CN103479606A

CN103479606A - 硒代蛋氨酸用于制备治疗阿尔茨海默症药物的用途

Info

Publication number: CN103479606A
Application number: CN201310452104.1A
Authority: CN
Inventors: 宋国丽; 倪嘉缵; 张中豪; 刘琼; 石庆学
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2014-01-01

Abstract

本发明涉及一种硒代蛋氨酸用于制备治疗阿尔茨海默症药物的用途，具体的，硒代蛋氨酸具有提高动物学习记忆能力、抑制脑内Aβ的聚集以及Tau蛋白及其磷酸化水平、降低动物体脑内GSK-3β表达、降低脑内炎症反应，缓解神经细胞的突触损伤，提高脑内SOD的活性及还原性谷胱甘肽含量的功效。硒代蛋氨酸对阿尔茨海默症具有显著性的治疗作用，且治疗作用稳定。是临床上治疗阿尔茨海默症药物的一个很好的选择。

Description

硒代蛋氨酸用于制备治疗阿尔茨海默症药物的用途

技术领域

本发明涉及药物治疗疾病领域。具体的涉及一种硒代蛋氨酸用于制备治疗阿尔茨海默症药物的用途。

背景技术

阿尔茨海默症的高发病率、高危害性给患者及社会带来了沉重的负担，现有技术中硒酸钠和亚硒酸钠对阿尔茨海默症具有一定的治疗作用，但其缺点是在生物体内具有较强的毒性，生物利用率低，治疗作用不够稳定。

故目前迫切需要找到适合于临床的有效治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗阿尔茨海默症的药物。

为实现上述目的，本发明提供一种硒代蛋氨酸（Se-Met）用于制备治疗阿尔茨海默症药物的用途。

本发明保护了一种硒代蛋氨酸用于制备治疗阿尔茨海默症药物的用途。

本发明还保护了一种硒代蛋氨酸用于制备提高动物学习记忆能力的药物的用途。

本发明还保护了一种硒代蛋氨酸用于制备抑制脑内Aβ的聚集以及Tau蛋白及其磷酸化水平的药物的用途。

本发明还保护了一种硒代蛋氨酸用于制备降低动物体脑内GSK-3β表达的药物的用途。

本发明还保护了一种硒代蛋氨酸用于制备降低脑内炎症反应，缓解神经细胞的突触损伤的药物的用途。

本发明还保护了一种硒代蛋氨酸用于制备提高脑内SOD的活性及还原性谷胱甘肽含量的药物的用途

本发明还保护了一种含有所述硒代蛋氨酸的药物，其特征在于，给药方式为通过加入饮用水方式给药。针对鼠，其浓度为6ug/ml，通过加入饮用水方式持续12周时间。

本发明所述硒代蛋氨酸的药物，其特征在于，所述药物是胶囊或药片形式。还可以是其他药物形式。比如液态注射剂，液态口服剂、药丸等多种形式。

所述硒代蛋氨酸具有极强的抗氧化性，是机体摄入硒的主要化合物之一，在机体内的生物活性高、利用率高，毒性低。

通过动物实验证明硒代蛋氨酸对阿尔茨海默症具有显著性的治疗作用，且治疗作用稳定。

本发明的实施例从细胞水平和动物水平两个方面验证了硒代蛋氨酸对于阿尔茨海默症的治疗作用。

细胞水平：

1、硒代蛋氨酸对N2A细胞（小鼠神经瘤细胞）的增值活力表现为低促高抑，但硒代蛋氨酸的可用的有效浓度范围较大（0～50uM）。

2、硒代蛋氨酸可以显著性的降低Aβ1-42所诱导得N2A细胞的脑内ROS水平，抑制N2A细胞的凋亡。

动物水平上：

1、硒代蛋氨酸可以明显提高4月龄AD小鼠认知能力，缓解脑内Aβ和Tau的聚集，抑制Tau蛋白过度磷酸化，降低脑内炎症反应，降低脑内氧化应激水平及突触损伤，在一定程度上改善和减缓了AD的发病进程。

2、硒代蛋氨酸能够明显改善8月龄AD小鼠学习记忆能力，降低脑内Tau的聚集及其过度磷酸化，修复受损的突触蛋白，降低脑内炎症反应，提高脑内抗氧化能力，对AD有明显的治疗效果。

3、硒代蛋氨酸能够降低脑组织中GSK3β的表达水平，从而抑制Tau蛋白的过度磷酸化，从而改善转基因AD小鼠的相关病理特征。

硒代蛋氨酸对AD治疗的各个病理指标变化的结果如下：

1、Aβ所导致的脑内老年斑是AD的显著特征

2、Tau及其磷酸化位点蛋白的过表达是导致AD出现脑内神经纤维缠结的主要原因

3、星形胶质细胞的标记物GFAP反应AD脑内的炎症水平

4、SOD活力、还原性谷胱甘肽含量反应了脑内的抗氧化水平

5、突触前蛋白synaptophysin及突触后蛋白PSD95在脑内的表达水平反映AD脑内的神经元的突触传递受损情况

6、水迷宫实验能够直接的反映出AD动物的认知能力的强弱

本发明的硒代蛋氨酸可以显著性提高4、8月龄AD小鼠的学习记忆能力、抑制脑内Aβ的聚集以及Tau蛋白及其磷酸化水平，降低脑内GSK-3β的表达；降低脑内炎症反应，缓解神经细胞的突触损伤，提高脑内SOD的活性及还原性谷胱甘肽含量；因此硒代蛋氨酸能够从各个发病指标上改善和治疗AD，在临床上具有潜在的有效治疗作用。本发明的实验结果也证明硒代蛋氨酸能够作为特效的AD临床治疗药物。

