JP7142284B2

JP7142284B2 - 神経伸長促進剤

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Publication number: JP7142284B2
Application number: JP2018102184A
Authority: JP
Inventors: 章博田井; 武尊古賀; 祥夫若山
Original assignee: Laimu Corp
Current assignee: Laimu Corp
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Filing date: 2018-05-29
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Description

本発明は、神経伸長促進剤に関する。

ヒトの脳における情報伝達は、神経細胞がシナプスを介して網の目状に接合したネットワークにより行われている。ところが、成人ではその神経細胞が毎日１０万個以上消失し、これがアルツハイマー型認知症などの中枢神経系疾患の一因になっていると言われている。このため、この種の疾患の原因を究明し、治療法や予防法を確立することが必要とされている。

アルツハイマー型認知症の原因はいまだ完全に解明されていないが、原因物質がβアミロイドであるという仮説が有力視されている。βアミロイドが脳内で凝集するとアミロイド斑として沈着し、その後に神経細胞が死滅する。このため、これまでの研究は、βアミロイド産生酵素であるβ－セクレターゼやγ－セクレターゼに対する阻害薬を提案したり、アミロイドなどの抗原や抗体を用いた免疫療法を提案したりするものが多かった。しかし、これらの阻害薬や療法では十分な効果が得られなかったり、副作用があったりするといった問題があることが指摘されていた。

一方、神経栄養因子をアルツハイマー病の治療薬として応用する検討もなされている。神経栄養因子（ニューロトロフィン）とは神経細胞の生存、分化、再生を促進させる物質の総称であり、様々な栄養因子が同定されている（例えば、非特許文献１参照。）。中でも神経成長因子（nerve growth factor，ＮＧＦ）は、アルツハイマー病の病態に関連する前脳基底核コリン作動性神経細胞（basal fore-brain cholinergic neuron；ＢＦＣＮ）に対するニューロトロフィンであることから注目され、その研究が盛んに行われている（例えば、非特許文献２、３参照。）。すなわち、アルツハイマー病は、病因が不明で有効な治療手段を持たない痴呆疾患であるが、その患者の脳ではＢＦＣＮに顕著な障害（細胞数の減少、細胞体の萎縮、神経突起の変性）が起きていることが知られている。そして、ＢＦＣＮは記憶や学習能に関連する神経路であり、アルツハイマー病の痴呆病態はこの神経路の障害とよく一致している。そのためアルツハイマー病の病因の１つとしてＮＧＦの欠乏が考えられるようになっており、また、神経栄養因子をアルツハイマー病の治療薬として応用する試みもなされている。たとえば、ＢＦＣＮの死を誘発するようにしたモデル動物にＮＧＦを投与すると神経細胞死が抑制されるという結果がでている（例えば、非特許文献４、５参照。）。また、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）患者や初期のアルツハイマー病患者において、前脳基底部のＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）免疫陽性細胞数は認知機能テストの成績と相関することが報告されている（非特許文献６参照。）

Drug News Perspect, 15, 290-298 (2002) The EMBO Journal, 4, 1389, (1985) Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology, 109, 145 (1987) Neurobiology of Aging, 9, 689-690 (1988) Journal of Neuroscience, 5, 866 (1985) Journal of Comparative Neurology, 427, 19-30 (2000)

上記のように、ＮＧＦをアルツハイマー病の治療薬として応用する試みがなされている。しかしながら、ＮＧＦは高分子のタンパク質であり、消化管内でタンパク質分解酵素により分解されるため、経口で摂取しても脳に到達しない。また、静脈内投与しても血液脳関門を通過できないため、脳に到達しない。そのため、ＮＧＦを外部から投与して、その神経分化促進作用や神経成長作用を脳で発現させるためには、脳実質内あるいは脳室内へＮＧＦを直接的に投与するしかなく、患者の負担が大きいという問題がある。

そこで本発明者らは、このような従来技術の課題を解決するために、神経分化促進作用と神経突起形成作用を有し、活性成分が消化酵素による分解を受けにくく、血液脳関門を通過できる薬剤を提供することを課題として検討を進めた。

