CN110179822B - 改性内嵌金属富勒烯及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了改性内嵌金属富勒烯及其制备方法与应用。改性内嵌金属富勒烯具有抑制Aβ多肽（b‑淀粉样多肽）纤维化及破坏成熟淀粉样纤维的能力，并显示出良好的生物相容性。通过分子动力学模拟发现其与Aβ多肽通过氢键相互作用抑制了β片层形成，降低了Aβ多肽形成淀粉样纤维的能力；能够有效抑制Aβ多肽纤维化，并在细胞显示出具有潜在治疗阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD）的作用。

Description

改性内嵌金属富勒烯及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及改性内嵌金属富勒烯及其制备方法与应用，能够有效抑制Aβ多肽纤维化，并在细胞显示出具有潜在治疗阿尔茨海默症（Alzheimer’sDisease, AD；又称为老年性痴呆症）的效果。

背景技术

AD是一种神经退行性疾病，严重危害患者的健康，给其家庭、社会带来沉重负担。该病典型的病理特征是β淀粉样多肽（Amyloid beta Peptides, Aβ）异常聚集形成的淀粉样斑块以及细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结，并伴随神经元的丢失及死亡。目前关于阿尔茨海默症的发病机制仍不清楚，在AD的各种发病机制假说中，最被认可的、研究体系最成熟的是淀粉样蛋白级联假说（Honig L S, Mayeux R. Natural history ofAlzheimer's disease. Aging (Milano), 2001, 13(3): 171-182）。该假说认为Aβ多肽纤维化是导致AD患者神经退化的主导因素，因此抑制Aβ多肽纤维化与聚集是当前AD防治的焦点和热点。随着纳米科学技术的发展，碳基纳米材料以其优异的物理化学性质在纳米医药领域展现出巨大的应用前景，它在各种神经退行性疾病中都展示出了潜在医用价值；但是获得水溶性好、生物相容性好、能够有效抑制Aβ多肽聚集，并能够在细胞、动物水平有效缓解神经毒性的碳基纳米材料仍然是该领域的一大挑战。

发明内容

本发明公开了改性内嵌金属富勒烯及其制备方法与应用，解决了现有碳基纳米材料生物相容性较差的问题，能够有效抑制Aβ多肽聚集，并在细胞显示出具有潜在治疗效果。

本发明采用如下技术方案：

改性内嵌金属富勒烯，其制备方法包括以下步骤，将内嵌金属富勒烯J@C_n、氨水和双氧水的混合物搅拌反应后去除未反应的原料，得到改性内嵌金属富勒烯，记为f-J@C_n。

本发明中，反应的时间为8～12小时，温度为40～90℃，优选50～60℃；反应结束后，采用过滤法去除未反应的原料；优选的，反应结束后，使用滤膜过滤，滤渣为未反应的原料，滤液为含有改性内嵌金属富勒烯的水溶液，更优选使用0.22微米滤膜过滤；进一步优选的，将滤液浓缩、醇洗、离心、复溶、透析、干燥，最终得到产物改性内嵌金属富勒烯。

本发明中，J@C_n为原料，属于现有技术，可市购，其中J表示内嵌的金属，比如Y、Ce、Pr、Gd，C_n表示富勒烯，n为60～100，优选70～82；J@C_n、双氧水、氨水的用量比例为3～8mg∶6mL∶4 mL；双氧水的质量浓度为25%～35%；氨水的质量浓度为15%～20%；搅拌反应的转速为1000 r/min～1500 r/min；透析5～7天，可得内嵌富勒烯衍生物的溶液；干燥为冷冻干燥，优选-80℃、真空度10 Pa的条件下冷冻干燥30 h。

