디자인은 라미닌에서 발견되며, 신경돌기 발아를 촉진하고, 신경돌기 성장을 유도하는 것으로 알려진 펜타펩티드 에피토프 이소루신-라이신-발린-알라닌-발린 (IKVAV)을 혼입하였다 (예를 들면, Kam et al., Biomaterials 22, 1049 (2001); Matsuzawa et al., Int. J. Dev. Neurosci. 14, 283 (1996); Powell et al., J. Neurosci. Res. 61, 302 (2000); Cornish et al., Mol. Cell. Neurosci. 20, 140 (2002); Chang et al., Biosens. Bioelectron. 16, 527 (2001); Wheeler et al., J. Biomech. Eng. 121, 73 (1999); Lauer et al., Biomaterials 23, 3123 (2002); Thiebaud et al., Biosens. Bioelectron. 17, 87 (2002). Yeung et al., Neurosci. Lett. 301, 147 (2001) 참고). 생활성에 대한 대조군으로서, 천연 에피토프가 결여된 유사한 분자를 합성하고, 이를 비생리학적 서열인 글루탐산- 글루타민-세린 (EQS)로 대체하였다. 상기 분자는 자기 조립에 의해 물리학적으로 유사한 골격을 형성하나, EQS 겔 내에 캡슐화된 세포는 신경돌기를 발아하거나 또는 형태학적으로 또는 조직학적으로 분화하지 않는다.
IKVAV 함유 펩티드 친양쪽성체 (IKVAV-PA)의 화학 구조 및 이의 자기 조립의 분자 그래픽 예시를 도 1A에 보여주며, 이것이 형성하는 골격의 주사전자현미경사진을 도 IB에 보여준다. 신경돌기-발아 에피토프 외에, 상기 분자는 세포 배양 배지에서 양이온이 이들 사이에 정전기적 반발을 스크리닝하고, 세포 현탁액이 첨가될 때 자기조립을 촉진할 수 있도록 pH 7.4에서 알짜 음전하를 제공하는 Glu 잔기를 포함한다. 서열의 나머지는 4개의 Ala 및 3개의 Gly 잔기 (A4G3)에 이은 16개 탄소의 알킬 꼬리로 이루어진다. 상기 A4G3 및 알킬 절편은 에피토프로부터 떨어진 증가하는 소수성 서열을 생성한다. 기작의 이해가 본 발명을 실시하기 위해 필요하지 않으며, 본 발명이 임의의 특정 작용 기작에 제한되지 않지만, 특정 구현예에서, 정전기적 반발이 전해질에 의해 스크리닝되면, 상기 분자는 수소결합 형성 및 소수성 절편 및 물 분자 사이의 바람직하지 않은 접촉에 의해 조립이 유도된다는 것이 고려된다.
수성 매질에서 자기 조립하는 나노섬유는 반데르발스 패킹 거리에서 이의 표면 상에 생활성 에피토프를 위치한다 (예를 들면, Hartgerink et al., Science 294, 1684(2001); Hartgerink et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5133 (2002) 참고). 상기 나노섬유는 3D 망을 형성하고, 겔 유사 고체를 생성하기 위해 다발을 이룬다 (도 1C, ID 및 1E 참고). 상기 나노섬유는 높은 종횡비 및 높은 표면적을 가지며, 직경이 5 내지 8 nm이며, 길이가 수백 나노미터에서 수 마이크로미터이다. 3D로 세포 주위에 형성하는 나노섬유는 천연 세포외 매질에 비해 인위적으로 높은 밀도로 에피토프를 제시할 수 있다. 그리하여, 특정 구현예에서, 본 발 명은 세포에 신호 (예를 들면, 펩티드 신호 서열) 현시를 위한 운반체 (예를 들면, 자기 조립 골격 (예를 들면, 나노섬유 함유))를 제공한다.
실시예 3
나노섬유 골격의 규명
1 중량% (wt%) 펩티드 친양쪽성체 수용액을 1:1 부피비로 배지 또는 생리학적 유체 중의 NPC 현탁액과 혼합할 때, 도 1C 및 1D에 보여준 투명한 겔 유사 고체를 수 초 내에 수득하였다. 상기 고체는 캡슐화된 분리된 NPC 또는 신경구로서 알려진 세포 집단을 포함하였다. 상기 세포는 자기 조립 과정에서 생존하였으며, 관찰 기간 (22일) 동안 생존해 있었다 (도 2A 내지 2D 참고). 나노섬유 망에서 캡슐화된 세포 (도 2D 참고)에 비해 폴리(D-라이신) (PDL, 많은 세포 유형을 배양하기 위해 이용되는 표준 기질) 상에서 배양된 세포 사이에 생존능에 현저한 차이가 없었다. 그리하여, 본 발명은 상기 매우 수화된 망을 통한 영양분, 생활성 인자, 및 산소의 확산이 연장된 기간 동안 많은 수의 세포의 생존에 충분하다는 것을 입증한다. 자기 조립 분자에 의해 형성된 인공 골격은 99.5 wt% 물을 포함하며, 기작의 이해가 본 발명을 실시하기 위해 필요하지 않으며, 본 발명은 임의의 특정 기작에 제한되지 않지만, 나노섬유의 높은 종횡비는 기계적으로 지지 기질이 상기 저농도의 펩티드 친양쪽성체를 형성하게 한다는 것이 고려된다. 그리하여, 인공 세포외 기질은 세포에 대한 기계적 지지를 제공할뿐만 아니라, 가용성 인자의 확산 및 세포의 이동이 일어날 수 있는 매질로서 이용된다.
