CN1652770A

CN1652770A - 使用抑制素和其它免疫调节剂治疗自身免疫病

Info

Publication number: CN1652770A
Application number: CNA03810847XA
Authority: CN
Inventors: H·盖伦; L·斯坦曼
Original assignee: Leland Stanford Junior University; Bayhill Therapeutics Inc
Current assignee: University of California; Bayhill Therapeutics Inc
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2005-08-10
Also published as: US20030229044A1; US20040002537A1; AU2003230765A1; JP2005527553A; WO2003082269A1; EP1494665A1; CA2480634A1

Abstract

提供治疗自身免疫病的方法，这是通过共施用抑制素和第2种免疫调节剂。第2种免疫调节剂可以是抗原特异或非抗原特异。

Description

使用抑制素和其它免疫调节剂治疗自身免疫病

相关专利申请的相互参照

此专利申请获得2002年3月29日提交的USSN 60/368,803的优先权，为了所有目的全部纳入本文供参考。

关于在联邦资助研究或发展下完成发明的权利的声明

本研究至少部分由国立卫生研究院的资助，资助号ROINS 18235。政府可拥有发明的某些权利。

发明的背景

免疫系统的复杂性是了解免疫系统功能紊乱的一个令人胆怯的障碍。近年来，分子生物技术可洞察构成免疫的机制和组成。免疫的故事很大程度上是淋巴细胞的故事。淋巴细胞具有非常复杂和精细的系统，用于彼此、与抗原呈递细胞、外来抗原和细胞相互作用。自身免疫病的例子包括多发性硬化、类类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和原发性胆汁性肝硬变。

多发性硬化(MS)是最普遍的中枢神经系统(CNS)脱髓鞘病，在北美影响350,000个(0.1％)人且全球影响110万人。一般，认为MS是部分由促炎CD4 T(Th1)细胞介导的自身免病，此细胞识别与抗原(Ag)呈递细胞(APC)上表达的MHC II类分子相关的特异髓鞘蛋白。与其它自身免疫病相似，MS易感性与MHC HLA-D区(HLA DR2(DRβ^*1501，DQβ^*0602)遗传相关。

MS是多阶段的。神经损伤发作在早期发生，其组织学特征是炎性损伤包含显著的CD4 T细胞、B细胞、MHC II类阳性巨噬细胞和小神经胶质细胞，小神经胶质细胞是居留CNS抗原呈递细胞(APC)。多次急性发作后，通常接着产生慢性“继发性进行性”阶段，伴随持续神经损伤。此“不可逆”阶段的特征是神经元损失和萎缩。

在美国，2种IFN-β药物avonex(IFN-β1a)和betaseron(IFN-β1b)以及copaxone(乙酸格拉太咪尔)批准用于治疗早期炎性“复发性-缓解性”阶段。IFNβ以非抗原特异方式发挥一些作用，而copaxone似乎优选影响地CNS自身抗原特异的T细胞。诺凡特龙是干扰DNA修复的癌症化疗剂，已批准用于治疗继发性进行性MS。除了它们的副作用和潜在毒性，这些药物仅部分有效，更需要开发新的免疫调节MS疗法。

称为“抑制素”的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂由于其在防止动脉粥样化形成中降低胆固醇效果被批准，有证据表明它们可能有益于治疗炎性疾病。在1995年，报导普代他汀治疗心脏移植病人与血液动力学上显著排斥发作减少和存活增加相关，不取决于其降低胆固醇效果。已知HMG-CoA还原酶产物甲羟戊酸盐的代谢物参与信号转导中的特异蛋白的翻译后修饰(异戊二烯化)和细胞分化。然而，当证明洛伐他汀抑制小神经胶质细胞和星形胶质细胞生成氧化氮合酶(iNOS)和促炎细胞因子(TNFα、IL-1β和IL-6)时，更加理解了开发抑制素的潜在免疫调节效果，星形胶质细胞是另一种CNS APC。观察到抑制素抑制iNOS分泌，提示它们也可能有神经保护作用。

抑制素通过抑制II类表达的主调节物MHC II型反式激活蛋白(CIITA)在IFN-γ-诱导型启动子(p)pIV的转录来防止非消化性APC上的IFN-γ-诱导型II类表达，但不改变使用pl的树突细胞或使用plll的B细胞中的组成型表达。因此，抑制素可通过非消化性居留CNS APC抑制抗原呈递。

抑制素抑制淋巴细胞分泌基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，此酶参与基膜降解和跨内皮屏障迁移，内皮屏障包括血脑屏障。抑制素结合淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)并防止与其配基ICAM-1相互作用和T细胞活化，这不取决于HMG-CoA还原酶抑制，LFA-1是β2-整联蛋白。这些发现提示抑制素可能在MS的病原级联的多个步骤中具有益的效果。与当前肠胃外施用的MS治疗相反，抑制素口服给予且耐受好。由于抑制素的活性似乎与目前批准的MS治疗不同，除了认为是单药治疗的候选的，它们也能用于联合治疗。

自身免疫病的其它例子包括类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和原发性胆汁性肝硬变。

类风湿性关节炎(RA)是慢性自身免疫炎性滑膜炎，影响0.8％的全球人口。其特征是导致侵蚀性关节破坏的慢性炎性滑膜炎。RA由T细胞、B细胞和巨噬细胞介导。

人I型或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的特征是自身免疫性破坏郎格汉斯胰岛的β细胞。耗竭β细胞导致不能调节血液中的葡萄糖水平。在人类中，糖尿病发作前有一段长的症状前阶段。在此阶段期间，胰腺β细胞功能逐渐丧失。糖尿病发展包括存在自身抗体抗胰岛素、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)，它们各自是根据本发明的自身-蛋白、-多肽或-肽的例子。

自身免疫性葡萄膜炎是眼部的自身免疫病，估计影响400,000个人，在美国的发病率为每年43,000个新病例。自身免疫性葡萄膜炎目前用类固醇、免疫抑制剂如甲氨蝶呤和环孢菌素、静脉内免疫球蛋白和TNFα-拮抗物治疗。

原发性胆汁性肝硬变(PBC)是器官特异性自身免疫病，主要影响40-60岁间的女性。此群体中报导的流行率接近每1,000人1个。PBC的特征是进行性破坏肝内胆上皮细胞(IBEC)，IBEC衬入小肝内胆管。这导致妨碍和干扰胆汁分泌，最终引起硬化。已报导与其它的免疫病相关的特征是上皮衬(lining)/分泌系统损害，包括舍格伦综合征、肢端硬皮综合征、自身免疫性甲状腺病和类风湿性关节炎。

发明概述

本发明提供治疗自身免疫病的方法，通过共施用有效量的抑制素和第2种免疫调节剂给罹患疾病的病人。可根据本文所提供方法治疗的自身免疫病包括例如多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、类风湿性关节炎或自身免疫性葡萄膜炎。自身免疫病可以是多阶段的，例如脱髓鞘自身免疫病(如多发性硬化)。

在一些实施方案中，抑制素在自身免疫病开始发作后施用。例如，抑制素能在疾病缓解阶段或主动发作期间施用。抑制素可以是例如罗苏伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、昔伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀或西伐他汀。

在发明的一些实施方案中，第2种免疫调节剂抗原特异。在一个实施方案中，抗原特异性免疫调节剂是自身载体，包括编码自身免疫病相关的自身多肽的多核苷酸。多核苷酸编码的自身多肽可以是例如蛋白或肽。在一些实施方案中，包含多核苷酸的自身载体编码一种自身多肽。

在另一个实施方案中，抗原特异性免疫调节剂是多肽。多肽可以是例如蛋白或肽。此外，多肽可包括疾病相关的自身多肽或能包括对应于疾病相关的自身多肽的自身抗原表位的氨基酸。在多肽包括对应于自身抗原表位的氨基酸的实施方案中，氨基酸可随机形成随机共聚物或有序从而多肽包括有序的氨基酸基序。在自身免疫病是脱髓鞘自身免疫病的实施方案中，有序的氨基酸基序是[1E2Y3Y4K]n，其中n从2到6。

在治疗脱髓鞘自身免疫病(如多发性硬化)的实施方案中，多核苷酸编码的多肽可以是例如髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MBOP)、髓鞘少突胶质细胞蛋白(MOG)或α-B晶体。脱髓鞘病可以是例如多发性硬化。

在治疗胰岛素依赖性糖尿病的实施方案中，多核苷酸编码的自身多肽可以是例如胰岛素、胰岛素B链、前胰岛素原、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶(65kDa或67kDa形式)、酪氨酸磷酸酶IA2或IA-2b、羧肽酶H、热激蛋白、glima38、岛细胞抗原的69kDa形式、p52或岛细胞葡萄糖转运子(GLUT2)。在一些实施方案中，含多核苷酸的自身载体编码一种自身多肽例如前胰岛素原或胰岛素B链9-23。

在其它实施方案中，自身免疫病是类风湿性关节炎。当治疗类风湿性关节炎时，多核苷酸编码的多肽可以是例如II型胶原；hnRNP A2/RA33；Sa；聚丝蛋白；角蛋白；包含gp39的软骨蛋白；I、III、IV、V、IX、XI型胶原；HSP-65/60；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；或醛缩酶A。

在治疗自身免疫性葡萄膜炎的实施方案中，多核苷酸编码的多肽可以是例如S抗原、光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP)、视紫质或恢复蛋白。

