CN101365494A - 治疗自身免疫性疾病的组合物和方法 - Google Patents

治疗自身免疫性疾病的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101365494A
CN101365494A CNA2006800456906A CN200680045690A CN101365494A CN 101365494 A CN101365494 A CN 101365494A CN A2006800456906 A CNA2006800456906 A CN A2006800456906A CN 200680045690 A CN200680045690 A CN 200680045690A CN 101365494 A CN101365494 A CN 101365494A
Authority
CN
China
Prior art keywords
self
carrier
polypeptide
self carrier
intron
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800456906A
Other languages
English (en)
Inventor
内尼特·苏瓦山
迈克尔·勒维腾
海德基·葛元
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayhill Therapeutics Inc
Original Assignee
Bayhill Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayhill Therapeutics Inc filed Critical Bayhill Therapeutics Inc
Publication of CN101365494A publication Critical patent/CN101365494A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申请公开了用于治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法，所述方法包括给予经修饰的编码并能表达自身多肽的自身载体，所述自身多肽包含与该自身免疫性疾病相关的一种或多种致病表位。本发明所述的改良方法包括向个体给予一种或多种经修饰的包含编码自身多肽的多核苷酸的自身载体。一方面，相对于所述未经修饰的自身载体，所述方法包括经修饰的允许在宿主细胞内表达增加量的自身多肽的自身载体，所述自身多肽与自身免疫性疾病相关。在另一互相不排斥的方面，所述方法包括经修饰的允许将分泌的自身抗原编码成非分泌的自身多肽的自身载体，所述分泌的自身抗原与自身免疫性疾病相关。

Description

治疗自身免疫性疾病的组合物和方法
发明背景
1.发明领域
本发明涉及免疫学及医学领域。本发明实现了治疗或预防个体疾病的方法和组合物，所述疾病与存在于该个体内且参与非生理状态的一种或多种自身蛋白、多肽或肽相关。更特别地，本发明涉及用于治疗和预防自身免疫性疾病的改良方法和组合物，其包括用修饰的编码并能表达自身多肽的自身载体进行DNA疫苗接种，所述自身多肽包括与自身免疫性疾病相关的一种或多种自身抗原表位。
2.背景
自身免疫性疾病及免疫反应调节
自身免疫性疾病指由错误指向机体健康细胞和/或组织的免疫细胞引起的任何疾病。自身免疫性疾病影响3％美国人口和可能类似比例的工业化世界人口(Jacobson et al.，Clin Immunol Immunopathol 84，223-43，1997)。自身免疫性疾病的特征为：异常地靶向自身蛋白、自身多肽、自身肽和/或其他自身分子的T和B淋巴细胞造成体内器官、组织或细胞类型(例如，胰腺、脑、甲状腺或胃肠道)的损伤和/或机能失调，从而引起该疾病的临床表现(Marrack et al.，Nat Med 7，899-905，2001)。自身免疫性疾病包括影响特异组织的疾病和影响多组织的疾病。对某些疾病而言，这可能部分取决于自身免疫反应是指向局限于特定组织的抗原还是指向广泛分布于机体的抗原。组织特异性自身免疫的表征特征为选择性靶向单个组织或单一细胞类型。然而，靶向普遍存在的自身蛋白的某些自身免疫性疾病也能影响特异组织。例如，在多肌炎中，自身免疫反应靶向广泛存在的蛋白组氨酰基-tRNA合成酶，然而主要涉及的临床表现为肌肉的自身免疫性破坏。
免疫系统采用高度复杂的机制用于产生反应以保护哺乳动物抵抗多种外源病原体并同时阻止对自身抗原的反应。除了决定是否反应(抗原特异性)之外，免疫系统还必须选择适当的效应功能以处理每种病原体(效应特异性)。介导并调控这些效应功能的关键细胞是CD4+T细胞。此外，对来自CD4+T细胞的特异细胞因子的精细加工表现为T细胞介导其功能的主要机制。因此，反应表征CD4+T细胞产生的细胞因子类型及它们的分泌是如何控制的对理解免疫反应是如何被调节的极为重要。
十多年前初次发表了对长期小鼠CD4+T细胞克隆产生细胞因子的表征(Mosmann et al.，J.Immunol.136：2348-2357，1986)。在这些研究中，显示了CD4+T细胞引起细胞因子产生的两种不同方式，命名为T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)。已发现Th1细胞主要产生白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和淋巴毒素(LT)，而Th2克隆主要产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-13(Cherwinski et al.，J.Exp.Med.169：1229-1244，1987)。稍后，从Th2克隆分离到另外的细胞因子：IL-9和IL-10(VanSnick et al.，J.Exp.Med.169:363-368，1989)(Fiorentino et al.，J.Exp.Med.170：2081-2095，1989)。最后，发现Th1和Th2细胞两者都分泌诸如IL-3、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的另外的细胞因子。
自身免疫性疾病包括能影响下表1列出的机体内许多不同器官和组织的广谱疾病(参见例如Paul，W.E(1999)FundamentalImmunology(基础免疫学)，第四版，Lippincott-Raven，纽约)。
表1 自身免疫性疾病中靶向的主要器官和组织
 
靶向的主要器官 疾病
甲状腺 桥本病(Hashimoto’s Disease)
甲状腺 原发性黏液水肿
甲状腺 甲状腺功能亢进
胃 恶性贫血
胃 萎缩性胃炎
肾上腺 阿狄森病(Addison’s disease)
胰岛 胰岛素依赖的糖尿病
肾 古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)
肌神经接点 重症肌无力
 
