CN113462722A - 通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法 - Google Patents

通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，包括：构建重组腺相关病毒；将构建好的腺相关病毒通过脑室注射方式注射小鼠右侧脑室；将AD患者脑内提取的病理性tau即AD O‑tau的分离；将分离后的AD O‑tau注射小鼠海马；结果显示rAAV9可以作为在脑组织递送基因的有效工具载体，通过病毒载体介导PP2A基因的过表达，增加tau的去磷酸化作用，从而研究tau病理发生的分子机制，明确tau病理聚集和朊样传播与tau磷酸化水平以及PP2A的关系，提示了rAAV载体介导的基因治疗的可行性，亦可有助于筛选出抑制或逆转tau病理发生发展及传播的药物，为此类疾病的治疗提供了新的策略。

Description

通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，俗称老年性痴呆，是多因素疾病，老化是其最主要的病因。AD拥有典型的病理特征：细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaque,SP)的沉积和细胞内大量的tau蛋白聚集形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)和广泛神经元退变。一直以来在AD研究领域都是以Aβ为中心，以Aβ为靶标作为药物开发的重点。遗憾的是AD一直是新药研发的重灾区，该领域临床试验失败率高达99.6％，过去20年来在该领域的研究几乎全军覆没，所以寻找新的靶点非常必要。
NFTs聚集的其数量和患者的痴呆程度呈明显的正相关，被认为是AD患者神经元纤维退化(neurofibrillary degeneration)的病理基础。而tau的异常过度磷酸化被认为是引起NFTs聚集和tau朊样传播的一个重要因素。为进一步证实tau病理发生、发展与磷酸化的关系，以及开发以tau为靶标的AD药物，我们拟过表达使tau发生去磷酸化的酶PP2A并观察tau朊样传播的变化。
PP2A，即蛋白磷酸酶2，是一种酶，在人类中由PPP2CA基因编码，是异源三聚体，由催化亚单位C，结构亚单位A和调节亚单位B组成。是丝氨酸苏氨酸磷酸化酶，调节真核细胞中大部分的磷酸化酶，对细胞内的许多通路产生影响。
重组腺相关病毒rAAV是在非致病的野生型腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)基础上改造而成的基因载体，具有免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势，被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。rAAV载体种类多样，有众多血清型，不同血清型的rAAV载体可以识别不同的细胞表面受体，表现出不同组织或细胞感染嗜亲性。
近年来，基因治疗作为全球最引人注目的新型疗法快速发展，rAAV作为基因治疗的明星载体，一直是人们广泛关注的重点。本项研究的结果显示rAAV9可以作为在脑组织递送基因的有效工具载体，通过病毒载体介导PP2A基因的过表达，增加tau的去磷酸化作用，从而研究tau病理发生的分子机制，明确tau病理聚集和朊样传播与tau磷酸化水平以及PP2A的关系，提示了rAAV载体介导的基因治疗的可行性，亦可有助于筛选出抑制或逆转tau病理发生发展及传播的药物，为此类疾病的治疗提供了新的策略。
发明内容
本发明的目的在于明确tau病理发生、发展和tau的磷酸化水平以及PP2A的关系，构建了一种重组腺相关病毒rAAV9-Ppp2ca，通过过表达PP2A，增加tau的去磷酸化，观察ADO-tau对tau朊样传播的影响。
本发明采用以下技术方案：
一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，包括以下步骤：
1)构建重组腺相关病毒：构建目的基因过表达载体，并进行包装及滴度的检测；
2)将构建好的腺相关病毒通过脑室注射方式注射小鼠右侧脑室；
3)将AD患者脑内提取的病理性tau即AD O-tau的分离；
4)将步骤3)分离后的AD O-tau注射小鼠海马；
5)组织固定与切片；
6)免疫组织化学；
7)蛋白质免疫印迹。
进一步的，步骤1)所述构建的重组腺相关病毒载体为rAAV9；所述构建目的基因过表达载体，其目的基因为Ppp2ca，载体名称为CV235，酶切位点为BamHI/AgeI。
进一步的，步骤1)所述病毒滴度的检测方法采用定量PCR法。
进一步的，所述腺相关病毒为rAAV9-Ppp2ca，病毒滴度能够达到1.67E+12vg/ml。
进一步的，步骤2)所述在小鼠脑室注射的坐标为：前囟向后0.5mm，向左/右旁开1.0mm，自硬膜向腹侧进针2.5mm；注射体积5μl，注射速度0.2μl/min，留针10min以防液体外溢。
进一步的，步骤3)所述分离的具体步骤包括：
将10％的AD脑匀浆液在4℃下，27000xg离心30min，取上清在4℃下235000xg离心45min，将沉淀Oligo-tau用生理盐水洗三次，再用生理盐水重悬，-80℃保存，得到的tau即为AD O-tau。
