JP7142284B2 - 神経伸長促進剤 - Google Patents
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Description
[2] さらに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいメチオニンを含有する[1]に記載の神経伸長促進剤。
バリンは、下記式で表される化合物であり、α位の炭素にアミノ基が結合したα-アミノ酸であって、分枝構造を有する分岐鎖アミノ酸(BCAA)である。
N置換もしくは無置換のバリンは、L体であってもD体であってもよく、L体とD体の混合物として神経伸長促進剤に含有されていてもよいが、神経伸長促進剤が含むN置換もしくは無置換のバリン全量の50mol%超がL体であることが好ましく、70mol%超がL体であることがより好ましく、80mol%超がL体であることがさらに好ましく、神経伸長促進剤が含む全てのN置換もしくは無置換のバリンがL体であることが最も好ましい。
以下において、アミノ基の水素原子が置換基で置換されたバリン(N置換バリン)の具体例を例示する。ただし、本発明において用いることができるN置換バリンはこの具体例によって限定的に解釈されるべきものではない。
以下において、アミノ基の水素原子が置換基で置換されたメチオニン(N置換メチオニン)の具体例を例示する。ただし、本発明において用いることができるN置換メチオニンはこの具体例によって限定的に解釈されるべきものではない。
また、神経伸長促進剤が、N置換もしくは無置換のバリン以外の成分を含む場合、神経伸長促進剤におけるN置換もしくは無置換のバリンの含有量は、神経伸長促進剤の全質量に対して0.01質量%以上であることが好ましく、0.1質量%以上であることがより好ましく、1質量%以上であることがさらに好ましい。また、例えば50質量%以上、90質量%以上、99質量%以上とすることもできる。
このため、本発明の神経伸長促進剤は、経口で摂取され、その成分が腸管から吸収された場合には、末梢、中枢に関わらず到達した神経系において幹細胞の神経細胞への分化、神経突起の形成を効果的に促進し、神経突起の変性または損傷により損なわれた神経回路の再構築に寄与する。これにより、神経変性疾患や神経損傷に起因する認知機能や運動機能の障害を効果的に軽減することができる。ここで、本発明の神経伸長促進剤は、生体成分であるバリンやバリン誘導体であるN置換バリンを用いているため安全性が高く、また、バリンおよび多くのN置換バリンは消化酵素による分解を受けないため、経口で摂取する内服剤として使用し易いという利点がある。
また、本発明の神経伸長促進剤は、培地で培養している幹細胞の神経細胞への分化を促進する作用を有する。このため、本発明の神経伸長促進剤は、iPS細胞等の多能性幹細胞や神経前駆細胞を利用する再生医療の分野において、それら幹細胞の神経細胞への分化を促進する分化促進剤としても効果的に用いることができる。これにより、幹細胞からの神経細胞の生産を効率よく行うことが可能となり、再生医療に関連する各種産業の生産効率向上およびコスト削減に大いに貢献することができる。
例えば本発明の神経伸長促進剤を内服薬として経口投与する場合、その投与量は80~2000mg/成人標準体重/日であることが好ましく、1日に2~3回に分けて投与することが適当である。
また、本発明の神経伸長促進剤を、多能性幹細胞や神経前駆細胞を培養する培地に添加する場合、その添加量は、全量に対する質量比率で0.1質量%以上であることが好ましく、0.2質量%以上であることがより好ましく、0.2~1.0質量%であることがさらに好ましい。また、N置換もしくは無置換のバリンとしての添加量は、乾燥重量で0.03質量%以上であることが好ましく、0.05質量%以上であることがより好ましく、0.05~0.25質量%であることがさらに好ましい。
上記のように、本発明の神経伸長促進剤は、神経伸長促進作用を有するとともに、多能性幹細胞や神経前駆細胞のような幹細胞の神経細胞への分化を促進する作用を有する。