间质细胞 男性不育
皮肤 寻常天疱疮
皮肤 类天疱疮
眼 交感性眼炎
眼 晶体原性葡萄膜炎(Phacogenic uveitis)
脑 多发性硬化
血红细胞 溶血性贫血
血小板 先天性血小板减少性紫癜
白细胞 先天性白血球减少症
胆道系统 原发性胆汁性肝硬化
肠 溃疡性结肠炎
动脉 动脉硬化症
唾液腺和泪腺 斯耶格伦(氏)综合征(Sjogren’s syndrome)
滑膜关节 风湿性关节炎
肌肉 多肌炎
肌肉和皮肤 皮肌炎
皮肤 硬皮病
皮肤、关节、肌肉、血细胞 混合性结缔组织病
凝固因子 抗磷脂病
皮肤 盘状红斑狼疮
皮肤、关节、肾、脑、血细胞 系统性红斑狼疮(SLE)
当前人自身免疫性疾病的治疗包括糖皮质激素、细胞毒性剂和最近开发的生物学疗法。通常，治疗人全身性自身免疫性疾病根据经验且不能令人满意。在多种严重的自身免疫性疾病和炎性疾病中主要采用诸如皮质类固醇的广谱免疫抑制药物。除皮质类固醇之外，在治疗全身性自身免疫性疾病中使用其他免疫抑制剂。环磷酰胺是引起T和B两种淋巴细胞完全耗尽及细胞介导的免疫损害的烷化剂。环孢霉素、他克莫司和吗替麦考吩酯是具有抑制T淋巴细胞的特异性质的天然产物，并且已用于治疗SLE、RA并在限定范围内用于治疗脉管炎和肌炎。这些药物伴有明显的肾脏毒性。甲氨蝶呤也作为“二线”试剂用于RA，目的为减缓疾病进展。它还用于多肌炎和其他结缔组织疾病。已尝试的其他方法包括意在阻断细胞因子作用或去除淋巴细胞的单克隆抗体。(Fox，Am.J.Med；99：82-881995)。多发性硬化(MS)的治疗包括干扰素β和共聚物1，它们降低复发率20-30％且仅适度影响疾病进展。MS的治疗还使用包括甲强龙、其他类固醇、甲氨蝶呤、克拉屈滨和环磷酰胺的免疫抑制剂。在治疗MS中这些免疫抑制剂具有最小效力。风湿性关节炎(RA)的当前疗法采用诸如甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羟化氯喹、路弗龙胺(leuflonamide)、强的松的非特异性抑制或调节免疫功能药剂，以及近来开发的TNFα拮抗剂依那西普和因福利美(Morelandet al，J Rheumatol 28，1431-52，2001)。依那西普和因福利美全面阻断TNFα，使患者更易死于败血症、慢性分枝杆菌感染的恶化和脱髓磷脂事件的发生。
在器官特异性自身免疫的情况下，已尝试过大量不同的治疗方法。全身性给药可溶性蛋白抗原以抑制随后对该抗原的免疫反应。这些疗法包括对患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的动物和患有多发硬化的人递送髓磷脂碱性蛋白、其显性肽或髓磷脂蛋白混合物(Brocke et al.，Nature 379，343-6，1996；Critchfield et al.，Science 263，1139-43.，1994；Weiner et al.，Annu Rev Immunol 12，809-37，1994)，对患有胶原蛋白诱导的关节炎的动物和患有风湿性关节炎的人给予II型胶原蛋白或胶原蛋白的混合物(Gumanovskaya et al.，Immunology 97，466-73.，1999)(McKown et al.，Arthritis Rheum 42，1204-8.，1999)(Trentham et al.，Science 261，1727-30.，1993)，对患有自身免疫性糖尿病的人和动物递送胰岛素(Pozzilli and Gisella Cavallo，Diabetes Metab Res Rev 16，306-7.，2000)，以及对患有自身免疫性葡萄膜炎的人和动物给予S-抗原(Nussenblatt et al.，Am J Ophthalmol 123，583-92.，1997)。与该方法相关的问题是全身性注射抗原诱导的T细胞无反应性。基于T细胞受体和结合到MHC分子上的肽之间的特异相互作用，另一种方法尝试设计用于全身性给药肽抗原的合理治疗策略。在糖尿病动物模型中使用肽方法的一项研究导致了该肽抗体产生的发生(Hurtenbach et al.，JExp.Med 177：1499，1993)。另一种方法是给予T细胞受体(TCR)肽免疫(参见例如，Vandenbark et al.，Nature 341：541，1989)。另有一种方法还通过摄入肽或蛋白抗原诱导口服免疫耐受(参见例如，Weiner，ImmmunolToday，18：335 1997)。
当前通过单独或与佐剂(免疫刺激剂)联合递送多肽来改变免疫反应。例如，乙型肝炎病毒疫苗包括作为佐剂的氢氧化铝配制的重组乙型肝炎病毒表面抗原(非自身抗原)。该疫苗诱导针对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫反应以抗感染。可选择方法涉及递送减毒的、复制缺陷的、和/或非病原体形式的病毒或细菌(各自为非自身抗原)引发针对该病原体的宿主保护性免疫反应。例如，口服脊髓灰质炎疫苗由活减毒病毒(非自身抗原)组成，在已接种的个体内该疫苗感染细胞并复制，从而诱导针对脊髓灰质炎病毒(外源或非自身抗原)的有效免疫，而不会引起临床疾病。作为选择，该失活脊髓灰质炎疫苗包括不能感染或复制的失活的或“被杀死的”病毒，皮下给药该疫苗以诱导针对脊髓灰质炎病毒的保护性免疫。
DNA疫苗接种/多核苷酸疗法
多核苷酸治疗或DNA疫苗接种是引发针对外源病原体(Davis，1997；Hassett and Whitton，1996；and Ulmer et al.，1996)和癌症抗原(Stevenson et al.，2004)的免疫以及调节自身免疫过程(Waisman et al.，1996)的有效方法。肌内注射之后，质粒DNA被例如肌细胞吸收，使得表达编码的多肽(Wolff et al.，1992)并对表达的蛋白具有持久的免疫反应(Hassett et al.，2000)。在自身免疫性疾病的情况下，效果为变换进行中的免疫反应以抑制自身免疫性破坏，并认为该效果包括将自身反应性淋巴细胞从Th1变换为Th2型反应。该免疫反应的调节不是全身性的，而是仅局部发生在自身免疫攻击的靶器官中。
编码自身蛋白、多肽或肽的多核苷酸的给药不同于“基因治疗”，该多核苷酸用沉淀促进剂和/或转染促进剂配制或使用病毒载体配制。基因治疗是递送多核苷酸以提供蛋白或肽的表达，从而替换宿主体内缺陷性或缺失蛋白或肽，和/或增大期望的生理功能。基因治疗包括出于治疗目的使得DNA整合到个体基因组的方法。基因治疗的实例包括递送DNA，所述DNA编码用于血友病的凝固因子、用于重症联合免疫缺陷的腺苷脱氨酶、用于家族性高胆固醇血症的低密度脂蛋白受体、用于葡萄糖脑苷脂沉积症(Gaucher’s disease)的葡糖脑苷脂酶、用于α1-抗胰蛋白酶缺陷的α1-抗胰蛋白酶、用于血红蛋白病的α-或β-球蛋白基因、以及用于囊肿性纤维化的氯化物通道(Verma and Somia，Nature 389，239-42，1997)。
研究者已描述了编码免疫分子以治疗自身免疫性疾病的DNA疗法。这些DNA疗法包括编码T细胞受体抗原结合区域的DNA改变驱动自身免疫反应的自身反应性T细胞的水平(Waisman et al.，Nat Med2：899-905，1996)(美国专利号5,939,400)。将编码自身抗原的DNA附着到颗粒上，并用基因枪递送至皮肤以预防多发性硬化和胶原蛋白诱导的关节炎(国际专利申请公开号WO 97/46253；Ramshaw et al.Immunol，and Cell Bio.75：409-413，1997)。编码粘附分子、细胞因子(例如，TNFα)、趋化因子(例如，C-C趋化因子)和其他免疫分子(例如，Fas-配体)的DNA已用于自身免疫性疾病的动物模型(Youssef et al.，J ClinInvest 106：361-371，2000)(Wildbaum et al：，J Clin Invest 106：671-679，2000)(Wildbaum et al，J Immunol 165：5860-5866，2000)(Wildbaum et al.，J Immunol 161：6368-7634，1998)(Youssef et al.，J Autoimmun 13：21-9，1999)。
国际申请公开号WO 00/53019、WO 2003/045316和WO2004/047734描述了通过给药编码一种或多种自身抗原的核酸治疗自身免疫性疾病的方法。尽管这些方法已获得成功，但是仍需要进一步的改进。
发明概述
本发明涉及治疗或预防个体疾病的方法和组合物，所述疾病与存在于该个体内且参与非生理状态的一种或多种自身蛋白、多肽或肽相关。更特别地，本发明涉及治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法和组合物，其包括用修饰的编码并能表达自身多肽的自身载体进行DNA疫苗接种，所述自身多肽包括与该疾病相关的一种或多种自身抗原的表位。向个体给予治疗或预防有效量的修饰的自身载体会引发与该自身免疫性疾病相关的自身抗原的免疫反应的抑制，由此治疗或预防该病。本发明首次提供了通过给予修饰的包括编码个体内存在的一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的自身载体治疗或预防自身免疫性疾病的手段和方法，相对于未修饰自身载体的表达，其使得自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达或增加或减少。优选实施方案是给予修饰的编码一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽的自身载体，其中对自身载体的修饰增加了该自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达，所述修饰包括，例如，提高下列的一种或多种：转录起始、转录终止、mRNA稳定性、翻译效率及蛋白稳定性。
本发明实现了用于治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法和组合物，其包括给药修饰的编码并能表达与该自身免疫性疾病相关的一种或多种自身多肽的自身载体。一方面，改变修饰的自身载体，使得相对于未修饰的载体增加宿主细胞内所述自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达。在另一个相互不排斥的方面，改变修饰的自身载体使得与所述自身疾病相关的胞外或分泌的自身抗原(例如，跨膜蛋白或分泌的可溶性因子)可作为胞内和非分泌多肽而被编码和表达。
在某些实施方案中，治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法包括对个体给予有效量的修饰的自身载体，所述自身载体经改造，使得相对于未修饰的编码同样自身蛋白、自身多肽或自身肽的自身载体增加了所编码的自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达。本文所称的修饰的自身载体指高表达的自身载体(HESV)。HESV包括编码并能表达与自身免疫性疾病相关的自身多肽的多核苷酸，并且相对于未修饰的同样的自身载体，HESV包括可产生所述自身多肽表达增加的修饰。HESV还包括可操作的组合：启动子；编码自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包括至少一种与所述自身免疫性疾病相关的自身抗原表位；转录终止子；及至少一种用于提高宿主细胞内所述自身蛋白表达的修饰，其中表达的提高是相对于包括所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体而言的。
提高与自身免疫性疾病相关的自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达的自身载体的修饰改变了自身载体的一种或多种组分，以提高下列的一种或多种：转录起始、转录终止、mRNA稳定性、翻译效率或蛋白稳定性。更具体地，为提高与自身免疫性疾病相关的自身多肽的表达而对自身载体进行的修饰选自：使用更强的启动子区域、添加增强子区域、使用更高效的转录终止序列、添加多聚腺苷酸化信号、使用更为理想的kozak共同序列、优化密码子使用、夹杂内含子或其它方法，或本领域普通技术人员公知的上述的组合。可以将两种或多种修饰整合进单个自身载体以产生HESV。在优选实施方案中，所述修饰是将内含子夹在启动子区域的下游和编码一种或多种自身多肽的多核苷酸的起始密码子的上游之间。更特别地，该优选内含子是人巨细胞病毒(CMV)的内含子A或β-球蛋白/Ig嵌合内含子，而最优选的内含子是β-球蛋白/Ig嵌合内含子。
在一些实施方案中，相对于未修饰的编码同样自身蛋白、自身多肽或自身肽的自身载体，产生的HESV表达增加量的与自身免疫性疾病相关的自身蛋白、自身多肽或自身肽，所述自身免疫性疾病例如胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)或风湿性关节炎(RA)。就IDDM而言，相对于未修饰自身载体，产生的HESV表达增加量的自身多肽前胰岛素原。在优选实施方案中，HESV包括该自身多肽前胰岛素原起始密码子的5’β-球蛋白/Ig嵌合内含子。在其他实施方案中，相对于未修饰的编码同样自身多肽的自身载体，产生的HESV表达增加量的与该自身免疫性疾病多发性硬化(MS)相关的自身多肽。更特别地，相对于所述未修饰的自身载体，产生的HESV表达增加量的自身多肽髓磷脂碱性蛋白(MBP)。在优选实施方案中，HESV包含该自身多肽MBP起始密码子的5’β-球蛋白/Ig嵌合内含子。
在相互不排斥的实施方案中，治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法包括给予个体有效量的修饰的自身载体，所述自身载体经改造后包含多核苷酸，该多核苷酸编码与所述疾病相关的胞外或分泌的自身抗原的胞内或非分泌自身蛋白、自身多肽或自身肽形式。本文所称不分泌自身蛋白、自身多肽或自身肽的修饰后的自身载体指非分泌的自身载体(N-SSV)，该自身蛋白、自身多肽或自身肽与胞外或分泌的自身抗原相关。N-SSV包括编码并能表达与自身免疫性疾病相关的分泌的自身多肽的多核苷酸，以及可阻止宿主细胞分泌该自身多肽的修饰。N-SSV还包括可操作的组合：启动子；编码胞外或分泌的自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包括至少一种与该自身免疫性疾病相关的自身抗原表位；转录终止子；及至少一种用于阻止宿主细胞分泌该自身多肽的修饰，其中阻止分泌是相对于包括所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体而言的。在优选的实施方案中，N-SSV编码的分泌的自身多肽的非分泌形式缺少信号序列。在某些实施方案中，该N-SSV编码与自身免疫性疾病胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)相关的自身多肽的非分泌形式。更特别地，所述N-SSV编码前胰岛素原、胰岛素原(例如，SEQ ID NO：2)的非分泌形式，所述非分泌形式缺少信号序列。
在相互不排斥的其他实施方案中，治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法包括向个体给予有效量的修饰的自身载体，所述自身载体经改造后包含多核苷酸，该多核苷酸编码与该疾病相关的膜结合或胞内自身抗原的分泌的或非膜结合的自身蛋白、自身多肽或自身肽形式。本文所称表达分泌的或非膜结合的自身蛋白、自身多肽、自身肽的修饰后的自身载体指分泌的自身载体(SSV)，该自身蛋白、自身多肽、自身肽与膜结合或胞内自身抗原相关。SSV包括编码并能表达与自身免疫性疾病相关的膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸，以及使宿主细胞表达该分泌的或非膜结合自身多肽的修饰。SSV还包括可操作的组合：启动子；编码膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包含至少一种与该自身免疫性疾病相关的自身抗原表位；转录终止子；以及至少一种用于从宿主细胞表达分泌的或非膜结合自身多肽的修饰，所述表达是相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体而言的。在某些实施方案中该SSV编码与诸如如多发性硬化(MS)的自身免疫抑制疾病相关的胞内自身多肽的分泌或非膜结合形式。更特别地，该SSV编码包含N-端信号序列的MBP。在其他优选实施方案中，该SSV编码与MS相关的跨膜自身多肽的分泌形式。更特别地，该SSV编码缺失跨膜和胞内结构域的MOG的胞外结构域。
本发明提供了治疗或预防诸如多发性硬化、风湿性关节炎、胰岛素依赖的糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、斯耶格伦(氏)综合征、寻常天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)及格雷夫斯病(Grave’s disease)的自身免疫性疾病的方法和组合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防自身免疫性疾病胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的改良方法，包括向个体给予编码并能表达包括与IDDM相关的一种或多种自身抗原表位的自身多肽的HESV。在某些实施方案中，HESV是通过下列修饰的一种或多种产生的：使用更强的启动子区域、添加增强子区域、使用更高效的转录终止序列、添加多聚腺苷酸化信号、使用更为理想的kozak共同序列、优化密码子使用、夹杂内含子或两种或多种前述修饰的组合。在优选实施方案中，为治疗或预防IDDM而给药的HESV是通过将内含子夹在启动子区域的下游和与IDDM相关的自身蛋白起始密码子的上游之间而产生。优选内含子包括β-球蛋白/Ig嵌合内含子或人巨细胞病毒(CMV)的内含子A。在一些实施方案中，与IDDM相关的自身多肽选自：前胰岛素原、谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和谷氨酸脱羧酶(GAD)-67；酪氨酸磷酸酶IA-2；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶相关蛋白(IGRP)和胰岛细胞抗原69kD。在最优选的实施方案中，为治疗或预防IDDM而给药的HESV包含位于编码自身多肽前胰岛素原的多核苷酸上游的β-球蛋白/Ig嵌合内含子。在本发明的其他实施方案中，提供了用于治疗或预防多发性硬化(MS)的改良方法，其包括向个体给予编码并能表达自身多肽的HESV，所述自身多肽包括一种或多种与MS相关的自身抗原表位。在某些实施方案中，HESV编码的自身多肽选自髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关的少突细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)及髓磷脂相关糖蛋白(MAG)。编码不同自身多肽的多种HESV可以鸡尾酒方式给药，并且每一种单独的HESV可能编码多种自身多肽。在优选实施方案中，为治疗或预防MS而给药的HESV包含位于编码自身多肽MBP的多核苷酸起始密码子上游的内含子A。
在相互不排斥的其他实施方案中，本发明提供了治疗或预防诸如IDDM的自身免疫性疾病的改良方法，其包括向个体给予编码并能表达自身多肽的N-SSV，该自身多肽包含与IDDM相关的一种或多种自身抗原表位。在某些实施方案中，N-SSV编码的自身多肽选自前胰岛素原、胰岛素原(例如，SEQ ID NO：2)、胰岛素和胰岛素B链。在优选实施方案中，为治疗或预防IDDM而给药的N-SSV编码前胰岛素原(例如，胰岛素原，SEQ ID NO：2)的非分泌形式，其中除去了前胰岛素原的信号序列。在其他实施方案中，提供了治疗或预防风湿性关节炎(RA)的改良方法，包括向个体给予编码并能表达自身多肽的N-SSV，该自身多肽包含与RA相关的一种或多种自身抗原表位。在某些实施方案中，N-SSV编码的自身多肽选自II型胶原蛋白、IV型胶原蛋白和纤维蛋白。在优选实施方案中，该N-SSV编码II型胶原蛋白的非分泌形式，其中去除了II型胶原蛋白的信号序列。
在某些变化中，治疗或预防自身免疫性疾病的方法和组合物还包括将所述修饰的自身载体与其他物质联合给药，所述其他物质例如，包含免疫调节序列的多核苷酸、药理学试剂、佐剂、细胞因子或编码细胞因子的载体。在本发明一个特定实施方案中，自身载体的递送与免疫调节序列的共给药相结合，所述免疫调节序列选自5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’以及5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’，其中X和Y为任何天然存在或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。在另一实施方案中，经修饰的自身载体的递送与编码Th2细胞因子的表达载体的共给药相结合，所述Th2细胞因子选自IL-4、IL-10和IL-13。
定义
除另已定义之外，本文使用的所有科技术语均与本发明所属技术领域的普通技术人员的通常理解具有相同含义。下列参考文献向技术人员提供了本文使用的许多术语的一般定义：Hale and Margham，TheHarper Collins Dictionary of Biology(Harper Collins生物学宇典)(HarperPerennial，1991)；King and Stansfield，A Dictionary of Genetics(遗传学宇典)(Oxford University Press，4th ed.1990)；Stedman＇s MedicalDictionary(Stedman＇s医学字典)(Lippincott Williams & Wilkins，27th ed.2000)；及Hawley＇sCondensed Chemical Dictionary(Hawley＇s简明化学宇典)(John Wiley & Sons，13th ed.1997)。本文使用的下列术语和短语具有其本身的意义，除非另已作说明。
术语“a”、“an”、“the”包括复数所指物，除非上下文另已清楚指明。
术语“多核苷酸”和“核酸”指多重的由磷酸二酯键连接的核苷酸单位(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或相关的结构上的变体)组成的聚合物。多核苷酸或核酸基本上可以是任意长度，通常从约六(6)个核苷酸到约109个核苷酸或更大。多核苷酸和核酸包括RNA、DNA、合成形式和混合的聚合物、有义链和反义链、双链或单链，也可以是化学或生物学修饰的或者能包含非天然或衍生的核苷酸碱基，所述技术人员会容易认同这一点。这些修饰包括：例如，标记；甲基化；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；诸如不带电连接(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧基部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂、和修饰的连接(例如，α异头核酸等)的核苷酸间的修饰。还包括在通过氢键和其他化学相互作用结合指定序列的这一能力上模拟多核苷酸的合成分子。这些分子为本领域已知，包括，例如，在分子骨架上肽键取代磷酸键的那些分子。
本文使用的术语“内含子”或“内含序列”指自身载体上存在的基因或者部分基因内的间隔多核苷酸序列，其位于“外显子”的上游或者夹在其中，“外显子”即RNA加工时保留的并最常编码多肽的多核苷酸序列。内含子在编码蛋白合成时不行使功能，并且在RNA被翻译成多肽之前，会从RNA上剪接内含子。
“剪接”指原始转录本或前体RNA加工期间，去除内含子并连接相邻外显子，从而产生单个功能性RNA分子的机制。内含子-外显子结合处存在共有序列，其定义了内含子的5’端或供体位点，以及3’端或受体位点，同时它存在于位于内含子序列内的受体位点上游约20-50碱基对处的支化点。大多数内含子始于序列GU并终于序列AG(按5’到3’方向)，具有近似于CU(A/G)A(C/U)的支化位点，其中A在所有基因中都是保守的。这些序列作为内含子出环及随后移除它的信号。
本文使用的术语“启动子”指为起始RNA合成或“转录”而由RNA聚合酶识别的多核苷酸区域。启动子是自身载体的功能性元件之一，它调控转录效率并且因而调控自身载体编码的自身多肽的蛋白表达水平。启动子可以是“组成型的”，从而允许相关基因的持续转录，或者是“诱导型的”，并且因此受环境中不同物质的存在或缺失而调控。另外，启动子还可以是普遍的，用于广泛的不同细胞类型的表达，或者具有细胞类型特异性，并且因此只能在诸如肌肉细胞的特定细胞类型中活化或诱导。控制从载体转录的启动子可能从各种来源中获得，例如，诸如多瘤病毒、猿病毒40(SV40)、腺病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒以及优选的巨细胞病毒的病毒基因组，或者获得自异源哺乳动物启动子，例如b-肌动蛋白启动子。所述SV40病毒的早期和晚期启动子象人巨细胞病毒的即时早期启动子一样可方便地获得。
“增强子”指长约10-300个碱基对的顺式作用多核苷酸区域，它作用于启动子以增强该启动子的转录。增强子的方向和位置相对独立，并且可置于转录单位的5’或3’端、内含子内部或者该编码序列本身内。
本文使用的“终止序列”指向RNA聚合酶发出DNA转录终止信号的多核苷酸序列。终止序列产生RNA3’端，在其明显上游处通常会在随后通过多聚腺苷化而加工。使用的“多聚腺苷化”指向经转录的信使RNA的3’端非模板地添加约50-200个多聚腺苷酸(polyA)的核苷酸链。已在mRNA的3’非翻译区内(UTR)发现了“多聚腺苷化信号”(AAUAAA)，并且该信号指定了转录本的切割位点及polyA尾巴的添加位点。转录终止和多聚腺苷化在功能上相联系，同时有效切割/多聚腺苷化所需的序列还构成了终止序列的重要元件(Connelly and Manley，1988)。
本文使用的“寡核苷酸”指长约6-175或更多个核苷酸的多核苷酸的子集。典型的寡核苷酸长达约100个核苷酸。寡核苷酸指寡聚核糖核苷酸和寡聚脱氧核糖核苷酸两者，后者在下文中称作ODN。ODN包括寡核苷酸和其他含有聚合物的有机碱。寡核苷酸可获得自现存的核酸来源，包括基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA和cDNA，但通常是寡核苷酸合成产生的合成寡核苷酸。寡核苷酸可以在寡核苷酸自动合成仪(例如，由Applid BioSystems(Foster City，Calif.)制造的合成仪)上按照厂家提供的说明书合成。
本文可替代的使用术语“DNA疫苗接种”、“DNA免疫”和“多核苷酸疗法”，它们指以调节免疫反应为目的，对个体给予多核苷酸。使用表达外源微生物抗原的质粒的“DNA疫苗接种”是引发保护性抗病毒或抗细菌免疫的公知方法(Davis，1997；Hassett and Whitton，1996；and Ulmer et al.，1996)。“DNA疫苗接种”、“DNA免疫”或“多核苷酸疗法”指为本发明的目的而给予编码一种或多种自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包括与疾病相关的一种或多种自身抗原表位。“DNA疫苗接种”的目的在于调节进行中的免疫反应以抑制自身免疫性破坏，用于治疗或预防自身免疫性疾病。对“DNA疫苗接种”做出反应的免疫反应调节可能包括将自身反应性淋巴细胞从Th1型转换为Th2型反应。对该免疫反应的调节可能全身发生或仅仅局部发生于遭受自身免疫性攻击的靶器官。
“自身载体”指一种或多种载体，其总和包括编码一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸。将该自身蛋白、自身多肽或自身肽编码序列插入到适合的表达载体。一旦编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸插入到所述表达载体，便将该载体称作“自身载体”。在给予编码不止一种自身多肽的多核苷酸的情况下，单一自身载体可能编码多种自身多肽，或者可选择地，每一自身多肽可能在单独的DNA表达载体上编码。单一自身载体内包含的多种自身多肽可能以允许其表达的任何方式排列，例如，通过使用内部核糖体进入序列(IRES)或者设计融合蛋白。
“修饰的自身载体”指经修饰以改造自身蛋白、自身多肽或自身肽表达的自身载体。相对于未修饰的自身载体，对所述自身蛋白、自身多肽或自身肽表达的改造可能是提高或降低所述自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达。可选择地，修饰的自身载体包括对编码序列的修饰，以将分泌的或膜结合自身蛋白、自身多肽或自身肽变为非分泌的或非膜结合自身蛋白、自身多肽或自身肽。修饰的自身载体还包括为提高自身蛋白、自身多肽或自身肽表达而进行的改造，其与为将分泌的或膜结合自身蛋白、自身多肽或自身肽变为非分泌的或非膜结合自身蛋白、自身多肽或自身肽而进行的修饰联合。向个体给予修饰的自身载体以调节免疫反应。
本文的“高表达自身载体”或“HESV”指相对于未修饰的编码同样的自身蛋白、自身多肽或自身肽的自身载体，改造后提高了编码的自身蛋白、自身多肽或自身肽表达的修饰的自身载体。HESV包括编码并能表达与自身免疫性疾病相关的自身多肽的多核苷酸，以及相对于未修饰的同样的自身载体，产生所述自身多肽表达增加的修饰。HESV还包含可操作的组合：启动子；编码自身多肽的多核苷酸，该自身多肽包含与所述自身免疫性疾病相关的至少一种自身抗原表位；转录终止子；以及为在宿主细胞内表达增加量的该自身多肽而进行的至少一种修饰，其中表达量的提高相对于未修饰的包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的自身载体。为产生自身多肽表达量提高的HESV而对自身载体进行的修饰选自提高如下的改造：转录起始、转录终止、mRNA稳定性、翻译效率和/或蛋白稳定性。更具体地，为提高自身多肽表达而对自身载体进行的修饰选自：使用更强的启动子区域、添加增强子区域、使用更为有效的转录终止子序列、添加多聚腺苷化信号、使用更为理想的kozak共同序列、优化密码子使用、夹入内含子或者前述修饰的组合。可以将单一或多种修饰引入自身载体以产生HESV。
“非分泌的自身载体”或“N-SSV”在本文指修饰的包含多核苷酸的自身载体，所述多核苷酸编码与疾病相关的胞外或分泌的自身抗原(例如，跨膜蛋白或分泌的可溶性因子)的胞内或非分泌自身多肽形式。N-SSV包含编码并能够表达与自身免疫性疾病相关的分泌的自身多肽的多核苷酸，以及为从宿主细胞表达非分泌的或非膜结合自身多肽而进行的修饰。N-SSV还包括可操作的组合：启动子；编码胞外或分泌的自身多肽的多核苷酸，该自身多肽包含与所述自身免疫性疾病相关的至少一种自身抗原表位；转录终止子；以及至少一种修饰，所述修饰相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体，阻止宿主细胞分泌该自身多肽。为产生编码并表达分泌的或膜结合自身多肽的非分泌的或非膜结合形式的N-SSV而对自身载体进行的修饰包括但不限于去除信号序列、突变信号序列以及添加可选择的蛋白定位(ER滞留、原生质膜附着，等等)、蛋白降解信号或修饰或删除该自身多肽的跨膜结构域或疏水区域。
“非分泌的高表达自身载体”或“N-SHESV”指修饰的自身载体，所述载体经改造以提高胞外或分泌的自身多肽的经编码的胞内或非分泌形式的表达或膜结合自身多肽的非膜结合形式的表达，其中表达和分泌是相对于未经修饰的自身载体的。N-SHESV包含编码并能表达与自身免疫性疾病相关的分泌的或膜结合自身多肽的多核苷酸，以及相对于未经修饰的自身载体，表达增加量的非分泌的或非膜结合形式的所述自身多肽而进行的修饰。N-SHESV还包括可操作的组合：启动子；编码胞外或分泌的自身多肽的多核苷酸，所述胞外或分泌的自身多肽包含与所述自身免疫性疾病相关的至少一种自身抗原表位的；转录终止子；以及为提高所述自身多肽表达而进行的至少一种修饰和为从宿主细胞表达所述非分泌的或非膜结合的自身多肽而进行的至少一种修饰，其中两类修饰都是相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体而言。
本文的“分泌的自身载体”或“SSV”指经修饰的自身载体，所述载体包含编码与疾病相关的膜结合或胞内自身抗原的分泌的自身多肽形式的多核苷酸。SSV包含编码并能表达与自身免疫性疾病相关的膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸，以及为使宿主细胞能分泌所述自身多肽而进行的修饰。SSV还包括可操作的组合：启动子；编码包含与所述自身免疫性疾病相关的至少一种自身抗原表位的膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸；转录终止子；以及相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体，为使宿主细胞能分泌所述自身多肽而进行的至少一种修饰。为产生编码并表达胞内自身多肽的分泌形式的SSV而对自身载体进行修饰包括，但不限于，添加信号序列。另外，所述修饰还可以包括膜结合信号，其包含，例如，跨膜结构域或GPI锚定，从而胞内表位可存在于胞外。为产生编码并表达膜结合自身多肽的分泌形式的SSV而对自身载体进行的修饰包括但不限于：除去跨膜结构域；除去GPI键，除去胞外和跨膜结构域并对胞内结构域添加信号序列；除去跨膜和胞内结构域。
本文的“分泌的高表达自身载体”或“SHESV”指经修饰的自身载体，所述载体经改造能提高膜结合或胞内自身多肽的经编码的分泌形式的表达，其中表达和分泌相对于未经修饰的自身载体。SHESV包含编码并能表达与自身免疫性疾病相关的膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸，以及相对于未经修饰的同样的自身载体，表达增加量的分泌的或胞外膜结合形式的所述自身多肽而进行的修饰。SHESV还包含可操作的组合：启动子；编码包含与所述自身免疫性疾病相关的至少一种自身抗原表位的膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸；转录终止子；以及为提高所述自身多肽表达而进行的至少一种修饰和为使宿主细胞分泌所述自身多肽而进行的至少一种修饰，其中两类修饰都是相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体而言的。
“质粒”和“载体”以小写p及其后的字母和/或数字命名。所述起始质粒可从商业渠道获得、非限制地向公众开放，或者可以根据公开的程序用可获得的质粒构建。此外，与描述质粒等同的质粒为本领域已知，并且对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。“载体”或“质粒”指通过包括适当的控制和调节元件存在于宿主细胞时能进行复制的任何遗传成分。为达到本发明的目的，载体或质粒的实例包括，但不限于，质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒等。
“转染”指将DNA导入宿主细胞从而使DNA表达，不管是否是功能性的表达；所述DNA还可能作为染色体外元件复制或者通过染色体整合而复制。转染可由本领域内可适于将胞外核酸导入宿主细胞的任何已知方法来完成，包括但不限于，使用转染促进试剂或诸如磷酸钙共沉淀、病毒转导、原生质融合、DEAE-葡聚糖介导的转染、凝聚胺介导的转染、脂质体融合、显微注射、微粒轰击或电穿孔的方法。在优选实施方案中，用钙配制关注的核酸以注射进动物，使动物宿主细胞吸收。在优选实施方案中，用浓度约0.05mM到约2M的钙配制待转染的核酸；在更为优选的实施方案中，所述钙浓度为约0.9mM(1x)到约8.1mM(9x)；在最优实施方案中，所述钙浓度为约0.9mM(1x)到约5.4mM(6x)。
本文使用的“抗原”指能被通过B细胞或T细胞或两者的免疫系统识别的任何分子。
本文使用的“自身抗原”指内源分子，通常为蛋白或其片段，其会诱导致病性免疫反应。将所述自身抗原或其表位称作“与自身免疫性疾病相关”时，理解为是指所述抗原或表位参与了该疾病的病理生理，其通过诱导病理生理(即与该疾病的病因相关)、调节或促进病理生理过程；和/或通过成为病病理生理过程的靶点。例如，在自身免疫性疾病中，所述免疫系统异常地以自身抗原为靶点，造成表达和/或存在所述自身抗原的细胞和组织的损伤和机能障碍。在正常生理情况下，宿主免疫系统会通过命名为“免疫耐受”的方法清除、灭活、或失活具有识别所述自身抗原能力的免疫细胞来忽略自身抗原。
本文使用的术语“表位”应理解为具有被动物免疫系统B细胞或T细胞识别的特定形状或结构的多肽的一部分。“自身抗原表位”或“致病性表位”指引发致病性免疫反应的自身抗原的表位。
本文可替代使用的“多肽”、“肽”和“蛋白”指氨基酸残基的聚合物。所述术语用于如下氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸残基是对应天然存在氨基酸的人工化学模拟，它们还用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
本文可替换地使用的“自身蛋白”、“自身多肽”或“自身肽”指满足下列的任何蛋白、多肽或肽或其片段或衍生物：在动物基因组内编码；在该动物内产生或生成；可以在该动物生命过程的某一时间进行翻译后修饰；并且，非生理的存在于该动物内。术语“非生理的”或“非生理地”用于描述本发明所述自身蛋白、自身多肽或自身肽时，指对所述自身蛋白、自身多肽或自身肽在动物体内的正常作用或过程的脱离或偏差。把所述自身蛋白、自身多肽或自身肽称作“疾病相关的”或“疾病涉及的”时，应理解为所述自身蛋白、自身多肽或自身肽可在形式上或结构上被修饰，并且因而不能发挥其生理作用或参与生理过程，或者可以参与所述状况或疾病的病理生理，所述参与是通过引发病理生理；介导或促进病理生理过程；和/或通过成为病理生理过程的靶点而进行的。例如，在自身免疫性疾病中，免疫系统异常攻击自身蛋白，造成表达和/或存在该自身蛋白的细胞和组织的损伤和机能障碍。可选择地，所述自身蛋白、自身多肽或自身肽本身可在非生理的水平下表达和/或非生理地发挥作用。例如在神经退化疾病中，自身蛋白被异常表达，并且在脑内以损伤形式聚集，从而造成神经机能障碍。在其他情况下，该自身蛋白会加重不希望的状况或过程。例如在骨关节炎中，包含胶原酶和基质金属蛋白酶的自身蛋白会异常地降解覆盖于关节的关节面的软骨。自身蛋白、自身多肽或自身肽的翻译后修饰的实例是糖基化、添加脂质基团、可逆的磷酸化、添加二甲基精氨酸残基、瓜氨酸化和蛋白水解，以及更具体地，通过肽基精氨酸脱亚氨酸酶(PAD)将微丝聚集蛋白和纤维蛋白瓜氨酸化、αβ-晶体蛋白(crystalin)的磷酸化、MBP的瓜氨酸化，以及caspase(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)和颗粒酶(granzyme)作用的SLE自身抗原蛋白水解。在免疫学上，认为自身蛋白、自身多肽或自身肽都是宿主自身抗原，并且在正常生理情况下，宿主免疫系统会通过命名为“免疫耐受”的过程清除、灭活、或失活具有识别所述自身抗原能力的免疫细胞来忽略自身蛋白、自身多肽或自身肽。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括如下免疫蛋白、多肽或肽：出于调节免疫功能的目的专门由免疫系统的细胞生理上表达的分子。免疫系统是防御机制，该防御机制提供的手段可对居住在动物界的无数的潜在致病微生物进行快速、高度特异且是保护性的反应。免疫蛋白、多肽或肽的实例是蛋白，所述蛋白包括T细胞受体、免疫球蛋白、包括I型白细胞介素细胞因子、和包括干扰素与IL-10的II型细胞因子、TNF、淋巴毒素、和诸如巨噬细胞炎性蛋白-1α和β、单核细胞-趋化性蛋白和RANTES的趋化因子、以及诸如Fas-配体的直接参与免疫功能的其他分子)。本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽包括某些免疫蛋白、多肽或肽，它们是：I类MHC膜糖蛋白、II类MHC糖蛋白和骨桥蛋白。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括如下蛋白、多肽和肽：由于造成代谢或功能失调的遗传性或获得性缺陷个体完全或基本上缺失的，并通过给予所述蛋白、多肽或肽或者通过给予编码所述蛋白、多肽或肽的多核苷酸(基因治疗)替代的蛋白、多肽和肽。这些失调的实例包括杜兴(氏)(Duchenne)肌营养不良、贝克尔(氏)(Becker)肌营养不良、囊肿性纤维化、苯丙酮酸尿症、半乳糖血症、槭糖尿病以及高胱氨酸尿。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括细胞特异且专门表达的蛋白、多肽和肽，所述细胞具有可将它们与正常细胞明显区分的特性，其包括：(1)克隆性，它代表遗传改造后的单一细胞的增殖，从而形成恶性细胞克隆，(2)自律性，它表示对生长的不适当调控，以及(3)退变性，或正常协同细胞分化的缺乏。具有前述三条标准之一条或多条的细胞称作肿瘤细胞、癌细胞或恶性细胞。
本文使用的“的调节”、“调节”或者“改变免疫反应”指对针对自身分子的现存的或潜在的免疫反应的任何改变，所述自身分子包括，例如，核酸、脂质、磷脂、碳水化合物、自身多肽、蛋白复合体或核蛋白复合体，所述改变是给予编码自身多肽的多核苷酸后的结果。所述调节包括对任何免疫细胞的存在、能力或功能的改造，所述免疫细胞参与或能够参与免疫反应。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、NK T细胞、专职抗原呈递细胞、非专职抗原呈递细胞、炎性细胞或能够参与或影响免疫反应的任何其他细胞。“调节”包括对现存免疫反应、正在发展的免疫反应、潜在的免疫反应造成的任何变化，或引发、调控、影响或反应免疫反应的能力。调节包括对作为免疫反应一部分的免疫细胞内基因、蛋白和/或其他分子的表达和/或功能的改变。
“免疫反应的调节”包括，例如，如下：免疫细胞的清除、删除或隔离；免疫细胞的诱导或产生，所述免疫细胞能调节诸如自身反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞(APC)或炎性细胞的其他细胞的功能性能力；免疫细胞无反应状态的引发(即无反应性)；免疫细胞活性或功能的提高、降低或改变或者这样的能力，包括但不限于所述细胞表达的蛋白类型的改变。实例包括某些种类的分子的经改造的生产和/或分泌，所述分子例如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、协同刺激分子或其他细胞表面受体；或者所述调节性事件的任意组合。
例如，编码自身多肽的多核苷酸能调节免疫反应，其通过清除、隔离或着灭活调节或能够调节不希望免疫反应的免疫细胞；诱导、产生或开启调节或能够调节保护性免疫反应的免疫细胞；改变免疫细胞的生理性或功能性性质；或这些效果的组合。测量免疫反应的调节的实例包含，但不限于，检验免疫细胞群的存在与否(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微术、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞功能性能力，其包括在反应信号时增殖或分裂的能力或抵抗力(例如使用基于3H-胸苷掺入跟踪刺激(3H-thymidine incorporationfollowing stimulation)的T细胞增殖试验和肽扫描分析，其使用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、PMA、装有肽或蛋白抗原的抗原呈递细胞；B细胞增殖试验)；测量杀死或裂解其他细胞的能力(例如细胞毒性T细胞试验)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验、蛋白印记分析、蛋白微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞活化生化标志物或免疫细胞内的信号通路(例如，对酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽酶切和蛋白复合体形成或解离的蛋白印记和免疫沉淀分析；蛋白阵列分析；使用DNA阵列或差减杂交的DNA转录图谱)；测量凋亡、坏死或其他机制导致的细胞死亡(例如，测量DNA梯状条带、组织学的微管连接蛋白V染色、TUNEL试验、凝胶电泳；荧光caspase试验，caspase底物的蛋白印记分析)；测量免疫细胞产生的基因、蛋白和其他分子(例如，Northern印记分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白微阵列、双向凝胶电泳、蛋白印记分析、酶联免疫吸附试验、流式细胞术)；测量临床症状或后果，例如对自身免疫性疾病、神经退化性疾病、和涉及自身蛋白或自身多肽的其他疾病的改善(临床评分、使用附加疗法的要求、功能性状态、图像研究)例如，通过在多发性硬化中测量复发率或疾病严重程度(使用本领域普通技术人员公知的临床评分)，在I型糖尿病中测量血糖，或在风湿性关节炎中测量关节炎症。
本文使用的“免疫调节序列(IMS)”指由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物组成的化合物，所述化合物调节自身免疫性和/或炎性反应。IMS通常是整合进载体的寡核苷酸或核苷酸序列(例如，单链或双链DNA、RNA和/或寡核苷)。
“个体”指任何动物，例如，人、非人灵长类、马、母牛、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。
疾病或病症的“治疗”、“治疗方法”或“疗法”指减慢、停止或逆转所述疾病的进展，其证据为减少、停止或去除了临床上或诊断上的症状，这是通过单独或与本文所述的另外的化合物联合给予编码自身多肽的多核苷酸来完成的。“治疗”、“治疗方法”或“疗法”还指降低了急性或慢性疾病或病症的症状的严重性，或者降低了例如在复发或缓减中的自身免疫性疾病进展中的复发率，或者降低了自身免疫性疾病在炎性方面的炎性。在优选实施方案中，治疗疾病指逆转或停止或缓和所述疾病的进展，理想地情况是达到去除疾病本身。本文使用的改善疾病和治疗疾病是等同的。
本发明上下文使用的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”、或“预防(prevention)”疾病或病症指单独或与本文所述的另外的化合物联合给予编码自身多肽的多核苷酸，以预防疾病或病症，或着疾病或病症的一些或全部症状的出现或发作，或者以减小疾病或病症发作的可能性。
自身载体的“治疗或预防有效量”指该足以治疗或预防该疾病的自身载体量，例如，通过改善或去除该疾病的症状和/或病因。例如，治疗有效量落在广泛的范围内，并且由临床试验所决定，同时对每一位特殊的病人而言，其由有经验的临床医师公知的因素决定，包括，例如，疾病的严重性、患者体重、年龄和其他因素。
附图概述
图1：使用编码前胰岛素原II的自身载体进行DNA疫苗接种治疗建 立的高血糖。治疗0周时高血糖发作(190-250mg/dl)后每两周一次使用肌内DNA疫苗治疗雌性NOD小鼠。向每只动物给予50μg的每种DNA质粒。给予的DNA包含编码鼠前胰岛素原I(ppINS-I)、鼠前胰岛素原II(ppINS-II)或非编码载体的疫苗，如图所示。糖尿病进展定义为每周监控下两次连续的大于250mg/dl的血糖测量。测量葡萄糖的时间在x轴上表示，同时确定为糖尿病的小鼠的百分比在y轴上表示。
图2：DNA疫苗接种作用和抗胰岛素自身抗体效价的相互关系。图1在完成本研究之后获得所述的本研究涉及的动物血清。用放射性免疫分析测量抗胰岛素自身抗体效价。单一的点代表单个小鼠的胰岛素自身抗体指数。水平条代表该组内全部小鼠的平均值。
图3：使用编码前胰岛素原II的自身载体进行DNA疫苗接种对随后 的免疫反应的影响。对6周大的雌性NOD小鼠每两周共3次肌肉内注射DNA疫苗mINS-II-pBHT1。向每只动物每次注射给予50μg的每种DNA质粒。在最后一次DNA注射后两周，用胰岛素II9-23肽免疫接种DNA的动物和对照动物。免疫十天后，通过ELISpot测定淋巴结细胞数量，该淋巴结细胞对INF-γ分泌的胰岛素II9-23的再刺激产生反应。已示出每一经治疗的或对照动物的IFN-γ分泌细胞的数量。
图4：编码胰岛素原的高表达自身载体的胰岛素表达的提高。将用胰岛素表达质粒mINS-II-pBHT1(pBHT500)和mINS-II-HESV(pBHT561)转染的HEK293孵育24小时，并用ELISA分析该上清液中胰岛素蛋白水平。图表已示出在两种胰岛素表达载体的上清液内检测到的蛋白量(ng/mL)。
图5：使用DNA疫苗接种治疗已建立的高血糖，所述疫苗接种使用编 码胰岛素II的经修饰的自身载体。治疗0周时高血糖发作(190-250mg/dl)后每周一次使用肌内DNA疫苗治疗雌性NOD小鼠(每组n＝10)。。向每只动物给予50μg的每种DNA质粒。给予的DNA疫苗包括pBHT1空载体、mINS-II-pBHT1、mINS-II-HESV或者mINS-II-N-SSV。连续5天通过静脉注射以5μg/动物给予抗CD3。每周监控动物IDDM的发作，并且第一次连续2周血糖水平超过250mg/dl时，即认为患上糖尿病。已示出随时间推移患上糖尿病的动物的百分比。使用GraphPad Prism生成KM印记。使用Prism完成LogRank测试，以测定统计学显著性。
图6：非分泌的自身载体表达的胰岛素原位于胞内。A)将用胰岛素表达质粒mINS-II-pBHT1(pBHT500)、mINS-II-N-SSV(pBHT555)和mINS-II-N-SHESV(pBHT568)转染的HEK293孵育48小时，用ELISA分析该上清液和细胞裂解物中的胰岛素蛋白水平。已示出在每种胰岛素表达载体的上清液和细胞裂解物内检测到的蛋白量。B)可选择地，在普通培养基中将转染后的细胞孵育24小时，随后在存在蛋白酶体抑制剂乳胞素(lactacystin)的情况下，孵育24小时。用ELISA测量48小时处的胰岛素蛋白水平。已示出在每种胰岛素表达载体的上清液和细胞裂解物内检测到的蛋白量。
图7：使用经修饰的自身载体治疗糖尿病时，每周一次与每两周一次 给药DNA疫苗的比较。用每周一次(A，B)或每两周一次(C，D)肌肉内注射mINS-II-HESV(A，C)和mINS-N-SSV(B，D)DNA疫苗治疗10周大的雌性NOD小鼠(每组n＝20)。向每只动物给予50μg的每种DNA质粒。每周监控动物糖尿病的发作，并且在第一次连续2周血糖水平超过250mg/dl时，即认为患上糖尿病。已示出随时间推移相对于载体对照患上糖尿病的动物的百分比。使用GraphPad Prism生成KM印记。
图8：使用编码小鼠胰岛素原II的非分泌的高表达自身载体(N-SHESV) 进行DNA疫苗接种治疗已建立的高血糖。治疗0周时高血糖发作(190-250mg/dl)后每周一次(QW)、每两周一次(Q2W)或每四周一次(Q4W)用肌内DNA疫苗治疗雌性NOD小鼠(每组n＝15)。向每只动物给予50μg的每一种DNA质粒。给予的DNA疫苗包含mINS-II-N-SSV和mINS-II-N-SHESV。连续5天通过静脉注射以5μg/动物给予抗CD3。每周监控动物IDDM的发作，并且在第一次连续2周血糖水平超过250mg/dl时，即认为患上糖尿病。已示出随时间推移，使用mINS-II-N-SSV(A)与使用mINS-II-N-SHESV治疗时，糖尿病动物的百分比的比较。
图9：使用非分泌的自身载体(N-SSV)和高表达自身载体(HESV)进行 DNA疫苗接种治疗已建立的高血糖。治疗0周时高血糖发作(190-250mg/dl)后每周一次用肌肉内DNA疫苗治疗雌性NOD小鼠。向每只动物给予50μg的每种DNA质粒。给予的DNA疫苗包含mINS-II-N-SSV、mINS-N-HESV以及所述两种载体的组合。每周监控动物IDDM的发作，并且在第一次连续2周血糖水平超过250mg/dl时，即认为患上糖尿病。已示出随时间推移，糖尿病动物的百分比。使用GraphPadPrism生成KM印记。
图10：使用编码前胰岛素原II的经修饰的DNA自身载体进行DNA 疫苗接种预防NOD小鼠内自身抗体的产生。每周一次用肌肉内DNA疫苗治疗五周大的雌性NOD小鼠(每组n＝20)。向每只动物给予50μg的每种DNA质粒。给予的所述DNA疫苗包括pBHT1空载体、mINS-I-pBHT1、mINS-II-pBHT1、mINS-II-HESV和mINS-II-N-SSV。连续5天通过静脉注射以5μg/动物给予抗CD3。在最后一次DNA注射后两周，收集血清，并在Barbara Davis Center for Diabetes(BarbaraDavis糖尿病中心)通过放射性免疫试验盲筛，寻找胰岛素抗体。本文图示了每一治疗组中小鼠胰岛素自身抗体(mIAA)指数高于0.01的动物的百分比。
图11：使用编码前胰岛素原H的经修饰的DNA自身载体进行DNA 疫苗接种，预防NOD小鼠患上胰岛炎。每周一次用肌肉内DNA疫苗治疗五周大的雌性NOD小鼠(每组n＝20)。向每只动物给予50μg的每一种DNA质粒。所述给予的DNA疫苗包括：pBHT1空载体、mINS-I-pBHT1、mINS-II-pBHT1、mINS-II-HESV以及mINS-II-N-SSV。连续5天通过静脉注射以5μg/动物给予抗CD3。在最后一次DNA注射后两周收集每一受治疗小鼠的胰腺，并将其置于福尔马林以H&E评估胰岛炎的程度。已示出相对于PBS对照，每一种治疗条件下的浸润百分比及P值。
图12：使用用不同Ca ++ 浓度配制的高表达自身载体(HESV)进行DNA 疫苗接种治疗已建立的高血糖。治疗0周时高血糖发作(190-250mg/dl)后每周一次肌肉内DNA接种疫苗治疗雌性NOD小鼠。对每只动物给予50μg的每一种DNA质粒。以不同Ca++浓度注射DNA疫苗mINS-N-HESV(pBHT-3021)，所述浓度包括：0.9mM(1x)、2.7mM(3x)和5.4mM(6x)。每周监控动物的糖尿病发作，并且在第一次连续2周血糖水平超过250mg/dl时，即认为患上糖尿病。已示出随时间推移，糖尿病动物的百分比。使用GraphPad Prism生成KM印记。A)在无Markane时使用不同钙浓度的pBHT-3021进行治疗，显示6x钙制剂显著地提高了DNA疫苗接种的效果，所述DNA疫苗接种是为对抗糖尿病进展而进行的保护。B)使用不同钙浓度下的pBHT-3021与共给予胰岛素相结合进行治疗，类似地显示使用6x钙的制剂增加了对抗糖尿病进展的效果。C)使用不同钙浓度下的pBHT-3021治疗与使用Markane治疗，显示3x和6x钙制剂的效果有少许增加。D)对使用pBHT-3021自身载体的实验结果的小结，所述自身载体用具有或没有Markane的浓度提高的钙配制。E)使用pBHT-3021治疗糖尿病后动物，所述pBHT-3021用1x或6x钙配制，显示使用6x钙的具有高血糖水平的动物的百分比延迟并降低(右下图，带三角的虚线)，这与抗CD3治疗的阳性对照相似(左图)，与1x钙对比(左上图，带菱形的虚线)，它没有表现出与PBS治疗的对照间存在差异(带方块的实线)。F)相对于PBS治疗的对照(带方块的实线)，使用用6x钙(右下图，带三角的虚线)或注射5天的用1x钙(左图，带空心圆圈的虚线)配制的pBHT-3021治疗糖尿病后动物降低了血糖水平，这一效果在单独使用1x钙制剂时没有出现(右上图，带菱形的虚线)。G)用1x钙或PBS治疗的动物没有回复的出现，相对于此，使用用6x钙配制的或注射5天的用1x钙配制的pBHT-3021自身载体治疗的动物有五分之一回复到了非糖尿病的状态。
图13：使用编码髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)胞外区域的分泌的自身 载体(SSV)进行DNA疫苗接种以治疗小鼠EAE。使用MOG肽35-55诱导小鼠EAE，并且16天后，每两周一次用肌肉内DNA疫苗治疗EAE，其用箭头表示在每幅插图中。对每只动物给予50μg的每一种DNA质粒。所述给予的DNA疫苗包括mMOG-pBHT1和mMOG-SSV。注射depromedrol(醋酸甲基泼尼松龙)作为阳性对照。依EAE引发后的时间推移，绘制每种治疗组的平均疾病分值。A)相对于注射PBS的对照，mMOG-pBHT1治疗的小鼠的平均疾病分值。B)相对于注射PBS的对照，mMOG-SSV治疗的动物的平均疾病分值。C)相对于注射PBS的对照，depromedrol治疗的动物的平均疾病分值。D)相对于mMOG-SSV治疗的动物，mMOG-pBHT1未经修饰载体治疗的小鼠的平均疾病分值。
图14：反应通过使用编码MOG胞外区域的分泌的自身载体(SSV)进 行DNA疫苗接种治疗EAE的免疫反应。使用MOG肽35-55诱导小鼠EAE，并且16天后，每两周一次用肌肉内DNA疫苗治疗EAE。对每只动物给予50μg的每一种DNA质粒。所述给予的DNA疫苗包含mMOG-pBHT1和mMOG-SSV。注射depromedrol作为阳性对照。当本试验完结时，检验了DNA接种动物和对照动物对MOG胞外结构域的免疫反应。收集受治疗小鼠的血清，并用ELISA分析其IgG1抗MOG特异性抗体。按治疗组绘制每种动物的所述ELISA光密度。每组的平均光密度用水平线表示。
本发明详述
本发明涉及治疗或预防个体疾病的方法和组合物，所述疾病与存在于该个体内且参与非生理状态的一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽相关。更特别地，本发明涉及用于治疗或预防自身免疫性疾病的方法和组合物，所述疾病与存在于该个体内的非生理状态的一种或多种自身多肽相关，所述自身免疫性疾病例如多发性硬化、风湿性关节炎、胰岛素依赖的糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、斯耶格伦(氏)综合征、寻常天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)及格雷夫斯病。本发明提供了用于治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法，包括向个体给予编码并能表达包括与所述疾病相关的一种或多种自身抗原表位的自身多肽的经修饰的自身载体。向个体给予治疗或预防有效量的经修饰的自身载体引发对与自身免疫性疾病相关的自身抗原免疫反应的抑制，从而治疗或预防所述疾病。
自身免疫性疾病
表2提出了与自身抗原相关的自身免疫性疾病的数种实例，并且下文进一步详细描述了特定的实例
             表2 示例性自身免疫性疾病和相关的自身抗原
Figure A200680045690D00401
Figure A200680045690D00411
多发性硬化。多发性硬化(MS)是最常见的CNS脱髓磷脂失调，并且影响350,000名美国人和一百万的世界人口。症状发作通常发生在20到40岁之间，并且表现为单侧视觉损伤、肌无力、感觉异常、运动失调、眩晕症、小便失禁、构音障碍或精神障碍的(按频率降低的顺序)急性或亚急性发作。这些症状由脱髓磷脂的病灶性损害导致，其既造成归因于轴突转导放缓的阴性传导异常，还造成归因于异位冲动产生的阳性传导异常(例如，莱尔米特(Lhermitte)症)。对MS的诊断基于病史，包括至少两次明显的时间上隔开的神经失调的发作、产生神经失调的客观临床迹象、和涉及CNS白质的分离区域。实验室研究提供了支持MS诊断的另外的客观证据，所述研究包括CNS白质损害的核磁共振成像(MRI)、IgG脑脊液(CSF)寡克隆带以及引起的异常反应。虽然大多数患者会经历渐进的复发缓解病程，但是MS的临床过程在个体间大相径庭，并且其范围可以从限于一生中的数次温和发作到慢性累积的爆发性疾病。具有分泌IFN-γ能力的髓磷脂-自身反应性T细胞数量的增加与MS和EAE的发病机理相关。
在诸如多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的自身免疫性脱髓磷脂疾病中，自身免疫反应的自身抗原靶点可能包括表位，该表位源自蛋白脂质蛋白(PLP)；髓磷脂碱性蛋白(MBP)；髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)；环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)；髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)；以及髓磷脂结合的少突细胞碱性蛋白(MBOP)；α-B-晶体蛋白(热激蛋白)；病毒和细菌模拟肽(例如，流感、疱疹病毒、乙型肝炎病毒，等等)；OSP(少突细胞特异性蛋白)；瓜氨酸修饰的MBP(MBP的C8异构体，其中6个精氨酸已脱亚胺基为瓜氨酸)，等等。嵌膜蛋白质PLP为髓磷脂的主要自身抗原。在数种小鼠品系中已鉴定出决定性的PLP抗原性，包括残基139-151、103-116、215-232、43-64和178-191。已报导了至少26个MBP表位(Meinl et al，J Clin Invest 92，2633-43，1993)。值得注意的是残基1-11、59-76和87-99。已在数种小鼠品系中鉴定的免疫显性MOG表位包括残基1-22、35-55、64-96。
在人MS患者中，鉴定到作为自身免疫性T和B细胞反应靶点的下列髓磷脂蛋白和表位。从MS脑斑洗脱的抗体识别髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽83-97(Wucherpfennig et al，J Clin Invest 100：1114-1122，1997)。另一项研究发现约50％MS患者对髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)具有外周血淋巴细胞(PBL)T细胞反应性(6-10％对照)、20％针对MBP反应(8-12％对照)、8％针对PLP反应(0％对照)、0％针对MAG反应(0％对照)。在本研究中，7/10的MOG反应性患者具有T细胞增殖性反应，所述反应聚焦在3种肽表位之一，包括MOG 1-22、MOG 34-56、MOG64-96(Kerlero de Rosbo et al.，Eur J Immunol 27，3059-69，1997)。T和B细胞(洗脱的脑损伤Ab)反应聚焦在MBP87-99(Oksenberg et al，Nature362，68-70，1993)。在MBP87-99中，氨基酸基序HFFK为T和B两种细胞反应的主要靶点(Wucherpfennig et al.，J Clin Invest 100，1114-22，1997)。另一个试验观察到针对髓磷脂结合的少突细胞碱性蛋白(MOBP)的淋巴细胞反应性，包括残基MOBP21-39和MOBP37-60(Holz et al.，JImmunol 164，1103-9，2000)。使用MOG和MBP肽的免疫金偶联物对MS脑和对照脑染色，通过结合MS斑的Abs识别到MBP和MOG肽两者(Genain and Hauser，Methods 10，420-34，1996)。
风湿性关节炎。风湿性关节炎(RA)是慢性自身免疫性炎性滑膜炎，影响着世界人口的0.8％。它由造成侵蚀性关节破坏的慢性炎性滑膜炎来表征。RA由T细胞、B细胞和巨噬细胞介导。
证明T细胞在RA中起关键作用的证据包括1)侵润滑膜的CD4+T细胞的主导性，2)与使用诸如环孢霉素的药物抑制T细胞功能相关的临床改善，以及3)RA与某些HLA-DR等位基因间的相关性。与RA相关的所述HLA-DR等位基因包括与β链第三高变区的位点67-74相似的氨基酸序列，所述位点参与肽结合与呈递到T细胞。RA由自身反应性T细胞介导，该自身反应性T细胞识别在含滑液的关节内存在的自身蛋白或经修饰的自身蛋白。RA中靶向的自身抗原包括，例如表位，该表位源自II型胶原蛋白；hnRNP；A2/RA33；Sa；微丝聚集蛋白；角蛋白；瓜氨酸；包括gp39的软骨蛋白；I、III、IV、V、IX、XI型胶原蛋白；HSP-65/60；IgM(风湿性因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心磷脂；醛缩酶A；瓜氨酸修饰的微丝聚集蛋白和纤维蛋白。已在高比例的RA患者的血清中鉴定到识别微丝聚集蛋白肽的自身抗体，所述微丝聚集蛋白肽包含经修饰的精氨酸残基(脱亚胺基以形成瓜氨酸)。一些患者中，自身反应性T和B细胞反应都指向同样的免疫显性的II型胶原蛋白(CII)肽257-270。
胰岛素依赖的糖尿病。人I型或胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)由郎格罕氏(Langerhans)胰岛内β细胞的自身免疫性破坏所表征。去除β细胞导致不能调节血糖水平。血糖水平升高到特定水平(通常约250mg/dl)之上时，即发生显著性糖尿病。人类糖尿病发作前有一段长时间的前症状期。该时期内，胰腺β细胞功能会渐渐丧失。抗胰岛素、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗体的存在暗示发生了疾病。
前症状期可能评价的标志物是胰腺内胰岛炎的存在；胰岛细胞抗体、胰岛细胞表面抗体的水平和频率；MHC II类分子在胰腺β细胞的异常表达；血糖浓度和胰岛素的血浆浓度。象胰岛素浓度的降低一样，胰腺T淋巴细胞、胰岛细胞抗体的数量增加和血糖升高指示所述疾病。
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠作为动物模型，具有许多与人IDDM相同的临床上、免疫学上和组织病理学上的特征。NOD小鼠自发地发生胰岛炎性和对所述β细胞的破坏，其导致高血糖和显著性糖尿病。糖尿病的发生需要CD4+和CD8+两种T细胞，尽管每一种的作用尚不清楚。已表明，在耐受化条件下，对NOD小鼠给予作为蛋白的胰岛素或GAD，能预防疾病和对其他自身抗原的下调反应。
血清内具有各种特异性的自身抗体的组合存在对人I型糖尿病高度敏感并高度特异。例如，抗GAD和/或IA-2自身抗体的存在对从对照血清鉴定I型糖尿病具有约98％的敏感性和99％的特异性。在I型糖尿病患者的非糖尿病一级亲属中，存在特异于包括GAD、胰岛素和IA-2的三种自身抗原中的两者的自身抗体，则表示>90％的阳性预期值，其代表五年内IDM型糖尿病的发生。
人胰岛素依赖性糖尿病靶向的自身抗原可能包括，例如，酪氨酸磷酸酶IA-2；IA-2β；65kDa和67kDa两种形式的谷氨酸脱羧酶(GAD)；羧肽酶H；胰岛素；胰岛素原(例如，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)；热休克蛋白(HSP)；glima 38；胰岛细胞抗原69kDa(ICA69)；p52；两种神经节苷脂抗原(GT3和GM2-1)；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶-相关蛋白(IGRP)；以及胰岛细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT 2)。
当前通过监控血糖水平治疗人IDDM，以指导重组胰岛素的注射或基于泵的递送。膳食和运动方式有助于达到对血糖的适当控制。自身免疫性葡萄膜炎。自身免疫性葡萄膜炎是眼的自身免疫性疾病，据估计影响400,000人，并且美国发病率为每年新增43,000例。当前对自身免疫性葡萄膜炎的治疗使用类固醇、诸如甲氨蝶呤和环孢霉素的免疫抑制剂、静脉免疫球蛋白以及TNFα-拮抗物。
实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是T细胞介导的自身免疫性疾病，该疾病以神经视网膜、葡萄膜及眼内相关组织为靶点。EAU具有与人自身免疫性葡萄膜炎相同的许多临床上和免疫学上的特征，并且由外周给予乳化于完全弗氏佐剂(CFA)的葡萄膜炎肽而引发。
在人自身免疫性葡萄膜炎中，自身免疫反应靶向的自身抗原可以包括S-抗原、感光细胞间维生素A类结合蛋白(IRBP)、视紫质和视觉恢复蛋白(recoverin)。
原发性胆汁性肝硬化。原发性胆汁性肝硬化(PBC)是器官特异性的自身免疫性疾病，主要影响40-60岁之间的女性。在该组中报导的发病率接近1/1000。表征PBC是通过内衬于小的肝内胆管的肝内胆管上皮细胞(IBEC)的进行性破坏。这导致对胆汁分泌的阻碍与干扰，造成最终的硬化。已报导由上皮衬里/分泌系统损坏表征的其他自身免疫性疾病的相关性，所述疾病包括斯耶格伦(氏)综合征、CREST综合征、自身免疫性甲状腺疾病以及风湿性关节炎。对驱动抗原的关注已集中在线粒体上超过50年，导致抗线粒体抗体(AMA)的发现(Gershwin et al.，Immunol Rev 174：210-225，2000)；(Mackay et al，Immunol Rev174：226-237，2000)。AMA很快成为实验室诊断PBC的基础，它存在于90-95％的临床症状出现很久以前的患者血清中。线粒体内的自身抗原性反应性命名为M1和M2。M2反应性指向抗48-74kDa组分家族。M2代表2-酮酸脱氢酶复合体(2-OADC)的多种自身抗原性亚单位，并且是本发明所述自身蛋白、自身多肽或自身肽的另一实例。鉴定PBC发病机理中丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)抗原作用的研究支持了这样的观念：PDC在所述疾病的引发中起中心作用(Gershwin et al，ImmunolRev 174：210-225，2000)；(Mackay et al.，Immunol Rev 174：226-237，2000)。在PBC中，95％的案例的最频繁反应性是E274kDa亚基，它属于PDC-E2。所存在的相关但明显不同的复合体包括：2-酮戊二酸脱氢酶复合体(OGDC)和支化链(BC)2-OADC。三种组成型酶(E1、E2、E3)有助于催化功能，该催化功能为将2-酮酸底物转换成酰基辅酶A(CoA)，同时将NAD+还原成NADH。哺乳动物PDC包括另外的组分，称蛋白X或E-3结合蛋白：(E3BP)。在PBC患者中，所述的，主要的抗原反应指向抗PDC-E2和E3BP。E2多肽包含两种衔接重复的硫辛酰结构域，而E3BP具有单一的硫辛酰结构域。所述硫辛酰结构域在大量PBC自身抗原靶点中都有发现，并且在本文中称作“PBC硫辛酰结构域”。用糖皮质激素和包括甲氨蝶呤和环孢霉素A的免疫抑制剂治疗PBC。
实验性自身免疫性胆管炎(EAC)的鼠模型采用在SJL/J雌性小鼠中使用哺乳动物PDC进行腹膜内(i.p.)致敏化，引发非化脓的破坏性胆管炎(NSDC)及AMA的产生(Jones，J Clin Pathol 53：813-21，2000)。
其他自身免疫性疾病与相关的自身抗原。重症肌无力的自身抗原可以包括乙酰胆碱受体内的表位。寻常天疱疮中靶向的自身抗原可以包括桥粒芯糖蛋白-3。斯耶格伦(氏)综合征抗原可以包括SSA(Ro)；SSB(La)；以及胞衬蛋白。寻常天疱疮的主要自身抗原可以包括桥粒芯糖蛋白-3。肌炎组可以包括tRNA合成酶(例如，苏氨酰基、组氨酰基、丙氨酰基、异亮氨酰基和甘氨酰基)；Ku；Scl；SSA；U1Sn核糖核蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku；以及SRP。硬皮病组可以包括Scl-70；着丝粒；U1核糖核蛋白；以及微丝聚集蛋白。恶性贫血组可以包括内因子；以及胃H/K ATP酶的糖蛋白β亚基。系统性红斑狼疮(SLE)的表位抗原可以包括DNA；磷脂；核抗原；Ro；La；U1核糖核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；钙网蛋白；Grp78；Scl-70；组蛋白；Sm蛋白；以及染色质，等等。在格雷夫斯病中，表位可以包括Na+/I-同向转运；促甲状腺素受体；Tg；以及TPO。
移植物抗宿主疾病。人组织和器官移植的最大限制之一是受体免疫系统的组织移植物排斥。已确定供体和受体间I类MHC和II类MHC(HLA-A、HLA-B以及HLA-DR)等位基因越匹配，移植物存活得越好。移植物抗宿主疾病(GVHD)在接受移植物的患者中造成显著的发病率和死亡率，所述移植物包含异源造血细胞。造血细胞存在于骨-骨髓移植物、干细胞移植物以及其他移植物中。在接受来自HLA匹配的亲属的移植物的患者中，约50％会发生中度到重度的GVHD，而非-HLA匹配的移植物中，所述发病率高出很多。三分之一的发生了中度到重度GVHD的患者最终都会死亡。供体移植物的T淋巴细胞和其他免疫细胞会攻击受体细胞，所述受体细胞表达氨基酸序列变化的多肽变体，特别是人染色体6上的主要组织相容性复合物(MHC)基因复合体上编码的蛋白变体。在包含异源造血细胞的移植物中，对GVHD最有影响的蛋白是高度多态(人之间广泛的氨基酸变化)的I类蛋白(HLA-A、HLA-B以及HLA-C)和II类蛋白(DRB1、DQB1和DPB1)(Appelbaum，Nature 411：385-389，2001)。即使供体和受体之间的所述I类MHC等位基因在血清学上“匹配”，DNA测序也揭示出，在30％的案例中存在等位基因水平上的错误匹配，这为即使匹配的供体-受体对中I类指向的GVHD提供了基础(Appelbaum，Nature 411，385-389，2001)。次要组织相容性自身抗原GVHD常常造成皮肤、肠、肝脏、肺和胰腺的损伤。GVHD的治疗使用糖皮质激素、环孢霉素、甲氨蝶呤、氟拉达滨和OKT3。
组织移植物排斥。组织移植物的免疫性排斥由移植物受体内指向抗该移植器官的免疫反应介导，所述组织移植物包括肺、心脏、肝脏、肾脏、胰腺以及其他器官和组织。异源移植器官包含相对于移植物受体氨基酸序列的氨基酸序列变化的蛋白。因为移植器官的氨基酸序列不同于移植物受体的氨基酸序列，因而常常在受体内引发抗移植器官的免疫反应。移植器官排斥是组织移植的主要并发症和限制之处，并且能造成受体内器官移植的失败。排斥造成的慢性炎症常常导致该移植器官的机能障碍。当前使用各种免疫抑制剂治疗移植物受体，以预防和抑制排斥。这些试剂包含糖皮质激素、环孢霉素A、骁悉(Cellcept)、FK-506和OKT3。
治疗组合物及方法
本发明提供用于治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法和组合物，包括用编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的经修饰的自身载体进行DNA疫苗接种。编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸可操作地连接到启动子以及允许宿主细胞表达该自身多肽的转录终止子。该多核苷酸编码的自身蛋白、自身多肽或自身肽包括与所述自身免疫性疾病相关的自身抗原的一种或多种致病表位。本发明的改良方法包括对个体给予经修饰的自身载体，该自身载体包括编码并能表达自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸。在本发明的一方面，相对于所述未经修饰的载体，经修饰的自身载体经改造以提高宿主细胞内该自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达。在另一相互不排斥的方面，经修饰的自身载体允许与该疾病相关的胞外或分泌的自身抗原(例如，跨膜蛋白或分泌的可溶性因子)作为胞内和非分泌的自身蛋白、自身多肽或自身肽而被编码和被表达。
本领域公知通过给予编码一种或多种自身多肽的自身载体治疗或预防自身免疫性疾病的方法，所述方法经受本发明阐明的所述改进。例如国际专利申请号WO 00/53019、WO 2003/045316和WO2004/047734(出于任何目的每个专利以其整体并入本文作为参考)描述了应用本发明修改的示例性方法。
高表达自身载体(HESV)
在本文描述的本发明之前，就给予用于治疗自身免疫性疾病的编码自身抗原或其致病表位的载体而言，普遍认为，较低水平的自身抗原或表位的表达对治疗自身免疫性疾病更为有效。令人惊奇的是，本文描述的研究证明：与本领域的所述理解相反，提高包括与自身免疫性疾病相关的致病表位的多肽的表达会增加该治疗的效果。因此，在某些实施方案中，用于治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法包含对个体给予有效量的经修饰的自身载体，相对于编码同样的自身多肽的未经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体经改造以提高编码的自身多肽的表达。经修饰的自身载体在本文称作高表达自身载体(HESV)，相对于所述未经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体经改造以提高编码的自身多肽的表达。HESV包括编码并能表达与自身免疫性疾病相关的自身多肽的多核苷酸，以及相对于同样的未经修饰的自身载体，可表达增加量的所述自身多肽的修饰。HESV还包括可操作的组合：启动子；编码自身多肽的多核苷酸，该自身多肽包含与所述自身免疫性疾病相关的至少一种致病表位；转录终止子；以及为在宿主细胞内表达增加量的所述自身多肽而进行的修饰，其中表达的提高相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体。
为表达增加量的多肽而进行的修饰为本领域所公知，该多肽由质粒载体编码(Azevedi et al.，1999)。在本发明的一个实施方案中，通过变化将自身载体修饰为HESV，相对于所述未经修饰的自身载体，所述变化提高多核苷酸的转录起始，该多核苷酸编码与自身免疫性疾病相关的一种或多种自身多肽。在另一个实施方案中，通过变化修饰自身载体以产生HESV，相对于所述未经修饰的自身载体，所述变化提高编码自身多肽的多核苷酸的转录终止。可预见的还有对自身载体的改造以产生HESV，相对于所述未经修饰的自身载体，该HESV产生稳定性提高的多聚核糖核苷酸或mRNA。在其他实施方案中，修饰自身载体以产生HESV，与未经修饰的自身载体相比，该HESV产生翻译效率提高的mRNA。另外，可以通过变化修饰自身载体以产生HESV，与该未经修饰的自身载体编码的同样自身多肽的稳定性相比，所述变化提高了编码的自身多肽的稳定性。在本发明特别的实施方案中，为提高与自身免疫性疾病相关的自身多肽表达而对自身载体进行的修饰选自：使用更强的启动子区域、添加增强子区域、使用更为有效的转录终止子序列、添加多聚腺苷化信号、使用更为理想的Kozak共同序列、优化密码子使用、夹杂内含子等等或所述修饰的组合。在优选的实施方案中，所述修饰是将内含子夹在启动子下游和编码自身多肽的多核苷酸的起始密码子上游。可以使用的启动子下游和该起始密码子上游的内含子是人巨细胞病毒的内含子A。更特别地，所述优选的内含子是β-球蛋白/Ig嵌合内含子。
可以对自身载体进行多种修饰，相对于所述未经修饰的自身载体，以提高编码的自身多肽的表达，从而产生HESV。例如，可以向自身载体添加增强子元件和内含子两者以产生HESV，或者修饰编码自身多肽的多核苷酸以包括最适Kozak共同序列和优选的多聚腺苷化信号等等。在一些实施方案中，将修饰的组合引入单一HESV，以影响该HESV编码的单一自身多肽。在其他实施方案中，将修饰引入单一HESV会提高该HESV编码的多种自身多肽的表达。单一HESV编码的多种自身多肽可由内部核糖体进入位点(IRES)隔开，可引入单一融合多肽，或者以允许其表达的任何方式排列。可选择的实施方案包括产生用于共给药的多种HESV，其引入各种各样的修饰以提高一种或多种自身多肽的表达。
用于产生HESV的预想的启动子/增强子区域包括在多种哺乳动物细胞内具有用于转录起始的高组成型能力的启动子或增强子区域。这些启动子常来自诸如SV40和人巨细胞病毒(CMV)的致病病毒。事实上，CMV的即时早期启动子/增强子区域是最常见且最强的启动子之一，在广泛范围的宿主细胞中高水平表达。还可使用适合的哺乳动物启动子，包括但不限于牛I类主要组织相容性复合体(MHC I)启动子/增强子区域和人β-肌动蛋白启动子。因此可以使用CMV启动子替换通用或内源启动子，将其用于把自身载体变为HESV，与未经修饰的自身载体相比，该HESV具有提高的转录起始。在可选择的实施方案中，还可以使用在截然不同的细胞类型中特异性表达的启动子。例如，人肌酸激酶启动子可用于产生HESV，该HESV在肌肉细胞中特异性表达自身多肽。诱导型启动子还可用于调节HESV编码的自身多肽的表达。优选的诱导型启动子由不同化合物的存在与否来控制，所述化合物在机体内通常不存在，其包括诸如四环素的抗生素。
本发明还预想向自身载体添加离散的增强子区域，以产生HESV。诸如αB晶体蛋白基因(cryB)增强子的增强子元件与缺乏这些元件的自身载体相比，能提高HESV编码的自身多核苷酸的转录起始率。可使用来自已知哺乳动物基因的增强子，包括，例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白和胰岛素。然而，通常，优选来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40增强子和CMV早期增强子。增强子的方向和位置相对独立，并且能位于自身载体的任何地方，以提高转录起始，不过优选地，将增强子引入HESV时，置于启动子上游。
为增强自身载体编码的自身多肽表达而产生HESV的修饰还包括使用有效的转录终止子序列并添加多聚腺苷化信号。改造这些元件能提高转录效率、提高mRNA稳定性、和/或提高翻译效率。存在强启动子/增强子的情况下，转录终止效率能成为限速因素，并且可通过嵌合终止序列来提高，所述嵌合终止序列移除了3’非翻译区(UTR)序列和/或包含更为有效的多聚腺苷化信号(Hartikka et al.，1996)。转录终止和多聚腺苷化在功能上相联系，并且有效酶切/多聚腺苷化所需的序列还构成终止序列的重要元件(Connelly and Manley，1988；Zhoa et al.，1999；Natalizio et al.，2002)。需要高表达重组蛋白时，通常使用牛生长激素多聚腺苷化信号和转录终止序列。
还可通过夹杂变化将自身载体修饰成HESV，所述变化增强由自身多核苷酸转录产生的mRNA的翻译效率。mRNA起始密码子(AUG)两侧的序列会通过真核核糖体影响翻译起始，该真核核糖体具有Kozak共同序列9GCCGCC(A/G)CCAUGG+4，它定义了优选的起始信号。然而，只要相对于所述AUG的-3位包含嘌呤(A/G)或鸟嘌呤位于+4位，就能获得有效的翻译。因此，可以通过定位突变修饰自身载体，例如，以更紧密地靠近所述Kozak序列，来产生HESV。通过基于不同物种中已知的密码子偏好性而优化密码子使用，也能够提高翻译效率(Gustafsson et al.，2004)。密码子偏好性是同义密码子的不等使用，所述同义密码子编码同样的氨基酸。不同密码子的使用频率在不同物种间以及相同物种内以不同水平表达的蛋白间各不相同。修饰自身多核苷酸以在宿主细胞内相对于次优选密码子包含优选密码子，能够提高蛋白表达。
为产生HESV而进行的预想的其他修饰包括引入变化，相对于所述未经修饰的自身多肽，所述变化改变编码的自身多肽以提高其稳定性。稳定蛋白有很多方式，包括但不限于：对胞外蛋白添加碳水化合物部分；清除诸如泛素化的用于蛋白降解的信号；通过引入脯氨酸残基、二硫键等等进行熵稳定化；以及减少与水接触的疏水表面。
通过把促进质粒DNA核定位的序列夹杂进所述载体，也能将自身载体修饰为HESV。这些序列在任何位置连接进质粒骨架，所述任何位置不干扰编码的自身多肽的表达。在某些实施方案中，将介导质粒核转运活性的猿病毒40(SV40)早期启动子和增强子区域引入自身载体以从HESV产生增加量的蛋白表达(Dean et al.，1999，Curr.Eye Res.19：66-75)。
在本发明的优选实施方案中，通过夹杂内含子序列，将自身载体修饰成HESV。添加内含子能够提高转录效率、mRNA加工和mRNA转运，并因而将质粒载体上的异种蛋白的蛋白表达提高约5倍到超过100倍(Gross et al.，1987；Buchman and Berg，1988；Chapman et al.，1991；Huang and Gorman，1990a)。该内含子造成的表达水平的提高取决于特定的cDNA插入。例如，在人胚胎肾脏细胞的瞬时转染中，嵌合内含子的存在将CAT基因的表达提高了20倍，但是仅仅将荧光素酶的表达水平提高了3倍(Brondyk，1994)。此外，转基因实验已显示，内含子的存在促进了机体内事实上所有编码的蛋白的高水平的表达(Brinster et al.，1988；Choi et al.，1991；Palmiter et al，1991)。常使用来自致病病毒的多种内含子，包括人CMV的内含子A、SV40小t内含子和SV40VP1内含子。也可使用来自哺乳动物基因的内含子，包括人延伸因子1α和兔或人β-球蛋白的内含子。可选择地，还可使用内源性内含子，其来自自身载体上编码自身多肽的基因，或者可以构建嵌合内含子，其包含共同或接近共同的剪接供体、剪接受体和支化点位点。内含子可置于所述自身多核苷酸的任何位置，从而转录为在RNA加工期间从转录本剪接掉的RNA。然而，替换该编码区域的3’内含子能带来有害的效果(Evans and Scarpulla，1989；Huang andGorman，1990b)。
