BR112020026606A2 - Métodos de tratamento de perda auditiva e/ou perda de visão associada à clrn1 - Google Patents

Métodos de tratamento de perda auditiva e/ou perda de visão associada à clrn1 Download PDF

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Abstract

"MÉTODOS DE TRATAMENTO DE PERDA AUDITIVA E/OU PERDA DE VISÃO ASSOCIADA À CLRN1". A presente invenção refere-se a composições que incluem um vetor de ácido nucleico único ou dois vetores de ácido nucleico diferentes e o uso dessas composições para tratar a perda de audição e/ou visão em um sujeito.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS DE TRATAMENTO DE PERDA AUDITIVA E/OU PERDA DE VISÃO ASSOCIADA À CLRN1".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório US de Nº de Série 62/689.660, depositado em 25 de junho de 2018; todo o conteúdo do qual é incorporado neste documento por referência.
CAMPO TÉCNICO
[0002] A presente invenção refere-se, de forma geral, ao uso de ácidos nucleicos para tratar perda de audição, perda de visão ou am- bas em um indivíduo humano.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] Os tratamentos atuais para perda auditiva consistem princi- palmente de amplificação auditiva para perda auditiva leve a severa e implantes cocleares para perda auditiva severa a profunda; no entanto, uma necessidade há muito sentida de agentes e métodos para preve- nir ou reverter a surdez sindrômica permanece.
[0004] A perda auditiva pode ser condutiva (decorrente do canal auditivo ou ouvido médio), neurossensorial (decorrente do ouvido in- terno ou nervo auditivo) ou mista. A maioria das formas de surdez sin- drômica está associada à perda auditiva permanente causada por da- nos às estruturas do ouvido interno (surdez neurossensorial), embora algumas formas possam envolver alterações no ouvido médio (perda auditiva condutiva). A grande maioria da perda auditiva neurossensori- al humana é causada por anormalidades nas células ciliadas do órgão de Corti na cóclea (mau funcionamento das células ciliadas). As célu- las ciliadas podem ser anormais no nascimento ou podem ser danifi- cadas durante a vida de um indivíduo (por exemplo, como resultado de traumatismo sonoro ou infecção).
SUMÁRIO
[0005] A presente invenção refere-se a uma composição incluindo pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência codifica- dora que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, pode ser usada para gerar uma sequência que codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa) em uma célula de mamífero e, assim, tratar a perda auditiva associada a CLRN1 e/ou a perda de visão em um indivíduo em necessidade de tal tratamento. A invenção também se refere a composições incluindo um único vetor de ácido nucleico que inclui uma sequência codificadora de uma primeira e/ou segunda isoforma da proteína CLRN1.
[0006] São fornecidas neste documento composições incluindo pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, onde: cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência codifica- dora que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, sen- do que cada uma das porções codificadas possui pelo menos 30 resí- duos de aminoácidos de comprimento, em que a sequência de amino- ácidos de cada uma das porções codificadas pode opcionalmente se sobrepor parcialmente à sequência de aminoácidos de uma porção codificada diferente; nenhum vetor único dos pelo menos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; pelo menos uma das sequências de codificação inclui uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos de DNA genômico de CLRN1 e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons consecutivos; e quando introduzidos em uma célula de mamífero, os pelo menos dois vetores diferentes são submetidos a recombinação homóloga um com o outro, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 completa. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência codificadora que codifica uma porção diferente de uma primeira isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das com- posições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste em SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes inclui ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, cada um dos pelo me- nos dois vetores diferentes inclui uma sequência codificadora que co- difica uma porção diferente de uma segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das com-
posições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qual- quer uma das composições fornecidas neste documento, um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes inclui ainda uma se- quência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 3.
[0007] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, pelo menos um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma região não traduzida (UTR) 5º, uma 3' UTR ou ambas. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 20 nucleotí- deos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui uma se- quência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 12. Em algu-
mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a 3' UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idên- tica à SEQ ID NO: 15.
[0008] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, cada um dos pelo menos dois veto- res diferentes é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um cromossomo artificial humano (HAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cro- mossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial deri- vado de P1 (PAC). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de len- tivítus ou um vetor de retrovírus. Em algumas modalidades de qual- quer uma das composições fornecidas neste documento, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um vetor AAV.
[0009] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi-
ções fornecidas neste documento, a sequência de aminoácidos de ne- nhuma das porções codificadas se sobrepõe à sequência de aminoá- cidos de uma porção codificada diferente. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a se- quência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas se so- brepõe parcialmente à sequência de aminoácidos de uma porção codi- ficada diferente. Em algumas modalidades de qualquer uma das com- posições fornecidas neste documento, a sequência de aminoácidos sobreposta possui de cerca de 30 resíduos de aminoácidos a cerca de 202 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalida- des de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, os vetores incluem dois vetores diferentes, sendo que cada um dos quais inclui um segmento diferente de um íntron, em que o íntron inclui a sequência nucleotídica de um íntron que está presente no DNA ge- nômico de CLRN1 e em que dois segmentos de íntron diferentes se sobrepõem em sequência em pelo menos 100 nucleotídeos. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, os dois segmentos de íntron diferentes se sobrepõem em sequência em de 100 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos.
[0010] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, a sequência nucleotídica inteira de cada um dos pelo menos dois vetores diferentes possui de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a sequência nucleotídica inteira de cada um dos pe- lo menos dois vetores diferentes possui de 500 nucleotídeos a 5.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o número de veto- res diferentes na composição é dois. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, um pri-
meiro dos dois vetores diferentes inclui uma sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a porção N-terminal da proteína CLRN1 possui entre 30 aminoácidos a 202 aminoácidos de comprimento. Em algumas moda- lidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a porção N-terminal da proteína CLRN1 possui entre 60 aminoáci- dos a 170 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o primei- ro vetor inclui ainda uma sequência de 5' UTR. Em algumas modalida- des de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qual- quer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a 5' UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idên- tica à SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o primeiro vetor inclui ainda um ou ambos dentre um promotor e uma sequência de Kozak. Em al- gumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o primeiro vetor inclui um promotor que é um promo- tor induzível, um promotor constitutivo ou um promotor tecido- específico. Em algumas modalidades de qualquer uma das composi-
ções fornecidas neste documento, o segundo dos dois vetores diferen- tes inclui uma sequência codificadora que codifica uma porção C- terminal da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a porção C- terminal da proteína CLRN1 possui entre 30 aminoácidos a 202 ami- noácidos de comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a porção C-terminal da proteína CLRN1 possui entre 60 aminoácidos a 170 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das compo- sições fornecidas neste documento, o segundo vetor inclui ainda uma sequência sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades de qual- quer uma das composições fornecidas neste documento, o segundo vetor inclui ainda uma sequência de 3' UTR. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 50 nucleotí- deos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO:
15.
[0011] Também são fornecidas neste documento composições que incluem um único vetor de ácido nucleico, em que o vetor inclui um ou ambos dentre (i) uma primeira sequência codificadora que codi-
fica uma primeira isoforma da proteína CLRN1 e (ii) uma segunda se- quência codificadora que codifica uma segunda isoforma de proteína CLRN1, em que uma ou ambas dentre a primeira e a segunda se- quências codificadoras incluilem) uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos de um DNA genômico de CLRN1 e sem uma sequência intrônica entre os dois íntrons consecutivos.
Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o único vetor de ácido nucleico contém a primeira sequência codificadora, e não a segunda sequência codificadora.
Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o único vetor de ácido nucleico contém a segunda sequência codificadora, e não a primeira sequência codificadora.
Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o único vetor de ácido nucleico contém ambas a primeira sequência codificadora e a segunda sequência codificadora.
Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qual- quer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isofor- ma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algumas modalida- des de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 5.
[0012] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, o único vetor de ácido nucleico in- clui ainda uma região não traduzida (UTR) 5º, uma 3' UTR ou ambas. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a 5' UTR inclui pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 5' UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a 3' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO:
15.
[0013] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, o único vetor de ácido nucleico é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o único vetor de ácido nu- cleico é um cromossomo artificial humano (HAC), um cromossomo arti- ficial de levedura (YAC), um cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC). Em algumas modali- dades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, o único vetor de ácido nucleico é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus ou um vetor de retrovírus. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o úni- co vetor de ácido nucleico é um vetor de AAV. Em algumas modalida- des de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o único vetor de ácido nucleico inclui ainda um ou ambos dentre um promotor e uma sequência de Kozak. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o primei- ro vetor inclui um promotor que é um promotor induzível, um promotor constitutivo ou um promotor tecido-específico. Em algumas modalida- des de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o único vetor de ácido nucleico inclui ainda uma sequência sinal de poli- adenilação. Algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento incluem ainda um excipiente farmaceuti- camente aceitável.
[0014] Também são fornecidos neste documento kits que incluem qualquer uma das composições fornecidas neste documento. Algumas modalidades de qualquer um dos kits fornecidos neste documento in- cluem ainda uma seringa pré-carregada que inclui ou contém qualquer uma das composições descritas neste documento.
[0015] Também são fornecidos neste documento métodos que in- cluem a introdução em uma cóclea de um mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste documento. Em algumas modalidades de qualquer um dos mé- todos fornecidos neste documento, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1.
[0016] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em uma cé- lula de mamífero que incluem a introdução de qualquer uma das com- posições fornecidas neste documento na célula de mamífero. Em al- gumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a célula de mamífero é uma célula ciliada interna da có- clea ou uma célula ciliada externa da cóclea. Em algumas modalida- des de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a célu- la de mamífero é uma célula da retina. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a célula de mamífero é uma célula humana. Em algumas modalidades de qual- quer um dos métodos fornecidos neste documento, foi previamente determinado que a célula de mamífero possui um gene defeituoso da CLRN1.
[0017] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 em uma célula ciliada interna, uma célula ciliada externa ou ambas em uma cóclea de um mamífero que incluem: introdução de uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste docu- mento na cóclea do mamífero. Também são fornecidos neste docu- mento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em um olho de um mamífero que incluem: administração in- traocular de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste documento no olho do mamífero. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o mamífero é um ser humano.
[0018] Também são fornecidos neste documento métodos de tra- tamento de perda auditiva em um indivíduo identificado como possuin- do um gene defeituoso da CLRN1 que incluem: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento na cóclea do indivíduo. Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de perda de visão em um indivíduo identificado como possuindo um gene defeituoso da CLRN1 que incluem: administração de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento no olho do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o indivíduo possui sín- drome de Usher tipo Ill. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o indivíduo é um ser humano. Algumas modalidades de qualquer um dentre os métodos fornecidos neste documento incluem ainda, antes da etapa de administração, de- terminar que o indivíduo possui um gene defeituoso da CLRN1.
[0019] Também são fornecidas neste documento composições que incluem dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico di- ferentes inclui um promotor, uma primeira sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada 3' do promotor e uma sequência doadora de splice posicionada na ex-
tremidade 3' da primeira sequência codificadora; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes inclui uma sequência aceptora de splice, uma segunda sequência codifica- dora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína CLRN1 po- sicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splice e uma sequência sinal de poliadenilação na extremidade 3' da segunda se- quência codificadora; em que cada uma das porções codificadas pos- sui pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as sequências de aminoácidos das duas porções codificadas não se sobrepõem uma à outra; em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; e quando se intro- duz em uma célula de mamífero, o splicing ocorre entre a sequência doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 completa.
Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma primeira isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C- terminal da primeira isoforma da proteína CLRN1. Em algumas moda- lidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 3. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, o primeiro vetor de ácido nucleico do segundo vetor de ácido nucleico inclui ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas mo-
dalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste docu- mento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modali- dades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 5.
[0020] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma segunda isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C- terminal da segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas moda- lidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a se- gunda isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, o primeiro vetor de ácido nucleico ou o segundo vetor de ácido nucleico inclui ainda uma sequência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1. Em algumas mo- dalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste docu- mento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algumas modali- dades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 3.
[0021] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, um ou ambos dentre o primeiro ve- tor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico inclui(em) uma região não traduzida (UTR) 5º, uma 3' UTR ou ambas. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a 5' UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idên- tica à SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a 3' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui uma se- quência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15.
[0022] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e segundo vetor de ácido nucleico é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nu- cleico e segundo vetor de ácido nucleico é um cromossomo artificial humano (HAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cro- mossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial deri- vado de P1 (PAC). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e segundo vetor de ácido nucleico é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus ou um vetor de retrovírus. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nu- cleico e segundo vetor de ácido nucleico é um vetor de AAV. Em al- gumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, pelo menos uma das sequências codificadoras inclui uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos de DNA genômico de CLRN1, e sem uma sequência intrônica entre os dois éxons consecutivos.
[0023] Também são fornecidas neste documento composições que incluem dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico di- ferentes inclui um promotor, uma primeira sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada
3' do promotor, uma sequência doadora de splice posicionada na ex- tremidade 3' da primeira sequência codificadora e um primeiro gene marcador detectável posicionado 3' da sequência doadora de splice; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes inclui um segundo gene marcador detectável, uma sequên- cia aceptora de splice posicionada 3' do segundo gene marcador de- tectável, uma segunda sequência codificadora que codifica uma por- ção C-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splice e uma sequência sinal de poliadenila- ção posicionada na extremidade 3' da segunda sequência codificado- ra; em que cada uma das porções codificadas possui pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem uma à outra; em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; e quando se introduz em uma célula de mamífero, o splicing ocorre entre a sequência doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico re- combinado que codifica uma proteína CLRN1 completa.
Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a primeira sequência codificadora codifica uma porção N- terminal de uma primeira isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da primeira iso- forma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das com- posições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isofor- ma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 3. Em algumas moda-
lidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, o primeiro vetor de ácido nucleico do segundo vetor de ácido nu- cleico inclui ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da pro- teína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das com- posições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isofor- ma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 5. Em algumas moda- lidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma segunda isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da pro- teína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das com- posições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isofor- ma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 5. Em algumas moda- lidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, o primeiro vetor de ácido nucleico ou o segundo vetor de ácido nu- cleico inclui ainda uma sequência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da pro- teína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das com-
posições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isofor- ma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 3.
[0024] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, um ou ambos dentre o primeiro ve- tor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico inclui(em) uma região não traduzida (UTR) 5º, uma 3' UTR ou ambas. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
12.
[0025] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, a 5' UTR compreende pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 5' UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a 3' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO:
15.
[0026] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e segundo vetor de ácido nucleico é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nu- cleico e segundo vetor de ácido nucleico é um cromossomo artificial humano (HAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cro- mossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial deri- vado de P1 (PAC). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e segundo vetor de ácido nucleico é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus ou um vetor de retrovírus. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nu- cleico e segundo vetor de ácido nucleico é um vetor de AAV. Em al- gumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, pelo menos uma das sequências codificadoras compreende uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons con- secutivos de DNA genômico de CLRN1, e sem uma sequência intrôni- ca entre os dois éxons consecutivos. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o primei-
ro ou o segundo gene marcador detectável é fosfatase alcalina.
[0027] Também são fornecidas neste documento composições que incluem dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico di- ferentes inclui um promotor, uma primeira sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada 3' do promotor, uma sequência doadora de splice posicionada na ex- tremidade 3' da primeira sequência codificadora e uma região recom- binogênica do fago F1 posicionada 3' da sequência doadora de splice; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nu- cleico diferentes inclui uma região recombinogênica do fago F1, uma sequência aceptora de splice posicionada 3' da região recombinogêni- ca do fago F1, uma segunda sequência codificadora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremida- de 3' da sequência aceptora de splice e uma sequência sinal de polia- denilação posicionada na extremidade 3' da segunda sequência codifi- cadora; em que cada uma das duas porções codificadas possui pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as se- quências de aminoácidos das duas porções codificadas não se sobre- põem uma à outra; em que nenhum vetor único dos dois vetores dife- rentes codifica uma proteína CLRN1 completa; e quando se introduz em uma célula de mamífero, o splicing ocorre entre a sequência doa- dora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 comple- ta. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma primeira isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da primeira isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primei-
ra isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo me- nos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qual- quer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 3. Em algumas mo- dalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste docu- mento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o primeiro vetor de ácido nucleico do se- gundo vetor de ácido nucleico inclui ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a se- gunda isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a se- gunda isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 5.
[0028] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma segunda isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C- terminal da segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas moda- lidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a segunda isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a se- gunda isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 5. Em algu- mas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ
ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, o primeiro vetor de ácido nucleico ou o segundo vetor de ácido nucleico inclui ainda uma sequência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1. Em algumas mo- dalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste docu- mento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em algumas modali- dades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a primeira isoforma da proteína CLRN1 inclui a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID NO: 3.
[0029] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, um ou ambos dentre o primeiro ve- tor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico compreen- de(m) uma região não traduzida (UTR) 5º, uma 3' UTR ou ambas. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contí- guos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas moda- lidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documen- to, a 5 UTR inclui pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das com- posições fornecidas neste documento, a 5' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, a 5' UTR inclui uma sequência que é pelo me- nos 80% idêntica à SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO:
15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições for- necidas neste documento, a 3' UTR inclui pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento, a 3' UTR inclui pelo menos 80 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, a 3 UTR inclui uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO:
15.
[0030] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e segundo vetor de ácido nucleico é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nu- cleico e segundo vetor de ácido nucleico é um cromossomo artificial humano (HAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cro- mossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial deri- vado de P1 (PAC). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e segundo vetor de ácido nucleico é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus ou um vetor de retrovírus. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições forneci- das neste documento, cada um dentre o primeiro vetor de ácido nu-
cleico e segundo vetor de ácido nucleico é um vetor de AAV. Em al- gumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, pelo menos uma das sequências codificadoras inclui uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos de DNA genômico de CLRN1, e sem uma sequência intrônica entre os dois éxons consecutivos.
[0031] Também são fornecidos neste documento kits que incluem qualquer uma das composições fornecidas neste documento. Algumas modalidades de qualquer um dos kits fornecidos neste documento in- cluem ainda uma seringa pré-carregada que inclui a composição.
[0032] Também são fornecidos neste documento métodos que in- cluem a introdução em uma cóclea de um mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste documento. Em algumas modalidades de qualquer um dos mé- todos fornecidos neste documento, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1.
[0033] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em uma cé- lula de mamífero que incluem a introdução de qualquer uma das com- posições fornecidas neste documento na célula de mamífero. Em al- gumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a célula de mamífero é uma célula ciliada interna da có- clea ou uma célula ciliada externa da cóclea. Em algumas modalida- des de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a célu- la de mamífero é uma célula da retina. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a célula de mamífero é uma célula humana. Em algumas modalidades de qual- quer um dos métodos fornecidos neste documento, foi previamente determinado que a célula de mamífero possui um gene defeituoso da CLRN1.
[0034] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 em uma célula ciliada interna, uma célula ciliada externa ou ambas em uma cóclea de um mamífero que incluem: introdução de uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documen- to na cóclea do mamífero. Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 comple- ta em um olho de um mamífero que incluem: administração intraocular de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste documento no olho do mamífero. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas neste documento, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o mamífero é um ser humano.
[0035] Também são fornecidos neste documento métodos de tra- tamento de perda auditiva em um indivíduo identificado como possuin- do um gene defeituoso da CLRN1 que incluem: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composi- ções fornecidas neste documento na cóclea do indivíduo. Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de perda de visão em um indivíduo identificado como possuindo um gene defeituoso da CLRN1 que incluem: administração de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste do- cumento no olho do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o indivíduo possui sín- drome de Usher tipo Ill. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o indivíduo é um ser humano.
Algumas modalidades de qualquer um dentre os métodos fornecidos neste documento incluem ainda, antes da etapa de administração, de- terminar que o indivíduo possui um gene defeituoso da CLRN1.
[0036] Os termos “um” e “uma” referem-se a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” abrange um elemento e mais de um elemen- to.
[0037] O termo "mutação em um gene CLRN1" refere-se a uma modificação em um gene CLRN1 do tipo selvagem que resulta na pro- dução de uma proteína CLRN1 com uma ou mais dentre: uma deleção em um ou mais aminoácidos, uma ou mais substituições de aminoáci- dos e uma ou mais inserções de aminoácidos em comparação com a proteína CLRN1 do tipo selvagem e/ou resulta em uma redução no nível expresso da proteína CLRN1 codificada em uma célula de mamí- fero em comparação com o nível expresso da proteína CLRN1 codifi- cada em uma célula de mamífero que não possui uma mutação. Em algumas modalidades, uma mutação pode resultar na produção de uma proteína CLRN1 com uma deleção em um ou mais aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos). Em algumas modalidades, a mutação pode resul- tar em uma mudança da matriz de leitura no gene CLRN1. O termo frameshift é conhecido na técnica como abrangendo qualquer mutação em uma sequência codificadora que resulta em uma mudança no qua- dro de leitura da sequência codificadora. Em algumas modalidades, uma mudança da matriz de leitura pode resultar em uma proteína não funcional. Em algumas modalidades, uma mutação pontual pode ser uma mutação sem sentido (ou seja, resultar em um códon de parada prematuro em um éxon do gene). Uma mutação sem sentido pode re- sultar na produção de uma proteína truncada (em comparação com uma proteína do tipo selvagem correspondente) que pode ou não ser funcional. Em algumas modalidades, a mutação pode resultar na per- da (ou diminuição no nível) de expressão de MRNA de CLRN1 ou pro- teína CLRN1 ou tanto o MRNA quanto a proteína. Em algumas moda- lidades, a mutação pode resultar na produção de uma proteína CLRN1 alterada com uma perda ou diminuição em uma ou mais atividades (funções) biológicas em comparação com uma proteína CLRN1 do tipo selvagem.
[0038] Em algumas modalidades, a mutação é uma inserção de um ou mais nucleotídeos em um gene CLRN1. Em algumas modalida- des, a mutação está em uma sequência reguladora do gene CLRN1, ou seja, uma porção do gene que não é a sequência codificadora. Em algumas modalidades, uma mutação em uma sequência reguladora pode estar em uma região promotora ou potencializadora e prevenir ou reduzir a transcrição adequada do gene CLRN1. O termo "mutação conservativa" refere-se a uma mutação que não altera o aminoácido codificado no sítio da mutação (devido à degenerescência do códon).
[0039] As modificações podem ser introduzidas em uma sequência nucleotídica por técnicas padrão conhecidas, tais como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. As substituições con- servativas de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoá- cido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui uma ca- deia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com ca- deias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Tais famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisi- na, arginina e histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína e triptofano), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, e metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina e isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, tripto- fano e histidina).
[0040] O termo “sequência nucleotídica que codifica uma sequên- cia de aminoácidos” inclui todas as sequências nucleotídicas que são versões degeneradas umas das outras e, portanto, codificam a mesma sequência de aminoácidos.
[0041] O termo "endógeno" refere-se a qualquer material originário de um organismo, célula ou tecido.
[0042] O termo "exógeno" refere-se a qualquer material introduzi- do ou originado de fora de um organismo, célula ou tecido que não é produzido ou não se origina do mesmo organismo, célula ou tecido no qual está sendo introduzido.
[0043] O termo "isolado" significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não está "isolado", mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcial ou completamente separado dos materi- ais coexistentes de seu estado natural está "isolado". Uma proteína ou ácido nucleico isolado podem existir em uma forma substancialmente purificada ou podem existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, em uma célula hospedeira.
[0044] O termo "transfectado", "transformado" ou "transduzido" refere-se a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno é transfe- rido ou introduzido em uma célula. Uma célula de mamífero "transfec- tada", "transformada" ou "transduzida" é uma célula que foi transfecta- da, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno.
[0045] O termo "expressão" refere-se à transcrição e/ou tradução de uma sequência nucleotídica particular que codifica uma proteína.
[0046] O termo "expressão transitória" refere-se à expressão de uma sequência codificadora não integrada por um curto período de tempo (por exemplo, horas ou dias). A sequência codificadora que é transitoriamente expressa em uma célula (por exemplo, uma célula de mamífero) é perdida após várias rodadas de divisão celular.
[0047] O termo "indivíduo" destina-se a incluir qualquer mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é um roedor (por exemplo, um rato ou camundongo), um coelho, uma ovelha, uma cabra, um porco, um cão, um gato, um primata não humano ou um humano. Em algu- mas modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de perda de audi- ção e/ou perda de visão. Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado anteriormente como tendo uma mutação em um gene CLRN1. Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado como tendo uma mutação em um gene CLRN!1 e foi diagnosticado com per- da de audição e/ou perda de visão. Em algumas modalidades, o indi- víduo foi identificado como tendo perda de audição e/ou perda de vi- são.
[0048] Um tratamento é "terapeuticamente eficaz" quando resulta em uma redução em um ou mais dentre o número, a gravidade e a frequência de um ou mais sintomas de uma doença (por exemplo, perda auditiva ou perda de visão) em um indivíduo (por exemplo, um humano). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de uma composição pode resultar em um aumento no nível de expressão de uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteí- na CLRN1 do tipo selvagem completa ou uma variante de uma proteí- na CLRN1 que possui a atividade desejada) (por exemplo, em compa- ração com o nível de expressão antes do tratamento com a composi- ção). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode resultar em um aumento no nível de expressão de uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 do tipo selvagem completa ou uma variante ativa) em uma cé- lula-alvo (por exemplo, um célula ciliada interior coclear). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma com-
posição pode resultar em um aumento no nível de expressão de uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 do tipo sel- vagem completa ou uma variante ativa) e/ou um aumento em uma ou mais atividades de uma proteína CLRN1 em uma célula-alvo (por exemplo, em comparação com um nível de referência, como o(s) ní- vel(is) em um indivíduo antes do tratamento, o(s) nível(is) em um indi- víduo com uma mutação em um gene CLRNI1, ou o(s) nível(is) em um indivíduo ou uma população de indivíduos com perda de audição e/ou perda de visão).
[0049] Os termos "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" referem-se a ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) ou combinações destes, na forma de fita simples ou fita dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos con- tendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que possuem propriedades de ligação semelhantes aos nucleotídeos de referência. A menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácidos nu- cleicos particular abrange também implicitamente sequências com- plementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Em algumas modalidades de qualquer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento, o ácido nucleico é DNA. Em algumas modalidades de qualquer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento, o ácido nucleico é RNA.
[0050] O termo "proteína CLRN1 ativa" significa uma proteína co- dificada por DNA que, se substituída por ambos os alelos do tipo sel- vagem que codificam proteína CLRN1 completa em células ciliadas auditivas ou células oculares de um mamífero que de outra forma seria do tipo selvagem e se expressa nas células ciliadas auditivas ou nas células oculares desse mamífero, causa naquele mamífero um nível de audição ou visão próximo ao nível normal de audição ou visão de um mamífero semelhante que é totalmente do tipo selvagem. Exem-
plos não limitativos de proteínas CLRN1 ativas são proteínas CLRN1 completas (por exemplo, qualquer uma das proteínas CLRN1 comple- tas descritas neste documento).
[0051] Por exemplo, uma proteína CLRN1 ativa pode incluir uma sequência de uma proteína CLRN1 inteira de tipo selvagem (por exemplo, uma . proteína CLRN1 inteira de tipo selvagem humana) in- cluindo 1 substituição de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 90 substitui- ções de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 85 subs- tituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoá- cido a cerca de 55 substituições de aminoácido, 1 substituição de ami- noácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, 1 substitui- ção de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoácido, 1 subs- tituição de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 25 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 20 substituições de aminoáci- do, 1 substituição de aminoácido a cerca de 15 substituições de ami- noácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 10 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 9 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 8 substitui- ções de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 7 substi- tuições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 6 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 4 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cer- ca de 3 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoáci- do, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 90 substitui- ções de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cer- ca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoáci- do, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 70 substitui- ções de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cer- ca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoáci- do, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 50 substitui- ções de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cer- ca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoáci- do, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 30 substitui- ções de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cer- ca de 25 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 20 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 15 substituições de aminoáci- do, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 10 substitui- ções de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cer- ca de 9 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 8 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 7 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de 6 substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoácido a cerca de substituições de aminoácido, de cerca de 2 substituições de aminoá- cido a cerca de 4 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substitui- ções de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoáci- do a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substitui- ções de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoáci- do a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substitui- ções de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoáci- do a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substitui- ções de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoáci- do a cerca de 25 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substitui- ções de aminoácido a cerca de 20 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 15 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 10 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoáci- do a cerca de 9 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substitui-
ções de aminoácido a cerca de 8 substituições de aminoácido, de cer- ca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 7 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoácido a cerca de 6 substituições de aminoácido, de cerca de 3 substituições de aminoáci- do a cerca de 5 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substitui- ções de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoáci- do a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substitui- ções de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoáci- do a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substitui- ções de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoáci- do a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substitui- ções de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoáci- do a cerca de 25 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substitui- ções de aminoácido a cerca de 20 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 15 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 10 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoáci- do a cerca de 9 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substitui-
ções de aminoácido a cerca de 8 substituições de aminoácido, de cer- ca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 7 substituições de aminoácido, de cerca de 4 substituições de aminoácido a cerca de 6 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoáci- do a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substi- tuições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoáci- do a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substitui- ções de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoáci- do a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substitui- ções de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoáci- do a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substitui- ções de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 25 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoáci- do a cerca de 20 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substitui- ções de aminoácido a cerca de 15 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 10 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoácido a cerca de 9 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substituições de aminoáci- do a cerca de 8 substituições de aminoácido, de cerca de 5 substitui-
ções de aminoácido a cerca de 7 substituições de aminoácido, de cer- ca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoáci- do a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substitui- ções de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoáci- do a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substitui- ções de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoáci- do a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substitui- ções de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoáci- do a cerca de 30 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substitui- ções de aminoácido a cerca de 25 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 20 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 15 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substituições de aminoáci- do a cerca de 10 substituições de aminoácido, de cerca de 6 substitui- ções de aminoácido a cerca de 9 substituições de aminoácido, de cer- ca de 6 substituições de aminoácido a cerca de 8 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoáci- do a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substitui-
ções de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoáci- do a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substitui- ções de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoáci- do a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substitui- ções de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoáci- do a cerca de 35 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substitui- ções de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 25 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 20 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoáci- do a cerca de 15 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substitui- ções de aminoácido a cerca de 10 substituições de aminoácido, de cerca de 7 substituições de aminoácido a cerca de 9 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoáci- do a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substitui- ções de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoáci- do a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substitui-
ções de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoáci- do a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substitui- ções de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoáci- do a cerca de 35 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substitui- ções de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 25 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoácido a cerca de 20 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substituições de aminoáci- do a cerca de 15 substituições de aminoácido, de cerca de 8 substitui- ções de aminoácido a cerca de 10 substituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de ami- noácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoáci- do, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 80 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de substituições de aminoácido a cerca de 65 substituições de amino- ácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 60 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de substituições de aminoácido a cerca de 45 substituições de amino- ácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 40 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 25 substituições de amino- ácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 20 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 10 substituições de aminoácido a cerca de 15 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de ami- noácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoá- cido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substi- tuições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 7O substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de ami- noácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoáci- do, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 55 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de amino- ácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 35 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 25 substituições de aminoácido, de cerca de 15 substituições de aminoácido a cerca de 20 substituições de amino-
ácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoá- cido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substi- tuições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de ami- noácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoáci- do, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 65 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de amino- ácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 45 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 30 substituições de amino- ácido, de cerca de 20 substituições de aminoácido a cerca de 25 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 25 substitui- ções de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de ami- noácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoáci- do, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 70 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de amino- ácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 50 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 35 substituições de amino- ácido, de cerca de 25 substituições de aminoácido a cerca de 30 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 30 substitui- ções de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de ami- noácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoáci- do, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 70 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de amino- ácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 50 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 30 substituições de aminoácido a cerca de 35 substituições de amino- ácido, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 35 substituições de aminoá- cido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 35 substi-
tuições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 35 substituições de ami- noácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoáci- do, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 65 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácido, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de amino- ácido, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 45 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 35 substituições de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de ami- noácido, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de aminoá- cido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 40 substi- tuições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 7O substituições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de ami- noácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoáci- do, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 55 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 40 substituições de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácido, de cerca de 45 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de ami-
noácido, de cerca de 45 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 45 substituições de aminoá- cido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 45 substi- tuições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 45 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 45 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 45 substituições de ami- noácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de 45 substituições de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoáci- do, de cerca de 45 substituições de aminoácido a cerca de 60 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 45 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 45 substituições de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácido, de cerca de 50 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de ami- noácido, de cerca de 50 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 50 substituições de aminoá- cido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 50 substi- tuições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 50 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 50 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 50 substituições de ami- noácido a cerca de 70 substituições de aminoácido, de cerca de 50 substituições de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoáci- do, de cerca de 50 substituições de aminoácido a cerca de 60 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 50 substituições de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácido, de cerca de 60 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 60 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de ami- noácido, de cerca de 60 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 60 substituições de aminoá-
cido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 60 substi- tuições de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácido, de cerca de 60 substituições de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácido, de cerca de 60 substituições de aminoácido a cerca de 7O substituições de aminoácido, de cerca de 60 substituições de ami- noácido a cerca de 65 substituições de aminoácido, de cerca de 70 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoá- cido, de cerca de 70 substituições de aminoácido a cerca de 95 substi- tuições de aminoácido, de cerca de 70 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 70 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 70 substituições de aminoácido a cerca de 80 substituições de amino- ácido, de cerca de 70 substituições de aminoácido a cerca de 75 subs- tituições de aminoácido, de cerca de 80 substituições de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 80 substitui- ções de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácido, de cerca de 80 substituições de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácido, de cerca de 80 substituições de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácido, de cerca de 90 substituições de ami- noácido a cerca de 100 substituições de aminoácido, de cerca de 90 substituições de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoáci- do ou de cerca de 95 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos.
[0052] Uma pessoa versada na técnica apreciaria que os aminoá- cidos que não são conservados entre proteínas CLRN1 do tipo selva- gem de espécies diferentes podem ser mutados sem perder atividade, enquanto os aminoácidos que são conservados entre proteínas CLRN1 do tipo selvagem de espécies diferentes não devem ser muta- dos, pois é mais provável (do que aminoácidos que não são conserva- dos entre espécies diferentes) que esteja envolvido na atividade.
[0053] Uma proteína CLRN1 ativa pode incluir, por exemplo, uma sequência de uma proteína CLRN1 inteira de tipo selvagem (por exemplo, uma proteína CLRN1 inteira de tipo selvagem humana) que tem de cerca de 1 aminoácido a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 1 ami- noácido a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 60 aminoáci- dos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 1 ami- noácido a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 15 aminoáci- dos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 10 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 9 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 8 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 7 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 6 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 5 aminoácidos, de cerca de 1 ami- noácido a cerca de 4 aminoácidos, de cerca de 1 aminoácido a cerca de 3 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 100 aminoá- cidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 2 aminoáci- dos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 75 aminoáci- dos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 2 aminoáci- dos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de
55 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 50 aminoáci- dos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 2 aminoáci- dos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 25 aminoáci- dos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 2 aminoáci- dos a cerca de 10 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 5 aminoácidos, de cerca de 2 aminoácidos a cerca de 4 ami- noácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, de cerca de 3 ami-
noácidos a cerca de 6 aminoácidos, de cerca de 3 aminoácidos a cer- ca de 5 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 100 ami- noácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 8 ami- noácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, de cerca de 5 ami- noácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, de cerca de 6 aminoácidos a cerca de 8 ami- noácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 8 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 10 aminoáci- dos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 70 amino- ácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 10 aminoáci- dos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 15 amino- ácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 15 aminoáci- dos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 50 amino- ácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 20 aminoáci- dos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 80 amino- ácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 20 aminoáci- dos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 25 amino- ácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 25 aminoáci- dos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 50 amino- ácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 95 aminoá- cidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cer- ca de 30 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 30 ami- noácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 30 aminoáci- dos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 40 amino-
ácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 35 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 35 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 35 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 95 aminoá- cidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cer- ca de 40 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 40 ami- noácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, de cerca de 40 aminoáci- dos a cerca de 50 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, de cerca de 45 aminoácidos a cerca de 50 amino- ácidos, de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, de cerca de 50 aminoáci- dos a cerca de 60 aminoácidos ou de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, deletados.
Em algumas modalidades em que dois ou mais aminoácidos são deletados da sequência de uma proteína CLRN1 do tipo selvagem completa, pelo menos dois dos dois ou mais aminoácidos deletados podem ser contíguos na sequência da proteína do tipo selvagem completa.
Em outros exemplos em que dois ou mais aminoácidos são deletados da sequência de uma proteína CLRN1 do tipo selvagem completa, alguns ou todos dos dois ou mais aminoáci- dos deletados não são contíguos na sequência da proteína do tipo sel-
vagem completa. Uma pessoa versada na técnica apreciaria que os aminoácidos que não são conservados entre as proteínas CLRN1 do tipo selvagem completas de diferentes espécies podem ser deletados sem perda de atividade, enquanto os aminoácidos que são conserva- dos entre as proteínas CLNRN1 do tipo selvagem completas de dife- rentes espécies não devem ser deletados porque é mais provável (do que aminoácidos que não são conservados entre espécies diferentes) que estejam envolvidos na atividade.
[0054] Em alguns exemplos, uma proteína CLRN1 ativa pode, por exemplo, incluir uma sequência de uma proteína CLRN1 do tipo selva- gem completa que tem de 1 aminoácido a cerca de 100 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 90 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 85 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 80 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 75 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 70 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 65 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 60 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 55 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 50 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 45 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 40 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 35 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 30 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 25 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 20 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 15 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 10 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 9 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 8 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 7 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 6 ami- noácidos, 1 aminoácido a cerca de 5 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 4 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 3 aminoácidos, cer- ca de 2 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 2 aminoá- cido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cer- ca de 2 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 2 aminoáci-
dos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cer- ca de 2 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 2 aminoáci- dos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cer- ca de 2 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 2 aminoáci- dos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cer- ca de 2 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 2 aminoáci- dos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 6 aminoá- cidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 5 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 4 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cer- ca de 100 aminoácidos, cerca de 3 aminoácido a cerca de 95 aminoá- cidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 75 ami- noácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cer- ca de 3 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 3 aminoáci- dos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cer- ca de 3 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 3 aminoáci- dos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cer- ca de 3 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 3 aminoáci-
dos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 5 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 4 aminoácido a cerca de 95 ami- noácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cer- ca de 4 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 4 aminoáci- dos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cer- ca de 4 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 4 aminoáci- dos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cer- ca de 4 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 4 aminoáci- dos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cer- ca de 4 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 4 aminoáci- dos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 5 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cer- ca de 5 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 5 aminoáci- dos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cer- ca de 5 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 5 aminoáci- dos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cer- ca de 5 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 5 aminoáci-
dos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cer- ca de 5 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 5 aminoáci- dos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 100 ami- noácidos, cerca de 6 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 80 ami- noácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cer- ca de 6 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 6 aminoáci- dos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cer- ca de 6 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 6 aminoáci- dos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cer- ca de 6 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 6 aminoáci- dos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 7 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 7 aminoá- cidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 7 amino- ácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 7 amino-
ácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 7 amino- ácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 7 amino- ácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 8 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 8 aminoá- cidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 8 amino- ácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 8 amino- ácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 8 amino- ácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 8 amino- ácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 10 aminoácido a cerca de 95 aminoáci- dos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 75 ami- noácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 10 aminoáci- dos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos,
cerca de 10 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 10 ami- noácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 30 aminoáci- dos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 20 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cer- ca de 20 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 20 amino- ácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 75 aminoáci- dos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 55 ami- noácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 20 aminoáci- dos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 30 ami- noácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 30 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 90 aminoáci- dos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 70 ami- noácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 30 aminoáci- dos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 30 ami- noácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 40 aminoácido a cerca de 95 aminoáci-
dos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 75 ami- noácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 40 aminoáci- dos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 50 ami- noácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 50 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 90 aminoáci- dos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 70 ami- noácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 50 aminoáci- dos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 60 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 60 ami- noácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 75 aminoáci- dos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 70 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 70 ami- noácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 80 aminoácidos a cerca de 100 aminoá- cidos, cerca de 80 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 80 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 80 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos ou cerca de 95 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos removidos de seu N-terminal e/ou 1 aminoácido a 100 aminoácidos (ou qualquer um dos subintervalos deste intervalo descritos neste documento) removi- dos de seu C-terminal.
[0055] Em algumas modalidades, uma proteína CLRN1 ativa pode, por exemplo, incluir a sequência de uma proteína CLRN1 do tipo sel- vagem completa, em que 1 aminoácido a 50 aminoácidos, 1 aminoáci- do a 45 aminoácidos, 1 aminoácido a 40 aminoácidos, 1 aminoácido a 35 aminoácidos, 1 aminoácido a 30 aminoácidos, 1 aminoácido a 25 aminoácidos, 1 aminoácido a 20 aminoácidos, 1 aminoácido a 15 ami- noácidos, 1 aminoácido a 10 aminoácidos, 1 aminoácido a 9 aminoá- cidos, 1 aminoácido a 8 aminoácidos, 1 aminoácido a 7 aminoácidos, 1 aminoácido a 6 aminoácidos, 1 aminoácido a 5 aminoácidos, 1 amino- ácido a 4 aminoácidos, 1 aminoácido a 3 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 45 aminoá- cidos, cerca de 2 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 2 aminoá- cidos a 35 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 9 aminoáci- dos, cerca de 2 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 7 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 6 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 5 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 4 aminoáci- dos, cerca de 3 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 3 aminoáci- dos a 45 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 40 aminoácidos, cer- ca de 3 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 15 aminoá- cidos, cerca de 3 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 3 aminoá-
cidos a 9 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 7 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 6 ami- noácidos, cerca de 3 aminoácidos a 5 aminoácidos, cerca de 4 amino- ácidos a 50 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 20 aminoá- cidos, cerca de 4 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 4 aminoá- cidos a 10 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 9 aminoácidos, cer- ca de 4 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 7 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 6 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 45 aminoá- cidos, cerca de 5 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 5 aminoá- cidos a 35 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 9 aminoáci- dos, cerca de 5 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 7 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 40 amino- ácidos, cerca de 6 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 6 aminoá- cidos a 30 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 9 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 8 aminoáci- dos, cerca de 7 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 7 aminoáci- dos a 45 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 40 aminoácidos, cer- ca de 7 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 15 aminoá-
cidos, cerca de 7 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 7 aminoá- cidos a 9 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 50 aminoácidos, cer- ca de 8 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 25 aminoá- cidos, cerca de 8 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 8 aminoá- cidos a 15 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 15 amino- ácidos, cerca de 15 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 15 ami- noácidos a 45 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 40 aminoáci- dos, cerca de 15 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 15 aminoá- cidos a 30 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 25 aminoácidos a 50 amino- ácidos, cerca de 25 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 25 ami- noácidos a 40 aminoácidos, cerca de 25 aminoácidos a 35 aminoáci- dos, cerca de 25 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 30 aminoá- cidos a 50 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 35 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 35 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 35 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a 45 aminoácidos ou cerca de 45 aminoácidos a cerca de
50 aminoácidos, são inseridos Em alguns exemplos, o 1 aminoácido a 50 aminoácidos (ou qualquer subintervalo destes) pode ser inserido como uma sequência contígua na sequência de uma proteína do tipo selvagem completa. Em alguns exemplos, o 1 aminoácido a 50 amino- ácidos (ou qualquer subintervalo destes) são inseridos em vários lo- cais não contíguos na sequência de uma proteína do tipo selvagem completa. Como pode ser apreciado na técnica, o 1 aminoácido a 50 aminoácidos podem ser inserido em uma porção da sequência de uma proteína do tipo selvagem completa que não é bem conservada entre espécies.
[0056] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos utilizados neste documento possuem o mesmo sig- nificado conforme comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Métodos e materiais são descri- tos neste documento para uso na presente invenção; outros métodos e materiais conhecidos na técnica adequados também podem ser usa- dos. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas, e não são destinados a ser um fator limitante. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, sequências, itens de banco de dados, e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por re- ferência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, servirá de base para controle.
[0057] Outros recursos e vantagens da invenção ficarão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e das figuras, bem como das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0058] A FIG. 1 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de CLRN-1 (SEQ ID NO: 40; 3397 pares de bases (bp)) que pode ser usado em qualquer um dos presen- tes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de
AAV2, um potencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma iso- forma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isoforma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 6), um sinal de po- Ili(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0059] A FIG. 2 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de CLRN-2GFP (SEQ ID NO: 41; 4177 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV?2, potencia- lizador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), um isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isoforma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 6), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma eGFP (SEQ ID NO: 32), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0060] A FIG. 3 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de CLRN-3 (SEQ ID NO: 42; 4607 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos des- critos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencia- lizador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), SUTR-291, uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), 3UTR-1357 (SEQ ID NO: 36), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0061] A FIG. 4 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de CLRN-4 (SEQ ID NO: 43; 4796 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos des- critos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencia- lizador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isofor-
ma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 6), 3UTR-1406 (SEQ ID NO: 37), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0062] A FIG. 5 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de pl TR-CBA-S'UTR-tGFP-3'UTR (5026 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), SUTR-291, tGFP (SEQ ID NO: 19), 3UTR-1595, um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV2.
[0063] A FIG. 6 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de CLRN-6eGFP (SEQ ID NO: 44; 4756 pb) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), eEGFP (SEQ ID NO: 32), 3'UTR-1406 (SEQ ID NO: 37), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0064] A FIG. 7 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de pl TR-CBA-3'UTR-600A (3982 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos des- critos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencia- lizador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 4), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isofor- ma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 6), 3 UTR-600 (SEQ ID NO: 27), um si- nal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0065] A FIG. 8 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de CLRN-8 (SEQ ID NO: 46; 3982 pb) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos des-
critos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencia- lizador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isofor- ma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 6), 3 UTR-600B (SEQ ID NO: 28), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0066] A FIG. 9 é uma representação esquemática exemplificativa de um mapa genético de um vetor de CLRN-9 (SEQ ID NO: 47; 3982 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos des- critos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencia- lizador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isofor- ma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 6), 3UTR-600C (SEQ ID NO: 29), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0067] A FIG. 10 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-O (SEQ ID NO: 39; 4732 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), 3UTR 1773 (SEQ ID NO: 15), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0068] A FIG. 11 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-7eGFP (SEQ ID NO: 45; 3580 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes mé- todos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma sequência de eGFP (SEQ ID NO: 32), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV2.
[0069] A FIG. 12 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de uma CLRN-10 (SEQ ID NO: 48; 3511 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um ín- tron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 4), uma sequência de HA (SEQ ID NO: 34), uma sequência de FP (SEQ ID NO: 30), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma iso- forma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 5), sequência de tag 3x FLAG (SEQ ID NO: 35), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0070] A FIG. 13 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-10myc (SEQ ID NO: 49; 3574 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes mé- todos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de myc (SEQ ID NO: 33), uma sequência de FP (SEQ ID NO: 30), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma sequência de tag 3x FLAG (SEQ ID NO: 35), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0071] A FIG. 14 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-10NF (SEQ ID NO: 50; 3499 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma sequência de HA (SEQ ID NO: 34), uma isoforma 2 de CLRN-1 (SEQ
ID NO: 5), uma sequência de tag 3x FLAG (SEQ ID NO: 35), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0072] A FIG. 15 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-11 (SEQ ID NO: 51; 4908 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de HA (SEQ ID NO: 34), uma sequência de FP (SEQ ID NO: 30), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isoforma 2 de CLRN-1 (SEQ ID NO: 5), sequência de tag 3x FLAG (SEQ ID NO: 35), 3 UTR-1406 (SEQ ID NO: 37), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0073] A FIG. 16 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-11myc (SEQ ID NO: 52; 4971 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes mé- todos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de myc (SEQ ID NO: 33), uma sequência de FP (SEQ ID NO: 30), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isoforma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 5), sequência de tag 3x FLAG (SEQ ID NO: 35), 3 UTR-1406 (SEQ ID NO: 37), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0074] A FIG. 17 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-11NF (SEQ ID NO: 53; 4896 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 1 de
CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de HA (SEQ ID NO: 34), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isoforma 2 de CLRN1 (SEQ ID NO: 5), sequência de 3x FLAG (SEQ ID NO: 33), 3 UTR-1406 (SEQ ID NO: 37), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0075] A FIG. 18 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-12 (SEQ ID NO: 54; 4640 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma sequência de 5'UTR-291 (SEQ ID NO:12), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de HA (SEQ ID NO: 34), 3UTR-1357 (SEQ ID NO: 36), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0076] A FIG. 19 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-13 (SEQ ID NO: 55; 4291 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 4 de CLRN1 (SEQ ID NO: 7), sequência de 3x FLAG tag (SEQ ID NO: 35), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de HA (SEQ ID NO: 34), 3UTR-600 (SEQ ID NO: 27), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV2.
[0077] A FIG. 20 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-14 (SEQ ID NO: 56; 4192 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 4 de CLRN1 (SEQ ID NO: 7), uma sequência de T2A (SEQ ID NO: 31), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), 3UTR-600 (SEQ ID NO: 27), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0078] A FIG. 21 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-15 (SEQ ID NO: 57; 3505 bpbp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes méto- dos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um potencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 4 de CLRN1 (SEQ ID NO: 7), uma sequência de 3x FLAG tag (SEQ ID NO: 35), 3 UTR-600 (SEQ ID NO: 27), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0079] A FIG. 22 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-16 (SEQ ID NO: 58; 3439 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron quimérico (SEQ ID NO: 16), uma isoforma 4 de CLRN1 (SEQ ID NO: 7), uma sequência de 3UTR-600 (SEQ ID NO: 27), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0080] A FIG. 23 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-17 (SEQ ID NO: 59; 130 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron sh-quimérico (SEQ ID NO: 26), SUTR-291 (SEQ ID NO:12), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), uma sequência de HA (SEQ IS NO: 34), 3UTR-1773 (SEQ ID NO: 15), um sinal de po- li(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV2.
[0081] A FIG. 24 é uma representação esquemática exemplificati- va de um mapa genético de um vetor de CLRN-18 (SEQ ID NO: 60; 4277 bp) que pode ser usado em qualquer um dos presentes métodos descritos neste documento. O vetor inclui uma ITR de AAV2, um po- tencializador de CMV (SEQ ID NO: 17), um promotor de B-actina de galinha, um íntron sh-quimérico (SEQ ID NO: 26), uma isoforma 1 de CLRN1 (SEQ ID NO: 1), 3UTR-1773 (SEQ ID NO: 15), um sinal de poli(A) de bGH (SEQ ID NO: 20) e uma ITR de AAV?2.
[0082] A FIG. 25 é uma imagem de um immunoblot dos níveis da proteína CLRN1 de células HEK293FT transfectadas 48 horas após a transfecção usando anticorpos anti-HA e anti-FLAG. Faixa 1 — Page- Ruler Plus Pré-corado; Faixa 2 — CLRN-10 (desnaturação a 37ºC); Faixa 3 — CLRN-11 (desnaturação a 37ºC); Faixa 4 — CLRN-12 (des- naturação a 37ºC); Faixa 5 — controle negativo; Faixa 6 — CLRN-10 (desnaturação a 56ºC); Faixa 7 — CLRN-11 (desnaturação a 56ºC); Faixa 8 — CLRN-12 (desnaturação 56ºC); Faixa 9 — controle negativo. A proteína isoforma de CLRN-1 é uma proteína glicosilada e que fre- quentemente migra como bandas de mancha.