在其它实施方案中，第2种免疫调节剂是非抗原特异的。在一个实施方案中，非抗原特异性免疫调节剂是骨桥蛋白或自身载体，自身载体包括编码骨桥蛋白的多核苷酸。在另外的实施方案中，非抗原特异性免疫调节剂是免疫调节序列。免疫调节序列可以是例如5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶3’，其中X和Y是任何天然产生或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。

附图简述

图1.通过口服阿托伐他汀防止和治疗EAE。在C57B1/6小鼠中MOG p35-55-诱导的EAE发作时治疗防止临床恶化(A，每组7只小鼠)，而发作后治疗改善EAE(B，每组14只小鼠)。在SJL/J小鼠中PLP p139-151-诱导的EAE发作时治疗防止复发(C，每组10只小鼠)，而急性EAE开始后治疗逆转EAE复发(D，每组10只小鼠)，防止MBP Ac1-11 Tg小鼠中MBP Ac1-11诱导的急性EAE(E，每组6只小鼠)。各图下的水平柱表示阿托伐他汀治疗阶段。平均EAE分数根据EAE诱导后的天数作图。

图2.阿托伐他汀治疗脑中单核浸润的减少。

图3.阿托伐他汀体内下调CNS中的不同CIITA转录物的表达。治疗3组SJL小鼠：1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀或仅PBS12天。治疗开始后2天，EAE用PLP139-151/CFA在这些小鼠中诱导。在治疗第12天(相当于EAE的第10天)，杀死每组的2只小鼠和2只原首次用于实验的小鼠。总RNA提取自脑且总CIITA表达和特异性CIITA表达用实时PCR技术分析。(A)显示所有CIITA mRNA转录物的总表达(如内部转录物所证明)，(B)显示形式I或设计启动子I(PI，对树突细胞特异)的特异性表达，(C)显示形式III或设计启动子III(PIII，对B细胞特异)的特异性表达和(D)显示形式IV或设计启动子IV(PIV，IFN-γ诱导形式且对小神经胶质细胞特异)的特异性表达。平均转录物拷贝根据治疗组作图。星号表示各情况中阿托伐他汀治疗或原初组相比PBS治疗组没有统计上显著的差异(p0.05，单向ANOVA测试)。

图4.阿托伐他汀抑制增殖并促进Th2细胞因子偏性。(A)来自阿托伐他汀治疗和载体治疗PLP p139-151免疫小鼠的PLP p139-151-刺激脾细胞的增殖反应。阿托伐他汀治疗与IL-2(B)和IFN-γ(C)分泌减少、IL-4(D)和IL-10(10mg/kg阿托伐他汀)(E)生成增加相关。增殖通过³H-胸苷结合测量，细胞因子通过ELISA测量。

图5.(A)进行抗磷STAT6-特异Western以确定小鼠中的STAT6活化程度，小鼠用PBS(1泳道)、1mg/kg阿托伐他汀(2泳道)、10mg/kg阿托伐他汀(3泳道)或mrIL-4(10ng/ml)处理淋巴细胞(4泳道)治疗。样品获得自不同组小鼠排出淋巴结细胞的蛋白裂解物。如正对照(4泳道)所见，IL-4治疗和阿托伐他汀治疗活化淋巴结细胞中预期的105kDa STAT6异构体(B和C)。剥下相同的印迹并用抗Stat6(B)或小鼠CD3(C)的抗体作为对照再探测以确保各泳道上样相等。所示数据代表2个单独实验中进行的2次不同Western印迹。分子量以千道尔顿表示。

图6A.编码来自自身蛋白蛋白脂质蛋白(PLP)的肽的DNA减少T细胞增殖反应。淋巴结细胞(LNC)对于PLP139-151的增殖反应在DNA接种小鼠中降低。从疾病急性阶段恢复后，杀死注射编码PLP139-151(A)或对照载体pTarget(B)的DNA的动物，分离排出的LNC。通过不同浓度的肽PLP139-151(正方形)或对照肽PLP178-191(三角形)刺激来体外测试细胞。来自5只动物组的集合的LNC增殖反应表示为一式三份孔的平均CPM±SD。伴刀豆球蛋白A(0.001mg/ml)刺激LNC的CPM对于组A是102401，对于组B是76702。

图6B.在ELISA分析基础上，细胞因子水平在来自DNA免疫动物的LNC中减少。EAE急性期后，来自5只动物组的LNC体外用免疫肽PLP139-151刺激，动物用编码PLP139-151的质粒DNA或单用载体(pTarget)接种。γ-干扰素(条纹柱)或IL-2(虚线柱)的水平通过ELISA在上清中测试并与已知标准对照比较。结果以ng/ml表示。

图6C.在RNA酶保护测定基础上，细胞因子水平在来自DNA免疫动物的LNC中减少。对于细胞因子mRNA检测，来自实验动物脑的RNA样品用多探针RNA酶保护测定测试且反应用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在走电泳结束时干燥凝胶并对X光胶片曝光。

图7.有抑制IMS的多核苷酸治疗抑制PLP139-151介导的EAE。在第0天，7周龄雌性SJL/J小鼠用PBS中的100μg PLP139-151皮下免疫，PLP139-151在CFA中乳化，由IFA和0.5mg热杀伤结核分支杆菌组成。在第7天开始每天给动物临床打分。在第12天，小鼠用PBS中的总共0.1ml 0.25％盐酸布比卡因注射两个四头肌。2天后，所选小鼠肌肉内注射两个四头肌，注射用0.2ml TE总体积中各单独pTARGET质粒(各25μg)上编码全长鼠PLP、MAG、MOG和MBP的DNA多核苷酸加50μg编码全长鼠IL-4的pTARGET质粒。DNA注射以每周间隔给予6周。与初始DNA治疗同时，200μlPBS体积中50μgIMS单独腹膜内施用或结合DNA多核苷酸治疗。IMS每隔一周给予，连续6周。

图8是描述有序肽治疗大鼠中防止EAE的图。图例：有序肽{SEQ ID NO：4}EYYKEYYKEYYK防止刘易斯大鼠中EAE的发展。动物用完全弗氏佐剂中0.1mgMBPp85-99乳剂注射，用于诱导EAE。10天后，当疾病的临床症状明显时，施用腹膜内单剂量肽{SEQ ID NO：4}EYYKEYYKEYYK(正方形)、{SEQ ID NO：5}KYYKYYKYYKYY(三角形)或PBS(圆形)。结果表示为6只动物组的平均疾病分数。

图9A.1mg/kg阿托伐他汀结合编码自身蛋白蛋白脂质蛋白(PLP)的DNA减少EAE严重性。在第0天，7周龄雌性SJL/J小鼠用PBS中的100μgPLP139-151皮下免疫，PLP139-151在CFA中乳化，由IFA和0.5mg热杀伤结核分支杆菌组成。在第7天开始每天给动物临床打分。在第15天，小鼠用PSB中总共0.1ml0.25％盐酸布比卡因注射两个四头肌。2天后，小鼠随机分成治疗组并用0.2ml TE总体积中的DNA多核苷酸肌肉内注射两个四头肌，DNA多核苷酸编码全长鼠PLP(50μg每小鼠)。实验中，DNA注射以每周间隔给予。与初始DNA治疗同时，阿托伐他汀以lmg/kg剂量在0.5ml体积中口服施用。阿托伐他汀在实验中每天施用。对照小鼠在每日基础上口服给予0.5ml PBS。每日监控小鼠的EAE疾病并指示治疗组的平均分数。

图9B.10mg/kg阿托伐他汀结合编码自身蛋白蛋白脂质蛋白(PLP)的DNA减少EAE严重性。实验如图1A进行，除了阿托伐他汀以10mg/kg施用。

图9C.DNA治疗在1mg/kg和10mg/kg阿托伐他汀剂量提供的益处相等。直接比较图1A和1b中的数据以证明DNA效果在2个测试的阿托伐他汀剂量上相等。

发明的详细描述

本发明的方法提供治疗自身免疫病的联合疗法，包括多阶段的自身免疫病如自身免疫性脱髓鞘病(例如多发性硬化)，使用甲羟戊酸途径抑制剂如抑制素。FDA批准长期使用β-干扰素和乙酸格拉太咪尔(glatiramer)，它是髓鞘碱性蛋白(MBP)的合成形式，副作用少于干扰素。其它治疗包括施用编码自身抗原的核酸、肽和其它免疫抑制方案。其它试剂的联合使用甲羟戊酸盐途径抑制剂如抑制素能具有优势，单独药物的所需剂量较低且不同药物效果互补。

治疗自身免疫病的联合疗法包括共施用有效剂量的甲羟戊酸盐途径抑制剂和有效剂量的第2种免疫调节剂给罹患疾病的病人。在较佳实施方案中，甲羟戊酸盐途径抑制剂是抑制素。显示抑制素使免疫反应转换成调节Th2反应，这主要通过生成IL-4和IL-10细胞因子，当治疗开始于首次发作后时能成功逆转复发性脱髓鞘病中的瘫痪。

在一些实施方案中，第2种免疫调节剂是抗原特异的。优选的抗原特异性免疫调节剂包括自身载体，其中自身载体包括编码与疾病相关的自身多肽的多核苷酸。在其它较佳实施方案中，治疗的自身免疫病是脱髓鞘病且抗原特异性免疫调节剂是有序肽，包括重复基序(SEQ ID NO：1)[¹E²Y³Y⁴K]_n，其中n从2到6。