本发明制备改性内嵌金属富勒烯可以具体为，取5 mg 购买的Gd@C₈₂原料加入6mL双氧水（30 wt%）和4 mL氨水（18 wt%）混合均匀，在55 ℃下1200 r/min搅拌大约10 h，反应过程中，溶液由黑色悬浊液逐步转变成褐色溶液，并有少量不溶物，使用0.22微米滤膜过滤，将所得的澄清褐色溶液减压蒸馏浓缩至1 mL；再加入20 mL乙醇，将反应产物析出，然后离心处理，得到固体产物；再将固体产物溶于去离子水中，再经过透析（去离子水中透析（3500截留分子量））、冷冻干燥（-80 ℃、真空度10Pa的条件下冷冻干燥30 h），得到改性内嵌金属富勒烯，记为f-Gd@C₈₂；超纯水重溶，4 ℃保存。本发明透析后的改性内嵌金属富勒烯f-Gd@C₈₂水溶液可以直接用于制备Aβ多肽纤维化抑制剂或者抑制Aβ多肽聚集，也可以将改性内嵌金属富勒烯f-Gd@C₈₂水溶液冷冻干燥，得到改性内嵌金属富勒烯f-Gd@C₈₂粉体，再次复溶后使用。

本发明公开了上述改性内嵌金属富勒烯在制备Aβ多肽纤维化抑制药物或者在抑制Aβ多肽纤维化中的应用。或者上述改性内嵌金属富勒烯在制备治疗AD药物中的应用。

本发明还公开了抑制Aβ多肽纤维化的药物或者治疗AD的药物，包括上述改性内嵌金属富勒烯。治疗包括其通常被接受的含义，比如阻止、预防、抑制、改善以及减缓、停止逆转所产生症状或预期病变的发展，本发明涵盖治疗性和预防性的施用。

本发明的药物还可以包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种，药物形式可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分改性内嵌金属富勒烯制备成药物或药物组合物，可采用本领域普通技术人员公知的方法来制备，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体（生理盐水、缓冲液等）混合，用载体稀释或者包封在载体中；适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些物质可以举例为乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。本发明的药物还可以包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。

优选的，本发明的药物为液体，进一步优选的，液体药物中，改性内嵌金属富勒烯的浓度为0.01～1.5mg/mL，优选0.1～1mg/mL。

为解决阿尔茨海默症带来的巨大的家庭与社会负担，世界各大制药公司（如Biogen、EliLilly、Merck、Roche、Novartis等）均投入巨大人力和财力用以药物开发。目前只有五种被美国国家食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）和欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）批准的用于AD治疗的药物：分别是多奈哌齐（Donepezil）、加兰他敏（Galanthamine）、卡巴拉汀（Rivastigmine）、他克林（Tacrine）和美金刚（Menantine Hydrochloride）。前四种是乙酰胆碱脂酶抑制剂，通过抑制乙酰胆碱脂酶的活性从而减少神经递质乙酰胆碱的水解，但此类药物仅适用于轻度阿尔茨海默症，其中他克林由于肝毒性较大，已逐渐减少使用；美金刚是NMDA受体（N-methyl-D-aspartic acidreceptor，NMDAR)拮抗剂，它主要通过降低谷氨酸过度刺激神经元造成的兴奋性毒性，适用于中重度阿尔茨海默症。AD治疗药物研发具有很大挑战性，一方面是因为AD的成因和机制尚不清楚。另一方面是因为血脑屏障的存在，降低了药物在脑内的有效浓度；并且AD发病早期难以诊断，确诊时神经元已发生不可逆损伤，药物难以发挥功效。现有小分子药物一般具有良好的水溶性，所以在成药性能和药物代谢动力学方面有着很大优势，但是合成环境要求苛刻、副产物多、定点修饰难。本发明合成的f-Gd@C₈₂合成方便，具有易修饰等特点，抑制了Aβ_1-42多肽之间形成β片层，最终抑制了纤维化的发生。另外f-Gd@C₈₂还具有破坏成熟淀粉样纤维的能力。细胞实验表明f-Gd@C₈₂在一定剂量范围内生物相容性良好，可以减弱Aβ_1-42多肽聚集产生的细胞毒性。