실시예 4
골격에 노출된 (예를 들면, 골격에 의해 캡슐화된) 신경 전구체 세포의 증진된 분화
생활성 골격에서, 면역세포화학에 의해 측정된 뉴런으로 분화한 NPC의 세포체 영역 및 신경돌기 길이는 PDL- 또는 라미닌-코팅된 기질 상에 배양된 세포와 비교하여 통계학적으로 유의한 차이를 보여주었다. 나노섬유 망 내의 뉴런은 대조군 배양에서의 뉴런보다 현저하게 컸다. 망에서 캡슐화된 전구세포의 평균 세포체 영역은 1일 및 7일 후에 현저하게 더 컸다 (도 2E 참고). 나노섬유 골격에서 캡슐화는 단지 1일 후에 큰 신경돌기의 형성을 초래한 반면(약 57 ± 26 ㎛, 평균 ± SD), PDL 및 라미닌 상에서 배양된 세포는 초기에 신경돌기를 발달하지 않았다. 상기 뉴런은 또한 7일 후에 PDL 기질 상에 배양된 세포와 비교하여 골격의 현저하게 더 긴 과정을 가졌다 (P <0.01). PA 골격 상에서 배양된 세포 및 라미닌-덮힌 기질 상에서 배양된 세포 사이의 7일 후의 신경돌기 길이의 통계학적 차이가 없었다. 7일 동안 생활성 골격에서 캡슐화된 NPC의 투과전자현미경기술 (TEM)은 전체 횡단면에서 보이는 풍부한 과정을 포함하는 건강하고 정상적인 초미세구조 형태를 보여주었다 (도 2F 참고).
실시예 5
나노섬유 골격 내의 세포 이동
나노섬유 골격 내의 세포 이동의 가능성을 평가하기 위해, 상기 캡슐화된 신경구를 14일 동안 추적하였다 (도 3A 및 3B 참고). 모든 3개의 신경구는 외부로 이동된 구성 세포로서 이의 중심으로부터 펼쳐졌다. 상기 효과는 각 신경구의 중 심 및 이의 외주에서 세포체 사이의 거리의 복수의 측정을 함으로써 정량화하고 (예를 들면, Zhu et al, J. Neurosci. Res. 59, 312 (2000) 참고), 개별 세포는 세포 덩어리의 중심으로부터 멀리 이동하는 것으로 관찰될 수 있었다. 나노섬유 기질 내의 세포의 이동은 시간 함수로서 통계학적으로 유의하였다 (P < 0.05) (도 3A 참고). 대조적으로, 더욱 조밀하고, 더욱 강한 망으로 캡슐화된 NPC (99.5% 물과 반대로 98%)는 생존하지 못하였다. 생활성 IKVAV 서열 대신에 EQS 서열을 갖는 나노섬유를 포함하는 비생활성 골격에서, 세포는 생존했을때 조차도 신경구로부터 멀리 이동하지 못하였다. 더 큰 정도의 신경돌기 성장은 또한 비생활성 EQS-PA외 비교하여 IKVAV-PA에서 관찰되었다 (도 3C 참고).
실시예 6
신경 전구체 세포의 분화
면역세포화학을 이용하여 배양 1일 및 7일 후에 전구세포의 시험관 내 분화를 확립하였다. 뉴런 및 성상세포 (중추신경계 (CNS) 아교세포의 서브클래스)의 β-튜불린 III 및 교섬유성산단백 (GFAP) 마커 (도 4A 내지 4E 참고). 면역세포화학에 의해 보여준 바와 같이, 이의 표면 상에 IKVAV를 제시하는 나노섬유를 갖는 망에서 캡슐화된 NPC는 신속하게 뉴런으로 분화하였으며, 총 세포의 약 35%가 단지 1일 후에 β-튜불린에 대해 양성으로 염색되었다. 대조적으로, 7일 이후조차도 GFAP+ 성상세포 분화는 거의 없었다 (<5%). 성상세포 증식의 저해는 CNS 외상에 따른 축삭 신장에 대한 알려진 장벽인 아교세포 흉터의 예방에 중요한 것으로 믿어진다 (예를 들면, Rabchevsky and Smith, Arch. Neurol. 58, 721 (2001); Chen et al., Mol. Cell. Neurosci. 20, 125 (2002); Costa et al., Glia 37, 105 (2002) 참고).