上記の課題を解決するために本発明者らが、生理活性と耐酵素性が期待できる低分子化合物としてアミノ酸に着目し、それらの神経細胞に対する作用を調べたところ、特に、バリンにおいて、神経突起の形成および神経分化を促進する作用が認められ、神経伸長促進剤として有用であることを見出した。本発明は、こうした知見に基づいて提案されたものであり、具体的に以下の構成を有する。

［１］アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいバリンを含有する神経伸長促進剤。
［２］さらに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいメチオニンを含有する［１］に記載の神経伸長促進剤。

本発明で用いるバリンは、神経突起を形成する作用と幹細胞の神経細胞への分化を促進する作用を有し、神経伸長促進剤として有用である。また、バリンは低分子化合物であるため、消化酵素による分解を受けにくく、血液脳関門を通過できる。そのため、バリンを含有する神経伸長促進剤は、例えば経口で摂取された場合でも、バリンが構造を維持したまま脳内に到達し、脳内においてその活性を発現しうる。

ＰＣ１２細胞における神経突起形成率のBt₂cAMP濃度依存性を示すグラフである。 Bt₂cAMPを添加したＰＣ１２細胞のＲＰＭＩ－１６４０培地に、Ｌ－バリン溶液、Ｌ－ロイシン溶液、Ｌ－イソロイシン溶液をそれぞれ０．０２μｇ／ｍＬまたは０．２μｇ／ｍＬで添加して培養したときの神経突起形成率を示すグラフである。 Bt₂cAMPを添加したＰＣ１２細胞のNutrient Mixture F-12 Ham培地に、Ｌ－バリン溶液、Ｌ－ロイシン溶液、Ｌ－イソロイシン溶液をそれぞれ０．０２μｇ／ｍＬで添加して培養したときの神経突起形成率を示すグラフである。 Bt₂cAMPを添加したＰＣ１２細胞のＲＰＭＩ－１６４０培地に、Ｌ－バリン溶液、Ｎ－アセチル－Ｌ－バリン溶液をそれぞれ０．２μＭまたは２μＭで添加して培養したときの神経突起形成率を示すグラフである。 Bt₂cAMPを添加したＰＣ１２細胞のＲＰＭＩ－１６４０培地に、Ｌ－メチオニン溶液、Ｄ－メチオニン溶液をそれぞれ０．２μＭ、２μＭまたは２０μＭで添加して培養したときの神経突起形成率を示すグラフである。 Bt₂cAMPを添加したＰＣ１２細胞のＲＰＭＩ－１６４０培地に、Ｌ－バリン溶液、Ｌ－メチオニン溶液、Ｌ－バリンとＬ－メチオニンの混合物の溶液をそれぞれ０．２μＭで添加して培養したときの神経突起形成率を示すグラフである。ＮＧＦおよびＬ－バリンを培地に添加せずに培養したＰＣ１２細胞（比較標本１）、ＮＧＦを培地に添加して培養したＰＣ１２細胞（比較標本２）、ＮＧＦおよびＬ－バリンを培地に添加して培養したＰＣ１２細胞（標本１）の位相コントラスト写真および蛍光染色画像である。

以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。

本発明の神経伸長促進剤は、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいバリンを含有する点に特徴がある。以下の説明では、アミノ基の水素原子が置換基で置換されたバリンを「Ｎ置換バリン」といい、Ｎ置換バリンと無置換のバリンを総称して「Ｎ置換もしくは無置換のバリン」ということがある。
バリンは、下記式で表される化合物であり、α位の炭素にアミノ基が結合したα－アミノ酸であって、分枝構造を有する分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）である。

バリンは、ヒトの必須アミノ酸の１つであり、生体内においてエネルギー源として利用されるとともに、骨格筋のタンパク質合成を促進し、タンパク質分解を抑制する作用を有することが知られている。一方、本発明者らがバリンの生理活性をさらに検討したところ、幹細胞の神経細胞への分化を促進する作用（神経分化促進作用）と神経突起を形成する作用（神経突起形成作用）が認められ、バリンが神経伸長促進剤として優れた機能を発揮することを明らかにした。また、ヒトの消化酵素には、大別して炭水化物分解酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素が存在するが、バリンは、いずれの酵素の分解も受けず、そのままの構造で腸管から吸収される。また、腸管から吸収され、血中に入ったバリンは血液脳関門を通過できる。そのため、バリンを含有する神経伸長促進剤は、例えば経口で摂取された場合でも、バリンが構造を維持したまま脳内に到達し、脳内においてその活性を効果的に発現しうる。