进一步的，步骤4)所述在小鼠海马注射的坐标为：前囟向后2.5mm，向左/右旁开2.0mm，自硬膜向腹侧进针1.8mm；注射体积2.5μl，注射速度1.25μl/min，留针3min以防液体外溢。
进一步的，步骤7)所述蛋白质免疫印迹包括以下步骤：
71)样品处理：分别取步骤4)中注射了AD O-tau的小鼠两侧海马组织，即注射病毒侧和注射病毒的对侧，在10倍体积匀浆液中4℃匀浆，按1:1加入2×Laemmli SDS样品缓冲液，沸水煮5min,用PierceTM 660nm蛋白质检测试剂盒测定蛋白浓度；
72)检测tau及其磷酸化时配制10％SDS-PAGE，相同量的蛋白上样，电压积层胶90V、分离胶110V，电泳；
73)电泳结束后采用湿转法将样品转移至PVDF膜，恒流1.0A，70min；
74)转膜结束后，将膜裁剪下干燥后再次用甲醇激活，TBS清洗一次后放入含有5％脱脂奶粉的TBS封闭30min；
75)加入含有5％脱脂奶粉和0.1％叠氮钠的TBS配置的一抗，4℃过夜；
76)TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次；加入用含有5％脱脂奶粉TBS配置的二抗，室温2h；
77)TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次，将膜置于ECL显色液中，临用前鲁米诺和过氧化氢等体积混匀，室温1min；压片、曝光、显影。
进一步的，步骤71)所述匀浆液包括：50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH为7.4；8.5％蔗糖；10mMβ-巯基乙醇；2mM乙二胺四乙酸；50mM NaF；1mM Na3VO4和蛋白酶抑制剂，以及1.0mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐，所述蛋白酶抑制剂包括10μg/ml的抑肽酶、胃酶抑素和亮抑酶肽。
有益效果
本发明的结果显示rAAV9可以作为在脑组织递送基因的有效工具载体，通过病毒载体介导PP2A基因过表达，研究tau病理发生的分子机制，明确tau病理聚集和朊样传播与tau的磷酸化水平以及PP2A的关系，提示了rAAV9载体介导的基因治疗的可行性，亦可有助于筛选出抑制或逆转tau病理发生发展及传播的药物，为此类疾病的治疗提供了新的策略。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是构建rAAV9-Ppp2ca病毒的流程图；
图2是rAAV9-Ppp2ca病毒的包装及滴度的检测流程图；
图3A载体(CV235载体，BamHI/AgeI酶切)酶切图；其中，1:10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)；2:载体酶切产物3:未酶切载体；
图3B目的基因PCR电泳图；其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp；
图3C重组质粒阳性转化子PCR电泳图；其中，1：阴性对照(ddH2O)2：阴性对照(空载自连对照组)3：阳性对照(GAPDH)4：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp 5-12:1-8号转化子；
图4A为ICV注射rAAV9-Ppp2ca的GFP荧光信号结果图；
图4B为海马注射rAAV9-Ppp2ca的GFP荧光信号结果图；
图5A是注射rAAV9-Ppp2ca病毒的GFP荧光信号结果图；
图5B是注射空载病毒的GFP荧光信号结果图；
图6是tau病理的细胞检测图；腺相关病毒载体过表达PP2A后，四组C57BL/6小鼠的海马AT8免疫荧光染色均可以看见tau在细胞内聚集；
图7是计数四组C57BL/6小鼠海马区域tau病理的细胞(AT8染色阳性细胞)；
图8特异性磷酸化抗体检测注射侧和对侧海马tau蛋白磷酸化水平(A)与统计分析(B)图(mean±SD)*,p<0.05。
具体实施方式
下面结合附图及具体实例对本发明作出进一步地详细阐述。
实施例：
一、构建rAAV9-Ppp2ca病毒
1.过表达载体构建，构建流程如图1所示：
(1)目的基因及工具载体信息
基因信息：
目的基因：Ppp2ca(HA-NM_019411-T2A-EGFP)
物种：Mouse
载体信息：
载体名称：CV235
元件顺序：hSyn promoter-MCS-SV40 PolyA
酶切位点：BamHI/AgeI
(2)目的基因片段的获取：
引物：P1:ggaggtagtggaatggatcccgccaccatgtacccttatgatgtcccagactatgctgg
P2:gttgattatcgataaccggtttacttgtacagctcgtccatgccg
PCR产物大小：1802
(3)重组质粒构建及阳性克隆测序结果分析
比对结果符合要求