상기 골격에서 증진된 뉴런 수는 배양에서 단지 1일 후에 검출되었으며, 7일 후에도 유지되었다. 대조적으로, GFAP 발현은 나노섬유 망에서 배양된 세포와 비교하여 PDL- 및 라미닌-코팅된 기질 상에 배양된 세포에서 현저하게 컸다 (도 4F 및 4G 참고). 이전에 연구된 PDL- 또는 라미닌-코팅된 기질에 대해 (예를 들면, Gage et al., Annu. Rev. Neurosci. 18, 159 (1995); Parmar et al., Mol. Cell. Neurosci. 21, 645 (2002); Wu et al., J. Neurosci. Res. 72, 343 (2003); Alsberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12025 (2002) 참고), IKVAV 나노섬유 골격은 뉴런으로 전구세포의 더 크고 빠른 분화를 촉진하였다. 관찰된 분화는 비생활성 EQS 서열을 포함하는 PA 분자에 의해 형성된 골격 내의 동일한 세포를 배양함으로써 IKVAV 나노섬유 망에 특이적이라는 것이 확립되었다. 상기 골격 및 알기네이트 (다양한 종류의 세포에 대한 3D 기질로서 잘 연구된 갈조류로부터 대개 유리되는 젤라틴성 화합물 (예를 들면, Canaple et al, J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 13, 783 (2002); Chang et al., J. Biomed. Mater. Res. 55, 503 (2001); Marler et al., Plast. Reconstr. Surg. 105, 2049 (2000); Rowley and Mooney, Biomed. Mater. Res. 60, 217 (2002) 참고))에서, 상기 캡슐화된 세포는 정량가능한 양의 β-튜불린 III 또는 GFAP를 발현하지 못하였다. 3D EQS 대조군의 추가 시험으로서, IKVAV 가용성 펩티드를 100 ㎍/ml의 농도로 EQS-PA-세포 현탁액 혼합물 내로 투여하였다. 선택적인 뉴런 분화 또는 세포 발아 신경돌기가 관찰되 지 않았다. 그리하여, 본 발명은 자기 조립된 나노섬유에서 생활성 에피토프의 물리적 포획, 및 상기 골격에서 단지 이의 부재가 관찰된 세포 분화에서 중요하다는 것을 입증한다.
세포에 제공된 고밀도의 생활성 에피토프가 관찰된 신속하고 선택적인 분화에 중요한지를 결정하기 위해, "적정" 실험을 다양한 양의 IKVAV-PA 및 EQS-PA를 갖는 망을 이용하여 수행하였다. 4가지 상이한 증가하는 농도의 IKVAV-PA를 EQS-PA와 혼합하여 전술한 바와 같이 현탁된 NPC를 포함하는 나노섬유 골격을 형성하였다. 이용된 몰비는 100:0, 90:10, 50:50, 40:60, 및 10:90 이었다. 상기 혼합된 PA 망에서 나노섬유의 존재는 TEM에 의해 확인되었다. 상기 망의 나노섬유는 IKVAV-PA, 또는 EQS-PA, 또는 PA 분자 양자의 혼합물을 포함하였다. 각 경우에, 주요 변수는 세포 환경에서 생활성 에피토프의 밀도이다.
1일 후의 상기 시스템에서 면역세포화학 데이타 (도 4H 참고)는 세포 주위의 유용한 에피토프 밀도가 관찰된 세포 분화에 역할을 한다는 것을 보여준다. 비생활성 EQS-PA 골격에서 세포 분화는 또한 조사되었다. 상기 골격에서, 증가하는 양의 가용성 IKVAV 펩티드를 이용한 적정은 IKVAV-PA 나노섬유 골격에서 관찰된 뉴런 분화의 정도를 유도하지 못하였으며 (도 4H 참고), 다시 나노섬유 상에 에피토프의 세포에 대한 현시가 관찰된 분화에 결정적이라는 것을 보여준다.