このため、本発明の神経伸長促進剤は、ヒト等の動物に投与して、その神経変性疾患や神経損傷に起因する機能障害を軽減する内服剤として効果的に用いることができる。内服剤としての神経伸長促進剤には、必要に応じて、上記の分解生成物や賦形剤以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、ビタミン、野菜粉末、ミネラル、酵母エキス、着色剤、増粘剤などを必要に応じて含有させることができる。これらの成分の種類は特に制限されず、含有量は目的とする機能を十分に発揮させることができる範囲内で適宜調節することができる。
また、本発明の神経伸長促進剤は、iPS細胞等の多能性幹細胞や神経前駆細胞を利用する再生医療の分野において、培地や細胞の希釈液に添加して、これら幹細胞の神経細胞への分化を促進する分化促進剤として好適に用いることができる。神経伸長促進剤を添加する培地は、液体(ブイヨン)培地、半流動培地、固形(寒天)培地のいずれであってもよく、その組成も特に制限されない。また、希釈液についても、生理食塩水等、細胞の希釈液として通常用いられているものの、いずれにも適用可能である。
以下のようにして、L-バリン(神経伸長促進剤1)の溶液と、L-ロイシン溶液およびL-イソロイシン溶液を調製した。各アミノ酸の構造を下記に示す。下記式に示すように、L-ロイシンおよびL-イソロイシンは、L-バリンと同様に分枝構造を有する分岐鎖アミノ酸である。
L-バリンを培地(シグマアルドリッチ社製,RPMI-1640)に溶解して0.4μg/mLのL-バリン溶液および4μg/mLのL-バリン溶液を調製した。
L-バリンを培地(シグマアルドリッチ社製,Nutrient Mixture F-12 Ham)に溶解して0.4μg/mLのL-バリン溶液を調製した。
L-バリンの代わりに、L-ロイシンまたはL-イソロイシンを用いること以外は、調製例1と同様にして0.4μg/mLのL-ロイシン溶液および4μg/mLのL-ロイシン溶液、並びに、0.4μg/mLのL-イソロイシン溶液および4μg/mLのL-イソロイシン溶液を調製した。
L-バリンの代わりに、L-ロイシンまたはL-イソロイシンを用いること以外は、調製例1と同様にして0.4μg/mLのL-ロイシン溶液および0.4μg/mLのL-イソロイシン溶液を調製した。
理化学研究所バイオリソースセンターより入手した、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来PC12細胞をモデルに用い、各調製例で調製したL-バリン溶液の神経突起形成作用および神経分化促進作用を評価した。PC12細胞は、Bt2cAMP(Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate)やNGFを作用させると、増殖を停止して神経繊維を伸長し、交感神経節ニューロン様の樹状突起を伸ばすことが知られている。ここでは、このBt2cAMP誘導性の神経突起形成プロセスおよびNGF誘導性の神経分化プロセスにL-バリンを導入し、その神経突起形成作用および神経分化促進作用を評価するとともに、L-ロイシンおよびL-イソロイシンの作用と比較した。
ここで、PC12細胞は、10%ウマ血清(非働化済)、5%ウシ胎児血清(非働化済)、100U/mLのペニシリンGおよび100μg/mLのストレプトマイシンを含有するRPMI-1640培地を用い、5%CO2気相下で、37℃のインキュベーターにより培養し、70%程度にコンフルエントになった細胞を基本培地で剥離し、実験に使用した。以下では、このPC12細胞の培養に使用した培地と同組成の培地を「基本培地」という。
予備実験として、下記の実験(b)で培地に添加するBt2cAMPの適正濃度を検討した。
まず、PC12細胞を基本培地中に浮遊させ、単一細胞となるようによく懸濁した。このPC12細胞の懸濁液を、コラーゲンコート済みの96ウェルプレートに4.0x103cells/95μL/wellで播種し、5%CO2気相下、37℃で24時間培養した。培養後、Bt2cAMPを5mM、10mM、20mMまたは25mMで含有する各種ダルベッコPBS(-)(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca、Mg不含))を、Bt2cAMP濃度が0.25mM、0.5mM、1.0mMまたは1.25mMとなるように、各ウェル内の培地に5μLずつ添加し、さらに24時間培養した。培養後、各ウェル内の培地を除去し、1%グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液(0.1M、pH7.2)を各ウェル内に100μLずつ分注して20分間静置し、細胞を固定した。続いて、グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液を各ウェル内から除去し、ギムザ染色液を100μLずつ分注し、2~3分間静置して染色を行った。染色後、ギムザ染色液を各ウェル内から除去し、染色したウェル内のサンプルを超純水で2回洗浄した後、乾燥させた。