本发明实施例的实验结果说明：

Morris水迷宫检测其空间记忆能力发现：Se-Met组小鼠的游泳逃避潜伏期明显的低于对照组，且与对照组相比其运动能力也无明显差异；空间探索试验检测24h、72h记忆结果表明：Se-Met组较对照组其原平台象限停留时间及跨越平台次数均有所上升。这说明在Se-Met给药治疗之后，Se-Met组的三转基因AD小鼠认知能力缺陷得到了明显的改善，也进一步证明了Se-Met在不改变小鼠运动能力的情况下，可以显著的延缓认知障碍的发生。接着免疫荧光检测海马区Aβ的表达发现：Se-Met组的Aβ斑块数量显著少于对照组，这表明Se-Met可以降低脑内Aβ表达。而western-blot检测脑内BACE1蛋白表达发现：无论海马区还是皮层区，其表达水平无明显变化。免疫荧光检测Tau蛋白阳性表达发现，在Se-Met组的海马和皮层区中Tau蛋白的阳性率显著下降。免疫荧光检测海马区Tau-ps404蛋白发现，Se-Met组较其对照组Tau-ps404的阳性率明显降低。Western-blot检测小鼠脑内海马和皮层区的Tau蛋白及其各位点磷酸化蛋白表达水平发现：对照组与Se-Met组均无明显差异，进一步检测了不可溶性的Tau蛋白表达水平，其结果表明Se-Met组明显低于对照组。因此，以上Tau蛋白及其磷酸蛋白检测结果指出：Se-Met可以显著降低脑内Tau蛋白及磷酸化蛋白（Tau-ps404）的表达，且在早期治疗过程中，其可能是通过降低不可溶性的Tau及其磷酸化蛋白从而降低Tau及其相关蛋白的表达，延缓神经纤维缠结的形成。

上述检测结果说明，Se-Met对AD的两大主要病理特征Aβ和Tau都有明显的缓解作用，然后我们利用免疫荧光检测了脑内的炎症水平即星形胶质细胞的表面标记物GFAP的表达。检测结果表明：Se-Met组的GFAP表达量显著低于对照组；且Se-Met在一定程度上也改善了星形胶质细胞结构的病变；这说明Se-Met可以明显的降低脑内炎症水平。根据炎症水平的显著变化，我们又用Western-blot检测突触前、后蛋白（Synaptophysin、PSD95）表达水平发现：Se-Met组的海马区和皮层区神经元突触前后蛋白表达水平显著高于对照组。因此，Se-Met在一定程度上能够抑制神经元突触受损，从而延缓认知障碍的发生。且在Se-Met组小鼠脑内的海马及皮层区，SOD活性较对照组有所增加，NO、MDA含量并无明显变化；在谷胱甘肽检测中发现，在总谷胱甘肽无明显差异的情况下，Se-Met组的还原性谷胱甘肽含量显著高于对照组。这些结果进一步说明了Se-Met可以抑制脑内氧化应激，降低炎症水平，延缓突触受损的发生。

从4月龄AD小鼠治疗后的检测结果发现，Se-Met对AD小鼠有明显的早期治疗效果。为了深入的研究Se-Met在AD小鼠中的治疗作用，接下来我们进一步检测了其对8月龄AD小鼠的治疗结果。Morris水迷宫检测其空间记忆能力发现：与4月龄一致，在不影响实验小鼠运动能力的条件下，Se-Met可以明显降低小鼠游泳的逃避潜伏期，而空间探索试验检测24h、72h记忆结果也表明：Se-Met组较对照组其原平台象限停留时间及跨越平台次数均有上升。这说明在Se-Met给药治疗之后，8月龄Se-Met组的AD小鼠认知能力缺陷得到了明显的改善，空间记忆能力显著提升。在4月龄检测结果中我们发现，Se-Met治疗后，AD小鼠脑内Tau蛋白的相关病理指标发生了显著性的变化，因此我们重点检测了小鼠脑内Tau及其磷酸化蛋白的表达情况。免疫荧光检测Tau蛋白阳性表达发现，Tau蛋白的阳性率在Se-Met组的海马区和皮层区中显著下降。免疫荧光检测海马区Tau-ps404蛋白发现，Se-Met组较其对照组Tau-ps404的阳性表达显著降低，且与4月龄结果一致。为进一步验证以上结果，我们同样用Western-blot定量检测了脑内Tau及Tau-ps404蛋白的表达水平。我们发现在8月龄实验组中，在脑内海马区或皮层区，无论是可溶性还是不可溶性的Tau及Tau-ps404蛋白，Se-Met组较对照组都有显著性降低。因此我们可以得出：Se-Met可以显著性的降低脑内Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表达，且Se-Met可以同时降低可溶与不可溶性Tau蛋白的表达水平，从而减少脑内的神经纤维缠结。

接着发明人同样检测了脑内的炎症水平，免疫荧光检测结果表明：Se-Met组的GFAP阳性率显著低于对照组；且Se-Met在一定程度上也改善了星形胶质细胞结构的病变；这表明Se-Met在AD发病的中后期同样可以显著性的降低脑内炎症水平。且Western-blot检测突触前、后蛋白（Synaptophysin、PSD95）表达水平发现：与4月龄结果一致，Se-Met组的海马区和皮层区神经元突触前后蛋白表达水平也显著高于对照组。因此，在发病期Se-Met在一定程度上能够恢复神经元突触受损，从而改善认知记忆能力。进一步检测Se-Met治疗后脑内氧化应激水平发现：总谷胱甘肽在脑内海马和皮层区无明显差异，但Se-Met组的还原性谷胱甘肽含量显著高于对照组。这表明Se-Met的抗氧化功效在AD的后期治疗中起了重要的作用，通过提高还原性谷胱甘肽的含量，从而在机体内起到抗氧化的效果。