附图说明

图1为f-Gd@C₈₂冻干粉X射线光电子能谱分析；

图2为f-Gd@C₈₂的电镜图（a）和粒径分布图（b）；

图3为f-Gd@C₈₂（黑色线）和Gd@C₈₂（红色线）红外吸收光谱；

图4为f-Gd@C₈₂减少Aβ_1-42纤维的形成，a为硫磺素T荧光实验检测β片层的含量，β纤维构象特异性抗体点杂交实验；

图5为f-Gd@C₈₂改变Aβ_1-42聚集体的二级结构；

图6为f-Gd@C₈₂与Aβ_1-42共同孵育产物TEM图；

图7为Th T检测f-Gd@C₈₂对成熟纤维的破坏作用；

图8为f-Gd@C₈₂破坏已形成的Aβ_1-42纤维；

图9为原代细胞纯度鉴定（绿色：MAP2;红色：GFAP;蓝色:DAPI），a为细胞免疫荧光实验，b为原代神经元纯度的统计图；

图10为f-Gd@C₈₂降低Aβ _1-42多肽聚集体的神经毒性，a.LIVE/DEAD实验（对活细胞与死细胞进行染色，绿色的是活细胞，红色的是死细胞），b为CCK8实验检测f-Gd@C₈₂对神经元的细胞毒性，c为细胞死亡率的统计图，d为乳酸脱氢酶实验，e为各组细胞进行形态学观察SEM图；

图11为Gd@C₈₂、f-Gd@C₈₂与g-Gd@C₈₂的水溶液照片；

图12为f-Gd@C₈₂与Aβ_1-42共同孵育产物TEM图；

图13为g-Gd@C₈₂作用下形成的Aβ_1-42纤维。

具体实施方式

本发明改性内嵌金属富勒烯的制备方法如下，将内嵌金属富勒烯J@C_n、氨水和双氧水的混合物搅拌反应后过滤，去除未反应的原料，将滤液浓缩后加入乙醇将反应产物改性内嵌金属富勒烯析出，再离心处理（12000 rpm），得到固体产物，再次将固体产物溶于去离子水中，透析得到改性内嵌金属富勒烯水溶液，冷冻干燥后得到改性内嵌金属富勒烯，记为f-J@C_n。

本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本发明教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

材料表征

a) X射线光电子能谱分析

取f-Gd@C₈₂溶液，放于 -80 ℃冰箱冰冻2 h，用Alpha1-4LSCplus RC6冷冻干燥机冷冻干燥48 h后取出粉末。然后取出少量的粉末样品进行上机检测。

b)样品制备及拍照

f-Gd@C₈₂溶液稀释到成不同浓度梯度，提前用镊子夹取铜网至于吸水滤纸上，各取5 μL溶液滴于铜网上，放阴凉处自然风干。样品干燥后用FEI Tecnai G20电子显微镜进行拍摄并选取图片。

c)红外光谱测定

将上述f-Gd@C₈₂冻干粉，适量样品在红外光谱仪上进行上机检测。

d)粒径的测量

取1 mL f-Gd@C₈₂水溶液，于粒径仪测量其水合粒径的大小。

实施例一 f-Gd@C₈₂的制备

取5 mg 购买的Gd@C₈₂原料加入6 mL双氧水（30wt%）和4 mL氨水（18 wt%）混合均匀，在55 ℃下1200 r/min搅拌10 h，反应过程中，溶液由黑色悬浊液逐步转变成褐色溶液，并有少量不溶物，使用0.22 微米滤膜过滤，将所得的澄清褐色溶液减压蒸馏浓缩至1 mL；再加入20 mL乙醇，将反应产物析出，然后12000 rpm离心处理，得到固体产物；再将固体产物溶于去离子水中，再经过透析（去离子水中透析（3500截留分子量））、冷冻干燥（-80 ℃、真空度10 Pa的条件下冷冻干燥30h），得到改性内嵌金属富勒烯，记为f-Gd@C₈₂；超纯水重溶，4 ℃保存。

f-Gd@C82的X射线光电子能谱分析见图1，从图1a可以确定碳元素以3种不同的形式存在，其中结合能284.61 eV对应的是碳笼上的C-C和C=C等无氧碳，286.37 eV处对应的是C-O,C-N等于羟基和氨基相连的碳，而288.55 eV则对应于C=O等与羰基相连的碳。通过拟合计算，这三类碳原子对应的相对峰面积分别为58.95% ，25.29% 和15.76%。另外对于N的分峰，从图1 b可以确定N元素以3中不同的形式存在，其中结合能399.52 eV对应的是-NH₂，401.42 eV处对应的是 -NH₃ ⁺，而406.51 eV则对应于-NO₂。