在发明的其它实施方案中，第2种免疫调节剂是非抗原特异的。在较佳实施方案中，非抗原特异性免疫调节剂是免疫调节寡核苷酸。

活性剂(甲羟戊酸盐途径抑制剂或免疫调节剂)可在疾病发作前、期间或之后施用。尽管受试者方法用于预防或治疗目的，特定兴趣是在疾病发作后共施用甲羟戊酸盐途径抑制剂和抗原特异性免疫调节剂，例如在缓解期间；疾病复发期间等。显示当治疗起始于首次发作后时，甲羟戊酸盐途径抑制剂结合抗原特异性治疗剂能成功逆转复发性脱髓鞘病导致的瘫痪。

在更详细陈述发明前，阐明下文所用一些术语的定义有助于进一步理解。

定义：

除非另有定义，本文所用全部技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。尽管任何类似于本文所述的方法和材料能用于实践或测试本发明，仅描述示范方法和材料。为了本发明目的，下列术语定义于下。

如本文所用，术语“一”、“该”是非限制性且包括复数所指的对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如提到“一个复合体”包括多种这种复合体，提到“制剂”包括一种或多种制剂和本领域技术人员已知的其等价物等。

如本文所用，术语“治疗”用于指防止疾病和治疗先存在的疾病。

术语“自身免疫病”指具有发病机制特征至少部分是适应性免疫的任何病症，免疫误导向健康细胞和/或身体组织。自身免疫病的特征是异常靶自身分子(如自身多肽)的T和/或B淋巴细胞，引起体内器官、组织或细胞类型(如胰腺、脑、甲状腺或胃肠道)损伤和/或功能失常。自身免疫病包括影响特定组织以及多种组织的紊乱。此外，如本文所用，术语“自身免疫病”可包括疾病的急性、慢性和/或复发-缓解形式。自身免疫病的例子包括类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GvHD)、炎性肠病(IBD)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬变、系统性硬化、牛皮癣、自身免疫性甲状腺炎和自身免疫性血小板减少性紫癜。

“受试者”或“病人”指任何动物，例如人、非人的灵长类动物、马、牛、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。

如本文所用，术语“分子”、“化合物”和“试剂”同义且广泛用于指潜在能经非共价相互作用与蛋白在结构上相互作用的分子，例如经氢键、离子键、范德华引力或疏水相互作用。例如，试剂通常包括与蛋白在结构上相互作用必需的官能团，特定是参与氢键的基团。试剂可包括例如小分子药物；肽，包括变体类似物、同系物、修饰肽或肽类似物质如肽模拟物或类肽；或蛋白、其片段。试剂可以是非天然产生，由体外方法生成，或可以是天然产生，例如细胞中内源表达的蛋白或其片段或者来自cDNA文库。

术语“多肽”指氨基酸和其等价物的聚合物且不指特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白包括在多肽定义内。“片段”指多肽部分通常有至少10个毗连氨基酸，更常有至少20个，更加常有至少50个多肽的毗连氨基酸。衍生物是与另外序列相比，有保守或非保守氨基酸取代的多肽。衍生物进一步包括例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。“多肽”定义内进一步包括例如一种或多种氨基酸类似物(如非天然或“非经典”氨基酸等)、有取代键以及本领域已知其它修饰的多肽，它们天然和非天然产生。因此，“多肽”可包括药学上可接受多肽的盐。

如本文所用，术语“药学上可接受盐”指无机酸加成盐如氢氯化物、硫酸盐和磷酸盐，或有机酸加成盐如乙酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和柠檬酸盐。药学上可接受金属盐的例子是碱性金属盐如钠盐和钾盐，碱土金属盐如镁盐和钙盐、铝盐和锌盐。药学上可接受铵盐的例子是铵盐和四甲基铵盐。药学上可接受有机胺加成盐的例子是有吗啉和哌啶的盐。药学上可接受氨基酸加成盐的例子是有赖氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸的盐。

如本文所用，术语“自身多肽”指动物基因组内编码的任何多肽或其片段或衍生物，它在动物中表达，可在动物生命中的某一时间翻译后修饰并作为自体抗原(即自身抗原)与自身免疫病相关。自身多肽的翻译后修饰的例子是糖基化，加入脂基、通过磷酸酶去磷酸化、加入二甲基精氨酸残基、通过肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)聚丝蛋白和纤维蛋白的瓜氨酸化(citrullination)；αB晶体磷酸化；MBP的瓜氨酸化；通过半胱天冬酶和粒酶的SLE自身抗原蛋白水解。“抗原”指能被免疫反应的组分如淋巴细胞或抗体特异识别的任何分子。自身多肽不包括免疫蛋白，免疫蛋白是由免疫系统的细胞特异和专一表达的分子，用于调节免疫功能。一些包括于自身多肽定义的免疫蛋白是：MHC I类膜糖蛋白、MHC II类糖蛋白和骨桥蛋白。

“自身载体”指载体包括编码自身多肽的多核苷酸，是DNA或RNA。如本文所用，多核苷酸是一系列包括DNA的脱氧核糖核酸或包括RNA的核糖核酸及它们的衍生物。自身多肽编码序列插入适当质粒表达自身盒。一旦编码自身多肽的多核苷酸插入表达自身盒，它称为“自身载体”。在待施用的多核苷酸编码超过一种自身多肽的情况中，单个自身载体可编码多种不同自身多肽。在一个实施方案中，编码一些自身多肽的DNA在单个自身质粒中连续编码，使用内部核糖体再进入序列(IRES)或其它方法以从单个DNA分子表达多种蛋白。制备编码自身多肽的DNA表达自身载体并用分离质粒DNA的常用技术分离，如商业购买自Qiagen公司的技术。纯化DNA无细菌内毒素，用于作为治疗剂传递给人。另外，各自身多肽在单独DNA表达载体上编码。本发明涵盖的自身载体进一步定义于WO053019。

“质粒”和“载体”由小写字母p和之后的字母和/或数字命名。起始质粒可商业购买，可无限制地公开获得，或能从符合发表过程的可用质粒构建。此外，与所述质粒相当的质粒在本领域已知且对于普通技术人员是显而易见的。“载体”或“质粒”指任何遗传元件，它们存在于宿主细胞时能通过包括适当控制和调节元件来复制。为了本发明目的，载体或质粒的例子包括但不限于质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒等。

“转染”指将DNA导入宿主细胞从而表达DNA，无论是功能性表达或其它；DNA也可作为染色体外元件或通过染色体整合来复制。除非另有说明，本文所用转化宿主细胞的方法是磷酸钙共沉淀方法，Graham和van der Eb(1973)Virology52，456-457。另外的转染方法是电穿孔、DEAE-葡聚糖方法、脂转染和生物导弹术(Kriegler(1990)《基因转移和表达：实验室手册》(Gene Transfer and Expression：ALaboratory Manual)，Stockton Press)。

如本文所用，关于试剂的“抗原特异”指试剂能与抗原识别分子(如T细胞受体、B细胞上的表面IgM)特异地相互作用，以区分同类但有不同抗原特异性的抗原识别分子。由于抗原识别分子通常无性地分布于B或T淋巴细胞，活性抗原特异性试剂能对特定淋巴细胞亚群产生免疫调节作用，此亚群表达与试剂相互作用的特定抗原识别分子。试剂与抗原识别分子的相互作用可以是例如在其它分子相互作用中，如肽抗原结合T细胞受体作为肽：MHC复合体。

如本文所用，“调节免疫反应”指体外或体内现有或潜在免疫反应的任何改变。在自身免疫病中，这种改变是抗自身分子的免疫反应的改变。调节可包括任何免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞等)中存在或功能的任何改变，这些细胞参与或有参与免疫反应的潜力。调节包括例如免疫细胞中作为免疫反应部分的基因、蛋白和/或其它分子表达和/或功能的改变；去除、缺失或鳌合免疫细胞；诱导或产生能调节其它细胞功能的免疫细胞，例如自身反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞(APCs)或炎性细胞；在免疫细胞中诱导无反应状态(如无反应性)；或者增加、减少或改变免疫细胞的活性或功能。免疫细胞表达蛋白的模式改变可包括例如某些分子种类生成和/或分泌的改变，如细胞因子(例如IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4)、趋化因子、生长因子、转录因子(例如NF-κB)、激酶(例如Lock、Lyn)、磷酸酶(例如(PTP-1C、PTP-1D)、共刺激分子(例如B7.1/B7.2、CTLA-4、CD40、ICAM、LFA-1)或其它细胞表面受体。

如本文所用，“免疫调节序列(IMSs)”指试剂由脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其类似物组成，它们调节自身免疫或炎性疾病。IMSs可以是寡核苷酸或掺入载体的核苷酸序列。根据本文提供方法使用的IMSs进一步描述于美国专利申请号10/302098，全部纳入本文供参考。

如本文所用，“免疫调节剂”指能调节宿主免疫反应的分子。免疫调节剂可以是例如核酸(如DNA)或多肽(如蛋白、糖蛋白、肽等)。另外，免疫调节剂可抗原特异(如多肽包括自身抗原表位或与自身抗原表位免疫交叉反应)或非抗原特异(如细胞因子、白介素、干扰素或免疫调节序列)。免疫调节多肽可包括多肽的重组或合成形式。免疫调节多肽可包括例如包含与寻求治疗疾病相关的自身抗原的多肽，或另外与自身抗原免疫交叉反应的多肽。此外，免疫调节多肽可包括例如细胞因子(或其功能片段)如白介素、干扰素或集落刺激因子。免疫调节多肽可包括例如趋化因子或共刺激分子或其功能片段。天然蛋白是膜结合分子(例如受体如细胞因子受体(如TNF-αR、IL-2R)或共刺激分子例如CD40、CTLA-4或B7分子)时，本文所述方法中使用的免疫调节多肽可以是蛋白的可溶形式，例如Ig融合蛋白。制备可溶性Ig融合重组形式受体的方法在本领域已知(参见例如美国专利号5,750,375)。

