CN106967692A - 一种重组腺相关病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物医药技术领域，提供了一种重组腺相关病毒及其应用。所述重组腺相关病毒由SelP‑H基因与腺病毒基因重组而成。本发明提供的重组腺相关病毒，由SelP‑H基因与腺病毒基因重组而成，所述重组腺相关病毒可在动物脑内特定区域稳定表达。重组腺相关病毒可以提高动物脑内尼氏小体的数量；降低患AD动物脑内GSK3β和磷酸化的蛋白水平，同时提高PP2A的表达量；提高神经突触相关蛋白的表达量。本发明实施例提供的重组腺相关病毒通过以上作用，起到调控脑内多种金属离子的含量和分布。

Description

一种重组腺相关病毒及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种重组腺相关病毒及其应用。
背景技术
阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种渐进性神经退行疾病，又称原发性老年痴呆症。AD的临床症状主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍和语言障碍等，是一种严重影响患病者社交与生活、给家庭和社会带来沉重负担的疾病。AD患者主要的病理特征为脑内观察到大量的老年斑(Senile plaque,SP)和神经纤维缠结(Neurofibrillarytangle,NFT)，相应地，AD病发目前最流行的是Aβ淀粉样蛋白级联假说和Tau蛋白异常磷酸化导致的神经纤维缠结假说。
根据上述发病机理假说，近年来研究者对AD开发出不少新的药物和治疗方法，目前临床上的治疗方法主要有：影响胆碱系统功能药物(包括胆碱酯酶抑制剂、Ach受体激动剂)；脑血循环改善剂；脑代谢激活剂；纠正钙稳态失调、抗氧化、抗炎药物；神经营养因子等。这些药物治疗机制不明确，也不确定是否产生确切疗效，一部分甚至有很大的毒副作用。此外，这些药物大多只能缓解AD的表面症状，不能防止AD的迅速发展。而某些在基础研究中表现出防治AD作用的药物，又因为不易透过血脑屏障而预测不到应用前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组腺相关病毒及其应用。
本发明是这样实现的，一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒由SelP-H 基因与腺病毒基因重组而成。
进一步地，所述腺病毒为9型重组腺相关病毒载体。
进一步地，所述重组腺相关病毒基因中携带有绿色荧光蛋白基因。
进一步地，所述重组腺相关病毒的碱基序列为如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述所述的重组腺相关病毒的应用，所述应用为将所述重组腺相关病毒用于制备防治阿尔茨海默症的药物或保健品。
进一步地，所述药物或保健品中所述重组腺相关病毒的含量为500-2000PFU/mL。
进一步地，所述药物或保健品用于调控阿尔茨海默症患者脑内金属离子的浓度。
进一步地，所述金属离子包括Cu2+、Zn2+和Fe2+，所述Cu2+的浓度为200-400μmol/L，所述Zn2+的浓度为500-1500μmol/L，所述Fe2+的浓度为500-1500μmol/L。
本发明还提供了上述所述的重组腺相关病毒的应用，所述应用为将所述重组腺相关病毒用于制备调控动物脑内金属离子的含量的片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物或保健品。
本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明实施例提供的重组腺相关病毒，由SelP-H基因与腺病毒基因重组而成，所述重组腺相关病毒可在动物脑内特定区域稳定表达。重组腺相关病毒可以提高动物脑内尼氏小体的数量；降低患AD动物脑内GSK3β和磷酸化的蛋白水平，同时提高PP2A的表达量；提高神经突触相关蛋白的表达量。本发明实施例提供的重组腺相关病毒通过以上作用，起到调控脑内多种金属离子的含量和分布。
附图说明
图1是本发明实施例2提供的重组腺相关病毒在小鼠海马区的感染效果的结果示意图；
图2是本发明实施例3提供的Morris水迷宫检测的SelP-H对AD模型小鼠的空间探索和记忆能力的影响的结果示意图；
图3是本发明实施例4提供的以硫黄素T染色检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内老年斑数量的影响的结果示意图；
