CN110327372B - 碳基纳米材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了碳基纳米材料及其应用，解决了现有碳纳米材料比如富勒烯合成成本过高的问题，具有水溶性好、可降解并能有效抑制Aβ多肽聚集等显著优势，碳基纳米材料吸附在原纤维轴向端面，抑制Aβ寡聚体形成；通过细胞实验和动物实验发现，碳基纳米材料能够缓解Aβ寡聚体对神经元的毒性并降低对突触的损害，改善了AD模型小鼠（APP/PS1）的学习记忆能力。

Description

碳基纳米材料及其应用

技术领域

本发明属于纳米药物技术，具体涉及一种碳基纳米材料及其制备方法与应用。

背景技术

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease, AD；又称为老年性痴呆症）是三大类神经退行性疾病中发病人数最多的一大类，该病严重影响患者的生活质量，增加死亡风险，同时给其家庭、社会增加沉重的负担。因此阿尔茨海默症被认为是继心血管病、脑血管病和癌症之后，威胁人类生命的“第四大杀手”。为解决阿尔茨海默症给家庭和社会带来的沉重负担，世界各大制药巨头如Biogen、EliLilly、Merck、Roche、Novartis等均投入了巨大精力和资金用以开发有效新药，但收效甚微，目前还没有治愈该病的药物。在1998年至2017年间，只有五个经过美国食品和药品管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准的抗AD药物，其中多奈哌齐（Donepezil）、加兰他敏（Galanthamine）、卡巴拉汀（Rivastigmine）和美金刚（Memantine Hydrochloride）。前四种为乙酰胆碱脂酶抑制剂。这些药物可以抑制乙酰胆碱脂酶的活性从而减少神经递质乙酰胆碱的水解，仅适用于轻度阿尔茨海默症。其中他克林肝毒性较大，已逐渐减少使用；美金刚是NMDA受体拮抗剂，用于降低谷氨酸的过度刺激神经元造成的兴奋性毒性，适用于中重度阿尔茨海默症。目前获批的所有药物均不能从根本上治愈AD，只能适度减轻AD 症状。AD药物开发过程充满了挑战，在十年新药的研发过程中，有40%停止于临床0期至临床1/2期，39%停止于临床2至2/3期，18%停止于临床3期甚至监管审批期间，还有3%因为各种原因没有进行下去。这些数字表明，有相当数量的药物已经达到了临床开发后期，但最终都未能成功，进一步凸显了AD药物开发过程困难程度。但是如果能尽快开发一种新药，将AD的发病时间延迟五年，并在2025年就被批准使用的话，AD护理成本可以减少大约40％（PhRMA，Researching Alzheimer’s Medicines）。

纳米技术用于疾病的诊断，预防和治疗是一个快速发展和极具前途的领域，但目前仍处于初级阶段。纳米材料作为AD诊断，预防和治疗的潜在纳米药物，具有极其重要的角色。在过去的几年中，利用纳米粒子被动和主动运输将药物运送到脑部的相关研究已取得较大进展。与此同时，可以控制大脑和外周循环的Aβ聚集的纳米技术也已经出现，这为AD的治疗提供了良好的技术基础。虽然人们对纳米材料类药物作为“智能”药物并应用于AD 治疗寄予了极大希望，但由于AD的病因仍未完全阐明，以及AD治疗药物难以透过血脑屏障均为AD治疗带来重重困难，纵观各项研究，寻找AD早期诊断和有效干预手段需要拨云见日的勇气和创新思索，更需要研究者孜孜不倦的追求。

发明内容

本发明公开了一种碳基纳米材料及其制备方法与应用，该碳纳米材料是一种继富勒烯、碳纳米管和石墨烯之后被发现的新的碳纳米材料，为尺寸小于10 nm、准球形的纳米粒子，具有良好的水溶性、生物相容性、荧光稳定性，并且物理化学性质稳定，易于实现表面功能化，可以抑制Aβ聚集以达到AD防治。

本发明采用如下技术方案：

碳基纳米材料，其制备方法包括以下步骤，以维生素或者类维生素为原料，经过加热反应，制备碳基纳米材料。

上述技术方案中，将维生素溶液或者类维生素溶液于170℃～190℃反应1.5h～2.5 h；然后自然冷却至室温，再过滤；然后将滤液透析后冷冻干燥，得到碳基纳米材料，称为CDs。

上述技术方案中，维生素溶液的浓度为0.1g/mL；类维生素溶液的浓度为0.1g/mL；维生素为维生素A、维生素E、维生素D3、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素K3、维生素B12等；类维生素为类维生素A、类维生素D3、类维生素E等。

上述技术方案中，将维生素溶液于180℃反应2 h，维生素发生聚合，生成水溶性碳纳米材料。

上述技术方案中，利用500～1000 Da的透析袋透析；透析在水中进行。滤液为碳基纳米材料水溶液，可以直接使用，用于抑制Aβ多肽的过量表达及聚集；也可以冷冻干燥得到碳基纳米材料，之后复溶使用。

上述技术方案中，冷冻干燥为-80℃、真空度10Pa的条件下冷冻干燥48h。优选的，冷冻干燥为先于冰箱中-80℃冰冻2小时，然后于冷冻干燥机中-80℃、真空度10Pa的条件下冷冻干燥48h。

碳量子点的碳源包括石墨结构碳材料、多壁碳纳米管等碳基材料，然而，其昂贵的原料及所需的高能系统都限制了其生产应用；自然生物，例如柚子皮、橙汁等也可制备碳量子点，但这些物质成分复杂，含有较多的杂质，不利于分析，且由于自然生物的个体性差异大，使得技术效果难以重复。

本发明公开了所述碳基纳米材料在制备Aβ多肽聚集抑制剂中的应用，或者所述碳基纳米材料在制备治疗或者缓解AD的药物中的应用。

本发明还公开了抑制Aβ多肽聚集的药物或者治疗AD的药物，包括上述碳基纳米材料。治疗包括其通常被接受的含义，比如阻止、预防、抑制、改善以及减缓、停止逆转所产生症状或预期病变的发展，本发明涵盖治疗性和预防性。