术语“活性剂”指能调节免疫反应的任何试剂。

如本文所用，术语“有效量”和“有效剂量”同义。施用试剂(抑制素、自身载体或有序肽)中的“有效剂量”指分子量足以调节受试者中的自身免疫反应，从而抑制受试者中靶自身免疫反应发生或改善一种或多种症状。因此，试剂的有效剂量是当施用适当时间段时自身免疫病的严重性明显减少的剂量。自身免疫病的严重性明显减少的适当施用时间段通常至少约1周，可以是约2周或更多，直至约4周的时间段。本领域技术人员要理解的是，初始剂量可施用于这些时间段，接着是维持剂量，在一些病例中维持剂量是减少的剂量。

此外，有效量的抑制素、自身载体或有序肽根据本发明方法以“有效方案”施用。术语“有效方案”指试剂量与剂量频率的组合足以完成治疗或防止自身免疫病。

另外，联合疗法(如抑制素加自身载体或抑制素加有序肽)中有效量的特定试剂指当特定试剂量与第2种活性剂共施用适当时间段时，自身免疫病的严重性相比单用第2种活性剂观察到的明显减少。在一些实施方案中，试剂组合产生协同疗效。如本文所用，“协同”指大于添加。在发明的其它实施方案中，施用有效量的第2种活性剂能降低第一种试剂量，此量需使自身免疫病的严重性相比单用第一种试剂观察到的明显减少。第2种活性剂存在时这种试剂“有效量”减少在本文称为“节省”，即施用第2种试剂用不首施用第一种试剂。

自身免疫病

本发明提供治疗或防止自身免疫病的方法。疾病进展可通过监控临床或诊断症状来测量，使用已知方法例如下文所述方法。

可根据本文提供的方法治疗的一些自身免疫病的例子描述于下。

特别感兴趣的发明方法用于治疗脱髓鞘病，包括多发性硬化、EAE、视神经炎、急性横贯性脊髓炎和急性播散性脑炎。

多发性硬化.多发性硬化的疾病进程高度变化、不可预测，在大部分病人中是间歇性的。MS的病理标志是多中心、多阶段CNS炎症和脱髓鞘。缓解几个月或几年可单独发作，特别在疾病早期。约70％的复发-缓解(RR)类型病人的特征是急性加剧，充分或部分缓解。剩余存在慢性进行性MS的病人再进一步分成(a)原发性-进行性(PP)，(b)复发-进行性(RP)，此模式结合RR和RP的特征且临床严重性处于中间，(c)继发性-进行性(SP)，许多患RR的病人随着时间发展。

MS的临床症状包括感觉丧失(感觉异常)、运动(痉挛状态继发的肌肉痛性痉挛)和自主(膀胱、肠、性功能障碍)的脊髓症状；小脑症状(如查科三联征构音障碍、共济失调、震颤；疲劳和头晕；神经心理学测试中的信息加工损伤；眼部症状，包括侧视中的复视；三叉神经痛和视神经炎。

MS中的自身抗原最可能是一些髓鞘蛋白(如蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突细胞糖蛋白(MOG)；髓鞘碱性蛋白(MBP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；髓鞘相关少突细胞碱性蛋白(MBOP)；瓜氨酸修饰的MBP(MBP的C8同种型，其中6个精氨酸脱亚氨成瓜氨酸)、环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、α-B晶体等)之一。整合膜蛋白PLP是髓鞘的显性自身抗原。小神经胶质细胞和巨噬细胞共同作为抗原呈递细胞，导致活化细胞因子、补体和炎症过程的其它调节物，靶向特异性少突细胞和其膜髓鞘。具有分泌IFN-γ能力的髓鞘-自身反应性T细胞的定量增加与MS和EAE的发病机制相关，提示MS病人的外周血中自身免疫诱导物/辅助T淋巴细胞可起始和/或调节MS病人的脱髓鞘过程。

类风湿性关节炎.类风湿性关节炎(RA)是慢性自身免疫性炎性滑膜炎，影响0.8％的全球人口。其特征是导致侵蚀性关节破坏的慢性炎性滑膜炎。RA由T细胞、B细胞和巨噬细胞介导。

T细胞在RA中发挥关键作用的证据包括(1)浸润滑膜的CD4+T细胞占主导，(2)临床改善与用药物如环孢菌素抑制T细胞功能相关，(3)RA与一些HLA-DR等位基因相关。与RA相关的HLA-DR等位基因包含β链的第3个高变区67-74位氨基酸的类似序列，它们参与肽结合和呈递给T细胞。RA由自身反应性T细胞介导，这些T细胞识别滑膜关节中存在的自身蛋白或修饰的自身蛋白。本发明的自身多肽也称为自身抗原，在RA中靶向且包括来自II型胶原的抗原表位；hnRNP；A2/RA33；Sa；聚丝蛋白；角蛋白；瓜氨酸；包括gp39的软骨蛋白；I、III、IV、V、IX、XI型胶原；HSP-65/60；IgM(类风湿因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心磷脂；醛缩酶A；瓜氨酸修饰的聚丝蛋白和纤维蛋白。在高比例RA病人的血清中鉴定了自身抗体，这些自身抗体识别含修饰的精氨酸残基(脱亚氨以形成瓜氨酸)的聚丝蛋白肽。自身反应性T和B细胞反应在一些病人中都针对相同的免疫显性II型胶原(CII)肽257-270。

胰岛素依赖性糖尿病.人I型或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的特征是自身免疫性破坏郎格汉斯胰岛中的β细胞。耗竭β细胞导致不能调节血液中的葡萄糖水平。当血液中的葡萄糖水平高于特定水平时，通常约250mg/dl，产生明显的糖尿病。在人类中，糖尿病发作前有一段长的症状前阶段。在此阶段中，逐步丧失胰β细胞功能。糖尿病的发展包括存在抗胰岛素的自身抗体、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)，它们各自是根据本发明的自身-蛋白、-多肽或-肽的例子。

可在症状前阶段期间评估的标记是胰中胰岛炎的存在、岛细胞抗体的水平和频率、岛细胞表面抗体、胰β细胞上MHC II类分子的异常表达、血中葡萄糖浓度和血浆胰岛素浓度。胰中T淋巴细胞、岛细胞抗体和血液葡萄糖的数量增加是疾病的征兆，胰岛素浓度减少也如此。

非-肥胖糖尿病(NOD)小鼠是动物模型，许多临床、免疫和组织学特征与人IDDM相同。NOD小鼠自发地发展岛的炎症和β细胞的破坏，导致高血糖症和明显的糖尿病。CD4+和CD8+T细胞都需要用于发展糖尿病，尽管各自的作用仍不清楚。已显示在NOD小鼠耐受情况下施用胰岛素或GAD作为蛋白，防止疾病并下调对其它自身抗原的反应。

血清中具不同特异性的自身抗体组合的存在是高度敏感的且对人I型糖尿病特异。例如，抗GAD和/或IA-2的自身抗体的存在约98％敏感且99％特异于来自对照血清的鉴定I型糖尿病特异。在I型糖尿病患者的非糖尿病一级亲属中，存在对3种自身抗原中的2种自身抗体特异对于5年内发展I型DM为＞90％的正预测值，自身抗原包括GAD、胰岛素和IA-2。

人胰岛素依赖性糖尿病中靶向的自身抗原可包括自身多肽酪氨酸磷酸酶IA-2；IA-2β；谷氨酸脱羧酶(GAD)，65kDa和67kDa形式；羧肽酶H；胰岛素；胰岛素原；热激蛋白(HSP)；glima38；岛细胞抗原69kDa(ICA69)；p52；2种神经节苷脂抗原(GT3和GM2-1)；岛细胞葡萄糖转运子(GLUT2)。

目前治疗人IDDM是通过监控血液葡萄糖水平以指导注射或以泵为基础传递重组胰岛素。饮食和锻炼方案有助于达到适当血液葡萄糖控制。

自身免疫性葡萄膜炎.自身免疫性葡萄膜炎是眼部的自身免疫病，估计影响400,000个人，在美国的发病率为每年43,000个新病例。自身免疫性葡萄膜炎目前用类固醇、免疫抑制剂如甲氨蝶呤和环孢菌素、静脉内免疫球蛋白和TNFα-拮抗物治疗。

实验自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是T细胞介导的自身免疫病，靶向神经视网膜、葡萄膜和眼中相关组织。EAU与人自身免疫性葡萄膜炎共享许多临床和免疫学特征，且通过外周施用葡萄膜产生的(uveitogenic)肽来诱导，此肽在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化。

人自身免疫性葡萄膜炎中由自身免疫反应靶向的自身蛋白可包括S-抗原、光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP)、视紫质和恢复蛋白。