실시예 7
2차원 (2D) 기질 상에 NPC 분화
IKVAV-PA 나노섬유로 코팅된 2차원 (2D) 기질 상의 NPC 분화를 조사하였다. 상기 PA 분자는 건조시 표면 상에 자기 조립하며 (예를 들면, Hartgerink et al., Science 294, 1684(2001); Hartgerink et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5133 (2002) 참고), 이는 TEM에 의해 확인되었다. 세포를 상기 표면 상에 1일 동안 도말하고, 면역세포화학에 의해 보여준 바와 같이, 상기 2D 표면은 뉴런으로 분화를 유도하는데 동일하게 효과적이었다. 실험 오차 내에서, 3D 골격에 비해 2D 기질 상에 뉴런으로 분화한 세포의 백분율은 동일하였다 (도 5 참고). IKVAV 가용성 펩티드 또는 라미닌으로 코팅된 기질 (도 4 참고)은 동일한 기간에 IKVAV-PA 나노섬유 상에서 관찰된 현저한 뉴런 분화를 초래하지 않았다. 발현된 IKVAV 펩티드로 코팅된 기질 상에 배양된 전구세포는 관찰 기간 동안 거의 정량불가능한 양의 β-튜불린 III 및/또는 GFAP를 발현하였다. 그리하여, 본 발명은 나노섬유는 2D 또는 3D 배양에서 이의 분화를 촉진하는 고밀도의 유용한 에피토프를 세포에 제공한다는 것을 입증한다. 더욱이, 본 발명은 에피토프 현시의 크기보다 밀도가 뉴런으로 세포의 신속하고 선택적인 분화에 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다. 상기 망에서 평균 크기의 나노섬유는 평가된 7.1 X 1014 IKVAV 에피토프/cm2를 포함한다. 고체 기질 상에 2차원 격자로 조밀하게 패킹된 라미닌 단백질 분자는 평가된 7.5 X 1011 IKVAV 에피토프/cm2를 가진다. 그리하여, 본 발명의 IKVAV를 포함하는 나노섬유는 대략 103의 인자에 의해 라미닌 단층에 비해 에피토프 밀도를 증폭한다.
실시예 8
조직에서 골격의 자기 조립
골격의 자기 조립은 또한 조직에 펩티드 친양쪽성체 용액의 주사에 의해 야기될 수 있다. 10 내지 80 ㎕의 1 wt% 펩티드 친양쪽성체 용액을 신선하게 핵이 제거된 래트 눈 제제 및 척수를 노출하기 위해 척추후궁절제술에 이어 래트 척수 내로 생체 내로 주사하였다. 그리하여, 상기 펩티드 친양쪽성체 용액은 조직과 접촉시 고체 골격으로 전환될 수 있다. 이 과정은 조직에 망을 국부화시키고, 주사 자리의 중심점으로부터 분자의 수동 확산을 막는다. 더욱이, 동물은 척수 내로 펩티드 친양쪽성체 용액의 주사 후에도 장기간 생존한다는 것이 알려져 있다.
본 발명의 방법은 또한 2차원 배양에 이용하기에 적합한 것으로 밝혀졌다. 도 5는 IKVAV-PA 나노섬유로 코팅된 기질 및 KVAV 펩티드로 코팅된 기질 상에서 2차원 배양에서 뉴런으로 분화한 총 세포의 백분율을 보여준다.
실시예 9
본 발명의 조성물의 규명을 위한 생체 내 모델
본 발명의 발달 동안 생성되고 규명된 펩티드 친양쪽성체의 특정 구현예의 모식도가 도 6 및 7에 제공된다. 상기 실시예 1 내지 4에 논의된 바와 같이, 상기 생물질은 수용액으로부터 생활성으로 디자인된 잘 정의된 초분자 나노섬유로 제조된 3차원 기질로 자기 조립된다. 개별 나노섬유는 6-8 나노미터 범위의 잘 정의된 직경을 갖는 원통형을 가지며, 섬유 축에 수직으로 생활성 펩티드 서열을 제공할 수 있다 (도 9a- 9b, 및 도 7a 참고). 전술한 생물질의 하나의 예는 라미닌의 신경활성 펜타펩티드 에피토프 이소루신-라이신-발린-알라닌-발린 (IKVAV)을 혼입하는 나노섬유를 형성한다. 상기 나노섬유 기질은 배양된 뉴런에서 과정의 성장을 촉진하고, 배양된 배아 및 출생후 (실시예 1-4, 및 도 8 참고) 신경 전구세포의 성상세포 분화를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 그리하여, 실험을 본 발명의 발달 동안 수행하여, 손상된 신경 조직의 자리로 신경 손상 (예를 들면, 척수 손상) 후에 본 발명의 조성물 (예를 들면, 펩티드 친양쪽성체 (예를 들면, 수용액 중에 제형화됨) 포함)의 주사가 신경 축삭 성장을 촉진시키고/시키거나 성상교세포증 및 척수 손상 후에 축삭 재생의 주요 장애물인 아교세포 흉터의 형성을 감소시킬 수 있는지를 결정하였다.