在一个实施方案中，所述修饰是夹杂所述人CMV内含子，将其置于所述自身多核苷酸的启动子区域下游和相对于起始密码子的5’非翻译区域(UTR)的紧邻上游。该人CMV主要即时早期(IE1)基因的转录区域包含三种内含子，其中最大的是内含子A，发生在该基因5’UTR内，并且包含最强的五个核因子1(NF1)转录因子结合位点。向质粒表达载体添加内含子A，增加了转化的猴肾脏细胞内瞬时表达的糖蛋白。该NF1结合位点的突变仅部分逆转该增加，暗示内含子A本身的存在对蛋白表达具有正向效果，这已在使用其他内含子时观察到(Chapmanetal.，1991；Huang and Gorman，1990a)。内含子A中的肌肉特异性增强子可以进一步提高肌肉细胞内的蛋白表达(Chapman et al.，1991)。
在示例性实施方案中，所述修饰是夹杂来自商业上可获得的载体pTarget(Promega，Madison，WI)的β球蛋白/Ig嵌合内含子，将其置于所述自身多核苷酸的启动子区域下游和相对于起始密码子的5’非翻译区域(UTR)的紧邻上游。该嵌合内含子由来自人β球蛋白基因第一内含子的5’供体位点和所述分枝及来自免疫球蛋白基因重链可变区的内含子的3’受体位点组成，所述供体、受体和支化点位点序列经改变以与用于剪接的共同序列匹配(Bothwell et al.，1981)。在人胚胎肾脏细胞的瞬时转染中，该嵌合内含子的存在能将编码的基因的表达提高20倍(Brondyk，1994)。
使用用于宿主细胞转染和重组蛋白表达的公知方法可在体外测定宿主细胞中与HESV相关的自身多肽的增加量的表达(相对于未经修饰的自身载体)。通常，使用所述未经修饰的自身载体或HESV转染宿主细胞群，该HESV包含为表达增加量的该自身多肽而进行的至少一种修饰。随后在允许该自身多肽表达的条件下培养所述宿主细胞。通常，所述宿主细胞和培养条件的设计在于模拟或接近体内的生理条件。随后使用公知方法，诸如，例如，蛋白印记分析、ELISA或FACS，测定用HESV转染的与未经修饰的自身载体转染的的宿主细胞群之间该自身多肽表达的相对水平。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防该自身免疫性疾病胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)的改良方法，包括对个体给予经修饰的编码并能表达自身多肽的自身载体，该自身多肽包含与IDDM相关的一种或多种自身抗原表位。用于治疗或预防IDDM的改良方法包括对个体给予有效量的经修饰的自身载体，相对于编码同样的自身蛋白、自身多肽或自身肽的未经修饰的自身载体，所述自身载体经改造以提高了与IDDM相关的编码的自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达。在一些实施方案中，该HESV的产生是通过下列修饰的一种或多种：使用更强的启动子区域、添加增强子区域、使用更为有效的转录终止子序列、添加多聚腺苷化信号、使用更为理想的kozak共同序列、优化密码子使用以及夹杂内含子。在优选实施方案中，经修饰以提高自身肽表达的所述自身载体是包含内含子的HESV，该内含子位于所述启动子区域下游和与IDDM相关的编码的自身多肽起始密码子的上游。更特别地，该内含子可以是β球蛋白/Ig嵌合内含子或人巨细胞病毒(CMV)的内含子A。为治疗或预防IDDM而给予的所述HESV可以包括多核苷酸，该多核苷酸编码一种或多种自身蛋白，例如，前胰岛素原、胰岛素原(例如，SEQ ID NO：2)；谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和谷氨酸脱羧酶(GAD)-67；酪氨酸磷酸酶IA-2；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶相关蛋白(IGRP)；和/或胰岛细胞抗原69kD。可选择地，可以给予编码不同自身蛋白、自身多肽或自身肽的多种HESV。在优选实施方案中，为治疗或预防IDDM而给予的所述HESV包含多核苷酸起始密码子的β球蛋白/Ig嵌合上游，该多核苷酸编码自身多肽前胰岛素原或胰岛素原(例如，SEQ ID NO：2)。
在本发明的其他实施方案中，提供了用于治疗或预防多发性硬化(MS)的改良方法，包括向个体给予经修饰的编码并能表达自身多肽的自身载体，该自身多肽包含与MS相关的一种或多种自身抗原表位。用于治疗或预防MS的改良方法包括向个体给予有效量的经修饰的自身载体，相对于编码同样的自身多肽的未经修饰的自身载体，该自身载体经改造以提高与MS相关的编码的自身多肽的表达。在一些实施方案中，经修饰以提高自身肽表达的所述自身载体是包含内含子的HESV，该内含子位于所述启动子区域下游和与MS相关的编码的自身多肽起始密码子的上游。为治疗MS而给予的所述HESV可以包括多核苷酸，该多核苷酸编码一种或多种自身多肽，包括但不限于：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂结合的少突细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)和/或髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)。可选择地，可以给予编码不同自身多肽的多种HESV。在优选实施方案中，给予的所述HESV包含β球蛋白/Ig嵌合内含子，其位于编码所述自身多肽MBP的多核苷酸的起始密码子上游。
非分泌的自身载体(N-SSV)
在相互不排斥的实施方案中，用于治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法包括对个体给予有效量的经修饰的包含多核苷酸的自身载体，该多核苷酸编码与该疾病相关的胞外或分泌的或膜结合自身抗原(例如，跨膜蛋白或分泌的可溶性因子)的胞内或非分泌非膜结合自身多肽形式。本文把经修饰的经改造以编码胞外或分泌的或膜结合自身多肽的胞内或非分泌的非膜结合形式的自身载体称作非分泌的自身载体(N-SSV)。N-SSV包括多核苷酸，该多核苷酸编码并能表达与自身免疫性疾病相关的分泌的自身多肽，以及为阻止宿主细胞分泌该自身多肽而进行的修饰。N-SSV还包括可操作的组合：启动子；编码胞外或分泌的自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包含与该自身免疫性疾病相关的至少一种致病表位；转录终止子；以及至少一种修饰，相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体，该修饰阻止了宿主细胞分泌该自身多肽。
在某些变化中，N-SSV编码的非分泌的或非膜结合自身多肽是分泌的或膜结合自身蛋白、自身多肽或自身肽的经改造的形式，所述经改造的形式包括修饰，该修饰阻止宿主细胞自身多肽分泌到或该自身多肽整合到宿主细胞膜中。在其他变化中，N-SSV编码的非分泌的自身多肽是胞外自身多肽的经改造的形式，所述经改造的形式包括修饰以编码例如跨膜蛋白或GPI连接蛋白的胞外区域的胞内形式，或者，N-SSV编码的非膜结合自身多肽是膜结合自身多肽的经改造的形式，所述经改造的形式改变或删除所述自身多肽的跨膜或疏水区域。为产生N-SSV的一个具体的适合的修饰是去除该胞外或分泌的自身多肽的信号序列。可选择地，可以突变该信号序列，从而使所述相关蛋白不再分泌。还预想了相互不排斥的其他修饰，该修饰能阻止分泌并将蛋白滞留在胞内，所述修饰包括将所述蛋白定位于特定胞内区域的信号，所述信号例如膜锚定器(跨膜结构域、脂质修饰等等)、核定位信号(NLS)、ER滞留信号、溶酶体定位信号等等。可选择地，可将诸如泛素化的蛋白降解信号添加到所述蛋白，使得该蛋白的显著片段在细胞内被降解和酶切，这与分泌相反。
在特别的实施方案中，本发明提供了治疗或预防IDDM的改良方法，包括对个体给予经修饰的编码并能表达自身多肽的自身载体，该自身多肽包含与IDDM相关的一种或多种自身抗原表位。治疗或预防IDDM的改良方法包括对个体给予有效量的经修饰的表达与IDDM相关的分泌的自身抗原的非分泌形式的自身载体，相对于未经修饰的自身载体，使得阻止宿主细胞进行分泌。在一些实施方案中，经修饰以阻止分泌的自身肽分泌的自身载体是N-SSV，其中已除去该分泌的自身多肽的所述信号序列。为治疗IDDM给予的该N-SSV可以包括编码与IDDM相关的一种或多种自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽例如：前胰岛素原、胰岛素原(例如，SEQ ID NO：2)、胰岛素和/或胰岛素B链。可选择地，可以给予编码不同自身多肽的多种N-SSV。在优选实施方案中，给予的所述N-SSV编码前胰岛素原、胰岛素原(例如，SEQID NO：2)的非分泌的形式，其中去除了前胰岛素原的信号序列。
在其他实施方案中，提供了治疗或预防风湿性关节炎(RA)的改良方法，其包括对个体给予编码并能表达自身多肽的经修饰的自身载体，该自身多肽包括与RA相关的一种或多种自身抗原表位。治疗或预防RA的改良方法包括对个体给予有效量的经修饰的表达与RA相关的分泌的自身抗原的非分泌形式的自身载体，相对于相对未经修饰的自身载体，使得阻止宿主细胞进行分泌。在一些实施方案中，经修饰以阻止分泌的自身肽分泌的自身载体是N-SSV，其中已除去该分泌的自身多肽的所述信号序列。为治疗RA而给予的该N-SSV可以包括多核苷酸，该多核苷酸编码与RA相关的一种或多种自身多肽，其包括但不限于：II型胶原蛋白、IV型胶原蛋白和/或纤维蛋白。可选择地可以给予编码不同自身多肽的多种N-SSV。在优选实施方案中，该N-SSV编码II型胶原蛋白的非分泌形式，其中去除了所述信号序列。
非分泌的高表达自身载体(N-SHESV)
在本发明的其他实施方案中，用于治疗或阻止自身免疫性的改良方法包括对个体给予有效量的经修饰的自身载体，所述经修饰的自身载体经改造以提高与自身免疫性疾病相关的胞外或分泌的自身多肽的胞内或非分泌形式的表达，其中表达与分泌两者都相对于该未经修饰的自身载体。经修饰的经改造以提高胞外或分泌的自身多肽的编码的胞内或非分泌形式的表达的自身载体称作非分泌的高表达自身载体(N-SHESV)。N-SHESV包括编码并能表达与自身免疫性疾病相关的分泌的自身多肽的多核苷酸，以及修饰，相对于所述未经修饰的自身载体，该修饰以非分泌形式表达增加量的该自身多肽。N-SSV还包括可操作的组合：启动子；编码胞外或分泌的自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包含与该自身免疫性疾病相关的至少一种自身抗原表位；转录终止子；以及为表达增加量的所述自身多肽而进行的至少一种修饰，和为阻止宿主细胞分泌该自身多肽而进行的至少一种修饰，其中两种修饰都相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体。
在本发明的某些实施方案中，提供了用于治疗或预防诸如胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)的自身免疫性疾病的改良方法，包括对个体给予经修饰的自身载体，相对于编码同样的自身多肽的未经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体经改造以提高与IDDM相关的编码的自身多肽的表达，以及相对于未经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体经改造以表达与IDDM相关的分泌的自身抗原的非分泌形式使得阻止宿主细胞分泌。在一些实施方案中，经修饰的提高非分泌的自身多肽表达的自身载体是N-SHESV，其包含内含子，该内含子位于所述启动子区域下游和非分泌形式的起始密码子的紧邻上游，所述非分泌形式为与IDDM相关的分泌的自身多肽的编码的非分泌形式。为治疗或预防IDDM给予的该N-SHESV可以包含编码胰岛素原(例如，SEQ ID NO：2)、胰岛素和胰岛素B的一种或多种的多核苷酸。可选择地，可以给予编码不同自身多肽的多种N-SHESV。在优选实施方案中，为治疗或预防IDDM给予的该N-SHESV包含内含子A或β-球蛋白/Ig嵌合内含子，其位于编码该自身多肽胰岛素原(SEQ ID NO：2)的多核苷酸的起始密码子上游，该自身多肽胰岛素原缺少前胰岛素原的信号序列。在更为优选实施方案中，为治疗或预防IDDM而给予的该N-SHESV包含β-球蛋白/Ig嵌合内含子，其位于编码该自身多肽胰岛素原(SEQ ID NO：2)的多核苷酸的起始密码子上游，该自身多肽胰岛素原缺少前胰岛素原的信号序列。
分泌的自身载体(SSV)
在相互不排斥的其他实施方案中，用于治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法包括对个体给予有效量的经修饰的包含多核苷酸的自身载体，该多核苷酸编码通常不分泌的自身蛋白、自身多肽或自身肽的分泌形式。该非分泌的自身蛋白或自身多肽的实例包括：诸如，例如髓磷脂蛋白(髓磷脂碱性蛋白和蛋白脂质蛋白)的胞内膜结合自身多肽；诸如，例如髓磷脂蛋白(髓磷脂少突细胞糖蛋白)的跨膜自身多肽；或胞质或核自身多肽(即组蛋白2B、组蛋白3、核糖核蛋白小体多肽A、核糖核蛋白小体多肽C、蛋白酪氨酸磷酸酶样IA-2和胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白)。本文将经修饰的经改造以编码不分泌的自身蛋白、自身多肽或自身肽(例如，跨膜或胞内自身多肽)的分泌形式的自身载体称作分泌的自身载体(SSV)。SSV包含编码并能表达与自身免疫性疾病相关的膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸，以及使宿主细胞分泌该自身多肽的修饰。SSV还包含可操作的组合：启动子；编码膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包含与该自身免疫性疾病相关的至少一种致病表位；转录终止子；以及至少一种修饰，相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体，该修饰允许宿主细胞分泌该自身多肽。
在某些变化中，SSV编码的分泌的自身多肽是胞内自身蛋白、自身多肽或自身肽的经改造的形式，所述经改造的形式包含使宿主细胞能分泌该自身多肽的修饰。产生SSV的一种特别适合的修饰是向该胞内自身多肽添加N末端信号序列，以允许宿主细胞进行分泌。可使用来自任何内源分泌蛋白的信号序列，或其嵌合和/或共有形式。除该信号序列之外，该修饰还可以包括膜结合信号，其包括，例如，跨膜结构域或GPI锚定器，从而使胞内表位在胞外表达。(GPI锚定器(磷脂酰肌醇多糖)是膜附着蛋白C末端的常见修饰。它由与成熟蛋白C末端氨基酸相连的疏水磷脂酰肌醇基团组成，该连接通过含碳水化合物的连接子(与磷酰基乙醇胺残基相连的葡糖胺和甘露糖)。疏水肌醇基团内的两种脂肪酸将该蛋白锚定于膜。)在其他变化中，SSV编码的分泌的自身多肽是跨膜自身多肽的经改造的形式，所述经改造的形式包括修饰，该修饰允许所述自身多肽胞内部分的分泌，该分泌带有或不带有所述自身多肽的胞外部分。一种适合的修饰包括移除该跨膜结构域。可选择地，移除该跨膜自身多肽的胞外部分，并向该胞内部分N末端添加信号序列。在其他变化中，SSV编码的分泌的自身多肽包括修饰，该修饰使跨膜或膜结合(例如，GPI键的)自身多肽的胞外部分能以可溶形式与或不与该胞内部分一同分泌。一种适合的修饰包括移除该跨膜结构域或GPI键。在优选实施方案中，移除跨膜和胞内结构域，以使该自身多肽的胞外部分以可溶形式分泌。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防例如胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)的自身免疫性疾病的改良方法，包括对个体给予编码并能表达自身多肽的经修饰的自身载体，所述自身多肽包含与IDDM相关的一种或多种自身抗原表位。用于治疗或预防IDDM的改良方法包括对个体给予有效量的经修饰的编码与IDDM相关的膜结合或胞内自身蛋白、自身多肽或自身肽的分泌的自身多肽形式的自身载体。在一些实施方案中，所述经修饰的自身载体是通过添加信号序列进行改造以允许与IDDM相关的胞内自身多肽分泌的SSV。为治疗或预防IDDM给予的该SSV可以包括多核苷酸，该多核苷酸编码一种或多种自身蛋白，例如：谷氨酸脱羧酶(GAD)-67；酪氨酸磷酸酶IA-2；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶相关蛋白(IGRP)；和/或胰岛细胞抗原69kD，但不能是GAD-65。可选择地，可以给予编码不同自身蛋白、自身多肽或自身肽的多种SSV。在优选实施方案中，为治疗或预防IDDM而给予的该SSV编码包含信号序列的该自身多肽酪氨酸磷酸酶IA-2。
在本发明其他实施方案中，提供了用于治疗或预防多发性硬化(MS)的改良方法，包括对个体给予编码并能表达自身多肽的经修饰的自身载体，所述自身多肽包含与MS相关的一种或多种自身抗原表位。用于治疗或预防MS的改良方法包括对个体给予有效量的经修饰的自身载体，相对于编码同样的自身蛋白、自身多肽或自身肽的未经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体编码由宿主细胞分泌的与MS相关的膜结合或胞内自身蛋白、自身多肽或自身肽。在一些实施方案中，所述经修饰的自身载体是通过添加信号序列进行改造以分泌胞内自身多肽的SSV。在其他实施方案中，经改造的SSV允许跨膜自身多肽的胞外结构域以可溶形式分泌，所述改造是通过移除所述跨膜和胞内结构域。为治疗或预防MS而给予的该SSV可以包括多核苷酸，该多核苷酸编码一种或多种自身蛋白，例如：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂结合的少突细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)和/或髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)。可选择地，可以给予编码不同自身蛋白、自身多肽或自身肽的多种SSV。在优选实施方案中，为治疗或预防MS给予的该SSV编码含有信号序列的该自身多肽MBP。在其他优选实施方案中，为治疗或预防MS给予的该SSV编码缺少所述跨膜和胞内结构域的该自身多肽MOG以允许该胞外区域以可溶形式分泌。
分泌的高表达自身载体(SHESV)
在本发明其他实施方案中，用于治疗或预防自身免疫性疾病的改良方法包括向个体给予有效量的经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体经改造以提高与自身免疫性疾病相关的膜结合或胞内自身多肽的分泌形式的表达，其中表达和分泌两者都相对于所述未经修饰的自身载体。把经修饰的经改造以提高膜结合或胞内自身多肽的编码的分泌形式表达的自身载体称作分泌的高表达自身载体(SHESV)。SHESV包括编码并能表达与自身免疫性疾病相关的膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸，以及修饰，相对于所述未经修饰的自身载体，该修饰表达增加量的分泌形式的该自身多肽。SHESV还包括可操作的组合：启动子；编码膜结合或胞内自身多肽的多核苷酸，该自身多肽包括与该自身免疫性疾病相关的至少一种自身抗原表位；转录终止子；以及为表达增加量的该自身多肽而进行的至少一种修饰，和为使宿主细胞能分泌该自身多肽的至少一种修饰，其中两种修饰都是相对于包含所述启动子、多核苷酸和转录终止子的未经修饰的自身载体。
在本发明的其他实施方案中，提供了用于治疗或预防诸如多发性硬化(MS)的自身免疫性疾病的改良方法，包括对个体给予经修饰的自身载体，相对于编码同样的自身多肽的未经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体经改造以提高与MS相关的编码的自身多肽的表达，以及相对于未经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体经改造以表达与MS相关的膜结合或胞内自身多肽的分泌形式使得宿主细胞发生分泌。本文把经修饰以提高膜结合或胞内自身多肽的编码的分泌形式的表达的自身载体称作分泌的高表达自身载体(SHESV)。在一些实施方案中，所述SHESV包含内含子，该内含子位于所述启动子区域下游和多核苷酸起始密码子的紧邻上游，该多核苷酸编码与MS相关的跨膜或胞内自身多肽的分泌形式。为治疗或预防MS而给予的该SHESV可以包括与MS相关的多核苷酸，例如：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂结合的少突细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)和/或髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)。可选择地，可以给予编码不同自身多肽的多种SHESV。在优选实施方案中，为治疗或预防MS给予的该SHESV包含β球蛋白/Ig嵌合内含子，其位于编码所述自身多肽MOG的多核苷酸的起始密码子上游，该自身多肽MOG缺乏跨膜和胞内结构域以允许以可溶形式分泌所述胞外区域。
使用宿主细胞内重组蛋白表达的公知方法可在体外测定对自身载体的修饰，相对于未经修饰的自身载体，所述修饰改变编码的自身蛋白、自身多肽或自身肽的表达水平和/或分泌。转染宿主细胞，例如哺乳动物原代细胞或细胞系，包括，例如，HEK293、COS或CHO细胞，所述转染使用未经修饰的自身载体或经修饰的自身载体，该经修饰的自身载体具有下列改变的一种或多种：1)为表达增加量的所述自身多肽而进行的至少一种修饰，2)为表达分泌的或膜结合自身多肽的非分泌的或非膜结合形式而进行的至少一种修饰；或3)为允许非分泌的自身多肽分泌而进行的至少一种修饰。随后在允许该自身多肽表达的条件下培养所述转染的宿主细胞。通常，该宿主细胞和培养条件的设计在于模拟或接近机体内的生理条件。随后使用诸如例如蛋白印记分析、ELISA或FACS的已知方法测定使用未经修饰的自身载体转染的宿主细胞与经修饰的自身载体转染的宿主细胞内编码的自身多肽的相对蛋白表达水平，该经修饰的自身载体具有为提高编码的自身多肽表达而进行的至少一种改变。经ELISA测定：在优选实施方案中，HESV的所述蛋白表达高出该未经修饰的自身载体的倍数约2倍到约50倍；在更为优选实施方案中，所述提高的表达高出该未经修饰的自身载体的倍数约5倍到约35倍；并且在最为优选的实施方案中，所述提高的表达高出该未经修饰的自身载体的倍数约10到约30倍。而且通过比较所述培养基或上清液内蛋白水平和细胞裂解物内蛋白水平，能够测定比较自身蛋白的分泌和不分泌。此外，例如使用免疫组织化学或免疫荧光可以测定相关蛋白定位。在优选实施方案中，N-SSV编码的分泌的自身多肽事实上完全不分泌，以致于在转染后细胞的上清液内蛋白水平并未明显高于背景，其测定是通过ELISA。在可选择的优选实施方案中，发现所述上清液内分泌有水平高于背景的SSV编码的非分泌的自身多肽，其测定是通过ELISA。
在某些变化中，用于治疗自身免疫性疾病的方法还包括给予包括免疫调节序列(IMS)的多核苷酸。用于本发明的IMS包括下列核心六聚物：
5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’
或
5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’；
其中X和Y是任何天然存在或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。
IMS核心六聚物的5’和/或3’可以侧翼连接任何组合或任意数目的核苷酸或核苷。优选地，IMS的长度范围为6到100碱基对，并且最优选地，长16-50碱基对。IMS还可作为更大DNA片段的部分递送，其范围从100到100,000碱基对。IMS能引入或已存在于DNA质粒、病毒载体和基因组DNA。最优选地，IMS的大小范围还能从6(无侧翼序列)到10,000碱基对或更大。可以构建侧翼于该六聚物核心的序列，使其基本上匹配出现在任何已知免疫抑制性序列(IIS)中的侧翼序列。例如，侧翼序列TGACTGTG-Pu-Pu-X-Y-Pyr-Pyr-AGAGATGA，其中TGACTGTG和AGAGATGA为侧翼序列。另一优选侧翼序列引入一系列的嘧啶(C、T和U)，或作为重复两次或多次的单一嘧啶，或作为两个长或更长的不同嘧啶的混合物。已使用不同侧翼序列测试抑制性调节序列。作为抑制性寡核苷酸的侧翼序列的进一步实例还包括在下列参考文献中：美国专利号6,225,292和6,339,068，Zeuner et al.，Arthritisand Rheumatism，46：2219-24，2002。
适于使用本发明的经修饰的自身载体进行给药的特别的IMS包括包含如下六聚物序列的寡核苷酸：
1.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，其包含如下GG双核苷酸核心：GTGGTT、ATGGTT、GCGGTT、ACGGTT、GTGGCT、ATGGCT、GCGGCT、ACGGCT、GTGGTC、ATGGTC、GCGGTC、ACGGTC等等；
2.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，其包含如下GC双核苷酸核心：GTGCTT、ATGCTT、GCGCTT、ACGCTT、GTGCCT、ATGCCT、GCGCCT、ACGCCT、GTGCTC、ATGCTC、GCGCTC、ACGCTC等等；
鸟嘌呤和次黄嘌呤能取代腺嘌呤，和/或尿嘧啶能取代胞嘧啶或胸腺嘧啶，并且基于上述方针可进行这些取代。
在本发明的某些实施方案中，所述IMS核心六聚物区域通过多聚G区域位于所述5’或3’末端，或者同时位于该5’和3’末端。本文使用的“多聚G区域”或“多聚G基序”指由至少两(2)个邻接鸟嘌呤碱基组成的核酸区域，通常由2-30或2-20个邻接鸟嘌呤组成。在一些实施方案中，所述多聚G区域具有2-10、4-10或4-8个邻接鸟嘌呤碱基。在某些优选实施方案中，所述侧翼多聚G区域邻接于该核心六聚物。但是在其他实施方案中，所述多聚G区域通过非多聚G区域(非多聚G连接子)与该核心六聚物连接；通常，所述非多聚G连接子区域具有不超过6个、更典型地不超过4个和最典型地不超过2个核苷酸。
IMS还包括至少八个核苷酸长的抑制性寡核苷酸，其中该寡核苷酸形成G四分体，该G四分体的圆二色性(CD)值大于约2.9，并且鸟苷的数量至少为2(本文引入国际专利申请号WO 2004/012669以供参考)。CD定义为左手和右手圆偏振光的差异吸收。G四分体是G富集的DNA片段，能形成复杂的二级和/或三级结构。更为具体地，1)G四分体包括平面连接的四个鸟苷，其按环状氢键排列，其包括非Watson Crick碱基配对，和2)G四分体需要两个更为邻接的鸟苷或六聚物区域，其中超过50％的所述碱基是鸟苷。实例包括具有至少1个并且优选地2-20个TTAGGG基序的寡核苷酸。其他有用的抑制性寡核苷酸包括但不限于符合下列之一的有用的抑制性寡核苷酸：(TGGGCGGT)x，其中x优选地为2-100，并且更为优选地为2-20；GGGTGGGTGGGTATTACCATTA；TTAGGGTTAGGGTCAACCTTCA；或(G)GG(C/G)AAGCTGGACCTTGGGGG(G)。
IMS优选地是包含未甲基化的GpG寡核苷酸的寡核苷酸。可选择的实施方案包括其中一种或多种腺嘌呤或胞嘧啶残基被甲基化的IMS。在真核细胞中，胞嘧啶和腺嘌呤残基通常能被甲基化。
IMS可以是稳定的和/或不稳定的寡核苷酸。稳定的寡核苷酸指在体内相对地抗降解的寡核苷酸，该降解通过核酸外切酶、核酸内切酶和其他降解途径进行。优选的稳定的寡核苷酸具有经修饰的磷酸盐骨架，并且最为优选的寡核苷酸具有硫代磷酸酯修饰的磷酸盐骨架，其中至少一种所述磷酸根氧由硫替代。骨架磷酸盐基团修饰包括磷酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键，其能向IMS提供抗菌性质。IMS优选稳定的寡核苷酸，优选地使用硫代磷酸酯稳定的寡核苷酸。
可选择地，稳定的寡核苷酸包括：烷基磷酸三酯和磷酸二酯，其中带电氧被烷化；芳基磷酸酯和烷基磷酸酯，它们是非离子DNA类似物，其中带电磷酸根氧由芳香基或烷基替代；或/和在一端或两端含六聚乙二醇或四聚乙二醇、或另一个二醇的寡核苷酸。可使用可选择的空间构型将糖侧基附于IMS的核苷碱基上。
位于该调节二核苷酸侧翼的IMS核苷酸碱基可以是已知天然存在的碱基或合成的非天然碱基。使用常规技术可以将寡核苷酸引入该IMS的内部区域和/或端部作为附着点，即作为附着或连接另一分子的手段，所述分子包括，例如，脂质、蛋白、肽、糖脂、碳水化合物、糖蛋白或其他的免疫调节性治疗剂。还可以以本领域普通技术人员公知的任何方式修饰该IMS的碱基、糖部分、磷酸盐基团和/或端部，以构建具有除IMS的调节性活性之外的所需性质的IMS。例如，糖部分可以以任何空间构型附于IMS的核苷酸碱基。
对寡核苷酸进行这些磷酸盐基团修饰的技术为本领域公知，并且不需要详细的解释。为回顾这样的有用技术，制备用作靶核苷酸产物的磷酸三酯中间体，并且使用含水碘或诸如无水胺的其他试剂将其氧化为天然存在的磷酸三酯。产生的寡核苷酸氨基磷酸酯可使用硫处理以产生硫代磷酸酯。可以应用同样的常规技术(除硫处理步骤之外)以从磷酸甲酯产生甲基亚磷酰胺。例如，第4,425,732、4,458,066、5,218,103和5,453,496号美国专利；Tetrahedron Lett，at 21：4149 25(1995)，7：5575(1986)和25：1437(1984)；以及Journal Am.ChemSoc.，93：6657(1987)进一步描述了关于磷酸盐基团修饰技术的细节，本文引入上述文件的公开文本以供参考。
特别有用的磷酸盐基团修饰是转化为该IMS寡核苷酸的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯形式。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯较之其未经修饰的寡核苷酸对应物，在体内更能抵抗降解，这使所述宿主更能获得本发明的IMS寡核苷酸。
IMS寡核苷酸能够合成，其使用本领域公知的技术和核酸合成设备。参见，例如，Ausubel，et al，Current Protocols in Molecular Biology，Chs.2 and 4(分子生物学现行规范，第2和4章)(Wiley Interscience，1989)；Maniatis，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(Cold Spring Harbor Lab.，New York，1982)；第4,458,066号美国专利；和第4,650,675号美国专利，本文引入每一篇以供参考。
可选择地，通过突变分离到的微生物免疫刺激性寡核苷酸以用竞争性二核苷酸取代所述侧翼核苷酸内天然存在的CpG基序能够获得免疫抑制性寡核苷酸。依赖核酸杂交的筛选步骤实现了从任何生物体分离任何多核苷酸序列，前提是能获得所述合适的探针或抗体。能够化学合成寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针对应编码所述蛋白的序列的一部分。这需要已知氨基酸序列的寡肽小段。还能从遗传密码推导编码该蛋白的DNA序列，尽管必须考虑所述密码子的简并度。
例如，可以筛选cDNA文库，所述cDNA文库据信包括含ISS的多核苷酸，所述筛选通过向卵母细胞注射源自cDNA的各种mRNA，留出足够时间，使所述cDNA基因产物开始表达，并通过测试所需cDNA表达产物的存在而完成，所述测试例如，通过使用特异于所关注多核苷酸编码的肽的抗体，或者通过使用针对由所关注多核苷酸编码的肽的重复基序和组织表达类型特征的探针。可选择地，使用特异于该肽的抗体可以间接筛选cDNA文库，寻找所关注的具有至少一种表位肽的表达。所述抗体可以是多克隆来源的或单克隆来源的，并且可用于检测表达产物，该表达产物指示所关注cDNA的存在。
一旦获得所述包含免疫刺激性序列的多核苷酸，便可以使用常规技术通过例如酶切将其缩短至所需的长度。随后将该免疫刺激性序列寡核苷酸产物内的CpG基序突变以用“抑制”二核苷酸(使用本发明方法鉴定的)取代该CpG基序。公知在具有已知序列DNA内的特定位点进行取代突变的技术，例如通过PCR的M13引物突变。该IMS是非编码的，因此进行取代突变时，无需关心维持开放阅读框。然而，为在体内使用，应给予基本上纯的该多核苷酸起始材料、免疫刺激性序列中间体或IMS突变产物(即使用本领域普通技术人员公知和选择的可获得的技术时，尽可能不含天然存在的污染物和LPS)。
可以单独使用本发明的IMS，或者将该IMS以顺式或反式引入重组自身载体(质粒、粘粒、病毒或反转录病毒)，其反过来可以编码可由重组表达载体递送的多肽。为方便起见，优选地，给予未引入表达载体的该IMS。然而，如果需要引入表达载体，使用本领域普通技术人员公知的常规技术可以完成所述引入。(通常参见，例如，Ausubel，Current Protocols in Molecular＇Biology，上述。还参见Sambrook andRussell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(3rd ed.2001)(第三版，2001)；Sambrook et al，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nded.1989)(第二版，1989)。)。
本领域公知载体构建和细胞转染技术，并且本领域技术人员熟悉描述具体条件和步骤的所述标准来源材料。制备编码自身多肽的该自身载体，并使用通常可获得的核酸分离技术分离该自身载体。该载体经纯化，不含细菌内毒素，作为治疗剂递送于人。
本发明所述载体的构建使用本领域公知的标准连接和限制技术(通常参见，例如Ausubel et al.，上述；Sambrook and Russell，上述；Sambrook，上述)。分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸经酶切、裁剪，再以所需形式重新连接。使用例如DNA序列分析标准方法能够确认DNA构建体的序列(参见，例如，Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci，74，5463-5467)。
用于本文提供的方法的一种特别适合的核酸载体是核酸表达载体，其中非CpG二核苷酸取代一种或多种化学式为5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’的CpG二核苷酸，由此产生免疫刺激性活性降低的载体。例如，CpG二核苷酸的胞嘧啶可用鸟嘌呤取代，因而产生化学式为5’-嘌呤-嘧啶-G-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-G-G-嘧啶-嘧啶-3’的具有GpG基序的IMS区域。该胞嘧啶还可用其他任何非胞嘧啶核苷酸取代。可以使用，例如定位突变完成所述取代。通常地，被取代的CpG基序是没有在该载体重要控制区域(例如，启动子区域)的CpG。此外，如果CpG位于表达载体的编码区域内，通常选择非胞嘧啶取代以产生沉默突变或对应于编码的氨基酸的保守取代的密码子。
例如，在某些实施方案中，用于该自身载体构建的所述载体为经修饰的pVAX1载体，其中化学式为5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’的一种或多种CpG二核苷酸通过用非胞嘧啶核苷酸取代该CpG二核苷酸的胞嘧啶而发生突变。所述pVAX1载体为本领域公知，并且商业上可从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的pVAX1载体在CpG基序内具有下列胞嘧啶向非胞嘧啶的取代：在核苷酸784、1161、1218和1966，胞嘧啶向鸟嘌呤；在核苷酸1264、1337、1829、1874、1940和1997，胞嘧啶向腺嘌呤；以及在核苷酸1963和1987，胞嘧啶向胸腺嘧啶；另外有在核苷酸1831、1876、1942和1999，胞嘧啶向鸟嘌呤的突变。(前述核苷酸序号指定根据Invitrogen提供的pVAX1的编号系统。)因而将该构建的载体命名为pBHT1。
为用于该自身载体而选择的核苷酸序列可以源自已知来源，例如，使用标准技术通过从包含所需基因或核苷酸序列的细胞中分离该核苷酸。类似的，使用本领域公知的多核苷酸合成的标准模式可以合成产生所述核苷酸序列。参见，例如，Edge et al.，Nature 292：756，1981；Nambair et al.，Science 223：1299，1984；Jay et al.，J.Biol.Chem.259：6311，1984。通常，可以通过Edge等人(上述)和Duckworth等人(Nucleic Acids Res.9：1691，1981)描述的磷酸三酯方法、或者通过Beaucage等人(Tet.Letts.22：1859，1981)和Matteucci等人(J.Am.Chem.Soc.103：3185，1981)描述的亚磷酰胺方法制备合成的寡核苷酸。也可以使用商业上可获得的寡核苷酸自动合成仪制备合成的寡核苷酸。因而可使用用于特定氨基酸序列的适合密码子设计所述核苷酸序列。一般来说，会选择用于在指定宿主中表达的优选密码子。从标准方法制备的重叠寡核苷酸组装该全序列，并组装为完整的编码序列。参见，例如，Edge et al.(上述)；Nambair et al.(上述)和Jay et al.(上述)。
本文使用的获得核酸序列的另一种方法是通过重组手段。因而，可以使用标准限制酶和步骤从携带该核酸的质粒上切下所需核苷酸序列。通过使用适合的限制酶和步骤进行处理，完成位点特异性DNA酶切。在本领域通常了解的条件下完成位点特异性DNA酶切，并且所述条件的特别之处由商业上可获得的限制酶厂家具体说明。如果需要，使用标准技术通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳可以完成所切片段的大小分离。
用于分离特异性核酸还有另一常规方法是通过聚合酶链式反应(PCR)(Mullis et al.，Methods Enzymol.155：335-350，1987)或反转录PCR(RT-PCR)。通过RT-PCR可以从RNA分离特异性核酸序列。通过本领域技术人员已知的技术从例如细胞、组织或整个生物体中分离RNA。随后使用多聚dT或随机六聚物引物、脱氧核苷酸以及合适的反转录酶产生互补DNA(cDNA)。随后通过PCR可以从产生的cDNA中扩增所需的多核苷酸。可选择地，可以从适当的cDNA文库直接扩增所关注的多核苷酸。合成与所关注多核苷酸序列的5’及3’两端杂交的引物并用于所述PCR。所述引物还可以包含位于5’端的容易酶切和容易将扩增序列连接到类似的限制性酶切质粒上的特异性限制酶位点。
该经修饰的自身载体的表达盒使用在宿主细胞中有功能的启动子。一般来说，将包含源自与宿主细胞一致的种类的启动子和控制序列的载体与特定的宿主细胞一起使用。适于与原核宿主一起使用的启动子示例性包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶-色氨酸(trp)启动子系统和诸如tac启动子的杂合启动子。然而，其他有功能的细菌启动子也是合适的。除原核生物之外，还可以使用诸如酵母培养物的真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母(common baker’s yeast)是最常用的真核微生物，尽管通常可获得大量其他品系。可以从各种来源(例如，诸如多瘤病毒、猿病毒40(SV40)、腺病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和优选的巨细胞病毒(CMV)的病毒基因组)，或从异源哺乳动物启动子(例如β肌动蛋白启动子)获得控制哺乳动物宿主细胞内载体转录的启动子。通常以SV限制片段获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒的复制原点。通常以HindIII限制片段获得人巨细胞病毒的即时早期启动子。当然，宿主细胞或相关物种的启动子在本文也是有用的。
在一个实施方案中，编码两种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽的DNA由单一自身载体连续编码，所述自身载体利用内部核糖体进入序列(IRES)或从单一DNA分子表达多种蛋白的其他元件。
本文使用的载体可以包含选择基因，也称选择标记。选择基因编码蛋白，为所述载体转化的宿主细胞存活或生长所必需。用于哺乳动物细胞的适合的选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、鸟氨酸脱羧酶基因、多种药物抗性基因(mdr)、腺苷脱氨酶基因以及谷氨酸盐合酶基因。如果所述选择标记成功转移至哺乳动物宿主细胞，那么只有置于选择性压力下，该转化的哺乳动物宿主细胞便能存活。有两类广泛使用且截然不同的选择性方式。第一类基于细胞代谢及突变细胞系的使用，所述突变细胞系缺乏在无添加物的培养基上独立生长的能力。第二类称作显性选择，它指用于任何细胞类型的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物以阻止宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞会表达传达药物抗性的蛋白，并且会在该选择下存活。这些显性选择的实例使用药物新霉素(Southern andBerg(1982)J.Molec.Appl.Genet.1，327)、霉酚酸(Mulligan and Berg(1980)Science 209，1422)或潮霉素(Sugden et al.(1985)Mol.Cell.Bio.5，410-413)药物。上述已给出的三种实例使用真核控制下的细菌基因，以分别传达对所述适合药物新霉素(G418或庆大霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。
可选择地，本文使用的载体在宿主细胞内繁殖，其使用基于阻遏物滴定的无抗生素的选择(Cranenburgh et al.，2001)。经修饰的所述载体包含lac操纵子，其作为lac启动子的部分或者具有lacO1和lacO3操纵基因，所述操纵基因具有pUC系列质粒载体中发现的最适间距。可选择地，可将该lacO1操纵基因或lacO的回文形式作为单一或多拷贝用于分离(Cranenburgh et al.，2004)。可以将该lac操纵子序列引入该载体内任何地方的单一或多位点，只要不干扰该载体的其他功能性组分。在优选实施方案中，使用合成的大肠杆菌(Escherichia coli)lac操纵子二聚物操纵基因(Genbank登录号K02913)。可以将该lac操纵子添加至缺少适合选择标记的载体以提供选择，以及除另一选择标志物外，该lac操纵子被添加或用于代替选择标记(尤其是抗生素抗性标记)以使该载体更适于治疗性应用。在lac启动子(lacOP)控制的情况下，可在经遗传修饰的具有包括dapD的关键基因的E.coli中选择含有该lac操纵子的载体，这样通过滴定对lacOP的lac阻遏使得该经修饰的宿主细胞存活，并且使得dapD表达。适合的E.coli菌株包括DH1lacdapD和DH1lacP2dapD(Cranenburgh et al.，2001)。
为进行体外评估，使用经修饰的自身载体可以转化宿主细胞，并且在常规营养培养基上培养，所述培养基经修饰以适于诱导启动子、选择转化子或扩增基因。用于宿主细胞转染的一种适合的方法是Graham and van der Eb(1973)Virology 52，456-457中的磷酸钙共沉淀法。可选择的转染方法是电穿孔、DEAE葡聚糖法、脂质体转染和基因抢(Kriegler(1990)Gene Transfer and Expression：A LaboratoryManual(基因转移与表达：实验室手册)，Stockton Press)。诸如温度、pH等适于宿主细胞表达的培养条件为本领域公知，并且对本领域技术人员来说是显而易见的。
如果使用重组表达载体作为本发明所述IMS-ODN的载体，则质粒和粘粒因其缺少致病性而特别优选。然而，质粒和粘粒比病毒经受更快速地体内降解，因此可能不会递送能预防或治疗炎性或自身免疫性疾病的足够剂量的IMS-ODN。
本发明的经修饰的自身载体能配制成用作药物的多核苷酸盐。可以使用非毒性无机或有机碱制备多核苷酸盐。无机碱盐包括钠、钾、锌、钙、铝、镁等等。有机非毒性碱包括一级胺盐、二级胺盐和三级胺盐等。能以冻干形式配制该自身DNA多核苷酸盐，递送前再溶解，例如无菌水或盐溶液。可选择地，能在溶液、悬浮液或包含用于递送的水基或油基载体的乳剂中配制自身DNA多核苷酸盐。在一个优选实施方案中，在具有生理水平钙(0.9mM)的磷酸盐缓冲盐水中冻干所述DNA，随后在给药前使用无菌水再溶解。可选择地，在含有更多数量的Ca++溶液(1mM和2mM之间)中配制所述DNA。在没有特异性离子型的情况下还能够配制该DNA。
存在广泛的多种方法向个体递送多核苷酸，如本文所定义的。例如，使用包括阳离子脂质体的阳离子聚合物能配制编码自身多肽的所述多核苷酸。其他脂质体也代表配制和递送自身多核苷酸的有效手段。可选择地，该自身DNA可引入用于药理递送的病毒载体、病毒颗粒或细菌。病毒载体可以是能够感染的、减毒的(具有降低疾病引发能力的突变)或复制缺陷型的。使用自身DNA以预防致病性自身蛋白沉淀、积聚或活性的方法可以通过使用病毒载体或其他递送系统来增强，所述递送系统增强抗编码的自身蛋白的体液反应。在其他实施方案中，该DNA可偶联到固体支持物，所述固体支持物包括金颗粒、基于多糖的支持物，或者能够注射、吸入或通过粒子轰击(基因枪递送)而递送的其他颗粒或小珠。本领域已知用于递送核酸制剂的方法。参见，例如，第5,399,346、5,580,859和5,589,466号美国专利。已开发了大量基于病毒的系统，用于转移至哺乳动物细胞。例如，已描述了反转录病毒系统(第5,219,740号美国专利；Miller et al，Biotechniques7：980-990，1989；Miller，Human Gene Therapy 1：5-14，1990；Scarpa et al，Virology 180：849-852，1991；Burns et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：8033-8037，1993；和Boris-Lawrie and Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109，1993)。还已经描述了大量腺病毒载体，参见，例如，(Haj-Ahmad et al.，J.Virol.57：267-274，1986；Bett et al，J.Virol.67：5911-5921，1993；Mittereder et al，Human Gene Therapy 5：717-729，1994；Seth et al，J.Virol.68：933-940，1994；Barr et al，Gene Therapy1：51-58，1994；Berkner，BioTechniques 6：616-629，1988；and，Rich et al，Human Gene Therapy 4：461-476，1993)。也已开发出腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。使用本领域公知技术可容易地构建AAV载体。参见，例如，第5,173,414和5,139,941号美国专利；国际公开号WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski et al，Molec.Cell.Biol.8：3988-3996，1988；Vincent et al，Vaccines 90(Cold Spring HarborLaboratory Press)1990；Carter，Current Opinion in Biotechnology3：533-539，1992；Muzyczka，Current Topics in Microbiol.And Immunol.158：97-129，1992；Kotin，Human Gene Therapy 5：793-801，1994；Shelling et al，Gene Therapy 1：165-169，1994；和Zhou et al.，J.Exp.Med.179：1867-1875，1994)。
递送本发明的多核苷酸也可以无需病毒载体。例如，可以在向个体递送前用脂质体包装该分子。通常使用能稳定地结合或夹住并滞留核酸的脂质体来完成脂质封装。回顾脂质体作为载体递送核酸的应用，参见，例如，Hug et al，Biochim.Biophys.Acta.1097：1-17，1991；Straubinger et al，in Methods of Enzymology，Vol.101，pp.512-527，1983。
治疗有效量的自身载体为约0.001mg到约1g的范围。优选的治疗量的自身载体为约10ng至约10mg的范围。最为优选的治疗量的自身载体为约0.025mg至6mg的范围。在某些实施方案中，每月一次给予该自身载体，持续6-12个月，随后每3-12个月以维持剂量给药。可以开发可选择的治疗方案，并且所述治疗方案的范围可以从每天一次到每周一次、到每隔一月一次、到每年一次给药，其取决于疾病的严重性、患者年龄、给予的自身多肽或多种自身多肽，以及普通治疗医师会考虑的此类其他因素。
在一个实施方案中，通过肌肉内注射递送该多核苷酸。在其他变化中，所述多核苷酸的递送通过鼻内、口服、皮下、皮内、静脉内、粘膜进行，按压该多核苷酸穿过皮肤，或者将其附着于金粒以递送到或穿过真皮(参见，例如WO 97/46253)。可选择地，可以通过使用或不使用脂质体或带电脂质的局部施用将核酸递送进皮肤细胞(参见，例如，第6,087,341号美国专利)。然而另一种选择是将该核酸作为吸入剂递送。在生理水平钙(0.9mM)的磷酸盐缓冲盐水中配制所述多核苷酸。可选择地，在含有更多数量Ca++的溶液(1mM和2mM之间)中配制该多核苷酸。使用诸如锌、铝和其他的其他阳离子配制该多核苷酸。可选择地，或此外，使用阳离子聚合物、形成阳离子脂质体的聚合物或在非阳离子脂质体中可以配制该多核苷酸。用于DNA递送的阳离子脂质体的实例包括使用1，2-双(油酰氧)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)和其他此类分子产生的脂质体。
在递送该多核苷酸之前，可以预处理该递送位点，其通过使用布比卡因(bupivicane)、心脏毒素或可能增强随后的多核苷酸递送的其他试剂。此类预处理方案的递送通常在递送治疗性多核苷酸前12-96小时进行；更为频繁地，在递送治疗性多核苷酸前24-48小时进行。可选择地，多核苷酸疗法之前不进行预处理。
在可选择的变化中，治疗自身性免疫疾病的方法还包括给予调节免疫反应的佐剂，其包括CpG寡核苷酸，以增强免疫反应。已显示CpG寡核苷酸或刺激性IMS能增强DNA疫苗接种的抗体反应(Kriegetal，Nature 374：546-9，1995)。该CpG寡核苷酸由纯化的骨架寡核苷酸组成，所述骨架抗体内降解，例如硫代磷酸酯化骨架。用于本发明的刺激性IMS包括下列核心六聚物：
5’-嘌呤-嘧啶-[C]-[G]-嘧啶-嘧啶-3’
或
5’-嘌呤-嘌呤-[C]-[G]-嘧啶-嘧啶-3’；
免疫刺激性IMS的核心六聚物的5’和/或3’可以侧翼连接任何组成或数量的核苷酸或核苷。优选地，刺激性IMS的长度范围为6到100碱基对，并且最为优选地，长16-50碱基对。刺激性IMS可作为DNA更大片段的部分而递送，其范围为100到100,000碱基对。刺激性IMS可引入或已存在于DNA质粒、病毒载体和基因组DNA。最为优选地，刺激性IMS的大小范围还能为6(无侧翼序列)到10,000碱基对，或更大。可以构建侧翼于该六聚物核心序列，使其基本上匹配出现在任何已知免疫刺激性序列(ISS)中的侧翼序列。例如，侧翼序列TGACTGTG-Pu-Pu-C-G-Pyr-Pyr-AGAGATGA，其中TGACTGTG和AGAGATGA为侧翼序列。另一优选侧翼序列引入一系列的嘧啶(C、T和U)，或作为重复两次或更多次的单一嘧啶，或作为两个长或更长的不同嘧啶的混合物。已使用不同侧翼序列测试抑制性调节序列，并且可以将其改变为刺激性调节序列。侧翼序列的进一步实例包括在下列参考文献中：第6,225,292和6,339,068号美国专利，Zeuner et al，Arthritis and Rheumatism，46：2219-24，2002。
适于使用本发明所述经修饰的自身载体给药的特别的刺激性抑制性IMS包括包含如下六聚物序列的寡核苷酸：
1.包含CG二核苷酸核心的5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS：GTCGTT、ATCGTT、GCCGTT、ACCGTT、GTCGCT、ATCGCT、GCCGCT、ACCGCT、GTCGTC、ATCGTC、GCCGTC、ACCGTC，等等；
鸟嘌呤和次黄嘌呤能取代腺嘌呤，和/或尿嘧啶能取代胞嘧啶或胸腺嘧啶，并且已说明的所述取代可基于上述方针进行。可选择地，如上对IMS的详细描述一样，可以将ISS-ODN包含进自身载体。特别有用的ISS包括小鼠最适CpG元件AACGTT。只要不扰乱其他功能性单元，单一ISS或多种ISS可以于该载体的单一或多种位点添加到经修饰的自身载体。在示例性实施例中，添加至经修饰的自身载体的该ISS包括一簇位于该启动子紧邻上游的五个小鼠最适CpG元件(AACGTT)。
可与其他物质联合给予该自身载体，所述其他物质诸如，例如药理学上的药剂、佐剂、细胞因子或编码细胞因子的载体。此外，使用细胞因子共递送时，为避免引发不需要的抗自身细胞因子反应的可能，还可以使用诸如维生素D3活性形式的化学免疫调节剂。在这点上，已显示1，25-二羟基维生素D3能通过肌内DNA免疫发挥佐剂效果。
可以使用该自身载体共给予编码已知能调节宿主免疫反应(例如，细胞因子)的蛋白的多核苷酸，。因此，根据本发明，可以使用编码免疫调节性细胞因子(例如，白介素、干扰素或集落刺激因子)的基因，或其功能性片段。已知大量该细胞因子的基因序列。因此，在本发明的一个实施方案中，将自身载体的递送与共给药联合，所述共给药使用至少一种下列免疫调节性蛋白或编码该蛋白的多核苷酸：IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ。
实施例
下列实施例为实现本发明的具体实施方案。提供所述实施例仅出于说明目的，并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
使用编码前胰岛素原II的自身载体通过DNA疫苗接种治疗NOD小鼠内建立的高血糖
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠发生自发的自身免疫性糖尿病，其具有许多与人胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)相同的临床上、免疫学上和组织病理学上的特征。通过DNA疫苗接种可以预防NOD小鼠中内糖尿病的发作，该DNA疫苗接种使用编码胰岛素B肽片段的自身载体(Urbanek-Ruiz et al.，2001)。在本研究中，研究了DNA疫苗接种以预防具有建立的高血糖的NOD小鼠内糖尿病的能力，所述DNA疫苗接种使用编码鼠前胰岛素原I或前胰岛素原II的自身载体。
产生编码鼠前胰岛素原I和前胰岛素原II的自身载体。通过PCR扩增编码全长前胰岛素原I(ppINS-I)或前胰岛素原II(ppINS-II)的多核苷酸，并将该多核苷酸连接至pBHT1的多克隆位点以分别产生mINS-I-pBHT1和mINS-II-pBHT1(pBHT500)。pBHT1是经修饰的pVAX1哺乳动物表达载体，该载体保留了其亲本质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)的主要结构性特征，包括CMV即时早期启动子/增强子、牛生长激素多聚腺苷化序列、用于细菌选择的卡那霉素抗性基因和pUC复制原点。通过使用定位突变技术去除所述载体的多核苷酸序列内29个免疫刺激性CpG序列(该序列具有共同基序：RYCpGYY；R＝A或G、Y＝C或T)中的12个将pVAX1修饰为pBHT1。按照厂家提供的方法，使用Qiagen Endo-free Mega-preps(Qiagen，Valencia，CA)纯化该DNA，以提供用于给药的基本上不含内毒素的自身载体。
NOD小鼠的治疗仅在小鼠发生高血糖后开始，其血糖水平达到190-250mg/dl(通常15-18周大)，使用One Touch II测量表(Johnson &Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法测定所述血糖水平。随后向患有此类明显临床上前糖尿病的小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠肌内给予ppINS-I、ppINS-II或非编码pBHT1载体，所述载体溶于具有0.9mM钙的磷酸盐缓冲盐水中，在每一四头肌注射总量50μg/动物。每两周一次注射DNA，持续8周。作为阳性对照，通过静脉注射以5μg/动物给予抗-CD3抗体，连续5天(Bisikirska & Herold，2004)。每周一次通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。糖尿病的进展定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl。
显示在图1的结果表明：相对于PBS注射的对照，使用编码鼠前胰岛素原II的自身载体而进行的DNA疫苗接种显著地减缓了高血糖NOD小鼠内糖尿病的进展。略多于50％注射ppINS-II的小鼠进展成糖尿病。相反，注射编码鼠前胰岛素原I或非编码pBHT1载体的小鼠以与对照注射PBS的动物相同的比率进展成糖尿病，到第8周有超过80％的动物进展成糖尿病。此外，如图2显示，观察到临床效果和胰岛素自身抗体效价降低的联系。在本研究最后，取小鼠血清，并通过放射性免疫试验测量抗胰岛素自身抗体效价。相对于未经治疗的小鼠，使用编码鼠前胰岛素原II的自身载体接种的小鼠表现出降低的平均胰岛素自身抗体指数，其与抗CD3阳性对照治疗的动物相似。
实施例2
使用编码前胰岛素原II的自身载体进行DNA疫苗接种对随后的免疫反应的效果。
本试验研究使用自身载体的DNA疫苗接种是否会影响随后的免疫反应。在受到胰岛素II(胰岛素II9-23)的肽片段激发前，使用编码鼠前胰岛素原II的自身载体接种NOD小鼠。然后检测针对使用所述胰岛素9-23肽的再刺激的随后的免疫反应。
在其6周大，出现高血糖征兆前，治疗NOD雌性小鼠。在每一四头肌向小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)。两天后，向所述小鼠肌内给予0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml mINS-II-pBHT1，在每一四头肌注射总量50μg/动物。每两周一次治疗动物，总计注射三次。最后一次DNA注射后两周，使用乳化于不完全弗氏佐剂的胰岛素II9-23肽免疫DNA疫苗接种的动物和对照动物。所述免疫后十天，收获该引流淋巴结，并完成ELISpot。使用细胞技术ELISpot平板阅读器将分泌干扰素(IFN)γ响应胰岛素II9-23肽刺激的细胞可视化。完成史蒂顿特(氏)t测验(Student＇st-test)以确定统计显著性。给予编码前胰岛素原II的DNA显著地减少了产生IFN-γ响应胰岛素II9-23肽再刺激的细胞数量(图3)，从而预防进展成糖尿病。
实施例3
使用编码前胰岛素原II的高表达自身载体(HESV)通过DNA疫苗接种治疗NOD小鼠内建立的高血糖。
本试验研究了将实施例1所述前胰岛素原II DNA自身载体修饰为HESV是否会影响用于减缓或预防进展成糖尿病的DNA疫苗接种的治疗效果。构建包含β-球蛋白/Ig嵌合内含子的高表达自身载体(HESV)，所述内含子位于编码前胰岛素原II的多核苷酸上游。随后使用该经修饰的自身载体接种患有已建立的高血糖的NOD小鼠。
产生的编码前胰岛素原II的HESV不同于实施例1所述的用于本研究的编码前胰岛素原II的自身载体(mINS-II-pBHT1)，因为它包含嵌合的β-球蛋白/Ig内含子，其位于所述启动子区域下游和所述前胰岛素原起始密码子的紧邻上游。如上所述，将全长前胰岛素原II克隆至经修饰的pVAX1质粒载体pBHT1以产生质粒pBHT500。构建源于pBHT1的质粒，其包含来自商业上可获得的载体pTarget(Promega，Madison，WI)的嵌合内含子，该内含子位于CMV启动子/增强子区域(pBHT520)下游。通过使用HindIII和XbaI的限制核酸酶酶切分离来自pBHT500的所述前胰岛素原II编码序列，并且将该前胰岛素原II编码序列连接至pBHT520生成所述质粒载体pBHT561，产生HESV并将其称作mINS-II-HESV。该嵌合内含子由来自人β球蛋白基因第一内含子的5’供体位点和分枝和来自免疫球蛋白基因重链可变区内含子的3’受体位点组成。改变该供体、受体和支化位点序列以符合用于剪接的共同序列(Bothwell et al.，1981)。
接下来证明相对于该未经修饰的自身载体mINS-pBHT1(pBHT500)，引入内含子产生高表达自身载体mINS-II-HESV(pBHT561)导致表达增加量的编码的胰岛素。转染后24小时，收集同等数量的使用0.1μg的每种质粒转染的HEK293细胞上清液，并且按照厂家提供的说明书(大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒，Linco ResearchInc.，St.Charles，MI)通过ELISA测定胰岛素蛋白水平。从已检测到的每种质粒的蛋白水平中减去收集自“无DNA”对照孔的上清液中背景水平。如图4所示，相对于该未经修饰的pBHT500自身载体，添加内含子以产生HESV pBHT561导致细胞分泌的胰岛素蛋白量提高了约30倍。
NOD雌性小鼠的治疗仅在小鼠发生高血糖后开始，其血糖水平达到190-250mg/dl(通常15-18周大)，使用One Touch II测量表(Johnson& Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法测定所述血糖水平。随后向患有此类明显临床上前糖尿病的小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠(每组n＝10)肌内给予基本上无内毒素的0.10ml PBS、0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml pBHT1空载体、mINS-II-pBHT1或mINS-II-HESV，在每一四头肌注射总量50μg/动物。此后连续每周一次DNA注射，持续共12周。作为阳性对照，通过静脉注射以5μg/动物给予抗-CD3抗体，连续5天。通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。糖尿病的进展定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl。
图5所示结果显示，相对于PBS(p＝0.007)和pBHT1空载体注射的对照，使用经修饰的自身载体mINS-II-HESV而进行的DNA疫苗接种减少了高血糖NOD小鼠内糖尿病的发生，其中，更少的小鼠在14周后进展成糖尿病并且糖尿病小鼠确实化更长的时间进展。此外，mINS-II-HESV的治疗效果也显著大于未经修饰的自身载体mINS-II-pBHT1，暗示与向自身载体引入嵌合内含子相关的前胰岛素原II的高表达水平可以进一步推迟疾病进展。重要地，mINS-II-HESV治疗与抗-CD3治疗的阳性对照(p＝0.47)没有显著差别。
实施例4
使用编码胰岛素原II的非分泌的自身载体(N-SSV)通过DNA疫苗接种治疗NOD小鼠内建立的高血糖。
本试验研究了将实施例1所述前胰岛素原II DNA自身载体修饰为N-SSV是否会影响用于减缓或预防进展成糖尿病的DNA疫苗接种的治疗效果。通过移除信号序列构建非分泌的自身载体(N-SSV)以编码前胰岛素原II、胰岛素原II的非分泌形式。随后使用该经修饰的自身载体接种患有已建立的高血糖的NOD小鼠。
产生的编码胰岛素原II的N-SSV不同于实施例1所述的编码前胰岛素原II的自身载体(mINS-II-pBHT1)，因为胰岛素原II缺少前胰岛素原II的信号肽序列。如上所述，将全长前胰岛素原II克隆至经修饰的pVAX1质粒载体pBHT1以产生质粒pBHT500。使用寡核苷酸INS2.5.Eco(ATTGAATTCAAGATGGCTTTTGTCAAGCAGCACACCTTTG)和INS2.3.Xho(AATTCTCGAGCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCT)PCR扩增来自pBHT500的小鼠前胰岛素II胰岛素原区域。将甲硫氨酸起始密码子引入胰岛素原序列N端的5’寡核苷酸，以替代删除的信号序列的起始密码子。使用EcoR1和Xho1酶切该PCR片段，并将其连接至pBHT1的相应位点，以产生pBHT555(mINS-II-N-SSV)。按照厂家提供的方法，使用Qiagen Endo-free Mega-preps(Qiagen，Valencia，CA)纯化该DNA。
接下来证明从前胰岛素原II移除信号序列以产生mINS-II-N-SSV，导致胰岛素胞内形式的产生。使用2μg的胰岛素表达质粒mINS-II-pBHT1(pBHT500)和mINS-II-N-SSV(pBHT555)转染HEK293细胞。将转染后的细胞孵育48小时，并且通过ELISA分析48小时处上清液和细胞裂解物的胰岛素蛋白水平(图6A)。在mINS-II-pBHT1转染的细胞的上清液中检测到显著数量的蛋白，但在用mINS-II-N-SSV转染的细胞的上清液中未检测到蛋白。可选择地，将转染后的细胞于普通培养基上孵育24小时，并且随后在存在蛋白酶体抑制子乳胞素(5μM)的情况下孵育24小时，以促进胞内胰岛素的稳态水平。通过ELISA测量48小时处胰岛素蛋白水平(图6B)。再次在mINS-II-pBHT1转染的细胞的上清液中检测到显著数量的蛋白，但在用mINS-II-N-SSV转染的细胞的上清液中未检测到蛋白而在细胞裂解物中发现了所述蛋白表明该蛋白局限在细胞质内。
NOD雌性小鼠的治疗仅在小鼠发生高血糖后开始，其血糖水平达到190-250mg/dl(通常15-18周大)，使用One Touch II测量表(Johnson& Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法测定所述血糖水平。随后向患有此类明显临床上前糖尿病的小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠肌内给予基本上无内毒素的0.10ml PBS、0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml pBHT1空载体、mINS-II-pBHT1或mINS-II-N-SSV，在每一四头肌注射总量50μg/动物。此后连续每周一次DNA注射，持续共12周。作为阳性对照，通过静脉注射以5μg/动物给予抗-CD3抗体，连续5天。通过Chemstrip(Boehringer MannheimCo.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。糖尿病的进展定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl。
图5所示结果显示，使用经修饰的自身载体mINS-II-N-SSV而进行的DNA疫苗接种减少了高血糖NOD小鼠内糖尿病的发生，其中，相对于注射PBS的对照更少的小鼠在14周后进展成糖尿病，并且相对于PBS(p＝0.02)和pBHT1空载体注射的对照糖尿病小鼠确实化更长的时间进展。此外，mINS-II-N-SSV的治疗效果也显著大于mINS-II-pBHT1的治疗效果，暗示阻止自身多肽的分泌可以进一步推迟疾病进展。重要地，mINS-II-N-SSV治疗与抗CD3治疗的对照(p＝0.13)没有显著差别。
实施例5
使用经修饰的自身载体治疗糖尿病的DNA疫苗剂量
本试验研究了使用经修饰的自身载体的DNA疫苗的优选剂量。检测了使用编码前胰岛素原的高表达自身载体(mINS-II-HESV)和编码胰岛素原II的非分泌自身载体(mINS-II-N-SSV)每周一次治疗与每两周一次治疗在减缓NOD小鼠内糖尿病进展的效果。
NOD雌性小鼠的治疗在10周大时开始。向小鼠(每组n＝20)注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠肌内给予基本上无内毒素的0.10ml的PBS、0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml mINS-II-HESV或mINS-II-N-SSV，在每一四头肌注射总量50μg/动物。此后每周一次或每两周一次持续DNA注射。通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。进展成糖尿病定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl。使用mINS-II-HESV和mINS-II-N-SSV两者进行DNA疫苗接种，显示了使用每周一次和每两周一次治疗都能推迟糖尿病发病的这一趋势。
实施例6
使用编码胰岛素原II的非分泌的高表达自身载体(N-SHESV)通过DNA疫苗接种治疗NOD小鼠内建立的高血糖
本试验研究了将对前胰岛素原II DNA自身载体进行的高表达修饰和非分泌修饰相结合而产生的效果对用于减缓或预防进展成糖尿病的DNA疫苗接种治疗效果的作用。构建编码胰岛素原II的非分泌的高表达自身载体(N-SHESV)，并且使用该经修饰的自身载体以接种患有建立的高血糖的NOD小鼠。
构建包含β球蛋白/Ig嵌合内含子的N-SHESV，所述内含子位于所述启动子区域下游和前胰岛素原II的非分泌形式(胰岛素II)的起始密码子上游。从pBHT520分离该嵌合β-球蛋白/IgG内含子作为280bpHindIII-XhoI片段，随后将其克隆至mINS-II-N-SSV(pBHT555)，位于CMV启动子和非分泌的胰岛素原编码区之间，以产生mINS-II-N-SHESV(pBHT568)。
首先证明，mINS-II-N-SHESV编码的胰岛素原II缺少信号序列，这导致胰岛素胞内形式的产生。使用2μg的胰岛素表达质粒mINS-II-pBHT1(pBHT500)和mINS-II-N-SHESV(pBHT568)转染HEK293细胞。将转染后的细胞孵育48小时，并且通过ELISA分析48小时处上清液和细胞裂解物的胰岛素蛋白水平(图6A)。在mINS-II-pBHT1转染的细胞的上清液中检测到显著数量的蛋白，但在用mINS-II-N-SHESV转染的细胞的上清液中未检测到蛋白。可选择地，将转染后的细胞于普通培养基上孵育24小时，并且随后在存在蛋白酶体抑制子乳胞素(5μM)的情况下孵育24小时，以促进胞内胰岛素的稳态水平。通过ELISA测量48小时处的胰岛素蛋白水平(图6B)。再次在mINS-II-pBHT1转染的细胞的上清液中检测到显著数量的蛋白，但在用mINS-II-N-SHESV转染的细胞的上清液中未检测到蛋白，相反地，该蛋白局限在所述细胞裂解物内。
接下来证明相对于未经修饰的自身载体mINS-II-pBHT1(pBHT500)，从前胰岛素原II移除信号序列并且引入内含子以产生高表达非分泌的自身载体mINS-II-N-SHESV(pBHT568)导致产生胰岛素胞内形式，并且相对于mINS-II-N-SSV(pBHT555)表达提高。使用2μg的胰岛素表达质粒mINS-II-pBHT1(pBHT500)、mINS-II-N-SSV(pBHT555)和mINS-II-N-SHESV(pBHT568)转染HEK293细胞。将转染后的细胞孵育48小时，并且通过ELISA分析48小时处上清液和细胞裂解物的胰岛素蛋白水平(图6A)。在mINS-II-pBHT1转染的细胞的上清液中检测到显著数量的蛋白，但在用mINS-II-N-SHESV转染的细胞的上清液中未检测到蛋白。可选择地，将转染后的细胞于普通培养基上孵育24小时，并且随后在存在蛋白酶体抑制子乳胞素(5μM)的情况下孵育24小时，以促进胞内胰岛素的稳态水平。通过ELISA测量48小时处的胰岛素蛋白水平(图6B)。再次在mINS-II-pBHT1转染的细胞的上清液中检测到显著数量的蛋白，但在用mINS-II-N-SHESV转染的细胞的上清液中未检测到蛋白。此外，相对于细胞裂解物内缺少内含子的mINS-II-N-SSV，使用mINS-II-N-SHESV转染的细胞显示蛋白表达提高2倍。
NOD雌性小鼠的治疗在小鼠发生高血糖后开始，其血糖水平达到190-250mg/dl(通常15-18周大)，使用One Touch II测量表(Johnson &Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法测定所述血糖水平。向患有此类明显临床上前糖尿病的小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠(每组n＝15)肌内给药基本上无内毒素的0.10ml的PBS、0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml mINS-II-N-SSV或mINS-II-N-SHESV，在每一四头肌注射总量50μg/动物。连续每周一次、每间隔一周一次或每四周一次DNA注射，持续共25周。作为阳性对照，通过静脉注射以5μg/动物给予抗-CD3抗体，连续5天。通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。糖尿病的进展定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl。
使用mINS-II-N-SSV或mINS-II-N-SHESV的治疗显著地推迟了所有治疗方案下IDDM的发作(图8A，B)。此外，相对于单一修饰的mINS-II-N-SSV，mINS-II-N-SHESV中高表达修饰和非分泌修饰的组合提高了DNA疫苗接种的治疗效果(图8A、B)。
实施例7
使用编码前胰岛素原II的经修饰的DNA自身载体的组合通过DNA疫苗接种治疗NOD小鼠内建立的高血糖
本试验研究了前胰岛素原II DNA自身载体的高表达修饰和非分泌修饰的组合是对影响用于减缓或预防进展成糖尿病的DNA疫苗接种的治疗效果否起加和作用。如上所述1)包含编码的前胰岛素原II的5’β-球蛋白/Ig嵌合内含子的HESV(mINS-II-HESV)和2)编码缺少前胰岛素原II信号序列的胰岛素原II的N-SSV(mINS-II-N-SSV)的组合用于接种患有建立的高血糖的NOD小鼠。
NOD雌性小鼠的治疗在小鼠发生高血糖后开始，其血糖水平达到190-250mg/dl(通常15-18周大)，使用One Touch II测量表(Johnson &Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法测定所述血糖水平。向患有此类明显临床上前糖尿病的小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠肌内给予0.10ml的PBS、0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml mINS-II-HESV、mINS-II-N-SSV、或mINS-II-HESV和mINS-II-N-SSV的组合，在每一四头肌注射总量50μg/动物。连续每周一次DNA注射，共持续25周。通过Chemstrip(Boehringer MannheimCo.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。糖尿病的进展定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl。
相对于仅使用mINS-II-HESV的疫苗接种，使用mINS-II-HESV和mINS-II-N-SSV自身载体的组合的疫苗接种导致疾病进展的显著减缓(图9)。
实施例8
使用编码前胰岛素原II的经修饰的DNA自身载体通过DNA疫苗接种预防NOD小鼠内自身抗体产生和胰岛炎
在糖尿病发作前，NOD小鼠产生抗胰岛素自身抗体，并表现出胰岛炎，即淋巴细胞浸润进郎格罕氏胰岛。本试验研究使用编码前胰岛素原II的经修饰的自身载体进行DNA疫苗接种是否容易抑制NOD小鼠内胰岛素自身抗体的产生和胰岛炎。
在高血糖征兆出现前，治疗5周大的NOD雌性小鼠。向小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌进注射。两天后，向所述小鼠肌内给予基本上无内毒素的0.10ml的PBS、0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml pBHT1非编码载体、mINS-I-pBHT1、mINS-II-pBHT1、mINS-II-HESV、或mINS-II-N-SSV，在每一四头肌注射总量50μg/动物。每周一次注射所述质粒DNA，共持续6周。通过静脉注射(5μg/动物)给予基本上无内毒素的抗CD3，持续5天。最后一次DNA注射后两周，收集血清，并在Barbara Davis糖尿病中心通过放射性免疫试验盲筛寻找胰岛素抗体。根据公知标准(Eisenbarth，et al.)，认为高于0.01的小鼠胰岛素自身抗体(mIAA)指数为阳性。图10显示具有胰岛素自身抗体的动物的百分比。统计分析(费歇尔精确检验(Fisher＇s Exact Test))显示：在该mINS-II-N-SSV受治组(p＝0.01)和抗CD3受治组(p＝0.01)中具有抗胰岛素自身抗体的动物的百分比在统计学上显著减少。
还检测免疫后NOD小鼠内胰岛炎的存在，该免疫如上所述。最后一次DNA注射后两周，收获每一受治小鼠的胰腺，并在福尔马林中固定。使用H&E染色切片，并由Barbara Davis糖尿病中心IDDM方面的专家盲评胰岛炎的程度。相对于仅用载体，使用INS-II-N-SSV的治疗提供胰岛炎在统计学上的显著减少(图11)。
实施例9
使用编码前胰岛素原II的经修饰的DNA自身载体通过DNA疫苗接种预防NOD小鼠的IDDM
本试验研究使用编码前胰岛素原II的经修饰的自身载体进行DNA疫苗接种是否预防NOD小鼠发生高血糖和糖尿病。
在高血糖征兆出现前，治疗5周大的NOD雌性小鼠。向小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠肌内给予基本上无内毒素的0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml pBHT1非编码载体、mINS-II-HESV、mINS-II-N-SSV、或mINS-II-N-SHESV，在每一四头肌注射总量50μg/动物。每周一次注射所述质粒DNA，共持续6周。通过静脉注射(5μg/动物)给予抗CD3抗体，持续5天。通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，持续超过30周，并且使用One Touch II测量表(Johnson &Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。血糖水平重复超过250mg/dl的动物即认为患有糖尿病。
实施例10
使用增加的Ca++浓度配制的编码胰岛素原II的高表达自身载体通过DNA疫苗接种治疗NOD小鼠内建立的高血糖
本试验研究使用增加的Ca++浓度配制的编码胰岛素原II的高表达自身载体进行DNA疫苗接种是否减少患有建立的高血糖的NOD小鼠内糖尿病的发生。
NOD雌性小鼠的治疗在小鼠发生高血糖后开始，其血糖水平达到190-250mg/dl(通常15-18周大)，使用One Touch II测量表(Johnson &Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法测定所述血糖水平。向患有此类明显临床上前糖尿病的小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠(每组n＝5)肌内给予0.10ml PBS或0.10ml溶于具有不同Ca++终浓度的PBS中的250μg/ml mINS-II-HESV(pBHT-3021)，所述不同Ca++终浓度包括：0.9mM(1x)、2.7mM(3x)和5.4mM(6x)，在每一四头肌注射总量50μg/动物。以0.25mg/ml或1.5mg/ml配制DNA制剂(0.2ml)，使用浓度范围在0.9mM(1X)至8.1mM(9X)间的氯化钙。配制后约一小时，将样品置于-20℃过夜。注射前，将样品于室温解冻。将分开的样品置于eppendorf微量离心机内离心5分钟(13,000rpm)。移除上清液，并将沉淀重悬于Tris-EDTA(TE)，并且读取OD260以测定沉淀中的DNA量。连续每周一次DNA注射，共持续4周。通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。糖尿病的进展定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl。
相对于使用3x或1x Ca++配制的mINS-II-HESV的疫苗接种，使用6x Ca++配制的mINS-II-HESV的疫苗接种导致疾病进展的显著减缓(图12A)。共给药胰岛素时，获得类似的结果(图12B)。此外，添加Markane显示在3x和6x钙制剂的情况下效力略微增加(图12C)。图12D小结了使用有或没有Markane的不同制剂的糖尿病进展复合结果。
除减缓疾病进展之外，使用高钙制剂的DNA疫苗接种还降低血糖(BG)水平超过600mg/dl的小鼠百分比。使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)测试糖尿病发作后的小鼠血糖水平。相对于使用1x钙制剂的自身载体治疗的小鼠，使用6x钙配制的pBHT-3021接种的小鼠表现出高血糖水平的显著推迟和降低，结果模拟使用抗CD3阳性对照获得的结果(图12E)。使用具有1x钙的pBHT-3021的5天注射方案还达到了类似于使用6x钙制剂获得的具有高血糖水平的小鼠百分数减少(图12F)。此外，相对于使用1x钙或PBS对照治疗动物时无回复的情形，注射5天的6x钙和1x钙两者导致1/5具有高血糖水平的动物向非糖尿病状态回复(图12G)。因此，具有更高浓度钙的自身载体质粒的制剂显著提高DNA疫苗接种的效力，并且取代更为频繁的给药方案。
实施例11
高钙制剂的物理分析
假定使用上述实施例公开的更高钙浓度配制的自身载体提高DNA疫苗接种的效力，进行不同钙制剂的物理分析。
动态光散射(DLS)用于评估在配制后并冷冻/解冻之后室温孵育0-3小时的情况下DNA聚集物的大小。将BHT-3021(2mg/mL)的DNA样品存于-80℃。在单独的或存在四种不同浓度的氯化钙的情况下(0.9mM、3.0mM、5.4mM和8.0mM)完成两种不同DNA浓度(0.25mg/ml和1.5mg/ml，稀释于磷酸盐缓冲盐水)的DLS分析。使用装备有50mW二极管泵激光器(532nm)的光散射仪器(Brookhaven Instruments Corp，Holtszille，NY)测量20℃下DNA样品的流体动力学直径(hydrodynamicdiameter)，所述激光器入射浸于萘烷浴的样品细胞。通过PMT(EMI9863)在与入射光束成90°处监测散射光，并且通过数字相关器(BI-9000AT)生成自相关函数。五次30秒间隔连续收集每一样品的数据并求平均。通过多种方法分析数据，以产生有关制剂多分散性和所出现的各种组分相对大小的信息。通过累积量法符合该自相关函数，以产生所述DNA和/或复合体的平均扩散系数。通过Stokes-Einstein公式从扩散系数获得有效流体动力学直径。此外，使数据符合非负强制最小二乘法(non-negatively constrained least squares algorithm)，以产生多重模态分布(multi-modal distributions)。为更为完整的分析，这些方法还采用了使用群体数量平均和强度平均。
具有低浓度(0.9mM)钙或无钙的质粒自身载体DNA制剂包含质粒单体，不考虑配制后时间或着所述溶液是否经受冷冻/解冻循环，该质粒单体的平均直径仅在～70nM(表2-4)。相反地，在3.0mM及以上的钙浓度的情况下，在一小时内形成微米大小的颗粒，并且配制后室温孵育该溶液2-3小时其大小增加(表2-4)。颗粒大小随渐增的钙和渐增的DNA浓度而增加。冷冻后，颗粒太大无法通过DLS分析测量。
表2 制备后0-1小时质粒制剂的动态光散射(基于强度平均对数正态粒径分布)
 