原发性胆汁性肝硬变.原发性胆汁性肝硬变(PBC)是器官特异性自身免疫病，主要影响40-60岁间的女性。此群体中报导的流行率接近每1,000人1个。PBC的特征是进行性破坏肝内胆上皮细胞(IBEC)，IBEC衬入小肝内胆管。这导致妨碍和干扰胆汁分泌，最终引起硬化。已报导PBC与其它自身免疫病相关的特征是上皮衬(lining)/分泌系统损害，包括舍格伦综合征、肢端硬皮综合征、自身免疫性甲状腺病和类风湿性关节炎。关于驱动抗原的注意力集中于线粒体超过50年，从而发现抗线粒体抗体(AMA)(Gershwin等，Immunol Rev 174：210-225，2000)；(Mackay等，mmunol Rev 174：226-237，2000)。AMA很快成为实验室诊断PBC的基础，它在临床症状出现前很久就存在于90-95％病人的血清中。线粒体中的自身抗原反应性命名为M1和M2。M2反应性针对48-74kDa组成的家族。M2代表2-氧酸(oxoacid)脱氢酶复合体(2-OADC)的酶的多个自身抗原性亚基且是本发明自身多肽的另一个例子。鉴定丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)抗原在PBC发病机制中作用的研究支持PDC在疾病诱导中发挥重要作用的观念(Gershwin等，Immunol Rev 174：210-225，2000)；(Mackay等，Immunol Rev 174：226-237，2000)。95％PBC病例中最频繁的反应性是E2 74kDa亚基，它属于PDC-E2。存在相关但不同的复合体，包括：2-氧戊二酸脱氢酶复合体(OGDC)和分支链(BC)2-OADC。3种组成酶(E1，2，3)有助于催化功能，使2-氧酸底物转化成酰基辅酶A(CoA)，伴随着NAD+还原成NADH。哺乳动物PDC包含另外的组分，名为蛋白X或E-3结合蛋白(E3BP)。在PBC病人中，主要的抗原反应针对PDC-E2和E3BP。E2多肽包含2个串联重复的硫辛酰结构域，而E3BP有单个硫辛酰结构域。硫辛酰结构域发现于一些PBC的自身抗原靶并在本文称为“PBC硫辛酰结构域”。PBC用糖皮质激素和免疫抑制剂治疗，免疫抑制剂包括甲氨蝶呤和环孢菌素A。

实验自身免疫性胆管炎(EAC)的鼠模型使用腹膜内(i.p.)用哺乳动物PDC在雌性SJL/J小鼠中致敏，诱导非化脓性破坏性胆管炎(NSDC)和生成AMA(Jones，J ClinPathol 53：813-21，2000)。

其它自身免疫病和相关的自身多肽.用于重症肌无力的自身抗原可包括乙酰胆碱受体内的抗原表位。寻常性天疱疮中靶向的自身抗原可包括桥粒芯蛋白-3。舍格伦综合征抗原可包括SSA(Ro)；SSB(La)和胞影蛋白。用于寻常性天疱疮的显性自身抗原可包括桥粒芯蛋白-3。用于肌炎的组可包括tRNA合成酶(如苏氨酰、组氨酰、丙氨酰、异亮氨酰和甘氨酰)；Ku；Scl；SSA；U1 Sn核糖核蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku和SRP。用于硬皮病的组包括Scl-70；着丝粒；U1核糖核蛋白和核仁纤维蛋白。用于恶性贫血的组包括内因子和胃H/K ATP酶的糖蛋白β亚基。系统性红斑狼疮(SLE)的抗原表位抗原可包括DNA；磷脂；核抗原；Ro；La；U1核糖核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；钙网蛋白；Grp78；Scl-70；组蛋白；Sm蛋白和染色质等。对于格雷夫斯病，抗原表位可包括Na+/-同向转运子；促甲状腺素受体；Tg和TPO。

甲羟戊酸盐途径抑制剂

根据本发明治疗自身免疫病的方法包括使用是甲羟戊酸盐合成或效应途径抑制剂的试剂。甲羟戊酸盐代谢物参与G蛋白的修饰，如Ras。甲羟戊酸盐途径抑制剂用于抑制Ras蛋白的异戊二烯化和Raf/MAP激酶级联(Kikuchi等，J.Biol.Chem.，269：20054-20059(1994))。HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸盐焦磷酸脱羧酶是抑制甲羟戊酸盐途径的2个有用靶。

抑制素.在一个较佳实施方案中，甲羟戊酸盐途径抑制剂是抑制素。抑制素指一类已知的HMG-CoA还原酶抑制剂。这些试剂详细描述于例如美国专利号3,983,140所示类伐他汀和相关化合物、美国专利号4,231,938所示洛伐他汀(美维诺林)和相关化合物、美国专利号4,346,227所示普伐他汀和相关化合物、美国专利号4,448,784和4,450,171所示昔伐他汀和相关化合物；美国专利号5,354,772所示氟伐他汀和相关化合物；美国专利号4,681,893、5,273,995和5,969,156所示阿托伐他汀和相关化合物；美国专利号5,006,530和5,177,080所示西伐他汀和相关化合物。另外的化合物揭示于美国专利号5,208,258、5,130,306、5,116,870、5,049,696、RE 36,481和RE 36,520。近来，“超级抑制素”罗苏伐他汀已商业化。一些抑制素的亲脂性使它们特别适用于皮下传递。

本文提供的数据证明抑制素通过差异地改变特异性STAT(信号转导物和转录的激活物)蛋白活化来促进Th2调节T细胞的发育。STATs是转录因子的家族，经酪氨酸激酶的Janus激酶(JAK)家族的磷酸化来活化。STAT6对于Th2分化是关键的，而STAT4在Th1分化上有非常重要的作用。抑制素通过磷酸化差异地促进STAT6的活化。抑制素也抑制治疗的脑中不同CIITA启动子的调节，影响非消化性CNS APC上受抑制的CIITA定向的II类上调，从而防止抗原呈递给Th1细胞。

抑制素的制剂和施用是熟知的，一般遵循常规用法。治疗自身免疫病所需剂量可不同于控制胆固醇所用的水平，在一些情况中剂量较高，约超过常规剂量5倍(其中常规剂量用于指控制胆固醇的批准剂量)；约超过常规剂量10倍，可多至20倍或更高。

抑制素能掺入多种制剂用于治疗施用。更具体地，本发明化合物能通过组合适当药学上可接受载体或稀释剂来配制成药物组合物，并可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制品，如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。这样，化合物能以多种方法施用，包括口服、含服、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、经皮、鞘内等施用。施用后，活性剂可以是全身性或局部性，通过使用区域施用、壁内施用或使用在移植位置维持活性剂量的植入物。

抗原特异性免疫调节剂

在发明的一些实施方案中，抗原特异性免疫调节剂与甲羟戊酸盐途径抑制剂(如抑制素)共施用。抗原特异性免疫调节剂可以是例如核酸(如DNA或RNA)，如编码与疾病相关的自身抗原性自身多肽的多核苷酸。另外，抗原特异性免疫调节剂可以是例如多肽。例如，抗原特异性试剂可以是多肽，包括与疾病相关的自身抗原性抗原表位。这种多肽可以是例如蛋白自身抗原或包括其片段的多肽(如肽片段)、有自身抗原性抗原表位的多肽片段。同样，例如，多肽试剂可包括的氨基酸与构成自身抗原性抗原表位的氨基酸不相同，但与抗原表位免疫交叉反应。此外，多肽可包括例如对应于自身抗原性抗原表位的氨基酸，如随机排列(随机共聚物，例如乙酸格拉太咪尔)或排列为有序基序。抗原特异性免疫调节多肽至少约6个氨基酸长度，通常从约6个到约100个氨基酸，更常从约8个到约50个氨基酸，最常从约8个到约25个氨基酸。在其它实施方案中，抗原特异性免疫调节多肽可以是衍生的多肽。与另外序列相比，衍生物是有保守或非保守氨基酸取代的多肽。衍生物进一步包括例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。这种衍生物的例子包括改变的肽配基，如U6669033、6322949所述。

编码自身多肽的多核苷酸.在发明的一些实施方案中，抗原特异性免疫调节剂是包含多核苷酸的自身载体，其中多核苷酸编码与疾病相关的自身抗原性自身多肽。自身载体是表达“自身盒”，设计用于在转染到宿主细胞时表达编码的自身多肽。

构建本发明载体使用本领域熟知的标准连接和限制技术(参见Ausuel等，(1987)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley-Interscience或Maniatis等，(1992)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.)。分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸被切割、剪接并归入所需形式。所有掺入合成DNA的所有DNA构建物的序列通过DNA序列分析确认(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463-5467)。

表达自身盒使用在宿主细胞中有功能的启动子。一般，含启动子和控制序列的载体用于特定宿主细胞，启动子和控制序列获得自与宿主细胞相容的种类。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子。然而，其它功能性细菌启动子也适合。除了原核生物，也可使用真核微生物如酵母培养物。酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，尽管一些其它菌株通常可用。哺乳动物宿主细胞中来自载体的启动子控制转录可获得自多种来源，例如病毒基因组如：多形瘤病毒、猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和优选的巨细胞病毒，或者来自异源哺乳动物启动子如β-肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子可作为SV40限制片段方便地获得，此片段也包含SV40病毒的复制起点。人巨细胞病毒的中间早期启动子作为HindIII限制片段方便地获得。当然，来自宿主细胞或相关属的启动子也用于本文。