通过4、8月龄给药治疗及一系列AD常规指标的检测，申请人发现：Se-Met不仅可以在AD发病早期延缓其发病进程，且在发病后期具有明显的治疗作用。整合结果分析其治疗机制，不难得出：Se-Met在体内可以降低Aβ、Tau及其磷酸蛋白的表达水平，抑制老年斑、及神经纤维缠结的形成，逆转突触蛋白的降低，降低脑内的炎症水平，并通过提高还原型谷胱甘肽的含量发挥抗氧化功能，从而达到缓解和改善认知及记忆能力障碍的治疗效果。GSK-3β是AD发生过程中一个重要的激酶，脑内炎症反应的增强能够激活其过量表达；且体外研究表明，GSK-3β可参与并调控脑内Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平^[34]。因此，通过Western-blot检测发现，在4、8月龄实验组中，给药组的可溶性GSK-3β表达水平显著降低，但不可溶性的GSK3β无明显变化；这是由于在正常生理活动中GSK-3β蛋白是以可溶性移动蛋白发挥生理功能，而不可溶性的GSK-3β蛋白往往是没有生理功能的膜结合蛋白等^[36]，这与本发明实验所得到的结果是一致的，且在本发明的实验中GSK-3β可能是Se-Met对AD治疗机制中的一个关键激酶。

附图说明

图1为硒代蛋氨酸对N2a细胞增殖的影响图；

图2为硒代蛋氨酸、Aβ_1-42对N2a细胞ROS的影响图；

图3为硒代蛋氨酸、Aβ_1-42对N2a细胞早期凋亡影响的检测图。

图4为硒代蛋氨酸、Aβ_1-42对N2a细胞早期凋亡影响的检测图；

图5为Morris水迷宫定位航行检测结果图；

图6为Morris水迷宫定位航行实验中实验小鼠找到平台的运动轨迹图；

图7为Morris水迷宫空间探索实验结果图（^*p<0.05;n=12）；

图8为小鼠海马CA3区Aβ_1-42免疫荧光检测图（20×）；

图9为小鼠海马CA3区Aβ_1-42免疫荧光检测结果比较图。

图10为小鼠海马区Tau5免疫荧光检测图（20×）；

图11为小鼠海马区Tau5免疫荧光检测结果比较图。

图12为小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测图（20×）；

图13为小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测结果比较图；

图14为小鼠海马区Tau-ps404免疫荧光检测图；

图15为小鼠海马区Tau-ps404免疫荧光检测结果比较图；

图16为小鼠脑组织海马区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平Western-blot电泳条带图；

图17为小鼠脑组织海马区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测结果比较图；

图18为小鼠脑组织皮层区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测Western-blot电泳条带图；

图19为小鼠脑组织皮层区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测结果比较图；

图20为小鼠脑组织非可溶性Tau蛋白表达水平检测Western-blot电泳条带图；

图21为小鼠脑组织非可溶性Tau蛋白表达水平检测结果比较图；

图22为小鼠海马区GFAP免疫荧光检测图（20×）；

图23为小鼠海马区GFAP免疫荧光检测结果比较图；

图24为小鼠脑组织海马区突触前后蛋白表达水平检测Western-blot电泳条带图；

图25为小鼠脑组织海马区突触前后蛋白表达水平检测结果比较图；

图26为小鼠脑组织皮层区突触前后蛋白表达水平检测Western-blot电泳条带图；

图27为小鼠脑组织皮层区突触前后蛋白表达水平检测结果比较图；

图28为超氧化物歧化酶SOD活力检测图；

图29为脑组织海马区谷胱甘肽含量检测图；

图30为脑组织皮层区谷胱甘肽含量检测图；

图31为小鼠脑组织糖元合成酶激酶（GSK-3β）表达水平检测电泳条带图；

图32为小鼠脑组织糖元合成酶激酶（GSK-3β）表达水平检测结果比较图；

图33为Morris水迷宫定位航行检测结果图；

图34为Morris水迷宫定位航行检测结果小鼠找到平台的运动轨迹图；

图35为Morris水迷宫空间探索实验结果图；

图36为小鼠大脑海马区Tau5免疫荧光检测图（20×）；

图37为小鼠大脑海马区Tau5免疫荧光检测结果比较图；

图38为小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测图（20×）；

图39为小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测结果比较图；

图40为小鼠海马区Tau-ps404免疫荧光检测图（20×）；

图41为小鼠海马区Tau-ps404免疫荧光检测结果比较图；

图42为小鼠脑组织海马区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测电泳条条带图；

图43为小鼠脑组织海马区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测结果比较图；

图44为小鼠脑组织皮层区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测电泳条带图；

图45为小鼠脑组织皮层区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测结果比较图；

图46为小鼠脑组织非可溶性Tau蛋白表达水平检测电泳条带图；

图47为小鼠脑组织非可溶性Tau蛋白表达水平检测结果比较图；

图48为小鼠海马区GFAP免疫荧光检测图（20×）；

图49为小鼠海马区GFAP免疫荧光检测结果比较图；

图50为小鼠脑组织海马区突触前后蛋白表达水平检测图；

图51为小鼠脑组织海马区突触前后蛋白表达水平检测结果比较图；

图52为小鼠脑组织皮层区突触前后蛋白表达水平检测电泳条带图；

图53为小鼠脑组织皮层区突触前后蛋白表达水平检测结果比较图；

图54脑组织海马区谷胱甘肽含量检测；

图55为脑组织皮层区谷胱甘肽含量检测图；

图56为小鼠脑组织糖元合成酶激酶（GSK-3β）表达水平检测电泳条带图；

图57为小鼠脑组织糖元合成酶激酶（GSK-3β）表达水平检测结果比较图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实验主要试剂：