[0083] A FIG. 26 é uma imagem de um immunoblot dos níveis de proteína CLRN1 de células HEK293FT transfectadas 48 horas após a transfecção usando um anticorpo anti-FLAG. Faixa 1 — PageRuler Plus Pré-corado; Faixa 2 — CLRN-10; Faixa 3 — CLRN-11; Faixa 4 — CLRN- 12; Faixa 5 — CLRN-13; Faixa 6 — CLRN-15; Faixa 7 — controle negati- vo
[0084] A FIG. 27 é uma imagem de um immunoblot dos níveis da proteína CLRN1 de células HEK293FT transfectadas 48 horas após a transfecção usando um anticorpo anti-FLAG. Faixa 1 — PageRuler Plus Pré-corado; Faixa 2 — CLRN-10; Faixa 3 — CLRN-10NF; Faixa 4 — CLRN-10myc; Faixa 5 — CLRN-11NF; Faixa 6 — CLRN-11myc; Faixa 7 — controle negativo. Todas as amostras foram mantidas em temperatu-
ra ambiente.
[0085] A FIG. 28 é uma imagem de um immunoblot dos níveis da proteína CLRN1 de células HEK293FT transfectadas 48 horas após a transfecção usando um anticorpo anti-myc. Faixa 1 — PageRuler Plus Pré-corado; Faixa 2 — CLRN-10; Faixa 3 — CLRN-10NF; Faixa 4 — CLRN-10myc; Faixa 5 — CLRN-11NF; Faixa 6 — CLRN-11myc; Faixa 7 — controle negativo.
[0086] A FIG. 29 é uma imagem de um immunoblot dos níveis da proteína CLRN1 colhida de células HEK293FT transfectadas 48 horas após a transfecção usando anticorpos anti-HA e anti-FLAG. Faixa 1 — PageRuler Plus Pré-corado; Faixa 2 — CLRN-13; Faixa 3 — CLRN-10; Faixa 4 — CLRN-10NF; Faixa 5 - CLRN-10myc; Faixa 6 — CLRN-11NF; Faixa 7 — CLRN-11myc; Faixa 8 — controle negativo.
[0087] A FIG. 30 é uma imagem de um immunoblot usando níveis de proteína anti-cCLRN (EKIANYKEGTYVYKTOQSEKY; SEQ ID NO: 38) de anticorpo policlonal de coelho da isoforma 1 de CLRN1 colhida de células HEK239FT transfectadas com plasmídeos descritos neste do- cumento 48 horas após a transfecção. Faixa 1 — PageRuler Plus Pré- corado; Faixa 2 — CLRN-10; Faixa 3 — CLRN-1; Faixa 4 — CLRN-2; Faixa 5 — CLRN-3; Faixa 6 — CLRN-4; Faixa 7 — CLRN-8; Faixa 8 — CLRN-9; Faixa 9 — CLRN-10; Faixa 10 — CLRN-11; Faixa 11 — CLRN- 12; Faixa 12 — CLRN-13, Faixa 13 — CLRN-14; Faixa 14 — CLRN-15; Faixa 15 — CLRN-16; Faixa 16 — controle negativo; Faixa 17 — controle negativo.
[0088] A FIG. 31 é uma imagem de um immunoblot dos níveis da proteína CLRN1 colhida de células HEK293FT transfectadas 48 horas após a transfecção usando um anticorpo policlonal de coelho anti- CLRN. Faixa 1 — PageRuler Plus Pré-corado; Faixa 2 — Anc80-CLRN- O; Faixa 3 — Anc80-CLRN-O +PNGase F; Faixa 4 — Anc80-CLRN-3; Faixa 5 — Anc80-CLRN-3 +PNGase F; Faixa 6 — Anc80-CLRN-6eGFP;
Faixa 7 — Anc80-CLRN-6eGFP +PNGase F; Faixa 8 — Anc80-CLRN- 13; Faixa 9 — Anc80-CLRN-13 +PNGase F; Faixa 10 — sem vetor; Fai- xa 11 — sem vetor +PNGase F. A proteína isoforma de CLRN-1 é uma proteína glicosilada e que frequentemente migra como bandas de mancha (faixas 2, 4 e 8). Após o tratamento com PNGase F, as ban- das de mancha desapareceram e mudaram para bandas distintas (fai- xas 3, 5e8).
[0089] A FIG. 32 é um conjunto de imagens imunofluorescentes de células HEK293FT transduzidas por AAVanc80-CLRN6eGFP tiradas 24 horas e 48 horas após a transfecção em MOI 8,41E+04 e MOI 2,53E+05, respectivamente.
[0090] A FIG. 33 é um gráfico de barras que mostra a expressão relativa de CLRN1 e GFP em células HEK293FT transduzidas com AAVanc80-CLRN-6eGFP (em MOI 1,05E+05 e MOI 3,15E+05), AA- Vanc80-CLRN-O (em MOI 8,23E+04 e MOI 2,47E+05), AAVanc80- CLRN-3 (em MOI 8,41E+04 e MOI 2,53E+04) e AAVanc80-CLRN-13 (em MOI 8,33E+04 e MOI 2,50E+05), respectivamente.
[0091] A FIG. 34 é um gráfico de barras que mostra a expressão relativa de CLRN1 e GFP em explantes cocleares P2 de camundongos WT infectados por 16 horas com AAVanc80-CLRN-6eGFP (em MOI 2,0E+05), AAVanc80-CLRN-O (em MOI 2,5E+05 e MOI 7,6E+0,5), AAVanc80-CLRN-3 (em MOI 2,0E+05 e 6,03E+05) e AAVanc80- CLRN-13 (em MOI 2,0E+05 e MOI 6,0E+05), respectivamente.
[0092] A FIG. 35 é um conjunto de imagens fluorescentes de ex- plantes cocleares P2 de camundongos WT infectados por 72 horas com 1,3E10 AAVanc80-CLRN-O VG/cóclea, 9,9E9 AAVanc80-CLRN-3 VG/cóclea e 1,0E10 AAVanc80-CLRN-13 VG/cóclea mostrando colo- ração de Myo7a e DAPI.
[0093] A FIG. 36 é um conjunto de imagens fluorescentes de ex- plantes cocleares P2 de camundongos WT infectados por 72 horas com 1E09 VG/cóclea AAV Anc80.CAG.eGFP.3'UTR mostrando colo- ração com eGFP, Myo7a e DAPI.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0094] Deficiência ou mutações na “clarina 1”, a proteína codifica- da pelo gene CLRN1, causa perda de audição e perda de visão. Por exemplo, mutações em CLRN1 levam à síndrome de Usher tipo Ill e à retinite pigmentosa.
[0095] São fornecidas neste documento composições que incluem pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: cada um dos pelo menos dois vetores diferentes compreende uma sequên- cia codificadora que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, sendo que cada uma das porções codificadas possui pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que a se- quência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas pode opcionalmente se sobrepor parcialmente à sequência de aminoácidos de uma porção codificada diferente; nenhum vetor único dos pelo me- nos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; pelo menos uma das sequências de codificação compreende uma se- quência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos de DNA genômico de CLRN1 e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons consecutivos; e quando introduzidos em uma célula de mamífero, os pelo menos dois vetores diferentes são submetidos a recombinação homóloga um com o outro, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 completa.
[0096] São fornecidas neste documento composições que incluem um único vetor de ácido nucleico, em que o vetor compreende um ou ambos dentre (i) uma primeira sequência codificadora que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1 e (ii) uma segunda sequên- cia codificadora que codifica uma segunda isoforma de proteína CLRN1, em que uma ou ambas dentre a primeira e a segunda se-
quências codificadoras compreende(m) uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos de um DNA genômico de CLRN1 e sem uma sequência intrônica entre os dois íntrons consecu- tivos.
[0097] São fornecidas neste documento composições que incluem dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes com- preende um promotor, uma primeira sequência codificadora que codifi- ca uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada 3' do promotor e uma sequência doadora de splice posicionada na extremi- dade 3' da primeira sequência codificadora; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compre- ende uma sequência aceptora de splice, uma segunda sequência codi- ficadora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splice e uma sequência sinal de poliadenilação na extremidade 3' da segunda se- quência codificadora; em que cada uma das porções codificadas pos- sui pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as sequências de aminoácidos das duas porções codificadas não se sobrepõem uma à outra; em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; e quando se intro- duz em uma célula de mamífero, o splicing ocorre entre a sequência doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 completa.
[0098] São fornecidas neste documento composições que incluem dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes com- preende um promotor, uma primeira sequência codificadora que codifi- ca uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada 3' do promotor, uma sequência doadora de splice posicionada na extremi- dade 3' da primeira sequência codificadora e um primeiro gene marca- dor detectável posicionado 3' da sequência doadora de splice; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende um segundo gene marcador detectável, uma sequência aceptora de splice posicionada 3' do segundo gene marca- dor detectável, uma segunda sequência codificadora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremida- de 3' da sequência aceptora de splice e uma sequência sinal de polia- denilação posicionada na extremidade 3' da segunda sequência codifi- cadora; em que cada uma das porções codificadas possui pelo menos resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem uma à ou- tra; em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; e quando se introduz em uma célula de mamífero, o splicing ocorre entre a sequência doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico re- combinado que codifica uma proteína CLRN1 completa.
[0099] Também são fornecidas neste documento composições que incluem dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico di- ferentes compreende um promotor, uma primeira sequência codifica- dora que codifica uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 po- sicionada 3' do promotor, uma sequência doadora de splice posiciona- da na extremidade 3' da primeira sequência codificadora e uma região recombinogênica do fago F1 posicionada 3' da sequência doadora de splice; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende uma região recombinogênica do fago F1, uma sequência aceptora de splice posicionada 3' da região re- combinogênica do fago F1, uma segunda sequência codificadora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splice e uma sequência sinal de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da segunda se- quência codificadora; em que cada uma das duas porções codificadas possui pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as sequências de aminoácidos das duas porções codificadas não se sobrepõem uma à outra; em que nenhum vetor único dos dois veto- res diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; e quando se introduz em uma célula de mamífero, o splicing ocorre entre a sequên- cia doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando as- sim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 completa.
[00100] São fornecidos neste documento métodos que incluem a introdução na cóclea de um mamífero uma quantidade terapeutica- mente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste do- cumento.
[00101] São fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em uma célula de mamí- fero que incluem a introdução de qualquer uma das composições des- critas neste documento na célula de mamífero.
[00102] São fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 em uma célula ciliada interna, uma célula ciliada externa ou ambas em uma cóclea de um mamífero que incluem: introdução de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento na cóclea do mamífero.
[00103] São fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em um olho de um ma- mífero que incluem: administração intraocular de uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento no olho do mamífero.
[00104] São fornecidos neste documento métodos de tratamento de perda auditiva em um indivíduo identificado como possuindo um gene defeituoso da CLRN1 que incluem: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento na cóclea do indivíduo.
[00105] “Também são fornecidos neste documento métodos de tra- tamento de perda de visão em um indivíduo identificado como pos- suindo um gene defeituoso da CLRN1 que incluem: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das compo- sições descritas neste documento no olho do indivíduo.
[00106] Aspectos não limitativos adicionais das composições, kits e métodos são descritos neste documento e podem ser usados em qualquer combinação sem limitação. CLRN1
[00107] O gene CLRN1 codifica a “clarina 1º (CLRN1), uma proteí- na que é expressa nas células ciliadas do ouvido interno (por exemplo, células ciliadas do ouvido interno, células ciliadas do ouvido externo) e na retina.
[00108] O gene CLRN1 humano está localizado no cromossomo
3925.1. Ele contém 7 éxons abrangendo —47 quilobases (kb) (Vastin- salo et al. (2011) Eur J Hum Genet 19(1): 30-35; NCBI Nº de Acesso NG 009168.1).
[00109] Várias mutações nos genes CLRN1 foram associadas à síndrome de Usher tipo Ill (por exemplo, síndrome de Usher tipo IIIA (MIM*606397) (ver, por exemplo, Fields et al. (2002) Am J Hum Genet 71: 607-617 e Joensuu et al. (2001) Am J Hum Genet 69: 673-684) e retinite pigmentosa (ver, por exemplo, Khan et al. (2011) Ophthalmo- logy 118: 1444-1448). Mutações causadoras da síndrome de Usher tipo Ill foram encontradas predominantemente no éxon 3 de CLRN1. À surdez da síndrome de Usher tipo Ill pode ser modelada gerando ca- mundongos deficientes em CLRN1 (ver, por exemplo, Geng et al. (2017) Sci Rep 7(1): 13480). Mutações exemplificativas associadas à CLRN1 com síndrome de Usher tipo Ill incluem: T528G, M120K, MA44K, N48K e C40G.
[00110] Mutações exemplificativas associadas à CLRN1 com retini- te pigmentosa incluem L154W e P31L (ver, por exemplo, Khan et al. (2011) Ophthalmology 118: 1444-1448).
[00111] Mutações exemplificativas adicionais em um gene CLRN1 que foram detectadas em indivíduos com perda auditiva e métodos de sequenciamento de um ácido nucleico que codifica CLRN1 são descri- tos em, por exemplo, Fields et al. (2002) Am J Hum Genet 71: 607- 617, Joensuu et al. (2001) Am J Hum Genet 69: 673-684, Adato et al. (2002) Europ J Hum Genet 10: 339-350, Aller et al. (2004), Clin Genet 66: 525-529. Os métodos de detecção de mutações em um gene são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de tais técnicas incluem: reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), PCR, sequenciamento, Southern blotting e Northern blotting.
[00112] Um exemplo de proteína CLRN1 humana do tipo selvagem é ou inclui a sequência de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: e SEQ ID NO: 7. Exemplos não limitativos de sequências nucleotídi- cas que codificam uma proteína CLRN1 do tipo selvagem são ou in- cluem SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8.
[00113] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, a proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 75% (por exemplo, pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 1.
[00114] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, a proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 75% (por exemplo, pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 3.
[00115] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, a proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 75% (por exemplo, pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 5.
[00116] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, a proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 75% (por exemplo, pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 7. Isoforma D da Proteína CLRN1 Humana do Tipo Selvagem Com- pleta (SEQ ID NO: 1)
MPSQQKKIIFCEMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVN ASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSFFPDLLKAIP VSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFIS VALWLPATRHQAQGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYK TQSEKYTTSFWVIFFCFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFAKSKDAETTNVA
ADLMY cCDNA da isoforma D da CLRN1 Humana do Tipo Selvagem (SEQ
ID NO: 2) atgccaagec caacagaaga aaatcatttt tigcatggcc ggagtattca gttttacata taccctegga gttatgacag cettagggac accgttgtag atcaaageca ctatecteta caaaacggga gctctgcteg teaatgectce agggcaggag ctaggacaadgt ttataggtga aatgcagtac ggagcttttce acggagaggg tataaggcag tataggattag gagcaaggec cttteggtte teattttttc cagatttgct caaagcaatc ccagtgagca tecacgtecaa tot- cattcte ttetetgoca tecttattat gttaaccata gtgagggacag ccettetticat gtacaatgct tttggaaaac cttttgaaac tetgcatagt cccctagggc tatacctttt gagcttcatt tcag- ttgcoc tttagetgcc agctaccagg caccaggcte aaggctectg tagctatett gtcatga- tat tgtttacctc taaagtgaaa atccatcacc teteagaaaa aattgcaaat tataaagaag ggacttatgt ctacaaaacg caaagitgaaa aatataccac ctcattctgg gtcattttct ttta- cttttt tattcatttt ctagaatgggc tectaatacg acttgctaga tttcagttoo cttttgcaaa atctaaagac gcagaaacaa ctaatgtagc tacagatcta atgtactga Isoforma A da Proteína CLRN1 Humana do Tipo Selvagem Com- pleta (SEQ ID NO: 3)
MPSQQKKIIFOMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVN ASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSFFPDLLKAIP VSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFIS GSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYKTQSEKYTTSFWVIF
FCFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFAKS KDAETTNVAADLMY CDNA da isoforma A da CLRN1 Humana do Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 4) atgccaagec caacagaaga aaatcatttt tigcatggcc ggagtattca gttttacata taccctegga gttgtgacag cettagggac accegttgtag atcraaageca ctgatecteta ca- aaacggga gctetacteg teaatgecte agggcaggag ctggacaadgt ttataggtga aa- tacagtac gggcttttece acggagaggg tgatgaggcag tatagattag gagcaaggec cttteggtte teattttttc cagatttgct caaagcaatc ccagtgagca tecacgtecaa tot- cattctc ttctetgeca tecttattat gttaaccatg gtagggacag ccettettcat gtacaatgct tttggaaaac cttttgaaac tcetgcatggt cccctagggc tatacctttt gagcttceatt teagg- ctcct gtggctatet tatcatgata ttgtttgcct ctgaagtgaa aatccatcac cteteagaaa aaattgcaaa ttataaagaa gogacttatg tetacaaaac gcaaagtgaa aaatatacca ceteattetg gateatttte ttttgctttt ttaticattt tetaaatagg ctectaatac gacttactgg atttcagttc cettttgcaa aatctaaaga cgcagaaaca actaatgtag ctgcagatct aa- tatactga Isoforma C da Proteína CLRN1 Humana do Tipo Selvagem Com- pleta (SEQ ID NO: 5)
MQALQQQPVFPDLLKAIPVSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFG KPFETLHGPLGLYLLSFISGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEG
TYVY KTQSEKYTTSFWLTKGHS cCDNA da isoforma C da CLRN1 Humana do Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 6) atgcaggc cctgcagcag caaccagttt ttccagattt gctcaaagca atcccagtga gcatccacgt caatgtcatt ctcettetetg ccatecttat tatattaacce atggtgggga cag- cettctt catgtacaat gcttttaggaa aaccttttga aactetgcat ggteccectag ggctatacct tttgagcttc atttraggcet cctatageta tettgtcatg atattgttta cctetgaagt gaaaa- tccat cacctetcag aaaaaattgc aaattataaa gaagggactt atgtctacaa aacg- caaagt gaaaaatata ccacctcatt ctggctgact aaaggccaca gcectga Isoforma E da Proteína CLRN1 Humana do Tipo Selvagem Com- pleta (SEQ ID NO: 7)
MPSQQKKIIFOMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVN ASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSCYFLDPFMG LPTGVPHLLSLPCSTSCRREHTSERVQEPAGCFSAVRSKLHAGPAAA
TSFSRFAQSNPSEHPRQCHS LLCHPYCVNHGGDSLLHVQCFWKTF cCDNA da isoforma E da CLRN1 Humana do Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 8) atgccaagec caacagaaga aaatcatttt tigcatggcc ggagtattca gttttacata taccctegga gttgtgacag cettagggac accegttgtag atcraaageca ctgatecteta ca- aaacggga gctetacteg teaatgecte agggcaggag ctggacaadgt ttataggtga aa- tacagtac gggcttttece acggagaggg tgatgaggcag tatagattag gagcaaggec cttteggtte teatgctatt ttcttgaceoc cttcataggga cteccaacag gggtacecca tttact-
cagc ctgcccetgct caacctettg caggagggag cacacgagtg aacgagtgca gga- accagct ggctacttta gtgctatgag gagtaaactc catgcaggeoc ctgcagcage aac- cagtttt tccagatttga ctcaaagecaa teccagtgag catccacgte aatgteatte tett- ctctgc catccttatt gtgttaacca tagtagggac agccttettc atgtacaatg cttttggaaa accttttga
Sequência Genômica da CLRN1 Humana do Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 9)
aggagatact tgaaggcagt ttgaaagact tgattttacag attcttagtc caaagattte 61 caattaggga gaagaagcag cagaaaagga gaaaagccaa gtatgagtga tgatgaggcc 121 tticatctact gacatttaac ctggegagaa cegtegatag taaagttgce ttttcagctag 181 ggagctatec gttcagcettc cgtaataaat gcagtcaaag aggcagtece ttcccattgc 241 teacaaaggt cttatttttg aacctegece teacagaage cgttteteat catgccaagc 301 caacagaaga aaatcatttt ttigcatggcc ggagtattca gttttacatg tagccctegga 361 gttgtgacag cettagggac acegttgtgg atraaageca ctatecteta caaaacggga 421 gctetactog teaatgecte agggcaggag ctagacaagt ttatagg- tga aatgcagtac 481 ggagctttticc acagagaggg tataaggcag tatagatigg gag- caaggcc cttteggtte 541 teatgtaagt agcaattgca tttgagttat ttaatacttt agg- cagactc ttcccagtgt 601 tacgaggaat tatatttgag aattttaceog tatttactgc agga- cttttt aaatcggtat 661 gaaccatatg aaaaacctat gactctgagc aatttettet tectag- tttt tattatttta 721 tacttgcttt ttattataat atagagttaa ttcattotta cataattaag gtttttggaa 781 atattggcaa ttaagatgct taagtattaa tatttatgta aaaaattatg gagtcttttt 841 aaaaaagtaa acttggggaa ataggaaagc tgtaaagaat gatctttatg ctttttattc 901 titataaaaa gaaccaaggt catgggctec gtatttaace aggttgccac ctttctcatg 961 attttattte ctgctececa ctecetecca ttattectgo taagaccttt ccta- ctgcta 1021 aataticagt tticattttt aactaatttg gaatcatttg gctatagaaa tttaaaatga 1081 tctactgtgc taactgggaa agaaatgagat gcctatttag tatagaacat tttaaactga 1141 ttgacctgca aatcatgtag agaatatgag agagattttc ttattatgat ttttgtgaaa 1201 tggaagtgta atccacagta tttataacct gtttatctta agaagagaat ttttaaaaat 1261 taccatgtga ataggcaact cattaaatga aaattaatag gaagtcattt gttatatctc 1321 ttacaacaca cattcagaag ttattattat tteagaaggg ctagtttaga acaaccttat 1381 gaagacacag tcagtaaatt actgcataaa tcactettca ggaaag- gagg ttaccaactg 1441 aagcatttaa aatgaattat tattttgccc aggttttttt tttetttcta gtataggtag 1501 aaggctaaat taattgaatt tattattaac atatgcagtg cctaattaaa tttcagtact 1561 ggtctattta tatttctgca acattectta tatcttetta gcagtcattg ga- caccaacc 1621 ttcagctcac ataggttact aagtgatatg aattttecata gggctecaga aaatttccaa 1681 gaattagttg ttagcttttt aattgatgaa gtggatacca gttettttea ctgaatagct 1741 titattcatt aaggtaatag goctattaga gttacttagt ttitectaggg aaggggaagg 1801 aagaaaacaa agcagaatgt catgtgatat gcaactgatat taaaaaaccg aaaaggaaaa 1861 aagttgagag agatgattta accgtgagtc ac- cggcagcc aaagcegtgag taaagcttct 1921 cacagatgaa tttagacaaa agcgga- gaag gtactggtga attttetgga gcctttacat 1981 tttetacagt gaaatggaga taaac- tttac tcatgccata ggacatgttt caaaacaata 2041 ataagatgtt ttctgaacac ttac- tacata ctaagcactt tatatacttt gtctcattta 2101 atccttacac agecacatte ttctagggtt tagegaatga tttttatggt tatatoectat 2161 gcttatecta tetaaggata aagttattct aattgaggtgc coectectttt getttectata 2221 aggacttgca gaactagtgg ggtttaaaca gtaccceteac ttateteaca gaatttcatt 2281 agcteccaga taccecetgac attctececoc tagectagtg aagaaaatct tecatttact 2341 tgattcattct gcagtgacag ctccatcaat atacaataga ctatacatat taagtgtact 2401 gtatatacta tacatgttaa aaatctcatt cattttggtg aggccecagct aagaatactt 2461 acagtagagc tttttttttt ttcctaagca taaaagtatc tttttcaatg cagcatgaga 2521 cagagttggg aaaac- caaaa taaatagatc caatggactc cccaaagagg ataatattica 2581 tttaaataaa caccccetetec agtattaaaa ctttetaatc aacatgcctt taggacacat 2641 tacaccctea aagtttacac teccattgca acgcagcttt gtggttcacg ttttttecat 2701 teagaatgte attaccctgt caatgatgtt tcatcaacgt ttgcttggat gagaatcctce 2761 tgatattctt cctgatagaa atgtataagc ccetgttcata taaatgaata aaagatctaa 2821 ccettacttte tcagtagtgg cttccttaga gcaaaaagea gggacceteca gagagcetceag 2881 gtaga- tgact cttttctagtt tetteccagag ctceaacttac aattagtgca caattcattt 2941 cccaga- atgt cttctttctt attgtagcctt tagaaagtta ttaagcaaac atttgaattce 3001 acagaa- tctt accagtgtaa gaggaatgga aaaggtaact tatcaaggta acaatcactt 3061 cgtggccagt ttttteggct cactgcaact acccecetectg ggattcaageg attetectgo 3121 ctcagectce caagtagctg ggactacagg cgtgcaccac catgcccage taattttttt 3181 tttgtatttt tagtaaagac agggtttcac catgtaggce aggctagtct catggcaagt 3241 tttctttgta ttgtoatatt attatcaatt aataggaatt tatatttcag ttetattagg 3301 tagataaaca ctattttaca tacctaaatg tttcatttat atcagcactg gccaataaaa 3361 atatactata agcaggccgg gtgcagtggc tcacgcctgt aatcccaact tttgggagge 3421 caacactttg ggaggacaca gggtcaggag atcgagacca tectagcetaa cctag- tgaaa 3481 tcccgtetet actaaaaata caaaaaatta gccgggegta gegggggege ctgtagtccc 3541 agctacttag gaggctgagg caggagaatg gcacgaaccc ggga- ggtgga gcttgcagtg 3601 agcegagate tegecactac actecagect tagtgacaga gcaagactct gtctcaaaaa 3661 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatata ta- tatatata tatatattac aagccacaag 3721 ccacatatgt acttttaaat gtcctagtag ccatattaga aaacaaaagt aaaaaggaat 3781 agatgaaatt aatttitaatg atttttttaa acccaagata tccaaaatat tatcatttta 3841 acatataatt aaaaatttat tgagatottt tacattgttt ttttttttct tagacgctagtc 3901 ttggaaatct agagtatatt ttacatttac attaca- tcta attcagtcta gecacattte 3961 acatgctcat ttttttatat gtagttttat ggagcaga- ga gtttaatagg caagaaagaa 4021 aagagaaggc agaagaaaat ggctececta tacagagacg cgggggtagg gegctccaaa 4081 gccaaaagag gaggteceta ag- tatggtag acaccagcca ggaatatatg cagtgtctgg 4141 aggaggggat gtctgattta catagggtca catgctcatt tttatagcta ctatattggt 4201 cagtacagat ttagataggg atttgctctg aacaagttag tgattgatag tottcatatt 4261 ttaattigaat ttttectgagg ttctactgta cacttgtatg tgatattagtt tcatatacaa 4321 tgacttgtato acttttaaaa cccagatata tagcataaca tgagaatgaa aaatggacca 4381 gaaaaatagt ttgg- caatgt agtcatgttt gttcctatta aatgttccct attgaccact 4441 ctatctcettt taatta- taac aagaatctgc cctgecagca tgcccagtta cgctaggaaa 4501 acttctgcct ca- tttactct ggctgattct catccactta taggtcagta gttcatttto 4561 tagaggtcac cag- cattcat acctagcata caatttcatt cattataatg aaggaatgtt 4621 ttcccttcaa aga- gacacaa ctagtgggct taatttttct taatatgtca cctgtaaaat 4681 tttaatgatg atgatt- taaac tctaaatgta gccatcaaga caaaaactgc aaattttgag 4741 ccteagtgta tatagataga tttctattte ggtaatttga aacattgcag aatatcatca 4801 aaatatgata cccaagaatc atatggtatc aatcattcct agatatactg atctattcat 4861 taccaagata gttcaatgag ctggcaaaaa catatggaat tattttctta aaatgtgaaa 4921 aataaaattt aaccaatcat gtatcacagc ttgcaacttt agtcatactt taaaaagcat 4981 tttaatttgg acctcatgat tgaaaattta taaaaagctg aacagaaatt agttcacttc 5041 atattttaga aaagcagadgt ttctttacta aatgaggcat tigacccaaa ttggagagaa 5101 aatg- ttgaaa ctacttctgt gagcaagcag gtggcettctc aaacacatgt taggatgaaa 5161 tagttaggcc teaggatete agtgcectatce actgagagtt ggcactcetct atctecatgg 5221 tetcctecaa gtgtgactct tatetettgc tgaccetgace taceccaagt gactcactgg 5281 tcatgaccoct gcacaccetig cgtetetect atcacectgc cgatggcaga gctacaaagg 5341 tctttgatgt agctetgtet gatatcctgt gttteceoct atagtctata tagaageagg 5401 tataggggta tataaagggg aagcctatga agttcatctg caaagactac ctggt- taggg 5461 gaggagagga agaagctata tagcaccattt caccagcaag catgggctet tetagcctttt 5521 agcttagggg tectattgtc tagtctcact cacctattaa aacagtccag caaatagagg 5581 ttttagtttac ctcccattaa aaaaaaagca attaatggaa tagaaga- taa taatgtatga 5641 gaagcactat tgtgaaagaa aaaccttcaa cttcteteag ccaaataatt gcttectect 5701 ctgtectteo cagaccttga tatttactct attatttcaa aa- caactata ttataaatat 5761 ttigagaatgat gtatttccct gcaaggagat cttaatccce aagaaggcag gagctgatata 5821 ttattcatcc cagtgctect teaaaccagg gectea- gaca gtgcatggcc caaagaggta 5881 cttaataaac gtttggtaaa ctgacactat tgaaattaag caacctggat ttgaggtagg 5941 tctetgocac teacaagaga ttacg- ctttg agaaaattcc atcacttcat tgattttcag 6001 ttcettacate tatatatagg agacga- tact aggtgatttc tgacatctct caccgtttaa 6061 atgctctata atctatacaa cgaggggctc gcetattctag acaagttcect tecagettta 6121 cagttgcata accettetaa tcttagtcac atgatgactc cactgacaga tttttggcca 6181 ccatcattag acatactgag ttacgtatac ctttgctcetg atcctoaaaa ctcatgattt 6241 ttaaagtttt ctgaaatatc taccatttat caggatccag atggatttca tgaccaaagt 6301 ggatgtttet tttetetece attacaatct tttacttttt gtgtgaggaaa ttgcatgtta 6361 aagaaaggga aattgaagaa taggatactt tagaattcta gcaagatgga ttagtggagtt 6421 ccagaaagta ggggcag- Ccca caaataccga aataaatgag atcgtattat tgagaaagca 6481 caaatggaag aaggtcaaaa gcaagaagaa gctgacatce tacttecteo aatttttact 6541 ttctotattt ttccaagaaa ctectettee aagecttgct gaaaaactcoc actttectaa 6601 atctaactte ttaaactgat aatggcaaga agttaggaat gaccaatatg tttaacactc 6661 caagag- tatt tattttattt tattttyaga ctgggtetoa ctetgtegte cagectagag 6721 tgcag- tagtg tgatcacagc teactgcagoe cttgaccetet ccetgcecaag gaatectece 6781 ac- ctcagcct ccetgagtaga agggaccaca ggcatgatagcc actacacctg gctaactttt 6841 aaaaaattit tttatagaga tggggttacc caggcagatce teaaactgct gggcteaage 6901 aatcctectg cattggecte ccaaagtgct ggaattatag gcataageca ctacg- cctga 6961 cctetecaag gacattettt acccagaaga ggaacttagc agaacttatc ctccaattagg 7021 tgaggaatat ggagaaaatg actttaagca aaggaacttc tagtt- ctgcc tacctaatcc 7081 agaaaaagaa gttttattte tecettecoco tagtaactat ctt- cccatat tcacataaaa 7141 aagtacagaa tcaacattgt tcaagaatta taattttact tgtaagcaca tgtgcacacg 7201 cacacccata taccttectt cectttaaat catcceca- cac cctaatagta gtaaaatcat 7261 tgacccgagc atacctggga gaggaagagg agtctgacag gggcagattc taagtggcac 7321 tectggaact taaccctagt gtata- tgaac tttacctatt gaaggatgac tecteaactg 7381 ttcteacaat ttgctactet gottt- ctttt ctaatttctg aaggtgactc atctteccea 7441 aggactttra gactteteag aagaaaaaaa tattgaggtag gtctctgcca ctggcaaaag 7501 attagacttt gagaat- cata aaagtatatc agtatatact cattaatatt gaattactat 7561 aattaatatt atgata- ttga tataatgata gaatgatatt gataaaagca atattcaata 7621 atgaatatta tttca- gctac cceacttattga ggtaccteat aggtgccagg cattttgtat 7681 gtattateta caac- ccttac atgggacata ttatgatact gtttctettg aagaaatata 7741 gaaactagaa acagagaggt caccacaatt ttccaaagtc acatagctaa taggtagcag 7801 acttgg- gatt caaattcata tgcatatggt aaatcatgct cttectetgc tacattttgc 7861 cecet- tagaa tatgaaaaag ggatacaaag agatgaagaa aatatgtaag attatcctte 7921 aatttcacta tcttttttaa agtttttttt attatacttt aaattctgaa atacatgtgc 7981 agaa- catgca ggatttattac ataggtatac acgtgccatg atggtttatt gcacccatca 8041 ac- ctgtcatc tacattaggt atttttecta atgctatcco tecectagte cececacecac 8101 cgacaagccc cgagtatatga tattecccecete cetgtgteca tgtattetea ttgttcaact 8161 ceccacttata agtigagaaca tgcggtattt ggttttctat tectacgtea gtttactgag 8221 aatgatggtt tccagcttca ttcatgttee tacaaaaggc atgaactcat tttatagcta 8281 cataccattc tatggtatac atgtgccaca ttttettaat ctagtctatc attgataggge 8341 atttggctta gttccaagte cttgctattg tagaacagtgc tgcaataaac atatgtggge 8401 atatgtcttt atagtagaat gatttataat cctttgggta tagacccagt aatagggattg 8461 ctgggtcaaa taggcatttct ggttctaggt cctteaggaa ttgccacact gtettecaca 8521 atagctgaac tagtttacac tcccaccaac agtgtaaaag cattectatt tetecacatc 8581 ctctecaaca tetgttactt cctgactttt taatgattgc cattctaatt ggagtgagat 8641 ggtatctcag tgatagtttta attagcattt ctttaatgac aagtgatgat gagctttttt 8701 tcatgtttgt tagccgtata aatgtcttct tttyagaagt gtecgttcat atcetttace 8761 cac- tttttaa cgggagttttt tettgtaaat ttgtttaact tecttataga ttctggatat 8821 tagtccttta tcagataggt agattgcaaa aattttette cattctgcag gttgccecgtt 8881 cactctgata atagtttctt tigctacgca gaagtttttt tagtttaatt agatcccatt 8941 tgtcaatttt gactittatt gccattgctt tiggtattta gtcatgaagt ctttgcccac 9001 gocctatatec tgaatggtaa tacctagatt ttcttetagg atttttatag ttttaggtct 9061 tatatitaaa tctt- taatcc atcttgagtt aatttttgta taaggtataa ggaaggggtce 9121 cagtttagtt ttcta- catat ggctagccag tttteccaac accatttatt aaatagggaa 9181 tectttecoc gtta- cttatt tttatcagat tigicaaaga gcagatggtt gtagatatat 9241 ggcattattt ctgaggcctc tgttctattt cattagtcto tatatctatt tigatacaag 9301 taccatgcta ttttagttac tagtagacttg tagtataatt tgaagtcagg tagcgtaata 9361 cctecagttt tattcttttt gcttaggatt gtcttgacta ttcaggctet tttttagttc 9421 catatgaaat ttaaagtagt tttttctaat tcetgtgaaga aagtcaatgg tagcttgatg 9481 ggaaaagcat tgaatctata agttactttg ggcagtatag ccattttecat gatattaatt 9541 cttcctatec gtgagcatgg aatgtttttc catttattta tatectttet tatttecttg 9601 agcagtagtt tatag- ttctc cttgaagagg tecatceacat cecttgtaag ttatattcct 9661 aggtatttta ttctotttat agcaattgtg aatggaagtt cactcataag tttgctetct 9721 gtttatetat tattagtata taggaatact tgtgattttt gcacattgat tttatatcct 9781 gagactttac cgaagttgact tatcagctta aggagatttt gggctgagac gacagggttt 9841 tcetaaatata caatcatcte atctgcaaac agagacaatt tgacttccte tettectatt 9901 tgaatacgct ttatttottt ctcttgectg tttgccctag ccagaacttc caatactgtg 9961 ttgaatagga gtattcacca cctattttaa gaatagtatt gaagcctcac aaaagctggt 10021 tceteatgtaa ccatcetga- ga atatttagcc ttatgacttg aattcattca ttgccttttt 10081 atttcacatt ttagtgatce tgatgtctaa atcttaatct ttgatccttg caaggtaaaa 10141 tagccaagte aagcctattt aataatattg gttgaggaag tcacatgctt atgatcaatc 10201 tttagattat gtaattatat taccttaatg ttggcagttt aggtataagg cagagatatc 10261 tgatcacatg tgtagt- tagc taatttaaga tcactgccaa ctaaaatctt catagtatga 10321 tettcaaagt tagc- tacttt gaccacagca atgatttcac cacagcaatt aacaaaatgg 10381 cagactcttt cctgaggtag catgaacagt tttaaaacaa agtcaaggac caaaagaaaa 10441 gcaggcacat ggcatttgat tcatttrcaaa aactagtatt gtattaagag ccaaggggat 10501 agaattgtag catcaattaa aatcttgttt gaaaaaaaat aaaaacaaac gtccattttt 10561 atctcetoaaa tatattaggg ttttcataaa gttataggto tatttttaaa aaaacaaaac 10621 tcatatacat tagactgaaa aatttgcctg teateteatc atagcage- taa atgcaattgt 10681 ctatggcgag atacactctt attagaggta tgatagcact aac- taatagc aaactttgta 10741 cctagtagtc taatttatgc agggttcata tttegetecoce tet- cagcatg ctgtaactgt 10801 ggcaaagcca tteteaggag ttattaccoc aacataatca tacccctata gattaggage 10861 agttaaatgg gtcctattat cagagacaca tatgtg- ccac agcegetgte atcectaage 10921 cacegtagat gattaagact cactgatggg actacctctg aataggcttg agtgaggtag 10981 atacacttca gctgagagaa attca- ggtaa ggggctgaga aaatcagatt ttgaatagtt 11041 ttatcatacc atcaggtete cttttaagtg ctggggtcat ggatttcatt caacctgacc 11101 acatagcctt tagaagcettg gctcaatacc tgagtgtgag attatgggta atattaaagg 11161 agatgaatac attgag- ctga tgtcagagaa tgtcttttac tagatttica taatgactag 11221 ctgcagatgg gctgagggga aagtcagatc aagagcattt ctgtaagaag aaagaaatct 11281 teccetettat tetetttcaa gaaaatgaat agctgagcac caagaggcca aatacttttt 11341 taaaaaacac atccttttat gtagagaagg acaggttgag acgaaaaaca gga- ccectetga 11401 aactgtcttt atagctttaa tetaggaaga aattgcggca ccattgctga catcattatc 11461 agaggctacc ttagttctga gagcettcaca gatggccttt tetgcatttt acatctggcc 11521 agatgaaggc aaaaaggttg atgaaaccaa aactattaga tcag- tagtcc ataactctag 11581 ctgcacttta gaatcatctg gggagtcctt aaaactactg atcctgaggc tecatcecag 11641 accaattgaa tcaggatete tagaggtaga ac- ctgagcat tggaatgctt taaaagttcce 11701 teagggactc taatgtgcag ccaagg- ctga gaatgactga ggtggatgagt ggccaagaca 11761 ggtgaggcca agagttagaa gocccettacta ttagggaagg cagaagecac aaggaggagg 11821 ggagggggaa ggagcagtat ttagcatttc ttecacacag ttgagggggtt ttctagatcaa 11881 aattagg- ctg ggatctttog cttccatttt catgaagate ttatgctttga tecacageca 11941 ccetgg- cctca gggcaatgag caatctgatt gatgaatttt cagtaagaaa ctgagcacac 12001 ttggcteteca gececagtag ctteccectat ticcaaatet gcecaccagt tacaggagec 12061 tgctcaccaa ctggttagagt taaagaagtc ggctetatec ttagcaggga gacctt- cagc 12121 tgatctagecc tatetatgac tacatagata aagctaccta atttggggaa cttgataggaa 12181 gatctaagct atgttctcta acagttttat cagaaataaa gttaactttt gacctecatc 12241 tgcctgtete ctatagaagg gcetetgetec ttecaaagag actetca- ggg gttcetectta 12301 gagagtatatt atcagtccaa agatcatttt agaccagcca tta- cagagga tgtccaagaa 12361 attgcacaag ggaaatagaa gtaagaatga gag- caatata tcagatagta aggaaagtat 12421 gtgactagtt ttaaataagt aattaaccat aaatccaaag ttcctgcatt agttatageca 12481 atagtcatcce acctggtcag gaaaaaaaaa gtaaaagact gagctgcaag atagaaagtt 12541 tocctgaatt ccacgtactt caaggactac tatagaggat tecttagtec caatagcagag 12601 acatg- tactc tgaccaccecca tgggccaaat ccectettace caceceteagt gattectect 12661 gggacctcac tacattgagt tettacatte cecactettt tegggggaaa tataaccectt 12721 ctgctcettct catgatatta aaaatattita gacaattact taaaatttac aacaatctte 12781 cacataaatg atctcactta tatttcttgt gagctctatg atttatttct attatcatct 12841 atg- ctgatag ttaaggaaac tgagatatcg agaccaacat gcatagtaaa tggcaaaacc 12901 agatgaattt taaactttcc taactecaaa agecacatcee taceccaacec gecatg- ctgc 12961 cgctcagtta atgcctagcet gtttatetec ccattagece ctetacecat tata- ctttga 13021 tggcacactg tattccaact gcectgagact cctggttaat gcecattacgt acagacttag 13081 gttgaattta ctaggatttt taagatttgt aggataagag atatgactgt tagactggaa 13141 tcagcaatag ataaaaggtt aacaaagttt cagaataaaa tataa- tagaa aaccccagca 13201 gatagaagta aaatgaatgg taagacaact gaaa- tgaaag ccatacattt agaaatatca 13261 aataaaacac agattaatag cagacaa- taa aggaacatac ttagcagtta gtaaaaacac 13321 titttacctt attcttatta cecetecagta accttttttt tttttttttt taagacaaag 13381 tctegctata tegtecagge tagaggagtag tgatatgatc teggcteact gcaacttcta 13441 ccetettagge tgaaga- gatt ctcctgceoc agcctectga gtagctagga ctatagggge 13501 ccatceactge acctgagctaa tttttgtatt tttagtagag acgggattte accatgttag 13561 ccaggctagt cttgaactcc tagecteagg tgatccacec gecteagect cceaaagtge 13621 tgagat- taca agcgtgagcc accaagceecg gctataaccet attgaaaata acattacttg 13681 acatgtgaga caaattattt gtaagttaaa gagtttatat gccttcaatg cteccacect 13741 teccteccct aaaaagatta ttgagtgccoc atgatgtacc taagccttet ggtagactect 13801 gagaatgtga agagagttag aggatacttg tticaacaacc cagaatctag ca- gaagtatt 13861 tigaaatgac cagccacttg ggagagctat gctagcatat cattcag- gat gggctgggtce 13921 atgttttaat aacaagtaag tttgaacttt ataggtttga aa- caaaaaag atgtatttct 13981 tgctcacagt tcatattttt tagagattigg 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cttaagct ctctggagte 35581 attctaattt gtagccagtg ctaagggttg caatataagt gaatatattt cacgtattta 35641 tcaaacattg actgagtgcc cattatgtac cagccattat aataggcact ggtgatccca 35701 cagtgaatca ggcacacaat gctgtettca cgaga- gcttagt tatctagtag gagagtcaaa 35761 caaaagtgta tatcaataat taagtgatta cagattgcaa taattacaat aagggtgata 35821 aacaggttgc tataatatac aatag- tattg cctttcacca gacatttett aaagaggtaa 35881 atcatctate agacaccttt taaaaatctc atctaattte aaaagtgtac ataaataatt 35941 aagtgattac agtttacaat aattacaatg agggtgataa acaagttgct atgaaagaga 36001 aagatagcag aga- tctggct ttgagataggt ggtcagggaa gactgctceca atagctgagt 36061 tcetaaageta agaaggaact gagaaccttc acagaacgtc ccaagtagaa gagaaagcac 36121 actgaagact ctagggaaag aggtctactt gttataggaa ccgaaagaag gcecaatatag 36181 ctaggtacta gotagigagg ggaaatggca caaggaaaaa atgaggttag agagatcagt 36241 tgataccagt taatgttgga ccctaaacat taaccatggt aagtcttt- ta gaattgattc 36301 taattgcaat gaaaaccttt tgaaagattt taaaaagata tctga- tagct gatttaccte 36361 tctaagaaat gtctagtgaa agacaatacc atcacattgg agatggaaaa agatgaatgg 36421 attctaaaaa cattctgaaa gtacattcaa aatg- tttttc aggtagctta tgcaactaat 36481 aaatagtggt ggcattctag gtaagacaag ggaggagcag gcttgcagtt tagggcaaga 36541 aaggggtago gagaagagct cagcactaaa atcatgtatt ccatttaggg cacatcgagt 36601 ctgagttgct atgagac- cac caagtggaga tgccaagtaa atagtcagtt acatgaatct 36661 ggagttcagt gaagaggtct agaagaaaga tgtatatttga ggcattattc ggatatagat 36721 attatg- taaa gcaataaaat tggatgagat cacctaggga gagaatgcac atagataaaa 36781 actgacctag gaccacttca tgtctaaaac accaaaagca atgtcaacaa aagccaaaat 36841 tgacaaatgg gatctaatta aactaaagag cttctgcaca gcaaaagaat ca- gagtigaac 36901 aggcaaccca caaaatggaa gaaaattttc acaacctact ca- tctgacaa agggctaata 36961 tccagaatct acagtgaact caaacaaatt ta- caagaaaa aaacaaacaa ccccatcraaa 37021 aagtaggtga aggacatgaa ca- gacacttc traaaagaag acatttatgc agccaaaaaa 37081 cacatgaaaa aatgct- cacc atcactggcc atcagagaaa tgcaaatcaa aaccacaatg 37141 agataccatc tcacaccagt tcaaatggca atcattamaaa agtcaggaaa caacaggtgec 37201 tagagaggat ctggagaaat aggaacactt ttacactgtt ggtaggacta taaactagtt 37261 caaccattgg ggaagtcatt gtggcgattc cteagggatc tagaactaga aatac- cattt 37321 gacccagecca teccattact gggtatatac ccaaaggact ataaatcatg ctgctataaa 37381 gacacatgca catgtatgtt tattgcggca ctattcacaa tagcaaa- gac ttggaaccaa 37441 cctaaatgtc caacaatgat agactggatt aagaaaatot ggcacatata caccatggaa 37501 tactatgcag ccataaaaaa tgatgagttc atg- tcctttg tagggacatg gatgaagctg 37561 gaaaccatca tcecteagcaa actatcg- caa ggacaaaaaa ccaaacaccg catgattctca 37621 cccataggtg ggaattgaac gatgagaaca catggacacg ggaaggggaa catcacacac 37681 tggggactat tatagggtag gaagagggag gaggagatagc attaggagat atacctaatg 37741 ctaaatgacg agttattagg tgcagcacac cagcatggca catgtataca tatgtaccta 37801 acctgcacat tgagcacacg taccctaaaa cttaaagtat aataataata aaa- taaaata 37861 aaataaaaaa acaaaaattg atgtaggacc aattcctgaa gaacac- tgac agttaatttt 37921 ttagtttagg aggaggagaa gccagcaaac gacactgagt agcaatatcc aaagaaaaag 37981 aggaaaaagg aaaactggga gattatgagt gtcccagagg gaatgatttca agattaccat 38041 cagcagtgag ctttatataa aggtag- cctc ctgtaataga ggtgcgggca ggagaaggca 38101 gaatagggaa aaggggg- tga aaaagcttcc cteaagattt ataatacagt ggaagagaga 38161 gacagagaga gagaaagaga aagagagaga gagaacttaa ggaggtagag gaagagagag 38221 aaccaaaaaa gagggagctg agtatagaag caattagatt catagttttt agttacggca 38281 gtgatatttg agtgggggcc ttttatatat tecattetag gtatttecca gttgatagga 38341 gagggtctta cctagatetga catgtaaaag ggagtaggecc agctggcaga cttgacatag 38401 atcagtggta gaacatccta gcagttctat gaatactctc tgagaa- tgac atgaaaggta 38461 ttggttcagg cctittagag gtgataaaaa ccaccaaaat gtggacttat tacaaattgt 38521 atttgttacc atttgcaatg attataatta ttctettata ta- taggcttt cttacatata 38581 gcttetetta cacatagegt catgagttat gccttetett aca- tatagtg tctgctatga 38641 gttatgccaa gcagggcaaa caaaattgct goctttottt aaaaagagga cgctcctagt 38701 atgggcctaa ttaattatga taattacagc tatgg- catgg aacataagca cattcatata 38761 cacaaagaca ataaaataaa gaacagtt- ca aaaacagaac agttacatta tatatcagtt 38821 tcagtatgaa taataccctg gac-
tctgaaa tatgtctggg gcacattatt ctataattgg 38881 tggtgaaaaa aaatctgcat cttatctcta cgccaatect tatgaaggag ctatttttca 38941 ggagttcgag aaagaga- cac agggatgtcc agtcatcaaa gcegcagage ctgaggaaga 39001 ataaaggatt tatggcagga aaacccagta atgaatgtat tctagctagtt tetcagcata 39061 gaact- tagaa aagaggccac agaaggaaaa gagaagtaat gttagacagc tgatgttage 39121 aatgggcaaa gaatttcatt ctcatataca gggcagtagc taaaggggca gtattg- tgag 39181 gaatcacatt ccaggtcatt catgtccagg gtatagtagg aggactatat ttcatttatt 39241 ttgtacatgg cccagctatg accttgtgca aggaaatgct taatcatttt ctatcacagt 39301 tgcaaagaga ttcttatcct actcagaatg tacgtettet cttetattte atttacagtc 39361 acaacccaag tcecttgcettt gacctecaaa gcaccacttg atgta- tccac ttcagaaaca 39421 cacacagaca gctcacctet ttetateoct tacettecte cecetettcac teaaaceace 39481 tacttecttt gcattcacte ttcettcage ctgaaataat cttcctecaa atatctacct 39541 teteactece teacttetot caagatacac ttaaatgatta tattccctat gaggccteco 39601 ctagecatec ctececagec ttectateoe cectetetge tttattttat tcetocttaat 39661 atatatcaca ctctgataaa ccattgaatg tacttatcaa gttattgcct ctetetecet 39721 ttccattate tecateacta agagctetgt gaagaaaagg atttgtacct gtttcattta 39781 gtgctgtacc cccagtteece acaacagege aacagg- cact caataaatag ttgttgaata 39841 agtgaataaa acagaagtag ctgacatattt tctggtaaca aatgatattc ttetgaaaat 39901 gtcatatttt cagacatatt tcegaaaata aattcaaatt agataaacat tgtattttta 39961 gaccatttct tctttacatt aatcatectt ctcaataata taacatttgt aaaacttagg 40021 ttagatatgg gctettcaac tttecattac agaagataaa gtgaaaaggc tagacccaat 40081 ggtattattc cttcatetac atcta- tcctt taggaaacaca tgaccaaatt gcttaccatc 40141 acaatctcaa aatctaccet ttggtattaa ctcacttcac ttgteccetet gtecottttt 40201 agatagtage catcggtete tagagcagtg tagagtcaga acaacttcta tttggggaag 40261 aaatcattgc tagtga- cctt actttcaatt actaactttc tagtgacatt tacataattt 40321 tagagaaaat taacac- ctac acttgtaaag ttgtaggcttt cccacaceta titatcatct 40381 ctcaatattc cttgaaaagg aaattatcaa tttatcattc tatattggca atgaaatgcc 40441 cetaatatct gtcacctata agacaattga agatgatgtg ttgaaagctt tetgaaaatg 40501 ctgatcat- ta ctttaaatgg aattgaaatt ccagtttatt atttccaaaa atatgatctt 40561 actgatca-
ta ggataacatt tcataacatt teagagattt cttececette gaggagecaa 40621 accca- tagga cctetggact cccacagatc ctggcaggga gtteccacte ataaaageac 40681 aggtgccctc agagtcattc agggatgaag aagcaacccet cattggecat gtcctacgtt 40741 ccccatatag taaggactgg aggagaccag tactcaattc tacagtetca gaca- gctgtc 40801 agaggagagt catgaatgtg cagtgtctag cacattacaa acgtttatta attgactgat 40861 cattcatggt gtgacagccc tataactcag ctatcctatt cagtca- gaaa ttaactcagt 40921 aatcaaagtc attaaaagga agaaaaaaaa aacctacagt accagacaga tggtggggaa 40981 atcagacaga tgaaaggaaa aatggctgata ggtcattgag taagacactg ggcagcaaaa 41041 cctaggcctt gtgcctagtt atac- tccaca ttatagctec agcaaggttt ggcaggattt 41101 ccacagtecect ggcttattct aacctttctt gggagcagga gcagtattgg teagatagac 41161 agacacataa ggaa- tcetgte caactggcac cgtatgaatt tagactcetta gtatacatag 41221 ataactagga aaaagaggag agagacatgt aggactgatc ctaccgatttg tgaagtctta 41281 ggcaagagta tgaatgaaaa cccacttete ttcecetgce tagctecact gcacacagta 41341 aagagcctca agcataggta tgtggacatt gcaccatgta tccaagetet gac- catgcct 41401 cttgaaacag ctattcctca gecacectet gaccatagga ggaatga- ccc aggagaaatg 41461 accacatagg tcttgaaaat gaggctcagag ctatttacga agtcaattcc ggggteccag 41521 gagtatagac taaaatgtga gtcaggcatg cca- gatggat atgttctatt gacttcaagg 41581 attccteatg ctataggaag gaaccetetec agaagagaga cagagcagaa ccctcetaaat 41641 gtggggcaca aagcaggage cecetettget ggattcaaag ggtcatacta gaagagtgata 41701 ggttgagtct tattetca- ca tcactcatat cacttacaca cttettttat agccttagca 41761 gccatgecac aaagagaaac tcttcatgca tatcttttgg tecataagtc ataaatagtt 41821 atccttgate ccatgtettt tttagageca tagacagaga gaagcaaaaa tataccaagt 41881 tca- cactgag ttgtcteoct teatatetet tagcagtcac tgaaaggtta tgagactceag 41941 gctagattte tatcctetat ccctgaaacg acaacgttga cctegtgatc aaccctagaa 42001 tccagagcaa gatcteagac totectetet actaccagac agcacacttt gttttagggg 42061 ctgtgtactt gaaatattag ctatggcaaa aggctttgag tettatgaca ccccaagtaa 42121 cttttacttt aggaatttga aatacagoct tactataatg ctgtctectt aacaaagcag 42181 tacctttgaa atatttaaca acttgaaaag gaaacegagc ttgaa-
ttttc ctttcaggta 42241 ctcaggaaat aatgtttcac ttctgtetga aattcaccat ctect- cagac aaagaaggct 42301 cttatagtaa aaggaatggc attttetcca caattttega ataaaagata aagagaaaac 42361 agcactgcag cctttttgtt aggatctaac aa- taaagaaa taatacggtt ttgccagggg 42421 agagctctgg ttttaagctc agaata- caaa aataggctga caaaatttta caaaggaata 42481 ttcteagcta ccactetgag gatggtagaa agtgaaattt caagaaaatt atattatttg 42541 attatttgat gatgattaag ctgattggcc agtcctatgt gaaattctaa agtagaagaa 42601 atgtgatgtt gtcttttcta ctcacetete cecteattece tacececcaaa tetetgeete 42661 taccccaaac ccag- cetgac ctttaggaaa ggaatagggg ctatcacttg cacegtaget 42721 cetectagecet gcagtactct ccccecacag tecagectec ctetgeteag ctaacttttc 42781 ctatag- ctcc ttctggctac ttetaaggaa cettecataa tactgcecac ceteteagta 42841 aca- goececete tactatcect tgattacata cactgtaatt ggttagtaat tgattttatg 42901 tcectetgceca aattatactce catgagagca aaaatcatga gtattatctt taatgtttaa 42961 atctccacaa ctatccococa tataagtcta gagaataaat gaatgagtga attaatgaat 43021 agaaactcaa gccattatagt taccactect aggatatttg gattaacttt aac- tgaagag 43081 taaaaagcat ttacctgtcc taaaggagac ataaaattag tggga- gagta tttggagaaa 43141 aaaaagacac tgtaatacat tcttttatat tagcctacecet gatgtagtca ggtgtcccta 43201 atatagggta ggactgaggat ttgaaataaa atacc- taatt tgacattgta agtggaggaa 43261 tcaggatttg aaaccaaatt ggtttgacct aaatcaagct attatgataa ggacttgcaa 43321 gaaaaaagga atccataaaa acca- tatgaa tagctaccaa ttagtaagca tttatatgtg 43381 tcaattacaa agcecaaatge aaatcatgct ttatttatat tagccacctt ttatagatga 43441 agaaattgag acctgaatat taaaattgcc tactittaca tagtaagtaa aggaatcagg 43501 gtttgaaccec aaattgg- ttt cacctaaggt agaaaaccat cccagcaagt ctcctattaa 43561 ctggaacccet attgtagtag cctgagatat aacagtagct gtggaagegc tatagagtcc 43621 tgg- ccatect atgtgctect gatcetagtee ctectgecac ctacttctac tecetatace 43681 atccacccat ctggaagtct cccagtgtec atcttegggg gagacactca ccagagttte 43741 cagcttccag ccagtataga gtgcccectgt cccacagcaa teteacegaa atca- cagcta 43801 catctgttaa aattaggcta ccaatgagtg atagatgagg gggaaaaata ataatagtgt 43861 actaaacaaa acaaatgttt atttittiectca cacataaaaa tctagagatt gaagtccagg 43921 gctggtccag aggctecaag gatctgggat ttaga- ctcce toetttctigt titticcacag 43981 catatagctt ccatttetgg ggccacattg gtccaaaatg tatgctaggg ctccagecat 44041 tgcatccata tttecagecac agga- aggagg aagtiggggaa gaaaggacag gcccecetaata 44101 ccetatatagt tcaagaagac tatccegece atacttecca accacectta gttgaacaat 44161 gctatet- taa ttcaagacac tcacatgtct agccaaaaat ctgaattctg ttacaaacaa 44221 ggagaataga gatgtgcgcc acctcaatac ctceatecata goctaccetttt coetttataca 44281 gctgtggcca agtgaaaget gaaggagetg tgagtaaccct tcetgaaggga ggctgagggcc 44341 tticacaaga ggoactgcatga ttgacattta tcctacatag ccta- tgaagt acagagaaat 44401 attttectett gaagccacat catagcagtg gctgctttat agcctgattc caccattata 44461 cctttaaagt gectagcaat teagecttea catcatg- caa agaggaatat ctcccagtct 44521 ttgtaagatc agcttaatte taaccacete cttacctccc actgcactec tacacgcaca 44581 cacaaatctt cttecactcag agca- gaacca taacccaagc cetaccaccet agagactgaa 44641 gaatcaggct catgatta- ca aatatgcaat aattttttgt gtagataatg tecaatgggga 44701 tgatggtaag agaa- ttcctt gatttacaca ttgacccetet tecetateco ttacaatcag 44761 gaaatatttg tcccaacacc ttatttette tattgcagge tectataget gtcttigtcat 44821 gatattgttt gcctetgaag tgaaaatocca tcacctetca gaaaaaatig caaattataa 44881 agaagggact tatgtctaca aaacgcaaag tgaaaaatat accacctcat tctgggtcat 44941 tttcttttao ttttttatto attttictgaa taggoctocta atacgacttg ctggatttca 45001 gttccctttt gcaaaatcta aagacgcaga aacaactaat gtagctgcag atctaa- tata 45061 ctgaaaggca aacctttcta taattttaca agggagtaga cttgctttag teac- ttttag 45121 atgtggttaa ttttacatat ccttttagtc tacatatatt aaagcatcag gac- ccettegt 45181 gacaatgttt acaaattacg tactaaggat acaggctgga aagtaagg- ga agcagaagga 45241 aggctttgaa aagttgatttt atctagtggg aaattgcttg ac- ccaggtag teaaaggcag 45301 ttgactagaa tegacaaatt gttactccat atatatatat gtatatatat gtatatatat 45361 gtgtatataa gatgatcttcc tatcaaaaag atatecaaagg cacatggaat atattttaat 45421 aaaaacaaat aatatctcta atatatccac acatttgttg ccagatttca gaaaactgag 45481 ctgcaatcgc tttecctaaaa cagtagtgta ttaaa- tgaac atctataaaa tgtatcaaca 45541 cacattttaa aaaatttgtt taaagtatac tct-
taggcca ggcgtagtga ctcacaccectg 45601 taattccagc acttcaggag gecaagg- tag gaagatcatt tgagttcagg agttcgagtt 45661 acagcctggg caataaagtg agaccctgtc actaacaaaa ttaaaaaata aaataaatat 45721 aaaatatagg ctt- taaaaaa gcatagtctt attaaccatg tctattggtc aaaatctgca 45781 aactctaaaa gaagaaaaga agaaaaaacc aagcttaggg tatttttecct ccegtgcctga 45841 ag- tcccaatt acattcacga cagtactttc aatgaacata attgttagga ccactgagga 45901 atcatgaaaa atgatctctg cttagtacat ttgatgcaaa atgacttatt aggggctatt 45961 tttctagcta tagtgtctog agtactaata tgcaattatg aaaattatat taaatctagg 46021 attatgacgg tatcactgta tcatcttggt cttattctgg ctgteaccaa gcatgaceca 46081 ggtcaacttt tttttteccoc tgaattaccc atcaaattga tetgcageta actaaaggcc 46141 acagctgagc ctggaactga ccocttectte atccteaace tactgtecte cagaaagcac 46201 caaggaaaaa gcagagaatg acagcaaaca gatcactagg cctetgacea caggtgctga 46261 gtactcagca gceccteatat aataggttta aaagtactcc ttaaaa- taaa acactgtttc 46321 cotttagaac tatttacaag gatgaaacaa ccoegtatacet gagaaataac ttgctctggt 46381 gtcaattcgc tattegeccag cagacatcag aaca- caccga gtttccagat gctagttttt 46441 cecettaaat caggaaatac acctggacaa tttctagaag actacaattc agtctagcca 46501 caaaggggat tttttttttt tagtaacagg ctagagcccg gttctgtaag tetttagcta 46561 aaatggtcca gtacaaaage actaga- aatg agtgggctag gaggacaagg accgtetect 46621 gegtgaggag ttagttagag gtccccaagg ccaggatacec cetgcactcet tattagattc 46681 ctetetatet tettggagtt ttgaaaaact ccttegaaca ccaggctttt ttetttagaa 46741 aacaagtcte caategttet ctgttccgta gaaagagaaa gaaaacctgg agcagctgct 46801 gaaaaatcta atgaggaact aagaggcaaa cccacca
[00117] Um exemplo não limitativo de uma sequência de DNA ge- nômico de CLRN1 humana do tipo selvagem é a SEQ ID NO: 9. Os éxons na SEQ ID NO: 9 são: posições de nucleotídeo 1-544 (éxon 1), posições de nucleotídeo 28764-29180 (éxon 2), posições de nucleotí- deo 31239-31418 (éxon 3), posições de nucleotídeo 32481-32519 (éxon 4), posições de nucleotídeo 44799-46433 (éxon 5), posições de nucleotídeo 44799-44935 (éxon 6) e posições de nucleotídeo 46128-
46837 (éxon 7). Os íntrons estão localizados entre cada par desses exons na SEQ ID NO: 9, ou seja, nas posições de nucleotídeo 545- 28763 (íntron 1), posições de nucleotídeo 29181-31238 (íntron 2), po- sições de nucleotídeo 31419-32480 (íntron 3), posições de nucleotídeo 32520-44798 (íntron 4) e posições de nucleotídeo 44936-46127 (íntron 7). Isoforma 1 da Proteína CLRN1 de Camundongo (SEQ ID NO: 10)
MPSQQKKIIFCEMAGVLSFLCALGVVTAVGTPLWVKATILCKTGALLVN ASGKELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSSRSMKERYS LYEDKGETAVFPDLVQAIPVSIHINIILESMILVVLTMVGTAFFMYNAFG KPFETLHGPLGLYLVSFISGSCGCLVMILFASEVKVHRLSEKIANFKEG TYAYRTQNENYTTSFWVVFICFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFTKSKETE
TTNVASDLMY Proteína CLRN1 de Cão (SEQ ID NO: 11)
MPNQQKKVVFCTAGVLSFVCALGVVTALGTPLWIKATFLCKTGALLV NASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGIRQCGLGARPFRFSLFPDLLKVIP VSIHVNVILFSTILVVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFIS GSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYAYKTOSEKYTTSFWVV
FICFLVHLLNGLLIRLAGFQFPFAKS KDTETTNVAADLMY Vetores
[00118] As composições fornecidas neste documento incluem pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) vetores de ácido nucleico, em que: cada um dos pelo menos dois vetores diferen- tes inclui um sequência codificadora que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, sendo que cada uma das porções codifica- das tem pelo menos 30 aminoácidos (por exemplo, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 202 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 80 ami- noácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 30 aminoáci- dos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 202 aminoáci- dos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 60 ami- noácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 202 aminoá- cidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 202 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 202 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 202 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 202 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 190 aminoácidos a cerca de 202 aminoácidos, or cerca de 190 aminoáci- dos a cerca de 200 aminoácidos) de comprimento.