图4是本发明实施例5提供的以尼氏染色检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内神经元功能的影响的结果示意图；
图5是本发明实施例6提供的通过ICP-MS检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内金属离子含量的影响的结果示意图，其中图5a是关于锌离子，图5b是关于铁离子，图5c是关于锰离子，图5d是关于钒离子。
图6是本发明实施例7提供的通过XRF检测SelP-H对AD模型小鼠脑内金属离子含量和分布的影响的结果示意图；
图7是本发明实施例8提供的以免疫印迹检测SelP-H对AD模型小鼠脑内tau蛋白过度磷酸化状况的影响(GSK3β，PP2A，磷酸化tau)的结果示意图，其中图7a是与tau蛋白磷酸化相关的蛋白的WB条带，图7b是对AD模型小鼠脑内对ptau404的影响的结果示意图，图7c是对AD模型小鼠脑内对ptau-422的影响的结果示意图，图7d是对AD模型小鼠脑内对GSK3β的影响的结果示意图，图7e是对AD模型小鼠脑内对PP2A的影响的结果示意图；
图8是本发明实施例9提供的以免疫印迹检测SelP-H对AD模型小鼠脑内突触相关蛋白及脑源性生长因子(BDNF)的影响的结果示意图，其中图8a是突触功能相关蛋白的WB条带，图8b是对AD模型小鼠脑内对PSD95的影响的结果示意图，图8c是对AD模型小鼠脑内对Synaptophysin-1的影响的结果示意图，图8d是对AD模型小鼠脑内对BDNF的影响的结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒由SelP-H基因与腺病毒基因重组而成。
本发明实施例提供的重组腺相关病毒，由SelP-H基因与腺病毒基因重组而成，所述重组腺相关病毒可在动物脑内特定区域稳定表达。重组腺相关病毒可以提高动物脑内尼氏小体的数量；降低患AD动物脑内GSK3β和磷酸化的蛋白水平，同时提高PP2A的表达量；提高神经突触相关蛋白的表达量。本发明实施例提供的重组腺相关病毒通过以上作用，起到调控脑内多种金属离子的含量和分布。
具体地，所述腺病毒为9型重组腺相关病毒载体(Recombinant adeno-associatedvirus 9,rAAV9)。
具体地，所述重组腺相关病毒的碱基序列如下：
aggtttcaga gcatattcct gtttatcaac aagaagaaaa ccaaacagat gtctggactcttttaaatgg aagcaaagat gacttcctca tatatgatag atgtggccgt cttgtatatc atcttggtttgcctttttcc ttcctaactt tcccatatgt agaagaagcc attaagattg cttactgtga aaagaaatgtggaaactgct ctctcacga。
具体地，所述重组腺相关病毒基因中携带有绿色荧光蛋白基因。
本发明实施例还提供了上述所述的重组腺相关病毒的应用，所述应用为将所述重组腺相关病毒用于制备防治阿尔茨海默症的药物或保健品。
具体地，所述药物或保健品中所述重组腺相关病毒的含量为500-2000PFU(Plaque-forming unit，空斑形成单位)/mL，优选1000PFU/mL。
具体地，所述药物或保健品用于调控阿尔茨海默症患者脑内金属离子的浓度。所述金属离子包括Cu2+、Zn2+和Fe2+，所述Cu2+的浓度为200-400μmol/L，优选393μmol/L，所述Zn2+的浓度为500-1500μmol/L，优选1055μmol/L，所述Fe2+的浓度为500-1500μmol/L，优选940μmol/L。
经本研究表明，脑内金属离子代谢失衡与AD的发病密切。如Cu2+和Zn2+，可以诱导Aβ聚集形成淀粉样斑块。此外具有氧化还原能力的金属离子如Cu2+可与Aβ相互作用，产生ROS并引起氧化应激作用，进而造成神经元功能丧失，加剧AD的病理损伤。Cu2+和Zn2+诱导的Aβ聚集是可逆的，比如Aβ的聚集和解聚可以被金属螯合剂如氯碘羟喹等调控。调节脑内金属离子代谢时可以选择螯合能力适中的螯合剂，这样能在不扰乱体内其他金属离子平衡的同时达到调节目的。
本发明实施例还提供了上述所述的重组腺相关病毒的应用，所述应用为将所述重组腺相关病毒用于制备调控动物脑内金属离子的含量的片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物或保健品。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1制备重组腺相关病毒
一、所用试剂：
1.293细胞；
2.重组好的腺病毒质粒；