标签 描述 直径(nm) 多分散性指数
BHT3021#1 0.25mg/mlBHT3021，无氯化钙 68.7±0.6 0.223±0.015
BHT3021#2 0.25mg/mlBHT3021，0.9mM氯化钙 69.5±0.7 0.217±0.017
BHT3021#3 0.25mg/mlBHT3021，3.0mM氯化钙 839.5±56.9 0.258±0.043
BHT3021#4 0.25mg/mlBHT3021，5.4mM氯化钙 1093.1±81.2 0.290±0.037
BHT3021#5 0.25mg/mlBHT3021，8.0mM氯化钙 3054±0.321 0.372±0.073
BHT3021#6 1.5mg/mlBHT3021，无氯化钙 56.9±0.3 0.240±0.004
BHT3021#7 1.5mg/mlBHT3021，0.9mM氯化钙 59.1±0.8 0.225±0.011
BHT3021#8 1.5mg/mlBHT3021，3.0mM氯化钙 706±69.7 0.407±0.056
BHT3021#9 1.5mg/mlBHT3021，5.4mM氯化钙 724±145 0.373±0.077
BHT3021#10 1.5mg/mlBHT3021，8.0mM氯化钙 1932.4±135 0.288±0.082
表3 制备后2-3小时质粒制剂的动态光散射(基于强度平均对数正态粒径分布)
 