[00119] Em algumas modalidades dessas composições, pelo me- nos uma das sequências codificadoras inclui uma sequência nucleotí- dica que abrange dois éxons consecutivos do DNA genômico de CLRN1 (por exemplo, éxons 1 e 2, ou éxons 5 e 6), e sem a sequência intrônica que ocorre naturalmente entre os dois éxons consecutivos.
[00120] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de nenhuma das porções codificadas se sobrepõe, nem mesmo em parte, à sequência de aminoácidos de uma das porções codificadas diferen-
te. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma ou mais das porções codificadas se sobrepõe parcialmente com a se- quência de aminoácidos de uma das porções codificadas diferente. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas se sobrepõe parcialmente à sequência de aminoácidos de uma porção codificada diferente.
[00121] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos so- breposta tem de cerca de 30 resíduos de aminoácidos e cerca de 202 aminoácidos (por exemplo, ou qualquer um dos subintervalos deste intervalo descritos neste documento) de comprimento.
[00122] Em alguns exemplos, os vetores incluem dois vetores dife- rentes, cada um dos quais compreendendo um segmento diferente de um fíntron, em que o íntron inclui a sequência nucleotídica de um íntron que está presente em um DNA genômico de CLRN1 (por exemplo, qualquer um dos íntrons exemplificativos na SEQ ID NO: 9 descritos neste documento), e em que os dois segmentos diferentes se sobre- põem em sequência por pelo menos 100 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleo- tídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de
3.500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 3.000 nu- cleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleo- tídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotí-
deos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cer- ca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotí- deos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 200 nu- cleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de
1.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 800 nucleo- tídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 400 nucle- otídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de
4.500 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 4.000 nu- cleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 400 nucleo- tídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de
1.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 800 nucleo- tídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 600 nu- cleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de
4.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 3.500 nu- cleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleo- tídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucle-
otídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleo- tídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
2.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 2.000 nu- cleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de
1.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotí- deos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
3.500 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 3.000 nu- cleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotí- deos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cer- ca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de
1.500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotí- deos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de
3.500 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 3.000 nu- cleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotí- deos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cer- ca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de
2.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 2.000 nu- cleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de
3.500 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 3.000 nu- cleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotí- deos, cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos,
cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de
2.500 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 2.500 nu- cleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de
3.000 nucleotídeos, cerca de 3.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 3.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotí- deos, cerca de 3.000 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cer- ca de 3.000 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de
3.000 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 3.500 nu- cleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 3.500 nucleotí- deos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 3.500 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 3.500 nucleotídeos a cerca de
4.000 nucleotídeos, cerca de 4.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 4.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotí- deos, cerca de 4.000 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cer- ca de 4.500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos cerca de
4.500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, or cerca de 5.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos) de comprimento.
[00123] A sequência nucleotídica sobreposta em quaisquer dois dos vetores diferentes pode incluir uma parte ou a totalidade de um ou mais éxons de um gene CLRN1 (por exemplo, qualquer um ou mais dos éxons exemplificativos na SEQ ID NO: 9 descritos neste documen- to).
[00124] Em algumas modalidades, o número de vetores diferentes na composição é dois, três, quatro ou cinco. Em composições em que o número de vetores diferentes na composição é dois, o primeiro dos dois vetores diferentes pode incluir uma sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal da proteína CLRN1. Em alguns exem- plos, a porção N-terminal do gene CLRN1 tem de cerca de 30 aminoá- cidos a cerca de 202 aminoácidos (ou qualquer uma das subfaixas desta faixa descritas acima) de comprimento. Em alguns exemplos, o primeiro vetor inclui ainda um ou ambos dentre um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento ou conhecidos na técnica) e uma sequência de Kozak (por exemplo, qualquer uma das sequências de Kozak exemplificativas descritas neste documento ou conhecidas na técnica). Em alguns exemplos, o primeiro vetor inclui um promotor que é um promotor induzível, um promotor constitutivo ou um promotor tecido-específico. Em alguns exemplos, o segundo dos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal da proteína CLRN1. Em alguns exemplos, a porção C-terminal da proteína CLRN1 tem de 30 aminoácidos a cerca de 202 aminoácidos (ou qualquer um dos subintervalos deste intervalo descritos acima) de comprimento. Em alguns exemplos, o segundo vetor inclui ainda uma sequência si- nal de poliadenilação.
[00125] Em alguns exemplos em que o número de vetores diferen- tes na composição é dois, a porção N-terminal codificada por um dos dois vetores pode incluir uma porção que compreende a posição de aminoácido 1 a qualquer um dos seguintes: por volta da posição de aminoácido 202, por volta da posição de aminoácido 200, por volta da posição de aminoácido 190, por volta da posição de aminoácido 180, por volta da posição de aminoácido 170, por volta da posição de ami- noácido 160, por volta da posição de aminoácido 150, por volta da po- sição de aminoácido 140, por volta da posição de aminoácido 130, por volta da posição de aminoácido 120, por volta da posição de aminoá- cido 110, por volta da posição de aminoácido 100, por volta da posição de aminoácido 90, por volta da posição de aminoácido 80, por volta da posição de aminoácido 70, por volta da posição de aminoácido 60, por volta da de aminoácido 50 ou por volta da posição de aminoácido 40 de uma proteína CLRN1 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO:
1,3, 5 0u7).
[00126] Em alguns exemplos em que o número de vetores diferen- tes na composição é dois, a porção N-terminal da proteína precursora CLRN1 pode incluir uma porção que compreende da posição de ami- noácido 1 até a posição de aminoácido 202, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 200, da posição de aminoá- cido 1 até por volta da posição de aminoácido 190, da posição de ami- noácido 1 até por volta da posição de aminoácido 180, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 170, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 160, da posi- ção de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 150, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 140, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 130, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoá- cido 120, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de ami- noácido 110, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 100, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 90, da posição de aminoácido 1 até por volta da posi- ção de aminoácido 80, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 70, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 60, da posição de aminoácido 1 até por vol- ta da posição de aminoácido 50, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 40, da posição de aminoácido 1 até por volta da posição de aminoácido 30 de uma proteína CLRN1 de tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7). Conforme usado neste documento, o termo "vetor" significa uma composição que inclui um polinucleotídeo capaz de transportar pelo menos um fragmento de ácido nucleico exógeno, por exemplo, um vetor de plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial (por exemplo, um cromossomo artificial humano (HAC), um cromossomo artificial de le-
vedura (YAC), um cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cro- mossomo artificial derivado de P1 (PAC)), um vetor viral (por exemplo, quaisquer vetores adenovirais (por exemplo, pSV ou vetores de pCMV) ou quaisquer vetores retrovirais conforme descritos neste do- cumento) e quaisquer vetores GatewayO. Um vetor pode, por exem- plo, incluir elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedei- ra de mamífero ou em um sistema de expressão in vitro. O termo "ve- tor" inclui qualquer elemento genético (por exemplo, um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial, um vetor viral, etc.) que é capaz de se replicar quando associado aos elementos de controle adequados. Assim, o termo inclui vetores de clonagem e de expressão, bem como vetores virais (por exemplo, um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus ou um vetor de retrovírus).
[00127] Os vetores incluem todos aqueles conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados) que incorporam o polinucleotídeo recombinan- te. Médicos qualificados serão capazes de selecionar vetores e células de mamíferos adequados para a produção de qualquer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento. Em algumas modalidades, o ve- tor é um plasmídeo (ou seja, uma molécula de DNA circular que pode se replicar autonomamente dentro de uma célula). Em algumas moda- lidades, o vetor pode ser um cosmídeo (por exemplo, as séries pWE e sCos (Wahl et al. (1987), Evans et al. (1989)).
[00128] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cro- mossomo artificial. Um cromossomo artificial é um cromossomo gene- ticamente manipulado que pode ser usado como um vetor para trans- portar grandes inserções de DNA. Em algumas modalidades, o cro-
mossomo artificial é cromossomo artificial humano (HAC) (ver, por exemplo, Kouprina et al., Expert Opin. Drug Deliv 11(4): 517-535, 2014; Basu et al., Pediatr. Clin. North Am. 53: 843-853, 2006; Ren et al., Stem. Cell Rev. 2(1):43-50, 2006; Kazuki et al., Mol. Ther. 19(9):1591- 1601, 2011; Kazuki et al., Gen. Ther. 18: 384-393, 2011; e Katoh et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 321:280-290, 2004).
[00129] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cro- mossomo artificial de levedura (YAC) (ver, por exemplo, Murray et al., Nature 305: 189-193, 1983; lkeno et al. (1998) Nat. Biotech. 16:431- 439, 1998). Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cro- mossomo bacteriano artificial (BAC) (por exemplo, pBeloBAC11, pECBAC1 e pBAC108L). Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC). Exemplos de cromossomos artificiais são conhecidos na técnica.
[00130] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vetor viral (por exemplo, vírus adenoassociado, adenovírus, lentivírus e re- trovírus). Exemplos não limitativos de vetores virais são descritos nes- te documento. Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um ve- tor viral adenoassociado (AAV) (ver, por exemplo, Asokan et al., Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012). Os vetores de AAV recombinantes, ou "rA- AVs", são tipicamente compostos de, no mínimo, um transgene, ou uma porção deste, e uma sequência reguladora e, opcionalmente, re- petições de terminal invertidas (ITRs) de AAV 5' e 3º. Esse vetor de AAV recombinante é empacotado em um capsídeo e distribuído a uma célula-alvo selecionada (por exemplo, uma célula ciliada coclear).
[00131] As sequências de AAV do vetor tipicamente compreendem as sequências de ITR de ação cis 5' e 3' (Ver, por exemplo, B. J. Car- ter, em "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168, 1990). As sequências típicas de ITR de AAV têm cerca de 145 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, incorpo-
ra-se pelo menos 75% de uma sequência de ITR típica (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%) no vetor de AAV. A capacidade de modificar essas sequências de ITR está dentro da habilidade da técnica. (Ver, por exemplo, textos como Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, 1989; e K. Fisher et al., J Virol. 70:520 532, 1996). Em algumas modalidades, qualquer uma das sequências codificadoras descritas neste documento é flan- queada por sequências ITR de AAV 5' e 3º nos vetores de AAV. As sequências de ITR de AAV podem ser obtidas a partir de qualquer AAV conhecido, incluindo os tipos de AAV atualmente identificados.
[00132] Os vetores de AAV como descritos neste documento po- dem incluir qualguer um dos elementos reguladores descritos neste documento (por exemplo, um ou mais de um promotor, uma sequência sinal de poliadenilação (poli (A)) e um IRES).
[00133] Em algumas modalidades, o vetor de AAV é selecionado do grupo que consiste em: um vetor de AAV1, um vetor de AAV2, um ve- tor de AAV3, um vetor de AAV4, um vetor de AAV5, um vetor de AAV6, um vetor de AAV7, um vetor de AAV8, um vetor de AAV9, um vetor de AAV2.7m8, um vetor de AAV8BP2 e um vetor de AAV293. Vetores de AAV exemplificativos adicionais que podem ser usados neste documento são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Ka- naan et al., Mol. Ther. Nucleic Acids 8:184-197, 2017; Li et al., Mol. Ther. 16(7): 1252-1260; Adachi et al., Nat. Commun. 5: 3075, 2014; Isgrig et al., Nat. Commun. 10(1): 427, 2019; and Gao et al., J. Virol. 78(12): 6381-6388.
[00134] Em algumas modalidades, um vetor de AAV fornecido nes- te documento inclui ou consiste em uma sequência que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pe-
lo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica) às SEQ ID NO: 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60. Em algumas modalidades, o(s) vetor(s) é(são) um adenoví- rus (ver, por exemplo, Dmitriev et al. (1998) J. Virol. 72: 9706-9713; e Poulin et al., J. Virol 8: 10074-10086, 2010). Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um retrovírus (ver, por exemplo, Maier et al. (2010) Future Microbiol 5: 1507-23).
[00135] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um lentiví- rus (ver, por exemplo, Matrai et al. (2010) Mol Ther. 18: 477-490; Ba- nasik et al. (2010) Gene Ther. 17:150-7; and Wanisch et al. (2009) Mol. Ther. 17: 1316-32). Um vetor lentiviral refere-se a um vetor deri- vado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluin- do, em especial, um vetor lentiviral autoinativante conforme descrito em Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Os vetores de lentivírus não limitativos que podem ser usados na clínica incluem a tecnologia de distribuição de gene LENTIVECTORO da Oxford BioMe- dica, o sistema de vetor LENTIMAXTY da Lentigen e semelhantes. Ou- tros tipos de vetores lentivirais também estão disponíveis e seriam co- nhecidos por uma pessoa versada na técnica.
[00136] Os vetores fornecidos neste documento podem ter tama- nhos diferentes. A escolha do vetor que é usado em qualquer uma das composições, kits e métodos descritos neste documento pode depen- der do tamanho do vetor.
[00137] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um plasmí- deo e pode(m) incluir um comprimento total de até cerca de 1 kb, até cerca de 2 kb, até cerca de 3 kb, até cerca de 4 kb, até cerca de 5 kb, até a cerca de 6 kb, até cerca de 7 kb, até cerca de 8 kb, até cerca de 9 kb, até cerca de 10 kb, até cerca de 11 kb, até cerca de 12 kb, até cerca de 13 kb, até cerca de 14 kb ou até cerca de 15 kb. Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um plasmídeo e pode(m) ter um comprimento total em um intervalo de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 1 kb a cerca de 6 kb, cerca de 1 kba cerca de 7 kb, cerca de 1 kb a cerca de 8 kb, cerca de 1 kb a cerca de 9 kb, cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, cerca de 1 kb a cerca de 11 kb, cerca de 1 kb a cerca de 12 kb, cerca de 1 kb a cerca de 13 kb, cerca de 1 kb a cerca de 14 kb ou cerca de 1 kb a cerca de 15 kb.
[00138] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um trans- poson (por exemplo, PiggyBac"'Y transposon) e pode(m) incluir mais de 200 kb. Em alguns exemplos, o(s) vetor(es) é(são) um transposon com um comprimento total no intervalo de cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, cerca de 1 kb a cerca de 20 kb, cerca de 1 kb a cerca de 30 kb, cerca de 1 kb a cerca de 40 kb, cerca de 1 kb a cerca de 50 kb, cerca de 1 kb a cerca de 60 kb, cerca de 1 kb a cerca de 70 kb, cerca de 1 kb a cerca de 80 kb, cerca de 1 kb a cerca de 90 kb, cerca de 10 kba cerca de 20 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 10 kb a cer- ca de 40 kb, cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, cerca de 10 kb a cerca de 60 kb, cerca de 10 kb a cerca de 70 kb, cerca de 10 kb a cerca de 90 kb, cerca de 10 kb a cerca de 100 kb, cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 20 kb a cerca de 50 kb, cerca de 20 kb a cerca de 60 kb, cerca de 20 kb a cerca de 70 kb, cer- ca de 20 kb a cerca de 80 kb, cerca de 20 kb a cerca de 90 kb, cerca de 20 kb a cerca de 100 kb, cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, cerca de kb a cerca de 50 kb, cerca de 30 kb a cerca de 60 kb, cerca de 30 kb a cerca de 70 kb, cerca de 30 kb a cerca de 80 kb, cerca de 30 kb a cerca de 90 kb, cerca de 30 kb a cerca de 100 kb, cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, cerca de 40 kb a cer- ca de 70 kb, cerca de 40 kb a cerca de 80 kb, cerca de 40 kb a cerca de 90 kb, cerca de 40 kb a cerca de 100 kb, cerca de 50 kb a cerca de
60 kb, cerca de 50 kb a cerca de 70 kb, cerca de 50 kb a cerca de 80 kb, cerca de 50 kb a cerca de 90 kb, cerca de 50 kb a cerca de 100 kb, cerca de 60 kb a cerca de 70 kb, cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, cer- ca de 60 kb a cerca de 90 kb, cerca de 60 kb a cerca de 100 kb, cerca de 70 kb a cerca de 80 kb, cerca de 70 kb a cerca de 90 kb, cerca de 70 kb a cerca de 100 kb, cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, cerca de 1 kb a cerca de 100 kb, cerca de 100 kb a cerca de 200 kb, cerca de 100 kb a cerca de 300 kb, cerca de 100 kb a cerca de 400 kb ou cerca de 100 kb a cerca de 500 kb.
[00139] Em algumas modalidades, o vetor é um cosmídeo e pode ter um comprimento total de até 55 kb. Em alguns exemplos, o vetor é um cosmídeo e tem um número total de nucleotídeos de cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, cerca de 1 kb a cerca de 20 kb, cerca de 1 kb a cer- ca de 30 kb, cerca de 1 kb a cerca de 40 kb, cerca de 1 kb a cerca de 50 kb, cerca de 1 kb a cerca de 55 kb, cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 10 kb a cerca de 40 kb, cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, cerca de 10 kb a cerca de 55 kb, cer- ca de 15 kb a cerca de 55 kb, cerca de 15 kb a cerca de 50 kb, cerca de 15 kb a cerca de 40 kb, cerca de 15 kb a cerca de 30 kb, cerca de kb a cerca de 20 kb, cerca de 20 kb a cerca de 55 kb, cerca de 20 kb a cerca de 50 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, cerca de 25 kb a cerca de 55 kb, cerca de 25 kb a cer- ca de 50 kb, cerca de 25 kb a cerca de 40 kb, cerca de 25 kb a cerca de 30 kb, cerca de 30 kb a cerca de 55 kb, cerca de 30 kb a cerca de 50 kb, cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, cerca de 35 kb a cerca de 55 kb, cerca de 40 kb a cerca de 55 kb, cerca de 40 kb a cerca de 50 kb ou cerca de 45 kb a cerca de 55 kb.
[00140] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cro- mossomo artificial e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de cerca de 100 kb a cerca de 2000 kb. Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um cromossomo artificial humano (HAC) e pode(m) ter um número total de nucleotídeos na faixa de cer- ca de 1 kb a cerca de 10 kb, 1 kb a cerca de 20 kb, cerca de 1kba cerca de 30 kb, cerca de 1 kb a cerca de 40 kb, cerca de 1 kb a cerca de 50 kb, cerca de 1 kb a cerca de 60 kb, cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 10 kb a cerca de 40 kb, cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, cerca de 10 kb a cerca de 60 kb, cer- ca de 20 kb a cerca de 30 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 20 kb a cerca de 50 kb, cerca de 20 kb a cerca de 60 kb, cerca de kb a cerca de 40 kb, cerca de 30 kb a cerca de 50 kb, cerca de 30 kb a cerca de 60 kb, cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, cerca de 40 kb a cerca de 60 kb ou cerca de 50 kb a cerca de 60 kb.
[00141] Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um cromossomo artificial de levedura (YAC) e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 1000 kb. Em algumas modalida- des, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um YAC com um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 100 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 100 kb a cerca de 900 kb, cerca de 100 kb a cerca de 800 kb, cerca de 100 kb a cerca de 700 kb, cerca de 100 kb a cerca de 600 kb, cerca de 100 kb a cerca de 500 kb, cerca de 100 kb a cerca de 400 kb, cerca de 100 kb a cerca de 300 kb, cerca de 100 kb a cerca de 200 kb, cerca de 200 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 200 kb a cerca de 900 kb, cerca de 200 kb a cerca de 800 kb, cerca de 200 kb a cerca de 700 kb, cerca de 200 kb a cerca de 600 kb, cerca de 200 kb a cerca de 500 kb, cerca de 200 kb a cerca de 400 kb, cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, cerca de 300 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 300 kb a cerca de 900 kb, cerca de 300 kb a cerca de 800 kb, cerca de 300 kb a cerca de 700 kb, cerca de 300 kb a cerca de 600 kb, cerca de 300 kb a cerca de 500 kb, cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, cerca de 400 kb a cerca de
1.000 kb, cerca de 400 kb a cerca de 900 kb, cerca de 400 kb a cerca de 800 kb, cerca de 400 kb a cerca de 700 kb, cerca de 400 kb a cerca de 600 kb, cerca de 400 kb a cerca de 500 kb, cerca de 500 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 500 kb a cerca de 900 kb, cerca de 500 kb a cerca de 800 kb, cerca de 500 kb a cerca de 700 kb, cerca de 500 kb a cerca de 600 kb, cerca de 600 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 600 kb a cerca de 900 kb, cerca de 600 kb a cerca de 800 kb, cerca de 600 kb a cerca de 700 kb, cerca de 700 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 700 kb a cerca de 900 kb, cerca de 700 kb a cerca de 800 kb, cerca de 800 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 800 kb a cerca de 900 kb ou cerca de 900 kb a cerca de 1.000 kb.
[00142] Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um cromossomo artificial bacteriano (BAC) e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 750 kb. Em algumas modalidades, o(s) crossomo(s) artificial(is) é(são) um BAC e pode(m) ter um número total de nucleotídeos no intervalo de cerca de 100 kb a cerca de 750 kb, cerca de 100 kb a cerca de 700 kb, cerca de 100 kb a cerca de 600 kb, cerca de 100 kb a cerca de 500 kb, cerca de 100 kb a cerca de 400 kb, cerca de 100 kb a cerca de 300 kb, cerca de 100 kb a cerca de 200 kb, cerca de 150 kb a cerca de 750 kb, cerca de 150 kb a cerca de 700 kb, cerca de 150 kb a cerca de 600 kb, cerca de 150 kb a cerca de 500 kb, cerca de 150 kb a cerca de 400 kb, cerca de 150 kb a cerca de 300 kb, cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, cerca de 200 kb a cerca de 750 kb, cerca de 200 kb a cerca de 700 kb, cerca de 200 kb a cerca de 600 kb, cerca de 200 kb a cerca de 500 kb, cerca de 200 kb a cerca de 400 kb, cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, cerca de 250 kb a cerca de 750 kb, cerca de 250 kb a cerca de 700 kb, cerca de 250 kb a cerca de 600 kb, cerca de 250 kb a cerca de 500 kb, cerca de 250 kb a cerca de 400 kb, cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, cerca de 300 kb a cerca de 750 kb, cerca de 300 kb a cerca de 700 kb, cerca de 300 kb a cerca de 600 kb, cerca de 300 kb t o cerca de 500 kb, cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, cerca de 350 kb a cerca de 750 kb, cerca de 350 kb a cerca de 700 kb, cerca de 350 kb a cerca de 600 kb, cerca de 350 kb a cerca de 500 kb, cerca de 350 kb a cerca de 400 kb, cerca de 400 kb a cerca de 750 kb, cerca de 400 kb a cerca de 700 kb, cerca de 450 kb a cerca de 600 kb, cerca de 450 kb a cerca de 500 kb, cerca de 500 kb a cerca de 750 kb, cerca de 500 kb a cerca de 700 kb, cerca de 500 kb a cerca de 600 kb, cerca de 550 kb a cerca de 750 kb, cerca de 550 kb a cerca de 700 kb, cerca de 550 kb a cerca de 600 kb, cerca de 600 kb a cerca de 750 kb, cerca de 600 kb a cerca de 700 kb, ou cerca de 650 kb a cerca de 750 kb.
[00143] Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC) e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 300 kb. Em algumas modali- dades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) derivado(s) de P1 pode(m) ter um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 100 kb a cerca de 300 kb, cerca de 100 kb a cerca de 200 kb ou cerca de 200 kb a cerca de 300 kb.
[00144] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vetor viral pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 10 kb. Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) viral(is) pode(m) ter um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, 1kba cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de kb, cerca de 1 kb a cerca de 6 kb, cerca de 1 kb a cerca de 7 kb, cerca de 1 kb a cerca de 8 kb, cerca de 1 kb a cerca de 9 kb, cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2kba cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 6 kb, cerca de 2 kb a cerca de 7 kb, cerca de 2 kb a cerca de 8 kb, cerca de 2 kb a cerca de 9 kb, cerca de 2 kb a cerca de 10 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 6 kb, cerca de 3 kb a cerca de 7 kb, cerca de 3 kb a cerca de 8 kb, cerca de 3 kb a cerca de 9 kb, cerca de 3 kb a cerca de 10 kb, cerca de 4 kb a cerca de 5 kb, cerca de 4 kb a cerca de 6 kb, cerca de 4 kb a cerca de 7 kb, cerca de 4 kb a cerca de 8 kb, cerca de 4kba cerca de 9 kb, cerca de 4 kb a cerca de 10 kb, cerca de 5 kb a cerca de 6 kb, cerca de 5 kb a cerca de 7 kb, cerca de 5 kb a cerca de 8 kb, cerca de 5 kb a cerca de 9 kb, cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, cerca de 6 kb a cerca de 7 kb, cerca de 6 kb a cerca de 8 kb, cerca de 6 kb a cerca de 9 kb, cerca de 6 kb a cerca de 10 kb, cerca de 7 kb a cerca de 8 kb, cerca de 7 kb a cerca de 9 kb, cerca de 7 kb a cerca de 10 kb, cerca de 8 kb a cerca de 9 kb, cerca de 8 kb a cerca de 10 kb, ou cer- ca de 9 kb a cerca de 10 kb.
[00145] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um lentiví- rus e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 8 kb. Em alguns exemplos, o lentivírus pode ter um número total de nucleotí- deos de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 1 kb a cerca de 6 kb, cerca de 1 kb a cerca de 7 kb, cerca de 1 kba cerca de 8 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 6 kb, cerca de 2 kb a cerca de 7 kb, cerca de 2 kb a cerca de 8 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kba cerca de 6 kb, cerca de 3 kb a cerca de 7 kb, cerca de 3 kb a cerca de 8 kb, cerca de 4 kb a cerca de 5 kb, cerca de 4 kb a cerca de 6 kb, cerca de 4 kb a cerca de 7 kb, cerca de 4 kb a cerca de 8 kb, cerca de kb a cerca de 6 kb, cerca de 5 kb a cerca de 7 kb, cerca de 5kba cerca de 8 kb, cerca de 6 kb a cerca de 8kb, cerca de 6 kb a cerca de 7 kb, ou cerca de 7 kb a cerca de 8 kb.
[00146] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um adeno- vírus e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 8 kb. Em algumas modalidades, o adenovírus pode ter um número total de nu- cleotídeos na faixa de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1kba cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de kb, cerca de 1 kb a cerca de 6 kb, cerca de 1 kb a cerca de 7 kb, cerca de 1 kb a cerca de 8 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2kb a cerca de 6 kb, cerca de 2 kb a cerca de 7 kb, cerca de 2 kb a cerca de 8 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 6 kb, cerca de 3 kb a cerca de 7 kb, cerca de 3 kb a cerca de 8 kb, cerca de 4 kb a cerca de 5 kb, cerca de 4kba cerca de 6 kb, cerca de 4 kb a cerca de 7 kb, cerca de 4 kb a cerca de 8 kb, cerca de 5 kb a cerca de 6 kb, cerca de 5 kb a cerca de 7 kb, cerca de 5 kb a cerca de 8 kb, cerca de 6 kb a cerca de 7 kb, cerca de 6 kb a cerca de 8 kb, ou cerca de 7 kb a cerca de 8 kb.
[00147] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vírus adenoassociado (vetor AAV) e pode(m) incluir um número total de nu- cleotídeos de até 5 kb. Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) de AAV pode(m) incluir um número total de nucleotídeos no intervalo de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2kba cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, ou cerca de 4 kb a cerca de 5 kb.
[00148] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vetor GatewayO e pode(m) incluir um número total de nucleotídeos de até 5 kb. Em algumas modalidades, cada vetor Gateway inclui um número total de nucleotídeos no intervalo de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de
4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb ou cerca de 4 kb a cerca de 5 kb.
[00149] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções, kits e métodos fornecidos neste documento, os pelo menos dois vetores diferentes podem substancialmente ser o mesmo tipo de vetor e podem diferir em tamanho. Em algumas modalidades, os pelo me- nos dois vetores diferentes podem ser tipos diferentes de vetor e po- dem ter substancialmente o mesmo tamanho ou ter tamanhos diferen- tes.
[00150] Em algumas modalidades, qualquer um de pelo menos dois vetores pode ter um número total nucleotídeos na faixa de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nu- cleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotí- deos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
12.500 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 12.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleo- tídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 11.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 10.500 nucleotídeos, de cer- ca de 500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 500 nu- cleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotí- deos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
7.800 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotí- deos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, de cerca de 500 nu- cleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotí-
deos a cerca de 6.400 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
6.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotí- deos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nu- cleotídeos a cerca de 4.800 nucleotídeos, de cerca de 4.600 nucleotí- deos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 4.400 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 4.200 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nu- cleotídeos a cerca de 3.800 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotí- deos a cerca de 3.600 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 3.400 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
3.200 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.800 nucleotí- deos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.600 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.400 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.200 nucleotídeos, de cerca de 500 nu- cleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotí- deos a cerca de 1.800 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 1.600 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
1.400 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 1.200 nucleotídeos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotí- deos, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleo- tídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
12.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 11.000 nucleo- tídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 10.500 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, de cer- ca de 800 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nu- cleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotí- deos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
7.600 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotí- deos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, de cerca de 800 nu- cleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotí- deos a cerca de 6.200 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
5.800 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotí- deos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.800 nucleotídeos, de cerca de 800 nu- cleotídeos a cerca de 4.600 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotí- deos a cerca de 4.400 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.200 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
4.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 3.800 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 3.600 nucleotí- deos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 3.400 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 3.200 nucleotídeos, de cerca de
800 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nu- cleotídeos a cerca de 2.800 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotí- deos a cerca de 2.600 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 2.400 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
2.200 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 1.800 nucleotí- deos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 1.600 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 1.400 nucleotídeos, de cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 1.200 nucleotídeos, de cerca de 800 nu- cleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotí- deos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cer- ca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
13.500 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
13.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
12.500 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
12.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
11.500 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
11.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
10.500 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
10.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleo- tídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, de cer- ca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, de cerca de
1.000 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleo- tídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
6.400 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleo- tídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, de cer- ca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, de cerca de
1.000 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleo- tídeos a cerca de 4.800 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 4.600 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 4.400 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
4.200 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 3.800 nucleo- tídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 3.600 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 3.400 nucleotídeos, de cer- ca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 3.200 nucleotídeos, de cerca de
1.000 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 2.600 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleo- tídeos a cerca de 2.400 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 2.200 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de
1.800 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 1.600 nucleotídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 1.400 nucleo- tídeos, de cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 1.200 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de
1.200 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nu- cleotídeos a cerca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleo- tídeos a cerca de 12.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cer- ca de 11.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de
10.500 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de
10.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleo- tídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cer- ca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, de cerca de
1.200 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleo- tídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de
6.600 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleo- tídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleotídeos, de cer- ca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, de cerca de
1.200 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleo- tídeos a cerca de 4.800 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 4.600 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 4.400 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de
4.200 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 3.800 nucleo- tídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 3.600 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 3.400 nucleotídeos, de cer- ca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 3.200 nucleotídeos, de cerca de
1.200 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 2.800 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleo-
tídeos a cerca de 2.600 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 2.400 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 2.200 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de
2.000 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 1.800 nucleotídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 1.600 nucleo- tídeos, de cerca de 1.200 nucleotídeos a cerca de 1.400 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de
1.400 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nu- cleotídeos a cerca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleo- tídeos a cerca de 12.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cer- ca de 11.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de
10.500 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de
10.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleo- tídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cer- ca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, de cerca de
1.400 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleo- tídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de
6.600 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleo- tídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleotídeos, de cer-
ca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, de cerca de
1.400 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleo- tídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 4.800 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 4.600 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de
4.400 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 4.200 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleo- tídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 3.800 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 3.600 nucleotídeos, de cer- ca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 3.400 nucleotídeos, de cerca de
1.400 nucleotídeos a cerca de 3.200 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleo- tídeos a cerca de 2.600 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 2.400 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 2.200 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de
2.000 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 1.800 nucleotídeos, de cerca de 1.400 nucleotídeos a cerca de 1.600 nucleo- tídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de
1.600 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 12.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nu- cleotídeos a cerca de 11.500 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleo- tídeos a cerca de 11.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 10.500 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cer- ca de 10.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de
9.500 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleo- tídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, de cer- ca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, de cerca de
1.600 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleo- tídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de
6.200 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleo- tídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, de cer- ca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, de cerca de
1.600 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 4.800 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleo- tídeos a cerca de 4.600 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 4.400 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 4.200 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de
4.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 3.800 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 3.600 nucleo- tídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 3.400 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 3.200 nucleotídeos, de cer- ca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, de cerca de
1.600 nucleotídeos a cerca de 2.800 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 2.600 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleo- tídeos a cerca de 2.400 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 2.200 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, de cerca de 1.600 nucleotídeos a cerca de
1.800 nucleotídeos, de cerca de 1.800 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 1.800 nucleotídeos a cerca de 14.500 nu- cleotídeos, de cerca de 1.800 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleo- tídeos, de cerca de 1.800 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotí- deos, de cerca de 1.800 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 1.800 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 1.800 nucleotídeos a cerca de 12.000 nucleotídeos, de cerca de 1.800 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleotídeos, de cerca de
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7.000 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, de cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, de cerca de 7.000 nucleo- tídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cer- ca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
14.000 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
13.500 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
13.000 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
12.500 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
12.000 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
11.500 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
11.000 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
10.500 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de
10.000 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleo- tídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cer- ca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, de cerca de
7.200 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, de cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, de cerca de 7.400 nucleo- tídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 7.400 nucleotídeos a cer- ca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de
13.500 nucleotídeos, de cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de
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10.000 nucleotídeos, de cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleo- tídeos, de cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cer- ca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, de cerca de
7.400 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nu- cleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleo- tídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cer- ca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de
12.500 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de
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10.000 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleo- tídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cer- ca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, de cerca de
7.800 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nu- cleotídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nucleo- tídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nucleotídeos a cer- ca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de
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10.000 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleo- tídeos, de cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, de cer- ca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de
8.000 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nu- cleotídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nucleo- tídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nucleotídeos a cer- ca de 12.000 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de
11.500 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de
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10.000 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleo- tídeos, de cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de
8.500 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nu- cleotídeos a cerca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleo- tídeos a cerca de 12.000 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cer- ca de 11.000 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de
10.500 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de
10.000 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, de cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleo- tídeos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotídeos, de cerca de
9.000 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 12.000 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nu- cleotídeos a cerca de 11.500 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nucleo- tídeos a cerca de 11.000 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 10.500 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cer- ca de 10.000 nucleotídeos, de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de
9.500 nucleotídeos, de cerca de 9.500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 15.000 nu- cleotídeos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleo- tídeos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotí- deos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotí- deos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotí- deos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotí- deos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 12.000 nucleotí- deos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleotí- deos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 11.000 nucleotí- deos, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 10.500 nucleotí- deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotí- deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotí- deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotí- deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotí- deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotí- deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 12.000 nucleotí-
deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleotí- deos, de cerca de 10.500 nucleotídeos a cerca de 11.000 nucleotí- deos, de cerca de 11.000 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 11.000 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotí- deos, de cerca de 11.000 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotí- deos, de cerca de 11.000 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotí- deos, de cerca de 11.000 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotí- deos, de cerca de 11.000 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotí- deos, de cerca de 11.000 nucleotídeos a cerca de 12.000 nucleotí- deos, de cerca de 11.000 nucleotídeos a cerca de 11.500 nucleotí- deos, de cerca de 11.500 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 11.500 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotí- deos, de cerca de 11.500 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotí- deos, de cerca de 11.500 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotí- deos, de cerca de 11.500 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotí- deos, de cerca de 11.500 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotí- deos, de cerca de 11.500 nucleotídeos a cerca de 12.000 nucleotí- deos, de cerca de 12.000 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 12.000 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotí- deos, de cerca de 12.000 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotí- deos, de cerca de 12.000 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotí- deos, de cerca de 12.000 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotí- deos, de cerca de 12.000 nucleotídeos a cerca de 12.500 nucleotí- deos, de cerca de 12.500 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 12.500 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotí- deos, de cerca de 12.500 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotí- deos, de cerca de 12.500 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotí- deos, de cerca de 12.500 nucleotídeos a cerca de 13.000 nucleotí- deos, de cerca de 13.000 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 13.000 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotí-
deos, de cerca de 13.000 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotí- deos, de cerca de 13.000 nucleotídeos a cerca de 13.500 nucleotí- deos, de cerca de 13.500 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 13.500 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotí- deos, de cerca de 13.500 nucleotídeos a cerca de 14.000 nucleotí- deos, de cerca de 14.000 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotí- deos, de cerca de 14.000 nucleotídeos a cerca de 14.500 nucleotídeos ou de cerca de 14.500 nucleotídeos a cerca de 15.000 nucleotídeos (inclusive).
[00151] São fornecidos neste documento vetores exemplificativos que podem ser usados em qualquer uma das composições e métodos descritos neste documento. Veja, por exemplo, as FIGs. 1-24.
[00152] Uma variedade de métodos diferentes conhecidos na técni- ca pode ser usada para introduzir qualquer um dos vetores divulgados neste documento em uma célula de mamífero (por exemplo, uma célu- la ciliada interna da cóclea, uma célula ciliada externa da cóclea, uma célula retinal). Exemplos não limitativos de métodos para a introdução de ácido nucleico em uma célula de mamífero incluem: lipofecção, transfecção (por exemplo, transfecção de fosfato de cálcio, transfec- ção usando compostos orgânicos altamente ramificados, transfecção usando polímeros catiônicos, transfecção baseada em dendrímero, transfecção óptica, transfecção baseada em partículas (por exemplo, transfecção de nanopartículas) ou transfecção usando lipossomas (por exemplo, lipossomas catiônicos)), microinjeção, eletroporação, com- pressão celular, sonoporação, fusão de protoplastos, impalefecção, entrega hidrodinâmica, arma gênica, magnetofecção, transfecção viral e nucleofecção.
[00153] Os profissionais qualificados apreciarão que qualquer um dos vetores descritos neste documento pode ser introduzido em uma célula de mamífero por, por exemplo, lipofecção, e pode ser integrado de forma estável em um locus do gene endógeno (por exemplo, um locus do gene da CLRN1). Em algumas modalidades, os vetores for- necidos neste documento se integram de forma estável em um locus do gene endógeno defeituoso da CLRN1 e, assim, substituem o gene defeituoso da CLRN1 por um ácido nucleico que codifica uma proteína CLRN1 funcional (por exemplo, tipo selvagem).