ccaccgcgaggcgcgagataggggggcacgggcgcgaccatctgcgctgcggcgccggcgactcagcgctgcctcagtctgcggtgggcagcggaggagtcgtgtcgtgcctgagagcgcagtcgagaaggtaccggaattcggaactggaggtggaggtagtggaatggatcccgccaccatgtacccttatgatgtcccagactatgctggaggtggaggatcaatggacgagaagttgttcaccaaggagctggaccagtggatcgagcagctgaacgagtgcaagcagctctccgagtcccaggtcaagagcctctgcgagaaggctaaagaaatcctgacaaaagaatccaacgttcaagaggttcgatgtccagtcactgtgtgtggagatgtacatgggcaatttcatgatctcatggaactctttagaattggtggtaaatcaccagatacaaattacctgtttatgggagactatgtggacagaggatattactctgttgaaacagttacactgcttgtagctcttaaggttcgttaccgagagcgcatcaccatactccgagggaatcacgagagcagacagatcacacaggtttatgggttctacgacgagtgtttaaggaaatacggaaatgcaaatgtttggaaatacttcacagacctttttgactatcttcctctcactgccttggtggatgggcagatcttctgtctacacggtggtctgtcaccatccatagacacactggatcacatccgagcactcgatcgcctacaggaagttcctcatgagggtccaatgtgtgacttgctgtggtcagatccagatgaccgtggtggctgggggatatctcctcggggagctggttatacctttggccaagatatttctgagacatttaatcatgccaatggcctcacgttggtgtccagagctcaccagctggtgatggagggatataactggtgccatgaccggaacgtagtaacaattttcagtgctccaaactattgctatcgttgtggtaaccaagctgcaatcatggaacttgacgacactcttaagtattctttcttgcagtttgacccagcacctcgtagaggcgagccacatgtcactcgtcgtaccccagactacttcctgggcagcggcgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaccggttatcgataatcaacctctggattacaaaa。
2.rAAV9-Ppp2ca病毒的包装及滴度的检测，检测流程如图2所示；
采用病毒滴度检测方法：Real-Time PCR(定量PCR法)
AAV9-Ppp2ca：1.67E+13v.g./ml
实验步骤：
1)每一个样品准备4份90μl水，装在Ep管中。取10uL样品加入到第一份水中，混匀并命名为-1，然后从中取出10μl加入到第二份水中，命名为-2，依次类推。最后得到8个稀释度的样品，取后5份作为模板进入定量PCR；
2)每个样品取10uL加入到40μl水中，混匀并命名为-2，准备4份90μl水，装在Ep管中，然后从中取出10μl加入到90μl水中，命名为-3，依次类推。不同在于4个稀释度，取后3个进入定量PCR；
3)测算所需要的反应孔数，每个反应中2X SYBR Green Mix为10μl，上下游引物各0.5μl，Rox参比染料0.2μl，加水补充到15μl。每20个反应多准备一个反应体系，以避免试剂不足。
4)将配好的反应体系加入到96孔反应板中，每孔15μl。每个样品加入5μl，设置复孔。
5)PCR反应按照SYBR Green试剂盒说明进行；
6)得到Ct值数据后，按照标准品浓度的对数值和Ct平均值得到标准曲线。其他样品的浓度可以根据标准曲线算出；
7)待测样品浓度最终值由测定值除以稀释度并乘2得到，此处乘2是因为标准品是双链的，而AAV病毒颗粒是单链的。
8)将不同稀释度病毒测定得到的滴度加以平均，即为病毒的最终浓度。
二、脑室注射AAV病毒
四月龄的C57BL/6小鼠，腹腔注射2.5％的2-Avertin麻醉，根据小鼠脑图谱，使用脑立体定位仪、微量注射泵和31-gauge Hamilton微量注射器。将构建好的rAAV9-Ppp2ca病毒通过脑室注射(intracerebroventricularly,ICV)方式注射小鼠右侧脑室(病毒滴度3.56E+12vg/ml)坐标如下：前囟向后0.5mm，向左/右旁开1.0mm，自硬膜向腹侧进针2.5mm。注射体积5μl，注射速度0.2μl/min，留针10min以防液体外溢。
三、AD O-tau(AD患者脑内提取的病理性tau)的分离：
将10％的AD脑匀浆液在4℃下，27000xg离心30min，取上清在4℃下235000xg离心45min，将沉淀Oligo-tau用生理盐水洗三次，再用生理盐水重悬，-80℃保存，得到的tau即为AD O-tau。AD O-tau经盐析、尿素处理，透析、离子交换层析，收集磷酸化的fractions,透析，-80℃保存。这部分的tau为AD P-tau。
四、海马注射AD O-tau：
病毒注射2w后，腹腔注射2.5％的2-Avertin麻醉，海马注射AD O-tau(蛋白浓度11mg/ml，tau的量600ng/2.5ul)坐标如下：前囟向后2.5mm，向左/右旁开2.0mm，自硬膜向腹侧进针1.8mm。注射体积2.5μl，注射速度1.25μl/min，留针3min以防液体外溢。