本発明で用いるＮ置換もしくは無置換のバリンは、遊離アミノ酸であることが好ましい。バリンがタンパク質やペプチドの構成単位として存在する場合、そのアミノ基が他のアミノ酸のカルボキシ基と脱水縮合してペプチド結合を形成し、そのカルボキシ基がさらに他のアミノ酸のアミノ基と脱水縮合してペプチド結合を形成したかたちで存在する。
Ｎ置換もしくは無置換のバリンは、Ｌ体であってもＤ体であってもよく、Ｌ体とＤ体の混合物として神経伸長促進剤に含有されていてもよいが、神経伸長促進剤が含むＮ置換もしくは無置換のバリン全量の５０ｍｏｌ％超がＬ体であることが好ましく、７０ｍｏｌ％超がＬ体であることがより好ましく、８０ｍｏｌ％超がＬ体であることがさらに好ましく、神経伸長促進剤が含む全てのＮ置換もしくは無置換のバリンがＬ体であることが最も好ましい。

本発明で用いるＮ置換もしくは無置換のバリンは、合成されたものであってもよいし、天然物から抽出されたものであってもよい。バリンの合成法として、α－ブロモイソ吉草酸にアンモニアを作用させる方法、ストレッカー反応を用いた合成法、微生物を用いたアミノ酸発酵による合成法を挙げることができる。また、天然物からのバリンの抽出は、機械的な天然物の小片化やホモジネート、酵素や酸、塩基による加水分解、各種分離精製法等を用いて行うことができる。

また、本発明におけるＮ置換バリンにおいて、置換基で置換されているのは、アミノ基を構成する２つの水素原子のうちの１つであっても２つであってもよいが、１つであることが好ましい。アミノ基の２つの水素原子が置換基で置換されているとき、その２つの置換基は互いに同一であっても異なっていてもよい。置換基の種類は特に限定されないが、例えばアルキル基、アシル基を挙げることができる。アルキル基は、その炭素数が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、例えば１～３の範囲内から選択することができる。アシル基は、その炭素数が２～１０であることが好ましく、２～６であることがより好ましく、例えば１～３の範囲内から選択することができ、アセチル基等を採用することが可能である。
以下において、アミノ基の水素原子が置換基で置換されたバリン（Ｎ置換バリン）の具体例を例示する。ただし、本発明において用いることができるＮ置換バリンはこの具体例によって限定的に解釈されるべきものではない。

本発明の神経伸長促進剤におけるバリンは、無置換のバリンのみから構成されていてもよいし、Ｎ置換バリンのみから構成されていてもよいし、無置換のバリンとＮ置換バリンの両方を含んでいてもよい。神経伸長促進剤がＮ置換バリンを含有する場合、そのＮ置換バリンは全て同一であってもよいし、２種類以上の組み合わせであってもよい。

本発明の神経伸長促進剤は、Ｎ置換もしくは無置換のバリンのみから構成されていてもよいし、Ｎ置換もしくは無置換のバリン以外の成分（他の成分）を含んでいてもよい。神経伸長促進剤に用いうる他の成分の好ましい例として、メチオニンを挙げることができる。Ｎ置換もしくは無置換のバリンとメチオニンを組み合わせて用いることにより、Ｎ置換もしくは無置換のバリンのみを用いる場合に比べて神経伸長促進作用を増強することができる。メチオニンは、下記式で表される化合物であり、Ｌ体であってもＤ体であってもよく、Ｌ体とＤ体の混合物として神経伸長促進剤に含有されてもよい。

また、Ｎ置換もしくは無置換のバリンと組み合わせて用いるメチオニンは、アミノ基の水素原子が置換基で置換されたものであってもよいが、神経伸長促進作用を増強させる点からは、無置換であることが好ましく、無置換のメチオニンと無置換のバリンを組み合わせて用いることがより好ましい。ここで、アミノ基が置換基で置換されたメチオニン（以下、「Ｎ置換メチオニン」ということがある）において、置換基で置換されているのは、アミノ基を構成する２つの水素原子のうち１つであっても２つであってもよいが、１つであることが好ましい。アミノ基の２つの水素原子が置換基で置換されているとき、その２つの置換基は互いに同一であっても異なっていてもよい。置換基の好ましい範囲と具体例については、上記のＮ置換バリンにおける、アミノ基の水素原子と置換する置換基の好ましい範囲と具体例を参照することができる。
以下において、アミノ基の水素原子が置換基で置換されたメチオニン（Ｎ置換メチオニン）の具体例を例示する。ただし、本発明において用いることができるＮ置換メチオニンはこの具体例によって限定的に解釈されるべきものではない。