图2a为f-Gd@C₈₂纳米材料电镜图，图2b为根据图2a所统计的f-Gd@C₈₂的粒径分布图，从图可以看出，f-Gd@C₈₂的平均粒径在110 nm左右。

通过对Gd@C₈₂和f-Gd@C₈₂产物进行红外光谱分析对比，可以发现谱图中新特征官能团的出现，进一步证明反应的进行成功。如图3所示，3400cm^-1对应的O-H峰，3170cm^-1对应的N-H和1750 cm^-1对应的C=O峰表明Gd@C₈₂的成功改性。

实施例二 f-Gd@C₈₂体外抑制Aβ聚集

a)Aβ_1-42单体化

六氟异丙醇（1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol，HFIP）能破坏蛋白质之间形成的氢键，将HFIP在冰上预冷，将1 mg的合成肽Aβ_1-42溶解到冷却的222 μL的HFIP中（1mM），超声10 min，室温孵育60 min，使蛋白充分单体化。开盖于通风橱至HFIP挥发干净，-80℃冰箱保存。

b)硫磺素T检测Aβ_1-42多肽聚集

取出-80 ℃冰箱保存的Aβ_1-42肽膜，加入MDSO重溶肽膜使其浓度为5 mM。使用PBS溶液（pH = 7.4）将Aβ_1-42-DMSO混合物稀释至100 μM，16 000g × 10 min离心取上清以去除预形成的纤维，单体在37 ℃、300 rpm条件环境下能自发聚集成寡聚体、原纤维、纤维等多种形式的聚集体。

硫磺素T（ThT）能结合淀粉样蛋白纤维的β片层，结合后荧光强度（激发波长：450nm，发射波长：485 nm）显著增强。对照组为PBS（pH 7.4）配置浓度为100 μM的Aβ单体，实验组为100 μM的Aβ单体与不同浓度f-Gd@C₈₂的混合物，37 ℃、300 rpm聚集后，使用20 μM的ThT在多功能酶标仪上读数以检测各组聚集体的形成，每个样品重复三次取平均值，每次荧光值减去空白对照孔的荧光值。

Aβ_1-42在一定pH值、温度、离子浓度等合适条件下能自发聚集成不同形式的原纤维、寡聚体、纤维。在聚集过程中，从无序的α螺旋转变成高度有序的β片层。使用ThT荧光实验评估了各组Aβ_1-42多肽的聚集程度。

图5所示，对于聚集成型的纤维来说结构稳定，对照组的荧光值稳定不变，而加入不同浓度f-Gd@C₈₂的组别荧光值比初始荧光值下降。说明f-Gd@C₈₂不但能够抑制Aβ_1-42多肽形成纤维，而且对成熟纤维具有破坏作用。

c)点杂交

将7 μL上述分组的样品滴在尼龙膜（NC膜）上，待干燥40 min后5% 脱脂奶粉封闭1小时，一抗Anti-Amyliod antibody/6E10/A11 4 ℃过夜孵育，TBST洗5 min×3次，相对应的二抗donkey anti rabbit/mouse室温孵育1.5 h，TBST洗5 min×3次，ECL显影进行图像数据采集。采用ImageJ进行图像的灰度密度分析。使用特异性识别Aβ_1-42构象的Anti-Amyloid Fibrils抗体对各组样品进行点杂交实验，与ThT结果相似，Aβ_1-42纤维化程度随f-Gd@C₈₂浓度的增加而减少。