标签 描述 直径(nm) 多分散性指数
BHT3021#1 0.25mg/mlBHT3021，无氯化钙 69.5±0.6 0.212±0.017
BHT3021#2 0.25mg/mlBHT3021，0.9mM氯化钙 69.4±0.3 0.236±0.032
BHT3021#3 0.25mg/mlBHT3021，3.0mM氯化钙 1219.6±97.7 0.307±0.077
BHT3021#4 0.25mg/mlBHT3021，5.4mM氯化钙 1304.0±101.8 0.343±0.028
BHT3021#5 0.25mg/mlBHT3021，8.0mM氯化钙 超出范围 nd
BHT3021#6 1.5mg/mlBHT3021，无氯化钙 55.3±0.5 0.238±0.004
BHT3021#7 1.5mg/mlBHT3021，0.9mM氯化钙 57.1±0.3 0.238±0.008
BHT3021#8 1.5mg/mlBHT3021，3.0mM氯化钙 1665.4±120.5 0.342±0.032
BHT3021#9 1.5mg/mlBHT3021，5.4mM氯化钙 1328.2±191.6 0.372±0.021
BHT3021#10 1.5mg/mlBHT3021，8.0mM氯化钙 1530.2±182.6 0.201±0.068
表4 过夜冷冻-解冻循环后质粒制剂的动态光散射(基于强度平均对数正态粒径分布)
 