本発明の神経伸長促進剤がバリンとメチオニン（いずれも、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよい）を含有する場合、バリンの含有率はバリンとメチオニンの合計量に対して１重量％以上であることが好ましく、１０重量％以上であることがより好ましく、３０重量％以上であることがさらに好ましい。また、９９重量％以下であることが好ましく、９０重量％以下であることがより好ましく、７０重量％以下であることがさらに好ましい。

また、本発明の神経伸長促進剤では、例えば、Ｎ置換もしくは無置換のバリンが天然物から抽出されたものである場合には、Ｎ置換もしくは無置換のバリン以外に、その天然物由来の成分を含んでいてもよい。また、本発明の神経伸長促進剤には、Ｎ置換もしくは無置換のバリン以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、神経伸長促進剤に賦形剤を含有させた場合には、成型が容易になるとともに、Ｎ置換もしくは無置換のバリンの含有量を変えずに神経伸長促進剤を増量させ、取り扱い性を改善することができる。賦形剤としては、特に限定されないが、デキストリンが好適である。賦形剤による希釈倍率は、質量比で２～１０倍であることが好ましく、２～７倍であることがより好ましく、３～５倍であることがさらに好ましい。
また、神経伸長促進剤が、Ｎ置換もしくは無置換のバリン以外の成分を含む場合、神経伸長促進剤におけるＮ置換もしくは無置換のバリンの含有量は、神経伸長促進剤の全質量に対して０．０１質量％以上であることが好ましく、０．１質量％以上であることがより好ましく、１質量％以上であることがさらに好ましい。また、例えば５０質量％以上、９０質量％以上、９９質量％以上とすることもできる。

本発明の神経伸長促進剤は、幹細胞の神経細胞への分化を促進する作用（神経分化促進作用）と、神経細胞に神経突起を形成する作用（神経突起形成作用）を有し、特にジブチリルｃＡＭＰ（Ｂｔ₂ｃＡＭＰ：Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate)により誘導される神経突起の形成、および、神経成長因子（ＮＧＦ）により誘導される神経分化を効果的に促進することができる。
このため、本発明の神経伸長促進剤は、経口で摂取され、その成分が腸管から吸収された場合には、末梢、中枢に関わらず到達した神経系において幹細胞の神経細胞への分化、神経突起の形成を効果的に促進し、神経突起の変性または損傷により損なわれた神経回路の再構築に寄与する。これにより、神経変性疾患や神経損傷に起因する認知機能や運動機能の障害を効果的に軽減することができる。ここで、本発明の神経伸長促進剤は、生体成分であるバリンやバリン誘導体であるＮ置換バリンを用いているため安全性が高く、また、バリンおよび多くのＮ置換バリンは消化酵素による分解を受けないため、経口で摂取する内服剤として使用し易いという利点がある。
また、本発明の神経伸長促進剤は、培地で培養している幹細胞の神経細胞への分化を促進する作用を有する。このため、本発明の神経伸長促進剤は、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞や神経前駆細胞を利用する再生医療の分野において、それら幹細胞の神経細胞への分化を促進する分化促進剤としても効果的に用いることができる。これにより、幹細胞からの神経細胞の生産を効率よく行うことが可能となり、再生医療に関連する各種産業の生産効率向上およびコスト削減に大いに貢献することができる。