d)透射电子显微镜观测样品

将f-Gd@C₈₂共同孵育后的Aβ_1-42聚集体样品滴于铜网上静置2分钟，滤纸吸去多余的样品，生物样品使用超纯水洗2次，2% 磷钨酸对样品进行负染色2 min，滤纸吸去多余的磷钨酸，干燥过夜即可。使用透射电子显微镜（TEM）观察与f-Gd@C₈₂共同孵育后的Aβ_1-42聚集体样品的形貌。如图6所示，在1×PBS（pH 7.4），37 ℃、300 rpm条件下Aβ_1-42（50 μM，对照组，Ctr）多肽聚集成典型的纤维结构。加入f-Gd@C₈₂（200 μg/mL）之后Aβ_1-42多肽无法形成长纤维，形成的聚集体的长度更短、密集度更低，视野范围内呈现分散状态。

e)圆二色谱分析（circular dichroism spectroscopy，CDs）测定二级结构变化

Aβ_1-42（100 μM）与f-Gd@C₈₂材料（400 μg/mL）混合，对照组使用等量PBS进行聚集，37 ℃，300 rpm摇晃24小时后，使用在J-815分光偏振计测量材料组与空白对照组Aβ_1-42聚集体二级结构的变化，使用聚集0 h Aβ_1-42单体（短暂保存于冰上）作为α螺旋或无规则卷曲的阳性对照。CD光谱扫描波长为200 nm-260 nm，谱宽2 nm，扫描速度50 nm/min，响应时间1s，测定温度为常温，扣除等浓度材料信号背景。每个样品测6次取平均值，最后对曲线进行拟合。采用圆二色谱仪进一步研究f-Gd@C₈₂所诱导的Aβ_1-42多肽聚集体二级结构的变化。图7显示Aβ_1-42多肽（0 h）溶液未聚集的CD谱扫描曲线200-220 nm出现负峰（黑色实线，无规则卷曲或a螺旋），而37 ℃聚集24小时Aβ_1-42多肽发生了结构变化，即呈现典型的β-片层结构（红色实线，在220 nm处有一负峰，在200-210 nm处有一强的正峰）。当Aβ_1-42单体加入f-Gd@C₈₂（400 μg/mL）共同孵育后，这些峰值消失，说明Aβ_1-42多肽无法形成具有β片层的纤维（蓝色实线）。

f)原子力显微镜观测样品

取10 μL待测样品滴加到新剥离的云母片上，静置10 min后用超纯水冲洗以除去溶液中的盐离子。真空干燥后在原子力显微镜下用轻敲模式扫描观察并测量聚集体的高度。AFM观察Aβ_1-42成熟淀粉样纤维与f-Gd@C₈₂（400 μg/mL）共同孵育24 h后产物的形貌变化发现，对照组中多肽保持几百纳米的清晰纤维结构不变。而与f-Gd@C₈₂共同孵育的样品，AFM视野范围内出现大量点状聚集体和短纤维，见图8，这表明f-Gd@C₈₂有良好的破坏成熟淀粉样纤维作用，这与荧光实验的结果一致。

2.4 f-Gd@C₈₂对神经元影响

a) 原代神经元培养方法

提前一天使用浓度为0.1 mg/mL的PDL将细胞培养板或玻片包被，4 ℃过夜，次日回收PDL后用灭菌超纯水洗玻片3次，晾干备用。

本实验采用无血清神经元培养方法进行培养。取孕18天（E18）的C57WT小鼠胎鼠，CO₂处死法处死母鼠，在预冷的DPBS解剖液下取出胎鼠，取出整脑、去除脑膜，去掉海马以及中脑部分只剩下皮层。分离出大脑皮层组织，2.5 % 胰酶37 ℃消化15 min，每5 min摇一次。用含10% FBS的DMEM完全培养基终止消化，必要时使用DNase酶处理细胞，用吸管将组织吹打分离成为单细胞悬液，800 rpm×5 min离心后，弃上清，以含有2 % B27、1 % 双抗、25μM谷氨酸、0.5 mM Glutamine的神经元培养基（Neurobasal Medium，NB）重悬细胞，使用400目细胞筛网过滤后，使用计数板计数后接种于板或者皿中。次日，以2% B27、1% 双抗、0.5mM Glutamine的NB培养基全换液，继续培养3-4天后半量换液，取培养7天后的细胞进行后续实验。