以上の処理を経た各ウェル内のサンプルを顕微鏡で観察し、細胞体の長径の2倍以上の長さで神経突起が形成されている細胞を陽性と判定し、全細胞数(陽性または陰性の判定を行った全細胞数)に対する陽性細胞数の百分率を神経突起形成率として求めた。ここで、陽性または陰性の判定は、1ウェル当たり300~400個の細胞について行った。
また、Bt2cAMPを含有するダルベッコPBS(-)の代わりに、Bt2cAMPを含有していないダルベッコPBS(-)をウェル内の培地に5μL添加したこと以外は同様にして、培養、グルタルアルデヒドによる固定、ギムザ染色を行い、染色後のサンプルを観察して神経突起形成率を求めた。
神経突起形成率のBt2cAMP濃度依存性を図1に示す。なお、図1における神経突起形成率は±SDで示しており、SDは同様にして行った3回の実験の標準偏差である。下記の実験(b)で測定した図2、3、4の神経突起形成率の表示もこれと同じである。
図1から示されるように、神経突起形成率は、培地のBt2cAMP濃度が1.0mMであるとき、19.5%と最大値になった。下記の実験(b)では、Bt2cAMPを神経突起形成のための誘導剤として使用するため、神経突起形成率が最大になる濃度(1.0mM)の1/2の濃度(0.5mM)を培地のBt2cAMP濃度として採用することとした。
上記の予備実験と同様にして、PC12細胞の懸濁液をコラーゲンコート済みの96ウェルプレートに4.0x103cells/90μL/wellで播種し、5%CO2気相下、37℃で24時間培養した。培養後、10mMのBt2cAMPを含有するダルベッコPBS(-)と、調製例1または調製例2で調製したL-バリン溶液をそれぞれ5μLずつ各ウェル内に添加し、さらに24時間培養した。このとき、各ウェル内の培地におけるBt2cAMP濃度はそれぞれ0.5mMである。その後、上記の予備実験と同様にして、グルタルアルデヒドによる細胞固定およびギムザ染色を行い、染色後のサンプルを観察して神経突起形成率を求めた。
また、L-バリン溶液の代わりに、比較調製例1、2で調製したL-ロイシン溶液、L-イソロイシン溶液、RPMI-1640培地、Nutrient Mixture F-12 Ham培地を各ウェル内の培地にそれぞれ5μLずつ添加すること以外は同様にして、培養、グルタルアルデヒドによる細胞固定およびギムザ染色を行い、染色後のサンプルを観察して神経突起形成率を求めた。
各サンプルの神経突起形成率をRPMI-1640培地またはNutrient Mixture F-12 Ham培地に添加したアミノ酸濃度に対してプロットしたグラフを図2、図3に示す。図2は調製例1、比較調製例1で調製した溶液(各分岐鎖アミノ酸をRPMI-1640培地に溶解して調製した溶液)を用いた場合のグラフであり、図3は調製例2、比較調製例2で調製した溶液(各分岐鎖アミノ酸をNutrient Mixture F-12 Ham培地に溶解して調製した溶液)を用いた場合のグラフである。
図2、3から、培地に微量のL-バリンを添加することにより、神経突起形成が有意に促進されることがわかった。一方、L-ロイシンとL-イソロイシンを培地に添加した系では、こうした神経突起形成促進作用が認められなかった。このことから、バリンの神経突起形成作用は、分岐鎖アミノ酸であることに起因するものではなく、バリン特有の作用であることが示唆された。
図6から示されるように、L-バリンとL-メチオニンを培地に共添加したことにより、それぞれのアミノ酸を単独で培地に添加した場合よりも強い神経突起形成促進作用が認められた。このことから、バリンとメチオニンの共添加により神経突起形成促進作用が相乗的に向上することがわかった。また、バリンとメチオニンを共添加する場合には、無置換のバリンと無置換のメチオニンを組み合わせることが作用増強の点で好ましいこともわかった。