硒代蛋氨酸（Seleno-DL-methionine）购买自sigma，单一化合物，纯度≥99%，白色粉末状，-18℃保存。

动物模型：AD三转基因小鼠（B6;129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe，tauP301L)1Lfa/J）及野生型对照小鼠（B6;129SF2/J）：购买于美国Jax实验室。

多聚甲醛，β-actin一抗，α-tublin一抗：sigma；氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，NaOH：广州化学试剂厂；

无水乙醇，工业酒精，二甲苯，工业石蜡，蜂蜡，冰乙酸，氨水，盐酸，KH550，柠檬酸三钠，中性树胶：南山化试科技；

多聚赖氨酸，尼氏染液，荧光抗猝灭封片剂，SOD活性试剂盒，NO总含量试剂盒，MDA含量试剂盒，GSH试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒，显影液，定影液：碧云天；

双氧水：东江化学试剂有限公司；

DAB，免疫组化试剂盒，免疫组化油性笔：福建迈新生物科技；

Tris碱，甘氨酸（Gly），EDTA：上海生工；

SDS：广州化学试剂厂；

蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂：罗氏生物；

4*蛋白loading buffer：武汉博士德；

蛋白预染marker：Fermentas；

PVDF膜：Millipore；

化学发光液ECL：Thermol；

Aβ1-42：苏州强耀生物科技有限公司

Aβ1-42一抗，GFAP一抗，Tau5一抗：Abcam；PS404一抗，PS422一抗，PS202一抗，PS262一抗，T235一抗，BACE-1一抗：Epitomics；

PSD-95一抗，Synaptophysin一抗，GSK-3β：基因公司；

羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗：欣博盛；

羊抗鼠DL488荧光二抗，羊抗兔DL488荧光二抗，羊抗兔DL649荧光二抗，羊抗鼠DL649荧光二抗：联科生物。

实验主要仪器：

高温试验箱：隆安；通风柜：深圳申立；石蜡切片机：莱卡；正置显微镜CX21：Olympus Corporation；立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司；

正置荧光显微镜CX51，荧光共聚焦显微镜：Olympus Corporation；

恒温水浴锅：上海精宏；酶标仪：Model550；蛋白电泳仪，电转仪：Tanon；

电子分析天平（BS110S）：Sartorius；

超声波破碎仪：宁波新芝科技股份有限公司;

高速冷冻离心机5804R：Eppendorf；

恒温培养摇床（THZ-300）：上海一恒科技有限公司；

显影仪：Carestream。

图1为硒代蛋氨酸对N2a细胞增殖的影响图(^**p<0.01，^***p<0.001，n=3)，其中A：硒代蛋氨酸处理12h B：硒代蛋氨酸处理24h C：硒代蛋氨酸处理48h；

图2为硒代蛋氨酸、Aβ_1-42对N2a细胞ROS的影响图（^**p<0.01，^***p<0.001VSControl，#p<0.05VS Aβ_1-42，n=3）；其中A：Aβ_1-42处理细胞6h B：Aβ_1-42处理细胞24h；

图3为硒代蛋氨酸、Aβ_1-42对N2a细胞早期凋亡影响的检测图。

图4为硒代蛋氨酸、Aβ_1-42对N2a细胞早期凋亡影响的检测图（^***p<0.001VSControl，#p<0.05VS Aβ_1-42，n=3）；

图5为Morris水迷宫定位航行检测结果图，A：实验小鼠逃避潜伏期（^*p<0.05;n=12）；B：实验小鼠游泳平均速度；

图6为Morris水迷宫定位航行实验中实验小鼠找到平台的运动轨迹图；其中A-D表示分别从一、二、三、四个象限入水轨迹图。

图7为Morris水迷宫空间探索实验结果图（^*p<0.05;n=12），A：实验小鼠24h记忆-原平台象限所停留时间；B：实验小鼠24h记忆-跨越原平台次数；C：实验小鼠72h记忆-原平台象限所停留时间；D：实验小鼠72h记忆-跨越原平台次数；图8为小鼠海马CA3区Aβ_1-42免疫荧光检测图（20×），A：对照组CA3区；B：Se-Met组CA3区；（图部分还有两张荧光图a和b））

图9为小鼠海马CA3区Aβ_1-42免疫荧光检测结果比较图。

图10为小鼠海马区Tau5免疫荧光检测图（20×）（^**p<0.01;n=3），A、B、C：对照组小鼠大脑海马区齿状回、CA3区、CA1区；D、E、F：Se-Met组小鼠大脑海马区齿状回、CA3区、CA1区。

图11为小鼠海马区Tau5免疫荧光检测结果比较图。

图12为小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测图（20×），A：对照组小鼠大脑皮层区；

B：Se-Met组小鼠大脑皮层区；

图13为小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测结果比较图；

图14为小鼠海马区Tau-ps404免疫荧光检测图（20×）（^***p<0.001;n=3），A、B、C：对照组小鼠大脑海马区CA3区、齿状回、CA1区；D、E、F：Se-Met组小鼠大脑海马区CA3区、齿状回、CA1区；