五、组织固定与切片：
取小鼠，先经腹腔注射2.5％的2-Avertin麻醉剂，麻醉后，开胸暴露心脏，自心尖部将灌注针头经左心室插至升主动脉，灌注生理盐水后，改快速灌注含有4％多聚甲醛的0.1MPBS(pH7.2)，待动物全身抽搐后，调慢灌注速度，约50滴/min，持续时间约30min后，取出大脑放入含有4％多聚甲醛的0.1MPBS(pH7.2)中后固定4h。再先后转入含20％和30％蔗糖溶液中，待组织块下沉后，行冠状位冰冻连续切片，片厚40μm，漂于0.01M PBS中。
六、免疫组织化学
(1)挑取海马结构清晰的漂片，置于0.01M PBS缓冲液(pH7.2)中漂洗3遍后，放入含有10％triton-100液体中20min，0.01M PBS缓冲液(pH7.2)中漂洗3遍。放入含有10％山羊血清的封闭液中，在室温下振摇2h。
(2)将封闭好的切片转入到1:500稀释的小鼠抗AT8单抗中，室温下轻轻振摇1h后放入4℃冰箱中过夜。
(3)次日晨吸去一抗，用PBS清洗3遍后，加入1:500稀释的cy3荧光二抗，hochest(1:500)避光、室温下轻轻振摇2h。
(4)0.01M PBS(pH 7.2)避光清洗3次，每次10min。
(5)荧光封片液封片后激光共聚焦显微镜下观察。
七、蛋白质免疫印迹(Western blot)
(1)样品处理：海马组织在10倍体积匀浆液(50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH为7.4；8.5％蔗糖；10mMβ-巯基乙醇；2mM乙二胺四乙酸；50mM NaF；1mM Na3VO4和蛋白酶抑制剂，以及1.0mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐，所述蛋白酶抑制剂包括10μg/ml的抑肽酶、胃酶抑素和亮抑酶肽)中4℃匀浆，1:1加入2×Laemmli SDS样品缓冲液，沸水煮5min,用PierceTM 660nm蛋白质检测试剂盒测定蛋白浓度。
(2)检测tau及其磷酸化时配制10％SDS-PAGE，相同量的蛋白上样，电压积层胶90V、分离胶110V，电泳。
(3)电泳结束后采用湿转法将样品转移至PVDF(polyvinylidene fluoridemembrane)膜(用甲醇激活)，恒流1.0A，70min。
(4)转膜结束后，将膜裁剪下干燥后再次用甲醇激活，TBS清洗一次后放入含有5％脱脂奶粉的TBS封闭30min。
(5)加入含有5％脱脂奶粉和0.1％叠氮钠的TBS配置的一抗，4℃过夜。
(6)TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次；加入用含有5％脱脂奶粉TBS配置的二抗，室温2h。
(7)TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次，将膜置于ECL显色液中(临用前A、B液等体积混匀)，室温1min。压片、曝光、显影。
实验设计分为四组，每组6-7只小鼠，分别是右侧脑室注射空载对照病毒和右侧海马注射生理盐水(con-V+NS)，右侧脑室注射空载对照病毒和右侧海马注射AD O-tau(con-V+AD O-tau)，右侧脑室注射rAAV9-Ppp2ca病毒和右侧海马注射生理盐水(PP2A+NS)，以及右侧脑室注射rAAV9-Ppp2ca病毒和右侧海马注射AD O-tau(PP2A+AD O-tau)。
病毒表达21天后对大脑切片进行成像观察。
如图4所示，结果显示，图4A中通过ICV注射rAAV9-Ppp2ca小鼠右侧海马区有较强的荧光信号，并蔓延到左侧海马；而图4B中注射右侧海马的病毒荧光信号局限在海马区，并没有扩散到对侧脑室；因此我们选择侧脑室注射病毒。
rAAV9载体感染小鼠8个月后。
如图5所示，无论是注射的rAAV9-Ppp2ca病毒(A)还是空载病毒(B)都可以看到GFP荧光信号，提示了rAAV9病毒载体携带的基因在脑组织可以长期、稳定的表达。
免疫荧光结果。如图6所示，同批侧脑室注射rAAV9-Ppp2ca的C57BL/6小鼠，在注射AD O-tau 8个月之后出现不同程度的tau病理改变，与注射空载病毒的对照组相比具有显著性差异(p＜0.001)。腺相关病毒载体过表达PP2A后，四组C57BL/6小鼠的海马AT8免疫荧光染色均可以看见tau在细胞内聚集(矩形方框)。
如图7所示，计数四组C57BL/6小鼠海马区域tau病理的细胞(AT8染色阳性细胞)，统计分析表明，通过注射rAAV9-Ppp2ca，有效抑制了AD O-tau诱导的C57BL/6小鼠tau在海马区域病理聚集和传播。
在注射rAAV9-Ppp2ca后8个月的C57BL/6小鼠，可以检测出小鼠大脑tau病理改变明显低于对照组，提示通过过表达PP2A，可以增强tau的去磷酸化，减少tau的病理传播。
如图8所示，特异性磷酸化抗体检测注射侧和对侧海马tau蛋白磷酸化水平(图8A)。为了研究注射病毒rAAV9-Ppp2ca对O-tau在小鼠C57BL/6脑内tau磷酸化水平的影响，我们使用Ser202/Thr205(AT8)、Thr212、Thr217、Ser262和Ser396位点tau的磷酸化抗体分析了注射侧和对侧海马小鼠脑的tau的磷酸化水平。结果显示注射病毒rAAV9-Ppp2ca侧比注射对照病毒侧的海马AT8位点磷酸化水平降低(图8B)，同理，注射病毒rAAV9-Ppp2ca的对侧比注射对照病毒的对侧AT8位点磷酸化水平亦降低；在Thr212、Thr217、Ser262和Ser396位点磷酸化水平差异没有统计学意义，但是我们观察到注射病毒rAAV9-Ppp2ca均可以使tau的磷酸化水平有下降的趋势，说明，PP2A可能通过减少tau的磷酸化水平来降低tau的病理传播。