[00154] Várias técnicas de biologia molecular que podem ser usa- das para introduzir mutação(ões) e/ou deleção(ões) em um gene en- dógeno também são conhecidas na técnica. Exemplos não limitativos de tais técnicas incluem mutagênese dirigida ao sítio, CRISPR (por exemplo, mutações knock-in induzidas por CRISPR/Cas9 e mutações knock-out induzidas por CRISPR/Cas9) e TALENs. Esses métodos podem ser usados para corrigir a sequência de um gene endógeno defeituoso presente em um cromossomo de uma célula alvo.
[00155] “Qualquer um dos vetores descritos neste documento pode ainda incluir uma sequência de controle, por exemplo, uma sequência de controle selecionada do grupo de uma sequência de iniciação de transcrição, uma sequência de terminação de transcrição, uma se- quência promotora, uma sequência potencializadora, uma sequência de splicing de RNA, uma poliadenilação (poliA) e uma sequência de consenso de Kozak. Exemplos não limitativos dessas sequências de controle são descritos neste documento. Em algumas modalidades, um promotor pode ser um promotor nativo, um promotor constitutivo, um promotor induzível, e/ou um promotor tecido-específico. Promotores
[00156] O termo "promotor" significa uma sequência de DNA reco- nhecida por enzimas/proteínas numa célula de mamífero necessária para iniciar a transcrição de um gene específico (por exemplo, um ge- ne da CLRN1). Um promotor normalmente se refere a, por exemplo, uma sequência nucleotídica na qual uma RNA polimerase and/or qual-
quer fator associado se liga e no qual a transcrição é iniciada. Exem- plos não limitativos de promotores são descritos neste documento. Exemplos adicionais de promotores são conhecidos na técnica.
[00157] Em algumas modalidades, um vetor que codifica uma por- ção N-terminal de uma proteína CLRN1 (por exemplo, uma proteína CLRN1 humana) pode incluir um promotor e/ou um potencializador. O vetor que codifica a porção N-terminal da proteína CLRN1 pode incluir qualquer um dos promotores e/ou potencializadores descritos neste documento ou conhecidos na técnica.
[00158] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor indu- zível, um promotor constitutivo, um promotor de células de mamíferos, um promotor viral, um promotor quimérico, um promotor de engenha- ria, um promotor específico de tecido ou qualquer outro tipo de promo- tor conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de RNA polimerase Il, como um promotor de RNA polimera- se |l de mamífero. Em algumas modalidades, o promotor é um promo- tor de RNA polimerase Ill, incluindo, mas não limitado a, um promotor H1, um promotor U6 humano, um promotor U6 de camundongo ou um promotor U6 suíno. O promotor será geralmente aquele que é capaz de promover a transcrição em uma célula ciliada interna. Em alguns exemplos, o promotor é um promotor específico da cóclea ou um pro- motor orientado para a cóclea.
[00159] Uma variedade de promotores é conhecida na técnica que pode ser usada neste documento. Exemplos não limitativos de promo- tores que podem ser usados neste documento incluem: EF1a humano, citomegalovírus humano (CMV) (Patente US No. 5.168.062), ubiquitina C humana (UBC), fosfoglicerato cinase 1 de camundongo, adenovírus de polioma, vírus símio 40 (SV40), B-globina, B-actina, a-fetoproteína, y-globina, B-interferon, y-glutamil transferase, vírus do tumor mamário do rato (MMTV), vírus do sarcoma Rous, insulina de rato, gliceraldeí-
do-3-fosfato desidrogenase, metalotioneína Il (MT Il), amilase, catep- sina, receptor muscarínico MI, LTR retroviral (por exemplo, vírus da leucemia de células T humanas HTLV), AAV ITR, interleucina-2, colle- ginase, fator de crescimento derivado de plaquetas, adenovírus 5 E2, estromelisina, gene MX murino, proteínas reguladas por glicose (GRP78 e GRP94), a-2-macroglobulina, vimentina, gene MHC classe | H-2K b, HSP70, proliferina, fator de necrose tumoral, fator a de hormô- nio estimulador da tireoide, cadeia leve de imunoglobulina, receptor de células T, HLA DQa e DOR, receptor de interleucina-2, MHC classe |l, MHC classe |l HLA-DRa, creatina quinase muscular, prealbu min (transtirretina), elastase |, gene da albumina, c-fos, c-HA-ras, molécula de adesão celular neural (NCAM), histona H2B (TH2B), hormona de crescimento de ratos, amiloide sérico humano (SAA), troponina | (TN |) distrofia muscular de Duchenne, vírus da imunodeficiência humana e promotores do Vírus da Leucemia de Macaco Gibbon (GALV). Exem- plos adicionais de promotores são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman and Company, No- va York 2007. Em algumas modalidades, o promotor é o promotor pre- coce imediato CMV. Em algumas modalidades, o promotor é um pro- motor CAG ou um promotor CAG/CBA. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor CBA, por exemplo, um promotor CBA com- preendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 18.
[00160] O termo promotor "constitutivo" refere-se a uma sequência nucleotídica que, quando operacionalmente ligada a um ácido nucleico que codifica uma proteína (por exemplo, uma proteína CLRN1), faz com que o RNA seja transcrito do ácido nucleico em uma célula de mamífero sob a maioria ou todas as condições fisiológicas.
[00161] Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limita- ção, o promotor LTR do vírus retroviral do sarcoma Rous (RSV), o promotor do citomegalovírus (CMV) (ver, por exemplo, Boshart et al,
Cell 41:521-530, 1985), o promotor SV40, o promotor di-hidrofolato redutase, o promotor beta-actina, o promotor fosfoglicerol quinase (PGK) e o promotor EF1-alfa (Invitrogen).
[00162] Os promotores induzíveis permitem a regulação da expres- são gênica e podem ser regulados por compostos fornecidos exoge- namente, fatores ambientais como temperatura ou a presença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação específico da célula ou apenas na replicação de células. Promotores induzíveis e sistemas induzíveis estão disponíveis em vá- rias fontes comerciais, incluindo, sem limitação, Invitrogen, Clontech e Ariad. Exemplos adicionais de promotores induzíveis são conhecidos na técnica.
[00163] “Exemplos de promotores indutíveis regulados por compos- tos fornecidos exogenamente incluem o promotor de metalotionina (MT) de ovelha induzível por zinco, o promotor do vírus do tumor ma- mário do rato indutível por dexametasona (Dex) (MMTV), o sistema promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o promotor de insetos ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 93:3346-3351, 1996), o sistema reprimível por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:5547-5551, 1992), o sistema indutível por tetraciclina (Gossen et al., Science 268:1766-1769, 1995, ver também Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518, 1998), o sistema induzível por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech. 15:239-243, 1997) e Wang et al., Gene Ther. 4:432-441, 1997) e o sistema induzível por rapamicina (Magari et al. J. Clin. Invest. 100:2865-2872, 1997).
[00164] O termo promotor "específico de tecido" refere-se a um promotor ativo apenas em certos tipos celulares específicos e/ou teci- dos (por exemplo, a transcrição de um gene específico ocorre apenas dentro das células que expressam proteínas reguladoras da transcri- ção que se ligam ao promotor tecido-específico).
[00165] Em algumas modalidades, as sequências reguladoras con- ferem capacidades de expressão de genes específicos de tecido. Em alguns casos, as sequências reguladoras específicas de tecido ligam fatores de transcrição específicos de tecido que induzem a transcrição de maneira específica de tecido.
[00166] Exemplos de promotores específicos de tecido incluem, en- tre outros, um promotor de globulina de ligação à tiroxina (TBG) espe- cífico do fígado, um promotor de insulina, um promotor de glucagon, um promotor de somatostatina, um promotor de polipeptídeo pancreá- tico (PPY), uma sinapsina-1 (Syn), um promotor de creatina quinase (MCK), um promotor de desmina de mamífero (DES), um promotor de cadeia pesada de alfa-miosina (a-MHC) e um promotor cardíaco de Troponina T (cTnT). Promotores exemplificativos adicionais incluem promotor de beta-actina, promotor do núcleo do vírus da hepatite B (Sandig et al., Gene Ther. 3:1002-1009, 1996), promotor de alfa- fetoproteína (AFP) (Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther. 7:1503-1514, 1996), promotor da osteocalcina óssea (Stein et al., Mol. Biol. Rep. 24:185-196, 1997); promotor da sialoproteína óssea (Chen et al., J. Bone Miner. Res. 11:654-664, 1996), promotor de CD2 (Hansal et al., J. Immunol. 161:1063-1068, 1998); promotor de cadeia pesada de imunoglobulina; promotor de cadeia alfa de receptor de células T, neu- ronal como o promotor de enolase específica dos neurônios (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol. 13:503-515, 1993), promotor de genes da cadeia leve de neurofilamentos (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88:5611-5615, 1991) e o promotor do gene vgf especí- fico para neurônios (Piccioli et al., Neuron 15:373-384, 1995).
[00167] Em algumas modalidades, o promotor específico de tecido é um promotor específico de cóclea. Em algumas modalidades, o pro- motor tecido-específico é um promotor específico de célula ciliada co- clear. Exemplos não limitativos de promotores específicos de células ciliadas da cóclea incluem, entre outros, um promotor ATOH1, um promotor POU4F3, um promotor LHX3, um promotor MYO7A, um promotor MYOG6, um promotor a9ACHR e um promotor a10ACHR. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico de células ciliadas cocleares, como um promotor PRESTIN ou um promotor ON- COMOD. Veja, por exemplo, Zheng et al., Nature 405:149-155, 2000; Tian et al. Dev. Dyn. 231:199-203, 2004; e Ryan et al., Adv. Otorhino- laryngol. 66: 99-115, 2009. Potencializadores
[00168] Em alguns casos, um vetor pode incluir uma sequência po- tencializadora. O termo "potencializador" se refere a uma sequência nucleotídica que pode aumentar o nível de transcrição de um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse (por exemplo, uma proteína CLRN1). Sequências potencializadoras (50-1500 pares de bases de comprimento) geralmente aumentam o nível de transcrição, fornecendo sítios de ligação adicionais para proteínas associadas à transcrição (por exemplo, fatores de transcrição). Em algumas modali- dades, uma sequência potencializadora é encontrada dentro de uma sequência intrônica. Diferentemente das sequências promotoras, as sequências potencializadoras podem atuar a uma distância muito mai- or do sítio de início da transcrição (por exemplo, em comparação com um promotor). Exemplos não limitativos de potencializadores incluem um potencializador de RSV, um potencializador de CMV e um potenci- alizador de SV40. Em algumas modalidades, a sequência potenciali- zadora de CMV compreende ou consiste na SEQ ID NO: 17. Sinal de Poli(A)
[00169] Em algumas modalidades, qualquer um dos vetores forne- cidos neste documento pode incluir uma sequência de poliadenilação (poli(A)). A maioria dos mMRNAs eucarióticos nascentes possui uma cauda poli(A) na extremidade 3 ', que é adicionada durante um pro-
cesso complexo que inclui a clivagem do transcrito primário e uma re- ação de poliadenilação acoplada impulsionada pela sequência sinal de poli(A) (ver, por exemplo, Proudfoot et al., Cell 108:501-512, 2002). À cauda poli(A) confere estabilidade e transferibilidade de MRNA (Mole- cular Biology of the Cell, Terceira Edição por B. Alberts et al., Garland Publishing, 1994). Em algumas modalidades, a sequência sinal de po- Ii(A) é posicionada 3' em relação à sequência de ácido nucleico que codifica o C-terminal da proteína CLRN1.
[00170] Conforme usado neste documento, "poliadenilação" refere- se à ligação covalente de uma fração de poliadenilil ou sua variante modificada a uma molécula de RNA mensageiro. Nos organismos eu- carióticos, a maioria das moléculas de RNA mensageiro (mMRNA) é po- liadenilada na extremidade 3'. A cauda poli(A) 3 'é uma longa sequên- cia nucleotídica de adenina (por exemplo, 50, 60, 70, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 ou 5000) adicionados ao pré-mRNA por meio da ação de uma enzima polimerase poliadenilada. Nos eucariotas su- periores, a cauda de poli(A) é adicionada a transcritos que contêm uma sequência específica, o sinal de poliadenilação (ou poli(A)). À cauda de poli(A) e a proteína a ela ligada ajudam a proteger o MRNA da degradação por exonucleases. A poliadenilação também é impor- tante para o término da transcrição, exportação do mRNA do núcleo e tradução. A poliadenilação ocorre no núcleo imediatamente após a transcrição do DNA para o RNA, mas também pode ocorrer posterior- mente no citoplasma. Após o término da transcrição, a cadeia de MRNA é clivada pela ação de um complexo de endonuclease associa- do à RNA polimerase. O sítio de clivagem é geralmente caracterizado pela presença da sequência de base AAUAAA perto do sítio de cliva- gem. Após a clivagem do mRNA, os resíduos de adenosina são adici- onados à extremidade 3' livre no sítio da clivagem.
[00171] Conforme usado neste documento, uma "sequência sinal de poli(A)" ou "sequência sinal de poliadenilação" é uma sequência que aciona a clivagem de endonucleases de um mRNA e a adição de uma série de adenosinas à extremidade 3 'do mRNA clivado.
[00172] Existem várias sequências sinal de poli(A) que podem ser usadas, incluindo aquelas derivadas do hormônio do crescimento bo- vino (bgh) (Woychik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81(13):3944- 3948, 1984; Patente US No. 5,122,458), B-globina de mouse, a-globina de mouse (Orkin et al., EMBO J. 4(2):453-456, 1985; Thein et al., Blo- od 71(2):313-319, 1988), colágeno humano, vírus do polioma (Batt et al., Mol. Cell Biol. 15(9):4783-4790, 1995), o gene da timidina quinase do vírus Herpes simplex (HSV TK), sinal de poliadenilação do gene da cadeia pesada de IgG (US 2006/0040354), hormona de crescimento humano (hGH) (Szymanski et al., Mol. Therapy 15(7):1340-1347, 2007), o grupo consistindo no local poli(A) de SV40, tal como o local poli(A) tardio e precoce de SV40 (Schek et al., Mol. Cell Biol. 12(12):5386-5393, 1992).
[00173] A sequência sinal de poli(A) pode ser AATAAA. A sequên- cia AATAAA pode ser substituída por outras sequências hexanucleotí- dicas com homologia com AATAAA e que são capazes de sinalizar poliadenilação, incluindo ATTAAA, AGTAAA, CATAAA, TATAAA, GA- TAAA, ACTAAA, AATATA, AAGAAA, AATAAT, AAAAAA, AATGAA, AATCAA, AACAAA, AATCAA, AATAAC, AATAGA, AATTAA, ou AA- TAAG (consulte, por exemplo, WO 06/12414).
[00174] Em algumas modalidades, a sequência sinal de poli(A) pode ser um local de poliadenilação sintético (ver, por exemplo, o vetor de expressão pCl-neo de Promega que é baseado em Levitt el al, Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989). Em algumas modalidades, a sequência sinal de poli(A) é o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCOTCCOCOCCG
TGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCOCT AATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTC TATTCTGGGGGGTGGGGCGTEGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGAT
TGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTAT GG (SEQ ID NO: 20)). Em algumas modalidades, a sequência sinal de poli(A) é o sinal de poliadenilação da neuropilina-1 solúvel (sSNRP) (ARATAAAATACGAAATG (SEQ ID NO: 21)) (ver, por exemplo, WO 05/073384). Exemplos adicionais de sequências sinal de poli(A) são conhecidos na técnica.
Sítio Interno de Entrada de Ribossomo (IRES)
[00175] Em algumas modalidades, um vetor que codifica a porção C-terminal da proteína CLRN1 pode incluir um sítio interno de entrada de ribossomo de polinucleotídeo (IRES). Uma sequência IRES é usa- da para produzir mais de um polipeptídeo a partir de um único transcri- to genético. Um IRES forma uma estrutura secundária complexa que permite que a iniciação da tradução ocorra a partir de qualquer posi- ção com um mRNA imediatamente a jusante de onde o IRES está lo- calizado (consulte, por exemplo, Pelletier e Sonenberg, Mol. Cell. Biol. 8(3): 1103-1112, 1988).
[00176] Existem várias sequências IRES conhecidas pelos especia- listas na técnica, incluindo aquelas do vírus da febre aftosa (FMDV), vírus da encefalomiocardite (EMCV), rinovírus humano (HRV), vírus da paralisia do críquete, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite C (HCV) e poliovírus (PV). Ver, por exemplo, Alberts, Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 2002; e Hellen et al., Genes Dev. 15(13):1593-612, 2001.
[00177] Em algumas modalidades, a sequência IRES que é incor- porada ao vetor que codifica a porção C-terminal de uma proteína CLRN1 é a sequência 2A do vírus da febre aftosa (FMDV). A sequên- cia do vírus da febre aftosa 2A é um peptídeo pequeno (aproximada-
mente 18 aminoácidos de comprimento) que demonstrou mediar a cli- vagem das poliproteínas (Ryan, M D et al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70:8124-8127, 1996; Furler et al., Gene The- rapy 8:864-873, 2001; e Halpin et al., Plant Journal 4:453-459, 1999). A atividade de clivagem da sequência 2A foi demonstrada anterior- mente em sistemas artificiais, incluindo plasmídeos e vetores de tera- pia genética (AAV e retrovírus) (Ryan et al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70:8124-8127, 1996; Furler et al., Gene The- rapy 8:864-873, 2001; e Halpin et al., Plant Journal 4:453-459, 1999; de Felipe et al., Gene Therapy 6:198-208, 1999; de Felipe et al., Hu- man Gene Therapy 11:1921-1931, 2000; e Klump et al., Gene Therapy 8:811-817, 2001). Sequências Repórter
[00178] “Qualquer um dos vetores fornecidos neste documento pode opcionalmente incluir uma sequência que codifica uma proteína repór- ter ("uma sequência repórter"). Exemplos não limitativos de sequên- cias repórteres incluem sequências de DNA que codificam: uma beta- lactamase, uma beta-galactosidase (LacZ), uma fosfatase alcalina, uma timidina-quinase, uma proteína verde fluorescente (GFP), uma proteína vermelha fluorescente, uma proteína fluorescente mCherry, uma proteína fluorescente amarela, uma cloranfenicol acetiltransferase (CAT) e uma luciferase. Exemplos adicionais de sequências repórter são conhecidos na técnica. Quando associada a elementos regulado- res que dirigem sua expressão, a sequência repórter pode fornecer sinais detectáveis por meios convencionais, incluindo ensaios enzimá- ticos, radiográficos, colorimétricos, fluorescentes ou outros ensaios espectrográficos; ensaios de triagem de células ativadoras fluorescen- tes (FACS); ensaios imunológicos (por exemplo, ensaio imunossorven- te ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e imuno- histoquímica).
[00179] Em algumas modalidades, a sequência repórter é teFP (SEQ ID NO: 19). Em algumas modalidades, a sequência repórter é o gene LacZ, e a presença de um vetor que transporta o gene LacZ em uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula ciliada coclear, uma célula ocular, tal como uma célula retinal) é detectada por ensaios de atividade da beta-galactosidase. Quando o repórter é uma proteína fluorescente (por exemplo, proteína verde fluorescente) ou luciferase, a presença de um vetor carregando a proteína fluorescente ou lucife- rase em uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula ciliada co- clear, uma célula ocular, tal como uma célula retinal) pode ser medida por técnicas fluorescentes (por exemplo, fluorescente microscopia ou FACS) ou produção de luz em um luminômetro (por exemplo, um es- pectrofotômetro ou um instrumento de imagem IVIS). Em algumas modalidades, a sequência repórter pode ser usada para verificar as capacidades de direcionamento específicas do tecido e a atividade re- guladora do promotor tecido-específico de qualquer um dos vetores descritos neste documento.
Regiões de Flanqueamento de Regiões Não Traduzidas (UTRs)
[00180] Em algumas modalidades, qualquer um dos vetores descri- tos neste documento (por exemplo, qualquer um dos pelo menos dois vetores diferentes) pode incluir uma região não traduzida, tal como uma UTR 5' ou uma UTR 3".
[00181] “Regiões não traduzidas (UTRs) de um gene são transcritas mas não traduzidas. A 5' UTR inicia no sítio inicial da transcrição e continua até o códon inicial, mas não inclui o códon inicial. A UTR 3' inicia imediatamente depois do códon de parada e continua até o sinal de terminação transcricional. Há um crescente corpo de evidências sobre as funções reguladoras desempenhadas pelas UTRs em termos de estabilidade da molécula de ácido nucleico e tradução. As caracte- rísticas reguladoras de uma UTR podem ser incorporadas em qualquer um dos vetores, composições, kits ou métodos conforme descrito nes- te documento para potencializar a expressão de uma proteína CLRN1.
[00182] As UTRs 5' naturais incluem uma sequência que desempe- nha um papel na iniciação da tradução. Elas abrigam assinaturas como sequências Kozak que são comumente conhecidas por estarem envolvi- das no processo pelo qual o ribossomo inicia a tradução de muitos ge- nes. Sequências Kozak têm o consenso CCR(A/G)CCAUGG, onde R é uma purina (A ou G) três bases a montante do códon de iniciação (AUG), que é seguida por uma outra "G". UTRs 5' são também conhe- cidas por formar estruturas secundárias que estão envolvidas na liga- ção do fator de alongamento.
[00183] Em algumas modalidades, uma UTR 5' está incluída em qualquer um dos vetores descritos neste documento. Exemplos não limitativos de UTRs 5', incluindo aqueles dos seguintes genes: albumi- na, amiloide sérico A, apolipoproteína A/B/E, transferrina, alfa- fetoproteína, eritropoietina e fator VIIl, podem ser usados para poten- cializar a expressão de uma molécula de ácido nucleico, como um MRNA.
[00184] Em algumas modalidades, uma UTR 5' de um mMRNA que é transcrito por uma célula na cóclea ou retina pode ser incluída em qualquer um dos vetores, composições, kits e métodos descritos neste documento.
[00185] Sabe-se que as UTRs 3 'possuem trechos de adenosinas e uridinas (na forma de RNA) ou timidinas (na forma de DNA) incorpora- das nelas. Estas assinaturas ricas de AU são particularmente preva- lentes em genes com altas taxas de turnover. Com base nas caracte- rísticas de sequência e propriedades funcionais, os elementos ricos em AU (AREs) podem ser separados em três classes (Chen et al., Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995; Chen et al., Mol. Cell Biol. 15:2010- 2018, 1995): Os AREs da Classe | contêm várias cópias dispersas de um motivo AUUUA em regiões ricas em U. Por exemplo, mMRNAs de C- Myc e MyoD contêm AREs de classe |. AREs de Classe |l possuem dois ou mais nonâmeros UUAUUUVA(U/A)U/A) sobrepostos. Os mMRNAs GM-CSF e TNF-alfa são exemplos que contêm AREs de clas- se Il. As AREs de Classe Ill são menos bem definidas. Essas regiões ricas em U não contêm um motivo AUUUA. Dois exemplos bem estu- dados dessa classe são os mMRNAs de c-Jun e miogenina.
[00186] A maioria das proteínas de ligação a AREs é conhecida por desestabilizar o mensageiro, enquanto os membros da família ELAV, mais notavelmente HuR, foram documentados aumentando a estabili- dade do mMRNA. HuR liga-se a AREs de todas as três classes. Manipu- lar os sítios de ligação específicos de HuR até a UTR 3' de moléculas de ácido nucleico específicas conduzirá à ligação de Hur e assim, a estabilização da mensagem in vivo.
[00187] Um exemplo de UTR 5º humana selvagem é ou inclui a se- quência da SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13. Um exemplo de UTR 5' humana selvagem é ou inclui a sequência da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.
[00188] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, uma região 5' não traduzida (UTR), uma UTR 3' ou ambas estão incluídas em um vetor (por exemplo, qualquer um dos vetores descritos neste documento). Por exemplo, qualquer uma das UTRs 5' descritas neste documento pode ser opera- tivamente ligada ao códon de início em qualquer uma das sequências de codificação descritas neste documento. Por exemplo, qualquer uma das UTRs 3' pode ser operativamente ligada ao códon do terminal 3' (último códon) em qualquer uma das sequências de codificação descri- tas neste documento.
[00189] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, a UTR 5' compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 15 nucleotídeos contíguos, pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo me- nos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, pelo menos 50 nucleotídeos contíguos, pelo menos 55 nucleotídeos contíguos, pelo menos 60 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 65 nucleotídeos contíguos, pelo me- nos 70 nucleotídeos contíguos, pelo menos 75 nucleotídeos contíguos, pelo menos 80 nucleotídeos contíguos, pelo menos 85 nucleotídeos contíguos, pelo menos 90 nucleotídeos contíguos, pelo menos 100 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 105 nucleotídeos contíguos, pelo menos 110 nucleotídeos contíguos, pelo menos 115 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 120 nucleotídeos contíguos, pelo menos 125 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 130 nucleotídeos contíguos, pelo menos 135 nucleotídeos contíguos, pelo menos 140 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 145 nucleotídeos contíguos, pelo menos 150 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 155 nucleotídeos contíguos, pelo menos 160 nucleotídeos contíguos, pelo menos 165 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 170 nucleotídeos contíguos, pelo menos 175 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 180 nucleotídeos contíguos, pelo menos 185 nucleotídeos contíguos, pelo menos 190 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 195 nucleotídeos contíguos, pelo menos 200 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 205 nucleotídeos contíguos, pelo menos 210 nucleotídeos contíguos, pelo menos 215 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 220 nucleotídeos contíguos, pelo menos 225 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 230 nucleotídeos contíguos, pelo menos 235 nucleotídeos contíguos, pelo menos 240 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 245 nucleotídeos contíguos, pelo menos 250 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 255 nucleotídeos contíguos, ou pelo menos 260 nucleotídeos contíguos) de qualquer lugar dentro da SEQ
ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13.
[00190] Por exemplo, uma UTR 5' pode incluir ou consistir em uma ou mais dentre: posições nucleotídicas 1 a 291, posições nucleotídicas 1 a 290, posições nucleotídicas 1 a 280, posições nucleotídicas 1 a 270, posições nucleotídicas 1 a 260, posições nucleotídicas 1 a 250, posições nucleotídicas 1 a 240, posições nucleotídicas 1 a 230, posi- ções nucleotídicas 1 a 220, posições nucleotídicas 1 a 210, posições nucleotídicas 1 a 200, posições nucleotídicas 1 a 190, posições nucle- otídicas 1 a 180, posições nucleotídicas 1 a 170, posições nucleotídi- cas 1 a 160, posições nucleotídicas 1 a 150, posições nucleotídicas 1 a 140, posições nucleotídicas 1 a 130, posições nucleotídicas 1 a 120, posições nucleotídicas 1 a 110, posições nucleotídicas 1 a 100, posi- ções nucleotídicas 1 a 90, posições nucleotídicas 1 a 80, posições nu- cleotídicas 1 a 70, posições nucleotídicas 1 a 60, posições nucleotídi- cas 1 a 50, posições nucleotídicas 1 a 40, posições nucleotídicas 1 a 30, posições nucleotídicas 1 a 20, posições nucleotídicas 1 a 10, posi- ções nucleotídicas 10 a 291, posições nucleotídicas 10 a 290, posi- ções nucleotídicas 10 a 280, posições nucleotídicas 10 a 270, posi- ções nucleotídicas 10 a 260, posições nucleotídicas 10 a 250, posi- ções nucleotídicas 10 a 240, posições nucleotídicas 10 a 230, posi- ções nucleotídicas 10 a 220, posições nucleotídicas 10 a 210, posi- ções nucleotídicas 10 a 200, posições nucleotídicas 10 a 190, posi- ções nucleotídicas 10 a 180, posições nucleotídicas 10 a 170, posi- ções nucleotídicas 10 a 160, posições nucleotídicas 10 a 150, posi- ções nucleotídicas 10 a 140, posições nucleotídicas 10 a 130, posi- ções nucleotídicas 10 a 120, posições nucleotídicas 10 a 110, posi- ções nucleotídicas 10 a 100, posições nucleotídicas 10 a 90, posições nucleotídicas 10 a 80, posições nucleotídicas 10 a 70, posições nucle- otídicas 10 a 60, posições nucleotídicas 10 a 50, posições nucleotídi- cas 10 a 40, posições nucleotídicas 10 a 30, posições nucleotídicas 10 a 20, posições nucleotídicas 20 a 291, posições nucleotídicas 20 a 290, posições nucleotídicas 20 a 280, posições nucleotídicas 20 a 270, posições nucleotídicas 20 a 260, posições nucleotídicas 20 a 250, po- sições nucleotídicas 20 a 240, posições nucleotídicas 20 a 230, posi- ções nucleotídicas 20 a 220, posições nucleotídicas 20 a 210, posi- ções nucleotídicas 20 a 200, posições nucleotídicas 20 a 190, posi- ções nucleotídicas 20 a 180, posições nucleotídicas 20 a 170, posi- ções nucleotídicas 20 a 160, posições nucleotídicas 20 a 150, posi- ções nucleotídicas 20 a 140, posições nucleotídicas 20 a 130, posi- ções nucleotídicas 20 a 120, posições nucleotídicas 20 a 110, posi- ções nucleotídicas 20 a 100, posições nucleotídicas 20 a 90, posições nucleotídicas 20 a 80, posições nucleotídicas 20 a 70, posições nucle- otídicas 20 a 60, posições nucleotídicas 20 a 50, posições nucleotídi- cas 20 a 40, posições nucleotídicas 20 a 30, posições nucleotídicas 30 a 291, posições nucleotídicas 30 a 290, posições nucleotídicas 30 a 280, posições nucleotídicas 30 a 270, posições nucleotídicas 30 a 260, posições nucleotídicas 30 a 250, posições nucleotídicas 30 a 240, po- sições nucleotídicas 30 a 230, posições nucleotídicas 30 a 220, posi- ções nucleotídicas 30 a 210, posições nucleotídicas 30 a 200, posi- ções nucleotídicas 30 a 190, posições nucleotídicas 30 a 180, posi- ções nucleotídicas 30 a 170, posições nucleotídicas 30 a 160, posi- ções nucleotídicas 30 a 150, posições nucleotídicas 30 a 140, posi- ções nucleotídicas 30 a 130, posições nucleotídicas 30 a 120, posi- ções nucleotídicas 30 a 110, posições nucleotídicas 30 a 100, posi- ções nucleotídicas 30 a 90, posições nucleotídicas 30 a 80, posições nucleotídicas 30 a 70, posições nucleotídicas 30 a 60, posições nucle- otídicas 30 a 50, posições nucleotídicas 30 a 40, posições nucleotídi- cas 40 a 291, posições nucleotídicas 40 a 290, posições nucleotídicas 40 a 280, posições nucleotídicas 40 a 270, posições nucleotídicas 40 a 260, posições nucleotídicas 40 a 250, posições nucleotídicas 40 a 240,
posições nucleotídicas 40 a 230, posições nucleotídicas 40 a 220, po- sições nucleotídicas 40 a 210, posições nucleotídicas 40 a 200, posi- ções nucleotídicas 40 a 190, posições nucleotídicas 40 a 180, posi- ções nucleotídicas 40 a 170, posições nucleotídicas 40 a 160, posi- ções nucleotídicas 40 a 150, posições nucleotídicas 40 a 140, posi- ções nucleotídicas 40 a 130, posições nucleotídicas 40 a 120, posi- ções nucleotídicas 40 a 110, posições nucleotídicas 40 a 100, posi- ções nucleotídicas 40 a 90, posições nucleotídicas 40 a 80, posições nucleotídicas 40 a 70, posições nucleotídicas 40 a 60, posições nucle- otídicas 40 a 50, posições nucleotídicas 50 a 291, posições nucleotídi- cas 50 a 290, posições nucleotídicas 50 a 280, posições nucleotídicas 50 a 270, posições nucleotídicas 50 a 260, posições nucleotídicas 50 a 250, posições nucleotídicas 50 a 240, posições nucleotídicas 50 a 230, posições nucleotídicas 50 a 220, posições nucleotídicas 50 a 210, po- sições nucleotídicas 50 a 200, posições nucleotídicas 50 a 190, posi- ções nucleotídicas 50 a 180, posições nucleotídicas 50 a 170, posi- ções nucleotídicas 50 a 160, posições nucleotídicas 50 a 150, posi- ções nucleotídicas 50 a 140, posições nucleotídicas 50 a 130, posi- ções nucleotídicas 50 a 120, posições nucleotídicas 50 a 110, posi- ções nucleotídicas 50 a 100, posições nucleotídicas 50 a 90, posições nucleotídicas 50 a 80, posições nucleotídicas 50 a 70, posições nucle- otídicas 50 a 60, posições nucleotídicas 60 a 291, posições nucleotídi- cas 60 a 290, posições nucleotídicas 60 a 280, posições nucleotídicas 60 a 270, posições nucleotídicas 60 a 260, posições nucleotídicas 60 a 250, posições nucleotídicas 60 a 240, posições nucleotídicas 60 a 230, posições nucleotídicas 60 a 220, posições nucleotídicas 60 a 210, po- sições nucleotídicas 60 a 200, posições nucleotídicas 60 a 190, posi- ções nucleotídicas 60 a 180, posições nucleotídicas 60 a 170, posi- ções nucleotídicas 60 a 160, posições nucleotídicas 60 a 150, posi- ções nucleotídicas 60 a 140, posições nucleotídicas 60 a 130, posi-
ções nucleotídicas 60 a 120, posições nucleotídicas 60 a 110, posi- ções nucleotídicas 60 a 100, posições nucleotídicas 60 a 90, posições nucleotídicas 60 a 80, posições nucleotídicas 60 a 70, posições nucle- otídicas 70 a 291, posições nucleotídicas 70 a 290, posições nucleotí- dicas 70 a 280, posições nucleotídicas 70 a 270, posições nucleotídi- cas 70 a 260, posições nucleotídicas 70 a 250, posições nucleotídicas 70 a 240, posições nucleotídicas 70 a 230, posições nucleotídicas 70 a 220, posições nucleotídicas 70 a 210, posições nucleotídicas 70 a 200, posições nucleotídicas 70 a 190, posições nucleotídicas 70 a 180, po- sições nucleotídicas 70 a 170, posições nucleotídicas 70 a 160, posi- ções nucleotídicas 70 a 150, posições nucleotídicas 70 a 140, posi- ções nucleotídicas 70 a 130, posições nucleotídicas 70 a 120, posi- ções nucleotídicas 70 a 110, posições nucleotídicas 70 a 100, posi- ções nucleotídicas 70 a 90, posições nucleotídicas 70 a 80, posições nucleotídicas 80 a 291, posições nucleotídicas 80 a 290, posições nu- cleotídicas 80 a 280, posições nucleotídicas 80 a 270, posições nucle- otídicas 80 a 260, posições nucleotídicas 80 a 250, posições nucleotí- dicas 80 a 240, posições nucleotídicas 80 a 230, posições nucleotídi- cas 80 a 220, posições nucleotídicas 80 a 210, posições nucleotídicas 80 a 200, posições nucleotídicas 80 a 190, posições nucleotídicas 80 a 180, posições nucleotídicas 80 a 170, posições nucleotídicas 80 a 160, posições nucleotídicas 80 a 150, posições nucleotídicas 80 a 140, po- sições nucleotídicas 80 a 130, posições nucleotídicas 80 a 120, posi- ções nucleotídicas 80 a 110, posições nucleotídicas 80 a 100, posi- ções nucleotídicas 80 a 90, posições nucleotídicas 90 a 291, posições nucleotídicas 90 a 290, posições nucleotídicas 90 a 280, posições nu- cleotídicas 90 a 270, posições nucleotídicas 90 a 260, posições nucle- otídicas 90 a 250, posições nucleotídicas 90 a 240, posições nucleotí- dicas 90 a 230, posições nucleotídicas 90 a 220, posições nucleotídi- cas 90 a 210, posições nucleotídicas 90 a 200, posições nucleotídicas
90 a 190, posições nucleotídicas 90 a 180, posições nucleotídicas 90 a 170, posições nucleotídicas 90 a 160, posições nucleotídicas 90 a 150, posições nucleotídicas 90 a 140, posições nucleotídicas 90 a 130, po- sições nucleotídicas 90 a 120, posições nucleotídicas 90 a 110, posi- ções nucleotídicas 90 a 100, posições nucleotídicas 100 a 291, posi- ções nucleotídicas 100 a 290, posições nucleotídicas 100 a 280, posi- ções nucleotídicas 100 a 270, posições nucleotídicas 100 a 260, posi- ções nucleotídicas 100 a 250, posições nucleotídicas 100 a 240, posi- ções nucleotídicas 100 a 230, posições nucleotídicas 100 a 220, posi- ções nucleotídicas 100 a 210, posições nucleotídicas 100 a 200, posi- ções nucleotídicas 100 a 190, posições nucleotídicas 100 a 180, posi- ções nucleotídicas 100 a 170, posições nucleotídicas 100 a 160, posi- ções nucleotídicas 100 a 150, posições nucleotídicas 100 a 140, posi- ções nucleotídicas 100 a 130, posições nucleotídicas 100 a 120, posi- ções nucleotídicas 100 a 110, posições nucleotídicas 110 a 291, posi- ções nucleotídicas 110 a 290, posições nucleotídicas 110 a 280, posi- ções nucleotídicas 110 a 270, posições nucleotídicas 110 a 260, posi- ções nucleotídicas 110 a 250, posições nucleotídicas 110 a 240, posi- ções nucleotídicas 110 a 230, posições nucleotídicas 110 a 220, posi- ções nucleotídicas 110 a 210, posições nucleotídicas 110 a 200, posi- ções nucleotídicas 110 a 190, posições nucleotídicas 110 a 180, posi- ções nucleotídicas 110 a 170, posições nucleotídicas 110 a 160, posi- ções nucleotídicas 110 a 150, posições nucleotídicas 110 a 140, posi- ções nucleotídicas 110 a 130, posições nucleotídicas 110 a 120, posi- ções nucleotídicas 120 a 291, posições nucleotídicas 120 a 290, posi- ções nucleotídicas 120 a 280, posições nucleotídicas 120 a 270, posi- ções nucleotídicas 120 a 260, posições nucleotídicas 120 a 250, posi- ções nucleotídicas 120 a 240, posições nucleotídicas 120 a 230, posi- ções nucleotídicas 120 a 220, posições nucleotídicas 120 a 210, posi- ções nucleotídicas 120 a 200, posições nucleotídicas 120 a 190, posi-
ções nucleotídicas 120 a 180, posições nucleotídicas 120 a 170, posi- ções nucleotídicas 120 a 160, posições nucleotídicas 120 a 150, posi- ções nucleotídicas 120 a 140, posições nucleotídicas 120 a 130, posi- ções nucleotídicas 130 a 291, posições nucleotídicas 130 a 290, posi- ções nucleotídicas 130 a 280, posições nucleotídicas 130 a 270, posi- ções nucleotídicas 130 a 260, posições nucleotídicas 130 a 250, posi- ções nucleotídicas 130 a 240, posições nucleotídicas 130 a 230, posi- ções nucleotídicas 130 a 220, posições nucleotídicas 130 a 210, posi- ções nucleotídicas 130 a 200, posições nucleotídicas 130 a 190, posi- ções nucleotídicas 130 a 180, posições nucleotídicas 130 a 170, posi- ções nucleotídicas 130 a 160, posições nucleotídicas 130 a 150, posi- ções nucleotídicas 130 a 140, posições nucleotídicas 140 a 291, posi- ções nucleotídicas 140 a 290, posições nucleotídicas 140 a 280, posi- ções nucleotídicas 140 a 270, posições nucleotídicas 140 a 260, posi- ções nucleotídicas 140 a 250, posições nucleotídicas 140 a 240, posi- ções nucleotídicas 140 a 230, posições nucleotídicas 140 a 220, posi- ções nucleotídicas 140 a 210, posições nucleotídicas 140 a 200, posi- ções nucleotídicas 140 a 190, posições nucleotídicas 140 a 180, posi- ções nucleotídicas 140 a 170, posições nucleotídicas 140 a 160, posi- ções nucleotídicas 140 a 150, posições nucleotídicas 150 a 291, posi- ções nucleotídicas 150 a 290, posições nucleotídicas 150 a 280, posi- ções nucleotídicas 150 a 270, posições nucleotídicas 150 a 260, posi- ções nucleotídicas 150 a 250, posições nucleotídicas 150 a 240, posi- ções nucleotídicas 150 a 230, posições nucleotídicas 150 a 220, posi- ções nucleotídicas 150 a 210, posições nucleotídicas 150 a 200, posi- ções nucleotídicas 150 a 190, posições nucleotídicas 150 a 180, posi- ções nucleotídicas 150 a 170, posições nucleotídicas 150 a 160, posi- ções nucleotídicas 160 a 291, posições nucleotídicas 160 a 290, posi- ções nucleotídicas 160 a 280, posições nucleotídicas 160 a 270, posi- ções nucleotídicas 160 a 260, posições nucleotídicas 160 a 250, posi-
ções nucleotídicas 160 a 240, posições nucleotídicas 160 a 230, posi- ções nucleotídicas 160 a 220, posições nucleotídicas 160 a 210, posi- ções nucleotídicas 160 a 200, posições nucleotídicas 160 a 190, posi- ções nucleotídicas 160 a 180, posições nucleotídicas 160 a 170, posi- ções nucleotídicas 170 a 291, posições nucleotídicas 170 a 290, posi- ções nucleotídicas 170 a 280, posições nucleotídicas 170 a 270, posi- ções nucleotídicas 170 a 260, posições nucleotídicas 170 a 250, posi- ções nucleotídicas 170 a 240, posições nucleotídicas 170 a 230, posi- ções nucleotídicas 170 a 220, posições nucleotídicas 170 a 210, posi- ções nucleotídicas 170 a 200, posições nucleotídicas 170 a 190, posi- ções nucleotídicas 170 a 180, posições nucleotídicas 180 a 291, posi- ções nucleotídicas 180 a 290, posições nucleotídicas 180 a 280, posi- ções nucleotídicas 180 a 270, posições nucleotídicas 180 a 260, posi- ções nucleotídicas 180 a 250, posições nucleotídicas 180 a 240, posi- ções nucleotídicas 180 a 230, posições nucleotídicas 180 a 220, posi- ções nucleotídicas 180 a 210, posições nucleotídicas 180 a 200, posi- ções nucleotídicas 180 a 190, posições nucleotídicas 190 a 291, posi- ções nucleotídicas 190 a 290, posições nucleotídicas 190 a 280, posi- ções nucleotídicas 190 a 270, posições nucleotídicas 190 a 260, posi- ções nucleotídicas 190 a 250, posições nucleotídicas 190 a 240, posi- ções nucleotídicas 190 a 230, posições nucleotídicas 190 a 220, posi- ções nucleotídicas 190 a 210, posições nucleotídicas 190 a 200, posi- ções nucleotídicas 200 a 291, posições nucleotídicas 200 a 290, posi- ções nucleotídicas 200 a 280, posições nucleotídicas 200 a 270, posi- ções nucleotídicas 200 a 260, posições nucleotídicas 200 a 250, posi- ções nucleotídicas 200 a 240, posições nucleotídicas 200 a 230, posi- ções nucleotídicas 200 a 220, posições nucleotídicas 200 a 210, posi- ções nucleotídicas 210 a 291, posições nucleotídicas 210 a 290, posi- ções nucleotídicas 210 a 280, posições nucleotídicas 210 a 270, posi- ções nucleotídicas 210 a 260, posições nucleotídicas 210 a 250, posi-
ções nucleotídicas 210 a 240, posições nucleotídicas 210 a 230, posi- ções nucleotídicas 210 a 220, posições nucleotídicas 220 a 291, posi- ções nucleotídicas 220 a 290, posições nucleotídicas 220 a 280, posi- ções nucleotídicas 220 a 270, posições nucleotídicas 220 a 260, posi- ções nucleotídicas 220 a 250, posições nucleotídicas 220 a 240, posi- ções nucleotídicas 220 a 230, posições nucleotídicas 230 a 291, posi- ções nucleotídicas 230 a 290, posições nucleotídicas 230 a 280, posi- ções nucleotídicas 230 a 270, posições nucleotídicas 230 a 260, posi- ções nucleotídicas 230 a 250, posições nucleotídicas 230 a 240, posi- ções nucleotídicas 240 a 291, posições nucleotídicas 240 a 290, posi- ções nucleotídicas 240 a 280, posições nucleotídicas 240 a 270, posi- ções nucleotídicas 240 a 260, posições nucleotídicas 240 a 250, posi- ções nucleotídicas 250 a 291, posições nucleotídicas 250 a 290, posi- ções nucleotídicas 250 a 280, posições nucleotídicas 250 a 270, posi- ções nucleotídicas 250 a 260, posições nucleotídicas 260 a 291, posi- ções nucleotídicas 260 a 290, posições nucleotídicas 260 a 280, posi- ções nucleotídicas 260 a 270, posições nucleotídicas 270 a 291, posi- ções nucleotídicas 270 a 290, posições nucleotídicas 270 a 280, posi- ções nucleotídicas 280 a 291, ou posições nucleotídicas 280 a 290, da SEQ ID NO: 12 ou 13.
[00191] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, a UTR 5' compreende uma sequên- cia que é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pe- lo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntico à SEQ ID NO: 12 ou 13.
[00192] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, a UTR 3' compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 15 nucleotídeos contíguos, pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo me- nos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, pelo menos 50 nucleotídeos contíguos, pelo menos 55 nucleotídeos contíguos, pelo menos 60 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 65 nucleotídeos contíguos, pelo me- nos 70 nucleotídeos contíguos, pelo menos 75 nucleotídeos contíguos, pelo menos 80 nucleotídeos contíguos, pelo menos 85 nucleotídeos contíguos, pelo menos 90 nucleotídeos contíguos, pelo menos 100 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 105 nucleotídeos contíguos, pelo menos 110 nucleotídeos contíguos, pelo menos 115 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 120 nucleotídeos contíguos, pelo menos 125 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 130 nucleotídeos contíguos, pelo menos 135 nucleotídeos contíguos, pelo menos 140 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 145 nucleotídeos contíguos, pelo menos 150 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 155 nucleotídeos contíguos, pelo menos 160 nucleotídeos contíguos, pelo menos 165 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 170 nucleotídeos contíguos, pelo menos 175 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 180 nucleotídeos contíguos, pelo menos 185 nucleotídeos contíguos, pelo menos 190 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 195 nucleotídeos contíguos, pelo menos 200 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 205 nucleotídeos contíguos, pelo menos 210 nucleotídeos contíguos, pelo menos 215 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 220 nucleotídeos contíguos, pelo menos 225 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 230 nucleotídeos contíguos, pelo menos 235 nucleotídeos contíguos, pelo menos 240 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 245 nucleotídeos contíguos, pelo menos 250 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 255 nucleotídeos contíguos, pelo menos 260 nucleotídeos contíguos, pelo menos 265 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 270 nucleotídeos contíguos, pelo menos 275 nu-
cleotídeos contíguos, pelo menos 280 nucleotídeos contíguos, pelo menos 285 nucleotídeos contíguos, pelo menos 290 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 295 nucleotídeos contíguos, pelo menos 300 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 305 nucleotídeos contíguos, pelo menos 310 nucleotídeos contíguos, pelo menos 315 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 320 nucleotídeos contíguos, pelo menos 325 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 330 nucleotídeos contíguos, pelo menos 335 nucleotídeos contíguos, pelo menos 340 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 345 nucleotídeos contíguos, pelo menos 350 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 355 nucleotídeos contíguos, pelo menos 360 nucleotídeos contíguos, pelo menos 365 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 370 nucleotídeos contíguos, pelo menos 375 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 380 nucleotídeos contíguos, pelo menos 385 nucleotídeos contíguos, pelo menos 390 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 395 nucleotídeos contíguos, pelo menos 400 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 450 nucleotídeos contíguos, pelo menos 500 nucleotídeos contíguos, pelo menos 550 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 600 nucleotídeos contíguos, pelo menos 650 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 700 nucleotídeos contíguos, pelo menos 750 nucleotídeos contíguos, pelo menos 800 nucleotídeos con- tíguos, pelo menos 850 nucleotídeos contíguos, pelo menos 900 nu- cleotídeos contíguos, pelo menos 950 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1000 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1050 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1100 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1150 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1200 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1250 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1300 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1350 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1400 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1450 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1500 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1550 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1600 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1650 nucleotídeos contíguos, pelo menos 1700 nucleotídeos contíguos, ou pelo menos 1750 nucleotídeos contíguos) de qualquer lugar dentro da SEQ ID NO: 14 ou 15.