本发明的药物还可以包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种，药物形式可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分碳基纳米材料制备成药物或药物组合物，可采用本领域普通技术人员公知的方法来制备，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体（生理盐水、缓冲液等）混合，用载体稀释或者包封在载体中；适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些物质可以举例为乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。本发明的药物还可以包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。

优选的，本发明的药物为液体，即碳基纳米材料水溶液，进一步优选的，液体药物中，碳基纳米材料的浓度为0.01～1mg/mL，优选0.1～0.5mg/mL。

抑制Aβ多肽的过量表达及聚集是AD 治疗的关键，然而，AD是一个漫长的神经退行性疾病，现有报道的纳米材料/药物能否最终被用于临床不仅由它们预防和治疗的效果所决定，还取决于它们的生物毒性效应和体内安全性，并且AD是一类中枢神经系统疾病，药物分子能否以无创的方式通过血脑屏障是前提条件。本发明公开的碳基纳米材料具有粒径小、比表面积大、表面功能化基团修饰、低毒和可降解等优点，并且可以通过血脑屏障，是对AD预防、治疗有效的碳基纳米材料。

附图说明

图1为CDs的结构特点（a）CDs水溶液的紫外-可见吸收光谱（b）CDs红外光谱（c）X射线光电子能谱分析；

图2为CDs水溶液的光谱性质；

图3为CDs的形貌，(a)透射电镜（TEM）进行形貌观察 (b)水合粒径分布图 （c）原子力显微镜检测高度；

图4为不同浓度的CDs水溶液照片；

图5为CDs呈浓度依赖抑制Aβ_1-42多肽在PBS中聚集 a.Th T实验检测抑制效果；b点杂交检测Aβ纤维的生成量；

图6位CDs与Aβ_1-42共同孵育聚集体的AFM图像，（紫色箭头为长纤维，黑色箭头为短纤维，绿色箭头为高度为10 nm范围内寡聚体，蓝色箭头为高度为10-20 nm的寡聚体）；

图7为CDs抑制Aβ_1-42聚集的动力学过程；

图8为寡聚体构象特异识别抗体（A11）点杂交图；

图9为分子动力学分析CDs抑制Aβ_1-42聚集过程；

图10为CCK8检测CDs对SH-SY5Y、PC12，原代神经元（Neuron）和原代星形胶质细胞的细胞毒性；

图11为CDs红细胞溶解实验，a为不同浓度CDs与红细胞共同孵育实拍图 b分别为共同孵育后酶标仪540 nm检测上清中血红素的释放率；

图12为CDs降低Aβ寡聚体的细胞毒性，a为活细胞/死细胞染色示意图；b为活细胞/死细胞染色统计图，c为乳酸脱氢酶（LDH）实验；

图13为CDs降低Aβ寡聚体的细胞毒性（细胞免疫荧光染色，MAP2）；

图14为CDs降低Aβ寡聚体引起的神经元毒性（隧道扫描电镜）；

图15为APP/PS1小鼠组织PCR鉴定结果示意图；

图16为各组小鼠体重变化曲线；

图17为各组小鼠水迷宫逃避潜伏期曲线；

图18为探索平台各组小鼠在各个平台停留时间；

图19为新物识别实验示意图；

图20为各组小鼠新事物探索能力；

图21为小鼠脑片激光共聚焦成像（激发光：405 nm）；

图22为实施例五中CDs抑制Aβ多肽聚集的效果图；

图23为对比例一中碳材料抑制Aβ多肽聚集的效果图。

具体实施方式

神经病理学上，AD的特征是神经元细胞的大量死亡、细胞外有Aβ异常聚集形成的淀粉样斑块和细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结。对于AD的发病机制尚不清楚，目前认为遗传、年龄、受教育程度、饮食、暴露重金属等因素可能影响AD早期的发生和后期的病理变化。根据病理表现，现有假说认为AD发病中的神经变性乃至痴呆是由Aβ多肽在脑的各个区域中异常沉积引起的。Aβ多肽的纤维化累积过程触发了tau蛋白过渡磷酸化，最终形成神经原纤维缠、神经炎症、神经元功能障碍和细胞凋亡等一系列的下游反应。近些年来的遗传、生化和病理研究均对Aβ多肽级联假说提供了强有力的支持证据。因此，抑制Aβ的聚集、破坏Aβ聚集过程中的二次成核是预防及治疗AD的重要策略。本发明公开的碳基纳米材料具有粒径小、比表面积大、表面功能化基团修饰、低毒和可降解等优点，并且可以通过血脑屏障，是对AD预防、治疗有效的碳基纳米材料。

本发明的碳基纳米材料的制备方法如下：将维生素溶液或者类维生素溶液于170℃～190℃反应1.5h～2.5 h；然后自然冷却至室温，再过滤；然后将滤液透析后冷冻干燥，得到碳基纳米材料，称为CDs。

本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本发明教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

材料表征方法

紫外光谱 取适量CDs水溶液稀释成一定浓度后转移至比色皿中，用紫外光谱仪测定紫外光谱。

电镜样制备及拍照 将CDs水溶液稀释到成不同浓度梯度，提前用镊子夹取铜网置于吸水滤纸上，各取5 µL溶液滴于铜网上，放阴凉处自然风干。样品干燥后用FEI TecnaiG20电子显微镜进行拍摄并选取图片，高倍图片用JEM-2010F 高透射电子显微镜进行拍摄。

CDs纳米材料的X射线光电子能谱分析 取适量CDs水溶液，放于-80 ℃冰箱冰冻2h, 用Alpha1-4LSCplus RC6冷冻干燥机冷冻干燥48 h后取出粉末。然后取出少量的粉末样品进行上机检测。