척수 손상 (SCI)의 클립 압박 (clip compression) 모델을 이용하여 설치류에서 일정한 손상을 제공하였다. 상기 모델은 초기 충격에 이어 대부분의 인간 SCI에서 발견되는 것과 유사한 지속적인 압박이 뒤따르는 손상을 생성한다 (예를 들면, Joshi and Fehlings, J Neurotrauma 19, 191-203 (2002); Joshi and Fehlings, J Neurotrauma 19, 175-190 (2002) 참고). 본 발명의 발달 동안 수행된 연구는 손상에 따른 만성 단계에서조차, 기능적 체중 압박 뒷다리 운동을 거의 또는 전혀 하지 못하는 마우스에서 심각한 손상 (24g 중량)을 이용하였다. 성체 (10 주령) 129SvJ 암컷 마우스를 마취시키고, 클립을 뒷다리 모드의 완전한 마비를 초래하는 흉부 척수의 T13 수준에서 전술한 바와 같이 적용하였다 (예를 들면, Joshi and Fehlings, J Neurotrauma 19, 175-190 (2002) 참고). 손상 후 24시간에 임의의 뒷다리 운동을 보여주는 마우스를 연구에서 제외하였다.
실시예 10
펩티드 친양쪽성체의 생체 내 규명
손상된 척수에서 생분해성 펩티드 친양쪽성체의 안정성을 평가하기 위해, 형광 유도체를 합성하여 (도 6a 참고) UV 범위에서 빛으로 여기에 의해 척수 내의 골격의 가시화하였다. 상기 친양쪽성체는 또한 생체 내 주사 동안 더욱 천천히 겔화하는 시스템을 생성하기 위해 변형되었다 (도 6 및 7 참고). 글루코스 등장액 중의 1% 펩티드 친양쪽성체 용액을 유리 모세관 마이크로피펫을 이용하여 손상에 이어 24시간에 병터 자리 내로 주사하였다. 도 9c에 보여준 척수 내에 형성된 형광 겔 (주사 후 24시간에 수행된 이미징), 및 나머지는 여전히 주사 후 5주에 손상된 척수에서 관찰될 수 있었다 (도 9d 참고). 주사 후 5주에, 상기 형광 겔은 주사 자리에서 떨어진 척수 내로 확산하기 시작했다 (예를 들면, 기작의 이해가 본 발명을 실시하기 위해 필요하지 않으며, 본 발명이 임의의 특정 작용 기작에 제한되지 않지만, 이는 펩티드 및 지질 기재 기질의 생분해를 반영할 수 있다). 그리하여, 본 발명은 생체 내 나노섬유 골격의 수명이 수 주 정도라는 것을 입증한다.
실시예 11
성상교세포증에 대한 나노섬유 골격 효과
신경 손상에 따른 성상교세포증은 초기 비대 (증가된 세포 크기)뿐만 아니라 후기 과다형성 (증가된 세포수) 반응을 포함한다 (예를 들면, Faulkner, J. R. et al., J Neurosci 24, 2143-55 (2004); Steward et al., J Comp Neurol 459, 1-8 (2003); 및 도 10 참고). 성상교세포증에 대한 겔의 효과를 분석하기 위해, 척수 손상 후 24시간에 병터 자리를 글루코스 또는 운반체로 1:1로 희석된 펩티드 친양쪽성체를 이용하여 주사하였다 (글루코스, 실시예 1 참고). 상기 치료를 손상 후 24시간까지 연기하여 발견을 임상적으로 관련시켰다 (예를 들면, 인간 대상에 일어날 수 있는 사건을 나타내기 위해). 운반체 주사된 동물은 대조군으로서 이용하였으며, 실험은 운반체 주사된 그룹이 모방 수술된 동물과 비교하여 약간 증진된 회복을 가진다는 것을 입증하였다 (도 10b 참고). 상기 및 모든 부차적인 실험에 대해, 실험자는 상기 동물의 실체에 대해 눈멀게 하였다.
마우스를 면역조직화학 분석을 위해 손상 후 4일 또는 11주에 희생하였다. 성상교세포증을 정량하기 위해, 병터 주위의 GFAP 면역형광의 강도를 척수의 비손상된 부분에서 기준선 수준과 비교하여 측정하였다 (방법론에 대해 실시예 1 참고). SCI 후 4일에, GFAP 면역조직화학은 처리 및 대조군 동물 사이에 명백한 차이를 나타내지 않았으며, 상기 시간에 GFAP의 수준의 정량화는 유사하게 차이를 나타내지 않았다 (도 9f 참고). 그리하여, 초기 단계에서, 나노섬유 겔은 성상세포 비대를 막지 못하였다. 그러나, 손상 후 11주에, GFAP 면역조직화학은 겔 주사된 그룹에서 성상세포 수의 명백한 감소를 나타냈으며 (도 9e 참고), GFAP 면역형광의 정량화 (도 9f)는 처리된 그룹에서 현저한 감소를 보여주었다 (평균: 겔 주사된 그룹에 대해 2.0+0.1; 운반체 주사된 그룹에 대해 2.7+0.2, p<0.04). 그리하여, 본 발명은 펩티드 친양쪽성체 용액의 주사는 혈액뇌 장벽을 복구하고, 항상성을 회복하는데 중요한 초기 반응성 비대를 변경하지 않으면서, 병터 자리에서 성상교세포 증식 및 흉터 형성을 억제한다는 것을 입증한다 (예를 들면, Faulkner, J. R. et al. J Neurosci 24, 2143-55 (2004) 참고).