[00193] Por exemplo, uma UTR 5' pode incluir ou consistir em uma ou mais dentre: posições nucleotídicas 1 a 1773, posições nucleotídi- cas 1 a 1770, posições nucleotídicas 1 a 1750, posições nucleotídicas 1 a 1700, posições nucleotídicas 1 a 1650, posições nucleotídicas 1 a 1600, posições nucleotídicas 1 a 1550, posições nucleotídicas 1 a 1500, posições nucleotídicas 1 a 1450, posições nucleotídicas 1 a 1400, posições nucleotídicas 1 a 1350, posições nucleotídicas 1 a 1300, posições nucleotídicas 1 a 1250, posições nucleotídicas 1 a 1200, posições nucleotídicas 1 a 1150, posições nucleotídicas 1 a 1100, posições nucleotídicas 1 a 1050, posições nucleotídicas 1 a 1000, posições nucleotídicas 1 a 950, posições nucleotídicas 1 a 900, posições nucleotídicas 1 a 850, posições nucleotídicas 1 a 800, posi- ções nucleotídicas 1 a 750, posições nucleotídicas 1 a 700, posições nucleotídicas 1 a 650, posições nucleotídicas 1 a 600, posições nucle- otídicas 1 a 550, posições nucleotídicas 1 a 500, posições nucleotídi- cas 1 a 450, posições nucleotídicas 1 a 400, posições nucleotídicas 1 a 350, posições nucleotídicas 1 a 300, posições nucleotídicas 1 a 250, posições nucleotídicas 1 a 200, posições nucleotídicas 1 a 150, posi- ções nucleotídicas 1 a 100, posições nucleotídicas 1 a 50, posições nucleotídicas 1 a 25, posições nucleotídicas 25 a 1773, posições nu- cleotídicas 25 a 1770, posições nucleotídicas 25 a 1750, posições nu- cleotídicas 25 a 1700, posições nucleotídicas 25 a 1650, posições nu- cleotídicas 25 a 1600, posições nucleotídicas 25 a 1550, posições nu- cleotídicas 25 a 1500, posições nucleotídicas 25 a 1450, posições nu- cleotídicas 25 a 1400, posições nucleotídicas 25 a 1350, posições nu- cleotídicas 25 a 1300, posições nucleotídicas 25 a 1250, posições nu- cleotídicas 25 a 1200, posições nucleotídicas 25 a 1150, posições nu-
cleotídicas 25 a 1100, posições nucleotídicas 25 a 1050, posições nu- cleotídicas 25 a 1000, posições nucleotídicas 25 a 950, posições nu- cleotídicas 25 a 900, posições nucleotídicas 25 a 850, posições nucle- otídicas 25 a 800, posições nucleotídicas 25 a 750, posições nucleotí- dicas 25 a 700, posições nucleotídicas 25 a 650, posições nucleotídi- cas 25 a 600, posições nucleotídicas 25 a 550, posições nucleotídicas a 500, posições nucleotídicas 25 a 450, posições nucleotídicas 25 a 400, posições nucleotídicas 25 a 350, posições nucleotídicas 25 a 300, posições nucleotídicas 25 a 250, posições nucleotídicas 25 a 200, po- sições nucleotídicas 25 a 150, posições nucleotídicas 25 a 100, posi- ções nucleotídicas 25 a 50, posições nucleotídicas 50 a 1773, posi- ções nucleotídicas 50 a 1770, posições nucleotídicas 50 a 1750, posi- ções nucleotídicas 50 a 1700, posições nucleotídicas 50 a 1650, posi- ções nucleotídicas 50 a 1600, posições nucleotídicas 50 a 1550, posi- ções nucleotídicas 50 a 1500, posições nucleotídicas 50 a 1450, posi- ções nucleotídicas 50 a 1400, posições nucleotídicas 50 a 1350, posi- ções nucleotídicas 50 a 1300, posições nucleotídicas 50 a 1250, posi- ções nucleotídicas 50 a 1200, posições nucleotídicas 50 a 1150, posi- ções nucleotídicas 50 a 1100, posições nucleotídicas 50 a 1050, posi- ções nucleotídicas 50 a 1000, posições nucleotídicas 50 a 950, posi- ções nucleotídicas 50 a 900, posições nucleotídicas 50 a 850, posi- ções nucleotídicas 50 a 800, posições nucleotídicas 50 a 750, posi- ções nucleotídicas 50 a 700, posições nucleotídicas 50 a 650, posi- ções nucleotídicas 50 a 600, posições nucleotídicas 50 a 550, posi- ções nucleotídicas 50 a 500, posições nucleotídicas 50 a 450, posi- ções nucleotídicas 50 a 400, posições nucleotídicas 50 a 350, posi- ções nucleotídicas 50 a 300, posições nucleotídicas 50 a 250, posi- ções nucleotídicas 50 a 200, posições nucleotídicas 50 a 150, posi- ções nucleotídicas 50 a 100, posições nucleotídicas 100 a 1773, posi- ções nucleotídicas 100 a 1770, posições nucleotídicas 100 a 1750, po-
sições nucleotídicas 100 a 1700, posições nucleotídicas 100 a 1650, posições nucleotídicas 100 a 1600, posições nucleotídicas 100 a 1550, posições nucleotídicas 100 a 1500, posições nucleotídicas 100 a 1450, posições nucleotídicas 100 a 1400, posições nucleotídicas 100 a 1350, posições nucleotídicas 100 a 1300, posições nucleotídicas 100 a 1250, posições nucleotídicas 100 a 1200, posições nucleotídicas 100 a 1150, posições nucleotídicas 100 a 1100, posições nucleotídicas 100 a 1050, posições nucleotídicas 100 a 1000, posições nucleotídicas 100 a 950, posições nucleotídicas 100 a 900, posições nucleotídicas 100 a 850, posições nucleotídicas 100 a 800, posições nucleotídicas 100 a 750, posições nucleotídicas 100 a 700, posições nucleotídicas 100 a 650, posições nucleotídicas 100 a 600, posições nucleotídicas 100 a 550, posições nucleotídicas 100 a 500, posições nucleotídicas 100 a 450, posições nucleotídicas 100 a 400, posições nucleotídicas 100 a 350, posições nucleotídicas 100 a 300, posições nucleotídicas 100 a 250, posições nucleotídicas 100 a 200, posições nucleotídicas 100 a 150, posições nucleotídicas 150 a 1773, posições nucleotídicas 150 a 1770, posições nucleotídicas 150 a 1750, posições nucleotídicas 150 a 1700, posições nucleotídicas 150 a 1650, posições nucleotídicas 150 a 1600, posições nucleotídicas 150 a 1550, posições nucleotídicas 150 a 1500, posições nucleotídicas 150 a 1450, posições nucleotídicas 150 a 1400, posições nucleotídicas 150 a 1350, posições nucleotídicas 150 a 1300, posições nucleotídicas 150 a 1250, posições nucleotídicas 150 a 1200, posições nucleotídicas 150 a 1150, posições nucleotídicas 150 a 1100, posições nucleotídicas 150 a 1050, posições nucleotídicas 150 a 1000, posições nucleotídicas 150 a 950, posições nucleotídicas 150 a 900, posições nucleotídicas 150 a 850, posições nucleotídicas 150 a 800, posições nucleotídicas 150 a 750, posições nucleotídicas 150 a 700, posições nucleotídicas 150 a 650, posições nucleotídicas 150 a 600, posições nucleotídicas 150 a 550, posições nucleotídicas 150 a 500,
posições nucleotídicas 150 a 450, posições nucleotídicas 150 a 400, posições nucleotídicas 150 a 350, posições nucleotídicas 150 a 300, posições nucleotídicas 150 a 250, posições nucleotídicas 150 a 200, posições nucleotídicas 200 a 1773, posições nucleotídicas 200 a 1770, posições nucleotídicas 200 a 1750, posições nucleotídicas 200 a 1700, posições nucleotídicas 200 a 1650, posições nucleotídicas 200 a 1600, posições nucleotídicas 200 a 1550, posições nucleotídicas 200 a 1500, posições nucleotídicas 200 a 1450, posições nucleotídicas 200 a 1400, posições nucleotídicas 200 a 1350, posições nucleotídicas 200 a 1300, posições nucleotídicas 200 a 1250, posições nucleotídicas 200 a 1200, posições nucleotídicas 200 a 1150, posições nucleotídicas 200 a 1100, posições nucleotídicas 200 a 1050, posições nucleotídicas 200 a 1000, posições nucleotídicas 200 a 950, posições nucleotídicas 200 a 900, posições nucleotídicas 200 a 850, posições nucleotídicas 200 a 800, posições nucleotídicas 200 a 750, posições nucleotídicas 200 a 700, posições nucleotídicas 200 a 650, posições nucleotídicas 200 a 600, posições nucleotídicas 200 a 550, posições nucleotídicas 200 a 500, posições nucleotídicas 200 a 450, posições nucleotídicas 200 a 400, posições nucleotídicas 200 a 350, posições nucleotídicas 200 a 300, posições nucleotídicas 200 a 250, posições nucleotídicas 250 a 1773, posições nucleotídicas 250 a 1770, posições nucleotídicas 250 a 1750, posições nucleotídicas 250 a 1700, posições nucleotídicas 250 a 1650, posições nucleotídicas 250 a 1600, posições nucleotídicas 250 a 1550, posições nucleotídicas 250 a 1500, posições nucleotídicas 250 a 1450, posições nucleotídicas 250 a 1400, posições nucleotídicas 250 a 1350, posições nucleotídicas 250 a 1300, posições nucleotídicas 250 a 1250, posições nucleotídicas 250 a 1200, posições nucleotídicas 250 a 1150, posições nucleotídicas 250 a 1100, posições nucleotídicas 250 a 1050, posições nucleotídicas 250 a 1000, posições nucleotídicas 250 a 950, posições nucleotídicas 250 a 900, posições nucleotídicas 250 a 850,
posições nucleotídicas 250 a 800, posições nucleotídicas 250 a 750, posições nucleotídicas 250 a 700, posições nucleotídicas 250 a 650, posições nucleotídicas 250 a 600, posições nucleotídicas 250 a 550, posições nucleotídicas 250 a 500, posições nucleotídicas 250 a 450, posições nucleotídicas 250 a 400, posições nucleotídicas 250 a 350, posições nucleotídicas 250 a 300, posições nucleotídicas 300 a 1773, posições nucleotídicas 300 a 1770, posições nucleotídicas 300 a 1750, posições nucleotídicas 300 a 1700, posições nucleotídicas 300 a 1650, posições nucleotídicas 300 a 1600, posições nucleotídicas 300 a 1550, posições nucleotídicas 300 a 1500, posições nucleotídicas 300 a 1450, posições nucleotídicas 300 a 1400, posições nucleotídicas 300 a 1350, posições nucleotídicas 300 a 1300, posições nucleotídicas 300 a 1250, posições nucleotídicas 300 a 1200, posições nucleotídicas 300 a 1150, posições nucleotídicas 300 a 1100, posições nucleotídicas 300 a 1050, posições nucleotídicas 300 a 1000, posições nucleotídicas 300 a 950, posições nucleotídicas 300 a 900, posições nucleotídicas 300 a 850, posições nucleotídicas 300 a 800, posições nucleotídicas 300 a 750, posições nucleotídicas 300 a 700, posições nucleotídicas 300 a 650, posições nucleotídicas 300 a 600, posições nucleotídicas 300 a 550, posições nucleotídicas 300 a 500, posições nucleotídicas 300 a 450, posições nucleotídicas 300 a 400, posições nucleotídicas 300 a 350, posições nucleotídicas 350 a 1773, posições nucleotídicas 350 a 1770, posições nucleotídicas 350 a 1750, posições nucleotídicas 350 a 1700, posições nucleotídicas 350 a 1650, posições nucleotídicas 350 a 1600, posições nucleotídicas 350 a 1550, posições nucleotídicas 350 a 1500, posições nucleotídicas 350 a 1450, posições nucleotídicas 350 a 1400, posições nucleotídicas 350 a 1350, posições nucleotídicas 350 a 1300, posições nucleotídicas 350 a 1250, posições nucleotídicas 350 a 1200, posições nucleotídicas 350 a 1150, posições nucleotídicas 350 a 1100, posições nucleotídicas 350 a 1050, posições nucleotídicas 350 a 1000,
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posições nucleotídicas 700 a 1400, posições nucleotídicas 700 a 1350, posições nucleotídicas 700 a 1300, posições nucleotídicas 700 a 1250, posições nucleotídicas 700 a 1200, posições nucleotídicas 700 a 1150, posições nucleotídicas 700 a 1100, posições nucleotídicas 700 a 1050, posições nucleotídicas 700 a 1000, posições nucleotídicas 700 a 950, posições nucleotídicas 700 a 900, posições nucleotídicas 700 a 850, posições nucleotídicas 700 a 800, posições nucleotídicas 700 a 750, posições nucleotídicas 750 a 1773, posições nucleotídicas 750 a 1770, posições nucleotídicas 750 a 1750, posições nucleotídicas 750 a 1700, posições nucleotídicas 750 a 1650, posições nucleotídicas 750 a 1600, posições nucleotídicas 750 a 1550, posições nucleotídicas 750 a 1500, posições nucleotídicas 750 a 1450, posições nucleotídicas 750 a 1400, posições nucleotídicas 750 a 1350, posições nucleotídicas 750 a 1300, posições nucleotídicas 750 a 1250, posições nucleotídicas 750 a 1200, posições nucleotídicas 750 a 1150, posições nucleotídicas 750 a 1100, posições nucleotídicas 750 a 1050, posições nucleotídicas 750 a 1000, posições nucleotídicas 750 a 950, posições nucleotídicas 750 a 900, posições nucleotídicas 750 a 850, posições nucleotídicas 750 a 800, posições nucleotídicas 800 a 1773, posições nucleotídicas 800 a 1770, posições nucleotídicas 800 a 1750, posições nucleotídicas 800 a 1700, posições nucleotídicas 800 a 1650, posições nucleotídicas 800 a 1600, posições nucleotídicas 800 a 1550, posições nucleotídicas 800 a 1500, posições nucleotídicas 800 a 1450, posições nucleotídicas 800 a 1400, posições nucleotídicas 800 a 1350, posições nucleotídicas 800 a 1300, posições nucleotídicas 800 a 1250, posições nucleotídicas 800 a 1200, posições nucleotídicas 800 a 1150, posições nucleotídicas 800 a 1100, posições nucleotídicas 800 a 1050, posições nucleotídicas 800 a 1000, posições nucleotídicas 800 a 950, posições nucleotídicas 800 a 900, posições nucleotídicas 800 a 850, posições nucleotídicas 850 a 1773, posições nucleotídicas 850 a 1770, posições nucleotídicas 850 a 1750,
posições nucleotídicas 850 a 1700, posições nucleotídicas 850 a 1650, posições nucleotídicas 850 a 1600, posições nucleotídicas 850 a 1550, posições nucleotídicas 850 a 1500, posições nucleotídicas 850 a 1450, posições nucleotídicas 850 a 1400, posições nucleotídicas 850 a 1350, posições nucleotídicas 850 a 1300, posições nucleotídicas 850 a 1250, posições nucleotídicas 850 a 1200, posições nucleotídicas 850 a 1150, posições nucleotídicas 850 a 1100, posições nucleotídicas 850 a 1050, posições nucleotídicas 850 a 1000, posições nucleotídicas 850 a 950, posições nucleotídicas 850 a 900, posições nucleotídicas 900 a 1773, posições nucleotídicas 900 a 1770, posições nucleotídicas 900 a 1750, posições nucleotídicas 900 a 1700, posições nucleotídicas 900 a 1650, posições nucleotídicas 900 a 1600, posições nucleotídicas 900 a 1550, posições nucleotídicas 900 a 1500, posições nucleotídicas 900 a 1450, posições nucleotídicas 900 a 1400, posições nucleotídicas 900 a 1350, posições nucleotídicas 900 a 1300, posições nucleotídicas 900 a 1250, posições nucleotídicas 900 a 1200, posições nucleotídicas 900 a 1150, posições nucleotídicas 900 a 1100, posições nucleotídicas 900 a 1050, posições nucleotídicas 900 a 1000, posições nucleotídicas 900 a 950, posições nucleotídicas 950 a 1773, posições nucleotídicas 950 a 1770, posições nucleotídicas 950 a 1750, posições nucleotídicas 950 a 1700, posições nucleotídicas 950 a 1650, posições nucleotídicas 950 a 1600, posições nucleotídicas 950 a 1550, posições nucleotídicas 950 a 1500, posições nucleotídicas 950 a 1450, posições nucleotídicas 950 a 1400, posições nucleotídicas 950 a 1350, posições nucleotídicas 950 a 1300, posições nucleotídicas 950 a 1250, posições nucleotídicas 950 a 1200, posições nucleotídicas 950 a 1150, posições nucleotídicas 950 a 1100, posições nucleotídicas 950 a 1050, posições nucleotídicas 950 a 1000, posições nucleotídicas 1000 a 1773, posições nucleotídicas 1000 a 1770, posições nucleotídicas 1000 a 1750, posições nucleotídicas 1000 a 1700, posições nucleotídicas 1000 a 1650, posições nucleotídi-
cas 1000 a 1600, posições nucleotídicas 1000 a 1550, posições nucle- otídicas 1000 a 1500, posições nucleotídicas 1000 a 1450, posições nucleotídicas 1000 a 1400, posições nucleotídicas 1000 a 1350, posi- ções nucleotídicas 1000 a 1300, posições nucleotídicas 1000 a 1250, posições nucleotídicas 1000 a 1200, posições nucleotídicas 1000 a 1150, posições nucleotídicas 1000 a 1100, posições nucleotídicas 1000 a 1050, posições nucleotídicas 1050 a 1773, posições nucleotídi- cas 1050 a 1770, posições nucleotídicas 1050 a 1750, posições nucle- otídicas 1050 a 1700, posições nucleotídicas 1050 a 1650, posições nucleotídicas 1050 a 1600, posições nucleotídicas 1050 a 1550, posi- ções nucleotídicas 1050 a 1500, posições nucleotídicas 1050 a 1450, posições nucleotídicas 1050 a 1400, posições nucleotídicas 1050 a 1350, posições nucleotídicas 1050 a 1300, posições nucleotídicas 1050 a 1250, posições nucleotídicas 1050 a 1200, posições nucleotídi- cas 1050 a 1150, posições nucleotídicas 1050 a 1100, posições nucle- otídicas 1100 a 1773, posições nucleotídicas 1100 a 1770, posições nucleotídicas 1100 a 1750, posições nucleotídicas 1100 a 1700, posi- ções nucleotídicas 1100 a 1650, posições nucleotídicas 1100 a 1600, posições nucleotídicas 1100 a 1550, posições nucleotídicas 1100 a 1500, posições nucleotídicas 1100 a 1450, posições nucleotídicas 1100 a 1400, posições nucleotídicas 1100 a 1350, posições nucleotídi- cas 1100 a 1300, posições nucleotídicas 1100 a 1250, posições nucle- otídicas 1100 a 1200, posições nucleotídicas 1100 a 1150, posições nucleotídicas 1150 a 1773, posições nucleotídicas 1150 a 1770, posi- ções nucleotídicas 1150 a 1750, posições nucleotídicas 1150 a 1700, posições nucleotídicas 1150 a 1650, posições nucleotídicas 1150 a 1600, posições nucleotídicas 1150 a 1550, posições nucleotídicas 1150 a 1500, posições nucleotídicas 1150 a 1450, posições nucleotídi- cas 1150 a 1400, posições nucleotídicas 1150 a 1350, posições nucle- otídicas 1150 a 1300, posições nucleotídicas 1150 a 1250, posições nucleotídicas 1150 a 1200, posições nucleotídicas 1200 a 1773, posi- ções nucleotídicas 1200 a 1770, posições nucleotídicas 1200 a 1750, posições nucleotídicas 1200 a 1700, posições nucleotídicas 1200 a 1650, posições nucleotídicas 1200 a 1600, posições nucleotídicas 1200 a 1550, posições nucleotídicas 1200 a 1500, posições nucleotídi- cas 1200 a 1450, posições nucleotídicas 1200 a 1400, posições nucle- otídicas 1200 a 1350, posições nucleotídicas 1200 a 1300, posições nucleotídicas 1200 a 1250, posições nucleotídicas 1250 a 1773, posi- ções nucleotídicas 1250 a 1770, posições nucleotídicas 1250 a 1750, posições nucleotídicas 1250 a 1700, posições nucleotídicas 1250 a 1650, posições nucleotídicas 1250 a 1600, posições nucleotídicas 1250 a 1550, posições nucleotídicas 1250 a 1500, posições nucleotídi- cas 1250 a 1450, posições nucleotídicas 1250 a 1400, posições nucle- otídicas 1250 a 1350, posições nucleotídicas 1250 a 1300, posições nucleotídicas 1300 a 1773, posições nucleotídicas 1300 a 1770, posi- ções nucleotídicas 1300 a 1750, posições nucleotídicas 1300 a 1700, posições nucleotídicas 1300 a 1650, posições nucleotídicas 1300 a 1600, posições nucleotídicas 1300 a 1550, posições nucleotídicas 1300 a 1500, posições nucleotídicas 1300 a 1450, posições nucleotídi- cas 1300 a 1400, posições nucleotídicas 1300 a 1350, posições nucle- otídicas 1350 a 1773, posições nucleotídicas 1350 a 1770, posições nucleotídicas 1350 a 1750, posições nucleotídicas 1350 a 1700, posi- ções nucleotídicas 1350 a 1650, posições nucleotídicas 1350 a 1600, posições nucleotídicas 1350 a 1550, posições nucleotídicas 1350 a 1500, posições nucleotídicas 1350 a 1450, posições nucleotídicas 1350 a 1400, posições nucleotídicas 1400 a 1773, posições nucleotídi- cas 1400 a 1770, posições nucleotídicas 1400 a 1750, posições nucle- otídicas 1400 a 1700, posições nucleotídicas 1400 a 1650, posições nucleotídicas 1400 a 1600, posições nucleotídicas 1400 a 1550, posi- ções nucleotídicas 1400 a 1500, posições nucleotídicas 1400 a 1450,
posições nucleotídicas 1450 a 1773, posições nucleotídicas 1450 a 1770, posições nucleotídicas 1450 a 1750, posições nucleotídicas 1450 a 1700, posições nucleotídicas 1450 a 1650, posições nucleotídi- cas 1450 a 1600, posições nucleotídicas 1450 a 1550, posições nucle- otídicas 1450 a 1500, posições nucleotídicas 1500 a 1773, posições nucleotídicas 1500 a 1770, posições nucleotídicas 1500 a 1750, posi- ções nucleotídicas 1500 a 1700, posições nucleotídicas 1500 a 1650, posições nucleotídicas 1500 a 1600, posições nucleotídicas 1500 a 1550, posições nucleotídicas 1550 a 1773, posições nucleotídicas 1550 a 1770, posições nucleotídicas 1550 a 1750, posições nucleotídi- cas 1550 a 1700, posições nucleotídicas 1550 a 1650, posições nucle- otídicas 1550 a 1600, posições nucleotídicas 1600 a 1773, posições nucleotídicas 1600 a 1770, posições nucleotídicas 1600 a 1750, posi- ções nucleotídicas 1600 a 1700, posições nucleotídicas 1600 a 1650, posições nucleotídicas 1650 a 1773, posições nucleotídicas 1650 a 1770, posições nucleotídicas 1650 a 1750, posições nucleotídicas 1650 a 1700, posições nucleotídicas 1700 a 1773, posições nucleotídi- cas 1700 a 1770, posições nucleotídicas 1700 a 1750, posições nucle- otídicas 1750 a 1773, ou posições nucleotídicas 1750 a 1770, da SEQ ID NO: 14 ou 15.
[00194] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento, a UTR 3' compreende uma sequên- cia que é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pe- lo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntico à SEQ ID NO: 14 ou 15. UTR 5º humana de CLRN1 (SEQ ID NO: 12)
AGGAGATACTTGAAGGCAGTTTGAAAGACTTGTTTTACAGATTCTT AGTCCAAAGATTTCCAATTAGGGAGAAGAAGCAGCAGAAAAGGAG AAAAGCCAAGTATGAGTGATGATGAGGCCTTCATCTACTGACATTT AACCTGGCGAGAACCGTCGATGGTGAAGTTGCCTTTTCAGCTGGG AGCTGTCCGTTCAGCTTCCGTAATAAATGCAGTCAAAGAGGCAGT CCCTTCCCATTGCTCACAAAGGTCTTGTTTTTGAACCTCGCCCTCA
CAGAAGCCGTTTCTCATC UTR 5º humana de CLRN1 (SEQ ID NO: 13) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTEGCTCGCTCACTGAGGCCGCCeG
GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCEGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG
AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT UTR 3º humana de CLRN1 (SEQ ID NO: 14)
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCT CGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCC CGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
CTGCCTGCAGG UTR 3º humana de CLRN1 (SEQ ID NO: 15)
AAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGG TCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATAT ATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTAC TAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTT GAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCA AAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATA TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCA AAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAA TATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGA GCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTA TAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTC TTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAG GAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTAC AGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAA TAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAA CCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAA GAAAAAACCAAGCTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCC AATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACC ACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCA AAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTA CTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGT ATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGAC CCAGGTCAACTTTTTTTTITCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATCOTG CAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTT CATCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAG AGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTG AGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAA ATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAAC CGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGC CAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTTTTCC CCTTAAATCAGGAAATACACCTGGACAATTTCTAGAAGACTACAAT TCAGTCTAGCCACAAAGGGGATTTTTTTITTTTTGGTAACAGGCTAG AGCCCGGTTCTGTAAGTCTTTAGCTGAAATGGTCCAGTACAAAAG CACTGGAAATGAGTGGGCTAGGAGGACAAGGACCGTCTCCTGCG TGAGGAGTTGGTTGGAGGTCCCCAAGGCCAGGTACCCCCTGCAC TCTTATTGGATTCCTCTCTGTCTTCTTGGAGTTTTGAAAAACTCCTT CGAACACCAGGCTTTTTTCTTTAGAAAACAAGTCTCCAATCGTTCT CTGTTCCGTAGAAAGAGAAAGAAAACCTGGAGCAGCTGCTGAAAA ATCTAATGAGGAACTAAGAGGCAAACCCACCA
[00195] Em algumas modalidades, a introdução, remoção ou modi- ficação de UTR 3' AREs pode ser usada para modular a estabilidade de um mRNA que codifica uma proteína CLRN1. Em outras modalida- des, AREs podem ser removidos ou mutados para aumentar a estabi- lidade intracelular e, assim, aumentar a tradução e a produção de uma proteína CLRN1.
[00196] Em outras modalidades, sequências não-ARE podem ser incorporadas nas UTRs 5 'ou 3'. Em algumas modalidades, íntrons ou porções de sequências de íntron podem ser incorporados nas regiões flanqueadoras dos polinucleotídeos em qualquer um dos vetores, composições, kits e métodos fornecidos neste documento. A incorpo- ração de sequências intrônicas pode aumentar a produção de proteí- na, bem como níveis de mMRNA.
[00197] Em algumas modalidades de qualquer um dos vetores des- critos neste documento, o vetor inclui uma sequência de íntron quimé- rica (SEQ ID NO: 16). Células de Mamífero
[00198] Também é fornecida neste documento uma célula (por exemplo, uma célula de mamífero) que inclui qualquer um dos ácidos nucleicos, vetores (por exemplo, pelo menos dois vetores diferentes descritos neste documento) ou composições descritas neste documen- to. Os médicos qualificados apreciarão que os ácidos nucleicos e veto- res descritos neste documento podem ser introduzidos em qualquer célula de mamífero. Exemplos não limitativos de vetores e métodos para a introdução de vetores em células de mamíferos são descritos neste documento.
[00199] Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana, uma célula de camundongo, uma célula porcina, uma célula de coelho, uma célula de cachorro, uma célula de gato, uma célula de rato, ou uma célula de primata não-humano. Em algumas modalidades, a célu- la é uma célula especializada da cóclea. Em algumas modalidades, a célula é uma célula ciliada, tal como uma célula ciliada interna da có- clea ou uma célula ciliada externa da cóclea. Em algumas modalida- des, a célula é uma célula ocular (por exemplo, uma célula retinal, uma célula ganglionar retinal, uma célula amácrina, uma célula horizontal, uma célula bipolar, uma célula fotorreceptora).
[00200] Em algumas modalidades, a célula de mamífero está in vi- tro. Em algumas modalidades, a célula de mamífero está presente em um mamífero. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula autóloga obtida de um indivíduo e cultivada ex vivo. Métodos
[00201] “Também são fornecidos neste documento métodos que in- cluem a introdução na cóclea de um mamífero (por exemplo, um hu- mano) uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento.
[00202] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em uma cé- lula de mamífero que incluem a introdução de qualquer uma das com- posições descritas neste documento na célula de mamífero.
[00203] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 em uma célula ciliada interna, uma célula ciliada externa ou ambas em uma cóclea de um mamífero (por exemplo, um humano) que incluem: introdução de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento na cóclea do mamífero.
[00204] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em um olho de um mamífero (por exemplo, um humano) que incluem: administra- ção intraocular de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qual- quer uma das composições descritas neste documento no olho do mamífero.
[00205] “Também são fornecidos neste documento métodos de tra- tamento de perda auditiva em um indivíduo identificado como possuin- do um gene defeituoso da CLRN1 que incluem: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composi- ções descritas neste documento na cóclea do indivíduo.
[00206] Também são fornecidos neste documento métodos de tra- tamento de perda de visão em um indivíduo identificado como pos- suindo um gene defeituoso da CLRN1 que incluem: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das compo- sições descritas neste documento no olho do indivíduo.
[00207] Em algumas modalidades de qualquer um desses métodos, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene de CLRN1 defeituoso (por exemplo, um gene de CLRN1 com uma muta- ção que resulta em uma diminuição na expressão e/ou atividade de uma proteína CLRN1 codificada pelo gene). Algumas modalidades de qualquer um desses métodos incluem ainda, antes da etapa de intro- dução ou administração, determinar que o indivíduo tem um gene de CLRN1 defeituoso. Algumas modalidades de qualquer um desses mé- todos podem incluir ainda a detecção de uma mutação em um gene de CLRN1 em um indivíduo. Algumas modalidades de qualquer um dos métodos podem incluir ainda identificar ou diagnosticar um indivíduo como tendo perda auditiva e/ou perda de visão.
[00208] Em algumas modalidades de qualquer um desses métodos, duas ou mais doses de qualquer uma das composições descritas nes- te documento são introduzidas ou administradas na cóclea do mamífe- ro ou indivíduo. Algumas modalidades de qualquer um desses méto- dos podem incluir a introdução ou administração de uma primeira dose da composição na cóclea do mamífero ou indivíduo, avaliação da fun- ção auditiva do mamífero ou indivíduo após a introdução ou adminis- tração da primeira dose e administração de um adicional dose da composição na cóclea do mamífero ou indivíduo que se descobriu não ter uma função auditiva dentro de uma faixa normal (por exemplo, con- forme determinado usando qualquer teste para audição conhecido na técnica).
[00209] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição pode ser formulada para administração intracoclear. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, as composições descritas neste docu- mento podem ser administradas por meio de administração intracocle- ar ou administração local. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, as composições são admi- nistradas através do uso de um dispositivo médico (por exemplo, qual- quer um dos dispositivos médicos exemplares descritos neste docu- mento).
[00210] Em algumas modalidades, a administração intracoclear po- de ser realizada usando qualquer um dos métodos descritos neste do- cumento ou conhecidos na técnica. Por exemplo, uma composição pode ser administrada ou introduzida na cóclea usando a seguinte técnica cirúrgica: primeiro usando a visualização com um endoscópio rígido de O mm e 2,5 mm, o canal auditivo externo é limpo e uma faca redonda é usado para delinear nitidamente um retalho timpanomeatal de aproximadamente 5 mm. O retalho timpanomeatal é então elevado e o ouvido médio é introduzido posteriormente. O nervo da corda tim- pânica é identificado e dividido, e uma cureta é usado para remover o osso escutal, expondo a membrana da janela redonda. Para aumentar a distribuição apical da composição administrada ou introduzida, um laser cirúrgico pode ser usado para fazer uma pequena fenestração de 2 mm na janela oval para permitir o deslocamento da perilinfa durante a infusão de membrana da janela trans-redonda da composição. O dispositivo de microinfusão é então preparado e trazido para o campo cirúrgico. O dispositivo é manobrado para a janela redonda e a ponta está assentada dentro da saliência óssea da janela redonda para per- mitir a penetração da membrana pela(s) microagulhas(s). O pedal é acionado para permitir uma infusão constante e medida da composi- ção. O dispositivo é então retirado e a janela redonda e o estribo são selados com um adesivo de gelfoam.
[00211] Em algumas modalidades de qualquer um desses métodos, duas ou mais doses de qualquer uma das composições descritas nes- te documento são introduzidas ou administradas no olho do mamífero ou indivíduo. Algumas modalidades de qualquer um desses métodos podem incluir a introdução ou administração de uma primeira dose da composição no olho (espaço intraocular) do mamífero ou indivíduo, avaliação da função auditiva do mamífero ou indivíduo após a introdu- ção ou administração da primeira dose e administração de um adicio- nal dose da composição no olho do mamífero ou indivíduo que se des- cobriu não ter uma visão dentro de uma faixa normal (por exemplo, conforme determinado usando qualquer teste para visão conhecido na técnica).
[00212] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição pode ser formulada para administração intraocular. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, as composições descritas neste documento podem ser administradas por meio de administração intraocular ou administração local.
[00213] Em algumas modalidades, a administração intraocular pode ser realizada usando qualquer um dos métodos descritos neste docu- mento ou conhecidos na técnica.
[00214] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero é um roedor, um primata não humano ou um humano. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero é um adulto, um adolescente, um juvenil, uma criança, uma criança pequena, um bebê ou um recém-nascido. Em algumas moda- lidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero tem 1-5, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-
70, 1- 80, 1-90, 1-100, 1-110, 2-5, 2-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 10-30, 10-40, 10-50, 10- 60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 10-110, 20- 40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 20-100, 20-110, 30-50, 30-60, 30-70, 30-80, 30-90, 30- 100, 40-60, 40-70, 40-80, 40-90, 40-100, 50-70, 50-80, 50-90, 50-100, 60-80, 60-90, 60- 100, 70-90, 70-100, 70-110, 80-100, 80-110 ou 90- 110 anos de idade. Em algumas modalidades de qualquer um dos mé- todos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero tem 1,2,3, 4, 5,6,7,8,9, 10 ou 11 meses de idade.
[00215] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero tem ou está em risco de desenvolver perda auditiva e/ou perda de visão (por exemplo, síndrome de Usher tipo Ill, retinite pigmentosa). Em algumas modali- dades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o in- divíduo ou mamífero foi previamente identificado como tendo uma mu- tação em um gene de CLRN1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero tem qualquer uma das mutações em um gene de CLRN1 que são des- critas neste documento ou são conhecidas na técnica por estarem as- sociadas à perda auditiva e/ou perda de visão.
[00216] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero foi identificado como sendo um portador de uma mutação em um gene de CLRN1 (por exemplo, por meio de teste genético). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou humano foi identificado como tendo uma mutação em um gene de CLRN1 e foi diagnosticado com perda auditiva e/ou perda de visão (por exemplo, síndrome de Usher tipo Ill, retinite pigmentosa). Em al- gumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste do- cumento, o indivíduo ou humano foi identificado como tendo perda au-
ditiva e/ou perda de visão (por exemplo, síndrome de Usher tipo Ill, retinite pigmentosa).
[00217] Em algumas modalidades, o tratamento bem-sucedido da perda auditiva (por exemplo, síndrome de Usher tipo Ill) pode ser de- terminado em um indivíduo usando qualquer um dos testes funcionais de audição convencionais conhecidos na técnica. Exemplos não limita- tivos de testes funcionais de audição são vários tipos de ensaios audi- ométricos (por exemplo, teste de tom puro, teste de fala, teste do ouvi- do médio, resposta auditiva do tronco cerebral e emissões otoacústi- cas).
[00218] Em algumas modalidades, o tratamento bem-sucedido da perda de visão pode ser determinado em um indivíduo usando qual- quer um dos testes convencionais de visão funcional conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de testes retinais e de visão funcio- nais são testes de acuidade, testes de pressão intraocular (IOP) e um eletrorretinograma (ERG).
[00219] Também são fornecidos métodos neste documento para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de comprimento total) em uma célula de mamífe- ro que inclui a introdução de qualquer uma das composições descritas neste documento na célula de mamífero. Em algumas modalidades desses métodos, a célula de mamífero é uma célula ciliada da cóclea (por exemplo, uma célula ciliada interna, uma célula ciliada externa) ou uma célula ocular (por exemplo, uma célula retinal). Em algumas mo- dalidades desses métodos, a célula de mamífero é uma célula humana (por exemplo, uma célula ciliada da cóclea humana). Em algumas mo- dalidades desses métodos, a célula de mamífero está in vitro. Em al- gumas modalidades desses métodos, a célula de mamífero está em um mamífero. Em algumas modalidades desses métodos, a célula de mamífero é originalmente obtida de um mamífero e é cultivada ex vivo.
Em algumas modalidades, a célula de mamífero foi previamente de- terminada como tendo um gene de CLRN1 defeituoso.
[00220] Os métodos para a introdução de qualquer uma das com- posições descritas neste documento em uma célula de mamífero são conhecidos na técnica (por exemplo, via lipofecção ou pelo uso de um vetor viral, por exemplo, qualquer um dos vetores virais descritos neste documento).
[00221] Um aumento na expressão de uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de comprimento total), conforme descrito neste documento, é, por exemplo, em comparação com um controle ou ao nível de expressão de uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de comprimento total) antes da intro- dução do(s) vetor(es).
[00222] Os métodos de detecção da expressão e/ou atividade de CLRN1 são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o nível de expressão de uma proteína CLRN1 pode ser detectado diretamente (por exemplo, detectando a proteína CLRN1 ou detectando mRNA de CLRN1). Exemplos não limitativos de técnicas que podem ser usadas para detectar a expressão e/ou atividade de CLRN1 diretamente inclu- em: PCR em tempo real, Western blotting, imunoprecipitação, imuno- histoquímica ou imunofluorescência. Em algumas modalidades, a ex- pressão de uma proteína CLRN1 pode ser detectada indiretamente (por exemplo, por meio de testes de audição funcionais, testes retinais e de visão funcionais). Kits e Composições Farmacêuticas
[00223] Em algumas modalidades, qualquer uma das composições descritas neste documento pode incluir ainda um ou mais agentes que promovem a entrada de um ácido nucleico ou qualquer um dos vetores descritos neste documento em uma célula de mamífero (por exemplo, um lipossoma ou lipídio catiônico).
[00224] Em algumas modalidades, qualquer um dos vetores descri- tos neste documento pode ser formulado usando recursos naturais e/ou polímeros sintéticos. Exemplos não limitativos de polímeros que podem ser incluídos em qualquer uma das composições descritas nes- te documento podem incluir, mas não estão limitados a, DYNAMIC POLYCONJUGATEPO (Arrowhead Research Corp., Pasadena, Califór- nia), formulações de Mirus Bio (Madison, Wis.) e Roche Madison (Ma- dison, Wisconsin), formulações de polímero PhaseRX como, sem limi- tação, SMARTT POLYMER TECHNOLOGYO (PhaseRX, Seattle, Wa- shington), DMRI/DOPE, poloxâmero, adjuvante VAXFECTINO de Vical (San Diego, Califórnia.), quitosano, ciclodextrina da Calando Pharma- ceuticals (Pasadena, Califórnia), dendrímeros e polímeros poli (ácido lático-coglicólico) (PLGA), polímeros RONDEL'Y (RNAi/Oligonucleoti- de Nanoparticle Delivery) (Arrowhead Research Corporation, Pasade- na, Califórnia), e polímeros de cobloco responsivos ao pH, tais como, mas não se limitando a, aqueles produzidos por PhaseRX (Seattle, Washington). Muitos destes polímeros demonstraram eficácia na ad- ministração de oligonucleotídeos in vivo em uma célula de mamífero (ver, por exemplo, deFougerolles, Human Gene Ther. 19:125-132, 2008; Rozema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 104:12982-12887, 2007; Rozema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 104:12982-12887, 2007; Hu-Lieskovan et al., Cancer Res. 65:8984-8982, 2005; Heidel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 104:5715-5721, 2007).
[00225] “Qualquer uma das composições descritas neste documento pode ser, por exemplo, uma composição farmacêutica. Os ensinamen- tos presentes também fornecem composições farmacêuticas que in- cluem pelo menos um composto descrito neste documento e um ou mais carreadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitá- veis. Tais composições podem compreender um ou mais tampões, tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e similares; um ou mais carboidratos, como glicose, ma- Nose, sacarose e dextrano; manitol; uma ou mais proteínas, polipeptí- deos ou aminoácidos, como glicina; um ou mais antioxidantes; um ou mais agentes quelantes, tais como EDTA ou glutationa; and/or um ou mais conservantes.
[00226] Em algumas modalidades, a composição inclui um carrea- dor farmaceuticamente aceitável (por exemplo, solução salina tampo- nada com fosfato, solução salina ou água bacteriostática). Após a for- mulação, as soluções podem ser administradas de forma compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que seja terapeuti- camente eficaz. As formulações são administradas facilmente em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções ingeríveis, cáp- sulas de liberação de drogas e afins.
[00227] Conforme usado neste documento, "carreador farmaceuti- camente aceitável" inclui solução salina, solventes, meios de disper- são, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento da absorção e isotônicos, e outros similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Os compostos ativos complemen- tares podem também ser incorporados nas composições.
[00228] Em algumas modalidades, uma dose única de qualquer uma das composições descritas neste documento pode incluir uma quantidade total de pelo menos dois vetores diferentes de pelo menos 1 ng, pelo menos 2 ng, pelo menos 4 ng, cerca de 6 ng, cerca de 8 ng, pelo menos 10 ng, pelo menos 20 ng, pelo menos 30 ng, pelo menos 40 ng, pelo menos 50 ng, pelo menos 60 ng, pelo menos 70 ng, pelo menos 80 ng, pelo menos 90 ng, pelo menos 100 ng, pelo menos 200 ng, pelo menos 300 ng, pelo menos 400 ng, pelo menos 500 ng, pelo menos 1 ug, pelo menos 2 ug, pelo menos 4 ug, pelo menos 6 ug, pelo menos 8 ug, pelo menos 10 ug, pelo menos 12 ug, pelo menos 14 ug, pelo menos 16 ug, pelo menos 18 ug, pelo menos 20 ug, pelo menos
22 ug, pelo menos 24 ug, pelo menos 26 ug, pelo menos 28 ug, pelo menos 30 ug pelo menos 32 ug, pelo menos 34 ug, pelo menos 36 ug, pelo menos 38 ug, pelo menos 40 ug, pelo menos 42 ug, pelo menos 44 ug, pelo menos 46 ug, pelo menos 48 ug, pelo menos 50 ug, pelo menos 52 ug, pelo menos 54 ug, pelo menos 56 ug, pelo menos 58 Vg, pelo menos 60 ug, pelo menos 62 ug, pelo menos 64 ug, pelo me- nos 66 ug, pelo menos 68 ug, pelo menos 70 ug, pelo menos 72 ug, pelo menos 74 ug, pelo menos 76 ug, pelo menos 78 ug, pelo menos 80 ug, pelo menos 82 ug, pelo menos 84 ug, pelo menos 86 ug, pelo menos 88 ug, pelo menos 90 ug, pelo menos 92 ug, pelo menos 94 vg, pelo menos 96 ug, pelo menos 98 ug, pelo menos 100 ug, pelo menos 102 ug, pelo menos 104 ug, pelo menos 106 ug, pelo menos 108 ug, pelo menos 110 ug, pelo menos 112 ug, pelo menos 114 ug, pelo menos 116 ug, pelo menos 118 ug, pelo menos 120 ug, pelo me- nos 122 ug, pelo menos 124 ug, pelo menos 126 ug, pelo menos 128 vg, pelo menos 130 ug pelo menos 132 ug, pelo menos 134 ug, pelo menos 136 ug, pelo menos 138 ug, pelo menos 140 ug, pelo menos 142 ug, pelo menos 144 ug, pelo menos 146 ug, pelo menos 148 ug, pelo menos 150 ug, pelo menos 152 ug, pelo menos 154 ug, pelo me- nos 156 ug, pelo menos 158 ug, pelo menos 160 ug, pelo menos 162 vg, pelo menos 164 ug, pelo menos 166 ug, pelo menos 168 ug, pelo menos 170 ug, pelo menos 172 ug, pelo menos 174 ug, pelo menos 176 ug, pelo menos 178 ug, pelo menos 180 ug, pelo menos 182 ug, pelo menos 184 ug, pelo menos 186 ug, pelo menos 188 ug, pelo me- nos 190 ug, pelo menos 192 ug, pelo menos 194 ug, pelo menos 196 vg, pelo menos 198 ug, ou pelo menos 200 ug, por exemplo, em uma solução tamponada.
[00229] Em geral, uma composição pode ser formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Um exemplo não limitativo de uma via de administração pretendida é a administra-
ção local (por exemplo, administração intracoclear). Em algumas mo- dalidades, as composições terapêuticas são formuladas para incluir uma nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas são formuladas para incluir uma nanopartícula polimérica. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas são formula- das para compreender um DNA minicircular. Em algumas modalida- des, as composições terapêuticas são formuladas para compreender um DNA CELID. Em algumas modalidades, as composições terapêuti- cas são formuladas para compreender uma solução sintética de peri- linfa. Uma solução de perilinfa sintética exemplificativa inclui 20-200 mM de NaCl; 1-5 mM de KCI; 0,1-10 mM de CaCl,; 1-10 mM de Glico- se; 2-50 mM de HEPES, com um pH entre cerca de 6 e cerca de 9.
[00230] Também são fornecidos kits, incluindo qualquer uma das composições descritas neste documento. Em algumas modalidades, um kit pode incluir uma composição sólida (por exemplo, uma compo- sição liofilizada incluindo os pelo menos dois vetores diferentes descri- tos neste documento) e um líquido para solubilizar a composição liofili- zada. Em algumas modalidades, um kit pode incluir uma seringa pré- carregada, incluindo qualquer uma das composições descritas neste documento.
[00231] Em algumas modalidades, o Kit inclui um frasco que com- preende qualquer uma das composições descritas neste documento (por exemplo, formuladas como uma composição aquosa, por exem- plo, uma composição farmacêutica aquosa).
[00232] Em algumas modalidades, os kits podem incluir instruções para executar qualquer um dos métodos descritos neste documento. Aparelhos e Métodos Cirúrgicos
[00233] São fornecidos neste documento os sistemas de aplicação terapêutica para o tratamento da perda auditiva e/ou perda de visão (por exemplo, síndrome de Usher tipo III, retinite pigmentosa). Em um aspecto, os sistemas de administração terapêutica incluem i) um dis- positivo médico capaz de criar uma ou uma pluralidade de incisões em uma membrana de janela redonda de uma ouvido interno de um indi- víduo humano em necessidade e ii) uma dose eficaz de uma composi- ção (por exemplo, qualquer uma das composições descritas neste do- cumento). Em algumas modalidades, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas.
[00234] “Também são fornecidos neste documento métodos cirúrgi- cos para o tratamento da perda auditiva (por exemplo, síndrome de Usher tipo 111). Em algumas modalidades, os métodos incluem as eta- pas de: introdução em uma cóclea de um indivíduo humano, uma pri- meira incisão em um primeiro ponto de incisão; e administrar intraco- clearmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste documento. Em algumas modalida- des, a composição é administrada ao indivíduo no primeiro ponto de incisão. Em algumas modalidades, a composição é administrada ao indivíduo na primeira incisão ou através da primeira incisão.
[00235] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, qualquer uma das composições descritas neste documento é administrada ao indivíduo na ou através da mem- brana da janela oval da cóclea. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, qualquer uma das com- posições descritas neste documento é administrada ao indivíduo na membrana de janela redonda da cóclea ou através da membrana de janela redonda da cóclea. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição é administrada usando um dispositivo médico capaz de criar uma pluralidade de inci- sões na membrana da janela redonda. Em algumas modalidades, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas. Em algu- mas modalidades, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de mi-
croagulhas, incluindo um primeiro aspecto geralmente circular, em que cada microagulha tem um diâmetro de pelo menos cerca de 10 míií- crons. Em algumas modalidades, o dispositivo médico inclui uma base and/or um reservatório capaz de reter a composição. Em algumas mo- dalidades, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas ocas, individualmente, incluindo um lúmen capaz de transferir a com- posição. Em algumas modalidades, o dispositivo médico inclui um meio para gerar pelo menos um vácuo parcial.
[00236] Também são fornecidos neste documento métodos cirúrgi- cos para o tratamento da perda de visão (por exemplo, retinite pigmen- tosa). Em algumas modalidades, os métodos incluem as etapas de: administração intraocular de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições fornecidas neste documento.
[00237] A invenção é descrita, adicionalmente, em detalhes por re- ferência aos seguintes exemplos experimentais. Esses exemplos são providos para fins de ilustração apenas, e não se destinam a serem limitantes, salvo indicação em contrário. Assim, a invenção não deve de forma alguma ser interpretada como estando limitada aos seguintes exemplos, mas, em vez disso, deve ser interpretada de forma a abran- ger quaisquer e todas as variações que se tornam evidentes como re- sultado dos ensinamentos providos neste documento.
[00238] Sem mais descrição, crê-se que um versado na técnica po- de utilizar a descrição precedente e os exemplos ilustrativos seguintes, fazer e utilizar os compostos da presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Os seguintes exemplos de trabalho apontam especifica- mente a vários aspectos da presente invenção, e não são para ser inter- pretados como limitando de qualquer forma o restante da divulgação.
EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de vetores virais
[00239] O AAV recombinante é gerado por transfecção com um mé-
todo livre de adenovírus conforme usado por Xiao et al. J. Virol. 73(5):3994-4003, 1999. Os plasmídeos cis com ITRs de AAV, o plas- mídeo trans com genes Rep e Cap de AAV e um plasmídeo auxiliar com uma região essencial de um genoma de adenovírus são cotrans- fectados em células 293 em uma razão de 1:1:2. Os vetores AAV usa- dos neste documento expressam CLRN1 humana ou CLRN1 de ca- mundongo sob múltiplas estratégias de vetor duplo usando os constru- tos descritos abaixo. Os sorotipos AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, rh8, rhi10, rh39, rh43 e Anc80O são preparados para encapsular três conjun- tos de construtos de CLRN1 para testar (i) uma estratégia de conca- temerização-transplicing, (ii) uma estratégia híbrida de recombinação homóloga intrônica-transplicing e (ili) uma estratégia de recombinação homóloga exônica, conforme resumido por Pryadkina et al., Meth. Clin. Devel. 2:15009, 2015. Exemplo 2: Geração e Purificação de Partículas Virais
[00240] O AAV-1 recombinante é produzido usando um protocolo de transfecção tripla e purificado por dois gradientes de densidade se- quenciais de cloreto de césio (CsCI), conforme descrito por Pryadkina et al., Mol. Ther. 2:15009, 2015. No final da segunda centrifugação, 11 frações de 500 ul são recuperadas do tubo de gradiente de densidade CsCI e purificadas por diálise em 1x PBS. As frações são analisadas por dot blot para determinar aquelas que contêm genomas de rAAV. O número do genoma viral (vg) de cada preparação é determinado por um método de titulação baseado em PCR quantitativo em tempo real usando primers e sonda correspondentes à região ITR do genoma do vetor AAV (Bartoli et al. Gene. Ther. 13:20-28, 2006). Exemplo 3: Formulação de Partículas Virais
[00241] — AAV produzido em um título de 1614 vg/mL é preparado em diluições de 3,2813, 1,0013, 3,2012, 1,0012 vg/mL em perilinfa artifici- al. A perilinfa artificial é preparada combinando os seguintes reagen-
tes: NaCl, 120 mM; KCl, 3,5 mM; CaCl2, 1,5 mM; glicose, 5,5 mM; HEPES, 20 mM. A perilinfa artificial titulada com NaOH para ajustar seu pH para 7,5 (concentração total de Na* de 130 mM) (Chen et al., J. Controlled Rel. 110:1-19, 2005). Exemplo 4: Descrição do Dispositivo
[00242] A formulação AAV-CLRN1 é fornecida à cóclea usando um microcateter especializado projetado para a penetração consistente e segura da membrana da janela redonda (RWM). O microcateter é moldado de modo que o cirurgião que realiza o procedimento de apli- cação possa entrar na cavidade do ouvido médio através do canal au- ditivo externo e entrar em contato com a extremidade do microcateter com o RWM. A extremidade distal do microcateter é composta por pe- lo menos uma microagulha com diâmetro entre 10 e 1.000 mícrons, que produz perfurações no RWM que são suficientes para permitir que AAV-CLRN1 entre na perilinfa coclear da escala do tímpano a uma taxa de aproximadamente 1 ul/min, mas pequenas o suficiente para cicatrizar sem reparo cirúrgico. A porção restante do microcateter, pro- ximal à(s) microagulha(s), é carregada com a formulação de AAV- CLRN1/perilinfa artificia em um título de aproximadamente 1e13 vg/mL. A extremidade proximal do microcateter é conectada a um mi- cromanipulador que permite infusões precisas e de baixo volume de aproximadamente 1 uL/min. Exemplo 5: Modelo Animal 1A: Método Cirúrgico em Camundon- gos Idosos
[00243] —AAV-CLRN1 preparado em perilinfa artificial é administrado à escala do tímpano em camundongos, conforme descrito por Shu et al. (Human Gene Therapy, doi: 10.1089/hum.2016.053, junho de 2016). Camundongos machos com seis semanas de idade são anes- tesiados usando uma injeção intraperitoneal de xilazina (20 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg). A temperatura corporal é mantida a 37ºC usan-
do uma almofada de aquecimento elétrica. Uma incisão é feita na regi- ão pós-auricular direita e a bula timpânica é exposta. A bula é perfura- da com uma agulha cirúrgica e o pequeno orifício é expandido para dar acesso à cóclea. O osso da parede lateral da cóclea da escala do tímpano é desbastado com uma broca dentária para que a parede la- teral membranosa permaneça intacta. Um sistema de microinjeção Nanoliter em conjunto com a micropipeta de vidro é usado para forne- cer um total de aproximadamente 300 nL de AAV-CLRN1 em perilinfa artificial para a escala do tímpano a uma taxa de 2 nL segundo. A mi- cropipeta de vidro é deixada no local por 5 minutos após a injeção. Após cocleostomia e injeção, a abertura na bula timpânica é selada com cimento dentário e o músculo e a pele são suturados. Os camun- dongos podem acordar da anestesia e sua dor é controlada com 0,15 mg/kg de cloridrato de buprenorfina por 3 dias. Exemplo 6: Modelo Animal 2: Microbomba Recíproca em Porqui- nho-da-Índia Procedimento Cirúrgico
[00244] —AAV- CLRN1 preparado em perilinfa artificial é administrado a porquinhos da índia para avaliar a distribuição e a toxicidade após a entrega intracoclear com uma microbomba recíproca, conforme des- crito por Tandon et al., Lab Chip, DOI: 10.1039/c5/c01396h, 2015. Porquinhos-da-índia machos pesando aproximadamente 350 g cada (n = 16) são anestesiados com uma combinação de pentobarbital sódico (Nembutal; 25 mg kg - 1, injetado por via intraperitoneal), fentanil (0,2 mg kg — 1, por via intramuscular) e haloperidol (10 mg kg - 1, por via intramuscular). A lidocaína com epinefrina é administrada por via sub- cutânea no local da incisão como anestésico tópico. Usando uma abordagem dorsal, um orifício de 5 mm de diâmetro é feito na bula e uma cocleostomia é criada aproximadamente 0,5 mm distal à mem- brana da janela redonda. A cânula da microbomba (descrita abaixo) é inserida na cocleostomia, rosqueada na cóclea 3 mm apicalmente e colada à bula com uma cola de cianoacrilato comum. Para medições de potencial de ação composto (CAP), um eletrodo de fio de prata iso- lado com perfluoroalcóxi-alcano (203 um de diâmetro não revestido) é inserido perto do nicho da janela redonda e colado à bula.