本発明の神経伸長促進剤の使用量は、対象とする障害によっても異なるが、例えば以下の使用量で用いることが好ましい。
例えば本発明の神経伸長促進剤を内服薬として経口投与する場合、その投与量は８０～２０００ｍｇ／成人標準体重／日であることが好ましく、１日に２～３回に分けて投与することが適当である。
また、本発明の神経伸長促進剤を、多能性幹細胞や神経前駆細胞を培養する培地に添加する場合、その添加量は、全量に対する質量比率で０．１質量％以上であることが好ましく、０．２質量％以上であることがより好ましく、０．２～１．０質量％であることがさらに好ましい。また、Ｎ置換もしくは無置換のバリンとしての添加量は、乾燥重量で０．０３質量％以上であることが好ましく、０．０５質量％以上であることがより好ましく、０．０５～０．２５質量％であることがさらに好ましい。

［神経伸長促進剤の用途］
上記のように、本発明の神経伸長促進剤は、神経伸長促進作用を有するとともに、多能性幹細胞や神経前駆細胞のような幹細胞の神経細胞への分化を促進する作用を有する。
このため、本発明の神経伸長促進剤は、ヒト等の動物に投与して、その神経変性疾患や神経損傷に起因する機能障害を軽減する内服剤として効果的に用いることができる。内服剤としての神経伸長促進剤には、必要に応じて、上記の分解生成物や賦形剤以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、ビタミン、野菜粉末、ミネラル、酵母エキス、着色剤、増粘剤などを必要に応じて含有させることができる。これらの成分の種類は特に制限されず、含有量は目的とする機能を十分に発揮させることができる範囲内で適宜調節することができる。
また、本発明の神経伸長促進剤は、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞や神経前駆細胞を利用する再生医療の分野において、培地や細胞の希釈液に添加して、これら幹細胞の神経細胞への分化を促進する分化促進剤として好適に用いることができる。神経伸長促進剤を添加する培地は、液体（ブイヨン）培地、半流動培地、固形（寒天）培地のいずれであってもよく、その組成も特に制限されない。また、希釈液についても、生理食塩水等、細胞の希釈液として通常用いられているものの、いずれにも適用可能である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、割合、操作等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。

［神経伸長促進剤の溶液の調製］
以下のようにして、Ｌ－バリン（神経伸長促進剤１）の溶液と、Ｌ－ロイシン溶液およびＬ－イソロイシン溶液を調製した。各アミノ酸の構造を下記に示す。下記式に示すように、Ｌ－ロイシンおよびＬ－イソロイシンは、Ｌ－バリンと同様に分枝構造を有する分岐鎖アミノ酸である。

（調製例１）ＲＰＭＩ－１６４０を用いたＬ－バリン溶液の調製
Ｌ－バリンを培地（シグマアルドリッチ社製，RPMI-1640）に溶解して０．４μｇ／ｍＬのＬ－バリン溶液および４μｇ／ｍＬのＬ－バリン溶液を調製した。

（調製例２） Nutrient Mixture F-12 Hamを用いたＬ－バリン溶液の調製
Ｌ－バリンを培地（シグマアルドリッチ社製，Nutrient Mixture F-12 Ham）に溶解して０．４μｇ／ｍＬのＬ－バリン溶液を調製した。

（比較調製例１） RPMI-1640を用いたＬ－ロイシン溶液、Ｌ－イソロイシン溶液の調製
Ｌ－バリンの代わりに、Ｌ－ロイシンまたはＬ－イソロイシンを用いること以外は、調製例１と同様にして０．４μｇ／ｍＬのＬ－ロイシン溶液および４μｇ／ｍＬのＬ－ロイシン溶液、並びに、０．４μｇ／ｍＬのＬ－イソロイシン溶液および４μｇ／ｍＬのＬ－イソロイシン溶液を調製した。

（比較調製例２） Nutrient Mixture F-12 Hamを用いたＬ－ロイシン溶液、Ｌ－イソロイシン溶液の調製
Ｌ－バリンの代わりに、Ｌ－ロイシンまたはＬ－イソロイシンを用いること以外は、調製例１と同様にして０．４μｇ／ｍＬのＬ－ロイシン溶液および０．４μｇ／ｍＬのＬ－イソロイシン溶液を調製した。

