CN109674814A - 一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法及其在制备抑制tau蛋白过度磷酸化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法及其在制备抑制tau蛋白过度磷酸化药物中的应用。本发明以硫酸软骨素、亚硒酸盐为原料，通过L‑半胱氨酸还原制备硫酸软骨素纳米硒，制备工艺简单，工艺绿色环保。本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒，有效的降低了无机硒的毒性，结合了硫酸软骨素和纳米硒的优点，具有良好的抑制tau蛋白过度磷酸化的药理活性，可以用于制备治疗、改善或预防tau蛋白过度磷酸化相关神经系统疾病的药物，可以作为一种治疗阿尔茨海默病的候选药物。

Description

一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法及其在制备抑制tau蛋白 过度磷酸化药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法及其在制备抑制tau蛋白过度磷酸化药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

阿尔兹海默症(Alzheimer's disease，AD)，又称为老年性痴呆，是一种以神经变性和认知功能受损为特征的复杂进行性脑退行性疾病。大量的研究表明，包括β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积、tau蛋白过度磷酸化、乙酰胆碱水平过低、炎症、氧化应激损伤和线粒体功能障碍等多种因素可能在AD的发病机制中起重要作用。目前，FDA批准的AD药物主要包括乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体拮抗剂，但这些药物只能轻微缓解症状。制药公司和学术界的科学家们在寻找抗AD药物方面做了大量的研究：许多潜在的以Aβ为靶点的药物已进入II期和III期临床试验，但结果几乎普遍令人失望，基于Aβ级联假说药物的临床失败提示Aβ或许不是最佳的治疗靶点。Tau蛋白与微管蛋白结合促进其聚合形成微管，其高度可溶，主要存在轴突中与微管结合。在与tau蛋白相关的疾病中，其主要病理改变为tau蛋白磷酸化而致使不能与微管结合，从而造成轴突转运障碍。AD的主要病理特点之一也是脑内神经元磷酸化tau蛋白高度聚集。针对tau蛋白的研究显示其可能为AD治疗的另一关键点。

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是一种存在于细胞外基质中的硫酸糖胺聚糖。CS具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、神经保护和抗神经炎症等。CS通常附着在蛋白核心上，形成硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)。CSPGs主要分布于神经元周围的基质中，参与神经系统损伤后的神经形成、迁移、轴突生长和引导、突触可塑性和再生。CS通过激活蛋白激酶C(PKC)，减少活性氧的形成，保护氧化应激条件下的SH-SY5Y细胞。CS还能抑制Aβ的纤维形成，阻断Aβ诱导的细胞活力丧失和凋亡，降低细胞内游离钙浓度和Caspase-3蛋白表达，减轻Aβ诱导的体内外神经毒性。此外，CS还能降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(INOS)的表达，防止NF-κB/p65核移位，进而抑制脂多糖诱导的神经炎症。CS的这些特点说明CS在AD治疗中可能具有良好的治疗价值。

硒(Se)是人体所必需的微量营养素，在解毒、调节细胞氧化还原稳态和免疫系统保护等方面发挥着重要作用。近年来，硒和硒蛋白在包括AD在内的神经退行性疾病中的作用已经有了大量的研究。硒能有效抑制Aβ纤维的形成，并能将预先形成的Aβ纤维分解成无毒的聚集体。此外，动物实验也表明神经递质代谢与体内硒的水平改变有关。然而，无机硒毒性大，安全剂量为400μg/天，且无机含硒物质的有效剂量与中毒剂量相差不大，服用过量可引起中毒。有机纳米硒的毒性比无机硒低，生物活性比无机硒高，可以作为一种有效的补硒剂。