红外光谱测定 将上述CDs冻干粉，取适量样品在红外光谱仪上进行上机检测。

CDs体外抑制Aβ_1-42多肽聚集

Aβ单体化/硫磺素T（ThT）检测Aβ_1-42聚集体的形成/点杂交/原子力显微镜/透射电子显微镜观察样品形貌实验方法如下：

a)Aβ_1-42单体化

六氟异丙醇（1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol，HFIP）能破坏蛋白质之间形成的氢键，将HFIP在冰上预冷，将1 mg的合成肽Aβ_1-42溶解到冷却的222 μL的HFIP中（1mM），超声10 min，室温孵育60 min，使蛋白充分单体化。开盖于通风橱至HFIP挥发干净，-80℃冰箱保存。

b)硫磺素T检测Aβ_1-42多肽聚集

取出-80 ℃冰箱保存的Aβ_1-42肽膜，加入MDSO重溶肽膜使其浓度为5 mM。使用PBS溶液（pH 7.4）将Aβ_1-42-DMSO混合物稀释至100 μM，16 000 g× 10 min离心取上清以去除预形成的纤维，单体在37 ℃、300 rpm条件环境下能自发聚集成寡聚体、原纤维、纤维等多种形式的聚集体。硫磺素T（ThT）能结合淀粉样蛋白纤维的β片层，结合后荧光强度（激发波长：450 nm，发射波长：485 nm）显著增强。对照组为PBS（pH 7.4）配置浓度为100 μM的Aβ单体，实验组为100 μM的Aβ单体与不同浓度CDs（PBS溶液）的混合物，37 ℃、300 rpm聚集24 h后，使用20 μM的ThT在多功能酶标仪上读数以检测各组聚集体的形成，每个样品重复三次取平均值，每次荧光值减去空白对照孔的荧光值。

c)点杂交

将7 μL上述分组的样品滴在尼龙膜（NC膜）上，待干燥40 min后5% 脱脂奶粉封闭1小时，一抗Anti-Amyliod antibody/6E10/A11 4 ℃过夜孵育，TBST洗5 min×3次，相对应的二抗donkey anti rabbit/mouse室温孵育1.5 h，TBST洗5 min×3次，ECL显影进行图像数据采集。采用ImageJ进行图像的灰度密度分析。

d)原子力显微镜观测样品

取10 μL待测样品滴加到新剥离的云母片上，静置10 min后用超纯水冲洗以除去溶液中的盐离子。真空干燥后在原子力显微镜下用轻敲模式扫描观察并测量聚集体的高度。

e)透射电子显微镜观测样品

将待测滴于铜网上静置2分钟，滤纸吸去多余的样品，生物样品使用超纯水洗2次，2% 磷钨酸对样品进行负染色2 min，滤纸吸去多余的磷钨酸，干燥过夜即可。

分子动力学

a)系统构建

构建如下体系研究CDs对Aβ寡聚体形成的影响：对照组，未聚集Aβ原纤维单体，质心距离2 nm；实验组，在对照组模型中随机放置CDs。两组体系均加入0.15 mol/L NaCl溶液，并保持电中性。Aβ原纤维选取最新冷冻电镜解析的结构，PDB号为5OQV。

b)参数设置

采用GROMACS-4.6.6程序，并选择CHARMM27力场和TIP3P水模型。对两组体系分别进行2000步的能量最小化优化结构，并选择NPT系综进行10 ns的位置限定弛豫。v-rescale温控算法控制温度在300 K, Parrinello-Rahman算法维持压强在1 bar的标准大气压。最后对对照组和实验组分别进行五组独立的MD模拟，生成独立的轨迹，模拟时间为200 ns。在测试过程中，对所有方向进行周期性边界条件的处理，长程静电相互作用、范德华(VDW)相互作用设置1.2 nm的截断距离。

细胞实验方法

a)SH-SY5Y细胞、PC12、原代星形胶质细胞的培养

SH-SY5Y、PC12、原代星形胶质细胞（细胞分离步骤与分离神经元细胞类似）培养于含10％FBS的DMEM的完全培养基中，在37℃、饱和湿度、5% CO₂条件下常规培养，每3天换液传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

b)原代神经元培养

提前一天使用浓度为0.1 mg/mL的PDL将细胞培养板或玻片包被，4 ℃过夜，次日回收PDL后用灭菌超纯水洗玻片3次，晾干备用。采用无血清神经元培养方法进行培养。取孕18天（E18）的C57WT小鼠胎鼠，CO₂处死法处死母鼠，在预冷的DPBS解剖液下取出胎鼠，取出整脑、去除脑膜，去掉海马以及中脑部分只剩下皮层。分离出大脑皮层组织，2.5 % 胰酶37℃消化15 min，每5 min摇一次。用含10% FBS的DMEM完全培养基终止消化，必要时使用DNase酶处理细胞，用吸管将组织吹打分离成为单细胞悬液，800 rpm×5 min离心后，弃上清，以含有2 % B27、1 % 双抗、25 μM谷氨酸、0.5 mM Glutamine的神经元培养基（Neurobasal Medium，NB）重悬细胞，使用400目细胞筛网过滤后，使用计数板计数后接种于板或者皿中。次日，以2% B27、1% 双抗、0.5 mM Glutamine的NB培养基全换液，继续培养3-4天后半量换液，取培养7天后的细胞进行后续实验。原代神经元第一天按照密度铺在24孔培养板中的粘附玻片上使其黏附生长，7天培养后待原代神经元成熟吸走培养基，使用37 ℃预热PBS洗3次，4 % PFA固定10 min，PBS洗5 min/3次，室温5% donkey serum + 0.3%Triton封闭液封闭2 h，吸走多余的封闭液，加入一抗Mouse anti-MAP2（1:1000）+ Rabbitanti-GFAP（1:800）于4 ℃冰箱过夜。次日一抗孵育结束，从冰箱取出并室温复温0.5 h，PBS洗5 min/3次，按浓度比例稀释二抗donkey anti-mouse AF488（1:400）+ donkeyantirabbit Cy3（1:400），室温孵育2 h。PBS洗5 min/3次，DAPI进行细胞核染色10 min。PBS洗5 min×3次，防猝灭封片剂进行封片倒贴在载玻片上。使用激光共聚焦采集图像分析。