3.3.Pac I限制性内切酶；
4.质粒回收相关试剂；
5.细胞培养、转染相关试剂；
6.TBS：10mM Tris,0.9％NaCl，pH8.1；
7.40％CsCl：28.45g CsCl溶于42.7ml的TBS中，4度保存；
8.15％CsCl：9.085g CsCl溶于47.69ml的TBS中，4度保存；
9.Beckman离心管：14*89mm，SW41转头；
10.Polybrene(sigma)，10mg/ml；
11.透析袋：Spectrum Co.(成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属)，MW＝8000～14400；
12.灭菌甘油。
二、操作流程：
1.293细胞在转染前24小时接种于1或2个60mm培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70％；
2.在转染前，用Pac I处理目的质粒(一般一个60mm细胞盘需要6μgDNA)。处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl无菌水中；
3.用PEI或其他转染试剂将6μg Pac I处理过的质粒转染细胞；
4.8个小时后移去混合液，加入4ml DMEM完全培养液(10％CBS，1％Pen/Strep)；
5.在转染后7到10天用细胞刮(而不是胰酶)将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。离心后将细胞重悬于2.0ml PBS或全培液中。于液氮中冻结细胞，37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4次。注意保存时不要反复冻融，可保存于-20℃；
6.将293细胞以50-70％的汇合率铺于60mm培养盘中，以30-50％的体积比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象；
7.在有1/3到1/2的细胞脱离漂浮时，通常是感染后3-5天收集病毒。可进一步通过Western blot或PCR(5μl病毒上清加上10μl PCR-grade Protease K，55℃消化1小时，然后煮沸样品5min，离心后取1-2μl进行PCR反应)证实重组腺病毒的存在；
8.按步骤5的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到107infectiousparticles/ml的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；
9.为了进一步扩增，将步骤8获得的病毒上清进一步感染100mm培养盘的细胞，按步骤5的方法收集病毒，并进而将其感染150mm细胞培养盘中的293细胞，以获得足够量的病毒；
10.将15％CsCl和40％CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液；
11.将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
12.超速离心，30000rpm，4度离心16个小时；
13.离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用16号针头将这一条带收集；
14.在TBS中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS中透析两次，每次一小时；
15.将纯化的腺病毒分装于EP管中；
16.在Eppendorf Biophotometer中测量透析液中的总蛋白量，1μg病毒蛋白相当于4×109病毒颗粒；
17.长期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反复冻溶；
18.由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：1000的Polybrene。在37度下平板离心30分钟；
19.感染8～12小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸中，加入适量全培液；获得重组腺相关病毒。
实施例2通过脑立体定位注射含SelP-H基因的重组腺相关病毒到小鼠海马CA3区