图15为小鼠海马区Tau-ps404免疫荧光检测结果比较图；

A：Tau5蛋白灰度值定量分析；B：Tau-ps404蛋白灰度值定量分析；

C：Tau-ps202蛋白灰度值定量分析；D：Tau-ps422蛋白灰度值定量分析；

E：Tau-ps235蛋白灰度值定量分析；

A：Tau5蛋白灰度值定量分析；B：Tau-ps235蛋白灰度值定量分析（^*p<0.05;n=3）；

C：Tau-ps404蛋白灰度值定量分析；D：Tau-ps202蛋白灰度值定量分析；

图20为小鼠脑组织非可溶性Tau蛋白表达水平检测Western-blot电泳条带图（^**p<0.01，^***p<0.001;n=3）A：皮层区Western-blot电泳条带图；B：海马区Western-blot电泳条带图；

A：皮层区Tau5蛋白灰度值定量分析；B：海马区Tau5蛋白灰度值定量分析；

图22为小鼠海马区GFAP免疫荧光检测图（20×）（^**p<0.01;n=3）

A：对照组小鼠大脑海马区CA1区；B：对照组小鼠大脑海马区CA3区；

C：对照组小鼠大脑海马区齿状回；D：实验组小鼠大脑海马区CA1区；

E：实验组小鼠大脑海马区CA3区；F：实验组小鼠大脑海马区齿状回；

图23为小鼠海马区GFAP免疫荧光检测结果比较图；

图24为小鼠脑组织海马区突触前后蛋白表达水平检测Western-blot电泳条带图（^*p<0.05;n=3）

A：突触前蛋白Western-blot电泳条带图；B：突触后蛋白Western-blot电泳条带图；

A：突触前蛋白灰度值定量分析；B：突触后蛋白蛋白灰度值定量分析

图26为小鼠脑组织皮层区突触前后蛋白表达水平检测Western-blot电泳条带图（^***p<0.001;n=3）

A：突触前蛋白灰度值定量分析；B：突触后蛋白蛋白灰度值定量分析；

图28为超氧化物歧化酶SOD活力检测图，A：海马区；B：皮层区；

图29为脑组织海马区谷胱甘肽含量检测图（^*p<0.05;n=3），A：还原性谷胱甘肽；

B：总谷胱甘肽；

图30为脑组织皮层区谷胱甘肽含量检测图（^*p<0.05;n=3），A：还原性谷胱甘肽；

B：总谷胱甘肽；

图31为小鼠脑组织糖元合成酶激酶（GSK-3β）表达水平检测电泳条带图，

A-B：皮层区、海马区可溶性GSK-3β电泳条带图；

A-B：皮层区、海马区可溶性GSK-3β灰度值定量分析量分析；（^***p<0.001;n=3）

图33为Morris水迷宫定位航行检测结果图，A：小鼠逃避潜伏期（^*p<0.05;n=12）；

B：小鼠平均游泳速度；

A-D：分别为从一、二、三、四个象限入水轨迹图；

图35为Morris水迷宫空间探索实验结果图，A：实验小鼠24h记忆-原平台象限所停留时间；B：实验小鼠24h记忆-跨越原平台次数；C：实验小鼠72h记忆-原平台象限所停留时间；D：实验小鼠72h记忆-跨越原平台次数；

图36为小鼠大脑海马区Tau5免疫荧光检测图（20×）（^*p<0.05;n=3），

A、B、C：对照组海马区齿状回、CA3区、CA1区

D、E、F：Se-Met组海马区齿状回、CA3区、CA1区；

图37为小鼠大脑海马区Tau5免疫荧光检测结果比较图；

图38为小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测图（20×）（^*p<0.05;n=3）

A：对照组皮层区；B：Se-Met组皮层区;

图39为小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测结果比较图；

图40为小鼠海马区Tau-ps404免疫荧光检测图（20×）（^*p<0.05;n=3）

A、B、C：对照组海马区CA3区、齿状回、CA1区

D、E、F：Se-Met组海马区CA3区、齿状回、CA1区；

图41为小鼠海马区Tau-ps404免疫荧光检测结果比较图；

图42为小鼠脑组织海马区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测电泳条条带图，

A：Tau5蛋白电泳条带图；B：Tau-ps404蛋白电泳条带；

C：Tau-ps202蛋白电泳条带；（^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001;n=3）

A：Tau5蛋白灰度值定量分析量分析；B：Tau-ps404蛋白灰度值定量分析量分析；

C：Tau-ps202蛋白灰度值定量分析量分析;