序列表
<110> 南通大学
<120> 通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggtagtg gaatggatcc cgccaccatg tacccttatg atgtcccaga ctatgctgg 59
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgattatc gataaccggt ttacttgtac agctcgtcca tgccg 45
<210> 3
<211> 1971
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaccgcgag gcgcgagata ggggggcacg ggcgcgacca tctgcgctgc ggcgccggcg 60
actcagcgct gcctcagtct gcggtgggca gcggaggagt cgtgtcgtgc ctgagagcgc 120
agtcgagaag gtaccggaat tcggaactgg aggtggaggt agtggaatgg atcccgccac 180
catgtaccct tatgatgtcc cagactatgc tggaggtgga ggatcaatgg acgagaagtt 240
gttcaccaag gagctggacc agtggatcga gcagctgaac gagtgcaagc agctctccga 300
gtcccaggtc aagagcctct gcgagaaggc taaagaaatc ctgacaaaag aatccaacgt 360
tcaagaggtt cgatgtccag tcactgtgtg tggagatgta catgggcaat ttcatgatct 420
catggaactc tttagaattg gtggtaaatc accagataca aattacctgt ttatgggaga 480
ctatgtggac agaggatatt actctgttga aacagttaca ctgcttgtag ctcttaaggt 540
tcgttaccga gagcgcatca ccatactccg agggaatcac gagagcagac agatcacaca 600
ggtttatggg ttctacgacg agtgtttaag gaaatacgga aatgcaaatg tttggaaata 660
cttcacagac ctttttgact atcttcctct cactgccttg gtggatgggc agatcttctg 720
tctacacggt ggtctgtcac catccataga cacactggat cacatccgag cactcgatcg 780
cctacaggaa gttcctcatg agggtccaat gtgtgacttg ctgtggtcag atccagatga 840
ccgtggtggc tgggggatat ctcctcgggg agctggttat acctttggcc aagatatttc 900
tgagacattt aatcatgcca atggcctcac gttggtgtcc agagctcacc agctggtgat 960
ggagggatat aactggtgcc atgaccggaa cgtagtaaca attttcagtg ctccaaacta 1020
ttgctatcgt tgtggtaacc aagctgcaat catggaactt gacgacactc ttaagtattc 1080
tttcttgcag tttgacccag cacctcgtag aggcgagcca catgtcactc gtcgtacccc 1140
agactacttc ctgggcagcg gcgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga 1200
ggagaatccc ggccctatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat 1260
cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga 1320
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc 1380
cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 1440
ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca 1500
ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt 1560
cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg 1620
caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc 1680
cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg 1740
cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 1800
gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 1860
gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 1920
cgagctgtac aagtaaaccg gttatcgata atcaacctct ggattacaaa a 1971

Claims (9)

1.一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建重组腺相关病毒：构建目的基因过表达载体，并进行包装及滴度的检测；
2)将构建好的腺相关病毒通过脑室注射方式注射小鼠右侧脑室；
3)将AD患者脑内提取的病理性tau即AD O-tau的分离；
4)将步骤3)分离后的AD O-tau注射小鼠海马；
5)组织固定与切片；
6)免疫组织化学；
7)蛋白质免疫印迹。
2.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤1)所述构建的重组腺相关病毒载体为rAAV9；所述构建目的基因过表达载体，其目的基因为Ppp2ca，载体名称为CV235，酶切位点为BamHI/AgeI。
3.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤1)所述病毒滴度的检测方法采用定量PCR法。
4.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，所述腺相关病毒为rAAV9-Ppp2ca，病毒滴度能够达到1.67E+12vg/ml。
5.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤2)所述在小鼠脑室注射的坐标为：前囟向后0.5mm，向左/右旁开1.0mm，自硬膜向腹侧进针2.5mm；注射体积5μl，注射速度0.2μl/min，留针10min以防液体外溢。
6.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤3)所述分离的具体步骤包括：
将10％的AD脑匀浆液在4℃下，27000xg离心30min，取上清在4℃下235000xg离心45min，将沉淀Oligo-tau用生理盐水洗三次，再用生理盐水重悬，-80℃保存，得到的tau即为AD O-tau。
7.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤4)所述在小鼠海马注射的坐标为：前囟向后2.5mm，向左/右旁开2.0mm，自硬膜向腹侧进针1.8mm；注射体积2.5μl，注射速度1.25μl/min，留针3min以防液体外溢。
8.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤7)所述蛋白质免疫印迹包括以下步骤：
71)样品处理：分别取步骤4)中注射了AD O-tau的小鼠两侧海马组织，即注射病毒侧和注射病毒的对侧，在10倍体积匀浆液中4℃匀浆，按1:1加入2×Laemmli SDS样品缓冲液，沸水煮5min,用PierceTM660nm蛋白质检测试剂盒测定蛋白浓度；
72)检测tau及其磷酸化时配制10％SDS-PAGE，相同量的蛋白上样，电压积层胶90V、分离胶110V，电泳；
73)电泳结束后采用湿转法将样品转移至PVDF膜，恒流1.0A，70min；
74)转膜结束后，将膜裁剪下干燥后再次用甲醇激活，TBS清洗一次后放入含有5％脱脂奶粉的TBS封闭30min；
75)加入含有5％脱脂奶粉和0.1％叠氮钠的TBS配置的一抗，4℃过夜；
76)TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次；加入用含有5％脱脂奶粉TBS配置的二抗，室温2h；
77)TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次，将膜置于ECL显色液中，临用前鲁米诺和过氧化氢等体积混匀，室温1min；压片、曝光、显影。
9.根据权利要求8所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤71)所述匀浆液包括：50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH为7.4；8.5％蔗糖；10mMβ-巯基乙醇；2mM乙二胺四乙酸；50mM NaF；1mM Na3VO4和蛋白酶抑制剂，以及1.0mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐，所述蛋白酶抑制剂包括10μg/ml的抑肽酶、胃酶抑素和亮抑酶肽。
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