将3月龄模型小鼠用10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉，并固定于立体定位仪上，剪去头部毛发，75％酒精消毒处理，沿头顶正中线纵行切开头皮，实验组用微量注射器注射2μL的带SelP-H及绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒rAAV9-GFP-SelP-H，(坐标为X＝±2.30mm，Y＝-2.18mm，Z＝-2.10mm)，注射时间4min，注射速度0.5μL/min。空白对照组采用同样方法射等量的对照腺病毒rAAV9-GFP。术后继续饲养，术后1个月、3个月分别杀鼠以脑组织的荧光强度确定蛋白表达情况。
图1是重组腺相关病毒在小鼠海马区的感染效果的结果示意图。从图1中可以看出，重组腺相关病毒中携带绿色荧光蛋白基因。注射1个月后的鼠脑切片显示出海马区有高亮的绿色荧光，表明rAAV的感染效果良好。注射后3个月荧光勉强可见，说明还有细微的表达量，但是水平已经很低，rAAV的表达时间可持续到注射3个月。
实施例3Morris水迷宫检测SelP-H对AD模型小鼠的空间探索和记忆能力的影响
实验小鼠：分为四组，一组为7月龄注射rAAV9-GFP的野生型小鼠，一组7月龄注射rAAV9-SelP-H的野生型小鼠，一组为7月龄注射rAAV9-GFP的AD模型小鼠，一组7月龄注射rAAV9-SelP-H的AD模型小鼠。每组20只。
Morris水迷宫实验分为定位航行及空间探索两部分。其中定位航行历时5天，空间探索两天。定位航行第一天为训练期，将小鼠置于平台上适应10s，随后将小鼠从不同象限的对应位置面壁放入池内，小鼠登上平台2s后终止记录，最长记录时间为60s，若小鼠在60s内不能上台，引导其登上平台适应10s。定位航行第二天到第五天为检测期。空间探索分为24小时记忆和72小时记忆：是从定位航行结束开始计时，将平台撤去，记录小鼠在原平台所在象限停留时间及跨越原平台的次数。
图2是通过Morris水迷宫检测的SelP-H对AD模型小鼠的空间探索和记忆能力的影响的结果示意图。水迷宫的训练过程可以评估小鼠的学习能力。在定位航行试验中，3×TgAD的对照组小鼠从第一天至第五天的训练中，测得的逃避潜伏期均比野生型小鼠长，并在第一天和第五天表现出有显著性(#p<0.05，##p<0.01；n＝20)；而接受SelP-H治疗的3×TgAD小鼠在注射后4个月，即7月龄时，其在不同检测时间点逃避潜伏期均表现出下降，并在第二天与对照组相比具有显著性(*p<0.05；n＝20)，甚至略略优于野生型小鼠的表现。从图2中可以看出，随着学习天数增加，小鼠的逃避潜伏期时长在下降。两组非转基因的野生型小鼠的逃避潜伏期整体低于转基因的AD模型小鼠。加了SelP-H表达的AD模型鼠逃避潜伏期整体低于对照组，并在第2天和第5天表现出显著性(Ng：非转基因的野生型；Tg：转基因的AD模型小鼠)。由此说明，本发明实施例提供的重组腺相关病毒可以显著提高患AD动物的空间探索和记忆能力。
实施例4以硫黄素T染色检测SelP-H对AD模型小鼠脑内老年斑数量的影响
取小鼠新鲜大脑组织于4％多聚甲醛固定24小时，30％蔗糖脱水48小时以上，以OCT包埋于20℃中切成16μm的冰冻切片。切片自来水洗后入蒸馏水，置入1％硫磺素T染液浸染30min，迅速蒸馏水洗，用抗荧光淬灭封片剂。在荧光显微镜下经488nm波长的光源激发，观察阳性染色并拍照。
图3是以硫黄素T染色检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内老年斑数量的影响的结果示意图。如图所示，染老年斑中，AD模型小鼠的阳性染色数量要多于野生型。提高SelP-H表达的AD模型小鼠的阳性染色变少了(Ng：非转基因的野生型；Tg：转基因的AD模型小鼠)。可见，与野生型两组相比，AD对照组有更高的老年斑含量。而加入SelP-H干预后的AD鼠，其老年斑的含量变少了，观察起来更加像是野生型，所以SelP-H可以减少AD模型小鼠脑内老年斑数量。由此可以确定，本发明实施例提供的重组腺相关病毒可以起到减少患AD动物的老年斑的作用。
实施例5以尼氏染色检测SelP-H对AD模型小鼠脑内神经元功能的影响
取小鼠新鲜大脑组织于4％多聚甲醛固定24小时，30％蔗糖脱水48小时以上，以OCT包埋于20℃中切成16μm的冰冻切片。切片自来水洗后入蒸馏水，尼氏(Nissl)染色液染色染色15分钟。蒸馏水洗涤2次(每次数秒钟即可)。95％乙醇约5秒。换用新鲜的95％乙醇再脱水2分钟。二甲苯透明5分钟。换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟。用中性树胶剂封片，显微镜下观察，细胞呈现斑驳的蓝紫色染色。