[00245] Os procedimentos de medição das emissões otoacústicas por produtos de distorção (EOAPD) e CAPs são realizados conforme descrito anteriormente em Tandon et al. Biomed Microdevices 2015, 17:3-21. As EOAPD são medidas antes e após o procedimento de co- cleostomia nas frequências características: 32, 24, 16, 12, 8, 56,4 e 2,78 kHz para monitorar qualquer dano que ocorra como resultado da cirurgia.
[00246] —AAV-CLRN1 em um título máximo de 1e14 vg/mL é admi- nistrado ao porquinho-da-índia usando uma microbomba conforme descrito por Tandon et al. Lab Chip, DOI: 10.1039/c5/c01396h, 2015. O sistema de microbomba possui 4 portas selecionáveis. Essas portas são conectadas a: (i) um grande capacitor fluídico usado para armaze- namento de perilinfa artificial; (ii) uma saída que se conecta à cóclea; (iii) a saída de um reservatório AAV-CLRN1 integrado; (iv) a entrada para o reservatório AAV-CLRN1 integrado. Cada porta é conectada de forma fluida a uma câmara central da bomba e cada uma é endereça- da individualmente com uma válvula. A sequência de eventos para a entrega recíproca de AAV-CLRN1 é a seguinte: (i) um ciclo de atuali- zação de AAV-CLRN1 interno é executado, transferindo AAV-CLRN1 do reservatório AAV-CLRN1 para a linha principal de retirada de infu- são; (ii) AAV-CLRN1 é infundido na cóclea e alguma perilinfa artificial é drenada do capacitor de armazenamento de perilinfa artificial; (ili) as duas primeiras etapas podem ser repetidas várias vezes para doses adicionais; (iv) após o AAV-CLRN1 ter sido permitido difundir por al- gum tempo, um volume de perilinfa é retirado da cóclea que é igual ao volume infundido nas etapas (i) - (iii), recarregando o capacitor de ar- mazenamento de perilinfa artificial. Este processo resulta na distribui- ção líquida de fármaco com zero volume líquido de fluido adicionado à cóclea.
[00247] Os capacitores fluídicos na microbomba são câmaras cilín- dricas cujos tetos são uma membrana de poli-imida fina (25,4 um) fle- xível. A câmara da bomba tem um diâmetro de 3,5 mm, o condensador de armazenamento de fluidos tem um diâmetro de 14 mm e todos os condensadores restantes têm um diâmetro de 4 mm. A mesma mem- brana é desviada para bloquear o fluxo em cada uma das válvulas. As câmaras das válvulas têm diâmetros de 3,1 mm. O canal de serpentina que compreende o reservatório de fármaco tem uma seção transversal quadrada de largura 762 um e comprimento de 410 mm para um vo- lume total de 238 ul. Todos os outros microcanais da bomba têm uma largura de 400 um e uma altura de 254 um. Distribuição aquda de fármacos em porquinhos-da-índia
[00248] A microbomba é carregada com AAV-CLRN1 e perilinfa ar- tificial, e a cânula inserida em uma cocleostomia feita na região da có- clea entre os locais com sensibilidade de frequência característica de 24 e 32 kHz, e rosqueada apicalmente 3 mm, terminando na região de 12-16 kHz. Os testes de audição DPOAE e CAP de linha de base são realizados antes do início da infusão de AAV-CLRN1/perilinfa artificial. A bomba é então ativada e aproximadamente 1 uL de perilinfa artificial é infundido a cada 5 minutos até que um total de aproximadamente 10 uL de perilinfa artificial seja distribuído à cóclea. Após um tempo de espera de 20 minutos, aproximadamente 10 uL de perilinfa são retira- dos da cóclea. A distribuição de AAV-CLRN1 é então iniciada a uma taxa de aproximadamente 1 ul a cada 5 minutos até que um total de aproximadamente 10 uL de fluido seja distribuído.
[00249] Os animais são sacrificados 1 semana, 1 mês, 3 meses e 6 meses após o tratamento (n = 4 por grupo) e as suas cócleas são ex- traídas. A extensão da transdução de AAV e expressão de CLRN1 ao longo do órgão de Corti é avaliada por meio de imunocoloração com anticorpos anti-CLRN1. Anticorpos contra marcadores de células cilia- das (Myo7a) e células de suporte (Sox2) são usados para quantificar IHCs, OHCs, células de suporte e morfologia de estereocílios. A colo- ração com anexina V é usada para avaliar a evidência de apoptose em células ao longo do epitélio sensorial coclear.
Exemplo 7: Modelo Animal 3: Ovelha
[00250] — AAV-CLRN1 preparado em perilinfa artificial é administrado a ovelhas juvenis para avaliar a distribuição e a toxicidade após a dis- tribuição à cóclea por meio de infusão trans-RWM. A resposta auditiva do tronco cerebral (ABR) e as emissões optoacústicas por produto de distorção (EOAPD) são medidas em ovelhas com 3 meses de idade (n = 40), bilateralmente, para avaliar a função de células ciliadas internas (IHC) e células ciliadas externas (OHC). Após as medições de ABR e DPOAE de linha de base, 20 ul de AAVI-CLRN1 em títulos de 1,0e14, 3,2013, 1,0013 e 3,2012 vg/mL são injetados na escala do tímpano esquerda das ovelhas (n=10 por grupo). O ouvido direito de cada animal é deixado como um controle não tratado. As medições ABR e DPOAE são feitas novamente bilateralmente nos animais juve- nis e adultos 1, 5 e 10 dias após o procedimento cirúrgico. Aos 6 me- ses após o procedimento, medições adicionais de ABR e DPOAE bila- terais são feitas de todos os animais, e os animais são subsequente- mente sacrificados e suas cócleas removidas.
[00251] Em metade dos animais sacrificados (n = 5 de cada uma das coortes de dose), a imunocoloração é realizada para identificar as estruturas das células ciliadas e para avaliar a expressão da proteína CLRN1 ao longo do epitélio sensorial coclear. Anticorpos contra mar- cadores para células ciliadas (Myo7a), células de suporte (Sox2) e
CLRN1 são usados conforme descrito anteriormente (Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519). Nos giros basal, médio e apical do órgão de corti, o número total de células ciliadas e as células cilia- das que expressam CLRN1 são contados em regiões de 200 um.
[00252] Na metade restante dos animais sacrificados (5 animais restantes de cada coorte de dose), as amostras de tecido coclear são coletadas das mesmas regiões basal, média e apical, conforme des- crito acima, e analisadas quanto à transcrição do MRNA de CLRN1. Exemplo 8: Exemplo Clínico Humano (Tratamento Pediátrico)
[00253] O paciente é colocado sob anestesia geral. O cirurgião aborda a membrana timpânica pelo meato acústico externo, faz uma pequena incisão na borda inferior do meato acústico externo, onde ela se encontra com a membrana do tímpano, e levanta a membrana tim- pânica como um retalho para expor o espaço do ouvido médio. Um laser cirúrgico é usado para fazer uma pequena abertura (aproxima- damente 2 mm) na placa do estribo. O cirurgião então penetra na membrana da janela redonda com um microcateter carregado com uma solução de AAV-CLRN1 preparada em perilinfa artificial a um títu- lo de 1613 vg/mL. O microcateter é conectado a um micromanipulador que infunde aproximadamente 20 ul da solução AAV-CLRN1 a uma taxa de aproximadamente 1 uL/min. Na conclusão da infusão de AAV- CLRN1, o cirurgião retira o microcateter e remende os orifícios da pla- ca do estribo e do RWM com um remendo de espuma de gel. O pro- cedimento é concluído com a troca do retalho de membrana timpânica. Exemplo 9: Teste Pré-Natal Não Invasivo de Sangue Materno para Detectar Mutação CLRN1
[00254] — Amostras de sangue materno (20-40 mL) são coletadas em tubos de DNA sem células. Pelo menos 7 mL de plasma são isolados de cada amostra por meio de um protocolo de dupla centrifugação de
2.000 g por 20 minutos, seguido de 3.220 g por 30 minutos, com trans-
ferência do sobrenadante após a primeira rotação. O cfDNA é isolado de 7-20 mL de plasma usando um kit QIAGEN QIAmp&O Circulating Nuclei Acid e eluído em 45 uL de tampão TE. O DNA genômico mater- no puro é isolado da camada leucocitária obtida após a primeira centri- fugação.
[00255] — Ao combinar a modelagem termodinâmica dos ensaios para selecionar sondas com probabilidade minimizada de interação sonda- sonda com abordagens de amplificação descritas anteriormente (Stiller et al. 2009 Genome Res 19(10):1843-1848), a multiplexação de
11.000 ensaios pode ser alcançada. Amostras de cfDNA materno e DNA genômico materno são pré-amplificadas por 15 ciclos usando
11.000 ensaios específicos do alvo e uma alíquota é transferida para uma segunda reação de PCR de 15 ciclos usando primers aninhados. As amostras são preparadas para sequenciamento adicionando eti- quetas com código de barras em uma terceira rodada de 12 ciclos de PCR. Os amplicons são então sequenciados usando um sequenciador Illumina HiSeg. O alinhamento da sequência do genoma é realizado usando software disponível comercialmente. Exemplo 10: Estratégia de Trans-Splicing de Adenovírus (AAV)
[00256] Pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes (por exemplo, vetores AAV) podem ser usados para reconstituir um gene de CLRN1 ativo (por exemplo, um gene de CLRN1 de comprimento total) dentro de uma célula após concatamerização intermolecular e trans-splicing. Ver, por exemplo, Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:12; 6716-6721, 2000, incorporado em sua totalidade neste docu- mento.
[00257] Em alguns exemplos, serão usados dois vetores de ácido nucleico diferentes. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento), uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na ex- tremidade 3' do promotor (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de um porção de uma proteína CLRN1 descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções N-terminais de uma proteína CLRN1 des- crita neste documento), e uma sequência doadora de splice posiciona- da na extremidade 3' da primeira sequência de codificação.
Um se- gundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma sequência aceptora de splice, uma segunda sequência de codificação que codifica uma por- ção C-terminal de uma proteína CLRN1 (ou seja, toda a porção da pro- teína CLRN1 que não está incluída na porção N-terminal) posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splice (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de uma porção de uma proteína CLRN1 descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções C-terminal de uma proteína CLRN1 descrita neste documento), e uma sequência de poliadenilação em a extremidade 3' da segunda sequência de codi- ficação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em algumas modalidades, cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento (por exemplo, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 75 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos de comprimento), a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas não se sobrepõe à sequência da outra porção codificada, e nenhum vetor dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de comprimento total). Quando intro- duzida em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento) o splicing ocorre en- tre a sequência doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma pro- teína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de comprimen- to completo).
[00258] Em outro exemplo, três vetores de ácido nucleico diferentes podem ser usados.
Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir uma porção de uma sequência promotora (por exemplo, qualquer uma das sequências promotoras descritas neste documento), uma primeira sequência codificadora de um gene de CLRN1 que codifica uma pri- meira porção de uma proteína CLRN1 (por exemplo, qualquer uma das sequências de codificação de CLRN1 descritas neste documento) posicionadas a 3' do promotor, e uma primeira sequência doadora de splice posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codifi- cação.
Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma primeira sequência aceptora de splice, uma segunda sequência de codificação de um gene de CLRN1 que codifica uma segunda porção de uma pro- teína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da primeira sequência aceptora de splice e uma segunda sequência doadora de splice posi- cionada na extremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências doadoras de splice descritas neste documento). Uma característica do segundo vetor de ácido nu- cleico será que o auto-splicing não pode ocorrer (ou seja, não ocorrerá splicing entre a segunda sequência doadora de splice e a primeira se- quência sinal aceptora de aceptora do segundo vetor de ácido nuclei- co). Em algumas modalidades, a sequência doadora de splice do pri- meiro vetor de ácido nucleico e a segunda sequência doadora de spli- ce do segundo vetor de ácido nucleico são iguais (por exemplo, qual- quer uma das sequências doadoras de splice descritos neste docu- mento ou conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, a primei- ra sequência doadora de splice do primeiro vetor de ácido nucleico e a segunda sequência doadora de splice do segundo vetor de ácido nu- cleico são diferentes (por exemplo, qualquer uma das sequências do- adoras de splice descritas neste documento ou conhecidas na técni- ca). Um terceiro vetor de ácido nucleico incluirá uma segunda sequên-
cia aceptora de splice, uma terceira sequência de codificação de um gene de CLRN1 que codifica uma terceira porção de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da segunda sequência aceptora de splice e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremi- dade 3' da terceira sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em tais métodos onde três vetores de ácido nucleico são usados, a primeira sequência doadora de splice e a primeira sequência aceptora de splice podem ser montadas juntas e a segunda sequência doadora de splice e a segunda sequência aceptora de splice podem ser monta- das (recombinar) e as porções da proteína CLRN1 respectivamente codificadas pela primeira, segunda e terceira sequências de codifica- ção não se sobrepõem, e quando introduzidas em uma célula de ma- miífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento), ocorre splicing entre a primeira sequência doadora de splice e a primeira sequência aceptora de splice, e entre a segunda sequência doadora de splice e a segunda sequência aceptora de spli- ce, para formar um ácido nucleico recombinado que codifica uma pro- teína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa). Com base nas estratégias fornecidas acima, um versado na técnica entenderia como desenvolver uma estratégia usando quatro, cinco ou seis vetores de ácido nucleico diferentes.
[00259] Em qualquer um dos exemplos destes métodos, nenhuma das sequências de aminoácidos das porções codificadas se sobrepõe a qualquer outra porção codificada e nenhum vetor único codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de compri- mento total).
[00260] Cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, e cada uma das porções codificadas pode ter pelo menos 30 aminoácidos (por exemplo, entre cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, ou qualquer das outras subfaixas desta faixa descritas neste documento).
[00261] Em algumas modalidades, cada uma das sequências de codificação pode incluir pelo menos um éxon e pelo menos um íntron da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, pelo menos dois éxons e pelo menos um íntron, pelo menos dois éxons e pelo menos dois íntrons, em pelo menos três éxons e pelo menos um íntron, pelo menos três éxons e pelo menos dois íntrons, ou pelo menos três éxons e pelo menos três íntrons). Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois ve- tores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, e cada uma das porções codificadas pode codificar até 80% da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID NO: 1) de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha. Em algumas modalida- des, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma se- quência de codificação que codifica uma porção diferente de uma pro- teína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando até 80% da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID NO: 3), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifi- ca uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das por- ções codificadas codificando até 80% da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID NO: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha. Em algumas modalida- des, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma se-
quência de codificação que codifica uma porção diferente de uma pro- teína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando até 80% da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID NO: 7), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha.
[00262] Cada um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico pode incluir ainda uma repetição terminal invertida (ITR) para permitir a recombinação cabeça-a-cauda. A ITR será subsequentemente re- movida por splicing. Por exemplo, o ITR pode ser um palindrômico du- plo D ITR conforme descrito em Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (12): 6716-6721, 2000, incorporado neste documento em sua totali- dade, ou um AAV serótipo 2 ITR como descrito em Gosh et al., Mol. Ther. 16: 124-130, 2008, e Gosh et al., Human Gene Ther. 22: 77-83,
2011. Exemplos não limitativos de sequências aceptoras e/ou doado- ras de splice são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Reich et al., Human Gene Ther. 14(1):37-44, 2003 e Lai et al. (2005) Nat. Bio- technol. 23(11):1435-1439, 2005, 2005. As sequências doadora e aceptora de splice podem ser qualquer sequência doadora/aceptora de splice de íntron endógeno de um gene (por exemplo, um gene CLRN1). Por exemplo, a sequência doadora de splice pode ser: 5'- GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATA- GAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT-3 '((SEQ ID NO: 22) e a sequência de aceitador de splice pode ser 5"- GATAGGCACCTATTGGTCTTACTG ACATCCACTTTGCCTTT- CTCTCCACAG-3' (SEQ ID NO: 23) (ver, por exemplo, Trapani et al., EMBO Mol. Med. 6(2): 194-211, 2014). Os métodos de avaliação do splicing e da eficiência do splicing são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Lai et al., Nat. Biotechnol. 23(11): 1435-1439, 2005). Exemplo 11: Estratégia de Trans-Splicing de Vetor Híbrido usando uma região de gene exógeno altamente recombinogênica de fos- fatase alcalina (AP)
[00263] Pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) vetores de ácido nucleico diferentes (por exemplo, vetores AAV) também podem ser usados em qualquer um dos métodos descritos neste documento para reconstituir um gene da CLRN1 ativo (por exemplo, um gene da CLRN1 completa) dentro de uma célula após concatamerização intermolecular, recombinação mediada por gene marcador e trans-splicing. Esta estratégia é uma estratégia híbrida, uma vez que inclui recombinação homóloga e/ou trans-splicing. Ver, por exemplo, Gosh et al., Mol. Ther. 16: 124-130, 2008; Gosh et al., Human Gene Ther. 22: 77-83, 2011; e Duan et al., Mol. Ther. 4: 383- 391, 2001, cada um incorporado neste documento em sua totalidade. Conforme usado neste documento, um gene marcador detectável po- de ser uma sequência de DNA altamente recombinogênica que permi- tirá a recombinação independente da sequência de codificação. Um exemplo não limitativo de um gene marcador detectável é um gene da fosfatase alcalina (AP). Por exemplo, o gene marcador detectável po- de ser o terço intermediário do DNA complementar AP da placenta humana, que tem 872 bp de comprimento (ver, por exemplo, Gosh et al., 2008). Pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes conte- rão um gene marcador detectável (por exemplo, qualquer um dos ge- nes marcadores detectáveis descritos neste documento). Uma vez que o vetor híbrido será construído com base em um vetor trans-splicing conforme descrito no Exemplo 10, um gene da CLRN1 ativo (por exemplo, um gene da CLRN1 completa) pode ser reconstituído usando recombinação mediada por ITR e trans-splicing ou recombinação me- diada por gene marcador detectável e trans-splicing (por exemplo, mediada por gene AP). Após o trans-splicing, um gene da CLRN1 ati- vo (por exemplo, um gene da CLRN1 completa) será reconstituído no
DNA genômico de uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer cé- lula de mamífero descrita neste documento).
[00264] Em um exemplo, dois vetores de ácido nucleico diferentes serão usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento), uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremida- de 3' do promotor (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de um porção de uma proteína CLRN1 descrita neste documento e/ou qual- quer uma das porções N-terminais de uma proteína CLRN1 descrita neste documento), uma sequência doadora de splice posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação, e um primeiro marcador de gene posicionado na extremidade 3' da sequência doado- ra de splice. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir um se- gundo gene marcador detectável, uma sequência aceptora de splice posicionada na extremidade 3' do segundo gene marcador detectável, uma segunda sequência de codificação que codifica uma porção C- terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splice (por exemplo, qualquer um dos tama- nhos de uma porção de uma proteína CLRN1 descrita neste documen- to e/ou qualquer uma das porções C-terminal de uma proteína CLRN1 descrita neste documento), e uma sequência de poliadenilação na ex- tremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qual- quer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documen- to). Em algumas modalidades, cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento (por exem- plo, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 75 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos de comprimento), as sequências de aminoá- cido das porções codificadas não se sobreponham, e nenhum vetor dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa). Quando introduzida em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento) o splicing ocorre entre a se- quência doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de comprimento completo).
[00265] Em outro exemplo, três vetores de ácido nucleico diferentes podem ser usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir uma porção de sequência promotora (por exemplo, qualquer uma das sequências promotoras descritas neste documento), uma primeira se- quência codificadora de um gene de CLRN1 que codifica uma primeira porção de uma proteína CLRN1 (por exemplo, qualquer uma das se- quências de codificação de CLRN1 descritas neste documento) posici- onadas a 3' do promotor, uma primeira sequência doadora de splice posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação, e um primeiro gene marcador detectável. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir um segundo gene marcador detectável, uma pri- meira sequência aceptora de splice posicionada na extremidade 3' do segundo gene marcador detectável, uma segunda sequência de codi- ficação de um gene de CLRN1 que codifica uma segunda porção de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da primeira se- quência aceptora de splice, uma segunda sequência doadora de splice posicionada na extremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma sequências doadoras de splice descritas neste documento) e um terceiro gene marcador detectável. Uma ca- racterística do segundo vetor de ácido nucleico será que o auto- splicing não pode ocorrer (ou seja, não ocorrerá splicing entre a se- gunda sequência doadora de splice e a primeira sequência sinal acep- tora de aceptora do segundo vetor de ácido nucleico). Em algumas modalidades, a sequência doadora de splice do primeiro vetor de áci- do nucleico e a segunda sequência doadora de splice do segundo ve- tor de ácido nucleico são iguais (por exemplo, qualquer uma das se- quências doadoras de splice descritos neste documento ou conheci- dos na técnica). Em algumas modalidades, a primeira sequência doa- dora de splice do primeiro vetor de ácido nucleico e a segunda se- quência doadora de splice do segundo vetor de ácido nucleico são di- ferentes (por exemplo, qualquer uma das sequências doadoras de splice descritas neste documento ou conhecidas na técnica). Um ter- ceiro vetor de ácido nucleico pode incluir um quarto gene marcador detectável, uma segunda sequência aceptora de splice posicionada na extremidade 3' do quarto gene marcador detectável, uma terceira se- quência de codificação de um gene de CLRN1 que codifica uma tercei- ra porção de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da segunda sequência aceptora de splice e uma sequência de poliadeni- lação posicionada na extremidade 3' da terceira sequência de codifica- ção (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em tais métodos onde três vetores de ácido nucleico são usados, a primeira sequência doadora de splice e a primeira sequência aceptora de splice podem ser montadas juntas (re- combinar) e a segunda sequência doadora de splice e a segunda se- quência aceptora de splice podem ser montadas (recombinar) e as porções da proteína CLRN1 respectivamente codificadas pela primei- ra, segunda e terceira sequências de codificação não se sobrepõem uma na outra, e quando introduzidas em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste do- cumento), ocorre splicing entre a primeira sequência doadora de splice e a primeira sequência aceptora de splice, e entre a segunda sequên- cia doadora de splice e a segunda sequência aceptora de splice, para formar um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína
CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa). Como pode ser apreciado na técnica, quando três vetores de ácido nucleico são usados, dois dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico dife- rentes podem incluir um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP) e um dos pelo menos dois diferentes os vetores de ácido podem incluir uma sequência aceptora de splice que é com- plementar a uma sequência doadora de splice em um vetor de ácido nucleico que inclui um gene marcador detectável. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro e o segundo vetores de ácido nuclei- co podem incluir um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP) e o terceiro vetor de ácido nucleico incluirá uma se- quência aceptora de splice que é complementar à sequência doadora de splice no segundo vetor de ácido nucleico, e o terceiro vetor de áci- do nucleico não incluirá um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP). Em outros exemplos, o segundo e o tercei- ro vetor de ácido nucleico podem incluir um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP), e o primeiro vetor de ácido nucleico incluirá uma sequência doadora de splice que é complemen- tar à sequência aceptora de splice no segundo vetor de ácido nucleico e o primeiro vetor de ácido nucleico não incluirá um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP).
[00266] “Com base nas estratégias fornecidas acima, um versado na técnica entenderia como desenvolver uma estratégia usando quatro, cinco ou seis vetores.
[00267] As sequências de codificação CLRN1 fornecidas em pelo menos dois vetores de ácido nucleico (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) não irão se sobrepor. Cada um dos pelo menos dois ve- tores diferentes pode incluir uma sequência de codificação que codifi- ca uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das por- ções codificadas tendo, por exemplo, pelo menos 30 aminoácidos (por exemplo, entre cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1600 aminoáci- dos, ou qualquer das outras subfaixas desta faixa descritas neste do- cumento).
[00268] Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando pelo menos um éxon e pelo menos um íntron de SEQ ID NO: 9 (por exemplo, pelo menos dois éxons e pelo menos um fíntron, pelo menos dois éxons e pelo menos dois íntrons, pelo me- nos três éxons, pelo menos um íntron, pelo menos três éxons e pelo menos dois íntrons, ou pelo menos três éxons e pelo menos três ín- trons). Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois veto- res diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codi- ficadas codificando até 80% de SEQ ID NO: 1 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID NO: 1), de modo que cada uma das porções codificadas não se so- breponha. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando até 80% de SEQ ID NO: 3 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% até 70% da SEQ ID NO: 3), de modo que cada uma das porções codificadas não se so- breponha. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando até 80% de SEQ ID NO: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID NO: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifi- ca uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das por- ções codificadas codificando até 80% de SEQ ID NO: 7 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% até 70% da SEQ ID NO: 7), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha.
[00269] — Conforme descrito no Exemplo 10, cada um dos pelo me- nos dois vetores de ácido nucleico pode incluir ainda uma repetição terminal invertida (ITR) para permitir a recombinação cabeça-a-cauda. A ITR será subsequentemente removida por splicing. Exemplos de ITRs e sequências aceptoras de splice e/ou sequências doadoras de splice são conhecidos na técnica e foram descritos no Exemplo 10. Exemplo 12: Estratégia de Trans-Splicing de Vetor Híbrido usando uma região de gene exógeno altamente recombinogênica de fago F1 (AK)
[00270] Pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) vetores de ácido nucleico diferentes (por exemplo, vetores AAV) também podem ser usados em qualquer um dos métodos descritos neste documento para reconstituir um gene da CLRN1 ativo (por exemplo, um gene da CLRN1 completa) dentro de uma célula após concatamerização intermolecular, recombinação mediada por gene marcador e trans-splicing. Esta estratégia é uma estratégia híbrida, uma vez que inclui recombinação homóloga e/ou trans-splicing. Ver, por exemplo, Trapani et al., EMBO Mol. Med. 6(2): 194-211, 2014, in- corporado neste documento em sua totalidade. Conforme usado neste documento, uma região recombinogênica de fago F1 (AK) será usada para permitir a recombinação independente da sequência de codifica- ção. A região recombinogênica do fago F1 pode ser uma região re- combinogênica de 77 bp do genoma do fago F1 conforme descrito em Trapani et al. (2014). Pelo menos dois vetores de ácido nucleico dife-
rentes conterão uma região recombinogênica do fago F1. Uma vez que o vetor híbrido será construído com base em um vetor trans- splicing, conforme descrito no Exemplo 10, um ácido nucleico que co- difica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa) pode ser gerado usando recombinação induzida por região recombinogênica do fago F1 e trans-splicing. Após o trans-splicing, um ácido nucleico que codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa) será gerado em uma célula de mamí- fero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento).
[00271] Em um exemplo, dois vetores de ácido nucleico diferentes serão usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento), uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremida- de 3' do promotor (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de um porção de uma proteína CLRN1 descrita neste documento e/ou qual- quer uma das porções N-terminais de uma proteína CLRN1 descrita neste documento), uma sequência doadora de splice posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação, e uma região re- combigênica do fago F1 posicionado na extremidade 3' da sequência doadora de splice. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma região recombinogênica do fago F1, uma sequência aceptora de splice posicionada na extremidade 3' da região recombinogênica do fago F1, uma segunda sequência de codificação que codifica uma por- ção C-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splice (por exemplo, qualquer um dos tama- nhos de uma porção de uma proteína CLRN1 descrita neste documen- to e/ou qualquer uma das porções C-terminal de uma proteína CLRN1 descrita neste documento), e uma sequência de poliadenilação na ex-
tremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qual- quer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documen- to). Em algumas modalidades, cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento (por exem- plo, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 75 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos de comprimento), a sequência de aminoácido de cada uma das porções codificadas não se sobrepõe, e nenhum ve- tor dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa). Quando introduzida em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento) o splicing ocorre entre a se- quência doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de comprimento completo).
[00272] Em outro exemplo, três vetores de ácido nucleico diferentes serão usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir uma sequência promotora (por exemplo, qualquer uma das sequências promotoras descritas neste documento), uma primeira sequência codi- ficadora que codifica uma primeira porção de uma proteína CLRN1 (por exemplo, qualquer uma das sequências de codificação de CLRN1 descritas neste documento) posicionadas a 5' do promotor, uma pri- meira sequência doadora de splice posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação, e uma região recombinogênica do fago F1. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma região recombinogênica de fago F1, uma primeira sequência aceptora de splice posicionada na extremidade 3' da região recombinogênica de fago F1, uma segunda sequência de codificação que codifica uma se- gunda porção de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da primeira sequência aceptora de splice, uma segunda sequência doadora de splice posicionada na extremidade 3' da segunda sequên- cia de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências doado- ras de splicing descritas neste documento) e uma região recombino- gênica de fago F1. Uma característica do segundo vetor de ácido nu- cleico será que o auto-splicing não pode ocorrer (ou seja, não ocorrerá splicing entre a segunda sequência doadora de splice e a primeira se- quência sinal aceptora de aceptora do segundo vetor de ácido nuclei- co). Em algumas modalidades, a sequência doadora de splice do pri- meiro vetor de ácido nucleico e a segunda sequência doadora de spli- ce do segundo vetor de ácido nucleico são iguais (por exemplo, qual- quer uma das sequências doadoras de splice descritos neste docu- mento ou conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, a primei- ra sequência doadora de splice do primeiro vetor de ácido nucleico e a segunda sequência doadora de splice do segundo vetor de ácido nu- cleico são diferentes (por exemplo, qualquer uma das sequências do- adoras de splice descritas neste documento ou conhecidas na técni- ca). Um terceiro vetor de ácido nucleico pode incluir uma região re- combinogênica de fago F1, um segunda sequência aceptora de splice posicionada na extremidade 3' da região recombinogênica de fago F1, uma terceira sequência de codificação que codifica uma terceira por- ção de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da segun- da sequência aceptora de splice e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da terceira sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descri- tas neste documento). Em tais métodos onde três vetores de ácido nu- cleico são usados, a primeira sequência doadora de splice e a primeira sequência aceptora de splice podem ser montadas juntas e a segunda sequência doadora de splice e a segunda sequência aceptora de spli- ce podem ser montadas (recombinar) e as porções da proteína CLRN1 respectivamente codificadas pela primeira, segunda e terceira sequên-
cias de codificação não se sobrepõem, e quando introduzidas em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamí- fero descritas neste documento), ocorre splicing entre a primeira se- quência doadora de splice e a primeira sequência aceptora de splice, e entre a segunda sequência doadora de splice e a segunda sequência aceptora de splice, para formar um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa). Como pode ser apreciado na técnica, quando três vetores de ácido nucleico são usados, dois dos diferentes vetores de ácido nucleico podem incluir uma região recombinogênica de fago F1 e um dos diferentes vetores de ácido nucleico pode incluir uma se- quência aceptora de splice que é complementar a uma sequência do- adora de splice em um vetor de ácido nucleico que inclui uma região recombinogênica de fago F1. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro e o segundo vetores de ácido nucleico podem incluir uma região recombinogênica de fago F1 e o terceiro vetor de ácido nucleico incluirá uma sequência aceptora de splice que é complementar à se- quência doadora de splice no segundo vetor de ácido nucleico, e o ter- ceiro vetor de ácido nucleico não incluirá uma região recombinogênica de fago F1 (por exemplo, um gene marcador de AP). Em outros exem- plos, o segundo e o terceiro vetor de ácido nucleico podem incluir uma região recombinogênica de fago F1 e o primeiro vetor de ácido nuclei- co incluirá uma sequência doadora de splice que é complementar à sequência aceptora de splice no segundo vetor de ácido nucleico e o primeiro vetor de ácido nucleico não incluirá uma região recombinogê- nica de fago F1. Com base nas estratégias fornecidas acima, um ver- sado na técnica entenderia como desenvolver uma estratégia usando quatro, cinco ou seis vetores.
[00273] As sequências de codificação CLRN1 fornecidas em cada um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico (por exemplo, dois,
três, quatro, cinco ou seis) não irão se sobrepor. Cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas tendo, por exemplo, pelo menos 30 aminoácidos (por exemplo, entre cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1600 aminoá- cidos, ou qualquer das outras subfaixas desta faixa descritas neste documento).
[00274] Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando pelo menos um éxon e pelo menos um íntron de SEQ ID NO: 9 (por exemplo, pelo menos dois éxons e pelo menos um fíntron, pelo menos dois éxons e pelo menos dois íntrons, pelo me- nos três éxons e pelo menos um íntron, pelo menos três éxons e pelo menos dois íntrons, ou pelo menos três éxons e pelo menos três ín- trons). Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois veto- res diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codi- ficadas codificando até 80% de SEQ ID NO: 1 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60%, ou até 70% da SEQ ID NO: 1), de modo que cada uma das porções codificadas não se so- breponha. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando até 80% de SEQ ID NO: 3 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60%, ou até 70% da SEQ ID NO: 3), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifi- ca uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das por-
ções codificadas codificando até 80% de SEQ ID NO: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60%, ou até 70% da SEQ ID NO: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha. Em algumas modalidades, cada um dos pelo me- nos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando até 80% de SEQ ID NO: 7 (por exem- plo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60%, ou até 70% da SEQ ID NO: 7), de modo que cada uma das porções codifica- das não se sobreponha.
[00275] Conforme descrito no Exemplo 10, cada um dos pelo me- nos dois vetores de ácido nucleico pode incluir ainda uma repetição terminal invertida (ITR) para permitir a recombinação cabeça-a-cauda. A ITR será subsequentemente removida por splicing. Exemplos de ITRs e sequências aceptoras de splice e/ou sequências doadoras de splice são conhecidos na técnica e foram descritos no Exemplo 10. Exemplo 13. Estratégia de Trans-Splicing de Vetor Híbrido usando Duas Isoformas CLRN1
[00276] Pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes (por exemplo, vetores AAV) podem ser usados para reconstituir um gene de CLRN1 ativo (por exemplo, um gene de CLRN1 de comprimento total) dentro de uma célula após concatamerização intermolecular e trans-splicing. Ver, por exemplo, Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:12; 6716-6721, 2000, incorporado em sua totalidade neste docu- mento.
[00277] Em alguns exemplos, serão usados dois vetores de ácido nucleico diferentes. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento), uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na ex-
tremidade 3' do promotor (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de um porção de uma proteína CLRN1 descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções N-terminais de uma proteína CLRN1 des- crita neste documento), e uma sequência doadora de splice posiciona- da na extremidade 3' da primeira sequência de codificação.
[00278] Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma se- quência aceptora de splice, uma segunda sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal de uma proteína CLRN1 (ou seja, toda a porção da proteína CLRN1 que não está incluída na porção N- terminal) posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splice (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de uma porção de uma proteína CLRN1 descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções C-terminal de uma proteína CLRN1 descrita neste docu- mento), e uma sequência sinal de poliadenilação em a extremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento).
[00279] Em algumas modalidades, cada uma das porções codifica- das tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento (por exemplo, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 75 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos de comprimento), as sequências de ami- noácido das duas porções codificadas não se sobreponham uma na outra, e nenhum vetor dos dois vetores diferentes codifica uma proteí- na CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 completa).
[00280] Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma primeira isoforma da proteína CLRN1 (por exemplo, SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codifica- ção que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas codificando até 80% da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID NO: 3), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha.
[00281] Em algumas modalidades, um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes inclui ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1 (por exemplo, SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma por- ção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codifi- cadas codificando até 80% da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID NO: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponha.
[00282] Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência codificadora que codifica uma porção diferente de uma segunda isoforma da proteína CLRN1. Em algumas modalidades, um dos pelo menos dois vetores de ácido nu- cleico diferentes inclui ainda uma sequência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1.
[00283] Quando introduzida em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste do- cumento), o splicing ocorre entre a sequência doadora de splice e a sequência aceptora de splice, formando assim um ácido nucleico re- combinado que codifica uma proteína CLRN1 ativa (por exemplo, uma proteína CLRN1 de comprimento completo).
[00284] Exemplos não limitativos de tais vetores são mostrados nas FIGs. 1, 2, 4, 7-10 e 12-24. Exemplo 14. Expressão CLRN1 em células HEK293FT
[00285] As células HEK293FT foram transfectadas com vetores CLRN exemplificativos. 48 horas após a transfecção, os lisados de cé-
lulas HEK293FT foram preparados e a expressão da proteína CLRN1 foi determinada por Western blot. Conforme mostrado nas Figuras 25 a 31, a proteína CLRN1 foi detectada em todas as amostras testadas. Este resultado confirmou que a proteína CLRN1 pode ser expressa por vetores CLRN1 exemplificativos descritos neste documento.
[00286] A Figura 32 mostrou que as células HEK293FT transfecta- das com o vetor CLRN1-6eGFP expressaram altos níveis de GFP logo 72 horas após a transfecção. 24 horas após a transfecção, poucas cé- lulas HEK293FT expressaram GFP após a transfecção com o vetor CLRN1-e6GFP em MOI 8,41E + 04 e 2,53E + 05. 72 horas após a transfecção, a maioria das células HEK293FT transfectadas com o ve- tor CLRN1I-e6GFP em MOI 2,53E + 05 expressaram GFP, enquanto algumas células HEK293FT transfectadas com o vetor CLRN1-e6GFP em MOI 8,41E + 04 expressaram GFP. Conforme mostrado na Figura 33, CLRN1 foi expresso em níveis elevados em células HEK293FT transfectadas com vetor CLRN-O, vetor CLRN-3 e vetor CLRN-13. Exemplo 15. Explantes cocleares de expressão CLRN1 de P2
[00287] Explantes cocleares P2 de camundongos WT foram infec- tados 16 horas após o plaqueamento e coletados para RNA e imuno- fluorescência 72 horas após a infecção. Conforme mostrado na Figura 34, CLRN1 foi eficientemente expresso em explantes cocleares. Con- forme mostrado na Figura 35, as células ciliadas externas (OHC) e as células ciliadas internas (IHC) de explantes cocleares P2 expressam Myo7a quando transfectadas com o vetor CLRN-O (1,3E10 VG/cóclea), CLRN-3 (9,9E09 VG/cóclea) e CLRN-13 (1,0E10 VG/cóclea). A trans- fecção com qualquer um dos vetores não interrompeu a integridade estrutural das OHCs ou IHCs da cóclea. Assim, a Figura 35 mostra a falta de toxicidade de construtos CLRN1 com células ciliadas externas viáveis e organizadas (OHC), células ciliadas internas (IHC) e feixes estereociliares. Conforme mostrado na Figura 36, a expressão de eGFP com CLRN1-3'UTR pareceu especificar a transdução em com- paração com o promotor CAG sozinho. Explantes cocleares infectados com 1E09 AAV/Anc80.CAG.eGFP expressaram Myo7a nas células ciliadas internas. Explantes cocleares infectados com 1E09 AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN-3'UTR expressaram MyO07a tanto no OHC quanto no IHC. Transdução e coexpressão mais altas de CLRN1 foram observadas em OHCs de explantes cocleares infectados com AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN-3'UTR. A expressão de GFP em ex- plantes cocleares infectados com AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN- 3'UTR foi restrita a OHCs.
OUTRAS MODALIDADES
[00288] Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido des- crita em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição anterior destina-se a ilustrar e não a limitar o escopo da invenção, o qual está definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, van- tagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.