b)小鼠原代神经元细胞纯度鉴定

原代神经元第一天按照5×10⁴密度铺在24孔培养板中的粘附玻片上使其黏附生长，7天培养后待原代神经元成熟吸走培养基，使用37 ℃预热PBS洗3次，4 % PFA固定10min，PBS洗5 min/3次，室温5% donkey serum + 0.3% Triton封闭液封闭2 h，吸走多余的封闭液，加入一抗Mouse anti-MAP2（1:1000）+ Rabbit anti-GFAP（1:800）于4 ℃冰箱过夜。次日一抗孵育结束，从冰箱取出并室温复温0.5 h，PBS洗5 min/3次，按浓度比例稀释二抗donkey anti-mouse AF488（1:400）+ donkey antirabbit Cy3（1:400），室温孵育2 h。PBS洗5 min/3次，DAPI进行细胞核染色10 min。PBS洗5 min×3次，防猝灭封片剂进行封片倒贴在载玻片上。使用激光共聚焦采集图像分析。采用了免疫细胞荧光双标法对原代培养的细胞进行纯度鉴定。用无血清神经元培养法所得神经元（绿色，MAP2标记）纯度大约在78.67% ,星形胶质细胞（红色，GFAP标记）占17.95% ，参见图9。

c)f-Gd@C82降低Aβ_1-42聚集体对原代神经元的细胞毒性

实验分为四组：①空白对照：NB培养基；②Aβ₁-42组：NB培养基 + Aβ_1-42；③实验组：NB培养基 + Aβ_1-42 + f-Gd@C₈₂；④f-Gd@C82对照组：NB培养基 + f-Gd@C82；采用CCK8的方法检测f-Gd@C₈₂对原代神经元的毒性作用。

d)Aβ_1-42寡聚体细胞毒性模型的建立

使用DMSO溶解的单体化处理过的Aβ_1-42（5 mM），NB培养基配置成浓度15 μM的Aβ_1-42溶液，置于37 ℃ 300 rpm分别聚集3、6、12、24 h，然后分别用以培养96孔板培养中成熟的原代神经元对照组为空白的NB培养基培养。共同培养24 h后使用CCK-8试剂盒于多功能酶标仪上450 nm检测原代神经元的活性。每个时间点的聚集体分别设6个重复孔。

e)乳酸脱氢酶（LDH）检测

取上述各组神经元孵育24小时后的细胞培养基，进行LDH含量测定，其中每一批实验设一空细胞添加2 % Triton作为阳性对照。按照LDH试剂盒说明书操作，催化剂（A液）：染料（B液）=1: 45，分别做三次重复，每次三个副孔，实验过程避光操作，酶标仪490 nm读数。LDH释放率（%）=（各组吸光值-无细胞孔吸光度）/（阳性对照组吸光度-无细胞孔吸光度），将阳性对照组的存活率设为100%。

f)LIVE/DEAD检测细胞死亡率

LIVE/DEAD试剂盒是一种快速、简便区分死细胞和活细胞的方法：利用能穿过细胞的绿色荧光染料Live-Dye染料对活细胞染色（Ex/Em = 488/518 nm），不能透过细胞膜的红色荧光染料碘化吡啶（PI）染色死细胞（Ex/Em = 488/615），直接在荧光显微镜下观察细胞死亡情况。LIVE/DEAD实验按照试剂盒说明书操作，细胞加入混合好的LIVE/DEAD试剂后在37 ℃ CO₂培养箱孵育15 min，转至在荧光显微镜下进行活细胞与死细胞的计数，其中绿色代表活细胞，红色代表死细胞，细胞死亡率%=死细胞/（活细胞+死细胞）。

g)隧道扫描电镜检测神经元

细胞培养方法与免疫荧光实验相同，吸去培养基，37 ℃ PBS洗3次，2.5%戊二醛预固定细胞4 ℃过夜。次日换2% 锇酸室温固定细胞1 h，超纯水洗5 min×3次，30%、50%、70%、80%、90%、100% 乙醇逐级脱水，每个浓度分别10 min。丁叔醇薄薄铺一层厚迅速放入冰箱冷冻20 min，样品真空干燥后即可喷金上机观察。