本文所用载体可包含选择基因，也称为可选择标记。选择基因编码蛋白，是用载体转化宿主细胞的存活或生长所必需的。用于哺乳动物细胞的合适的可选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、鸟氨酸脱羧酶基因、多药物抗性基因(mdr)、腺苷脱氨酶基因和谷氨酰胺合酶基因。当这种可选择标记成功地转入哺乳动物宿主细胞时，如果置于选择性压力下转化的哺乳动物宿主细胞能存活。有2类广泛使用的不同选择方案。第1类以细胞代谢为基础并使用突变细胞系，此细胞系缺乏不依赖补充培养基生长的能力。第2类称为显性选择，指用于任何细胞类型的选择方案且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用抑制宿主细胞生长的药物。有新基因的细胞表达赋予药物抗性的蛋白且在选择中存活。这种显性选择的例子使用药物新霉素(Southern和Berg(1982)J.Molec.Appl.Genet.1，327)、霉酚酸(Mulligan和Berg(1980)Science 209，1422)或潮霉素(Sugden等(1985)Mol.Cell.Biol.5，410-413)。上述3个例子使用真核控制下的细菌基因以分别赋予对适当药物新霉素(G418或庆大霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。

本发明的自身载体能制成多核苷酸盐，用作药物。多核苷酸盐可用非毒性无机或有机碱基制备。无机碱盐包括钠、钾、锌、钙、铝、镁等。有机非毒性碱基包括伯、仲、叔胺等的盐。这种自身DNA多核苷酸盐能制成冻干形式用于在传递前重建，如无菌水或盐溶液。另外，自身DNA多核苷酸盐能制成溶液、悬浮液或乳剂，包括以水或油为基础的载体用于传递。在一个较佳实施方案中，DNA在有生理水平的钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中冻干，随后施用前用无菌水重建。另外，DNA在含较高量Ca++的溶液中配制，量在1mM和2M间。DNA也能在缺乏特定离子种类时配制。

如本领域普通技术人员已知，有多种方法传递多核苷酸给受试者，如本文所定义。编码自身多肽的多核苷酸能用阳离子聚合物制成，包括阳离子脂质体。其它脂质体也代表配制和传递自身多核苷酸的有效方法。另外，自身DNA可掺入病毒载体、病毒粒子或细菌用于药理学传递。病毒载体可以是感染感受态、减毒(有减少诱导疾病能力的突变)或复制缺陷。使用自身DNA防止致病的自身蛋白的沉积、积聚或活性的方法可用病毒载体或其它传递系统增强，这些系统增加抗编码自身蛋白的体液反应。在其它实施方案中，DNA能缀合固体支持物，包括金粒、以多糖多基础的支持物，或者其它能注射、吸入或由粒子轰击(弹道传递)传递的颗粒或珠。

传递核酸制品的方法在本领域已知。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466。开发了一些以病毒为基础的系统用于转入哺乳动物细胞。例如，描述了逆转录病毒系统(美国专利号5,219,740；Miller等，Biotechniques 7：980-990，1989；Miller，A.D.，Human Gene Therapy 1：5-14，1990；Scarpa等，Virology 180：849-852，1991；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037，1993；Boris-Lawrie和Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109，1993)。也描述了一些腺病毒载体，参见例如(Haj-Ahmad等，J.Virol.57：267-274，1986；Bett等，J.Virol.67：5911-5921，1993；Mittereder等，Human Gene Therapy 5：717-729，1994；Seth等，J.Virol.68：933-940，1994；Barr等，GeneTherapy 1：51-58，1994；Berkner，K.L.，BioTechniques 6：616-629，1988；Rich等，HumanGene Therapy 4：461-476，1993)。也开发了腺伴随病毒(AAV)载体系统用于核酸传递。AAV载体能用本领域熟知技术方便地构建。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际出版号WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.8：3988-3996，1988；Vincent等，Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)1990；Carter，B.J.，《生物技术的当前观点》(Current Opinion in Biotechnology)3：533-539，1992；Muzyczka，N.，《微生物和免疫的当前主题》(Current Topics in Microbiol.And Immunol.)158：97-129，1992；Kotin，R.M.，Human Gene Therapy 5：793-801，1994；Shelling等，Gene Therapy 1：165-169，1994；Zhou等，J.Exp.Med.179：1867-1875，1994)。

本发明的多核苷酸也能没有病毒载体传递。例如，分子可包装于脂质体，然后传递给受试者。脂质胶囊化一般用脂质体完成，脂质体能稳定结合或截留和保持核酸。对于使用脂质体作为传递核酸的载体的综述，参见(Hug等，Biochim.Biophys.Acta.1097：1-17，1991；Straubinger等，《酶学方法》(Methods of Enzymology)，101卷，512-527页，1983)。

“治疗有效量”的自身载体根据本发明的讲授施用并足以治疗或防止疾病，例如通改善或去除症状和/或疾病的原因，自身载体含编码自身多肽的多核苷酸。例如，治疗有效量在广泛范围内且经临床试验确定，对于特定病人，在普通熟练临床医生已知因素基础上确定，包括疾病严重性、病人重量、年龄和其它因素。治疗有效量的自身载体在约0.001微克到约1克的范围内。优选治疗量的自身载体在约10微克到约5毫克的范围内。最优选的治疗量的自身载体在约0.025mg到约5mg的范围内。多核苷酸治疗每月传递，连续6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可制定另外的治疗方案且范围可从每日到每周、到每隔一月、到每年、到一次施用，这取决于疾病严重性、病人年龄、施用的自身多肽和其它因素如普通治疗医师会考虑的因素。

在一个实施方案中，多核苷酸通过肌肉内注射传递。在另一个实施方案中，多核苷酸是鼻内、口、皮下、皮内、静脉内、粘膜传递，经皮肤传递或附于金粒传递给皮肤或通过皮肤(参见例如WO 97/46253)。另外，核酸能传递入皮肤细胞，通过有或没有脂质体或带电脂类的局部应用(参见例如美国专利号6,087,341)。另一种选择是传递核酸作为吸入剂。多核苷酸在有生理水平的钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中制成。另外，多核苷酸在含较高量Ca++的溶液中制成，量在1mM和2M间。多核苷酸可用其它阳离子制成，如锌、铝和其它。或者或此外，多核苷酸可用阳离子聚合物、阳离子脂质体-形成的化合物制成，或在非阳离子脂质体中制成。用于DNA传递的阳离子脂质体的例子包括用1，2-二(油酰基氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)和其它这类分子产生的脂质体。

在传递多核苷酸前，传递位置能通过bupivicane、心脏毒素或另一种提高随后多核苷酸治疗的传递的试剂治疗进行预处理。这种预处理方案一般传递12到96小时，然后传递治疗多核苷酸，更常在传递治疗DNA前传递24到48小时。另外，DNA治疗前没有给予预处理。

除了编码自身多肽的自身载体外，可共施用调节免疫反应的佐剂以增强免疫反应，佐剂由CpG寡核苷酸组成。CpG寡核苷酸显示增强DNA接种的抗体反应(Krieg等，Nature 374：546-9，1995)。CpG寡核苷酸由纯化的主链寡核苷酸组成，即抗体内降解如硫代磷酸主链。包含于寡核苷酸内的特定序列是嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶或嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶。所有这些构建物的施用方式产生抗编码自身多肽的免疫反应。免疫反应通常是抗体反应，影响非生理作用或与自身多肽相关的过程。

选择用于本发明的核苷酸可获得自已知来源，例如用标准技术从含所需基因或核苷酸序列的细胞中分离核酸。类似地，核苷酸序列能用本领域熟知的多核苷酸合成的标准方式合成产生。参见例如(Edge等，Nature 292：756 1981)；(Nambair等，Science 223：1299 1984)；(Jay等，J.Biol.Chem.259：6311-1984)。一般，能制备合成寡核苷酸，通过(Edge等，同上)和(Duckworth等，Nucleic Acids Res.9：1691 1981)所述磷酸三酯方法或(Beaucage等，Tet.Letts.22：1859 1981)和(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103：3185 1981)所述亚磷酰胺方法。合成寡核苷酸也能用可商业购买的自动寡核苷酸合成仪制备。因此，对于特定氨基酸序列，核苷酸序列能用适当密码子命名。一般，可选择在预期宿主中表达的优选密码子。完整序列集合自重叠寡核苷酸，它们用标准方法制备并集合到完整编码序列中。参见例如Edge等(同上)；Nambair等(同上)和Jay等(同上)。

获得本文所用核酸序列的另一种方法是重组方法。因此，所需核苷酸序列可切自携带核酸的质粒，使用标准限制性酶和步骤。位点特异性DNA切割通过合适的限制性酶和步骤处理来进行。位点特异性DNA切割通过合适的限制性酶(或几种酶)在本领域一般理解的条件下处理来进行，细节由商业购买限制性酶的厂商指定。如果需要，大小分离切割片段可通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳进行，使用标准技术。

分离特定核酸分子的另一种方便方法是聚合酶链式反应(PCR)。(Mullis等，Methods Enzymol.155：335-350，1987)。

有序肽.在发明的一些实施方案中，抗原特异性免疫调节剂是具有有序的氨基酸基序的肽，其中氨基酸对应于抗原表位中的氨基酸。

在一个治疗脱髓鞘自身免疫病的较佳实施方案中，有序肽包括有序的氨基酸基序{SEQ ID NO：1}[¹E²Y³Y⁴K]_n，其中n从2到6。有序基序可开始于所示残基1，或可开始于不同位置，如{SEQ ID NO：6}YYKEYYKEYYKE；{SEQ ID NO：7}KEYYKEYYKEYY等。有序肽序列的总长度通常至少为约8个氨基酸长度且不超过约24个氨基酸长度，通常至少约10个且不超过约20个。感兴趣的特定肽包括序列{SEQ ID NO：4}EYYKEYYKEYYK。肽仅由有序重复组成，或通过加入其它氨基酸残基在任一末端延伸。