[00289] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e ou- tras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, servirá de base para controle. Além disso, cabeçalhos de secção, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser um fator limitante.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 - Isoforma D da Proteína CLRN1 Humana do Tipo Selvagem Completa
MPSQQKKIIFCEMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVN ASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSFFPDLLKAIP VSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFIS VALWLPATRHQAQGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYK TQSEKYTTSFWVIFFCFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFAKSKDAETTNVA
ADLMY SEQ ID NO: 2 - cDNA da isoforma D de tipo selvagem CLRN1 hu- mano atgccaagec caacagaaga aaatcatttt tigcatggcc ggagtattca gttttacata taccctegga gttatgacag cettagggac accgttgtag atcaaageca ctatecteta caaaacggga gctctgcteg teaatgectce agggcaggag ctaggacaadgt ttataggtga aatgcagtac ggagcttttce acggagaggg tataaggcag tataggattag gagcaaggec cttteggtte teattttttc cagatttgct caaagcaatc ccagtgagca tecacgtecaa tot- cattcte ttetetgoca tecttattat gttaaccata gtgagggacag ccettetticat gtacaatgct tttggaaaac cttttgaaac tetgcatagt cccctagggc tatacctttt gagcttcatt tcag- ttgcoc tttagetgcc agctaccagg caccaggcte aaggctectg tagctatett gtcatga- tat tgtttacctc taaagtgaaa atccatcacc teteagaaaa aattgcaaat tataaagaag ggacttatgt ctacaaaacg caaagitgaaa aatataccac ctcattctgg gtcattttct ttta- cttttt tattcatttt ctagaatgggc tectaatacg acttgctaga tttcagttoo cttttgcaaa atctaaagac gcagaaacaa ctaatgtagc tacagatcta atgtactga SEQ ID NO: 3 - Isoforma A da Proteína CLRN1 Humana do Tipo Selvagem Completa
MPSQQKKIIFOMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVN ASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSFFPDLLKAIP VSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFIS GSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYKTQSEKYTTSFWVIF
FCFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFAKS KDAETTNVAADLMY SEQ ID NO: 4 - cDNA da isoforma A de tipo selvagem CLRN1 hu- mano atgccaagec caacagaaga aaatcatttt tigcatggcc ggagtattca gttttacata taccctegga gttgtgacag cettagggac accegttgtag atcraaageca ctgatecteta ca- aaacggga gctetacteg teaatgecte agggcaggag ctggacaadgt ttataggtga aa- tacagtac gggcttttece acggagaggg tgatgaggcag tatagattag gagcaaggec cttteggtte teattttttc cagatttgct caaagcaatc ccagtgagca tecacgtecaa tot-
cattctc ttctetgeca tecttattat gttaaccatg gtagggacag ccettettcat gtacaatgct tttggaaaac cttttgaaac tcetgcatggt cccctagggc tatacctttt gagcttceatt teagg- ctcct gtggctatet tatcatgata ttgtttgcct ctgaagtgaa aatccatcac cteteagaaa aaattgcaaa ttataaagaa gogacttatg tetacaaaac gcaaagtgaa aaatatacca ceteattetg gateatttte ttttgctttt ttaticattt tetaaatagg ctectaatac gacttactgg atttcagttc cettttgcaa aatctaaaga cgcagaaaca actaatgtag ctgcagatct aa- tatactga SEQ ID NO: 5 - Isoforma C da Proteína CLRN1 Humana do Tipo Selvagem Completa
MQALQQQPVFPDLLKAIPVSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFG KPFETLHGPLGLYLLSFISGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEG
TYVY KTQSEKYTTSFWLTKGHS SEQ ID NO: 6 - cDNA da isoforma C de tipo selvagem CLRN1 hu- mano atgcaggc cctgcagcag caaccagttt ttccagattt gctcaaagca atcccagtga gcatccacgt caatgtcatt ctcettetetg ccatecttat tatattaacce atggtgggga cag- cettctt catgtacaat gcttttaggaa aaccttttga aactetgcat ggteccectag ggctatacct tttgagcttc atttraggcet cctatageta tettgtcatg atattgttta cctetgaagt gaaaa- tccat cacctetcag aaaaaattgc aaattataaa gaagggactt atgtctacaa aacg- caaagt gaaaaatata ccacctcatt ctggctgact aaaggccaca gcectga SEQ ID NO: 7 - Isoforma E da Proteína CLRN1 Humana do Tipo Selvagem Completa
MPSQQKKIIFOMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVN ASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSCYFLDPFMG LPTGVPHLLSLPCSTSCRREHTSERVQEPAGCFSAVRSKLHAGPAAA
TSFSRFAQSNPSEHPRQCHS LLCHPYCVNHGGDSLLHVQCFWKTF SEQ ID NO: 8 - cDNA da Isoforma E de Tipo Selvagem CLRN1 Humano atgccaagec caacagaaga aaatcatttt tigcatggcc ggagtattca gttttacata taccctegga gttgtgacag cettagggac accegttgtag atcraaageca ctgatecteta ca-
aaacggga gctetacteg teaatgecte agggcaggag ctggacaadgt ttataggtga aa- tacagtac gggcttttece acggagaggg tgatgaggcag tatagattag gagcaaggec cttteggtte teatgctatt ttcttgaceoc cttcataggga cteccaacag gggtacecca tttact- cagc ctgcccetgct caacctettg caggagggag cacacgagtg aacgagtgca gga- accagct ggctacttta gtgctatgag gagtaaactc catgcaggeoc ctgcagcage aac- cagtttt tccagatttga ctcaaagecaa teccagtgag catccacgte aatgteatte tett- ctctgc catccttatt gtgttaacca tagtagggac agccttettc atgtacaatg cttttggaaa accttttga
SEQ ID NO: 9 - sequência genômica do tipo selvagem humano CLRN1 aggagatact tgaaggcagt ttgaaagact tgattttacag attcttagtc caaagattte 61 caattaggga gaagaagcag cagaaaagga gaaaagccaa gtatgagtga tgatgaggcc 121 tticatctact gacatttaac ctggegagaa cegtegatag taaagttgce ttttcagctag 181 ggagctatec gttcagcettc cgtaataaat gcagtcaaag aggcagtece ttcccattgc 241 teacaaaggt cttatttttg aacctegece teacagaage cgttteteat catgccaagc 301 caacagaaga aaatcatttt ttigcatggcc ggagtattca gttttacatg tagccctegga 361 gttgtgacag cettagggac acegttgtgg atraaageca ctatecteta caaaacggga 421 gctetactog teaatgecte agggcaggag ctagacaagt ttatagg- tga aatgcagtac 481 ggagctttticc acagagaggg tataaggcag tatagatigg gag- caaggcc cttteggtte 541 teatgtaagt agcaattgca tttgagttat ttaatacttt agg- cagactc ttcccagtgt 601 tacgaggaat tatatttgag aattttaceog tatttactgc agga- cttttt aaatcggtat 661 gaaccatatg aaaaacctat gactctgagc aatttettet tectag- tttt tattatttta 721 tacttgcttt ttattataat atagagttaa ttcattotta cataattaag gtttttggaa 781 atattggcaa ttaagatgct taagtattaa tatttatgta aaaaattatg gagtcttttt 841 aaaaaagtaa acttggggaa ataggaaagc tgtaaagaat gatctttatg ctttttattc 901 titataaaaa gaaccaaggt catgggctec gtatttaace aggttgccac ctttctcatg 961 attttattte ctgctececa ctecetecca ttattectgo taagaccttt ccta- ctgcta 1021 aataticagt tticattttt aactaatttg gaatcatttg gctatagaaa tttaaaatga 1081 tctactgtgc taactgggaa agaaatgagat gcctatttag tatagaacat tttaaactga 1141 ttgacctgca aatcatgtag agaatatgag agagattttc ttattatgat ttttgtgaaa 1201 tggaagtgta atccacagta tttataacct gtttatctta agaagagaat ttttaaaaat 1261 taccatgtga ataggcaact cattaaatga aaattaatag gaagtcattt gttatatctc 1321 ttacaacaca cattcagaag ttattattat tteagaaggg ctagtttaga acaaccttat 1381 gaagacacag tcagtaaatt actgcataaa tcactettca ggaaag- gagg ttaccaactg 1441 aagcatttaa aatgaattat tattttgccc aggttttttt tttetttcta gtataggtag 1501 aaggctaaat taattgaatt tattattaac atatgcagtg cctaattaaa tttcagtact 1561 ggtctattta tatttctgca acattectta tatcttetta gcagtcattg ga- caccaacc 1621 ttcagctcac ataggttact aagtgatatg aattttecata gggctecaga aaatttccaa 1681 gaattagttg ttagcttttt aattgatgaa gtggatacca gttettttea ctgaatagct 1741 titattcatt aaggtaatag goctattaga gttacttagt ttitectaggg aaggggaagg 1801 aagaaaacaa agcagaatgt catgtgatat gcaactgatat taaaaaaccg aaaaggaaaa 1861 aagttgagag agatgattta accgtgagtc ac- cggcagcc aaagcegtgag taaagcttct 1921 cacagatgaa tttagacaaa agcgga- gaag gtactggtga attttetgga gcctttacat 1981 tttetacagt gaaatggaga taaac- tttac tcatgccata ggacatgttt caaaacaata 2041 ataagatgtt ttctgaacac ttac- tacata ctaagcactt tatatacttt gtctcattta 2101 atccttacac agecacatte ttctagggtt tagegaatga tttttatggt tatatoectat 2161 gcttatecta tetaaggata aagttattct aattgaggtgc coectectttt getttectata 2221 aggacttgca gaactagtgg ggtttaaaca gtaccceteac ttateteaca gaatttcatt 2281 agcteccaga taccecetgac attctececoc tagectagtg aagaaaatct tecatttact 2341 tgattcattct gcagtgacag ctccatcaat atacaataga ctatacatat taagtgtact 2401 gtatatacta tacatgttaa aaatctcatt cattttggtg aggccecagct aagaatactt 2461 acagtagagc tttttttttt ttcctaagca taaaagtatc tttttcaatg cagcatgaga 2521 cagagttggg aaaac- caaaa taaatagatc caatggactc cccaaagagg ataatattica 2581 tttaaataaa caccccetetec agtattaaaa ctttetaatc aacatgcctt taggacacat 2641 tacaccctea aagtttacac teccattgca acgcagcttt gtggttcacg ttttttecat 2701 teagaatgte attaccctgt caatgatgtt tcatcaacgt ttgcttggat gagaatcctce 2761 tgatattctt cctgatagaa atgtataagc ccetgttcata taaatgaata aaagatctaa 2821 ccettacttte tcagtagtgg cttccttaga gcaaaaagea gggacceteca gagagcetceag 2881 gtaga- tgact cttttctagtt tetteccagag ctceaacttac aattagtgca caattcattt 2941 cccaga-
atgt cttctttctt attgtagcctt tagaaagtta ttaagcaaac atttgaattce 3001 acagaa- tctt accagtgtaa gaggaatgga aaaggtaact tatcaaggta acaatcactt 3061 cgtggccagt ttttteggct cactgcaact acccecetectg ggattcaageg attetectgo 3121 ctcagectce caagtagctg ggactacagg cgtgcaccac catgcccage taattttttt 3181 tttgtatttt tagtaaagac agggtttcac catgtaggce aggctagtct catggcaagt 3241 tttctttgta ttgtoatatt attatcaatt aataggaatt tatatttcag ttetattagg 3301 tagataaaca ctattttaca tacctaaatg tttcatttat atcagcactg gccaataaaa 3361 atatactata agcaggccgg gtgcagtggc tcacgcctgt aatcccaact tttgggagge 3421 caacactttg ggaggacaca gggtcaggag atcgagacca tectagcetaa cctag- tgaaa 3481 tcccgtetet actaaaaata caaaaaatta gccgggegta gegggggege ctgtagtccc 3541 agctacttag gaggctgagg caggagaatg gcacgaaccc ggga- ggtgga gcttgcagtg 3601 agcegagate tegecactac actecagect tagtgacaga gcaagactct gtctcaaaaa 3661 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatata ta- tatatata tatatattac aagccacaag 3721 ccacatatgt acttttaaat gtcctagtag ccatattaga aaacaaaagt aaaaaggaat 3781 agatgaaatt aatttitaatg atttttttaa acccaagata tccaaaatat tatcatttta 3841 acatataatt aaaaatttat tgagatottt tacattgttt ttttttttct tagacgctagtc 3901 ttggaaatct agagtatatt ttacatttac attaca- tcta attcagtcta gecacattte 3961 acatgctcat ttttttatat gtagttttat ggagcaga- ga gtttaatagg caagaaagaa 4021 aagagaaggc agaagaaaat ggctececta tacagagacg cgggggtagg gegctccaaa 4081 gccaaaagag gaggteceta ag- tatggtag acaccagcca ggaatatatg cagtgtctgg 4141 aggaggggat gtctgattta catagggtca catgctcatt tttatagcta ctatattggt 4201 cagtacagat ttagataggg atttgctctg aacaagttag tgattgatag tottcatatt 4261 ttaattigaat ttttectgagg ttctactgta cacttgtatg tgatattagtt tcatatacaa 4321 tgacttgtato acttttaaaa cccagatata tagcataaca tgagaatgaa aaatggacca 4381 gaaaaatagt ttgg- caatgt agtcatgttt gttcctatta aatgttccct attgaccact 4441 ctatctcettt taatta- taac aagaatctgc cctgecagca tgcccagtta cgctaggaaa 4501 acttctgcct ca- tttactct ggctgattct catccactta taggtcagta gttcatttto 4561 tagaggtcac cag- cattcat acctagcata caatttcatt cattataatg aaggaatgtt 4621 ttcccttcaa aga- gacacaa ctagtgggct taatttttct taatatgtca cctgtaaaat 4681 tttaatgatg atgatt-
taaac tctaaatgta gccatcaaga caaaaactgc aaattttgag 4741 ccteagtgta tatagataga tttctattte ggtaatttga aacattgcag aatatcatca 4801 aaatatgata cccaagaatc atatggtatc aatcattcct agatatactg atctattcat 4861 taccaagata gttcaatgag ctggcaaaaa catatggaat tattttctta aaatgtgaaa 4921 aataaaattt aaccaatcat gtatcacagc ttgcaacttt agtcatactt taaaaagcat 4981 tttaatttgg acctcatgat tgaaaattta taaaaagctg aacagaaatt agttcacttc 5041 atattttaga aaagcagadgt ttctttacta aatgaggcat tigacccaaa ttggagagaa 5101 aatg- ttgaaa ctacttctgt gagcaagcag gtggcettctc aaacacatgt taggatgaaa 5161 tagttaggcc teaggatete agtgcectatce actgagagtt ggcactcetct atctecatgg 5221 tetcctecaa gtgtgactct tatetettgc tgaccetgace taceccaagt gactcactgg 5281 tcatgaccoct gcacaccetig cgtetetect atcacectgc cgatggcaga gctacaaagg 5341 tctttgatgt agctetgtet gatatcctgt gttteceoct atagtctata tagaageagg 5401 tataggggta tataaagggg aagcctatga agttcatctg caaagactac ctggt- taggg 5461 gaggagagga agaagctata tagcaccattt caccagcaag catgggctet tetagcctttt 5521 agcttagggg tectattgtc tagtctcact cacctattaa aacagtccag caaatagagg 5581 ttttagtttac ctcccattaa aaaaaaagca attaatggaa tagaaga- taa taatgtatga 5641 gaagcactat tgtgaaagaa aaaccttcaa cttcteteag ccaaataatt gcttectect 5701 ctgtectteo cagaccttga tatttactct attatttcaa aa- caactata ttataaatat 5761 ttigagaatgat gtatttccct gcaaggagat cttaatccce aagaaggcag gagctgatata 5821 ttattcatcc cagtgctect teaaaccagg gectea- gaca gtgcatggcc caaagaggta 5881 cttaataaac gtttggtaaa ctgacactat tgaaattaag caacctggat ttgaggtagg 5941 tctetgocac teacaagaga ttacg- ctttg agaaaattcc atcacttcat tgattttcag 6001 ttcettacate tatatatagg agacga- tact aggtgatttc tgacatctct caccgtttaa 6061 atgctctata atctatacaa cgaggggctc gcetattctag acaagttcect tecagettta 6121 cagttgcata accettetaa tcttagtcac atgatgactc cactgacaga tttttggcca 6181 ccatcattag acatactgag ttacgtatac ctttgctcetg atcctoaaaa ctcatgattt 6241 ttaaagtttt ctgaaatatc taccatttat caggatccag atggatttca tgaccaaagt 6301 ggatgtttet tttetetece attacaatct tttacttttt gtgtgaggaaa ttgcatgtta 6361 aagaaaggga aattgaagaa taggatactt tagaattcta gcaagatgga ttagtggagtt 6421 ccagaaagta ggggcag-
Ccca caaataccga aataaatgag atcgtattat tgagaaagca 6481 caaatggaag aaggtcaaaa gcaagaagaa gctgacatce tacttecteo aatttttact 6541 ttctotattt ttccaagaaa ctectettee aagecttgct gaaaaactcoc actttectaa 6601 atctaactte ttaaactgat aatggcaaga agttaggaat gaccaatatg tttaacactc 6661 caagag- tatt tattttattt tattttyaga ctgggtetoa ctetgtegte cagectagag 6721 tgcag- tagtg tgatcacagc teactgcagoe cttgaccetet ccetgcecaag gaatectece 6781 ac- ctcagcct ccetgagtaga agggaccaca ggcatgatagcc actacacctg gctaactttt 6841 aaaaaattit tttatagaga tggggttacc caggcagatce teaaactgct gggcteaage 6901 aatcctectg cattggecte ccaaagtgct ggaattatag gcataageca ctacg- cctga 6961 cctetecaag gacattettt acccagaaga ggaacttagc agaacttatc ctccaattagg 7021 tgaggaatat ggagaaaatg actttaagca aaggaacttc tagtt- ctgcc tacctaatcc 7081 agaaaaagaa gttttattte tecettecoco tagtaactat ctt- cccatat tcacataaaa 7141 aagtacagaa tcaacattgt tcaagaatta taattttact tgtaagcaca tgtgcacacg 7201 cacacccata taccttectt cectttaaat catcceca- cac cctaatagta gtaaaatcat 7261 tgacccgagc atacctggga gaggaagagg agtctgacag gggcagattc taagtggcac 7321 tectggaact taaccctagt gtata- tgaac tttacctatt gaaggatgac tecteaactg 7381 ttcteacaat ttgctactet gottt- ctttt ctaatttctg aaggtgactc atctteccea 7441 aggactttra gactteteag aagaaaaaaa tattgaggtag gtctctgcca ctggcaaaag 7501 attagacttt gagaat- cata aaagtatatc agtatatact cattaatatt gaattactat 7561 aattaatatt atgata- ttga tataatgata gaatgatatt gataaaagca atattcaata 7621 atgaatatta tttca- gctac cceacttattga ggtaccteat aggtgccagg cattttgtat 7681 gtattateta caac- ccttac atgggacata ttatgatact gtttctettg aagaaatata 7741 gaaactagaa acagagaggt caccacaatt ttccaaagtc acatagctaa taggtagcag 7801 acttgg- gatt caaattcata tgcatatggt aaatcatgct cttectetgc tacattttgc 7861 cecet- tagaa tatgaaaaag ggatacaaag agatgaagaa aatatgtaag attatcctte 7921 aatttcacta tcttttttaa agtttttttt attatacttt aaattctgaa atacatgtgc 7981 agaa- catgca ggatttattac ataggtatac acgtgccatg atggtttatt gcacccatca 8041 ac- ctgtcatc tacattaggt atttttecta atgctatcco tecectagte cececacecac 8101 cgacaagccc cgagtatatga tattecccecete cetgtgteca tgtattetea ttgttcaact 8161 ceccacttata agtigagaaca tgcggtattt ggttttctat tectacgtea gtttactgag 8221 aatgatggtt tccagcttca ttcatgttee tacaaaaggc atgaactcat tttatagcta 8281 cataccattc tatggtatac atgtgccaca ttttettaat ctagtctatc attgataggge 8341 atttggctta gttccaagte cttgctattg tagaacagtgc tgcaataaac atatgtggge 8401 atatgtcttt atagtagaat gatttataat cctttgggta tagacccagt aatagggattg 8461 ctgggtcaaa taggcatttct ggttctaggt cctteaggaa ttgccacact gtettecaca 8521 atagctgaac tagtttacac tcccaccaac agtgtaaaag cattectatt tetecacatc 8581 ctctecaaca tetgttactt cctgactttt taatgattgc cattctaatt ggagtgagat 8641 ggtatctcag tgatagtttta attagcattt ctttaatgac aagtgatgat gagctttttt 8701 tcatgtttgt tagccgtata aatgtcttct tttyagaagt gtecgttcat atcetttace 8761 cac- tttttaa cgggagttttt tettgtaaat ttgtttaact tecttataga ttctggatat 8821 tagtccttta tcagataggt agattgcaaa aattttette cattctgcag gttgccecgtt 8881 cactctgata atagtttctt tigctacgca gaagtttttt tagtttaatt agatcccatt 8941 tgtcaatttt gactittatt gccattgctt tiggtattta gtcatgaagt ctttgcccac 9001 gocctatatec tgaatggtaa tacctagatt ttcttetagg atttttatag ttttaggtct 9061 tatatitaaa tctt- taatcc atcttgagtt aatttttgta taaggtataa ggaaggggtce 9121 cagtttagtt ttcta- catat ggctagccag tttteccaac accatttatt aaatagggaa 9181 tectttecoc gtta- cttatt tttatcagat tigicaaaga gcagatggtt gtagatatat 9241 ggcattattt ctgaggcctc tgttctattt cattagtcto tatatctatt tigatacaag 9301 taccatgcta ttttagttac tagtagacttg tagtataatt tgaagtcagg tagcgtaata 9361 cctecagttt tattcttttt gcttaggatt gtcttgacta ttcaggctet tttttagttc 9421 catatgaaat ttaaagtagt tttttctaat tcetgtgaaga aagtcaatgg tagcttgatg 9481 ggaaaagcat tgaatctata agttactttg ggcagtatag ccattttecat gatattaatt 9541 cttcctatec gtgagcatgg aatgtttttc catttattta tatectttet tatttecttg 9601 agcagtagtt tatag- ttctc cttgaagagg tecatceacat cecttgtaag ttatattcct 9661 aggtatttta ttctotttat agcaattgtg aatggaagtt cactcataag tttgctetct 9721 gtttatetat tattagtata taggaatact tgtgattttt gcacattgat tttatatcct 9781 gagactttac cgaagttgact tatcagctta aggagatttt gggctgagac gacagggttt 9841 tcetaaatata caatcatcte atctgcaaac agagacaatt tgacttccte tettectatt 9901 tgaatacgct ttatttottt ctcttgectg tttgccctag ccagaacttc caatactgtg 9961 ttgaatagga gtattcacca cctattttaa gaatagtatt gaagcctcac aaaagctggt 10021 tceteatgtaa ccatcetga- ga atatttagcc ttatgacttg aattcattca ttgccttttt 10081 atttcacatt ttagtgatce tgatgtctaa atcttaatct ttgatccttg caaggtaaaa 10141 tagccaagte aagcctattt aataatattg gttgaggaag tcacatgctt atgatcaatc 10201 tttagattat gtaattatat taccttaatg ttggcagttt aggtataagg cagagatatc 10261 tgatcacatg tgtagt- tagc taatttaaga tcactgccaa ctaaaatctt catagtatga 10321 tettcaaagt tagc- tacttt gaccacagca atgatttcac cacagcaatt aacaaaatgg 10381 cagactcttt cctgaggtag catgaacagt tttaaaacaa agtcaaggac caaaagaaaa 10441 gcaggcacat ggcatttgat tcatttrcaaa aactagtatt gtattaagag ccaaggggat 10501 agaattgtag catcaattaa aatcttgttt gaaaaaaaat aaaaacaaac gtccattttt 10561 atctcetoaaa tatattaggg ttttcataaa gttataggto tatttttaaa aaaacaaaac 10621 tcatatacat tagactgaaa aatttgcctg teateteatc atagcage- taa atgcaattgt 10681 ctatggcgag atacactctt attagaggta tgatagcact aac- taatagc aaactttgta 10741 cctagtagtc taatttatgc agggttcata tttegetecoce tet- cagcatg ctgtaactgt 10801 ggcaaagcca tteteaggag ttattaccoc aacataatca tacccctata gattaggage 10861 agttaaatgg gtcctattat cagagacaca tatgtg- ccac agcegetgte atcectaage 10921 cacegtagat gattaagact cactgatggg actacctctg aataggcttg agtgaggtag 10981 atacacttca gctgagagaa attca- ggtaa ggggctgaga aaatcagatt ttgaatagtt 11041 ttatcatacc atcaggtete cttttaagtg ctggggtcat ggatttcatt caacctgacc 11101 acatagcctt tagaagcettg gctcaatacc tgagtgtgag attatgggta atattaaagg 11161 agatgaatac attgag- ctga tgtcagagaa tgtcttttac tagatttica taatgactag 11221 ctgcagatgg gctgagggga aagtcagatc aagagcattt ctgtaagaag aaagaaatct 11281 teccetettat tetetttcaa gaaaatgaat agctgagcac caagaggcca aatacttttt 11341 taaaaaacac atccttttat gtagagaagg acaggttgag acgaaaaaca gga- ccectetga 11401 aactgtcttt atagctttaa tetaggaaga aattgcggca ccattgctga catcattatc 11461 agaggctacc ttagttctga gagcettcaca gatggccttt tetgcatttt acatctggcc 11521 agatgaaggc aaaaaggttg atgaaaccaa aactattaga tcag- tagtcc ataactctag 11581 ctgcacttta gaatcatctg gggagtcctt aaaactactg atcctgaggc tecatcecag 11641 accaattgaa tcaggatete tagaggtaga ac-
ctgagcat tggaatgctt taaaagttcce 11701 teagggactc taatgtgcag ccaagg- ctga gaatgactga ggtggatgagt ggccaagaca 11761 ggtgaggcca agagttagaa gocccettacta ttagggaagg cagaagecac aaggaggagg 11821 ggagggggaa ggagcagtat ttagcatttc ttecacacag ttgagggggtt ttctagatcaa 11881 aattagg- ctg ggatctttog cttccatttt catgaagate ttatgctttga tecacageca 11941 ccetgg- cctca gggcaatgag caatctgatt gatgaatttt cagtaagaaa ctgagcacac 12001 ttggcteteca gececagtag ctteccectat ticcaaatet gcecaccagt tacaggagec 12061 tgctcaccaa ctggttagagt taaagaagtc ggctetatec ttagcaggga gacctt- cagc 12121 tgatctagecc tatetatgac tacatagata aagctaccta atttggggaa cttgataggaa 12181 gatctaagct atgttctcta acagttttat cagaaataaa gttaactttt gacctecatc 12241 tgcctgtete ctatagaagg gcetetgetec ttecaaagag actetca- ggg gttcetectta 12301 gagagtatatt atcagtccaa agatcatttt agaccagcca tta- cagagga tgtccaagaa 12361 attgcacaag ggaaatagaa gtaagaatga gag- caatata tcagatagta aggaaagtat 12421 gtgactagtt ttaaataagt aattaaccat aaatccaaag ttcctgcatt agttatageca 12481 atagtcatcce acctggtcag gaaaaaaaaa gtaaaagact gagctgcaag atagaaagtt 12541 tocctgaatt ccacgtactt caaggactac tatagaggat tecttagtec caatagcagag 12601 acatg- tactc tgaccaccecca tgggccaaat ccectettace caceceteagt gattectect 12661 gggacctcac tacattgagt tettacatte cecactettt tegggggaaa tataaccectt 12721 ctgctcettct catgatatta aaaatattita gacaattact taaaatttac aacaatctte 12781 cacataaatg atctcactta tatttcttgt gagctctatg atttatttct attatcatct 12841 atg- ctgatag ttaaggaaac tgagatatcg agaccaacat gcatagtaaa tggcaaaacc 12901 agatgaattt taaactttcc taactecaaa agecacatcee taceccaacec gecatg- ctgc 12961 cgctcagtta atgcctagcet gtttatetec ccattagece ctetacecat tata- ctttga 13021 tggcacactg tattccaact gcectgagact cctggttaat gcecattacgt acagacttag 13081 gttgaattta ctaggatttt taagatttgt aggataagag atatgactgt tagactggaa 13141 tcagcaatag ataaaaggtt aacaaagttt cagaataaaa tataa- tagaa aaccccagca 13201 gatagaagta aaatgaatgg taagacaact gaaa- tgaaag ccatacattt agaaatatca 13261 aataaaacac agattaatag cagacaa- 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tacataattt 40321 tagagaaaat taacac- ctac acttgtaaag ttgtaggcttt cccacaceta titatcatct 40381 ctcaatattc cttgaaaagg aaattatcaa tttatcattc tatattggca atgaaatgcc 40441 cetaatatct gtcacctata agacaattga agatgatgtg ttgaaagctt tetgaaaatg 40501 ctgatcat- ta ctttaaatgg aattgaaatt ccagtttatt atttccaaaa atatgatctt 40561 actgatca- ta ggataacatt tcataacatt teagagattt cttececette gaggagecaa 40621 accca- tagga cctetggact cccacagatc ctggcaggga gtteccacte ataaaageac 40681 aggtgccctc agagtcattc agggatgaag aagcaacccet cattggecat gtcctacgtt 40741 ccccatatag taaggactgg aggagaccag tactcaattc tacagtetca gaca- gctgtc 40801 agaggagagt catgaatgtg cagtgtctag cacattacaa acgtttatta attgactgat 40861 cattcatggt gtgacagccc tataactcag ctatcctatt cagtca- gaaa ttaactcagt 40921 aatcaaagtc attaaaagga agaaaaaaaa aacctacagt accagacaga tggtggggaa 40981 atcagacaga tgaaaggaaa aatggctgata ggtcattgag taagacactg ggcagcaaaa 41041 cctaggcctt gtgcctagtt atac- tccaca ttatagctec agcaaggttt ggcaggattt 41101 ccacagtecect ggcttattct aacctttctt gggagcagga gcagtattgg teagatagac 41161 agacacataa ggaa- tcetgte caactggcac cgtatgaatt tagactcetta gtatacatag 41221 ataactagga aaaagaggag agagacatgt aggactgatc ctaccgatttg tgaagtctta 41281 ggcaagagta tgaatgaaaa cccacttete ttcecetgce tagctecact gcacacagta 41341 aagagcctca agcataggta tgtggacatt gcaccatgta tccaagetet gac- catgcct 41401 cttgaaacag ctattcctca gecacectet gaccatagga ggaatga- ccc aggagaaatg 41461 accacatagg tcttgaaaat gaggctcagag ctatttacga agtcaattcc ggggteccag 41521 gagtatagac taaaatgtga gtcaggcatg cca- gatggat atgttctatt gacttcaagg 41581 attccteatg ctataggaag gaaccetetec agaagagaga cagagcagaa ccctcetaaat 41641 gtggggcaca aagcaggage cecetettget ggattcaaag ggtcatacta gaagagtgata 41701 ggttgagtct tattetca- ca tcactcatat cacttacaca cttettttat agccttagca 41761 gccatgecac aaagagaaac tcttcatgca tatcttttgg tecataagtc ataaatagtt 41821 atccttgate ccatgtettt tttagageca tagacagaga gaagcaaaaa tataccaagt 41881 tca- cactgag ttgtcteoct teatatetet tagcagtcac tgaaaggtta tgagactceag 41941 gctagattte tatcctetat ccctgaaacg acaacgttga cctegtgatc aaccctagaa 42001 tccagagcaa gatcteagac totectetet actaccagac agcacacttt gttttagggg 42061 ctgtgtactt gaaatattag ctatggcaaa aggctttgag tettatgaca ccccaagtaa 42121 cttttacttt aggaatttga aatacagoct tactataatg ctgtctectt aacaaagcag 42181 tacctttgaa atatttaaca acttgaaaag gaaacegagc ttgaa- ttttc ctttcaggta 42241 ctcaggaaat aatgtttcac ttctgtetga aattcaccat ctect- cagac aaagaaggct 42301 cttatagtaa aaggaatggc attttetcca caattttega ataaaagata aagagaaaac 42361 agcactgcag cctttttgtt aggatctaac aa- taaagaaa taatacggtt ttgccagggg 42421 agagctctgg ttttaagctc agaata- caaa aataggctga caaaatttta caaaggaata 42481 ttcteagcta ccactetgag gatggtagaa agtgaaattt caagaaaatt atattatttg 42541 attatttgat gatgattaag ctgattggcc agtcctatgt gaaattctaa agtagaagaa 42601 atgtgatgtt gtcttttcta ctcacetete cecteattece tacececcaaa tetetgeete 42661 taccccaaac ccag- cetgac ctttaggaaa ggaatagggg ctatcacttg cacegtaget 42721 cetectagecet gcagtactct ccccecacag tecagectec ctetgeteag ctaacttttc 42781 ctatag- ctcc ttctggctac ttetaaggaa cettecataa tactgcecac ceteteagta 42841 aca- goececete tactatcect tgattacata cactgtaatt ggttagtaat tgattttatg 42901 tcectetgceca aattatactce catgagagca aaaatcatga gtattatctt taatgtttaa 42961 atctccacaa ctatccococa tataagtcta gagaataaat gaatgagtga attaatgaat 43021 agaaactcaa gccattatagt taccactect aggatatttg gattaacttt aac- tgaagag 43081 taaaaagcat ttacctgtcc taaaggagac ataaaattag tggga- gagta tttggagaaa 43141 aaaaagacac tgtaatacat tcttttatat tagcctacecet gatgtagtca ggtgtcccta 43201 atatagggta ggactgaggat ttgaaataaa atacc- taatt tgacattgta agtggaggaa 43261 tcaggatttg aaaccaaatt ggtttgacct aaatcaagct attatgataa ggacttgcaa 43321 gaaaaaagga atccataaaa acca- tatgaa tagctaccaa ttagtaagca tttatatgtg 43381 tcaattacaa agcecaaatge aaatcatgct ttatttatat tagccacctt ttatagatga 43441 agaaattgag acctgaatat taaaattgcc tactittaca tagtaagtaa aggaatcagg 43501 gtttgaaccec aaattgg- ttt cacctaaggt agaaaaccat cccagcaagt ctcctattaa 43561 ctggaacccet attgtagtag cctgagatat aacagtagct gtggaagegc tatagagtcc 43621 tgg- ccatect atgtgctect gatcetagtee ctectgecac ctacttctac tecetatace 43681 atccacccat ctggaagtct cccagtgtec atcttegggg gagacactca ccagagttte
43741 cagcttccag ccagtataga gtgcccectgt cccacagcaa teteacegaa atca- cagcta 43801 catctgttaa aattaggcta ccaatgagtg atagatgagg gggaaaaata ataatagtgt 43861 actaaacaaa acaaatgttt atttittiectca cacataaaaa tctagagatt gaagtccagg 43921 gctggtccag aggctecaag gatctgggat ttaga- ctcce toetttctigt titticcacag 43981 catatagctt ccatttetgg ggccacattg gtccaaaatg tatgctaggg ctccagecat 44041 tgcatccata tttecagecac agga- aggagg aagtiggggaa gaaaggacag gcccecetaata 44101 ccetatatagt tcaagaagac tatccegece atacttecca accacectta gttgaacaat 44161 gctatet- taa ttcaagacac tcacatgtct agccaaaaat ctgaattctg ttacaaacaa 44221 ggagaataga gatgtgcgcc acctcaatac ctceatecata goctaccetttt coetttataca 44281 gctgtggcca agtgaaaget gaaggagetg tgagtaaccct tcetgaaggga ggctgagggcc 44341 tticacaaga ggoactgcatga ttgacattta tcctacatag ccta- tgaagt acagagaaat 44401 attttectett gaagccacat catagcagtg gctgctttat agcctgattc caccattata 44461 cctttaaagt gectagcaat teagecttea catcatg- caa agaggaatat ctcccagtct 44521 ttgtaagatc agcttaatte taaccacete cttacctccc actgcactec tacacgcaca 44581 cacaaatctt cttecactcag agca- gaacca taacccaagc cetaccaccet agagactgaa 44641 gaatcaggct catgatta- ca aatatgcaat aattttttgt gtagataatg tecaatgggga 44701 tgatggtaag agaa- ttcctt gatttacaca ttgacccetet tecetateco ttacaatcag 44761 gaaatatttg tcccaacacc ttatttette tattgcagge tectataget gtcttigtcat 44821 gatattgttt gcctetgaag tgaaaatocca tcacctetca gaaaaaatig caaattataa 44881 agaagggact tatgtctaca aaacgcaaag tgaaaaatat accacctcat tctgggtcat 44941 tttcttttao ttttttatto attttictgaa taggoctocta atacgacttg ctggatttca 45001 gttccctttt gcaaaatcta aagacgcaga aacaactaat gtagctgcag atctaa- tata 45061 ctgaaaggca aacctttcta taattttaca agggagtaga cttgctttag teac- ttttag 45121 atgtggttaa ttttacatat ccttttagtc tacatatatt aaagcatcag gac- ccettegt 45181 gacaatgttt acaaattacg tactaaggat acaggctgga aagtaagg- ga agcagaagga 45241 aggctttgaa aagttgatttt atctagtggg aaattgcttg ac- ccaggtag teaaaggcag 45301 ttgactagaa tegacaaatt gttactccat atatatatat gtatatatat gtatatatat 45361 gtgtatataa gatgatcttcc tatcaaaaag atatecaaagg cacatggaat atattttaat 45421 aaaaacaaat aatatctcta atatatccac acatttgttg ccagatttca gaaaactgag 45481 ctgcaatcgc tttecctaaaa cagtagtgta ttaaa- tgaac atctataaaa tgtatcaaca 45541 cacattttaa aaaatttgtt taaagtatac tct- taggcca ggcgtagtga ctcacaccectg 45601 taattccagc acttcaggag gecaagg- tag gaagatcatt tgagttcagg agttcgagtt 45661 acagcctggg caataaagtg agaccctgtc actaacaaaa ttaaaaaata aaataaatat 45721 aaaatatagg ctt- taaaaaa gcatagtctt attaaccatg tctattggtc aaaatctgca 45781 aactctaaaa gaagaaaaga agaaaaaacc aagcttaggg tatttttecct ccegtgcctga 45841 ag- tcccaatt acattcacga cagtactttc aatgaacata attgttagga ccactgagga 45901 atcatgaaaa atgatctctg cttagtacat ttgatgcaaa atgacttatt aggggctatt 45961 tttctagcta tagtgtctog agtactaata tgcaattatg aaaattatat taaatctagg 46021 attatgacgg tatcactgta tcatcttggt cttattctgg ctgteaccaa gcatgaceca 46081 ggtcaacttt tttttteccoc tgaattaccc atcaaattga tetgcageta actaaaggcc 46141 acagctgagc ctggaactga ccocttectte atccteaace tactgtecte cagaaagcac 46201 caaggaaaaa gcagagaatg acagcaaaca gatcactagg cctetgacea caggtgctga 46261 gtactcagca gceccteatat aataggttta aaagtactcc ttaaaa- taaa acactgtttc 46321 cotttagaac tatttacaag gatgaaacaa ccoegtatacet gagaaataac ttgctctggt 46381 gtcaattcgc tattegeccag cagacatcag aaca- caccga gtttccagat gctagttttt 46441 cecettaaat caggaaatac acctggacaa tttctagaag actacaattc agtctagcca 46501 caaaggggat tttttttttt tagtaacagg ctagagcccg gttctgtaag tetttagcta 46561 aaatggtcca gtacaaaage actaga- aatg agtgggctag gaggacaagg accgtetect 46621 gegtgaggag ttagttagag gtccccaagg ccaggatacec cetgcactcet tattagattc 46681 ctetetatet tettggagtt ttgaaaaact ccttegaaca ccaggctttt ttetttagaa 46741 aacaagtcte caategttet ctgttccgta gaaagagaaa gaaaacctgg agcagctgct 46801 gaaaaatcta atgaggaact aagaggcaaa cccacca SEQ ID NO: 10 - Isoforma 1 da proteína CLRN1 de camundongo
MPSQQKKIIFOMAGVLSFLCALGVVTAVGTPLWVKATILCKTGALLVN ASGKELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSSRSMKERYS LYEDKGETAVFPDLVOQAIPVSIHINIILESMILVVLTMVGTAFFMYNAFG KPFETLHGPLGLYLVSFISGSCGCLVMILFASEVKVHRLSEKIANFKEG TYAYRTQNENYTTSFWVVFICFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFTKSKETE
TTNVASDLMY SEQ ID NO: 11 - Proteína CLRN1 de cachorro
MPNQQKKVVFCTAGVLSFVCALGVVTALGTPLWIKATFLCKTGALLV NASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGIRQCGLGARPFRFSLFPDLLKVIP VSIHVNVILFSTILVVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFIS GSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYAYKTOSEKYTTSFWVV
FICFLVHLLNGLLIRLAGFQFPFAKS KDTETTNVAADLMY SEQ ID NO: 12- 5 'UTR
AGGAGATACTTGAAGGCAGTTTGAAAGACTTGTTTTACAGATTCTT AGTCCAAAGATTTCCAATTAGGGAGAAGAAGCAGCAGAAAAGGAG AAAAGCCAAGTATGAGTGATGATGAGGCCTTCATCTACTGACATTT AACCTGGCGAGAACCGTCGATGGTGAAGTTGCCTTTTCAGCTGGG AGCTGTCCGTTCAGCTTCCGTAATAAATGCAGTCAAAGAGGCAGT CCCTTCCCATTGCTCACAAAGGTCTTGTTTTTGAACCTCGCCCTCA
CAGAAGCCGTTTCTCATC SEQ ID NO: 13- 5'ITR
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG
AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 14 - 3 'ITR
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCT CGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCC CGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
CTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 15-3'UTR
AAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGG TCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATAT ATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTAC TAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTT GAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCA AAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATA TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCA AAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAA TATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGA GCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTA TAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTC TTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAG GAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTAC AGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAA TAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAA CCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAA GAAAAAACCAAGCTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCC AATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACC ACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCA AAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTA CTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGT ATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGAC CCAGGTCAACTTTTTTTITTCCCOTGAATTACCCATCAAATTGATCOTG CAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTT CATCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAG AGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTG AGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAA ATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAAC CGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGC CAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTTTTCC CCTTAAATCAGGAAATACACCTGGACAATTTCTAGAAGACTACAAT TCAGTCTAGCCACAAAGGGGATTTTITTTITITTGGTAACAGGCTAG AGCCCGGTTCTGTAAGTCTTTAGCTGAAATGGTCCAGTACAAAAG CACTGGAAATGAGTGGGCTAGGAGGACAAGGACCGTCTCCTGCG TGAGGAGTTGGTTGGAGGTCCCCAAGGCCAGGTACCCCCTGCAC TCTTATTGGATTCCTCTCTGTCTTCTTGGAGTTTTGAAAAACTCCTT CGAACACCAGGCTTTTTTCTTTAGAAAACAAGTCTCCAATCGTTCT CTGTTCCGTAGAAAGAGAAAGAAAACCTGGAGCAGCTGCTGAAAA
ATCTAATGAGGAACTAAGAGGCAAACCCACCA SEQ ID NO: 16 - íntron quimérico GGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCoCcGCTCCGCGCCGC CTCGCGCCGCcoeGccecGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCAC
AGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAG CGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAA GCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGÇ GCTCGGGGGGTEGCETGCGTGTGTGTGTGCEGTGGGGAGCGCCGC GTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTETGAGCGCTGCGGGCGCGÇ GCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCG GCCGGGEGCGEGTGCCCCGCEGGTECEGGEGEGGCTGCGAGGGGA ACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCEGTGGGGGGGTEGAGCAGG
GGGTGTGGGCGCGGCGGTCEGGGCTETAACCCCCCCCTGCACCC CCCTCCCceGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTEGGETECGGEG
CTCCGTGCGEGEGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGETEGCCGGGCGGÇ
GGGTGGCGGCAGEGTEGGGGETECCGEGGCEGEGCEGGGGCCGCCT CGGGCCGGGGAGEGCTEGEGGEGAGGGGCGCEGCGGCCCEes6
AGCGCCGGCEGGCTETCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCC TTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCC AAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACOCCC
TCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAG GAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGcceTC
CCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTEGTCCEGCGGGGGGACEGC TGCCTTCGGGGGGGACGEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGC GTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCT
TCTTCTTTTTCCTACAG SEQ ID NO: 17 - potencializador de CMV
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACG GTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGAC TTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCAC TTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTG ACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACA TGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGT
CATCGCTATTACCATG SEQ ID NO: 18 - promotor CBA TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCOCcATCOTCCOcoc
CCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTITAATTATTITGTG CAGCGATGGGGGCEGGGGECGGGEGGEGGCECGCGCCAGGCEG GGCEGGGCGEGECEGAGEGGGCGGGGCEGEGCGAGGCGGAGAG GTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCOT TTTATGGCGAGGCGGCEGGCGGCGGCGGCCCTATAAMAAAGCGAAG
CGCGCGGCGGGCGÇ SEQ ID NO: 19 tGFP
MESDESGLPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPEQGRMTNKMK STKGALTFSPYLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNT RIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVMGTGFPEDSVIFTDKIIRS NATVEHLHPMGDNDLDGSFTRTFSLRDGGYYSSVVDSHMHFKSAIH
PSILQONGGPMFAFRRVEEDHSNTELGIVEYQHAFKTPDADAGEE SEQ ID NO: 20 - hormônio de crescimento bovino poli-A
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCG TGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCT AATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTC TATTCTGGGGGGTEGGGGTEGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGAT TGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTAT
GG SEQ ID NO: 21 - sinal de poliadenilação de neuropilina-1 solúvel
AAATAAAATACGAAATG SEQ ID NO: 22 - sequência doadora de splice
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAA
CTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT SEQ ID NO: 23 - Sequência aceptora de splice
GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTC
CACAG SEQ ID NO: 24 - 3ITR
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCG GGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCA GTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCA
CTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 25-ITR
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGC CCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCC TCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCAT
CACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 26 - íntron esquimérico GGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCoCcGCTCCGCGCCGC CTCGCGCCGCcoeGccecGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCAC
AGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAG CGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAA GCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTC
ATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG SEQ ID NO: 27 - 3UTR 600A
AAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGG TCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATAT ATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTAC TAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTT GAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCA AAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATA TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCA AAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAA TATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGA GCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTA TAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTC TTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAG GAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTAC
AG SEQ ID NO: 28 - 3UTR 600B
GAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCCTGGGCAATA AAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAATAAATATAA AATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGTCTGTTGGT CAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGAAAAAACCAACGT TAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAATTACATTCACGAC AGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACCACTGAGGAATCATGA AAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCAAAATGACTTATTAGG GGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTAATATGCAATTAT GAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGTATCACTGTATCATCT TGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTTITTT TTTTCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAAGG CCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACCOTGC TGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAA
CA SEQ ID NO: 29 - 3UTR 600C
AGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAA TAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGA ACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAGAAATAACTTGC TCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCAGCAGACATCAGAACACACCG AGTTTCCAGATGCTGGTTTTTCCCCTTAAATCAGGAAATACACCTG GACAATTTCTAGAAGACTACAATTCAGTCTAGCCACAAAGGGGATT TTTTTTTTTTGGTAACAGGCTAGAGCCCGGTTCTGTAAGTCTTTAG CTGAAATGGTCCAGTACAAAAGCACTGGAAATGAGTGGGCTAGGA GGACAAGGACCGTCTCCTGCGTGAGGAGTTGGTTGGAGGTCCCC AAGGCCAGGTACCCCCTGCACTCTTATTGGATTCCTCTCTGTCTTC TTGGAGTTTTGAAAAACTCCTTCGAACACCAGGCTTTTTTCTTTAG AAAACAAGTCTCCAATCGTTCTCTGTTCCGTAGAAAGAGAAAGAAA ACCTGGAGCAGCTGCTGAAAAATCTAATGAGGAACTAAGAGGCAA
ACCCACCA SEQ ID NO: 30 — FP
KRKRRG SEQ ID NO: 31 - T2A
EGRGSLLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 32 — eEGFP
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKF ICTT]GKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGY VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKL EYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIG DGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDEL
YK SEQ ID NO: 33 — Myc
EQKLISEEDLEQKLISEEDLEQKLISEEDL SEQ ID NO: 34 — HA
YPYDVPDYA SEQ ID NO: 35 - 3x tag FLAG
DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK SEQ ID NO: 36 — 3UTR 1357
AAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGG TCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATAT ATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTAC TAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTT GAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCA AAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATA TGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATATCAA AGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTAATAT ATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGC TTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCA ACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGC GTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGT GGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGTCTGGGCAA TAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAATAAATAT AAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGTCTGTTG GTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGAAAAAACCAAC GTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAATTACATTCACG ACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACCACTGAGGAATCAT GAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCAAAATGACTTATTA GGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTAATATGCAATT ATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGTATCACTGTATCAT CTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTT TTTTTTTCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAA GGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACEOT GCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCA AACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAG CCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTT TCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAGA AATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCEGCCAGCAGACATCAG AACACACCGAGTTTCCAGATGCT
SEQ ID NO: 37 - 3UTR 1406
AAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGG TCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATAT ATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTAC TAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTT GAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCA AAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATA TATGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATATCAA AGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTAATAT ATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGC TTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCA ACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGC GTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGT GGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCCTGGGCAA TAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAATAAATAT AAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGTCTGTTG GTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGAAAAAACCAAC GTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAATTACATTCACG ACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACCACTGAGGAATCAT GAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCAAAATGACTTATTA GGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTAATATGCAATT ATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGTATCACTGTATCAT CTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTT TTTTTTTCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAA GGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACEOT GCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCA AACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAG CCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTT TCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAGA AATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCEGCCAGCAGACATCAG AACACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTTTTCCCCTTAAATCAGGAA
ATACACCTGGACAATTTCTAGAAGAC SEQ ID NO: 38 - epítopo de anticorpo CLRN1
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ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATOTCCcooccoTtoococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGECEGEGEGEGEGECGECGCECCAGGCEGEGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGCEGEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCGGCEGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCoGCTCOGCGÇ CCEGCCTEGCEGCoGCceGcocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGÇ
AGCGGCTCGGGGGGTGCEGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGÇ CCEGCGTGCGGCCeGoGcTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ
CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
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GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACTAAGAGCT CAAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTG GTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATA TATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTA CTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTT TGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTC AAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATAT ATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATC AAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATA ATATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTG AGCTGCAATCGCTTTCCTAMAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCT ATAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACT CTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCA GGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTA CAGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAA AATAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATT AACCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAG AAGAAAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCE CCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGA CCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATG CAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAG TACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACG GTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATG ACCCAGGTCAACTTTTTTTTTCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATC TGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCC TTCATCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGC AGAGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGC TGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTA AAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACA ACCGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTC GCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTTTT CCCCTTAAATCAGGAAATACACCTGGACAATTTCTAGAAGACTACA ATTCAGTCTAGCCACAAAGGGGATTTTTITITTITTGGTAACAGGCT AGAGCCCGGTTCTGTAAGTCTTTAGCTGAAATGGTCCAGTACAAA AGCACTGGAAATGAGTGGGCTAGGAGGACAAGGACCGTCTCCTG CGTGAGGAGTTGGTTGGAGGTCCCCAAGGCCAGGTACCCCCTGC ACTCTTATTGGATTCCTCTCTGTCTTCTTGGAGTTTTGAAAAACTCC TTCGAACACCAGGCTTTTTTCTTTAGAAAACAAGTCTCCAATCGTT CTCTGTTCCGTAGAAAGAGAAAGAAAACCTGGAGCAGCTGCTGAA
AAATCTAATGAGGAACTAAGAGGCAAACCCACCACTGTGCCTTCT AGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCceGTGCCTTCCTTS
ACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAG GAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGG GGTGGGGTEGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACA ATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGA ATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGG AGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGÇ
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GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
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GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
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CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
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TAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCcoGTGCCOTTCCOTT
GACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGA GGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGG GGGTGGGCGTEGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAC AATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTG AATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATG GAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGC CGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGÇ
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ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
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GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
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GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
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GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
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AGGGCCACTCTGGATCAGGCGAAGGCAGGGGATCTCTGCTGACC TGCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCAatggtgagcaagggegagga gctattcacceggggtagtgccecatcectagtegagectagacggegacgtaaacggccacaagtte agcgtgtecggegagggegagggegatagccacctacggcaagetgaccectgaagttcatetgc accaceggcaagcetgccegtgecetggeceacectegtgaccacectgacetacggegtacagt gettcagceegetacecegacceacatgaageagceacgacttcttcaagtcegecatagccegaagg ctacgtccaggagegcaccatcttetteaaggacgacggcaactacaagaccegegecgagat gaagttcgagggegacaccctagtgaacegcategagctgaagggcategacttcaaggagg acggcaacatcctagggcacaagcetagagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatag ccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatcegecacaacategaggacgg cagcgtagcagctegeegacceactaccagecagaacacceceecateggegacggecceegtgactact gccegacaaccactacctgagcacecagtecgecetgageaaagaccecaacgagaagege gatcacatggtcctgctagagttegtaacegeegecgggatcacteteggcatagacgagetata caagTAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCC AGCCATCTGTTGTTTGCCCCOTCCCcoGTGCCTTCCTTGACCCTGG
AAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGC ATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGEGGST GGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGG CATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCT GACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCC ACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACC AAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTG
AGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 42 — CLRN-3
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CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTAGGAGATACTTGAAGGCAGTTTGAAAGACTTGTTTTACA GATTCTTAGTCCAAAGATTTCCAATTAGGGAGAAGAAGCAGCAGA AAAGGAGAAAAGCCAAGTATGAGTGATGATGAGGCCTTCATCTAC TGACATTTAACCTGGCGAGAACCGTCGATGGTGAAGTTGCCTTTT CAGCTGGGAGCTGTCCGTTCAGCTTCCGTAATAAATGCAGTCAAA GAGGCAGTCCCTTCCCATTGCTCACAAAGGTCTTGTTTTTGAACCOT CGCCCTCACAGAAGCCGTTTCTCATOEGCCACCATGCCTAGCOCAGC AGAAGAAAATCATCTTCTGCATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCOT GTGCTCTGGGAGTTGTGACAGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATC AAAGCCACAGTGCTGTGCAAGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGC CTCTGGCCAAGAGCTGGACAAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACG GCCTGTTCCATGGCGAAGGCGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCC AGACCTTTCAGATTCAGCTTCTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATC CCCEGTGTCCATCCACGTGAACGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCOTG ATCGTGCTGACAATGGTCGGAACCGCCTTCTTCATGTACAACGCC TTCGGCAAGCCCTTCGAGACACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTAC CTGCTGAGCTTTATCAGCGGCAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATT CTGTTCGCCAGCGAAGTGAAGATCCACCACCTGAGCGAGAAGAT CGCCAACTACAAAGAGGGCACCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGA GAAGTACACCACCAGCTTTTGGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCOGTG CACTTCCTGAACGGCCTGCTGATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTT CCATTCEGCCAAGAGCAAGGACGCCGAAACCACAAACGTGGCCGC CGATCTGATGTACTAAGAGCTCAAGGCAAACCTTTCTATAATTTTA CAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTT GCATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAGCATCAGGACCCTTCGT GACAATGTTTACAAATTACGTACTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAA GGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGA AATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACA AATTGTTACTCCATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGT CTTCCTATCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAA AAACAAATAATATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTC AGAAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAA TGAACATCTATAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTA AAGTATACTCTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCC AGCACTTCAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGA GTTCGAGTTACAGTCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAAC AAAATTAAAAAATAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCA TAGTCTTATTAACCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAA GAAGAAAAGAAGAAAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGT GCCTGAGTCCCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAA TTGTTAGGACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTA CATTTGATGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAG TGTCTCGAGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGG ATTATGACGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCA CCAAGCATGACCCAGGTCAACTTTTTTTTTCCCCTGAATTACCCAT CAAATTGATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAAC TGACCCTTCCTTCATCCTCAACCOTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCA AGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGA CCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAA AGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAA GGATGAAACAACCGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCA ATTCGCTATTCEGCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGA TGCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCC CCCGTGCCTTCOTTGACCOTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTT TCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTC ATTCTATTCTGGGGGGTEGEGTEGGGCAGGACAGCAAGGGGGA GGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCT CTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAA
CCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCOGCTCGCTC GCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCoGACGCCCGG6c
TTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCC
TGCAGG SEQ ID NO: 43 — CLRN-4
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGCAGCG GAGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAG AACCCCGGACCTATGCAGGCTCTGCAGCAGCAGCCAGTGTTCCC CGATCTGCTGAAAGCCATTCCTGTCAGCATCCATGTCAACGTCAT CCTCTTCTCTGCCATCCTCATTGTCCOTCACTATGGTTGGAACGGC CTTTTTTATGTATAATGCCTTTGGGAAGCCGTTTGAAACCCTGCAC GGACCCCTGGGACTCTATCTCCOTGAGCTTCATCTCOGGCTCTTGC GGCTGCCTCGTGATGATCCTCTTTGCCTCTGAAGTCAAAATTCAC CACCTGTCTGAGAAAATTGCTAATTACAAAGAAGGGACATACGTTT ACAAAACGCAGAGCGAAAAGTATACGACCAGCTTCTGGCTGACCA AGGGCCACTCTTAAGAGCTCAAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACA AGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGC ATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGA CAATGTTTACAAATTACGTACTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGG GAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAA TTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAA TTGTTACTCCATATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCT TCCTATCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAA ACAAATAATATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAG AAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATG AACATCTATAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAA GTATACTCTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAG CACTTCAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTT CGAGTTACAGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAA ATTAAAAAATAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAG TCTTATTAACCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGA AGAAAAGAAGAAAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGC CTGAGTCCCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATT GTTAGGACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACA TTTGATGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTG TCTCGAGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGAT TATGACGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACC AAGCATGACCCAGGTCAACTTTTTTITTTCCCCTGAATTACCCATCA AATTGATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTG ACCCTTCCTTCATCCTCAACCOTGCOTGTCCTCCAGAAAGCACCAAG GAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACC ACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAG TACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGG ATGAAACAACCGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATT CGCTATTCEGCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGC TGGTTTTTCCCCTTAAATCAGGAAATACACCTGGACAATTTCTAGA
AGACAGGCCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGC CCCTCCCCoGTGCCTTCOTTGACCOTGGAAGGTGCCACTCCCACT
GTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTA GGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTEGEGGTEGGGCAGGACAGCAAG GGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGT GGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCT AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCT CGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCC CGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
CTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 44 — CLRN-6eGFP
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC
CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCatggtgagcaagggegaggagetattcaccggggtagtgcecatee tggtegagctagacggegacgtaaacggccacaagttcagegtgtecggegagggegaggge gatgccacctacggcaagctgaccctgaagtteatetacaccaceggcaagetgccegtgecet ggcecaccectegtgaccacectgacetacggegtgcagtgactticagecegetacecegaccacat gaagcagcacgacttctteaagtecgecatgceegaaggctacgtecaggagegceaccatettet tcaaggacgacggcaactacaagaccegegecgaggtgaagttegagggegacaccctagta aaccgcategagctgaagggcategactticaaggaggacggcaacatcctagggcacaaget ggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatagcegacaagcagaagaacgagcatca aggtgaacttcaagatcegecacaacategaggacggcagegtgcagetegecgaccactace agcagaacacccecceccateggegacggececgtgetagctgccegacaaccactacctgageace cagtcegecetgagcaaagaccecaacgagaagegegatceacatggtectactagagttegta acegeegecgggatcacteteggcatagacgagetgtacaagTAATAAGAGCTCAAG
GCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCA CTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATT AAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTACTAA GGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAA AAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAG GCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATATGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAA AGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATAT CTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGC TGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAA AATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTA GGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGA GGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAG CCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATA AAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACC ATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGA AAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAAT TACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACCACT GAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCAAAA TGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTA ATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGTATC ACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCA GGTCAACTTTTTTTITTCCCCOTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCA GCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCA TCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAG AATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAG TACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAAT AAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCG TATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCA GCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTTTTCCCC TTAAATCAGGAAATACACCTGGACAATTTCTAGAAGACTACAATTC AGTCTAGCCACAAAGGGGATTTTITTTTTTITTGGTAACAGGCTAGAG CCCGGTTCTGTAAGTCTTTAGCTGAAATGGTCCAGTACAAAAGCA CTGGAAATGAGTGGGCTAGGAGGACAAGGACCGTCTCCTGCGTG AGGAGTTGGTTGGAGGTCCCCAAGGCCAGGTACCCCCTGCACTC TTATTGGATTCCTCTCTGTCTTCTTGGAGTTTTGAAAAACTCCTTCG AACACCAGGCTTTTTTCTTTAGAAAACAAGTCTCCAATCGTTCTCT GTTCCGTAGAAAGAGAAAGAAAACCTGGAGCAGCTGCTGAAAAAT
CTAATGAGGAACTAAGAGGCAAACCCACCACTGTGCCTTCTAGTT GCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCOTCCCCoGTGCCTTCCTTGACCOC
TGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAAT TGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTEG GGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGC AGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCA GCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTG GCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCG ACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCA
GTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 45 -CLRN-7eGFP
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ
CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
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CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCatggtgagcaagggegaggagetattcaccggggtagtgcecatee tggtegagctagacggegacgtaaacggccacaagttcagegtgtecggegagggegaggge gatgccacctacggcaagctgaccctgaagtteatetacaccaceggcaagetgccegtgecet ggcecaccectegtgaccacectgacetacggegtgcagtgactticagecegetacecegaccacat gaagcagcacgacttctteaagtecgecatgceegaaggctacgtecaggagegceaccatettet tcaaggacgacggcaactacaagaccegegecgaggtgaagttegagggegacaccctagta aaccgcategagctgaagggcategactticaaggaggacggcaacatcctagggcacaaget ggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatagcegacaagcagaagaacgagcatca aggtgaacttcaagatcegecacaacategaggacggcagegtgcagetegecgaccactace agcagaacacccecceccateggegacggececgtgetagctgccegacaaccactacctgageace cagtcegecetgagcaaagaccecaacgagaagegegatceacatggtectactagagttegta acegecegecgggatcacteteggcatagacgagetgtacaagTAAGAGCTCAAGGCA
AACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTT TAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAG CATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTACTAAGGAT ACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTT GTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAGGCAG TTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATATGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATA TCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTA ATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAA TCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGT ATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCA GGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAA GGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCTGTGC CTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCOTCCCCCGTGCCTT CCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAA ATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCT GGGGGGTEGGGTEGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAA GACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGC TTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGA
TGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAG GCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCeGGGCTTTGCCCGGG
CGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 46 — CLRN-8
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
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CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGCAGCG GAGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAG AACCCCGGACCTATGCAGGCTCTGCAGCAGCAGCCAGTGTTCCC CGATCTGCTGAAAGCCATTCCTGTCAGCATCCATGTCAACGTCAT CCTCTTCTCTGCCATCCTCATTGTCCOTCACTATGGTTGGAACGGC CTTTTTTATGTATAATGCCTTTGGGAAGCCGTTTGAAACCCTGCAC GGACCCCTGGGACTCTATCTCCOTGAGCTTCATCTCOGGCTCTTGC GGCTGCCTCGTGATGATCCTCTTTGCCTCTGAAGTCAAAATTCAC CACCTGTCTGAGAAAATTGCTAATTACAAAGAAGGGACATACGTTT ACAAAACGCAGAGCGAAAAGTATACGACCAGCTTCTGGCTGACCA AGGGCCACTCTTAAGAGCTCGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTC GAGTTACAGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAA TTAAAAAATAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGT CTTATTAACCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAA GAAAAGAAGAAAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCT GAGTCCCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGT TAGGACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATT TGATGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTC TCGAGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTA TGACGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAA GCATGACCCAGGTCAACTTTTTTTTITCCCCTGAATTACCCATCAAA TTGATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGAC CCTTCCTTCATCCTCAACCOTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGA AAAAGCAGAGAATGACAGCAAACACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGC CATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAG GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATC GCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTEGGGTEGS GGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCAT GCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGAC GTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAA GGTCGCCCGACGCCEGGEGCTTTGCCEGGGCGGCCTCAGTGAGC
GAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 47 — CLRN-9
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGCAGCG GAGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAG AACCCCGGACCTATGCAGGCTCTGCAGCAGCAGCCAGTGTTCCC CGATCTGCTGAAAGCCATTCCTGTCAGCATCCATGTCAACGTCAT CCTCTTCTCTGCCATCCTCATTGTCCOTCACTATGGTTGGAACGGC CTTTTTTATGTATAATGCCTTTGGGAAGCCGTTTGAAACCCTGCAC GGACCCCTGGGACTCTATCTCCOTGAGCTTCATCTCOGGCTCTTGC GGCTGCCTCGTGATGATCCTCTTTGCCTCTGAAGTCAAAATTCAC CACCTGTCTGAGAAAATTGCTAATTACAAAGAAGGGACATACGTTT ACAAAACGCAGAGCGAAAAGTATACGACCAGCTTCTGGCTGACCA AGGGCCACTCTTAAGAGCTCAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAG TACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAAT AAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCG TATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCA GCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTTTTCCCC TTAAATCAGGAAATACACCTGGACAATTTCTAGAAGACTACAATTC AGTCTAGCCACAAAGGGGATTTTITTTTTTITTGGTAACAGGCTAGAG CCCGGTTCTGTAAGTCTTTAGCTGAAATGGTCCAGTACAAAAGCA CTGGAAATGAGTGGGCTAGGAGGACAAGGACCGTCTCCTGCGTG AGGAGTTGGTTGGAGGTCCCCAAGGCCAGGTACCCCCTGCACTC TTATTGGATTCCTCTCTGTCTTCTTGGAGTTTTGAAAAACTCCTTCG AACACCAGGCTTTTTTCTTTAGAAAACAAGTCTCCAATCGTTCTCT GTTCCGTAGAAAGAGAAAGAAAACCTGGAGCAGCTGCTGAAAAAT
CTAATGAGGAACTAAGAGGCAAACCCACCACTGTGCCTTCTAGTT GCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCOTCCCCoGTGCCTTCCTTGACCOC
TGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAAT TGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTEG GGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGC AGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCA GCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTG GCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCG ACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCA
GTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 48 — CLRN-10
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGATCCT ATCCCTATGATGTGCCAGACTATGCTAAGCGGAAGAGAAGAGGCG AAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAGAAC CCCEGGACCTATGCAGGCTCTGCAGCAGCAGCCAGTGTTCCCCGA TCTGCTGAAAGCCATTCCTGTCAGCATCCATGTCAACGTCATCCTC TTCTCTGCCATCCTCATTGTCCTCACTATGGTTGGAACGGCCTTTT TTATGTATAATGCCTTTGGGAAGCCGTTTGAAACCCTGCACGGAC CCCTGGGACTCTATCTCOTGAGCTTCATCTCOCGGCTCTTGCGGCT GCCTCGTGATGATCCTCTTTGCCTCTGAAGTCAAAATTCACCACCT GTCTGAGAAAATTGCTAATTACAAAGAAGGGACATACGTTTACAAA ACGCAGAGCGAAAAGTATACGACCAGCTTCTGGCTGACCAAGGG CCACTCTGGATCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGA TCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGTAAGAGCTCGC
TGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTT GCCCCTCCCCCoGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCC
ACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGA GTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTEGGGGCAGGACAGC AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGC GGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGAC CGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCG CGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGAC GCCCGGGCTTTGCCCEGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG
CAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 49 — CLRN-10myc
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGATCCG AGCAGAAACTCATCTCTGAAGAAGATCTGGAACAAAAGTTGATTTC AGAAGAAGATCTGGAACAGAAGCTCATCTCTGAGGAAGATCTGAA GCGGAAGAGAAGAGGCGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTG GCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGCAGGCTCTGCAGCAG CAGCCAGTGTTCCCCGATCTGCTGAAAGCCATTCCTGTCAGCATC CATGTCAACGTCATCCTCTTCTCTGCCATCCTCATTGTCCOTCACTA TGGTTGGAACGGCCTTTTTTATGTATAATGCCTTTGGGAAGCCGTT TGAAACCCTGCACGGACCCCTGGGACTCTATCTCCTGAGCTTCAT CTCCGGCTCTTGCEGGCTGCCTCGTGATGATCCTCTTTGCCTCTGA AGTCAAAATTCACCACCTGTCTGAGAAAATTGCTAATTACAAAGAA GGGACATACGTTTACAAAACGCAGAGCGAAAAGTATACGACCAGC TTCTGGCTGACCAAGGGCCACTCTGGATCCGACTACAAAGACCAT GACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGAT
GACAAGTAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTT GCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCOTCCCCoGTGCCTTCCTTGACCOC
TGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAAT TGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTEG GGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGC AGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCA GCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTG GCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCG ACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCA
GTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 50- CLRN-10NF
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGATCCT ATCCCTATGATGTGCCAGACTATGCTAAGGGCGAAGGCAGAGGC AGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTAT GCAGGCTCTGCAGCAGCAGCCAGTGTTCCCCGATCTGCTGAAAG CCATTCCTGTCAGCATCCATGTCAACGTCATCCTCTTCTCTGCCAT CCTCATTGTCCTCACTATGGTTGGAACGGCCTTTTTTATGTATAAT GCCTTTGGGAAGCCGTTTGAAACCCTGCACGGACCCCTGGGACT CTATCTCCTGAGCTTCATCTCCGGCTCTTGCGGCTGCCTCGTGAT GATCCTCTTTGCCTCTGAAGTCAAAATTCACCACCTGTCTGAGAAA ATTGCTAATTACAAAGAAGGGACATACGTTTACAAAACGCAGAGC GAAAAGTATACGACCAGCTTCTGGCTGACCAAGGGCCACTCTGGA TCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATC GATTACAAGGATGACGATGACAAGTAAGAGCTCGCTGATCAGCCT CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCOTGTTGTTTGCCCCTCCC CCGTGCCTTCCTTGACCCOTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTT CCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCA TTCTATTCTGGGGGGTEGGGTEGGGCAGGACAGCAAGGGGGAG GATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTC TATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAAC CCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCG CTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCT TTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCT
GCAGG SEQ ID NO: 51 — CLRN-11
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
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CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
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TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGATCCT ATCCCTATGATGTGCCAGACTATGCTAAGCGGAAGAGAAGAGGCG AAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAGAAC CCCEGGACCTATGCAGGCTCTGCAGCAGCAGCCAGTGTTCCCCGA TCTGCTGAAAGCCATTCCTGTCAGCATCCATGTCAACGTCATCCTC TTCTCTGCCATCCTCATTGTCCTCACTATGGTTGGAACGGCCTTTT TTATGTATAATGCCTTTGGGAAGCCGTTTGAAACCCTGCACGGAC CCCTGGGACTCTATCTCOTGAGCTTCATCTCOCGGCTCTTGCGGCT GCCTCGTGATGATCCTCTTTGCCTCTGAAGTCAAAATTCACCACCT GTCTGAGAAAATTGCTAATTACAAAGAAGGGACATACGTTTACAAA ACGCAGAGCGAAAAGTATACGACCAGCTTCTGGCTGACCAAGGG CCACTCTGGATCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGA TCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGTAAGAGCTCAA GGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTC ACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATAT TAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTACTA AGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGA AAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAA GGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATATAT GTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATATCAAAGG CACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTAATATATC CACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGCTTT CCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCAACA CACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGCGTG GTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGTGGG AAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCCTGGGCAATAA AGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAATAAATATAAA ATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGTCTGTTGGT CAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGAAAAAACCAACGT TAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAATTACATTCACGAC AGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACCACTGAGGAATCATGA AAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCAAAATGACTTATTAGG GGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTAATATGCAATTAT GAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGTATCACTGTATCATCT TGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTTITTT TTTTCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAAGG CCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACCOTGC TGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAA CAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCC CTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTC CCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAGAAA TAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCAGCAGACATCAGAA CACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTTTTCCCCTTAAATCAGGAAAT
ACACCTGGACAATTTCTAGAAGACAGGCCTCTGTGCCTTCTAGTT GCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCOTCCCCoGTGCCTTCCTTGACCOC
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GTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 52 — CLRN-11myc
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
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GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGATCCG AGCAGAAACTCATCTCTGAAGAAGATCTGGAACAAAAGTTGATTTC AGAAGAAGATCTGGAACAGAAGCTCATCTCTGAGGAAGATCTGAA GCGGAAGAGAAGAGGCGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTG GCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGCAGGCTCTGCAGCAG CAGCCAGTGTTCCCCGATCTGCTGAAAGCCATTCCTGTCAGCATC CATGTCAACGTCATCCTCTTCTCTGCCATCCTCATTGTCCOTCACTA TGGTTGGAACGGCCTTTTTTATGTATAATGCCTTTGGGAAGCCGTT TGAAACCCTGCACGGACCCCTGGGACTCTATCTCCTGAGCTTCAT CTCCGGCTCTTGCEGGCTGCCTCGTGATGATCCTCTTTGCCTCTGA AGTCAAAATTCACCACCTGTCTGAGAAAATTGCTAATTACAAAGAA GGGACATACGTTTACAAAACGCAGAGCGAAAAGTATACGACCAGC TTCTGGCTGACCAAGGGCCACTCTGGATCCGACTACAAAGACCAT GACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGAT GACAAGTAAGAGCTCAAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGA GTAGACTTGCTTTGGTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATC CTTTTAGTCTGCATATATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATG TTTACAAATTACGTACTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAG CAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCT TGACCCAGGTAGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTT ACTCCATATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTA TCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAA TAATATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAAC TGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACAT CTATAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATA CTCTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTT CAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAG TTACAGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAA AAAATAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTA TTAACCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAA AGAAGAAAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAG TCCCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAG GACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGA TGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCG AGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGA CGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCA TGACCCAGGTCAACTTTTTTITTCCCCTGAATTACCCATCAAATTG ATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCT TCCTTCATCCTCAACCOTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAA AGCAGAGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGG TGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCC TTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAA CAACCGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTAT TCGCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTT TTCCCCTTAAATCAGGAAATACACCTGGACAATTTCTAGAAGACAG GCCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCOTGTTGTTTGCCCCTCC CCCGTGCCTTCOTTGACCOTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTT TCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTC ATTCTATTCTGGGGGGTEGEGTEGGGCAGGACAGCAAGGGGGA GGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCT CTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAA
CCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCOGCTCGCTC GCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCoGACGCCCGG6c
TTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCC
TGCAGG SEQ ID NO: 53 — CLRN-11NF
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ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTT CTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAA CGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGG AACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGAC ACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGG CAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAA GATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCA CCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTT GGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCT GATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOGCCAAGAGCAAGGA CGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACGGATCCT ATCCCTATGATGTGCCAGACTATGCTAAGGGCGAAGGCAGAGGC AGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTAT GCAGGCTCTGCAGCAGCAGCCAGTGTTCCCCGATCTGCTGAAAG CCATTCCTGTCAGCATCCATGTCAACGTCATCCTCTTCTCTGCCAT CCTCATTGTCCTCACTATGGTTGGAACGGCCTTTTTTATGTATAAT GCCTTTGGGAAGCCGTTTGAAACCCTGCACGGACCCCTGGGACT CTATCTCCTGAGCTTCATCTCCGGCTCTTGCGGCTGCCTCGTGAT GATCCTCTTTGCCTCTGAAGTCAAAATTCACCACCTGTCTGAGAAA ATTGCTAATTACAAAGAAGGGACATACGTTTACAAAACGCAGAGC GAAAAGTATACGACCAGCTTCTGGCTGACCAAGGGCCACTCTGGA TCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATC GATTACAAGGATGACGATGACAAGTAAGAGCTCAAGGCAAACCTT TCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTTTAGAT GTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAGCATCA GGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTACTAAGGATACAGG CTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTT ATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAGGCAGTTGAC TAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATATATGTGTGTGTGT GTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAAT ATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTAATATATCCACACATTTGT TGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGT AGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCAACACACATTTTAAA AAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACAC CTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTG AGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCT GTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAATAAATATAAAATATAGGCTTT AAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCA AACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGAAAAAACCAACGTTAGGGTATTTT TCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAA TGAACATAATTGTTAGGACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTC TGCTTAGTACATTTGATGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTC TAGCTATAGTGTCTCGAGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATT AAATCTGGGATTATGACGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTC TGGCTGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTTTITTITTTTCCCCOTGA ATTACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGA GCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACCOTGCTGTCCTCCAG AAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAACAGATCACTA GGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAAT AGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAA CTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAGAAATAACTTGCT CTGGTGTCAATTCGCTATTCEGCCAGCAGACATCAGAACACACCGA GTTTCCAGATGCTGGTTTTTCCCCTTAAATCAGGAAATACACCTGG ACAATTTCTAGAAGACAGGCCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGT GCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGC ATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTEGGGTÇCGGGÇ CAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGC TGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGT GCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCC CTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGG TCGCCCGACGCCEGGGCTTTGCCEGGGCGGCCTCAGTGAGCGA
GCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 54 — CLRN-12
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ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTAGGAGATACTTGAAGGCAGTTTGAAAGACTTGTTTTACA GATTCTTAGTCCAAAGATTTCCAATTAGGGAGAAGAAGCAGCAGA AAAGGAGAAAAGCCAAGTATGAGTGATGATGAGGCCTTCATCTAC TGACATTTAACCTGGCGAGAACCGTCGATGGTGAAGTTGCCTTTT CAGCTGGGAGCTGTCCGTTCAGCTTCCGTAATAAATGCAGTCAAA GAGGCAGTCCCTTCCCATTGCTCACAAAGGTCTTGTTTTTGAACCOT CGCCCTCACAGAAGCCGTTTCTCATOEGCCACCATGCCTAGCOCAGC AGAAGAAAATCATCTTCTGCATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCOT GTGCTCTGGGAGTTGTGACAGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATC AAAGCCACAGTGCTGTGCAAGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGC CTCTGGCCAAGAGCTGGACAAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACG GCCTGTTCCATGGCGAAGGCGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCC AGACCTTTCAGATTCAGCTTCTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATC CCCEGTGTCCATCCACGTGAACGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCOTG ATCGTGCTGACAATGGTCGGAACCGCCTTCTTCATGTACAACGCC TTCGGCAAGCCCTTCGAGACACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTAC CTGCTGAGCTTTATCAGCGGCAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATT CTGTTCGCCAGCGAAGTGAAGATCCACCACCTGAGCGAGAAGAT CGCCAACTACAAAGAGGGCACCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGA GAAGTACACCACCAGCTTTTGGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCOGTG CACTTCCTGAACGGCCTGCTGATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTT CCATTCEGCCAAGAGCAAGGACGCCGAAACCACAAACGTGGCCGC CGATCTGATGTACGGATCCTATCCCTATGATGTGCCAGACTATGC TTAAGAGCTCAAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGA CTTGCTTTGGTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTA GTCTGCATATATTAMAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACA AATTACGTACTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAG GAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCC AGGTAGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCAT ATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAA GATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATC TCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCT GCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAA AATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTA GGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGA GGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAG TCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATA AAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACC ATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGA AAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAAT TACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACCACT GAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCAAAA TGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTA ATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGTATC ACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCA GGTCAACTTTTTTTITTCCCCOTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCA GCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCA TCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAG AATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAG TACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAAT AAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCG TATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCA
GCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTCTGTGCCTTCT AGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCceGTGCCTTCCTTS
ACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAG GAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGG GGTGGGGTEGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACA ATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGA ATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGG AGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGÇ
CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 55 — CLRN-13
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ
CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
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GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCCGGTTCAGCT GCTACTTTCTGGACCCCTTCATGGGCCTGCCTACCGGCGTTCCOAC ATCTGCTGTCTCTGCCTTGCAGCACCAGCTGCAGAAGAGAGCACA CCAGCGAGAGAGTGCAAGAGCCTGCCGGCTGTTTTTCTGCCGTG CGGTCTAAACTGCACGCCGGACCTGCTGCCGCCACCAGCTTTTCOT AGATTCGCCCAGAGCAACCCCAGCGAGCACCCTAGACAGTGTCA CAGCCTGCTGTGTCACCCCTACTGTGTGAATCACGGCGGCGATTC TCTGCTGCATGTGCAGTGCTTTTGGAAAACCTTCGGCAGCGACTA CAAGGACCACGACGGCGATTATAAGGATCACGATATCGATTACAA GGACGATGACGACAAGGGCGAAGGCAGAGGCTCCCTGCTGACAT GCGGAGATGTCGAAGAGAACCCCGGACCTATGCCTTCTCAGCAG AAAAAGATTATTTTCTGTATGGCTGGGGTGTTCTCCTTCGCTTGCG CCCECTGGGTGTTGTTACCGCTCTCGGAACACCACTGTGGATTAAGG CTACCGTCCTGTGTAAAACCGGCGCTCTGCTCGTGAATGCCAGCG GACAAGAACTGGATAAGTTTATGGGAGAAATGCAATATGGGCTCT TTCACGGCGAGGGTGTTAGACAGTGCGGACTCGGCGCTAGACCC TTCAGATTCAGCTTCTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGE TCCATCCACGTGAACGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTG CTGACAATGGTCGGAACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGC AAGCCCTTCGAGACACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTG AGCTTTATCAGCGGCAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTC GCCAGCGAAGTGAAGATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAA CTACAAAGAGGGCACCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTA CACCACAAGCTTTTGGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTC CTGAACGGCCTGCTGATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTC GCCAAGTCCAAGGACGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGACET GATGTACAGCGGCTACCCCTACGACGTGCCAGATTATGCATAAGA GCTCAAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCT TTGGTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGC ATATATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTAC GTACTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGG CTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTA GTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATA TATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCT ATCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAA ATAATATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAA CTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACA TCTATAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATA CTCTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTT CAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAG TTACAGGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCAT CTSTTGTTTGCCCCTCCCCOCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTG CCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCA TTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTEGGEGCÇ AGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCT GGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTG CCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCC
TCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGT CGCCCGACGCCeGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAG
CGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 56 — CLRN-14
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCCGGTTCAGCT GCTACTTTCTGGACCCCTTCATGGGCCTGCCTACCGGCGTTCCOAC ATCTGCTGTCTCTGCCTTGCAGCACCAGCTGCAGAAGAGAGCACA CCAGCGAGAGAGTGCAAGAGCCTGCCGGCTGTTTTTCTGCCGTG CGGTCTAAACTGCACGCCGGACCTGCTGCCGCCACCAGCTTTTCOT AGATTCGCCCAGAGCAACCCCAGCGAGCACCCTAGACAGTGTCA CAGCCTGCTGTGTCACCCCTACTGTGTGAATCACGGCGGCGATTC TCTGCTGCATGTGCAGTGCTTTTGGAAAACCTTCGGCAGCGGCGA AGGCAGAGGCTCCCTGCTGACATGCGGAGATGTCGAAGAGAACC CCGGACCTATGCCTTCTCAGCAGAAAAAGATTATTTTCTGTATGGC TGGGGTGTTCTCCTTCGCTTGCGCCCTGGGTEGTTGTTACCOGCTCOT CGGAACACCACTGTGGATTAAGGCTACCGTCCTGTGTAAAACCGG CGCTCTGCTCGTGAATGCCAGCGGACAAGAACTGGATAAGTTTAT GGGAGAAATGCAATATGGGCTCTTTCACGGCGAGGGTGTTAGACA GTGCGGACTCGGCGCTAGACCCTTCAGATTCAGCTTCTTCCCAGA CCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAACGTGATCCT GTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGGAACCGCCTT CTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGACACTGCATGG ACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGGCAGCTGTGG CTGCCTGGTCATGATTCTGTTCEGCCAGCGAAGTGAAGATCCACCA CCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCACCTACGTCTA CAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACAAGCTTTTGGGTTATCTT CTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCTGATCAGACT GGCCGGCTTCCAGTTTCCATTOEGCCAAGTCCAAGGACGCCGAAA CCACAAACGTGGCCGCCGACCTGATGTACTAAGAGCTCAAGGCA AACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTT TAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAG CATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTACTAAGGAT ACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTT GTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAGGCAG TTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATATGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATA TCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTA ATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAA TCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGT ATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCA
GGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAA GGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGgctgatcag cetegaCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCOTGTTGTTTGCCCCTCC
CCCGTGCCTTCOTTGACCOTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTT TCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTC ATTCTATTCTGGGGGGTEGEGTEGGGCAGGACAGCAAGGGGGA GGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCT CTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAA
CCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCOGCTCGCTC GCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCoGACGCCCGG6c
TTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCC
TGCAGG SEQ ID NO: 57 — CLRN-15
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCETCCCCATOTCCococcoeTtococACCOC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GGCEGGECGGCGCGGGCGGGGCGCGCGCEGCCAGECEGEGGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
GGGGGGTEGGCGGCAGSTEGGGGECTCGCCGGGCSGGGGCEGGGCCGÇ CCTCGGGCCEGEGAGEGCTCEGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCoE
CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
TCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTEGGGGCTEGTCCGCGGGGGGACGÇ GCTGCCTTCGGGGGGGACEGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTG GCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGC CTTCTTCTTTTTCCTACAGCO TCC TGGGCAACGTGCTGGTTATTGTG ACCGGTGCCACCATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGC ATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGAC AGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCA AGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGAC AAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGG CGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCCGGTTCAGCT GCTACTTTCTGGACCCCTTCATGGGCCTGCCTACCGGCGTTCCOAC ATCTGCTGTCTCTGCCTTGCAGCACCAGCTGCAGAAGAGAGCACA CCAGCGAGAGAGTGCAAGAGCCTGCCGGCTGTTTTTCTGCCGTG CGGTCTAAACTGCACGCCGGACCTGCTGCCGCCACCAGCTTTTCOT AGATTCGCCCAGAGCAACCCCAGCGAGCACCCTAGACAGTGTCA CAGCCTGCTGTGTCACCCCTACTGTGTGAATCACGGCGGCGATTC TCTGCTGCATGTGCAGTGCTTTTGGAAAACCTTCGGCAGCGACTA CAAGGACCACGACGGCGATTATAAGGATCACGATATCGATTACAA GGACGATGACGACAAGTAAGAGCTCAAGGCAAACCTTTCTATAAT TTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTTTAGATGTGGTTAA TTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAGCATCAGGACCCTT CGTGACAATGTTTACAAATTACGTACTAAGGATACAGGCTGGAAA GTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGT GGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATC GACAAATTGTTACTCCATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATATCAAAGGCACA TGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTAATATATCCACA CATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTA AAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCAACACACA TTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGCGTGGTGA
CTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGTGGGAAGA TCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGgctgatcagceetegaCTGTGC
CTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCOGTGCCTT CCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAA ATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCT GSGGGECGTEGEGTEGEGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAA GACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGC TTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGA TGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAG GCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGÇ
CGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 58 - CLRN-16
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGC CCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATOETCCcCcococoTtTcoccACCC
CCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGG GCGCEGEGEGEGEGEGEGCECECECCAGGECEGEGCGGGGCEG GGCGAGGGGCEGGGGCGCEGEGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG
GCGGCGGCGGCEGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGG GCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCeGTGCCCOGCTCCGCGÇ CCGCCTEGCEGCOGCcoeGoocoGGCTCTGACTGACCGCGTTACTC
CCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAA TTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTITTTCTGTGGCTGCGT GAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGÇCGEGÇ AGCGGCTCGGGGGGCGTEGCGEGTGCGEGTEGTGTEGTEGTGCGTGGGGAGECG CCGCSGTGCGGCCCGCGCTECCCGGCGGCTEGTGAGCGCTGCGGGÇ CGCGGCGCGEGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTETEGCGCGAGGGGAG CGCGGCCGGEGECEGTGCCCCGCGGTGCEGGEGGGGCTGCGÇGAG
GGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTETGTGCEGTEGGGGGGGTÇGAG CAGGGGGTEGTGGGCGCEGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCcceTGC
ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTÇGCGÇ GGGCTCCEGTGCGEGGEGCESTEGCGCGGGGCTCEGCCGTEGCCGGGC
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CGGAGCGCCGGCGGCTETCEGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATT GCCTTTTATGGTAATCEGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGT CCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCE
CCCTCTAGCEGGGCGCEGEGGCGAAGCGGTEGCGGCGCCGGCAGGA AGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGCC6Gces
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CAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAG TTACAGgctgatcagcetegaCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCOTGTT
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GCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 59 — CLRN-17
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG
AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 60 — CLRN-18
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCOGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGC GTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
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GGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCAT CGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGCTEG GGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCAT GCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGAC GTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAA GGTCGCCCGACGCCEGGEGCTTTGCCEGGGCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

Claims (228)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: cada um dos pelo menos dois vetores diferentes compre- ende uma sequência codificadora que codifica uma porção diferente de uma proteína CLRN1, cada uma das porções codificadas tendo pe- lo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que a se- quência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas pode, opcionalmente, sobrepor parcialmente com a sequência de aminoáci- dos de uma das porções codificadas diferente; nenhum vetor único dos pelo menos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; pelo menos uma das sequências codificadoras compreende uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos do DNA genômico da CLRN1 e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons consecutivos; e quando introduzidos em uma célula de mamífero, os pelo menos dois vetores diferentes sofrem recombinação homóloga entre si, formando, assim, um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína CLRN1 completa.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência codificadora que codifica uma porção diferente de uma primeira isoforma da proteína CLRN1.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compre- ende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 3.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracteri- zada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compre-
ende a SEQ ID Nº: 3.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID Nº: 3.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zada pelo fato de que um dos pelo menos dois vetores de ácido nu- cleico diferentes compreende ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compre- ende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 5.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 com- preende a SEQ ID Nº: 5.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracteri- zada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste em SEQ ID Nº: 5.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferen- tes inclui uma sequência codificadora que codifica uma porção diferen- te de uma segunda isoforma da proteína CLRN1.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, carac- terizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 com- preende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº:
5.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, carac- terizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 5.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, carac- terizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 con-
siste em SEQ ID Nº: 5.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, carac- terizada pelo fato de que um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende ainda uma sequência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 com- preende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº:
3.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, carac- terizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 com- preende a SEQ ID Nº: 3.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 con- siste na SEQ ID Nº: 3.
18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos pelo menos dois vetores diferentes compreende uma região 5' não traduzi- da (UTR), uma 3' UTR ou ambas.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 10 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 20 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 50 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 80 nucleo-
tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 18, carac- terizada pelo fato de que a SUTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 12.
24. Composição, de acordo com a reivindicação 18, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 10 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 20 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
26. Composição, de acordo com a reivindicação 25, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 50 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 80 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
28. Composição, de acordo com a reivindicação 18, carac- terizada pelo fato de que a 3UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 15.
29. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferen- tes é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral.
30. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferen- tes é um cromossomo artificial humano (HAC), cromossomo artificial de levedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC).
31. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferen-
tes é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoasso- ciado (AAV), um vetor adenoviral, um vetor lentiviral ou um vetor retro- viral.
32. Composição, de acordo com a reivindicação 31, carac- terizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores dife- rentes é um vetor AAV.
33. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 32, caracterizada pelo fato de que a sequência de amino- ácidos de nenhuma das porções codificadas se sobrepõe à sequência de aminoácidos de uma diferente das porções codificadas.
34. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 32, caracterizada pelo fato de que a sequência de amino- ácidos de cada uma das porções codificadas se sobrepõe parcialmen- te à sequência de aminoácidos de uma diferente das porções codifica- das.
35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, carac- terizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos sobreposta tem entre cerca de 30 resíduos de aminoácidos e cerca de 202 resíduos de aminoácidos de comprimento.
36. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 32, caracterizada pelo fato de que os vetores incluem dois vetores diferentes, cada um dos quais compreende um segmento dife- rente de um íntron, em que o íntron compreende a sequência nucleotí- dica de um íntron que está presente no DNA genômico da CLRN1, e em que os dois segmentos de íntron diferentes se sobrepõem em se- quência em pelo menos 100 nucleotídeos.
37. Composição, de acordo com a reivindicação 36, carac- terizada pelo fato de que os dois segmentos de íntron diferentes se sobrepõem em sequência por 100 nucleotídeos a cerca de 800 nucleo- tídeos.
38. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que toda a sequência nucle- otídica de cada um dos pelo menos dois vetores diferentes tem entre cerca de 500 nucleotídeos e cerca de 10.000 nucleotídeos de compri- mento.
39. Composição, de acordo com a reivindicação 38, carac- terizada pelo fato de que toda a sequência nucleotídica de cada um dos pelo menos dois vetores diferentes tem entre 500 nucleotídeos e
5.000 nucleotídeos de comprimento.
40. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 39, caracterizada pelo fato de que o número de vetores di- ferentes na composição é dois.
41. Composição, de acordo com a reivindicação 40, carac- terizada pelo fato de que um primeiro dos dois vetores diferentes com- preende uma sequência codificadora que codifica uma porção N- terminal da proteína CLRN1.
42. Composição, de acordo com a reivindicação 41, carac- terizada pelo fato de que a porção N-terminal da proteína CLRN1 tem entre 30 aminoácidos e 202 aminoácidos de comprimento.
43. Composição, de acordo com a reivindicação 41, carac- terizada pelo fato de que a porção N-terminal da proteína CLRN1 tem entre 60 aminoácidos e 170 aminoácidos de comprimento.
44. Composição, de acordo com a reivindicação 41, carac- terizada pelo fato de que o primeiro vetor compreende ainda uma se- quência SUTR.
45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 10 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 45, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 20 nucleo-
tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
47. Composição, de acordo com a reivindicação 46, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 50 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
48. Composição, de acordo com a reivindicação 47, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 80 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 44, carac- terizada pelo fato de que a SUTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 12.
50. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 41 a 49, caracterizada pelo fato de que o primeiro vetor com- preende ainda um ou ambos dentre um promotor e uma sequência de Kozak.
51. Composição, de acordo com a reivindicação 50, carac- terizada pelo fato de que o primeiro vetor compreende um promotor que é um promotor induzível, um promotor constitutivo ou um promotor tecido-especiífico.
52. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 40 a 51, caracterizada pelo fato de que o segundo dos dois vetores diferentes compreende uma sequência codificadora que codifi- ca uma porção C-terminal da proteína CLRN1.
53. Composição, de acordo com a reivindicação 52, carac- terizada pelo fato de que a porção C-terminal da proteína CLRN1 tem entre 30 aminoácidos e 202 aminoácidos de comprimento.
54. Composição, de acordo com a reivindicação 53, carac- terizada pelo fato de que a porção C-terminal da proteína CLRN1 tem entre 60 aminoácidos e 170 aminoácidos de comprimento.
55. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 52 a 54, caracterizada pelo fato de que o segundo vetor com-
preende ainda uma sequência sinal de poliadenilação.
56. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 52 a 55, caracterizada pelo fato de que o segundo vetor com- preende ainda uma sequência 3'UTR.
57. Composição, de acordo com a reivindicação 56, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 10 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
58. Composição, de acordo com a reivindicação 57, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 20 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
59. Composição, de acordo com a reivindicação 58, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 50 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
60. Composição, de acordo com a reivindicação 59, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 80 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
61. Composição, de acordo com a reivindicação 56, carac- terizada pelo fato de que a 3UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 15.
62. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de um vetor de ácido nucleico único, em que o vetor compreende um ou ambos de (i) uma primeira sequência codificadora que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1, e (ii) uma segunda sequência codificadora que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1, em que uma ou ambas a primeira e a segunda sequências codificadora compreendem uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos de um DNA genômico de CLRN1 e não pos- suem uma sequência intrônica entre os dois íntrons consecutivos.
63. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único contém a primeira sequência codificadora e não a segunda sequência codifica- dora.
64. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único contém a se- gunda sequência codificadora e não a primeira sequência codificadora.
65. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único contém am- bas a primeira sequência codificadora e a segunda sequência codifi- cadora.
66. Composição, de acordo com as reivindicações 62, 63 e 65, caracterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 3.
67. Composição, de acordo com a reivindicação 66, carac- terizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 com- preende a SEQ ID Nº: 3.
68. Composição, de acordo com a reivindicação 67, carac- terizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 con- siste na SEQ ID Nº: 3.
69. Composição, de acordo com as reivindicações 62, 64 e 65, caracterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 5.
70. Composição, de acordo com a reivindicação 69, carac- terizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 5.
71. Composição, de acordo com a reivindicação 70, carac- terizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 con- siste em SEQ ID Nº: 5.
72. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-
cações 62 a 71, caracterizada pelo fato de que o vetor de ácido nu- cleico único compreende ainda uma região 5' não traduzida (UTR), uma 3' UTR ou ambas.
73. Composição, de acordo com a reivindicação 72, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 10 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
74. Composição, de acordo com a reivindicação 73, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 20 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
75. Composição, de acordo com a reivindicação 74, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 50 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
76. Composição, de acordo com a reivindicação 75, carac- terizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 80 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
77. Composição, de acordo com a reivindicação 72, carac- terizada pelo fato de que a SUTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 12.
78. Composição, de acordo com a reivindicação 72, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 10 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
79. Composição, de acordo com a reivindicação 78, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 20 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
80. Composição, de acordo com a reivindicação 79, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 50 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
81. Composição, de acordo com a reivindicação 80, carac- terizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 80 nucleo- tídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
82. Composição, de acordo com a reivindicação 72, carac- terizada pelo fato de que a 3UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 15.
83. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único é um plasmí- deo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral.
84. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único é um cromos- somo artificia humano (HAC), cromossomo artificial de levedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo ar- tificial derivado de P1 (PAC).
85. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor adenoviral, um vetor lentiviral ou um vetor retroviral.
86. Composição, de acordo com a reivindicação 85, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único é um vetor AAV.
87. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único compreende ainda um ou ambos de um promotor e uma sequência de Kozak.
88. Composição, de acordo com a reivindicação 87, carac- terizada pelo fato de que o primeiro vetor compreende um promotor que é um promotor induzível, um promotor constitutivo ou um promotor tecido-especiífico.
89. Composição, de acordo com a reivindicação 87, carac- terizada pelo fato de que o vetor de ácido nucleico único compreende ainda uma sequência sinal de poliadenilação.
90. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-
cações 1 a 89, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
91. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a
90.
92. Kit, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda uma seringa pré-carregada que compreende a composição.
93. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: introdução, na cóclea de um mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a590.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracteriza- do pelo fato de que o mamífero é um humano.
95. Método, de acordo com a reivindicação 93 ou 94, carac- terizado pelo fato de que o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1.
96. Método para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em uma célula de mamífero, sendo o método carac- terizado pelo fato de que compreende a introdução da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 90 na célula de mamífero.
97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula ciliada interna da cóclea ou uma célula ciliada externa da cóclea.
98. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula da retina.
99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 96 a 98, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula humana.
100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 96 a 99, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero foi previamente determinada como tendo um gene defeituoso da CLRN1.
101. Método para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em uma célula ciliada interna, uma célula ciliada ex- terna, ou ambas, na cóclea de um mamífero, sendo o método caracte- rizado pelo fato de que compreende: introdução, na cóclea do mamífero, de uma quantidade te- rapeuticamente eficaz da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a590.
102. Método para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em um olho de um mamífero, o método caracteriza- do pelo fato de que compreende: administração intraocular no olho do mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a90.
103. Método, de acordo com a reivindicação 101 ou 102, caracterizado pelo fato de que o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1.
104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 101 a 104, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um hu- mano.
105. Método de tratamento de perda auditiva em um sujeito identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1, o método ca- racterizado pelo fato de que compreende: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 90 na cóclea do sujeito.
106. Método de tratamento de perda de visão em um sujei- to identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1, o método caracterizado pelo fato de que compreende: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 90 no olho do sujeito.
107. Método, de acordo com a reivindicação 105 ou 106, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem a síndrome de Usher tipo UI.
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 107, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.
109. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 108, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes da etapa de administração, determinar se o sujeito tem um gene defeituoso da CLRN1.
110. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende um promotor, uma primeira se- quência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma pro- teína CLRN1 posicionada a 3' do promotor e uma sequência doadora de splicing posicionada na extremidade 3' da primeira sequência codi- ficadora; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende uma sequência aceptora de splicing, uma segunda sequência codificadora que codifica uma por- ção C-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de splicing e uma sequência sinal de poliadeni- lação na extremidade 3' da segunda sequência codificadora; em que cada uma das porções codificadas tem pelo menos resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as sequências de aminoácidos das duas porções codificadas não se sobrepõem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma pro- teína CLRN1 completa; e quando introduzido em uma célula de mamífero, ocorre splicing entre a sequência doadora de splicing e a sequência aceptora de splicing, formando assim um ácido nucleico recombinado que codi- fica uma proteína CLRN1 completa.
111. Composição, de acordo com a reivindicação 110, ca- racterizada pelo fato de que a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma primeira isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da primeira isoforma da proteína CLRN1.
112. Composição, de acordo com a reivindicação 111, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 3.
113. Composição, de acordo com a reivindicação 112, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 3.
114. Composição, de acordo com a reivindicação 113, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID Nº: 3.
115. Composição, de acordo com a reivindicação 111, ca- racterizada pelo fato de que o primeiro vetor de ácido nucleico ou o segundo vetor de ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1.
116. Composição, de acordo com a reivindicação 115, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 5.
117. Composição, de acordo com a reivindicação 116, ca-
racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 5.
118. Composição, de acordo com a reivindicação 117, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste em SEQ ID Nº: 5.
119. Composição, de acordo com a reivindicação 110, ca- racterizada pelo fato de que a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma segunda isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da segunda isoforma da proteína CLRN1.
120. Composição, de acordo com a reivindicação 119, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 5.
121. Composição, de acordo com a reivindicação 120, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 5.
122. Composição, de acordo com a reivindicação 121, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste em SEQ ID Nº: 5.
123. Composição, de acordo com a reivindicação 119, ca- racterizada pelo fato de que o primeiro vetor de ácido nucleico ou se- gundo vetor de ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1.
124. Composição, de acordo com a reivindicação 123, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 3.
125. Composição, de acordo com a reivindicação 124, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 3.
126. Composição, de acordo com a reivindicação 125, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID Nº: 3.
127. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 110 a 126, caracterizada pelo fato de que um dentre ou am- bos o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nu- cleico compreendem uma região 5' não traduzida (UTR), uma 3' UTR ou ambas.
128. Composição, de acordo com a reivindicação 127, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 10 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
129. Composição, de acordo com a reivindicação 128, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 20 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
130. Composição, de acordo com a reivindicação 129, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 50 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
131. Composição, de acordo com a reivindicação 130, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 80 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
132. Composição, de acordo com a reivindicação 127, ca- racterizada pelo fato de que a S"UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 12.
133. Composição, de acordo com a reivindicação 127, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 10 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
134. Composição, de acordo com a reivindicação 133, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 20 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
135. Composição, de acordo com a reivindicação 134, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 50 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
136. Composição, de acordo com a reivindicação 135, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 80 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
137. Composição, de acordo com a reivindicação 127, ca- racterizada pelo fato de que a 3UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 15.
138. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 110 a 137, caracterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artifici- al ou um vetor viral.
139. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 110 a 137, caracterizada pelo fato de que cada um dentre primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um cromossomo artificial humano (HAC), cromossomo artificial de le- vedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromos- somo artificial derivado de P1 (PAC).
140. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 110 a 137, caracterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor adenoviral, um vetor lentiviral ou um vetor retroviral.
141. Composição, de acordo com a reivindicação 140, ca- racterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um vetor AAV.
142. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 110 a 141, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das sequências codificadoras compreende uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons consecutivos do DNA genômico da CLRN1 e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons consecutivos.
143. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende um promotor, uma primeira se- quência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma pro- teína CLRN1 posicionada a 3' do promotor, uma sequência doadora de splicing posicionada na extremidade 3' da primeira sequência codifica- dora e um primeiro gene marcador detectável posicionado a 3' da se- quência sinal doadora de splicing; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende um segundo gene marcador de- tectável, uma sequência aceptora de splicing posicionada a 3' do se- gundo gene marcador detectável, uma segunda sequência codificado- ra que codifica uma porção C-terminal de uma proteína CLRN1 posici- onada na extremidade 3' da sequência aceptora de splicing e uma se- quência sinal de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da se- gunda sequência codificadora; em que cada uma das porções codificadas tem pelo menos resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; e quando introduzido em uma célula de mamífero, ocorre splicing entre a sequência doadora de splicing e a sequência aceptora de splicing, formando assim um ácido nucleico recombinado que codi- fica uma proteína CLRN1 completa.
144. Composição, de acordo com a reivindicação 143, ca-
racterizada pelo fato de que a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma primeira isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da primeira isoforma da proteína CLRN1.
145. Composição, de acordo com a reivindicação 144, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 3.
146. Composição, de acordo com a reivindicação 145, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 3.
147. Composição, de acordo com a reivindicação 146, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID Nº: 3.
148. Composição, de acordo com a reivindicação 144, ca- racterizada pelo fato de que o primeiro vetor de ácido nucleico ou o segundo vetor de ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1.
149. Composição, de acordo com a reivindicação 148, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 5.
150. Composição, de acordo com a reivindicação 149, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 5.
151. Composição, de acordo com a reivindicação 150, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste em SEQ ID Nº: 5.
152. Composição, de acordo com a reivindicação 143, ca- racterizada pelo fato de que a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma segunda isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da segunda isoforma da proteína CLRN1.
153. Composição, de acordo com a reivindicação 152, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 5.
154. Composição, de acordo com a reivindicação 153, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 5.
155. Composição, de acordo com a reivindicação 154, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste em SEQ ID Nº: 5.
156. Composição, de acordo com a reivindicação 152, ca- racterizada pelo fato de que o primeiro vetor de ácido nucleico ou se- gundo vetor de ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1.
157. Composição, de acordo com a reivindicação 156, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 3.
158. Composição, de acordo com a reivindicação 157, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 3.
159. Composição, de acordo com a reivindicação 158, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID Nº: 3.
160. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 143 a 159, caracterizada pelo fato de que um dentre ou am-
bos o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nu- cleico compreendem uma região 5' não traduzida (UTR), uma 3' UTR ou ambas.
161. Composição, de acordo com a reivindicação 160, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 10 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
162. Composição, de acordo com a reivindicação 161, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 20 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
163. Composição, de acordo com a reivindicação 162, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 50 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
164. Composição, de acordo com a reivindicação 163, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 80 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
165. Composição, de acordo com a reivindicação 160, ca- racterizada pelo fato de que a S"UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 12.
166. Composição, de acordo com a reivindicação 160, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 10 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
167. Composição, de acordo com a reivindicação 166, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
168. Composição, de acordo com a reivindicação 167, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 50 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
169. Composição, de acordo com a reivindicação 168, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 80 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
170. Composição, de acordo com a reivindicação 160, ca- racterizada pelo fato de que a 3UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 15.
171. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 143 a 170, caracterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artifici- al ou um vetor viral.
172. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 143 a 170, caracterizada pelo fato de que cada um dentre primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um cromossomo artificial humano (HAC), cromossomo artificial de le- vedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromos- somo artificial derivado de P1 (PAC).
173. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 143 a 170, caracterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor adenoviral, um vetor lentiviral ou um vetor retroviral.
174. Composição, de acordo com a reivindicação 173, ca- racterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um vetor AAV.
175. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 143 a 174, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das sequências codificadoras compreende uma sequência nucleotídi- ca que abrange dois éxons consecutivos do DNA genômico da CLRN1 e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons consecuti- vos.
176. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 143 a 175, caracterizada pelo fato de que o primeiro ou se-
gundo gene marcador detectável é a fosfatase alcalina.
177. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende um promotor, uma primeira se- quência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma pro- teína CLRN1 posicionada a 3' do promotor, uma sequência doadora de splicing posicionada na extremidade 3' da primeira sequência codifica- dora e uma região recombinogênica de fago F1 posicionada a 3' em relação à sequência sinal doadora de splicing; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende uma região recombinogênica de fago F1, uma sequência aceptora de splicing posicionada a 3' da se- gunda região recombinogênica de fago F1, uma segunda sequência codificadora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína CLRN1 posicionada na extremidade 3' da sequência aceptora de spli- cing e uma sequência sinal de poliadenilação posicionada na extremi- dade 3' da segunda sequência codificadora; em que cada uma das duas porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que as se- quências de aminoácidos das duas porções codificadas não se sobre- põem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína CLRN1 completa; e quando introduzido em uma célula de mamífero, ocorre splicing entre a sequência doadora de splicing e a sequência aceptora de splicing, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifi- ca uma proteína CLRN1 completa.
178. Composição, de acordo com a reivindicação 177, ca- racterizada pelo fato de que a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma primeira isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da primeira isoforma da proteína CLRN1.
179. Composição, de acordo com a reivindicação 178, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 3.
180. Composição, de acordo com a reivindicação 179, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 3.
181. Composição, de acordo com a reivindicação 180, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID Nº: 3.
182. Composição, de acordo com a reivindicação 178, ca- racterizada pelo fato de que o primeiro vetor de ácido nucleico ou o se- gundo vetor de ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma segunda isoforma da proteína CLRN1.
183. Composição, de acordo com a reivindicação 182, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 5.
184. Composição, de acordo com a reivindicação 183, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 5.
185. Composição, de acordo com a reivindicação 184, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste em SEQ ID Nº: 5.
186. Composição, de acordo com a reivindicação 177, ca- racterizada pelo fato de que a primeira sequência codificadora codifica uma porção N-terminal de uma segunda isoforma da proteína CLRN1, e a segunda sequência codificadora codifica uma porção C-terminal da segunda isoforma da proteína CLRN1.
187. Composição, de acordo com a reivindicação 186, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 5.
188. Composição, de acordo com a reivindicação 187, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 5.
189. Composição, de acordo com a reivindicação 188, ca- racterizada pelo fato de que a segunda isoforma da proteína CLRN1 consiste em SEQ ID Nº: 5.
190. Composição, de acordo com a reivindicação 186, ca- racterizada pelo fato de que o primeiro vetor de ácido nucleico ou se- gundo vetor de ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma primeira isoforma da proteína CLRN1.
191. Composição, de acordo com a reivindicação 190, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 3.
192. Composição, de acordo com a reivindicação 191, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 compreende a SEQ ID Nº: 3.
193. Composição, de acordo com a reivindicação 192, ca- racterizada pelo fato de que a primeira isoforma da proteína CLRN1 consiste na SEQ ID Nº: 3.
194. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 177 a 193, caracterizada pelo fato de que um dentre ou am- bos o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nu- cleico compreendem uma região 5' não traduzida (UTR), uma 3' UTR ou ambas.
195. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 10 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
196. Composição, de acordo com a reivindicação 195, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 20 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
197. Composição, de acordo com a reivindicação 196, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 50 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
198. Composição, de acordo com a reivindicação 197, ca- racterizada pelo fato de que a 5' UTR compreende pelo menos 80 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 12.
199. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que a S"UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 12.
200. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 10 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
201. Composição, de acordo com a reivindicação 200, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 20 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
202. Composição, de acordo com a reivindicação 201, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 50 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
203. Composição, de acordo com a reivindicação 202, ca- racterizada pelo fato de que a 3' UTR compreende pelo menos 80 nu- cleotídeos contíguos de qualquer lugar dentro da SEQ ID Nº: 15.
204. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que a 3UTR compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID Nº: 15.
205. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 177 a 204, caracterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artifici- al ou um vetor viral.
206. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 177 a 204, caracterizada pelo fato de que cada um dentre primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um cromossomo artificial humano (HAC), cromossomo artificial de le- vedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromos- somo artificial derivado de P1 (PAC).
207. Composição, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 177 a 204, caracterizada pelo fato de que cada um den- tre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nu- cleico é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoas- sociado (AAV), um vetor adenoviral, um vetor lentiviral ou um vetor retroviral.
208. Composição, de acordo com a reivindicação 207, ca- racterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo vetor de ácido nucleico é um vetor AAV.
209. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 177 a 204, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das sequências codificadoras compreende uma sequência nucleotídi- ca que abrange dois éxons consecutivos do DNA genômico da CLRN1 e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons consecuti- vos.
210. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 110 a
209.
211. Kit, de acordo com a reivindicação 210, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma seringa pré-carregada que compreende a composição.
212. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: introdução, na cóclea de um mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 110 a 209.
213. Método, de acordo com a reivindicação 212, caracteri- zado pelo fato de que o mamífero é um humano.
214. Método, de acordo com a reivindicação 212 ou 213, caracterizado pelo fato de que o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1.
215. Método para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em uma célula de mamífero, sendo o método carac- terizado pelo fato de que compreende a introdução da composição, com definida em qualquer uma das reivindicações 110 a 209 na célula de mamífero.
216. Método, de acordo com a reivindicação 215, caracteri- zado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula ciliada inter- na da cóclea ou uma célula ciliada externa da cóclea.
217. Método, de acordo com a reivindicação 215, caracteri- zado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula da retina.
218. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 215 a 217, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula humana.
219. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 215 a 218, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero foi previamente determinada como tendo um gene defeituoso da CLRN1.
220. Método para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em uma célula ciliada interna, uma célula ciliada ex-
terna, ou ambas, na cóclea de um mamífero, sendo o método caracte- rizado pelo fato de que compreende: introdução, na cóclea do mamífero, de uma quantidade te- rapeuticamente eficaz da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 110 a 209.
221. Método para aumentar a expressão de uma proteína CLRN1 completa em um olho de um mamífero, o método caracteriza- do pelo fato de que compreende: administração intraocular no olho do mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 110 a 209.
222. Método, de acordo com a reivindicação 220 ou 221, caracterizado pelo fato de que o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1.
223. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 220 a 222, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um hu- mano.
224. Método de tratamento de perda auditiva em um sujeito identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1, o método ca- racterizado pelo fato de que compreende: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 110 a 209 na cóclea do sujeito.
225. Método de tratamento de perda de visão em um sujei- to identificado como tendo um gene defeituoso da CLRN1, o método caracterizado pelo fato de que compreende: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 110 a 209 no olho do sujeito.
226. Método, de acordo com a reivindicação 224 ou 225,
caracterizado pelo fato de que o sujeito tem a síndrome de Usher tipo UI.
227. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 224 a 226, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.
228. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 224 a 227, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes da etapa de administração, determinar se o sujeito tem um gene defeituoso da CLRN1.
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