标签 描述 直径(nm) 多分散性指数
BHT3021#1 0.25mg/mlBHT3021，无氯化钙 69.3±1.2 0.223±0.031
BHT3021#2 0.25mg/mlBHT3021，0.gmM氯化钙 79.5±2.4 0.271±0.005
BHT3021#3 0.25mg/mlBHT3021，3.0mM氯化钙 超出范围 nd
BHT3021#4 0.25mg/mlBHT3021，5.4mM氯化钙 超出范围 nd
BHT3021#5 0.25mg/mlBHT3021，8.0mM氯化钙 超出范围 nd
BHT3021#6 1.5mg/mlBHT3021，无氯化钙 57.5±0.3 0.225±0.006
BHT3021#7 1.5mg/mlBHT3021，0.9mM氯化钙 59.1±0.4 0.235±0.007
BHT3021#8 1.5mg/mlBHT3021，3.0mM氯化钙 超出范围 nd
BHT3021#9 1.5mg/mlBHT3021，5.4mM氯化钙 超出范围 nd
BHT3021#10 1.5mg/mlBHT3021，8.0mM氯化钙 超出范围 nd
由于DLS分析说明在存在浓度为3.0mM及以上的氯化钙时，形成微米大小的颗粒，因而采用具有0.4-1200μm总体大小范围的CoulterMultisizer 3(Beckman Coulter Inc.)以完成对DNA/Ca-磷酸盐复合物聚集状态的分析。该Multisizer 3 coulter计数器提供超高分辨率、多通道分析和精确性；并且其灵敏度不受颗粒色彩、形状、密度、组合物或折射率的影响。将悬浮于缓冲液的颗粒拖过小孔，将之间具有电流通过的两电极分开。跨该孔应用的电压创造了“感应区”，通过其间的颗粒会置换其自身的电解量，即刻增加该孔的阻抗。所述阻抗的变化产生微小而成比例的电流，流进放大器，该放大器将电流起伏转换成大到足够精确测量的电压脉冲。分析该脉冲能获得并显示粒径分布。为进行本实验，使用200μm孔管探测4-120μm范围内的大小，并且使用560μm孔探测120-336μm范围内的颗粒。通过如下3种不同的方案制备用于大颗粒分析的溶液：在-20摄氏度冷冻前，4摄氏度过夜；配制后15分钟内于-20摄氏度下冷冻；和室温孵育4小时后，于-20摄氏度下冷冻。冷冻后可见颗粒正态分布，DNA浓度为0.25mg/mL且具有5.4mM氯化钙时，其平均直径约25μm。
为测定与大颗粒相结合的DNA量，进行离心实验。产生含有比例变化的DNA(0.25-2.0mg/ml)和钙(6X至80X)的溶液，并于-20摄氏度下冷冻过夜。解冻后，将该溶液于微型离心机内离心5分钟，并且使用分光光度计通过测量吸光度(260nm)分析上清液的DNA含量。使用微型离心机通过短暂离心所述6X钙样品中约70％的所述DNA与从溶液中沉淀的颗粒结合。下表5显示以不同DNA浓度和钙浓度沉淀的DNA的量。在DNA浓度为1.5-2.0mg/ml时，只有～50％的DNA可以沉淀。
表5
 