［神経突起形成作用および神経分化促進作用の評価］
理化学研究所バイオリソースセンターより入手した、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来ＰＣ１２細胞をモデルに用い、各調製例で調製したＬ－バリン溶液の神経突起形成作用および神経分化促進作用を評価した。ＰＣ１２細胞は、Bt₂cAMP(Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate)やＮＧＦを作用させると、増殖を停止して神経繊維を伸長し、交感神経節ニューロン様の樹状突起を伸ばすことが知られている。ここでは、このBt₂cAMP誘導性の神経突起形成プロセスおよびＮＧＦ誘導性の神経分化プロセスにＬ－バリンを導入し、その神経突起形成作用および神経分化促進作用を評価するとともに、Ｌ－ロイシンおよびＬ－イソロイシンの作用と比較した。
ここで、ＰＣ１２細胞は、１０％ウマ血清（非働化済）、５％ウシ胎児血清（非働化済）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地を用い、５％ＣＯ₂気相下で、３７℃のインキュベーターにより培養し、７０％程度にコンフルエントになった細胞を基本培地で剥離し、実験に使用した。以下では、このＰＣ１２細胞の培養に使用した培地と同組成の培地を「基本培地」という。

（ａ）培地に添加するBt₂cAMPの濃度の検討
予備実験として、下記の実験（ｂ）で培地に添加するBt₂cAMPの適正濃度を検討した。
まず、ＰＣ１２細胞を基本培地中に浮遊させ、単一細胞となるようによく懸濁した。このＰＣ１２細胞の懸濁液を、コラーゲンコート済みの９６ウェルプレートに４．０ｘ１０³ｃｅｌｌｓ／９５μＬ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ₂気相下、３７℃で２４時間培養した。培養後、Bt₂cAMPを５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭまたは２５ｍＭで含有する各種ダルベッコＰＢＳ（－）（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｃａ、Ｍｇ不含））を、Bt₂cAMP濃度が０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは１．２５ｍＭとなるように、各ウェル内の培地に５μＬずつ添加し、さらに２４時間培養した。培養後、各ウェル内の培地を除去し、１％グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）を各ウェル内に１００μＬずつ分注して２０分間静置し、細胞を固定した。続いて、グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液を各ウェル内から除去し、ギムザ染色液を１００μＬずつ分注し、２～３分間静置して染色を行った。染色後、ギムザ染色液を各ウェル内から除去し、染色したウェル内のサンプルを超純水で２回洗浄した後、乾燥させた。
以上の処理を経た各ウェル内のサンプルを顕微鏡で観察し、細胞体の長径の２倍以上の長さで神経突起が形成されている細胞を陽性と判定し、全細胞数（陽性または陰性の判定を行った全細胞数）に対する陽性細胞数の百分率を神経突起形成率として求めた。ここで、陽性または陰性の判定は、１ウェル当たり３００～４００個の細胞について行った。
また、Bt₂cAMPを含有するダルベッコＰＢＳ（－）の代わりに、Bt₂cAMPを含有していないダルベッコＰＢＳ（－）をウェル内の培地に５μＬ添加したこと以外は同様にして、培養、グルタルアルデヒドによる固定、ギムザ染色を行い、染色後のサンプルを観察して神経突起形成率を求めた。
神経突起形成率のBt₂cAMP濃度依存性を図１に示す。なお、図１における神経突起形成率は±ＳＤで示しており、ＳＤは同様にして行った３回の実験の標準偏差である。下記の実験（ｂ）で測定した図２、３、４の神経突起形成率の表示もこれと同じである。
図１から示されるように、神経突起形成率は、培地のBt₂cAMP濃度が１．０ｍＭであるとき、１９．５％と最大値になった。下記の実験（ｂ）では、Bt₂cAMPを神経突起形成のための誘導剤として使用するため、神経突起形成率が最大になる濃度（１．０ｍＭ）の１／２の濃度（０．５ｍＭ）を培地のＢｔ₂ｃＡＭＰ濃度として採用することとした。