c） CCK-8测定CDs的细胞毒性的实验

使用细胞相应的培养基（SH-SY5Y、PC细胞系、原代星形胶质细胞使用无血清DMEM培养基，神经元使用Neurobasal培养基）配制不同浓度的CDs水溶液与细胞在37 ℃培养箱共同孵育24 h后使用CCK8试剂盒在450 nm检测吸收光强度。每个CDs的浓度做6个重复。

d) 红细胞溶血实验

取动物新鲜血液，收集于肝素浸润过的EP管中，轻轻摇晃，800 g离心5 min，用生理盐水冲洗3次至上清液不呈红色为止。使用生理盐水将红细胞配置成 4％ 的红细胞混悬液。分装到不同EP管中，分别加入400、200、100 、50μg/mL等体积的 CDs生理盐水溶液，阳性对照组红细胞使用超纯水配置，阴性对照组使用生理盐水配置，各组混匀后置于 37 ℃金属浴300 rpm中进行震荡3 h，取200 μL溶液800 g离心5 min，酶标仪540 nm分别记录0 h和3 h的结果。如溶液变清呈红色，则表示溶血，溶血率（%）=（3 h数读- 阴性对照读数）/阳性对照。

e)CDs降低Aβ_1-42聚集体对原代神经元的细胞毒性

实验分为四组：①空白对照：NB培养基（Ctr）；②NB培养基+15 μM Aβ_1-42；③NB培养基15 μM Aβ_1-42+100 μg/mL CDs；④CDs对照组：NB培养基+100 μg/mL CDs；各组在37 ℃聚集12小时后分别用以培养神经元细胞。

f) 神经元的损伤/乳酸脱氢酶（LDH）的检测/细胞死亡率

使用DMSO溶解的单体化处理过的Aβ_1-42（5 mM），NB培养基配置成浓度15 μM的Aβ_1-42溶液，置于37 ℃ 300 rpm分别聚集3、6、12、24 h，然后分别用以培养96孔板培养中成熟的原代神经元对照组为空白的NB培养基培养。共同培养24 h后使用CCK-8试剂盒于多功能酶标仪上450 nm检测原代神经元的活性。每个时间点的聚集体分别设6个重复孔。

乳酸脱氢酶（LDH）检测

取上述各组神经元孵育24小时后的细胞培养基，进行LDH含量测定，其中每一批实验设一空细胞添加2 % Triton作为阳性对照。按照LDH试剂盒说明书操作，催化剂（A液）：染料（B液）=1: 45，分别做三次重复，每次三个副孔，实验过程避光操作，酶标仪490 nm读数。LDH释放率（%）=（各组吸光值-无细胞孔吸光度）/（阳性对照组吸光度-无细胞孔吸光度），将阳性对照组的存活率设为100%。

活细胞/死细胞检测细胞死亡率

活细胞/死细胞LIVE/DEAD试剂盒是一种快速、简便区分死细胞和活细胞的方法：利用能穿过细胞的绿色荧光染料Live-Dye染料对活细胞染色（Ex/Em = 488/518 nm），不能透过细胞膜的红色荧光染料碘化吡啶（PI）染色死细胞（Ex/Em = 488/615），直接在荧光显微镜下观察细胞死亡情况。LIVE/DEAD实验按照试剂盒说明书操作，细胞加入混合好的LIVE/DEAD试剂后在37 ℃ CO₂培养箱孵育15 min，转至在荧光显微镜下进行活细胞与死细胞的计数，其中绿色代表活细胞，红色代表死细胞，细胞死亡率%=死细胞/（活细胞+死细胞）。

细胞免疫组化方法： 7天培养后待原代神经元成熟吸走培养基，使用37 ℃预热PBS洗3次，4 % PFA固定10 min，PBS洗5 min/3次，室温5% donkey serum + 0.3% Triton封闭液封闭2 h，吸走多余的封闭液，加入一抗Mouse anti-MAP2（1:1000）+ Rabbit anti-GFAP（1:800）于4 ℃冰箱过夜。次日一抗孵育结束，从冰箱取出并室温复温0.5 h，PBS洗5min/3次，按浓度比例稀释二抗donkey anti-mouse AF488（1:400）+ donkey antirabbitCy3（1:400），室温孵育2 h。PBS洗5 min/3次，DAPI进行细胞核染色10 min。PBS洗5 min×3次，防猝灭封片剂进行封片倒贴在载玻片上。使用激光共聚焦采集图像分析。

隧道扫描电镜检测神经元

细胞培养方法与免疫荧光实验相同，吸去培养基，37 ℃ PBS洗3次，2.5%戊二醛预固定细胞4 ℃过夜。次日换2% 锇酸室温固定细胞1 h，超纯水洗5 min×3次，30%、50%、70%、80%、90%、100% 乙醇逐级脱水，每个浓度分别10 min。丁叔醇薄薄铺一层厚迅速放入冰箱冷冻20 min，样品真空干燥后即可喷金上机观察。

动物实验方法

动物饲养

SPF级APPswe/PS1（B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju）双转基因小鼠、C57BL/6购南京模式动物研究所，动物饲养于苏州大学药学院SPF动物房，饲养及动物繁育过程遵守《实验动物管理条例》，动物实验遵循实验等实验动物伦理规定。动物饲养在恒温（22 ℃±1℃）恒湿（40～70%）、光暗周期循环（12/24 h）、自由摄食及饮水的环境中。所有实验均由苏州大学动物伦理委员会审核。