실시예 12
나노섬유 겔의 생체 내 투여는 손상된 운동 및 감각 축삭의 회복을 촉진한다
다음으로, 본 발명의 조성물의 투여가 손상된 운동 및 감각 축삭의 실제적인 재생을 촉진할 수 있는지를 결정하였다. 하강 피질척수 운동 섬유 (CST)의 분석을 위해, 바이오티닐화된 덱스트란 아민 (BDA)을 손상 후 9주에 감각운동피질 내로 주사하였다 (방법론에 대해 실시예 1 참고). 2주 후에, 상기 동물을 희생시키고, 조직을 일련의 20㎛ 두께 종단면의 분석을 위해 각 그룹에서 3마리 동물로부터 가공하였다. 일련의 섹션을 모아서, 개별 축삭이 섹션에서 섹션으로 추적될 수 있도록 하고, 병터에 대해 입쪽으로 500 ㎛ 거리 내에 표지된 각 축삭에 대해 Neurolucida 이미징 소프트웨어를 이용하여 과정을 추적하였다. 겔 주사된 동물 및 운반체 주사된 동물로부터의 대표적인 추적은 처리군 및 손상 후 9주에 BDA 주사를 받은 대조군 사이에 현저한 차이를 예시한다 (11주에 분석함) (도 11 참고). 나노섬유 겔 그룹에서 표지된 축삭의 거의 80%는 대조군 동물에서 상기 섬유의 약 50%와 비교하여 병터에 들어갔다 (도 11 참고). 대조군 동물에서 어떤 섬유도 병터를 횡단한 길의 25% 만큼 멀리서 검출되지 않았다. 대조적으로, 나노섬유 겔 처리된 그룹에서 대략 50%의 섬유는 병터를 통한 길의 반을 통과하고, 약 45%의 섬유는 거리의 3/4를 통과하였다. 현저하게, 약 35%의 섬유는 실제로 병터를 통해 성장하였으며, 병터에 대한 척수 꼬리에 들어갔다. 이용된 손상의 심각도에 대해, 축삭의 보존 (sparing)은 일어나지 않을 것이다.
그럼에도 불구하고, 축삭 보존의 가능성을 더욱 명확히 배제하기 위해, BDA를 손상 후 1일에 감각운동피질 내로 주사하고, 신경로 추적을 2주 후에 조사하였 다. 이 때, 겔 처리된 그룹에서 단지 15%의 섬유가 병터에 들어가는 것이 관찰되었으며, 운반체 처리된 그룹에서 어떤 섬유도 병터에 들어가는 것이 관찰되지 않았다. 더욱 중요하게, 이 때에 각 그룹에서 어떤 섬유도 병터를 통한 길의 25% 조차 관찰되지 않았는데, 이는 보존된 섬유가 존재하지 않았다는 것을 입증한다. 부가적으로, 또한 보존 축삭으로부터 재생을 구별하기 위한 엄격한 기준을 적용하는 것이 중요하다 (예를 들면, Steward et al., J Comp Neurol 459, 1-8 (2003) 참고). 나노섬유 겔 처리된 그룹에서 축삭은 흉터의 조직에 들어갔으며, 조직 환경을 통한 비정상적인 과정을 따랐다. 상기 축삭이 여행한 거리는 그럴듯한 재생율과 일치하였으며, 추적에서 보여준 바와 같이, 상기 섬유는 병터를 지난 직후에 정지하였다. 상기 축삭에서 비정상적인 분지 패턴 및 기타 비전형적인 형태학적 특성이 또한 관찰되었다. 그리하여, 본 발명은 나노섬유 겔이 피질척수로 운동 섬유의 재생을 촉진한다는 것을 입증한다.
감각 축삭 재생의 분석을 위해, BDA를 손상 후 9주에 경계 표지로서 좌골신경의 도입점을 이용하여, L5 후근 (감각) 신경절 내로 주사하고, 상기 동물을 분석을 위해 2주 후에 희생하였다. 연속적인 섹션 및 Neurolucida 이미징을 이용한 축삭의 추적을 하강 운동 섬유의 추적과 유사한 방식으로 각 그룹에서 4마리 동물에 대해 수행하였다. 겔 주사된 및 운반체 주사된 동물로부터의 추적은 처리군 및 손상 후 9주에 BDA를 받은 대조군 사이에 현저한 차이를 예시한다 (도 12 참고). 겔 그룹에서 대략 60%의 표지된 축삭이 대조군 동물에서 단지 약 20%의 섬유와 비교하여 병터에 들어갔다 (도 12 참고). 대조군 동물에서 단지 섬유는 병터를 횡단한 길의 25% 성장하지 못하였으며, 대조군 동물에서 어떤 섬유도 50% 만큼 멀리 통과하지 못하였따. 대조적으로, 처리군에서 대략 35%의 섬유가 병터를 통한 길의 25%를 통과하였으며, 약 25%의 섬유는 거리의 50%를 통과하였다. 중요하게, 약 10%의 섬유는 실제적으로 병터를 통해 성장하였으며, 병터에 대해 입쪽 척수로 들어갔다. 상기 축삭은 또한 보존된 축삭에 대해 재생된 축삭에 대한 기준을 만족시켰다 (예를 들면, Steward et al., J Comp Neurol 459, 1-8 (2003) 참고).