样品 上清液的％DNA
0.25mg/mL+6X 70％
0.5mg/mL+6X 57％
0.5mg/mL+20X 12％
0.5mg/mL+40X 35％
1.0mg/mL+6X 82％
1.0mg/mL+20X 25％
1.0mg/mL+40X 50％
1.5mg/mL+6X 85％
1.5mg/mL+20X 68％
1.5mg/mL+40X 60％
2.0mg/mL+6X 79％
2.0mg/mL+24X 56％
2.0mg/mL+48X 46％
2.0mg/mL+80X 50％
实施例12
使用经修饰的编码前胰岛素原II的DNA自身载体与免疫调节序列(IMS)组合通过DNA疫苗接种治疗NOD小鼠内建立的高血糖
本试验研究共给药IMS能否进一步增强使用经修饰的编码前胰岛素原II的自身载体进行DNA疫苗接种的治疗效果。使用硫代磷酸酯骨架化学合成含有单一5’-AAGGTT-3’序列的IMS 22-mer寡脱氧核糖核苷酸(IMS-ODN)，以防止被核酸酶降解。随后这些IMS-ODN与经修饰的自身载体一起向患有建立的高血糖的小鼠共给药。
NOD雌性小鼠的治疗在小鼠发生高血糖后开始，其血糖水平达到190-250mg/dl(通常15-18周大)，使用One Touch II测量表(Johnson&Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法测定所述血糖水平。向患有此类明显临床上前糖尿病的小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠肌内给予基本上无内毒素的0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml pBHT1非编码载体、mINS-II-pBHT1、mINS-II-HESV、mINS-II-N-SSV、mINS-II-HESV和mINS-II-N-SSV的组合、或者mINS-II-N-SHESV，在每一四头肌注射总量50μg/动物。连续每周一次DNA注射，共持续12周。在最初的DNA疫苗接种同时，腹膜内给予溶于200μl体积PBS的50μg IMS，并且每周一次再注射，持续12周。通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson &Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。糖尿病的进展定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl，并且糖尿病的进展说明共给药IMS是否影响治疗效果。
实施例13
使用经修饰的编码前胰岛素原II的DNA自身载体与添加的免疫刺激性序列(ISS)通过DNA疫苗接种治疗NOD小鼠内建立的高血糖
本试验研究共给药免疫刺激性序列(ISS)能否进一步增强使用经修饰的编码前胰岛素原II的自身载体进行DNA疫苗接种的治疗效果。根据所述最适序列5’-AACGTT-3’，将含有未甲基化的CpG序列的ISS簇添加至编码胰岛素原的非分泌的自身载体，并且添加至编码前胰岛素原的高表达载体，该高表达载体随后用于治疗患有建立的高血糖的NOD小鼠。
产生的经修饰的自身载体包含载体骨架上增加量的小鼠最适刺激性CpG元件。通过退火一对磷酸化的寡核苷酸(有义链-AGCTCAACGTTTCTAACGTTTTAACGTTTCCAACGTTTTAACGTTTC和反义链-GAAACGTTAAAACGTTGGAAACGTTAAAACGTTAGAAACGTTGAGCT)产生序列AACGTT的五种小鼠最适CpG元件簇。将该退火的序列连接至mINS-II-N-SSV(pBHT555)的NruI位点以产生mINS-II-N-SSV-CpG，所述NruI位点位于CMV启动子紧邻上游。类似地，将退火的序列连接至mINS-II-HESV的NruI位点以产生mINS-II-HESV-CpG。
NOD雌性小鼠的治疗在小鼠发生高血糖后开始，其血糖水平达到190-250mg/dl(通常15-18周大)，使用One Touch II测量表(Johnson &Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法测定所述血糖水平。向患有此类明显临床上前糖尿病的小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠肌内给予基本上无内毒素的0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml pBHT1非编码载体、mINS-II-HESV、mINS-II-HESV-CpG、mINS-II-N-SSV、或mINS-II-N-SSV-CpG，在每一四头肌注射总量50μg/动物。连续每周一次DNA注射，共持续12周。通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，并且使用One Touch II测量表(Johnson & Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。糖尿病的进展定义为连续两次血糖测量超过250mg/dl，并且糖尿病的进展说明添加的CpG免疫刺激性序列对治疗效果的影响。
实施例14
使用编码前胰岛素原、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶IA-2的高表达DNA自身载体通过DNA疫苗接种预防NOD小鼠内的IDDM
本试验研究与经修饰的编码与IDDM相关的多种自身蛋白的自身载体结合的DNA疫苗接种是否预防高血糖和进展成明显糖尿病。在这一特别的实施方案中，测试HESV预防NOD小鼠内高血糖和糖尿病发生的能力，所述HESV编码如上所述的自身蛋白前胰岛素原II、谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和谷氨酸脱羧酶(GAD)-67、以及酪氨酸磷酸酶IA-2。
构建编码GAD-65、GAD-67、IGRP和酪氨酸磷酸酶IA-2的HESV。通过PCR从小鼠胰腺cDNA文库分离编码全长鼠GAD-65、GAD-67和酪氨酸磷酸酶IA-2的cDNA，并将其克隆至包含嵌合的β-球蛋白/Ig内含子的pBHT1，所述内含子位于启动子区域下游并且是每一扩增的cDNA起始甲硫氨酸的5’内含子。使用Qiagen Endo-freeMega-preps(Qiagen，Valencia，CA)纯化该DNA。所述经修饰的自身载体随后用于接种NOD小鼠。
在高血糖征兆出现前，治疗5周大的NOD雌性小鼠。向小鼠注射0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)，在每一四头肌注射。两天后，向所述小鼠肌内给予基本上无内毒素的0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml pBHT1非编码载体、pINS-II-HESV、编码GAD-65的HESV、编码GAD-67的HESV、编码酪氨酸磷酸酶IA-2的HESV、或者所述HESV的组合，在每一四头肌注射总量50μg/动物。每周一次注射所述质粒DNA，共持续6周。通过Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)每周一次测试小鼠糖尿，持续超过30周，并且使用One Touch II测量表(Johnson &Johnson，Milpitas，CA)通过血浆葡萄糖测量法确认糖尿病。血糖水平重复超过250mg/dl的动物即认为患有糖尿病。
实施例15
使用编码前胰岛素原的高表达DNA自身载体通过DNA疫苗接种治疗人IDDM
本研究检测使用经修饰的编码并能表达包含与IDDM相关的一种或多种自身抗原表位的自身多肽的自身载体进行DNA疫苗接种能否治疗人IDDM。在该特别的实施方案中，研究使用包含位于编码的前胰岛素原5’的嵌合β-球蛋白/Ig内含子的HESV的DNA疫苗接种。通过PCR从人胰腺cDNA文库(Stratagene，La Jolla，CA)分离编码前胰岛素原的全长人cDNA，并将其克隆至经修饰的包含位于启动子区域下游的嵌合的β-球蛋白/Ig内含子的pBHT1以产生适于向人给药的HESV。
向诊断为IDDM的人患者给予治疗有效量的编码前胰岛素原的HESV。治疗有效量的自身载体为约0.001μg到约1g的范围。最为优选的治疗量的自身载体为约0.025mg至约5mg的范围。每月一次递送该DNA疗法，持续6-12月，随后每3-12个月以维持剂量递送。可以开发可选择的治疗方案，并且所述治疗方案的范围可以从每天一次到每周一次、到每隔一月一次、到每年一次给药，其取决于疾病的严重性、患者年龄、给予的自身蛋白、自身多肽或自身肽、以及普通治疗医师会考虑的此类其他因素。
在优选的实施方案中，通过肌内注射递送该DNA。可选择地，所述DNA自身载体的吸入或递送通过鼻内、口服、皮下、皮内、静脉内进行，按压该DNA自身载体穿过皮肤，或者将其附着于金粒以通过基因枪递送到真皮或穿过真皮。该DNA配制于具有生理水平的钙(0.9mM)的磷酸盐缓冲盐水中。可选择地，该DNA配制于包含更多数量的Ca++(1mM和2M之间)的溶液中。可以使用诸如锌、铝及其他的其他阳离子配制该DNA。
监控使用编码前胰岛素原的HESV治疗的人糖尿病患者的疾病活性，所述疾病活性基于外源胰岛素需求的减少、血清自身抗体谱的改变、糖尿的减少、以及诸如白内障、血管机能不全、关节病和神经病的糖尿病并发症的减少。
实施例16
通过阻遏物滴定选择和维持高表达自身载体(HESV)
抗生素和抗生素抗性基因是用于在宿主细胞内选择和维持重组DNA质粒的最常用标志物，所述宿主细胞包括诸如E.coli的细菌宿主。然而不鼓励将其用于基因治疗(向患者直接注射质粒)以避免通过水平转移的抗生素抗性性状扩散。因而我们描述可选择的无抗生素选择和维持本发明所述HESV的方法。
如上所述的包含嵌合的β-球蛋白/Ig内含子并且编码人前胰岛素原载体的源于亲本pBHT1的HESV经修饰以允许使用阻遏物滴定的无抗生素选择和维持。使用存在于亲本pBHT1载体的侧翼限制酶位点从该HESV移除卡那霉素抗性基因，或使用标准重组DNA技术通过定位突变添加卡那霉素抗性基因。使用同样的限制位点，将66个碱基对的合成的E.coli乳糖(lac)操纵子二聚物操纵基因(Genbank登录号K02913)连接至该HESV以代替该卡那霉素抗性基因。可选择地，首先修饰含有嵌合β-球蛋白/Ig内含子的HESV，以用合成的lac操纵基因代替该卡那霉素抗性基因，并且随后将人前胰岛素原编码区克隆至该嵌合内含子的下游。将经修饰以包含lac操纵基因序列的HESV称作HESVlacO。随后将HESVlacO载体转化至遗传修饰的包含dapD关键基因的E.coli，所述dapD关键基因受控于诸如所述的DH1lacdapD或DH1lacP2dapD的lac启动子(lacOP)(Cranenburgh et al.，2001)。阻遏物滴定使转化的E.coli细胞得以存活，并且使HESVlacO质粒得以增殖。
实施例17
使用编码胰岛素原的非分泌的DNA自身载体通过DNA疫苗接种治疗人IDDM
本研究检测使用经修饰的编码并能表达非分泌的自身多肽的自身载体进行DNA疫苗接种能否治疗人IDDM，所述非分泌的自身多肽包含与IDDM相关的一种或多种分泌的自身抗原。在该特别的实施方案中，研究使用编码缺少信号序列的胰岛素原的非分泌形式的N-SSV的DNA疫苗接种。通过PCR从人胰腺cDNA文库(Stratagene，La Jolla，CA)分离编码胰岛素原但缺少信号序列的全长人cDNA，所述PCR使用包含符合读框的起始甲硫氨酸的5’引物以代替被移除的信号序列的起始密码子。酶切该PCR扩增产物，并将其连接至适于向人给药的pBHT1。
向诊断为IDDM的人患者肌内给予治疗有效量的约0.025mg至约5mg的编码胰岛素原的N-SSV。每月一次递送该DNA疗法，持续6-12月，随后每3-12个月以维持剂量递送。监控用编码胰岛素原的N-SSV治疗的患者的疾病活性，所述疾病活性基于外源胰岛素需求的减少、血清自身抗体谱的改变、糖尿的减少、以及诸如白内障、血管机能不全、关节病和神经病的糖尿病并发症的减少。
实施例18
通过阻遏物滴定选择和维持非分泌的自身载体(N-SSV)
该实施例描述可选择的无抗生素选择和维持本发明所述N-SSV的方法。如上所述的编码缺少信号序列的前胰岛素原(胰岛素原)的源于亲本pBHT1载体的N-SSV经修饰以允许使用阻遏物滴定的无抗生素选择和维持。使用存在于亲本pBHT1载体的侧翼限制酶位点从该N-SSV移除卡那霉素抗性基因，或使用标准重组DNA技术通过定位突变添加卡那霉素抗性基因。使用同样的限制位点，将66个碱基对的合成的E.coli乳糖(lac)操纵子二聚物操纵基因(Genbank登录号K02913)连接至该N-SSV以代替该卡那霉素抗性基因。可选择地，首先修饰亲本pBHT1载体，以用合成的lac操纵基因代替该卡那霉素抗性基因，并且随后将缺少信号序列的人前胰岛素原编码区(胰岛素原)克隆至所述启动子的下游。将经修饰以包含lac操纵基因序列的N-SSV称作N-SSVlacO。随后将N-SSVlacO载体转化至遗传修饰的包含dapD关键基因的E.coli，所述dapD关键基因受控于诸如所述的DH1lacdapD或DH1lacP2dapD的lac启动子(lacOP)(Cranenburgh et al.，2001)。阻遏物滴定使转化的E.coli细胞得以存活，并且因此使N-SSVlacO质粒得以增殖。
实施例19
使用编码多种自身多肽的高表达和非分泌的DNA自身载体通过DNA疫苗接种治疗人IDDM
本研究检测使用经修饰的编码并能表达与IDDM相关的多种自身多肽的自身载体进行DNA疫苗接种能否治疗人IDDM。在该特别的实施方案中，研究使用编码胰岛素原的N-SSV和HESV的组合进行DNA疫苗接种，该HESV编码上述胰岛素原；谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和谷氨酸脱羧酶(GAD)-67；酪氨酸磷酸酶IA-2；以及胰岛细胞抗原69kD。通过PCR从人胰腺cDNA文库(Stratagene，La Jolla，CA)分离编码GAD-65、GAD-67、酪氨酸磷酸酶IA-2以及胰岛细胞抗原65kD的全长人cDNA，并将其克隆至pBHT1，以产生适于向人给药的HESV，所述pBHT1经修饰以包含位于启动子区域下游的嵌合β-球蛋白/Ig内含子。
向诊断为IDDM的人患者肌内给予治疗有效量的编码胰岛素原的N-SSV和HESV的组合，该HESV编码胰岛素原、GAD-65、GAD-67、酪氨酸磷酸酶IA-2以及胰岛细胞抗原65kD。每月一次递送该DNA疗法，持续6-12月，随后每3-12个月以维持剂量递送。监控如此治疗的患者的疾病活性，所述疾病活性基于外源胰岛素需求的减少、血清自身抗体谱的改变、糖尿的减少、以及诸如白内障、血管机能不全、关节病和神经病的糖尿病并发症的减少。
实施例20
使用经修饰的编码蛋白脂质蛋白(PLP)的DNA自身载体通过DNA疫苗接种预防实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化(MS)的小鼠模型，其为中枢神经系统的脱髓磷脂的炎性自身免疫性疾病。设计本试验以研究经修饰的编码鼠PLP的自身载体能否治疗EAE。在本具体的实施方案中，在预防易感小鼠内EAE诱导的能力上将编码PLP的自身载体与编码全长PLP的HESV相比较。
为产生所述自身载体，通过PCR扩增从小鼠胰腺cDNA文库分离全长鼠PLP，并将其克隆至具有或不具有位于起始密码子5’的嵌合β球蛋白/Ig内含子的pBHT1。使用0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)在每一四头肌注射小鼠，并且两天后使用0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/ml非编码载体、编码PLP的自身载体、或包含嵌合内含子并且编码PLP的HESV再次注射。一周后进行第二次DNA注射。十天后，用EAE诱导激发小鼠。
在对照小鼠和实验小鼠中注射鼠PLP的肽片段(139-151肽)诱导EAE，所述肽片段以2mg/ml溶于PBS并且使用等体积不完全弗氏佐剂乳化，所述不完全弗氏佐剂添加了4mg/ml可热灭活的结核分枝杆菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，MI)。使用0.1ml的所述肽乳剂皮下注射小鼠，并且在同一天和48小时后，使用0.1ml溶于PBS的4μg/ml百日咳博德特氏(Bordetella Pertussis)菌毒素静脉注射小鼠。每周一次监控并评分动物，持续多达20周，评分按如下：0＝无临床疾病；1＝尾部虚弱或瘫痪；2＝后肢虚弱；3＝后肢瘫痪；4＝前肢虚弱或瘫痪；5＝垂死或死亡动物。
在解决该临床疾病的急性期后，牺牲对照动物和实验动物，并且检测淋巴结细胞(LNC)增殖反应及细胞因子生产。使用该PLP139-151自身肽在体内再刺激引流LNC，并通过氚化胸苷引入评定其增殖。为评估发炎脑内细胞因子mRNA的水平，使用核糖核酸酶保护分析从脑组织中分离到的mRNA。使用管家基因GAPDH的表达水平将值标准化。
实施例21
使用渐增的Ca++浓度配制的、经修饰的编码蛋白脂质蛋白(PLP)的DNA自身载体通过DNA疫苗接种治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
设计本试验以研究使用浓度渐增的Ca++配制时，使用经修饰的编码鼠PLP的自身载体的DNA疫苗接种在治疗小鼠EAE上是否更为有效。
在对照和实验SJL小鼠中注射鼠PLP的肽片段(139-151肽)诱导EAE，所述肽片段以2mg/ml溶于PBS并且使用等体积不完全弗氏佐剂乳化，所述不完全弗氏佐剂添加了4mg/ml可热灭活的结核分枝杆菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，MI)。使用0.1ml的所述肽乳剂皮下注射小鼠。从第十天起，监控并评分动物，评分按如下：0＝无临床疾病；1＝尾部虚弱或瘫痪；2＝后肢虚弱；3＝后肢瘫痪；4＝前肢虚弱或瘫痪；5＝垂死或死亡动物。
在疾病高峰，将小鼠随机分成不同治疗组。随后使用0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)注射小鼠，在每一四头肌注射，并且两天后使用0.10ml PBS或0.10ml溶于具有不同Ca++终浓度的PBS中的250μg/ml pBHT-PLP再次注射，所述不同的Ca++终浓度包括：0.9mM(1x)、2.7mM(3x)和5.4mM(6x)，在每一四头肌注射总量50μg/动物。随后监控动物在平均疾病评分上的变化，评分如上所述。
实施例22
使用编码髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)的分泌的自身载体(SSV)通过DNA疫苗接种治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化(MS)的小鼠模型，其为中枢神经系统的脱髓磷脂的炎性自身免疫性疾病。设计本试验以研究经修饰的编码鼠MOG的自身载体能否治疗EAE。在本具体的实施方案中，在治疗易感小鼠内EAE的能力上将编码MOG的自身载体与经修饰的编码MOG胞外区域可溶形式的自身载体相比较。
构建编码鼠MOG的SSV，该SSV不同于编码全长MOG的自身载体，因为MOG的胞外区域以缺乏跨膜和胞内结构域的可溶形式分泌。从包含全长MOG编码序列的质粒mMOG-pBHT1(pBHT503)中PCR扩增编码鼠MOG的信号肽和胞外结构域(MOG1-154)的多核苷酸序列。所用寡核苷酸是smMOG.5.Eco-CATTGAATTCAAGATGGCCTGTTTGTGGAGC和smMOG.3.Xho-CAATTCTCGAGTCAACCGGGGTTGACCCAATAGAAG，smMOG.3.Xho寡核苷酸提供分泌的MOG蛋白的终止密码子。将扩增的片段克隆至EcoRI-XhoI位点以产生mMOG-SSV(pBHT516)，该位点位于pBHT1的CMV启动子和BGH多聚腺苷化信号之间。
在易感小鼠中通过注射鼠MOG的肽片段(35-55肽)诱导EAE，所述肽片段以2mg/ml溶于PBS并且使用等体积不完全弗氏佐剂乳化，所述不完全弗氏佐剂添加4mg/ml可热灭活的结核分枝杆菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，MI)。使用0.1ml的所述肽乳剂皮下注射小鼠，并且在同一天和48小时后，使用0.1ml溶于PBS的4μg/ml百日咳博德特氏菌毒素静脉内注射小鼠。每日监控并评分动物，持续多达14周，评分按如下：0＝无临床疾病；1＝尾部虚弱或瘫痪；2＝后肢虚弱；3＝后肢瘫痪；4＝前肢虚弱或瘫痪；5＝垂死或死亡动物。
16天时，基于其疾病评分将小鼠随机分成不同治疗组，使得所有组具有相等的平均疾病分数。使用0.05ml的0.25％布比卡因-HCL(Sigma，St.Louis，MO)注射小鼠，在每一四头肌注射，并且两天后，使用0.10ml PBS、0.10ml溶于具有0.9mM钙的PBS中的250μg/mlmMOG-pBHT1或mMOG-SSV再次注射，在每一四头肌注射总量50μg/动物。每两周一次DNA注射，共进行5次注射。作为阳性对照，每周一次向MOG免疫的小鼠以1mg/kg注射类固醇depromedrol。
本研究最后，检测DNA接种动物和对照动物对MOG胞外结构域的免疫反应。收集受治疗小鼠的血清并通过ELISA分析IgG1抗-MOG特异性抗体。
图13所示结果显示，相对于空载体对照，使用MOG自身载体接种的动物显示其平均疾病评分的降低。此外，与使用未经修饰的MOG自身载体接种的动物相比，使用mMOG-SSV接种的动物具有较低的平均疾病评分。识别MOG的抗体的存在与治疗反应相对应(图14)。与注射PBS的对照相比，使用MOG自身载体治疗的动物具有较低的平均光密度ELISA评分，同时与使用所述未经修饰的MOG自身载体治疗的动物相比，mMOG-SSV治疗的动物存在该评分较低的倾向。
实施例23
使用编码髓磷脂碱性蛋白(MBP)的高表达DNA自身载体通过DNA疫苗接种治疗人多发性硬化(MS)
本研究检测使用经修饰的编码并能表达自身多肽的自身载体进行DNA疫苗接种能否治疗人MS，该自身多肽包含与MS相关的一种或多种自身抗原表位。在该特别的实施方案中，使用包含位于人MBP起始密码子5’的β球蛋白/Ig嵌合内含子的HESV进行DNA疫苗接种。通过PCR扩增从人脑cDNA文库(Stratagene，La Jolla，CA)分离全长人MBP cDNA。使用限制酶消化该PCR扩增产物，并将其连接至pBHT1以产生适于向人给药的HESV，该pBHT1包含位于起始甲硫氨酸的5’β-球蛋白/Ig嵌合内含子。
向诊断为MS的人患者肌内给予治疗有效量的约0.025mg至5mg的HESV，该HESV编码MBP。每月一次递送该多核苷酸疗法，持续6-12月，随后每3-12个月以维持剂量递送。监控使用HESV编码的MBP治疗的人MS患者的疾病活性，所述疾病活性基于临床复发数量和MRI监控，该MRI监控监控新的钆增强损害的量和该增强损害的体积。
实施例24
使用编码髓磷脂自身多肽组合的高表达DNA自身载体通过DNA疫苗接种治疗人多发性硬化(MS)
本研究检测使用经修饰的编码并能表达与MS相关的多种自身多肽的自身载体进行DNA疫苗接种能否治疗人MS。在本特别的实施方案中，使用具有编码多种髓磷脂自身多肽的HESV的DNA疫苗接种。在一个实施方案中，每一种髓磷脂自身多肽在截然不同的HESV上编码。在另一个实施方案中，数种髓磷脂自身多肽在单一HESV上按顺序编码，所述单一HESV利用内部核糖体再进入序列(IRES)或其他方法以从单一质粒DNA表达多种蛋白。通过PCR从人脑cDNA文库(Stratagene，La Jolla，CA)分离全长人MBP cDNA、PLP cDNA、髓磷脂结合的少突细胞碱性蛋白(MOBP)cDNA、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)cDNA和髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)cDNA，并将其克隆至pBHT1以产生HESV，该pBHT1包含位于起始甲硫氨酸的5’嵌合β-球蛋白/Ig内含子。
向诊断为MS的人患者给予治疗有效量的约0.025mg至5mg的编码髓磷脂结合的自身蛋白的HESV。每月一次递送该多核苷酸疗法，持续6-12月，随后每3-12个月以维持剂量递送。治疗人MS患者并监控人MS患者的疾病活性，所述疾病活性基于临床复发数量和MRI监控，该MRI监控监控新的钆增强损害的量和该增强损害的体积。
实施例25
使用经修饰的编码II型胶原蛋白的DNA自身载体通过DNA疫苗接种预防并治疗小鼠内胶原蛋白引发的关节炎
风湿性关节炎(RA)是慢性自身免疫性疾病，它由造成侵蚀性关节破坏的炎性滑膜炎来表征。RA由自身反应性T细胞介导，所述T细胞识别滑膜关节存在的自身蛋白。小鼠内胶原蛋白引发的关节炎(CIA)是T细胞介导的自身免疫模型，其具有与风湿性关节炎相同的许多特征，包括组织学上相似的滑膜炎和骨侵蚀。此外，CIA的复发模型所具有的炎性侵蚀性滑膜炎的临床缓解与复发与在人RA患者观察到的很类似(Malfait et al.，2000)。使用II型胶原蛋白通过免疫遗传上易感的小鼠株系引发CIA。设计本试验以研究在预防小鼠CIA发生的能力上，经修饰的编码全长鼠II型胶原蛋白的自身载体是否强于类似的未经修饰的自身载体。
构建编码II型胶原蛋白的自身载体、HESV、N-SSV和N-SHESV。通过PCR从小鼠cDNA文库分离全长II型胶原蛋白，并将其克隆至单独的pBHT1或具有嵌合β-球蛋白/Ig内含子的pBHT1以分别产生未经修饰的自身载体和HESV，该嵌合β-球蛋白/Ig内含子位于起始密码子的5’。
使用包含符合读框起始甲硫氨酸的5’引物从编码II型胶原蛋白的pBHT1载体扩增缺少信号序列的II型胶原蛋白，并且将其再克隆至单独的pBHT1或具有嵌合β-球蛋白/Ig内含子的pBHT1以分别产生N-SSV和N-SHESV。类似可得诸如IV型胶原蛋白和IX型胶原蛋白的编码另外的滑膜自身蛋白的自身载体。按照厂商提供的方法，使用Qiagen Endo-free Mega-preps(Qiagen，Valencia，CA)纯化DNA。
本研究使用6-9周大的雄性DBA/1LacJ(H-2q)小鼠。向胫骨前肌肌肉肌内注射100μg的编码II型胶原蛋白的未经修饰的自身载体或经修饰的载体，每周一次，持续三周，所述注射在疾病引发前或为治疗复发CIA的临床CIA发作后进行。DNA疫苗接种后，在尾巴基部通过皮内注射100μg的纯化的牛II型胶原蛋白使用CIA诱导激发小鼠，所述牛II型胶原蛋白配制于完全弗氏佐剂(CFA)。
每日观察注射后的小鼠，持续12周，以收集CIA的临床证据，其基于可视评分系统：0，无红斑和肿胀证据；1，限于足中段(跗骨)或踝关节的红斑及轻微肿胀；2，从踝延伸至足中段的红斑及轻微肿胀；3，从踝延伸至跖骨关节的红斑及中度肿胀；以及4包括踝、足和趾的红斑及重度肿胀(Coligan et al.，John Wiley and Sons，Inc 15.5.1-15.5.24，1994)。每一动物的临床评分是其四爪可视评分的总和。对发生临床关节炎的小鼠的关节进行组织学分析。对具有最高可视评分的肢的第一爪进行脱钙、切片并使用苏木精和曙红染色，并且检测该染色切片的淋巴细胞浸润、滑膜增生和侵蚀(Williams et al，1994)。
实施例26
使用经修饰的编码滑膜自身多肽组合的DNA自身载体通过DNA疫苗接种治疗人风湿性关节炎(RA)及靶向关节的其他自身免疫性疾病
本研究检测使用经修饰的编码并能表达自身多肽的自身载体进行DNA疫苗接种能否治疗人RA，所述自身多肽包含与RA相关的一种或多种自身抗原表位。在特别的实施方案中，预见了使用编码II型和IV型胶原蛋白的N-SSV组合的DNA疫苗接种。在其他实施方案中，使用具有编码BiP、gp39、和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶的HESV的DNA疫苗接种。还预见了使用编码BiP、gp39、和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶的HESV与编码II型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、和/或纤维蛋白的N-SHESV组合的DNA疫苗接种。通过PCR扩增从人cDNA文库分离Bip、gp39和葡萄糖-6-磷酸的人cDNA，并将其克隆至含有嵌合的β-球蛋白/Ig内含子的pBHT1，所述内含子位于每一经编码的自身多肽的起始密码子上游。使用含有符合读框起始密码子的5’引物通过PCR分离缺少信号序列的II型胶原蛋白、IV型胶原蛋白和纤维蛋白的人cDNA，并且将所述人cDNA克隆至pBHT1以产生N-SSV，或将其克隆至含有嵌合的β-球蛋白/Ig内含子的pBHT1以产生N-SHESV。
基于美国风湿病学学会标准(American College of RheumatologyCriteria)诊断患有新发作或正发作RA的人。诊断需要满足下列7条标准中的4条：(i)对称的多发性关节炎，(ii)涉及MCP、PIP或腕关节，(iii)涉及超过3种不同的关节区，(iv)手或足的X射线显示关节侵蚀，(v)风湿症因子测试阳性，(iv)晨僵超过1小时，以及(vii)伸肌表面节结。使用治疗有效量的约0.025mg至5mg的HESV和/或N-SHESV的组合治疗诊断为RA的患者，该HESV编码BiP、gp39和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶，该N-SHESV编码II型胶原蛋白、IV胶原蛋白和/或纤维蛋白。每月一次递送该多核苷酸疗法，持续6-12月，随后每3-12个月以维持剂量递送。对DNA治疗效果的监控基于其柔软和肿胀关节计数减少的患者的分数，所述分数超过20％(美国风湿病学学会20％反应、ACR20)、50％(ACR50)和70％(ACR70)。用于人RA的另外的测量包括炎性标志物(包括ESR和CRP)的减少、类固醇使用的减少、X光成像进展(包括侵蚀和关节间隙变窄)的减少以及伤残状态分数的改善(例如健康评定问卷(Health Assessment Questionnaire)-HAQ)。监控自身抗原效价和自身抗原谱的变化。相同的方法可用于诸如银屑病关节炎、反应性关节炎、莱特尔(Reiter)综合征、强直性脊柱炎和风湿性多肌痛的相关的关节炎。
实施例27
使用经修饰的编码烟碱乙酰胆碱受体α链的DNA自身载体通过DNA疫苗接种预防并治疗小鼠(大鼠)重症肌无力
本研究检测使用经修饰的编码烟碱乙酰胆碱受体α链(CHRNA1)的自身载体进行DNA疫苗接种，能否治疗大鼠的实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)。使用标准重组DNA技术构建编码CHRNA1的三种截然不同的载体：HESV、N-SHESV和SHESV。为产生HESV，通过RT-PCR从大鼠肌肉文库中分离CHRNA1的全长编码序列，并将其连接至含有β-球蛋白/Ig嵌合内含子的pBHT520(rAchR-HESV)。为产生N-SHESV，通过RT-PCR分离大鼠CHRNA1的胞外结构域(氨基酸21-230)，所述胞外结构域缺少信号序列及跨膜结构域，并将该分离到的胞外结构域连接至含有β-球蛋白/Ig嵌合内含子的pBHT520(rAchR-N-SHESV)。最后，为产生SHESV，通过RT-PCR分离大鼠CHRNA1的前230个氨基酸，并将其连接至含有β-球蛋白/Ig嵌合内含子的pBHT520(rAchR-SHESV)。
使用与完全弗氏佐剂混合的纯化自电鳐(eel Torpedo californica)产电器官的天然多亚基乙酰胆碱受体蛋白免疫大鼠，从而诱导重症肌无力。预防性和治疗性治疗方案都已采用。为预防疾病，在免疫前动物接受最少4次每周一次注射的上述经修饰的自身载体。为治疗疾病，在免疫后及以及疾病开始发作时，动物接受每周一次注射。手工从尾巴基部倒悬大鼠30s，通过此时大鼠紧握并从桌子反复提起300g架子的能力来评定肌肉强度。每日一次评分动物疾病的临床征兆以检测使用AchRα链修饰的自身载体进行DNA免疫在降低和/或回复疾病严重性上的能力，所述评分基于下列等级(Baggi et al.，JI 172：2697，2004)：
0正常；
1测试前无不正常，但最终强度降低；
2测试前出现临床征兆，即战栗、头部下垂、驼背及缺乏握力；
3测试前出现严重临床征兆(无法紧握)及垂死；
4死亡。
尽管已基本上详细描述了本发明的一种或多种具体实施方案，但是本领域技术人员知道，可以改变本申请具体公开的实施方案，但是所述修饰和改善不超出随后在权利要求中所描述的本发明范围和精神。本说明书引用的所有出版物或专利文件以引用的方式并入本文，如同将每一所述出版物或文件具体地并单独地指出以引用的方式并入本文。引用上述出版物或文件并非意在承认前述任一为相关现有技术，也不构成对所述出版物或文件的内容或日期的承认。
Figure A200680045690E01061
Figure A200680045690E01062