（ｂ）Bt₂cAMP誘導性神経突起形成に対する作用の評価
上記の予備実験と同様にして、ＰＣ１２細胞の懸濁液をコラーゲンコート済みの９６ウェルプレートに４．０ｘ１０³ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ₂気相下、３７℃で２４時間培養した。培養後、１０ｍＭのBt₂cAMPを含有するダルベッコＰＢＳ（－）と、調製例１または調製例２で調製したＬ－バリン溶液をそれぞれ５μＬずつ各ウェル内に添加し、さらに２４時間培養した。このとき、各ウェル内の培地におけるBt₂cAMP濃度はそれぞれ０．５ｍＭである。その後、上記の予備実験と同様にして、グルタルアルデヒドによる細胞固定およびギムザ染色を行い、染色後のサンプルを観察して神経突起形成率を求めた。
また、Ｌ－バリン溶液の代わりに、比較調製例１、２で調製したＬ－ロイシン溶液、Ｌ－イソロイシン溶液、RPMI-1640培地、Nutrient Mixture F-12 Ham培地を各ウェル内の培地にそれぞれ５μＬずつ添加すること以外は同様にして、培養、グルタルアルデヒドによる細胞固定およびギムザ染色を行い、染色後のサンプルを観察して神経突起形成率を求めた。
各サンプルの神経突起形成率をRPMI-1640培地またはNutrient Mixture F-12 Ham培地に添加したアミノ酸濃度に対してプロットしたグラフを図２、図３に示す。図２は調製例１、比較調製例１で調製した溶液（各分岐鎖アミノ酸をRPMI-1640培地に溶解して調製した溶液）を用いた場合のグラフであり、図３は調製例２、比較調製例２で調製した溶液（各分岐鎖アミノ酸をNutrient Mixture F-12 Ham培地に溶解して調製した溶液）を用いた場合のグラフである。
図２、３から、培地に微量のＬ－バリンを添加することにより、神経突起形成が有意に促進されることがわかった。一方、Ｌ－ロイシンとＬ－イソロイシンを培地に添加した系では、こうした神経突起形成促進作用が認められなかった。このことから、バリンの神経突起形成作用は、分岐鎖アミノ酸であることに起因するものではなく、バリン特有の作用であることが示唆された。

また、Ｄ－バリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－バリンについても、上記と同様にして、Bt₂cAMP誘導性神経突起形成に対する作用を評価したところ、Ｌ－バリンと同等の神経突起形成促進作用を確認することができた（図４）。

さらに、分岐鎖アミノ酸以外のアミノ酸について、上記と同様にして、Bt₂cAMP誘導性神経突起形成に対する作用を調べたところ、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、またはプロリンでは、RPMI-1640培地に添加する各アミノ酸の濃度を２００μＭまで上げても神経突起形成率の有意な変化は認められなかった。一方、Ｌ－メチオニンまたはＤ－メチオニンを培地に添加した系においては、２０μＭの高濃度で、神経突起形成促進作用が確認された（図５）。

そこで、次に、バリンとメチオニンを培地に共添加することによる効果を調べるため、上記と同様にして、ウェルプレートに播種して培養したＰＣ１２細胞のRPMI-1640培地にBt₂cAMPを添加し、さらにＬ－バリン溶液、Ｌ－メチオニン溶液、またはＬ－バリンとＬ－メチオニンを１：１で混合した混合物の溶液をそれぞれ添加して培養し、神経突起形成率を調べた。RPMI-1640培地に添加するアミノ酸の濃度は、Ｌ－バリン溶液またはＬ－メチオニン溶液を用いた系では０．２μＭとし、Ｌ－バリンとＬ－メチオニンの混合物の溶液を用いた系では、Ｌ－バリンとＬ－メチオニンの各濃度を０．１μＭとし、合計で０．２μＭとした。測定された神経突起形成率を図６に示す。
図６から示されるように、Ｌ－バリンとＬ－メチオニンを培地に共添加したことにより、それぞれのアミノ酸を単独で培地に添加した場合よりも強い神経突起形成促進作用が認められた。このことから、バリンとメチオニンの共添加により神経突起形成促進作用が相乗的に向上することがわかった。また、バリンとメチオニンを共添加する場合には、無置換のバリンと無置換のメチオニンを組み合わせることが作用増強の点で好ましいこともわかった。