可对有序肽的结构进行修饰和变化并仍获得有所需抑制脱髓鞘自身免疫病特征的分子。所需性质可在体外测定中至少部分确定，其中结合MHC抗原HLA-DR，特别是HLA-DR2，相关生物活性的征兆。

例如，一些氨基酸可取代蛋白结构中的其它氨基酸而没有显著丧失功能。本领域技术人员应理解可对有序肽的序列进行多种改变(如关于蛋白稳定性或效率)而没有显著丧失其生物效用或活性，特别是另外的末端氨基酸。只要变化维持结合性质和免疫学活性，认为所得蛋白是用于发明目的的生物功能等价物。

肽能以多种方式提供，连接非野生型侧翼区域作为融合蛋白，通过连接基团连接或者经半胱氨酸(二硫化物)或肽键直接共价连接。肽可连接N-或C-末端或氨基酸链的单个氨基酸。融合肽可延伸以提供方便的连接位置例如半胱氨酸或赖氨酸、提高稳定性、结合特定受体、提供位点定向作用、提供纯化方便、改变物理特征(如稳定性、电荷等)、稳定构象等。肽可以是N-末端、C-末端或与这些加入序列有关的内部。

肽可经多种双功能试剂连接，如马来酰亚胺苯甲酸、甲基二硫代乙酸(methyldfhioacetic acid)、巯基苯甲酸、S-吡啶基二硫代丙酸盐等。寡肽能连接蛋白以提供位点定向作用。寡肽能连接抗体用于位点定向作用，特别是通过细胞内可切割的键。对于缀合技术，参见例如美国专利号3,817,837；3,853,914；3,850,752；3,905,654；4,156,081；4,069,105和4,043,989，纳入本文供参考。寡肽也可通过掺入小泡的腔如脂质体来修饰，可依次结合配基或受体用于指导特定细胞或组织。

对于治疗，肽能局部或肠胃外施用，例如通过在特定位置注射，包括皮下、腹膜内、血管内等或经皮，如通过电转运。在较佳实施方案中，皮下注射用于传递肽。寡肽也可在持续释放制剂或渗透泵中施用，用于提供活性肽的贮存以在延伸段缓慢释放。这种传递可降低所需药物剂量，也减少获得疗效所需的治疗数量。

本发明的寡肽能根据常规技术制备，如合成、重组技术等。例如，固相肽合成包括连续加入氨基酸以产生线性肽链(参见Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。也通过重组DNA技术生成肽。首先合成或另外产生编码所需肽的核酸序列。此编码序列可操作连接用于表达的合适控制元件，如本领域已知的启动子、终止子、ATG起始密码子等。此表达构建的导入合适的宿主细胞，分离生成的重组蛋白。另外，编码序列导入长期疗法治疗的宿主，例如通过插入表达构建物到肌肉或长命的造血细胞用于治疗。表达载体可以是质粒、病毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒等，且可通过转导、DNA接种等导入。

药学上可接受的肽盐也在本文所示肽的范围内。

可使用多种施用方法。制剂能口服、吸入给予，或可注射，如血管内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内等。治疗制剂的剂量可广泛变化，这取决于疾病性质、施用频率、施用方式、从宿主中清除试剂等。初始剂量可较大，接着是较小的维持剂量。施用剂量可少至每周或双周一次，或分成较小剂量和每日、一周两次施用等，用于维持有效剂量水平。在许多病例中，口服施用需要的剂量高于静脉内施用。

发明的肽能掺入多种制剂用于治疗施用。更具体地，复合体能通过组合适当药学上可接受载体或稀释剂来配制成药物组合物，并可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制品，如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。这样，肽能以多种方法施用，包括口服、含服、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、经皮、鞘内等施用。施用后，肽可以是全身性或局部性，通过使用在移植位置维持活性剂量的植入物。

以药物剂量形式，肽能以其药学上可接受盐的形式施用，或它们也能单独使用或适当联合以及结合其它药物活性化合物。下列方法和赋形剂仅作为示范且决不限制。

对于口服制品，肽能单独使用或结合适当添加剂以制备片剂、粉末、颗粒或胶囊，例如用常规添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；用粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；用崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；用润滑剂如滑石或硬脂酸镁；如果需要，用稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂。

肽能制成用于注射的制品，这是通过使它们溶解、悬浮或乳化于水或非水溶剂，如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、较高脂肪酸的酯或丙二醇；如果需要，用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

肽能在气雾剂制剂中使用，气雾剂制剂通过吸入施用。本发明的化合物可制成加压的可接受推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。

此外，肽能制成栓剂，这是通过混合多种碱基如乳化碱基或水溶性碱基。本发明的肽可经栓剂直肠施用。栓剂可包括载体，如可可油、碳蜡和聚乙二醇，它们在体温融化而在室温固化。

可提供口服或直肠施用的单位剂量形式如糖浆、酏剂和悬浮液，其中各剂量单位如一茶匙、一汤匙、片剂或栓剂，包含预定量的组合物，组合物含一种或多种本发明化合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂量形式可包括组合物中的本发明化合物，如无菌水、正常盐水或另外药学上可接受载体中的溶液。

用于持续释放制剂的植入物在本领域熟知。植入物制成微球；厚片等，用可生物降解或非生物降解的聚合物。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主良好耐受的易蚀聚合物。含肽的植入物置于作用位置附近，从而活性剂的局部浓度相对于身体的其它部分增加。

如本文所用，术语“单位剂量形式”指物理上离散单位，适合作为单元剂量用于人和动物受试者，各单位含预定量的本发明肽，量计算足以产生与药学上可接受稀释剂、运载体或载体相关的所需效果。本发明新单位剂量形式的规格取决于所用特定复合体和待获得的效果以及与宿主中各复合体相关的药效学。

药学上可接受赋形剂如载体、佐剂、运载体或稀释剂是公开获得。此外，药学上可接受辅助物质如pH调节和缓冲剂、渗透性调节剂、稳定剂、润湿剂等易公开获得。

取决于病人和治疗情况及施用途径，肽一般以0.01mg到500mg V/kg体重每天施用，例如对于普通人约20mg/天。范围广，因为对不同哺乳动物疗效的功效一般随着剂量广泛变化，人中通常20、30或甚至40倍(每单位体重)小于大鼠。类似地，施用模式可对剂量有大的作用。因此，例如大鼠中的口服剂量可10倍于注射剂量。典型的剂量可以是每日一次注射。

技术人员员理解剂量水平可随特定化合物、症状严重性和受试者对副作用易感性而变。一些特定肽比其它更有效。用于特定复合体的优选剂量可由本领域技术人员通过多种方法容易确定。优选方法是测量特定化合物的生理效价。

非抗原特异性免疫调节剂

在发明的一些实施方案中，非抗原特异性免疫调节剂与甲羟戊酸盐途径抑制剂(如抑制素)共施用。非抗原特异性免疫调节剂可以是例如核酸(如DNA或RNA)，如编码免疫调节多肽的免疫调节寡核苷酸或多核苷酸载体。同样非抗原特异性试剂可以是例如有免疫抑制性质的小有机分子。在其它实施方案中，非抗原特异性试剂可以是例如多肽。免疫调节多肽能包括例如细胞因子、趋化因子、白介素、干扰素(如IFN-β)或共刺激分子(如CTLA-4)。在免疫调节多肽的天然形式作为膜结合蛋白存在的情况中，多肽可修饰成可溶形式(如与多肽的胞外结构域Ig-融合)。通常，非抗原特异性免疫调节剂不是甲羟戊酸盐途径抑制剂。例如，甲羟戊酸盐途径抑制剂是抑制素时，非抗原特异性试剂是非抑制素分子。

在发明的一个较佳实施方案中，非抗原特异性免疫调节剂是骨桥蛋白或自身载体，载体包括编码骨桥蛋白的多核苷酸。骨桥蛋白是多效分子，近来被鉴定在自身免疫病中发挥致病作用。用自身蛋白骨桥蛋白或编码骨桥蛋白的DNA治疗诱导宿主中抗骨桥蛋白的免疫球蛋白反应，抑制骨桥蛋白在持续疾病中的有害影响。

免疫调节序列.在一个较佳实施方案中，非抗原特异性免疫调节蛋白是含免疫调节序列的寡核苷酸。

一方面，发明的免疫调节序列是合成寡核苷酸，包括下列一级结构：

5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’

或5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶3’；

其中X和Y是任何天然产生或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。

IMSs的核心六聚体可以通过任何组成或数量的核苷酸或核苷位于5’和/或3’的侧翼。IMSs范围优选在6和100个碱基对长度间，最优选6-15个碱基对长度。IMSs也能作为较大DNA片段的部分传递，范围从100到100,000个碱基对。IMSs能掺入或已存在于DNA质粒、病毒载体和基因组DNA。IMSs范围也最优选从6(无侧翼序列)到10,000个碱基对大小，或更大。能构建存在于六聚体核心侧翼的序列以与任何已知免疫抑制序列(IIS)中存在的侧翼序列充分匹配。例如，侧翼序列TGACTGTG-Pu-Pu-X-Y-Pyr-Pyr-AGAGATGA，其中TGACTGTG(SEQ ID NO：76)和AGAGATGA(SEQ ID NO：77)是侧翼序列。另外的优选侧翼序列掺入一系列嘧啶(C、T和U)，作为重复2次或多次的单独嘧啶，或者有2种或多种长度不同的嘧啶的混合物。不同侧翼序列用于测试抑制调节序列。用于抑制寡核苷酸的侧翼序列的更多例子包含于下列参考文献：美国专利号6,225,292和6,339,068，Zeuner等，《关节炎和风湿病》(Arthritis and Rheumatism)，46：2219-24，2002。