축삭 보존의 가능성을 더욱 명확히 배제하기 위해, BDA를 손상 후 1일에 L5 후근 (감각) 신경절 내로 주사하고, 신경로 추적을 2주 후에 조사하였다. 이 때, 각 그룹에서 어떤 섬유도 병터를 통한 길의 25% 만큼 멀리 통과하는 것이 관찰되지 않았는데, 이는 보존된 섬유가 존재하지 않았다는 것을 입증한다. 그리하여, 본 발명은 생활성 나노섬유 망이 감각뿐만 아니라 피질척수로 운동 섬유의 재생을 촉진한다는 것을 입증한다.
실시예 13
행동 회복과 관련된 해부학적 개선
관찰된 해부학적 개선이 마우스에 대해 변형된 Basso, Beattie, 및 Bresnahan (BBB) 운동 스케일을 이용한 행동 회복과 관련되는 지를 결정하였다 (예를 들면, Joshi and Fehlings, J Neurotrauma 19, 175-190 (2002); Bresnahan et al., Exp Neurol 95, 548-70 (1987); Basso et al. Exp Neurol 139, 244-56 (1996) 참고). 행동 시험을 치료 후 9주 동안 매주 수행하였다 (도 13a). 처음 5주 동안, 대조군 및 자기 조립 분자로 주사된 그룹 사이에 현저한 차이가 없었으나, 5주 및 그 후에, 겔 주사된 그룹은 대조군과 비교하여 현저한 행동 개선을 나타내었다. 9주에, 대조군에 대한 평균 BBB 스코어는 7.03+0.8인 반면, 겔 주사된 그룹에 대한 평균 스코어는 9.2+0.5 (p<0.04)이었다. 이는 현저한 기능 회복을 나타내는데, 스코어 7은 뒷다리의 모든 3가지 관절에서 광대한 범위의 운동에도 불구하고 기능적 개선이 없다는 것을 의미하는 반면, 스코어 9는 동물이 운동 동안 이의 발의 등쪽에 발을 내디디는 등 발디딤을 나타내기 때문이다 (예를 들면, 뒷다리 운동은 기능적 이용을 가진다). 현저하게 그룹 사이의 차이는 손상 후기 단계에 명백하였으며, 보호 효과보다 재생 반응과 더욱 일치한다.
행동 회복에 대한 생활성 겔의 효과를 또한 래트에서 척수 손상의 상이하고, 더욱 널리 이용된 타박상 모델인 MASCIS 충격기에서 BBB 운동 스케일을 이용하여 평가하였다 (예를 들면, Young, Prog Brain Res. 137:231-55 (2002) 참고) (도 13b 참고). 결과는 마우스에서 클립 타박상 모델을 이용한 발견과 유사하였다. 운반체 주사된 및 겔 주사된 그룹은 처음 5주 동안 서로 거의 차이가 없었다. 또한, 주사된 그룹이 약간 더 높은 스코어를 갖는 경향이지만, 상기 그룹 및 모방 주사된 그룹 사이에 현저한 차이가 없었다. 5주 및 그 후에, 겔 주사된 그룹은 모방 주사된 그룹 및 운반체 주사된 그룹 양자와 비교하여 현저한 행동 개선을 나타내었다. 9주에, 모방 주사된 대조군에 대한 평균 BBB 스코어는 9.4+0.6인 반면, 운반체 주사된 그룹에 대한 평균 스코어는 9.9+0.5 이었다. 대조적으로, 겔 주사된 그룹에 대한 평균 BBB 스코어는 12.7+0.6 이었으며, 이는 대조군보다 현저하게 높았다 (p<0.02). 기능적으로, 이는 현저한 개선이며, 대조군에서 등 발디딤 및 자기 조 립 생활성 기질을 갖는 그룹에서 빈번한 앞다리 뒷다리 조절을 갖는 일정한 체중 지지 발바닥 스텝 사이의 차이를 나타낸다.
본 명세서에 언급된 모든 공개공보 및 특허는 본원에 원용에 의해 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이가 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 함께 기재되었지만, 청구된 발명은 상기 특정 구현예에 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 정말로, 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형이 하기 청구범위의 범위 내에서 의도된다.