（ｃ）ＮＧＦ誘導性神経分化に対する作用の評価
ニューロフィラメントを神経分化マーカーとして用い、これを免疫蛍光染色法で染色することにより、Ｌ－バリンの神経分化促進作用を評価した。
ＰＣ１２細胞を基本培地中に浮遊させ、単一細胞となるようによく懸濁し、１．４ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。このＰＣ１２細胞の懸濁液を、コラーゲンコートした８ウェルチャンバースライドに５．０ｘ１０³ｃｅｌｌｓ／３６０μＬ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ₂気相下で、３７℃のインキュベーターにより２４時間培養した。培養後、２００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを含有するダルベッコＰＢＳ（－）（ＮＧＦ溶液）と、４μｇ／ｍＬのＬ－バリンを含有するRPMI-1640培地（調製例１で調製したＬ－バリン溶液）をそれぞれ２０μＬずつ各ウェル内に分注し、さらに４８時間培養した。培養後、各ウェル内の培地を除去し、ＰＢＳ（－）（リン酸緩衝生理食塩水（Ｃａ、Ｍｇ不含））で洗浄した後、４％ホルムアルデヒド溶液を各ウェル内に分注して３０分間処理した後、ＰＢＳ（－）で３分間の洗浄を３回行った。続いて、０．４％のTriton X-100（シグマアルドリッチ社製）を含有するＰＢＳ（－）を各ウェル内に分注し、３０分間処理した後、ＰＢＳ（－）で洗浄した。
次に、２．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ（－）を各ウェル内に分注して１時間処理した後、２．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（－）で２００倍希釈した１次抗体（シグマアルドリッチ社製，Anti-neurofilament 200 IgG fraction of antiserum）を各ウェル内に分注して室温で２時間処理し、０．０５％のTween 20（アトー社製）を含有するＰＢＳ（－）で３分間の洗浄を３回行った。続いて、２．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（－）で２００倍希釈した２次抗体（シグマアルドリッチ社製，Anti-Rabbit IgG(whole molecule)-FITC antibody produced in goat）を各ウェル内に分注し、室温で１時間処理した後、０．０５％のTween 20を含有するＰＢＳ（－）で３分間の洗浄を３回行った。以上の処理を経た各ウェル内のサンプルを核染色封入剤（コスモバイオ社製，DAPI-Fluoromount-G）にて封入し、カバーガラスを被せて四方をマニキュアすることにより標本１を作製した。また、ＮＧＦ溶液の代わりにダルベッコＰＢＳ（－）を用い、Ｌ－バリン溶液の代わりにＲＰＭＩ－１６４０培地を用いること以外は、上記と同様の工程で培養および免疫蛍光染色を行って比較標本１を作製し、Ｌ－バリン溶液の代わりにRPMI-1640培地を用いること以外は、上記と同様の工程で培養および免疫蛍光染色を行って比較標本２を作製した。
作製した各標本の蛍光染色画像を共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製，FLUOVIEWFV10i）を用いて観察し、写真を撮影した。撮影した写真を図７に示す。図７中、左から１列目の写真は標本の位相コントラスト写真である。左から２列目の写真は励起波長３５９ｎｍ、検出波長４６１ｎｍで撮影したDAPI蛍光染色画像であり、光って見える箇所が核に相当する。左から３列目の写真は励起波長４９５ｎｍ、検出波長５１９ｎｍで撮影したFITC蛍光染色画像であり、光って見える箇所がニューロフィラメントに相当する。また、左から４列目の写真は、左から２列目の写真と３列目の写真を合成したものである。
培地にＮＧＦとＬ－バリンを添加した標本１と、培地にＮＧＦを添加し、Ｌ－バリンを添加していない比較標本２の各FITC蛍光染色画像を比較すると、標本１の蛍光染色画像の方が比較標本２の蛍光染色画像よりも光って見える箇所が多数存在しており、ニューロフィラメントが多く発現していることがわかる。このことから、培地のバリンを添加することにより、幹細胞からの神経分化が促進されることがわかった。

本発明によれば、幹細胞の神経細胞への分化、神経細胞における神経突起の形成を効果的に促進することができ、且つ、活性成分が消化酵素による分解を受けにくい神経伸長促進剤を低コストで提供することができる。このため、本発明の神経伸長促進剤を用いれば、神経変性疾患や神経損傷が起因する認知機能障害や運動機能障害を軽減しうる、安価な内服剤を提供することができる。このため、本発明は産業上の利用可能性が高い。

Claims

アミノ基の水素原子が炭素数２～６のアシル基で置換されていてもよい遊離バリンを含有するが、遊離ロイシンを含有しない神経伸長促進剤。
さらに、アミノ基の水素原子が炭素数２～６のアシル基で置換されていてもよい遊離メチオニンを含有する請求項１に記載の神経伸長促進剤。