由图10b 可以看出f-Gd@C₈₂在高达400 μg/mL的浓度没有表现出对原代神经元的毒性，提示400 μg/mL的浓度是可以安全选用的。另外，选用了LIVE/DEAD试剂盒（美国invitrogen）检测了与f-Gd@C₈₂共同孵育后的Aβ_1-42寡聚体对原代神经元的毒性是否降低。与对照组（Ctr，NB培养基）相比，Aβ_1-42聚集体作用原代神经元24小时后导致神经元的死亡，细胞死亡率约为58% （P＜0.5）。而与f-Gd@C₈₂共同孵育后所形成的寡聚体毒性降低，细胞死亡率大约为32%，与对照组没有明显差异（P＞0.5）。这说明，f-Gd@C₈₂降低了Aβ_1-42多肽聚集体的神经毒性，见图10c。使用SEM对各组细胞进行形态学观察发现：正常培养的神经元胞体完整、突触茁壮，并且细胞爬片上长满完整的突触分枝；而Aβ_1-42寡聚体共孵育24 h的神经元细胞胞体皱缩、突触严重受到损伤；f-Gd@C₈₂与Aβ_1-42共孵育得到的寡聚体毒性减弱，神经元细胞包体皱缩、突触变性等现象明显减弱，见图10d。通过细胞LIVE/DEAD实验结合形态学表征（图10a），证明了f-Gd@C₈₂具有减弱Aβ_1-42神经毒性的作用。

实施例三

取5 mg 购买的Gd@C₈₂原料加入6 mL双氧水（30wt%）和4 mL氨水（18 wt%）混合均匀，在90 ℃下1200 r/min搅拌10 h，反应过程中，溶液由黑色悬浊液逐步转变成褐色溶液，并有少量不溶物，使用0.22 微米滤膜过滤，将所得的澄清褐色溶液减压蒸馏浓缩至1 mL；再加入20 mL乙醇，将反应产物析出，然后12000 rpm离心处理，得到固体产物；再将固体产物溶于去离子水中，再经过透析（去离子水中透析（3500截留分子量））、冷冻干燥（-80 ℃、真空度10 Pa的条件下冷冻干燥30h），得到改性内嵌金属富勒烯，记为f-Gd@C₈₂；超纯水重溶，4 ℃保存。采用前文的方法，将f-Gd@C₈₂共同孵育后的Aβ_1-42聚集体样品滴于铜网上静置2分钟，滤纸吸去多余的样品，生物样品使用超纯水洗2次，2% 磷钨酸对样品进行负染色2min，滤纸吸去多余的磷钨酸，干燥过夜即可。使用透射电子显微镜（TEM）观察与f-Gd@C₈₂共同孵育后的Aβ_1-42聚集体样品的形貌。如图12所示，在1×PBS（pH 7.4），37 ℃、300 rpm条件下Aβ_1-42（50 μM，对照组，Ctr）多肽聚集成典型的纤维结构；加入f-Gd@C₈₂（400 μg/mL）之后Aβ_1-42多肽成纤维聚集体与PBS组相比，产生变化，说明f-Gd@C₈₂对Aβ_1-42多肽成纤维有抑制效果，但是比较图6发现，制备温度对于富勒烯改性有影响，高温的改性效果较差，并且与该f-Gd@C₈₂共同孵育24小时后，神经元细胞死亡率大约为40%。