Claims (51)

  1. 뉴런과, 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 뉴런의 발생의 변경 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런의 발생의 변경은 축삭(axonal) 성장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 축삭 성장은 하강 운동(descending motor) 섬유 성장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 축삭 성장은 상행 감각(ascending sensory) 섬유 성장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 발생의 변경은 병터 자리(lesion site)를 통해 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런의 발생의 변경은 감소된 성상교세포증을 동반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 IKVAV 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런은 손상된 척수에서의 뉴런인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 척수는 외상 척수 손상에 의해 손상된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런은 감각 뉴런인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런은 운동 뉴런인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런의 발생의 변경은 상기 뉴런의 발생을 촉진시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런의 발생의 변경은 손상된 뉴런의 발생을 재생시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물은 성장인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 성장인자는 신경영양인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런은 신경돌기인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. a) 대상에게 손상된 신경을 제공하는 단계, 및
    b) 뉴런 성장이 상기 대상에서 발생하도록 하는 조건하에 상기 대상에게 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상을 치료하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 뉴런 성장은 축삭 성장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 축삭 성장은 하강 운동 섬유 성장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 축삭 성장은 상행 감각 섬유 성장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항에 있어서, 상기 뉴런 성장은 상기 손상된 신경의 자리에 축삭 성장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 17 항에 있어서, 상기 뉴런 성장은 상기 대상에서 감소된 성상교세포증을 동반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 17 항에 있어서, 상기 뉴런 성장은 상기 대상에서 감소된 흉터 형성을 동반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 감소된 성상교세포증 및 상기 감소된 흉터 형성은 신경 손상의 자리에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 17 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 IKVAV 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 17 항에 있어서, 상기 손상된 신경은 손상된 척수에서의 신경인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 손상된 신경은 외상 척수 손상에 의해 손상된 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 17 항에 있어서, 상기 손상된 신경은 손상된 감각 뉴런을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 17 항에 있어서, 상기 손상된 신경은 손상된 운동 뉴런을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 17 항에 있어서, 상기 뉴런 성장은 손상된 뉴런의 발생을 재생시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 17 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물은 성장인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 성장인자는 신경영양인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 17 항에 있어서, 상기 투여 단계는 상기 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 수용액의 비경구 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 상기 손상된 신경과 접촉시 나노섬유 겔을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 17 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 형광 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 형광 물질은 피렌부틸 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 17 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 조성물은 하나 이상의 다른 물질과 동시 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 물질은 신경영양인자, 신경성장저해제의 저해제, 신경성장유인제 및 신경성장저해제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 신경영양인자는 신경성장인자 (NGF), 뇌유래 신경영양인자 (BDNF), 신경영양인자-3 (NT-3), 신경영양인자-4/5 (NT-4/5), 섬모 신경영양인자 (CNTF), 백혈병 저해인자 = 콜린성 신경분화 인자 (LIF/CDF), 카디오트로핀-1, 염기성 섬유모세포성장인자 (bFGF), 산성 섬유모세포성장인자 (aFGF), 섬유 모세포성장인자-5 (FGF-5), 인슐린, 인슐린유사성장인자 I (IGF-I), 인슐린유사성장인자 II (IGF-II), 전환성장인자 βl (TGFβl), 전환성장인자 β2 (TGFβ2), 전환성장인자 β3 (TGFβ3), 액티빈, 신경교세포유래 신경영양인자 (GDNF), 미드카인헤파린 결합 신경영양인자 (HBNF), 플레이오트로핀, 표피성장인자 (EGF), 전환성장인자 α (TGFα), 신경초종유래 성장인자, 헤레굴린 (뉴레귤린, ARIA), 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 축삭 리간드-1 (Al-1), elf-1, ehkl-L, 및 LERK2로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 상기 신경성장저해제의 저해제는 Nogo, Ryk, Ryk 유사 저해제, sFRP, sFRP 유사 물질, MAG, Omgp, Wnt 또는 CSPG의 발현 및/또는 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 대상에서 뉴런 성장을 변경하도록 배치된, IKVAV 서열을 포함하는 펩티드 친양쪽성체를 포함하는 약학 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 뉴런 성장의 변경은 뉴런 성장을 촉진하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제 41 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 SLSL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 SLSL 서열은 치료학적으로 유용한 펩티드 친양쪽성체의 자기 조립을 제공하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제 41 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 A3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 A3 서열은 치료학적으로 유용한 펩티드 친양쪽성체의 자기 조립을 제공하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제 41 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 헤테로원자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 헤테로원자는 Br, I 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제 41 항에 있어서, 상기 펩티드 친양쪽성체는 분지기(branching group)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 분지기는 상기 펩티드 친양쪽성체 내에 존재하는 펩티드 에피토프의 유용성을 개선하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제 49 항에 있어서, 상기 분지기는 이의 N-말단에 변형된 라이신 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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