图44为小鼠脑组织皮层区可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表达水平检测电泳条带图，

A：Tau5蛋白电泳条带图；B：Tau-ps404蛋白电泳条带；

A：Tau5蛋白灰度值定量分析量分析；

B：Tau-ps404蛋白灰度值定量分析量分析；（^*p<0.05，^***p<0.001;n=3）

图46为小鼠脑组织非可溶性Tau蛋白表达水平检测电泳条带图（^**p<0.01，^***p<0.001）；

A：皮层区Tau5蛋白电泳条带图；B：海马区Tau5蛋白电泳条带图；

C：海马区Tau-ps404蛋白电泳条带；

A：皮层区Tau5蛋白灰度值定量分析量分析；

B：海马区Tau5蛋白灰度值定量分析量分析；

C：海马区Tau-ps404蛋白灰度值定量分析量分析；

图48为小鼠海马区GFAP免疫荧光检测图（20×）（^*p<0.05;n=3）

A、B、C：对照组海马区CA1区、CA3区、齿状回；

D、E、F：Se-Met组海马区CA1区、CA3区、齿状回；

图49为小鼠海马区GFAP免疫荧光检测结果比较图；

图50为小鼠脑组织海马区突触前后蛋白表达水平检测图（^*p<0.05，^***p<0.001;n=3）

图52为小鼠脑组织皮层区突触前后蛋白表达水平检测电泳条带图（^***p<0.001;n=3）

图54脑组织海马区谷胱甘肽含量检测（^**p<0.01;n=3），A：还原性谷胱甘肽；

B：总谷胱甘肽；

图55为脑组织皮层区谷胱甘肽含量检测图，A：还原性谷胱甘肽；B：总谷胱甘肽；

图56为小鼠脑组织糖元合成酶激酶（GSK-3β）表达水平检测电泳条带图（^*p<0.05;n=3）

A-B：皮层区、海马区可溶性GSK-3β电泳条带图；

A-B：皮层区、海马区可溶性GSK-3β灰度值定量分析量分析。

实施例1：细胞水平检测硒代蛋氨酸的功效

将硒代蛋氨酸以1uM的浓度加入到细胞培养基中以观察其对Aβ诱导的N2A细胞（小鼠神经瘤细胞）的治疗作用。采用CCK-8法检测不同浓度Se-Met对N2a细胞活力的影响；N2a细胞经Se-Met预处理后，加入Aβ_1-42（10uM）共培养6小时；FITC-annexinⅤ/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡水平变化；DCFH-DA标记法检测细胞内总活性氧（ROS）水平变化。

1.CCK-8检测细胞的活力

CCK-8检测发现：结果见图1：硒代蛋氨酸对N2a细胞的活力影响存在与时间相关的剂量效应，作用12h时，随着硒代蛋氨酸浓度升高，细胞活力逐渐增强，高浓度组（50μM，100μM）表现出显著效应（p<0.001）；作用24h后，低浓度（0.1μM，1μM，10μM)硒代蛋氨酸持续表现为促进增殖作用，其中0.1uM、1uM促增殖作用最显著（p<0.001），而高浓度组的增殖减缓；作用时间延长至48h时，0.1μM、1μM硒代蛋氨酸对N2a细胞的仍然表现出显著的促进增殖作用（p<0.01），相反，高浓度的硒代蛋氨酸表现出显著的抑制N2a细胞增殖的作用（p<0.001），即48h时硒代蛋氨酸对N2a细胞的增殖具有有“低促高抑”作用。

2.流式细胞仪检测细胞ROS水平

结果见图2：Aβ_1-42处理6h后N2a细胞ROS水平显著增高（p<0.01），硒代蛋氨酸预处理组的ROS有所降低；Aβ_1-42处理24h后细胞ROS较对照组有更显著的升高（p<0.01），而硒代蛋氨酸预处理的细胞ROS明显降低（p<0.05）；说明Aβ_1-42会刺激细胞ROS的升高，而硒代蛋氨酸能抑制Aβ_1-42的这种影响。

3.流式细胞仪检测细胞早期凋亡水平

Aβ_1-42作用后N2a早期凋亡率显著升高（p<0.001），而硒代蛋氨酸预处理能显著抑制Aβ_1-42对细胞的毒性作用，细胞早期凋亡率显著降低（p<0.05）。

实施例2：动物水平检测硒代蛋氨酸的功效

选取4、8月龄的3×Tg AD小鼠作为药物实验对象（见表1），硒代蛋氨酸（Se-Met）以6ug/ml的浓度加入其饮水中，持续给药12周。治疗结束后，Morris水迷宫检测小鼠的空间记忆及探索能力；采用免疫荧光、Western-Blot及特异性试剂盒分别检测以下几个方面的变化：Aβ、Tau及其各位点的磷酸化蛋白、炎症反应（GFAP）、突触前后蛋白（synaptophysin及PSD95）、氧化应激水平（SOD、MDA、NO、谷胱甘肽）；并检测BACE-1、GSK-3β表达水平变化，对Aβ、Tau的影响机制进行一定的研究。

表1：实验动物分组及治疗方案

1.4月龄实验结果

1.1空间记忆及探索能力检测

4月龄三转基因AD小鼠在Se-Met给药治疗12周后，morris水迷宫检测实验组和对照组的空间探索记忆能力发现：在定位航行试验中Se-Met组较对照组，其逃避潜伏期显著降低，即找到平台所用的时间较对照组显著下降（*p<0.05;n=12）（如图5A）；但在实验中各组小鼠的平均游泳速度无明显差异（如图5B）；且实验小鼠从四个象限入水的游泳轨迹图表明，给药组实验小鼠在找平台过程中其运动轨迹更为简单，目的性更强，且少有“绕圈”现象的出现如图6A-D。

在空间探索试验中，检测4月龄Se-Met组和对照组小鼠的24小时记忆发现，两组实验小鼠60s内在原平台所在象限停留的时间无明显的差异（如图7A）；而Se-Met组其跨越原平台的次数较对照组有一定的增加，但无显著性差异（如图7B）。检测实验小鼠72小时记忆发现，Se-Met组小鼠60s内在原平台所在象限停留时间有所增加（如图7C），且跨越平台次数显著上升（*p<0.05;n=12）（如图7D）。

1.2免疫荧光检测Aβ1-42表达水平

免疫荧光检测脑内海马组织CA3区Aβ_1-42的表达发现，两个实验组中Aβ_1-42在神经元胞内和胞外均有所表达，Se-Met组较对照组其胞外Aβ沉积数量明显减少（如图8和9）。