对比例一

取0.01 mmol 购买的Gd@C₈₂、0.6 mmol NH₄Cl、0.6 mmol 30wt% 双氧水混合在玻璃研钵中，在室温下研磨15min，固体颜色由黑色变成棕褐黄色；然后将研磨后的体系转移到装有20mL去离子水的烧瓶中，磁力搅拌10min，反应产物完全溶解；然后用砂芯过滤装置（0.22 微米滤膜）将含有反应产物的水溶液过滤，过滤掉未反应的原料Gd@C82，并得到含有反应产物的滤液（澄清褐色溶液）；将滤液用旋转蒸发仪浓缩，再加入20 ml乙醇，将反应产物析出，离心处理（12000rpm），得到固体产物；再将固体产物溶于去离子水中，再经过透析（去离子水中透析（3500截留分子量））、冷冻干燥（-80℃、真空度10Pa的条件下冷冻干燥30h），得到内嵌金属富勒烯g-Gd@C₈₂；超纯水重溶得到g-Gd@C82水溶液，4 ℃保存。

通过对Gd@C₈₂和g-Gd@C₈₂产物进行红外光谱分析对比，也可以发现谱图中新特征官能团的出现，并且与f-Gd@C₈₂图谱存在差别。图11为Gd@C₈₂、f-Gd@C₈₂与g-Gd@C₈₂的水溶液照片，可以看出未改性的Gd@C₈₂水溶性很差，无法应用，改性后的水溶性好很多，其中本发明的f-Gd@C₈₂优于对比g-Gd@C₈₂，对于3mg/mL的浓度，本发明制备的改性富勒烯水溶液明显清亮。

AFM观察Aβ_1-42成熟淀粉样纤维与g-Gd@C₈₂（400 μg/mL）共同孵育24 h后产物的形貌变化发现，对照组中多肽保持几百纳米的清晰纤维结构不变。而与g-Gd@C₈₂共同孵育的样品，AFM视野范围内出现的纤维状态几乎没有改善，见图13，这表明g-Gd@C₈₂不具备良好的破坏成熟淀粉样纤维作用。

综上可知，Aβ_1-42多肽由于其特殊性，对修饰的碳材料反应不一，常规方法改性的内嵌金属富勒烯对其作用不佳，需要研发更多的方法以获得不同的改性富勒烯；本发明先合成f-Gd@C₈₂，证明它能抑制Aβ_1-42纤维化，通过圆二光谱实验结合分子动力学，证实f-Gd@C₈₂抑制了Aβ_1-42多肽之间形成β片层，最终抑制了纤维化的发生。另外f-Gd@C₈₂还具有破坏成熟淀粉样纤维的能力。细胞实验表明f-Gd@C₈₂在一定剂量范围内生物相容性良好，可以减弱Aβ_1-42多肽聚集产生的细胞毒性。

Claims (5)

1.改性内嵌金属富勒烯在制备Aβ多肽纤维化抑制药物中的应用，其特征在于，所述改性内嵌金属富勒烯的制备方法包括以下步骤，将内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂、氨水和双氧水的混合物搅拌反应后去除未反应的原料，得到改性内嵌金属富勒烯；反应的时间为10小时，温度为55℃；Gd@C₈₂、双氧水、氨水的用量比例为3～8mg∶6mL∶4mL；双氧水的质量浓度为25%～35%；氨水的质量浓度为15%～20%。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，搅拌反应结束后，采用过滤法去除未反应的原料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将滤液浓缩、醇洗、离心、复溶、透析、干燥，得到改性内嵌金属富勒烯。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为改性内嵌金属富勒烯水溶液；改性内嵌金属富勒烯水溶液中，改性内嵌金属富勒烯的浓度为0.01～1.5mg/mL。

5.改性内嵌金属富勒烯在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，所述改性内嵌金属富勒烯的制备方法包括以下步骤，将内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂、氨水和双氧水的混合物搅拌反应后去除未反应的原料，得到改性内嵌金属富勒烯；反应的时间为10小时，温度为55℃；Gd@C₈₂、双氧水、氨水的用量比例为3～8mg∶6mL∶4mL；双氧水的质量浓度为25%～35%；氨水的质量浓度为15%～20%。

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