动物繁育

APPswe/PS1双转基因雄性小鼠与C57BL/6WT雌性小鼠以1:2的数量进行合笼繁育，子代21天进行离乳，进行剪趾标记并进行基因型鉴定。

采用现有方法进行转基因小鼠基因型鉴定，确定老年痴呆模型的建立。

动物分组

将APPswe/PS1双转基因老年痴呆模型小鼠分为Tg阳性组（对照组，Ctr），给药组分为高剂量组2 mg/kg，中剂量组1 mg/kg，低剂量0.5 mg/kg三组。同窝来源的野生型作为正常对照组（wildtype，WT），其中Ctr组和WT组注射CDs的溶剂（即灭菌生理盐水）。APPswe/PS1双转基因老年痴呆模型小鼠在3-4月龄时Aβ表达增多，在6-7月龄时脑内形成β淀粉样蛋白沉淀，选择小鼠3月龄时开始进行每天称重，根据体重腹腔注射不同浓度的CDs溶液或生理盐水，给药持续6个月以上。然后进行后续行为学和生化实验。Morris 水迷宫行为学评估实验

a)Morris水迷宫设备及准备

直径120 cm，高度50 cm，水深40 cm，将水池分为四个象限，水池东、南、西、北壁上分别粘贴不同形状和颜色空间标记物。在第四象限中，位于圆心和池壁中点的位置上设一平台，平台直径10 cm，没于水下1 cm。水温22 ℃±1 ℃，实验期间保持平台位置、参照物不变，实验过程保持安静以免噪音干扰。加入奶粉，使水变成不透明的乳白色背景。数据采集使用上海欣软信息科技有限公司检测分析软件。

b) 水迷宫训练

一部分为定位航行学习获得性实验，另一部分为空间探测记忆实验。将上述治疗实验后的鼠进行水迷宫实验。

（1）定位航行学习获得性实验

本实验测试小鼠在水池的学习与记忆能力。实验历时5天。方法：每天每只小鼠分别随机从水池的四个象限选择入水点，每天每只小鼠共训练4次，实验人员将小鼠以手托的方式，使其面向池壁，轻轻地放入水中。自动录像系统则记录小鼠从入水开始直至寻找并且爬上平台所需的时间（四肢均爬上平台），即潜伏期(latency)。此行为需在60 s内完成，若小鼠在60 s内并没有找到平台，则需实验人员将小鼠引导至平台上，潜伏期则记为60 s。当小鼠登上平台后，让其在平台上停留30 s，用来让其以空间的物体为参照物来对平台的位置进行空间的学习和记忆。如果60 s内未能成功的找到站台，由实验人员将小鼠人工置于站台上，且同样给予30 s的休息时间。有时小鼠可能会在30 s间隔时间到达之前从站台上掉下或跳入水中继续游泳。一旦这种情况发生，则将小鼠重新放回站台，并重新计时，使时间间隔到达30 s。这样可以确保每只小鼠在每次实验后有相等的时间来观察和获取空间信息。为避免低温造成的应激反应，每次的训练完成后用加热器将小鼠的毛发烘干。

（2）空间探索实验（probe/retention trial)

空间探索实验用来测量动物通过学习后对平台的空间位置的准确记忆，即记忆的保持能力。

最后一次获得性训练结束后的第二天，撤除站台。然后任选一相同入水点将小鼠放入水中，记录小鼠在60 s内的游泳路径，记录小鼠在原站台象限的停留时间和穿越原站台次数，观察受试小鼠的空间定位能力，及在空间探索过程中的变化规律，以此作为空间记忆的检测指标。

（3）水迷宫数据处理

采用重复测量数据的双因素方差分析（two-way ANOVA with repeatedmeasures），以不同的处理组作为组间因素，连续的训练天数作为组内因素。由于探索试验只做一次，原平台跨越次数、原平台象限停留时间及四个环带游泳轨迹的比较等实验数据组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以上方法在SPSS10.0统计软件中均可处理。

（4）新物识别实验

新物体识别实验（Novel Object Recognition，NOR）是评价动物学习记忆能力的基本实验之一，它利用啮齿类动物喜欢接触和探索新奇事物的天性检测动物非空间记忆能力。通过观察并记录实验动物对新物体的嗅探次数、时间等参数可以很好的考察实验动物的事件记忆能力。实验分三步，如示意图19所示，① 适应阶段( habituation session)：将小鼠依次放入没有任何物体的测试箱中，适应实验环境1天，10 min/次。②熟悉阶段(sample session)：在距侧壁10 cm处放入两个相同物体，将小鼠以背对物体方向放入，自由探索7 min后将小鼠取出，记录小鼠物体探索时间。每天一次，连续3天。③测试阶段(testsession)：24 h后进行测试，将两个相同物体中A替换成另一物体C，即熟悉物体(B)和新奇物体(C)，记录小鼠7 min对两物体的探索时间。探索活动定义为：小鼠鼻子在≤2cm范围内直指向物体或直接接触物体时的行为，小鼠转头或坐在物体上时不被认为是对物体的探索。检测指标： 采用动物行为分析系统( SuperMaze动物行为分析软件)新物体识别实验中各物体的探索时间进行分析。物体识别辨别指数用DR(discrimination ratio)表示。DR=(N–F)/(N+F)。“N”为小鼠对新奇物体的探索时间，“F”为小鼠对熟悉物体的探索时间。DR范围为[–,1]，“–”提示小鼠完全偏向于熟悉物体，而“1”则完全偏向于新奇物体。

动物灌流取材

使用1% 戊巴比妥钠腹腔麻醉动物(1 mL/100 g体重)，待深度麻醉后固定于手术板上，打开胸腔暴露心脏，注射针于左心室插管至主动脉，剪开右心耳。使用恒流泵灌入生理盐水，待放血完毕流出液体清亮后，换4％多聚甲醛固定10 min，小鼠出现尾巴上翘为灌流成功的标准。取出全脑及其他组织，放入4％多聚甲醛进行后固定2 h，换20％蔗糖溶液中浸泡至组织块沉底，最终以30％蔗糖溶液脱水组织块沉底。组织可在30％蔗糖溶液4 ℃短暂保存。