1.3免疫荧光检测总Tau、Tau-ps404蛋白表达

免疫荧光检测脑内海马区总Tau蛋白的表达发现，在海马组织的齿状回、CA3、CA1区中，Se-Met组其总Tau蛋白表达量显著低于对照组（**p<0.01;n=3）（如图10和11）

免疫荧光检测脑内皮层区总Tau蛋白的表达发现，Se-Met组其总Tau蛋白表达量较对照组有所降低。（如图12和13）

免疫荧光检测脑内海马区Tau-ps404磷酸化蛋白的表达发现，在海马组织的齿状回、CA3、CA1区中，Se-Met组其Tau-ps404磷酸化蛋白表达量显著低于对照组（***p<0.001;n=3）（如图14和15）

1.4脑内可溶性（TBS-soluble）的总Tau、Tau-ps404蛋白表达水平

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内海马区Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其Tau5、Tau-ps404、Tau-ps202蛋白表达水平无明显变化，Tau-ps235蛋白有一定程度升高，Tau-ps422蛋白有所降低，但均无显著差异性（如图16和17）。

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内皮层区Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其Tau5、Tau-ps404、Tau-ps202蛋白表达水平无明显变化，Tau-ps235蛋白表达水平显著性降低（*p<0.05;n=3）（如图18和19）

1.5脑内非可溶性（TBS-insoluble）的总Tau蛋白表达水平

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内非可溶性（TBS-insoluble）总Tau蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其海马区及皮层区Tau5蛋白表达水平明显降低（**p<0.01，***p<0.001;n=3）（如图20和21）。

1.6免疫荧光检测实验小鼠脑内星型胶质细胞炎症水平

免疫荧光检测脑内海马区星形胶质细胞表面标记GFAP的表达发现，在海马组织的CA1、CA3、齿状回区中，Se-Met组其GFAP的阳性表达率明显低于对照组（**p<0.01;n=3）。且对照组其星形胶质细胞标准的放射状结构减少，胞体变大，交叉、缠结结构明显增多，甚至出现了一部分圆球结构，而Se-Met组星形胶质细胞较小，形态较标准（如图22和23）。

1.7脑组织中突触蛋白表达水平检测

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内海马区突触蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其突触前蛋白synaptophysin表达水平显著升高（*p<0.05;n=3）；其突触后蛋白PSD95表达水平比对照组有所增加，但无显著性差异（如图24和25）。

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内皮层区突触蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其突触前蛋白synaptophysin及突触后蛋白PSD95表达水平均显著升高（***p<0.001;n=3）（如图26和27）。

1.8小鼠脑内氧化应激水平检测

超氧化物歧化酶SOD活力检测结果表明：在小鼠脑组织海马区和皮层区，Se-Met组较对照组其SOD活力有一定程度的增强（如图28）。脑组织中谷胱甘肽GSH含量检测结果表明：在海马区，总谷胱甘肽含量在两实验组中无明显变化，但Se-Met组较对照组其还原型谷胱甘肽含量显著升高，（*p<0.05;n=3）（如图29）；对皮层区的检测也出现了同样的结果（*p<0.05;n=3）（如图30）。

1.9脑组织糖元合成酶激酶（GSK-3β）表达水平检测

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内糖元合成酶激酶的表达水平发现：在海马和皮层组织区，Se-Met组的可溶性GSK-3β蛋白的表达水平显著低于对照组（***p<0.001;n=3）（如图31和32）。

2.8月龄治疗实验结果

2.1空间记忆及探索能力检测

8月龄三转基因AD小鼠在Se-Met给药治疗12周后，morris水迷宫检测空间探索记忆能力发现：在定位航行试验中Se-Met组的逃避潜伏期明显低于对照组，即小鼠找到平台所用的时间较对照组显著降低（*p<0.05;n=12）（如图33A）；而两组小鼠的平均游泳速度无明显差异（如图33B）；且小鼠从四个象限入水的游泳轨迹图表明，Se-Met组实验小鼠在找平台过程中其运动轨迹更为简单，目的性更强，少有“绕圈”现象的出现；而对照组运动轨迹杂乱、“绕圈”现象明显（如图34）。

在探索试验中，检测小鼠的24小时记忆发现，Se-Met组小鼠60s内在原平台所在象限停留的时间及其跨越原平台所在位置的次数均有所增加，但与对照组相比无明显差异（如图35A-B）。检测小鼠72小时记忆发现，Se-Met组小鼠60s内在原平台所在象限停留时间增加（如图35C），且跨越平台次数增多，但与对照组相比也没有明显差异性（如图35D）。

2.2免疫荧光检测总Tau、Tau-ps404蛋白的表达

免疫荧光检测脑内海马区总Tau蛋白的表达发现，在海马组织的齿状回、CA3、CA1区中，Se-Met组其总Tau蛋白表达量显著低于对照组（*p<0.05;n=3）（如图36和37）。

免疫荧光检测脑内皮层区总Tau蛋白的表达发现，Se-Met组其总Tau蛋白表达量较对照组显著性降低（*p<0.05;n=3）（如图38和39）。

免疫荧光检测脑内海马区Tau-ps404磷酸化蛋白的表达发现，在海马组织的齿状回、CA3、CA1区中，Se-Met组其Tau-ps404磷酸化蛋白表达量显著低于对照组（*p<0.05;n=3）（如图40和41）。