发明内容

本发明提供了一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法，以硫酸软骨素、亚硒酸盐为原料，通过L-半胱氨酸还原制备硫酸软骨素纳米硒(CS@Se)，制备工艺简单，工艺绿色环保。所提供的硫酸软骨素纳米硒，可以有效降低了无机硒的毒性，结合了硫酸软骨素和纳米硒的优点，具有良好的抑制tau蛋白过度磷酸化的药理活性，可以用于制备治疗、改善或预防tau蛋白过度磷酸化相关神经系统疾病的药物，可以作为一种治疗阿尔茨海默病的候选药物。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法，步骤如下：

取Na₂SeO₃、CS(Na₂SeO₃：CS摩尔比＝1:1～1:4)溶于40ml去离子水中，逐滴加入50mM L-半胱氨酸(L-cys)溶液(Na₂SeO₃：L-cys摩尔比＝1:1～1:4)，30℃磁力搅拌1.5h。MWCO 1000透析袋对水透析24h后(每3h换水一次)，冷冻干燥得硫酸软骨素纳米硒。

优选的，所述Na₂SeO₃与硫酸软骨素摩尔比为1:1～1:3；Na₂SeO₃与L-半胱氨酸摩尔比为1:1～1:3。

优选的，所述硫酸软骨素选自猪硫酸软骨素、牛硫酸软骨素、鲨鱼硫酸软骨素、鸡硫酸软骨素、鸭硫酸软骨素、乌贼硫酸软骨素、鲟鱼硫酸软骨素、鳗鱼硫酸软骨素、鳐鱼硫酸软骨素、魟鱼硫酸软骨素中的任一种或几种。

上述硫酸软骨素纳米硒在制备抑制tau蛋白过度磷酸化药物中的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒，以硫酸软骨素为纳米硒修饰剂和稳定剂，所形成的硫酸软骨素纳米硒稳定性好，细胞毒性低。

2.本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒，可降低tau蛋白在Ser396位点的过度磷酸化；且其调节tau蛋白过度磷酸化效果远好于同剂量的纳米硒和硫酸软骨素。

附图说明

图1为CS和CS@Se的红外光谱图；

图2为Na₂SeO₃和CS@Se的细胞毒性图，其中：组1:CS@Se 200μg/ml，Na₂SeO₃800ng/ml；组2:CS@Se 100μg/ml，Na₂SeO₃400ng/ml；组3:CS@Se 50μg/ml，Na₂SeO₃200ng/ml；组4:CS@Se 25μg/ml，Na₂SeO₃100ng/ml；

图3为CS@Se对tau蛋白过度磷酸化的抑制作用，其中：CS组中CS剂量与50μg/mLCS@Se中所含CS相同，纳米硒组中硒剂量与50μg/mLCS@Se中所含纳米硒相同；*p<0.05,***p<0.001vs.模型组；^###p<0.001vs.CS@Se高剂量组。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1硫酸软骨素纳米硒的制备

取50mmolNa₂SeO₃、100mmol鲨鱼CS(Na₂SeO₃：CS摩尔比＝1:2)溶于40ml去离子水中，逐滴加入50mM L-半胱氨酸(L-cys)溶液(Na₂SeO₃：L-cys摩尔比＝1:2)，30℃磁力搅拌1.5h。MWCO 1000透析袋对水透析24h后(每3h换水一次)，冷冻干燥得粉红色的硫酸软骨素纳米硒。图1为CS和CS@Se的红外光谱，3600-3200cm^-1内有一个很宽的吸收带，为-OH和-NH的伸缩振动吸收峰的重叠峰；2910cm^-1处附近为-CH和-CH₃的C-H反对称伸缩振动峰；1642cm^-1处附近为-NHCO-的羰基的伸缩振动峰；1566cm^-1处为-NHCO-的-NH-变角振动峰，1417cm^-1处为-COOH的拉伸振动峰，1377cm^-1处为-COO-的对称拉伸振动峰。通过对比可以看出，CS@Se在3600-3200cm^-1内的吸收峰变弱且发生了蓝移，表明纳米硒的引入可能使得分子内氢键对-OH伸缩振动的影响减弱；1566cm^-1处-NHCO-上-NH-峰强度降低，表明纳米硒的引入可能影响到了-NH-的变角振动；1377cm^-1处的峰值明显减弱，表明电离COO-的数量明显减少。这些结果表明CS可以通过物理吸附、共价键或其他形式的复合键来稳定引入的纳米硒，从而使CS@Se纳米粒子形成高度稳定和良好的分散性。