CDs血脑屏障通透性

10周龄C57雄性小鼠腹腔注射CDs水溶液（5 mg/kg）4小时后，对照组腹腔注射生理盐水，灌流方法取脑，后固定，蔗糖脱水后，使用小鼠脑膜局对脑组织进行修快，OTC包埋组织，将冷冻切片机探头和机身调至-20 ℃，做连续冠状切片，片厚12 μm，迅速将切片贴于粘附载玻片上，-20 ℃冰箱保存备用。根据CDs的光谱性质，选用激光共聚焦显微镜405 nm激光器对脑片成像。为降低组织自发荧光的干扰，先进行对照组脑片进行激光强度调试，将激光强度调至对照组未出现阳性信号为标准，再对CDs组的脑片进行激光成像。

实施例一 碳基纳米材料（CDs）的制备

碳基纳米材料的制备方法如下：

称取1.00 g 左旋维生素C（L-Vc）并将其溶于10 mL H₂O中，超声20 min 使其充分溶解；将溶解好的Vc溶液转移到水热釜，于180 ℃反应2 h，反应结束后自然冷却至室温，接着利用沙星漏斗过滤反应液去掉不溶颗粒，然后利用500-1000 Da透析袋在水中纯化，最后得到棕红色的CDs溶液；将棕红色的CDs溶液于-80℃冰箱冰冻2 h，再用Alpha1-4LSCplusRC6冷冻干燥机于-80℃、真空度10Pa的条件下冷冻干燥48h，得到碳基纳米材料CDs。将获得的碳基纳米材料CDs加入纯水中，获得碳基纳米材料CDs水溶液。

CDs水溶液的紫外-可见吸收光谱（红色曲线）显示在243和293 nm处有两个宽的吸收峰，分别来自CDs中共轭碳环（C=C，C-C）的π-π*跃迁和CDs的多共轭键（C=O和C-O）的n-π*跃迁（图1a）。通过傅立叶变换红外（FTIR）光谱和X射线光电子能谱（XPS）证实了CDs的化学结构和元素组成。图1b是CDs的傅立叶变换红外（FTIR）光谱图，从图中可以看出该碳点含有−OH和−COOH等亲水的官能团，这些官能团使得该CDs具有良好的水溶性。从XPS全谱（图1c）中可以看出，位于284.8 、286.3和288.8 eV的三个峰分别归属于C−C，C−O和C=O。

图2显示了CDs水溶液的激发－发射图。在激发波长范围为250-600 nm的情况下，它们表现出依赖于激发的发射，表明它们的荧光过程由非均匀发射状态控制。此外，CDs水溶液的最大激发发生在372 nm（图2，红色曲线），最佳发射在461 nm（图2，黑色曲线）。

CDs的平均水合粒径大约在4.5 nm（图3 b所示），TEM和高分辨率TEM（HRTEM）图像显示在图3 a中，AFM显示其高度大约在4 nm，如图3 c所示。

图4为CDs水溶液的照片，数字浓度单位为（mg/mL），随着浓度增加，CDs水溶液呈现由浅黄到深棕色，图中CDs最高浓度为70 mg/mL。

实施例二 CDs有效抑制Aβ_1-42聚集

从图5a可以看出，与对照组相比，CDs对Aβ_1-42聚集的抑制效果呈现浓度依赖性，抑制Aβ_1-42多肽聚集的效果随浓度增加而增强。在浓度为100 µg/mL的时候抑制Aβ_1-42聚集的效果达60%，浓度为200 µg/mL的时候抑制效果大约80% 。使用特异性识别Aβ_1-42构象的抗体anti-Amyloid Fibril（mOC87，Conformation specific）和内参6E10用点杂交实验检测各组产物中成熟纤维的含量。该结果与ThT结果一致，进一步证实了Aβ_1-42纤维随CDs浓度的增加而减少。

图6显示了对照组与三种不同浓度的CDs（50/100/200 µg/mL）条件下Aβ_1-42多肽聚集24 h的AFM图像。对照组呈现典型的淀粉样长纤维结构，而在不同浓度的CDs影响下，成熟长纤维数量减少，呈现短纤维结构（黑色箭头表示）。另外，存在高度不一的寡聚体（10-20nm，蓝色箭头；6-10 nm，绿色箭头表示）。对比发现，随着浓度增加，长纤维逐渐变短，并最终消失，而寡聚体逐步出现并数量逐渐增多。相比而言，现有石墨烯为无机纳米材料，尺寸不均一，无法降解，生物相容性差，抑制性能弱且材料浓度高。

β片层结构是淀粉样纤维程度的重要标志，它能特异性结合ThT，用ThT荧光标记纤维化程度来研究聚集动力学过程。采样时间间隔前密后疏，Aβ_1-42多肽与CDs共同孵育作为实验组，等浓度Aβ_1-42多肽（于PBS溶液中）作为对照组。从图7可以看出，对照组的Aβ_1-42多肽自发聚集，大约18小时纤维含量达到最大并趋于稳定；而加入CDs后Aβ_1-42多肽Th T荧光值在长时间（48 h）都没有对照组高。另外，利用透射电子显微镜对48 h的产物进行形态学观察，与上述AFM观察结果（24 h）一致，实验组观察到大量的球形寡聚体。为了检测与CDs共同孵育后形成的寡聚体是够与正常聚集途径形成的寡聚体有所差异，使用寡聚体构象识别抗体A11检测两种寡聚体的生成情况，从图8可以看出，对照组的寡聚体能被A11抗体识别，其生成量随时间先增后减，而CDs重定向形成的寡聚体不能被A11抗体识别，说明CDs改变了其表面性质或者结构。综上，本发明的CDs有效抑制了Aβ聚集过程，重定向了Aβ_1-42多肽的聚集途径，诱导产生了“off-pathway”特殊寡聚体。