尼氏小体是神经元发挥正常生理功能的必要结构，图4是以尼氏染色检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内神经元功能的影响的结果示意图。如图所示，野生型两组的小鼠海马形态清晰，细胞排列整齐，神经元的形态正常，尼氏体明显。而AD模型小鼠海马形态受损，组织结构松散，神经元明显缺失，尼氏体分布稀疏。而经过SelP-H治疗后的AD小鼠，保留的尼氏体数量非常明显地增多，甚至比野生型更加稠密，海马的形态也十分清晰。可见，AD模型小鼠中的尼氏小体相比起野生型更少，提高SelP-H表达的AD小鼠的尼氏小体增多了(Ng：非转基因的野生型；Tg：转基因的AD模型小鼠)。从图4中可以看出，SelP-H增加了AD模型小鼠脑内尼氏小体数量的结果。由此可以看出，本发明实施例提供的重组腺相关病毒可以促进AD动物脑内神经元功能。
实施例6ICP-MS检测SelP-H对AD模型小鼠脑内金属离子含量的影响
所有器皿及消化罐均须先以20％硝酸浸泡24小时，然后用自来反复冲洗，最后用超纯水冲洗干净。
杀鼠取脑组织，称取一定量质量的组织，置于玻璃试管中，加入90μL纯硝酸在60℃中处理25小时。用超纯水定容到5mL，盖上密封盖，放入微波消解仪中，微波消解仪功率和加热时间调至最佳程序，消解结束后，冷却至室温，混匀，使用ICP-MS检测样品中Cu，Fe，Zn等金属离子。同时做试剂空白对照。
图5是通过ICP-MS检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内金属离子含量的影响的结果示意图。如图所示，在AD模型小鼠中，海马区Zn、Fe等金属离子浓度发生了紊乱，表现明显不同于野生型。与野生型对比，AD模型鼠的海马中的Zn离子、Fe离子、Mn离子及V离子水平显著更高，而在SelP-H的治疗之后显著下降了。提高了SelP-H表达之后，金属离子的浓度趋向于恢复到野生型的状态。由此可知，本发明实施例提供的重组腺相关病毒可以起到调控AD动物脑内金属离子浓度的作用，从而可以起到治疗AD的效果。
实施例7XRF检测SelP-H对AD模型小鼠脑内金属离子含量和分布的影响
实验小鼠通过腹腔乙醚麻醉，处死。取脑组织以4％的多聚甲醛24小时以上，30％的蔗糖脱水48小时。OCT包埋后以冷冻切片机进行冠状切片，厚度50 μm。将切片贴到3M胶带备用。样品采用上海第三代同步辐射光源BLl5U1(硬x微聚焦及应用光束线)试验站的SR-XRF进行分析。实验时，样品放置在7轴样品台上，7轴样品台的X、Y、Z扫描时的精度可达0.1μm。采用光学显微镜对样品进行定位，扫描整个海马区及部分皮层区。仪器工作条件为：入射光能量12.0keV，与样品成45度角，光斑大小调节为100μm×100μm，步长(x、y两个方向)为100μm。每点扫描时间为2s，Si(Li)探测器采集荧光。采用GeoPIXE(CSIRO,Australia)软件从能量分散图谱提取各种金属元素在每个象素点的荧光计数，并以Igor Pro(WaveMetrics,USA)软件作图。
图6是通过XRF检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内金属离子含量和分布的影响的结果示意图。如图所示，与野生型两组小鼠相比，铜在AD鼠海马区的分布更少。而SelP-H治疗后的AD模型鼠脑内铜的含量显著回复，表现更加趋近于野生型。与铜在小鼠脑内的分布不一样，锌在齿状回和海马区有明显的分布，且在AD模型鼠的海马区有高度的富集，类似地，SelP-H的治疗减轻了AD鼠脑中锌的富集。铁的分布在整个鼠脑中都比较均匀，而且四组间的表现并没有很大差异。从图中可以看出，AD鼠异于野生型小鼠，而提高SelP-H表达能使这种异常变小(WG：野生型；WP：野生型+SelP-H；AG：AD模型小鼠；AP：AD模型小鼠+SelP-H)。这进一步证实了本发明实施例提供的重组腺相关病毒可以起到调控AD动物脑内金属离子浓度的作用，从而可以起到治疗AD的效果。
实施例8以免疫印迹检测SelP-H对AD模型小鼠脑内tau蛋白过度磷酸化状况的影响(GSK3β,PP2A,磷酸化tau)
1、以注射rAAV9-SelP-H的小鼠脑组织为实验组，以注射rAAV9-GFP的小鼠脑组织对照组。
2、制作蛋白匀浆，提蛋白。
3、蛋白定量。
4、进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳。
5、切胶转膜。
6、5％脱脂牛奶封闭。
7、用相应的一抗孵育。
8、二抗孵育。
9、显影并进行数据分析。