2.3脑内可溶性（TBS-soluble）的总Tau、Tau-ps404蛋白表达水平

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内海马区Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其Tau5、Tau-ps404、Tau-ps202蛋白表达水平均显著性降低（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001;n=3）（如图42和43）。

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内皮层区Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其Tau5、Tau-ps404蛋白表达水平显著性下降（*p<0.05，***p<0.001;n=3）（如图44和45）。

2.4脑内非可溶性（TBS-insoluble）的总Tau、Tau-ps404蛋白表达水平

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内非可溶性（TBS-insoluble）总Tau蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其海马区及皮层区Tau5蛋白表达水平明显降低（***P<0.001）；且在海马区非可溶性的Tau-ps404磷酸化蛋白表达水平给药组比对照组显著性降低（**P<0.01）（如图46和47）。

2.5免疫荧光检测实验小鼠脑内星型胶质细胞炎症水平

免疫荧光检测脑内海马区星形胶质细胞GFAP的表达发现，在海马组织的CA1、CA3、齿状回区中，Se-Met组其GFAP的阳性率显著低于对照组（*p<0.05;n=3）（如图48和49）。

2.6脑组织中突触蛋白表达水平检测

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内海马区及皮层区突触蛋白的表达水平发现，Se-Met组较对照组其突触前蛋白synaptophysin及突触后蛋白PSD95表达水平显著升高（*p<0.05，***p<0.001;n=3）（如图50-53）。

2.7脑内氧化应激水平检测

脑组织中谷胱甘肽GSH含量检测结果表明：在海马区，两实验组的总谷胱甘肽含量无明显变化，但Se-Met组较对照组其还原型谷胱甘肽含量显著升高，（**p<0.01;n=3）（如图54）；而在皮层区，给药组的谷胱甘肽含量增加并无显著性差异（如图55）。

2.8脑组织糖元合成酶激酶（GSK-3β）表达水平检测

Western-blot检测Se-Met治疗后脑内糖元合成酶激酶的表达水平发现：在海马和皮层组织区，Se-Met组的可溶性GSK-3β蛋白的表达水平显著低于对照组（*p<0.05;n=3）（如图56和57）。

实验结果说明：

接着我们同样检测了脑内的炎症水平，免疫荧光检测结果表明：Se-Met组的GFAP阳性率显著低于对照组；且Se-Met在一定程度上也改善了星形胶质细胞结构的病变；这表明Se-Met在AD发病的中后期同样可以显著性的降低脑内炎症水平。且Western-blot检测突触前、后蛋白（Synaptophysin、PSD95）表达水平发现：与4月龄结果一致，Se-Met组的海马区和皮层区神经元突触前后蛋白表达水平也显著高于对照组。因此，在发病期Se-Met在一定程度上能够恢复神经元突触受损，从而改善认知记忆能力。进一步检测Se-Met治疗后脑内氧化应激水平发现：总谷胱甘肽在脑内海马和皮层区无明显差异，但Se-Met组的还原性谷胱甘肽含量显著高于对照组。这表明Se-Met的抗氧化功效在AD的后期治疗中起了重要的作用，通过提高还原性谷胱甘肽的含量，从而在机体内起到抗氧化的效果。

通过4、8月龄给药治疗及一系列AD常规指标的检测，我们发现：Se-Met不仅可以在AD发病早期延缓其发病进程，且在发病后期具有明显的治疗作用。整合结果分析其治疗机制，不难得出：Se-Met在体内可以降低Aβ、Tau及其磷酸蛋白的表达水平，抑制老年斑、及神经纤维缠结的形成，逆转突触蛋白的降低，降低脑内的炎症水平，并通过提高还原型谷胱甘肽的含量发挥抗氧化功能，从而达到缓解和改善认知及记忆能力障碍的治疗效果。GSK-3β是AD发生过程中一个重要的激酶，脑内炎症反应的增强能够激活其过量表达；且体外研究表明，GSK-3β可参与并调控脑内Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平^[34]。因此，我们通过Western-blot检测发现，在4、8月龄实验组中，给药组的可溶性GSK-3β表达水平显著降低，但不可溶性的GSK3β无明显变化；这是由于在正常生理活动中GSK-3β蛋白是以可溶性移动蛋白发挥生理功能，而不可溶性的GSK-3β蛋白往往是没有生理功能的膜结合蛋白等^[36]，这与我们实验所得到的结果是一致的，且在我们的实验中GSK-3β可能是Se-Met对AD治疗机制中的一个关键激酶。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种硒代蛋氨酸用于制备治疗阿尔茨海默症药物的用途。

2.一种硒代蛋氨酸用于制备提高动物学习记忆能力的药物的用途。

3.一种硒代蛋氨酸用于制备抑制脑内Aβ的聚集以及Tau蛋白及其磷酸化水平的药物的用途。

4.一种硒代蛋氨酸用于制备降低动物体脑内GSK-3β表达的药物的用途。

5.一种硒代蛋氨酸用于制备降低脑内炎症反应，缓解神经细胞的突触损伤的药物的用途。

6.一种硒代蛋氨酸用于制备提高脑内SOD的活性及还原性谷胱甘肽含量的药物的用途。

7.一种含有权利要求1-6任一所述硒代蛋氨酸的药物，其特征在于，给药方式为通过加入饮用水方式给药。

8.权利要求7所述硒代蛋氨酸的药物，加入到饮用水后的终浓度为6ug/ml。

9.一种含有权利要求1-6任一所述硒代蛋氨酸的药物，其特征在于，所述药物是胶囊。

10.一种含有权利要求1-6任一所述硒代蛋氨酸的药物，其特征在于，所述药物是药片。