分子动力学说明CDs抑制Aβ聚集

图9显示了对照组和实验组（终浓度为200 μg/mL的作为实验组）的动力学差异。在对照体系中，分离的原纤维在138 ns左右已经出现二聚化趋势，而加入CDs的实验组在140ns左右原纤维单体仍然处于分离之中。仔细分析发现，CDs倾向结合在Aβ_1-42原纤维的轴向生长端面以及C端部分。这些结果提示CDs与原纤维的结合抑制了Aβ_1-42单体在轴向端面的结合，也同时抑制了Aβ_1-42寡聚物的形成，从分子层面揭示了CDs抑制Aβ_1-42多肽纤维生长的内在原因。该结果也是部分证实了CDs结合的寡聚体无法被A11抗体所识别。

实施例三 细胞实验

生物相容性是指材料与宿主之间的相容性。它是纳米药物研究中始终贯穿的主题，评价纳米药物/材料的生物相容性要遵循生物安全性和生物功能性两个原则，而生物安全性的最主要指标是无毒性。

图10为不同浓度的CDs与SH-SY5Y细胞、PC12细胞、原代神经元（Neuron）、星形胶质细胞共孵育24小时后的细胞存活率，由图可以看出，当CDs浓度在400 μg/mL的浓度范围的时候，各组细胞存活率在95%以上，对照组比较没有显著差异，表明400 μg/mL浓度以内的CDs对细胞没有毒性。

使用红细胞溶血实验检测不同浓度CDs对红细胞的破坏情况，如图11所示，CDs对红细胞的毒性极小，浓度400 μg/mL时溶血率仅为6.8%。

实验发现，Aβ_1-4237 ℃聚集12小时对细胞的毒性最大，这与报道出来的寡聚体比单体、原纤维等形式的毒性都大相一致。选用了LIVE/DEAD试剂盒检测了与CDs共同孵育后的Aβ寡聚体对原代神经元的毒性影响。与对照组（Ctr，NB培养基）相比，Aβ寡聚体作用原代神经元24小时后导致神经元的死亡，细胞死亡率大约为60%。而与CDs共同孵育后细胞死亡率约为38%。而单纯100 μg/mL 的CDs作用于神经元对原代神经元没有毒性作用。同时，四组实验细胞培养基的乳酸脱氢酶的释放率（图12c）与各组细胞死亡率呈一致的趋势。

使用细胞免疫荧光法对各组神经元细胞进行形态标记（图13）。在共聚焦显微镜下观察可以看到，对照组细胞形态完整，轴突树突分布正常。而Aβ_1-42导致细胞形态破坏，神经元轴突丢失。加入CDs后，轴突长度与分枝数目比明显比Aβ_1-42组多，说明CDs显著降低了Aβ_1-42聚集体对神经元的损伤。另外，只加入CDs，细胞形态完整性、荧光强度接近于对照组，与CCK8测的材料毒性数据相一致，说明该浓度材料对神经元没有明显毒性。同时，为了得到放大倍数更高的立体3D图，对各组细胞进行了SEM扫描（图14），结果与共聚焦类似。

实施例四 动物实验

根据现有常规方法，裂解小鼠组织后用强碱法提取DNA，用APP、PS1基因进行扩增结果如图15，筛选双阳性小鼠，同窝阴性小鼠分笼作为WT对照。

动物给药6个月后，根据所记录每天给药称重记录做了体重变化曲线图，从图16中可以看出，动物体重在整个长期给药过程没有表现出大幅度降低，这提示CDs生物安全性高，对个体毒性小。

CDs 改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力

AD是一种慢性神经退行性疾病，发病漫长，选择在给以CDs处理6个月后，也就是在转基因小鼠9个月龄的时候进行水迷宫和新物体识别检测实验。

Morris水迷宫实验结果

（a）Morris水迷宫检测航空定位能力

检测各组小鼠在 Morris 水迷宫测试实验中寻找到平台并爬上平台的潜伏期。测试的前 5 天，各组小鼠的逃避潜伏期都表现为整体缩短趋势。在第五天的时候，CDs中高剂量（1、2 mg/kg）组与对照组相比，逃避潜伏期明显缩短，具有统计学意义（P <0.05），中剂量组效果要比高剂量组的效果好；低剂量组（0.5 mg/kg）与对照组相比相别差别没有统计学意义（P＞0.05）这说明CDs说明中高剂量组CDs都可以提高大鼠的学习能力（见表1，图17）。

表1 CDs对AD小鼠逃避潜伏期的影响（Mean±SEM,n=3）

（b）Morris水迷宫检测空间探索能力

在水迷宫实验第6 天，撤掉平台，检测各组小鼠在60 s内经过原平台（第四象限）所在象限次数、有效区停留时间，实验结果如下（图18），各组小鼠停留时间分别是：Ctr组（6.88±4.48 s），WT组（19.21±8.13 s），高剂量组（18.70±2.46 s），中剂量组（22.08±4.88 s），低剂量组（19.99±15.85 s）。这说明CDs能一定程度上提高小鼠空间记忆能力（*P＜0.05与对照组相比）。

（c）新事物探索能力

为了进一步验证CDs对认知能力的改善作用，对各组小鼠做了新事物识别行为学实验，实验分三步，如示意图19所示。新事物识别行为学是基于实验动物喜新厌旧的天性而设计的，不依赖于空间提示。通过观察并记录实验动物对新物体的嗅探次数、时间等参数可以很好的考察实验动物的事件记忆能力。

结果显示（图20、表2）：WT组的平均辨别指数为77.1%，Ctr组的平均辨别指数为14.8%，2 mg/kg给药组为71.4%，1 mg/kg给药组为60.9%，0.5 mg/kg给药组为12.8%。组间比较进行独立样本t检验， Ctr组相比，2 mg/kg与1mg/kg给药组所得P值分别为0.023和0.014，具有统计学意义；而0.5mg/kg给药组所得P值为0.090，不具有统计学意义。故可以认为2 mg/kg与1 mg/kg给药能够改善AD鼠的事件记忆能力。