ニューロフィラメントを神経分化マーカーとして用い、これを免疫蛍光染色法で染色することにより、L-バリンの神経分化促進作用を評価した。
PC12細胞を基本培地中に浮遊させ、単一細胞となるようによく懸濁し、1.4x104cells/mLに調製した。このPC12細胞の懸濁液を、コラーゲンコートした8ウェルチャンバースライドに5.0x103cells/360μL/wellで播種し、5%CO2気相下で、37℃のインキュベーターにより24時間培養した。培養後、200ng/mLのNGFを含有するダルベッコPBS(-)(NGF溶液)と、4μg/mLのL-バリンを含有するRPMI-1640培地(調製例1で調製したL-バリン溶液)をそれぞれ20μLずつ各ウェル内に分注し、さらに48時間培養した。培養後、各ウェル内の培地を除去し、PBS(-)(リン酸緩衝生理食塩水(Ca、Mg不含))で洗浄した後、4%ホルムアルデヒド溶液を各ウェル内に分注して30分間処理した後、PBS(-)で3分間の洗浄を3回行った。続いて、0.4%のTriton X-100(シグマアルドリッチ社製)を含有するPBS(-)を各ウェル内に分注し、30分間処理した後、PBS(-)で洗浄した。
次に、2.5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBS(-)を各ウェル内に分注して1時間処理した後、2.5%のBSAを含有するPBS(-)で200倍希釈した1次抗体(シグマアルドリッチ社製,Anti-neurofilament 200 IgG fraction of antiserum)を各ウェル内に分注して室温で2時間処理し、0.05%のTween 20(アトー社製)を含有するPBS(-)で3分間の洗浄を3回行った。続いて、2.5%のBSAを含有するPBS(-)で200倍希釈した2次抗体(シグマアルドリッチ社製,Anti-Rabbit IgG(whole molecule)-FITC antibody produced in goat)を各ウェル内に分注し、室温で1時間処理した後、0.05%のTween 20を含有するPBS(-)で3分間の洗浄を3回行った。以上の処理を経た各ウェル内のサンプルを核染色封入剤(コスモバイオ社製,DAPI-Fluoromount-G)にて封入し、カバーガラスを被せて四方をマニキュアすることにより標本1を作製した。また、NGF溶液の代わりにダルベッコPBS(-)を用い、L-バリン溶液の代わりにRPMI-1640培地を用いること以外は、上記と同様の工程で培養および免疫蛍光染色を行って比較標本1を作製し、L-バリン溶液の代わりにRPMI-1640培地を用いること以外は、上記と同様の工程で培養および免疫蛍光染色を行って比較標本2を作製した。
作製した各標本の蛍光染色画像を共焦点レーザー顕微鏡(オリンパス社製,FLUOVIEWFV10i)を用いて観察し、写真を撮影した。撮影した写真を図7に示す。図7中、左から1列目の写真は標本の位相コントラスト写真である。左から2列目の写真は励起波長359nm、検出波長461nmで撮影したDAPI蛍光染色画像であり、光って見える箇所が核に相当する。左から3列目の写真は励起波長495nm、検出波長519nmで撮影したFITC蛍光染色画像であり、光って見える箇所がニューロフィラメントに相当する。また、左から4列目の写真は、左から2列目の写真と3列目の写真を合成したものである。
培地にNGFとL-バリンを添加した標本1と、培地にNGFを添加し、L-バリンを添加していない比較標本2の各FITC蛍光染色画像を比較すると、標本1の蛍光染色画像の方が比較標本2の蛍光染色画像よりも光って見える箇所が多数存在しており、ニューロフィラメントが多く発現していることがわかる。このことから、培地のバリンを添加することにより、幹細胞からの神経分化が促進されることがわかった。
Claims (2)
- アミノ基の水素原子が炭素数2~6のアシル基で置換されていてもよい遊離バリンを含有するが、遊離ロイシンを含有しない神経伸長促進剤。
- さらに、アミノ基の水素原子が炭素数2~6のアシル基で置換されていてもよい遊離メチオニンを含有する請求項1に記載の神経伸長促進剤。
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