Claims (83)

1.治疗个体的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：
向个体给予有效量的经修饰的包括如下可操作的组合的自身载体：
(a)启动子；
(b)编码自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包含与所述自身免疫性疾病相关的自身抗原表位；以及
(c)转录终止子和多聚腺苷化序列；
其中，相对于未经修饰的自身载体，所述经修饰的自身载体包括提高表达的修饰。
2.如权利要求1所述的方法，其中为提高表达而对所述经修饰的自身载体进行的所述修饰是添加下列的一种或多种：
(i)增强子；
(ii)内含子；或
(iii)Kozak共同序列。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的自身载体上的启动子选自诸如SV40或人CMV的致病病毒的启动子、牛MHC I的启动子、诱导型启动子或人肌酸激酶启动子。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述增强子选自αB晶体蛋白基因(cryB)增强子、源自诸如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白或胰岛素的哺乳动物基因的增强子、或者源自诸如SV40或CMV早期增强子的真核细胞病毒的增强子。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的自身载体的转录终止子和多聚腺苷化序列是牛生长激素多聚腺苷化信号序列。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述内含子选自人CMV内含子A、SV40小t内含子、SV40 VP1内含子、源自编码所述自身多肽的基因的内源内含子、或诸如β-球蛋白/Ig嵌合内含子的嵌合内含子。
7.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括给予免疫调节序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述免疫调节序列选自
5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-[嘧啶]-[嘧啶]-3’，及
5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-[嘧啶]-[嘧啶]-3’，
其中X和Y是任一天然存在或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。
9.如权利要求1所述的方法，其中使用浓度约0.05mM至约2M的钙配制所述经修饰的自身载体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述钙浓度为约0.9mM至约8.1mM。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述钙浓度为约0.9mM至约5.4mM。
12.高表达自身载体，包含：
(a)启动子；
(b)编码自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包含与自身免疫性疾病相关的自身抗原表位；和
(c)转录终止子和多聚腺苷化序列；以及
(d)(i)增强子、(ii)内含子、或(iii)Kozak共同序列的一种或多种。
13.如权利要求12所述的高表达自身载体，其中所述启动子是人CMV的启动子。
14.如权利要求13所述的高表达自身载体，所述高表达自身载体还包括CMV早期增强子。
15.如权利要求12所述的高表达自身载体，其中所述转录终止子包括多聚腺苷化序列，所述多聚腺苷化序列是牛生长激素多聚腺苷化信号序列。
16.如权利要求12所述的高表达自身载体，还包括Kozak共同序列。
17.如权利要求12所述的高表达自身载体，还包括选自如下的内含子：人CMV内含子A、SV40小t内含子、SV40 VP1内含子、源自编码所述自身多肽的基因的内源内含子、或诸如β-球蛋白/Ig嵌合内含子的嵌合内含子。
18.如权利要求17所述的高表达自身载体，还包括源自CMV的内含子A的内含子。
19.如权利要求18所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码包含与I型糖尿病相关的自身抗原表位的自身多肽。
20.如权利要求19所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码胰岛素原。
21.如权利要求20所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码人胰岛素原。
22.如权利要求18所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码包含与多发性硬化相关的自身抗原表位的自身多肽。
23.如权利要求22所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码髓磷脂碱性蛋白。
24.如权利要求22所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码人髓磷脂碱性蛋白。
25.如权利要求12所述的高表达自身载体，其中使用浓度约0.05
mM至约2M的钙配制所述高表达自身载体。
26.如权利要求25所述的高表达自身载体，其中使用浓度约0.9mM至约8.1mM的钙配制所述高表达自身载体。
27.如权利要求25所述的高表达自身载体，其中使用浓度约0.9mM至约5.4mM的钙配制所述高表达自身载体。
28.高表达自身载体，包括：
(a)CMV启动子和CMV早期增强子；
(b)编码自身多肽的多核苷酸，所述自身多肽包含与自身免疫性疾病相关的自身抗原表位；
(c)牛生长激素多聚腺苷化信号序列和转录终止子；
(d)Kozak共同序列；以及
(e)β-球蛋白/Ig嵌合内含子。
29.如权利要求28所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码包含与I型糖尿病相关的自身抗原表位的自身多肽。
30.如权利要求29所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码胰岛素原。
31.如权利要求29所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码人胰岛素原。
32.如权利要求28所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码包含与多发性硬化相关的自身抗原表位的自身多肽。
33.如权利要求32所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码髓磷脂碱性蛋白。
34.如权利要求32所述的高表达自身载体，其中所述多核苷酸编码人髓磷脂碱性蛋白。
35.如权利要求28所述的高表达自身载体，其中使用浓度约0.05mM至约2M的钙配制所述经修饰的自身载体。
36.如权利要求35所述的高表达自身载体，其中所述钙浓度为约0.9mM至约8.1mM。
37.如权利要求36所述的高表达自身载体，其中所述钙浓度为约0.9mM至约5.4mM。
38.如权利要求1所述的方法，还包括给予编码Th2细胞因子的表达载体。
39.如权利要求1所述的方法，其中所述Th2细胞因子是IL-4、IL-10或IL-13。
40.如权利要求1所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自胰岛素依赖的糖尿病、多发性硬化、风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、斯耶格伦(氏)综合征、寻常天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮和格雷夫斯病。
41.治疗个体内自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：
向个体给予有效量的非分泌的自身载体，所述非分泌的自身载体包含可操作的组合：
(a)启动子；
(b)编码包含与自身免疫性疾病相关的自身抗原表位的自身多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸经修饰以编码所述自身多肽的非分泌或非膜结合形式；以及
(c)转录终止子和多聚腺苷化序列。
42.如权利要求41所述的方法，其中，相对于未经修饰的自身载体，所述非分泌的自身载体还包括提高表达的修饰。
43.如权利要求42所述的方法，其中为提高表达而对非分泌的自身载体进行的所述修饰是添加下列的一种或多种：
(i)增强子元件；
(ii)内含子；或
(iii)Kozak共同序列。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述非分泌的自身载体上的启动子选自诸如SV40或人CMV的致病病毒的启动子、牛MHC I的启动子、诱导型启动子或人肌酸激酶启动子。
45.如权利要求41所述的方法，其中所述增强子区域选自αB晶体蛋白基因(cryB)增强子、源自诸如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白或胰岛素的哺乳动物基因的增强子，或者源自诸如SV40或CMV早期增强子的真核细胞病毒的增强子。
46.如权利要求41所述的方法，其中所述非分泌的自身载体的转录终止子和多聚腺苷化信号序列是牛生长激素多聚腺苷化信号序列。
47.如权利要求41所述的方法，其中所述内含子选自人CMV内含子A、SV40小t内含子、SV40 VP1内含子、源自编码所述自身多肽的基因的内源内含子、或诸如β-球蛋白/Ig嵌合内含子的嵌合内含子。
48.如权利要求41所述的方法，其中使用浓度约0.05mM至约2M的钙配制所述经修饰的自身载体。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述钙浓度为约0.9mM至约8.1mM。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述钙浓度为约0.9mM至约5.4mM。
51.如权利要求41所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。
52.如权利要求41所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化。
53.如权利要求41所述的方法，还包括给予免疫调节序列。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述免疫调节序列选自
5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-[嘧啶]-[嘧啶]-3’，及
5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-[嘧啶]-[嘧啶]-3’，
其中X和Y是任一天然存在或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。
55.如权利要求41所述的方法，还包括给予编码Th2细胞因子的表达载体。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述Th2细胞因子是IL-4、IL-10或IL-13。
57.如权利要求41所述的方法，其中该自身免疫性疾病选自胰岛素依赖的糖尿病、多发性硬化、风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、斯耶格伦(氏)综合征、寻常天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮和格雷夫斯病。
58.非分泌的自身载体，包括：
(a)启动子；
(b)编码包含与自身免疫性疾病相关的自身抗原表位的自身多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸经修饰以编码所述自身多肽的非分泌或非膜结合形式；以及
(c)转录终止子和多聚腺苷化序列。
59.如权利要求58所述的非分泌的自身载体，所述非分泌的自身载体还包含下列的一种或多种：
(i)增强子；
(ii)内含子；或
(iii)Kozak共同序列。
60.如权利要求59所述的非分泌的自身载体，还包含CMV早期增强子。
61.如权利要求58所述的非分泌的自身载体，其中所述转录终止子和多聚腺苷化序列是牛生长激素多聚腺苷化信号序列。
62.如权利要求58所述的非分泌的自身载体，其还包含选自如下的内含子：人CMV内含子A、SV40小t内含子、SV40 VP1内含子、源自编码所述自身多肽的基因的内源内含子、或诸如β-球蛋白/Ig嵌合内含子的嵌合内含子。
63.如权利要求58所述的非分泌的自身载体，还包含源自CMV的内含子A的内含子。
64.如权利要求58所述的非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码包含与I型糖尿病相关的自身抗原表位的自身多肽，其中所述多核苷酸经修饰以编码所述自身多肽的非分泌或非膜结合形式。
65.如权利要求64所述的非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码胰岛素原。
66.如权利要求64所述的非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码人胰岛素原。
67.如权利要求58所述的非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码包含与多发性硬化相关的自身抗原表位的自身多肽，其中所述多核苷酸经修饰以编码所述自身多肽的非分泌或非膜结合形式。
68.如权利要求67所述的非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码髓磷脂碱性蛋白。
69.如权利要求67所述的非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码人髓磷脂碱性蛋白。
70.如权利要求58所述的非分泌的自身载体，其中使用浓度约0.05mM至约2M的钙配制所述经修饰的自身载体。
71.如权利要求70所述的非分泌的自身载体，其中所述钙浓度为约0.9mM至约8.1mM。
72.如权利要求71所述的非分泌的自身载体，其中所述钙浓度为约0.9mM至约5.4mM。
73.高表达非分泌的自身载体，其包含：
(a)CMV启动子和CMV早期增强子；
(b)编码包含与自身免疫性疾病相关的自身抗原表位的自身多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸经修饰以编码所述自身多肽的非分泌或非膜结合形式；
(c)牛生长激素多聚腺苷化信号序列和转录终止子；
(d)Kozak共同序列；以及
(e)β-球蛋白/Ig嵌合内含子。
74.如权利要求73所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码包含与I型糖尿病相关的自身抗原表位的自身多肽，其中所述多核苷酸经修饰以编码所述自身多肽的非分泌或非膜结合形式。
75.如权利要求74所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码胰岛素原。
76.如权利要求74所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码人胰岛素原。
77.如权利要求76所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述人胰岛素原如SEQ ID NO：2所示。
78.如权利要求73所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码包含与多发性硬化相关的自身抗原表位的自身多肽，其中所述多核苷酸经修饰以编码所述自身多肽的非分泌或非膜结合形式。
79.如权利要求78所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码髓磷脂碱性蛋白。
80.如权利要求78所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述多核苷酸编码人髓磷脂碱性蛋白。
81.如权利要求73所述的高表达非分泌的自身载体，其中使用浓度约0.05mM至约2M的钙配制所述经修饰的自身载体。
82.如权利要求70所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述钙浓度为约0.9mM至约8.1mM。
83.如权利要求71所述的高表达非分泌的自身载体，其中所述钙浓度为约0.9mM至约5.4mM。
CNA2006800456906A 2005-10-05 2006-10-04 治疗自身免疫性疾病的组合物和方法 Pending CN101365494A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72420305P 2005-10-05 2005-10-05
US60/724,203 2005-10-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101365494A true CN101365494A (zh) 2009-02-11

Family

ID=37943343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800456906A Pending CN101365494A (zh) 2005-10-05 2006-10-04 治疗自身免疫性疾病的组合物和方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20100160415A1 (zh)
EP (1) EP1931390B1 (zh)
JP (1) JP2009511014A (zh)
CN (1) CN101365494A (zh)
AU (1) AU2006302477A1 (zh)
CA (1) CA2624615A1 (zh)
IL (1) IL190520A0 (zh)
NZ (1) NZ567150A (zh)
WO (1) WO2007044394A2 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7199090B2 (en) * 2003-09-29 2007-04-03 Ethena Healthcare Inc. High alcohol content gel-like and foaming compositions comprising an alcohol and fluorosurfactant
DE102004062775A1 (de) 2004-12-21 2006-06-29 Stockhausen Gmbh Alkoholischer Pumpschaum
JP2008531740A (ja) 2005-03-07 2008-08-14 デブ ワールドワイド ヘルスケア インコーポレーテッド シリコーン・ベースの界面活性剤を含むアルコール含有量の高い発泡性組成物
WO2010151420A1 (en) * 2009-06-05 2010-12-29 Bayhill Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of insulin-dependent diabetes mellitus
EP2525825A1 (en) * 2010-01-20 2012-11-28 Bayhill Therapeutics, Inc. Combination therapy to treat autoimmune diseases
TWI545196B (zh) * 2011-05-25 2016-08-11 國立大學法人岡山大學 Ｒｅｉｃ表現腺病毒載體
KR101466874B1 (ko) * 2012-05-11 2014-12-03 가톨릭대학교 산학협력단 자가면역 질환의 예방과 치료를 위한 ｉｌ-６ 수용체에 대한 항체를 발현하는 미니서클
KR101466875B1 (ko) * 2012-05-11 2014-12-03 가톨릭대학교 산학협력단 항종양괴사인자 수용체 2를 발현하도록 설계된 미니서클 벡터를 이용한 자가면역질환 치료
AU2014351815B2 (en) 2013-11-22 2019-12-12 Amarna Holding B.V. Method for restoring immune tolerance in vivo
US10545144B2 (en) 2013-12-31 2020-01-28 Yeda Research And Development Co., Ltd. Diagnosis of systemic lupus erythematosus using oligonucleotides antigens
WO2015101987A1 (en) * 2013-12-31 2015-07-09 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods for assaying immunological competence
RU2019129803A (ru) * 2014-06-04 2020-12-14 Диамид Медикал Аб Новые комбинации для антигенной терапии
CN107533058A (zh) 2015-03-01 2018-01-02 免疫阵列有限公司 使用蛋白、肽和寡核苷酸抗原诊断系统性红斑狼疮
CA3028682A1 (en) * 2016-06-20 2017-12-28 Howard Y. Chang Circular rnas and their use in immunomodulation
BR112019007408A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-02 Novo Nordisk As vacina de dna tolerogênica
US11279745B2 (en) 2019-04-26 2022-03-22 Novo Nordisk A/S Tolerogenic DNA vaccine

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6274136B1 (en) * 1996-05-29 2001-08-14 University Of Southern California Construction and use of genes encoding pathogenic epitopes for treatment of autoimmune disease
WO2000002591A1 (en) * 1998-07-09 2000-01-20 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine formulations
ES2228467T3 (es) * 1999-02-03 2005-04-16 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Particulas terapeuticas de fosfato calcico y metodos de fabricacion y su uso.
US7030098B2 (en) * 1999-03-12 2006-04-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University DNA vaccination for treatment of autoimmune disease
US6479474B2 (en) * 1999-07-08 2002-11-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Dietary calcium as a supplement to vitamin D compound treatment of multiple sclerosis
CA2456821A1 (en) * 2001-08-02 2003-02-13 Trinity Biomedical Technology Corporation Human zona pellucida proteins and methods of their use in diagnosing male infertility
EP2301553A1 (en) * 2001-11-21 2011-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Polynucleotide therapy
CA2480634A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Use of statins and other immunomodulatory agents in the treatment of autoimmune disease
NZ546554A (en) * 2003-10-10 2009-04-30 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs

Also Published As

Publication number Publication date
EP1931390A4 (en) 2009-04-15
CA2624615A1 (en) 2007-04-19
NZ567150A (en) 2011-12-22
WO2007044394A3 (en) 2007-07-12
WO2007044394A2 (en) 2007-04-19
IL190520A0 (en) 2008-11-03
EP1931390A2 (en) 2008-06-18
EP1931390B1 (en) 2012-07-25
JP2009511014A (ja) 2009-03-19
US20100160415A1 (en) 2010-06-24
AU2006302477A1 (en) 2007-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101365494A (zh) 治疗自身免疫性疾病的组合物和方法
CN100534436C (zh) 多核苷酸
EP0884947B1 (en) Dna vaccination for induction of suppressive t cell response
US20110143994A1 (en) Compositions and methods for treatment of autoimmune and allergic diseases
CN102959082B (zh) 用于治疗自身免疫性和变应性疾病的新组合物和方法
CN101489382A (zh) 多核苷酸疗法
CN1652770A (zh) 使用抑制素和其它免疫调节剂治疗自身免疫病
CN100546657C (zh) 预防和治疗疾病的方法及免疫调节核酸组合物
US7378089B2 (en) Gene therapy for the prevention of autoimmune disease
JP2013517329A (ja) 自己免疫疾患を処置するための併用治療
WO1997026325A9 (en) Compositions and their uses for transfer of down-regulatory genes into cells associated with inflammatory responses
AU2008201186B2 (en) Polynucleotide therapy
CN101484176A (zh) 预防和治疗疾病的方法及免疫调节核酸组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090211