表2 CDs对AD小鼠新物识别指数的影响(Mean±SEM，n=3)

血脑屏障（Blood brain barrie，BBB），是在脑和脊髓内的毛细血管与神经组织之间存在的一个调节界面，具有严格调控机制以维持中枢神经系统稳定性，主要是由内皮细胞、周皮细胞、星形胶质细胞和基底膜组成。同周围毛细血管相比，脑部毛细血管缺少一般毛细血管所具有的孔，被具有低速率胞饮作用的血管内皮细胞覆盖，从而形成了一个更紧密的结构。BBB的特征是在脑微血管内皮细胞之间存在紧密连接（TJs）。TJs 是连接复合体的重要成分，由跨膜蛋白（如claudins）组成，与微环境调节、细胞增殖的调控相关。星形胶质细胞的血管周足将 BBB中的内皮细胞包围起来，为它们提供生长因子等生化支持。周细胞和基底膜可以维持BBB的稳定性。BBB是保护大脑免受有害血源性物质和微生物伤害的屏障。然而，它同时也阻碍了药物进入脑部而使其无法发挥作用。药物分子必须穿越一系列膜才得以进入脑部，虽然有许多药物在体外的治疗表现出令人满意的功效，但如何使它们穿透血脑屏障进入中枢神经系统仍是一大挑战。BBB具有调节和控制外周血与脑间物质交换的功能，约98％的小分子药物和几乎所有大分子药物都被BBB所阻隔，无法进入大脑。因此，开发小分子药物对中枢神经系统疾病进行无创诊断和治疗的成功率变得微乎其微。

CDs穿透血脑屏障及组织分布

为确认CDs穿透血脑屏障，本发明对实验组转基因小鼠脑组织进行切片观察。CDs可以在紫外光的激发下产生荧光，结合激光以及荧光成像方法，在脑部发现了CDs，参见图21；采用¹³C同位素对CDs标记，进一步确认CDs的血脑屏障穿透性、组织分布、血液循环的效果。

实施例五

称取1.00 g 左旋维生素C（L-Vc）并将其溶于10 mL H₂O中，超声20 min 使其充分溶解；将溶解好的Vc溶液转移到水热釜，于180 ℃反应2 h，反应结束后自然冷却至室温，接着利用沙星漏斗过滤反应液去掉不溶颗粒，然后利用500-1000 Da透析袋在水中纯化，最后得到棕红色的CDs溶液；将棕红色的CDs溶液于-50℃冰箱冰冻2 h，再用Alpha1-4LSCplusRC6冷冻干燥机于-50℃、真空度10Pa的条件下冷冻干燥48h，得到碳基纳米材料CDs。将获得的碳基纳米材料CDs加入纯水中，获得碳基纳米材料CDs水溶液。根据前文的测试方法，检测了上述CDs抑制抑制 Aβ_1-42聚集的效果，发现冷冻工艺对碳基纳米材料的效果产生影响，说明不同程度冷冻干燥对碳基纳米材料的形成、性能有影响，本实施例CDs浓度为200 µg/mL时对Aβ_1-42聚集的抑制效果约68%，对SH-SY5Y细胞、PC12、原代胶质细胞、神经元细胞几乎没有毒性。图22显示了上述CDs作用于Aβ_1-42多肽聚集24 h的AFM图像。对照组（PBS）呈现典型的淀粉样长纤维结构，而在上述CDs影响下，成熟长纤维数量减少，呈现短纤维结构，但是与图6对比发现，上述CDs的抑制效果逊于实施例一的CDs。

对比例一

将实施例一的左旋维生素C更换为柠檬酸，同样的方法，也可以制备出水溶性碳材料，最大溶解度为65mg/mL，粒径为7.5nm左右，根据前文的测试方法，该水溶性碳材料对SH-SY5Y细胞、PC12、原代胶质细胞、神经元细胞也几乎没有毒性；浓度为200 µg/mL时，该碳材料对Aβ_1-42聚集的抑制效果约30%，效果不好，图23显示了该对比碳材料（200 µg/mL）作用于Aβ_1-42多肽聚集24 h的点杂交结果，上述碳材料的抑制效果远差于实施例一的CDs。

综上，纳米粒子表面的电荷、配体能、Aβ多肽结合的能力都是影响Aβ聚集的关键因素。例如，溶解酵素淀粉样蛋白形成的聚集体可被谷胱甘肽（GSH）所修饰的纳米金破坏，而单独的GSH并没有这种作用；现有碳纳米材料存在水溶性差的缺点，阻碍了它们在生物医学和纳米医学中的应用。本发明研发了具有低成本、尺寸极小、水溶性好，生物相容性高、可降解，效果好等优势的碳基纳米材料（CDs），应用到抗AD的药物制备，分子动力学发现CDs通过与原纤维表面相结合，抑制Aβ多肽的生长以及寡聚体的形成，细胞实验和动物实验发现，CDs能够缓解Aβ寡聚体对神经元的毒性并降低对突触的损害，能够改善AD模型小鼠（APP/PS1）的学习记忆能力，尤其是可以穿透血脑屏障，在脑部发现了CDs。

Claims (3)

1.一种碳基纳米材料在制备Aβ多肽聚集抑制剂中的应用或者在制备治疗或者缓解AD的药物中的应用，其特征在于，将左旋维生素C溶液经过加热反应后自然冷却至室温，再过滤；然后将滤液透析后冷冻干燥，制备碳基纳米材料；左旋维生素C溶液的浓度为0.1g/mL；加热反应的温度为180℃，时间为2 h；冷冻干燥为-80 ℃冰冻2 h，然后在-80℃、真空度10Pa的条件下冷冻干燥48h。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用500～1000 Da的透析袋在水中透析。

3.根据权利要求1所述的应用，所述药物为碳基纳米材料水溶液；碳基纳米材料水溶液中，碳基纳米材料的浓度为0.01～1mg/mL。

Images