图7是以免疫印迹检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内tau蛋白过度磷酸化状况的影响(GSK3β，PP2A，磷酸化tau)的结果示意图。如图所示，与野生型(WT)相比AD鼠的海马区中ptau-404、ptau-422均显著上升，在经过SelP-H治疗之后显著下降。对图7a中GSK3β条带的定量分析，与野生型(WT)相比AD鼠的海马区中GSK3β显著上升，在经过SelP-H治疗之后显著下降；对图7a中PP2A条带的定量分析，与野生型(WT)相比AD鼠的海马区中GSK3β显著下降，在经过SelP-H治疗之后显著上升。AD模型小鼠中，GSK3β和磷酸化的蛋白水平会相比起野生型提高，而PP2A的表达量则降低，提高SelP-H表达可以缓解这些情况。可见，本发明实施例提供的重组腺相关病毒可以起到降低患AD动物脑内GSK3β和磷酸化的蛋白水平，同时提高PP2A的表达量。
实施例9以免疫印迹检测SelP-H对AD模型小鼠脑内突触相关蛋白及脑源性生长因子(BDNF)的影响
方法同实施例8。
图8是以免疫印迹检测的SelP-H对AD模型小鼠脑内突触相关蛋白及脑源性生长因子(BDNF)的影响的结果示意图。如图所示，对图8a中PSD95条带的定量分析，与野生型(WT)相比AD鼠的海马区中PSD95显著下降，在经过SelP-H治疗之后显著上升；对图8a中Synaptophysin-1条带的定量分析，与野生型(WT)相比AD鼠的海马区中Synaptophysin-1显著上升，在经过SelP-H治疗之后显著下降；对图8a中BDNF条带的定量分析，与野生型(WT)相比AD鼠的海马区中BDNF显著上升，在经过SelP-H治疗之后显著下降。与野生型相比，在AD模型小鼠中，神经突触相关蛋白表达量降低了，而提高SelP-H 表达能逆转这种状况，同时SelP-H的提高还能促进BDNF的表达。可见，本发明实施例提供的重组腺相关病毒可以起到提高患AD动物神经突触相关蛋白表达量，此外还能促进BDNF的表达。这进一步证实了本发明实施例提供的重组腺相关病毒可以起到治疗AD的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种重组腺相关病毒及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 重组腺相关病毒的碱基序列
<400> 1
aggtttcaga gcatattcct gtttatcaac aagaagaaaa ccaaacagat gtctggactc 60
ttttaaatgg aagcaaagat gacttcctca tatatgatag atgtggccgt cttgtatatc 120
atcttggttt gcctttttcc ttcctaactt tcccatatgt agaagaagcc attaagattg 180
cttactgtga aaagaaatgt ggaaactgct ctctcacga 219

Claims (9)

1.一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒由SelP-H基因与腺病毒基因重组而成。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述腺病毒为9型重组腺相关病毒载体。
3.如权利要求1所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒基因中携带有绿色荧光蛋白基因。
4.如权利要求1所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒的碱基序列为如SEQ ID NO.1所示。
5.如权利要求1至4任意一项所述的重组腺相关病毒的应用，其特征在于，所述应用为将所述重组腺相关病毒用于制备防治阿尔茨海默症的药物或保健品。
6.如权利要求5所述的重组腺相关病毒的应用，其特征在于，所述药物或保健品中所述重组腺相关病毒的含量为500-2000PFU/mL。
7.如权利要求5所述的重组腺相关病毒的应用，其特征在于，所述药物或保健品用于调控阿尔茨海默症患者脑内金属离子的浓度。
8.如权利要求7所述的重组腺相关病毒的应用，其特征在于，所述金属离子包括Cu2+、Zn2+和Fe2+，所述Cu2+的浓度为200-400μmol/L，所述Zn2+的浓度为500-1500μmol/L，所述Fe2+的浓度为500-1500μmol/L。
9.如权利要求1至4任意一项所述的重组腺相关病毒的应用，其特征在于，所述应用为将所述重组腺相关病毒用于制备调控动物脑内金属离子的含量的片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物或保健品。
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