实施例2硫酸软骨素纳米硒和亚硒酸钠的SH-SY5Y细胞毒性试验

为了考察CS@Se的生物相容性，采用CCK-8法测定CS@Se对SH-SY5Y细胞的细胞毒性。其具体试验方法如下：取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以每孔8,000细胞、100μL培养基接种于96孔培养板，培养24h后，吸弃培养基，分别加入100μL不同浓度的CS@Se和Na₂SeO₃溶液，继续培养24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃下孵育2h，Bio-Rad 680酶标仪450nm处测定吸光度，计算细胞存活率。结果发现即使在高浓度(100μg/mL)时，CS@Se处理的细胞具有较高的活力；而Na₂SeO₃对SH-SY5Y细胞在极低浓度下仍表现出很高的毒性。这些结果表明CS@Se的毒性远低于Na₂SeO₃的毒性。当浓度为100μg/mL时，

CS@Se的细胞存活率可达80％。

实施例3CS@Se对SH-SY5Y细胞内tau蛋白变化的影响

取对数生长期的SH-SY5Y细胞以1×10⁶个/10cm皿的密度种植于培养皿中，细胞培养箱中培养48h，吸弃培养基，加入含有不同浓度CS@Se的无血清培养基(25μg/mL和50μg/mL)继续培养，作用12h后，加入终浓度为10μmol/L经过预孵育的Aβ_1-42(37℃孵育72h)，再培养6h，预冷的PBS冲洗2次，加入预冷的RIPA细胞裂解液200μl，放置20min后，用细胞刮收集细胞。4℃、12000r/min离心10min，取其中的上清即得总蛋白。取少量蛋白提取液，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，测定各组蛋白的浓度后，超低温冰箱中储存，然后采用Westernblot的方法检测SH-SY5Y细胞内p-Tau(s396)蛋白的表达，从图3可以看出50μg/mLCS@Se可以显著降低细胞内p-Tau(s396)蛋白的表达，且其降低p-Tau(s396)蛋白表达的效果较氯化锂、同剂量的CS和同剂量的纳米显著(p<0.001，p<0.001和p<0.001)。本研究结果表明CS@Se可以降低tau蛋白的过度磷酸化，从而起到抗AD的作用。

Claims (4)

1.一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取Na₂SeO₃、硫酸软骨素溶于40ml去离子水中，逐滴加入50mM L半胱氨酸溶液，30℃磁力搅拌1.5h；MWCO 1000透析袋对水透析24h后，冷冻干燥得硫酸软骨素纳米硒；

所述Na₂SeO₃与硫酸软骨素摩尔比为1:1～1:4；

所述Na₂SeO₃与L-半胱氨酸摩尔比为1:1～1:4。

2.根据权利要求1所述的硫酸软骨素纳米硒的制备方法，其特征在于，所述Na₂SeO₃与硫酸软骨素摩尔比为1:1～1:3；Na₂SeO₃与L-半胱氨酸摩尔比为1:1～1:3。

3.根据权利要求1所述硫酸软骨素纳米硒的制备方法，其特征在于所述硫酸软骨素选自猪硫酸软骨素、牛硫酸软骨素、鲨鱼硫酸软骨素、鸡硫酸软骨素、鸭硫酸软骨素、乌贼硫酸软骨素、鲟鱼硫酸软骨素、鳗鱼硫酸软骨素、鳐鱼硫酸软骨素、魟鱼硫酸软骨素中的任一种或几种。

4.权利要求1所述硫酸软骨素纳米硒在制备治疗、改善或预防tau蛋白过度磷酸化相关神经系统疾病的药物中的应用。