发明的特定IMSs包括寡核苷酸，含下列六聚体序列：

1.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMSs，IMSs含GG二核苷酸核心：GTGGTT(SEQ ID NO：12)、ATGGTT(SEQ ID NO：13)、GCGGTT(SEQ ID NO：14)、ACGGTT(SEQ ID NO：15)、GTGGCT(SEQ ID NO：16)、ATGGCT(SEQ ID NO：17)、GCGGCT(SEQ ID NO：18)、ACGGCT(SEQ ID NO：19)、GTGGTC(SEQ ID NO：20)、ATGGTC(SEQ ID NO：21)、GCGGTC(SEQ ID NO：22)、ACGGTC(SEQ ID NO：23)等。

2.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMSs，IMSs含GC二核苷酸核心：GTGCTT(SEQ ID NO：24)、ATGCTT(SEQ ID NO：25)、GCGCTT(SEQ ID NO：26)、ACGCTT(SEQ ID NO：27)、GTGCCT(SEQ ID NO：28)、ATGCCT(SEQ ID NO：29)、GCGCCT(SEQ ID NO：30)、ACGCCT(SEQ ID NO：31)、GTGCTC(SEQ ID NO：32)、ATGCTC(SEQ ID NO：33)、GCGCTC(SEQ ID NO：34)、ACGCTC(SEQ ID NO：35)等。

3.鸟嘌呤和肌苷取代腺嘌呤和/或尿苷取代胞嘧啶或胸腺嘧啶，这些取代可在以上指南基础上进行。

如前所示，免疫抑制序列或IIS显示抑制免疫刺激序列(ISS)活性，ISS含核心二核苷酸CpG，美国专利号6,225,292。在缺乏ISS的情况下此IIS，首次由本发明显示能防止和治疗自身免疫病，单独或联合DNA多核苷酸疗法。此IIS包含核心六聚体AAGGTT(SEQ ID NO：36)。此序列在本文称为免疫调节序列或IMS。在本发明IMSs内包括的具有类似基序的其它相关IISs是：

1.5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMSs，IMSs含GG二核苷酸核心：GGGGTT(SEQ ID NO：37)、AGGGTT(SEQ ID NO：38)、GAGGTT(SEQ ID NO：39)、AAGGTT(SEQ ID NO：40)、GGGGCT(SEQ ID NO：41)、AGGGCT(SEQ ID NO：42)、GAGGCT(SEQ ID NO：43)、AAGGCT(SEQ ID NO：44)、GGGGTC(SEQ ID NO：45)、AGGGTC(SEQ ID NO：46)、GAGGTC(SEQ ID NO：47)、AAGGTC(SEQ ID NO：48)等。

2.5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMSs，IMSs含GC二核苷酸核心：GGGCTT(SEQ ID NO：48)、AGGCTT(SEQ ID NO：49)、GAGCTT(SEQ ID NO：50)、AAGCTT(SEQ ID NO：51)、GGGCCT(SEQ ID NO：52)、AGGCCT(SEQ ID NO：53)、GAGCCT(SEQ ID NO：54)、AAGCCT(SEQ ID NO：55)、GGGCTC(SEQ ID NO：56)、AGGCTC(SEQ ID NO：57)、GAGCTC(SEQ ID NO：58)、AAGCTC(SEQ ID NO：59)等。

寡核苷酸可获得自现有核酸来源，包括基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA和cDNA，但优选由寡核苷酸合成产生的合成寡核苷酸。IMS可以是部分单链或双联DNA、RNA和/或寡核苷酸。

IMSs优选是含未甲基化GpG寡核苷酸的寡核苷酸。另外的实施方案包括IMSs，其中一个或多个腺嘌呤或胞嘧啶残基被甲基化。在真核细胞中，通常胞嘧啶和腺嘌呤残基能被甲基化。

IMSs可以是稳定和/或不稳定寡核苷酸。稳定寡核苷酸指相对抗核酸外切酶、核酸内切酶和其它降解途径体内降解的寡核苷酸。优选的稳定寡核苷酸有修饰的磷酸主链，最优选的寡核苷酸有硫代磷酸修饰的磷酸主链，其中至少1个磷酸酯氧被硫取代。主链磷酸基团修饰包括甲基膦酸酯、硫代磷酸、氨基磷酸盐和二硫代磷酸酯核苷酸间键合，能提供IMSs的抗微生物性质。IMSs优选是稳定寡核苷酸，优选使用硫代磷酸酯稳定寡核苷酸。

另外的稳定寡核苷酸包括：烷基磷酸三酯和磷酸二酯，其中带电氧被烷基化；芳基膦酸盐和烷基膦酸盐，它们是非离子DNA类似物，其中带电膦酸酯氧被芳基或烷基取代；或/和在任一或两个末端含六乙二醇或四乙二醇或另外二醇的寡核苷酸。另外的空间构象能用于使糖部分附于IMSs中的核苷碱基。

在调节二核苷酸侧翼的IMS的核苷酸碱基可以是已知的天然产生碱基或合成的非天然碱基。寡核苷能用常规技术掺入IMS-ON的内部区和/或末端用作附着点，即作为附着或连接其它分子的方法用于其它化合物，包括自身脂类、自身多肽、自身糖蛋白、自身糖脂、自身碳水化合物和翻译后修饰的自身多肽或自身糖蛋白，或者作为另外免疫调剂治疗剂的附着点。IMS-ON的碱基、糖部分、磷酸基团和末端也可以本领域普通技术人员已知的任何方式修饰用于构建具有所需性质的IMS-ON，除了IMS-ON的调节活性外。例如，糖部分可以在任何空间构象中附于IMS-ON的核苷酸碱基。

对寡核苷酸进行这些磷酸基团修饰的技术在本领域已知且不需要详细解释。为回顾一个这种有用技术，制备用于靶寡核苷酸产物的中间磷酸三酯并氧化成天然产生的磷酸三酯，用含水碘或其它试剂如无水胺。所得寡核苷酸氨基磷酸酯能用硫处理以产生硫代磷酸。可应用相同的一般技术(除了硫处理步骤)从甲基膦酸酯产生甲基氨基亚磷酰胺(phosphoamidites)。关于磷酸基团修饰技术的更多细节，本领域普通技术人员可参考美国专利号4,425,732；4,458,066；5,218,103和5,453,496以及Tetrahedron Lett.21：4149 25(1995)、7：5575(1986)、25：1437(1984)和Journal Am.ChemSoc.，93：6657(1987)，其内容纳入本文供参考以阐明关于IMSs组成和制备领域的知识水平。

尤其有用的磷酸基团修饰是转变成IMS-ON寡核苷酸的硫代磷酸或二硫代磷酸形式。硫代磷酸和二硫代磷酸酯对体内降解的抗性大于其未修饰的寡核苷酸对应物，使发明的IMS-ON更可为宿主所用。

IMS-ON能用本领域熟知的技术和核酸合成高备来合成。关于此方面，参见例如Ausubel等，《新编分子生物学实验掼》(Current Protocols in Molecular Biology)，第2和4章(Wiley Interscience，1989)；Maniatis等，《分子克隆：实验室手册》(ColdSpring Harbor Lab.，New York，1982)；美国专利号4,458,066和美国专利号4,650,675。这些参考文献纳入本文供参考以证明关于生成合成寡核苷酸领域的知识水平。

另外，能通过突变分离的微生物ISS-ODN获得IMS-ON以使竞争的二核苷酸取代天然产生的CpG基序和侧翼核苷酸。筛选过程取决于核酸杂交，能从任何生物体分离任何多核苷酸序列，只要存在适当探针或抗体。寡核苷酸探针对应于编码上述蛋白序列的一部分，能化学合成。这需要氨基酸序列的短、寡肽延伸必须已知。编码蛋白的DNA序列也可推断自遗传密码子，然而，必须考虑密码子简并性。

例如，能筛选被认为包括含ISS的多核苷酸的cDNA文库，通过将获得自cDNAs的不同mRNA注射入卵母细胞，有足够时间表达cDNA基因产物，测试所需cDNA表达产物的存在，例如通过使用对由感兴趣多核苷酸编码的肽特异的抗体或使用探针用于重复基序和组织表达模式，这些是感兴趣多核苷酸编码的肽的特征。另外，能间接筛选cDNA文库表达感兴趣肽，肽有至少1个抗原表位，使用对肽特异的抗体。这种抗体可以是多克隆或单克隆获得并用于检测指示感兴趣cDNA存在的表达产物。

一旦获得含ISS的多核苷酸，它能缩短至所需长度，例如通过用常规技术酶消化。ISS-ODN寡核苷酸产物中的CpG基序随后突变以使“抑制”二核苷酸-用本发明方法鉴定-取代CpG基序。在有已知序列的DNA中特定位置进行取代突变的技术熟知，例如通过PCR的M13引物诱变。因为IMS是非编码的，在取代突变中没有涉及维持可读框。然而，对于体内使用，多核苷酸起始物质ISS-ODN寡核苷酸中间物或IMS突变产物应充分纯(即尽可能无天然产生的污染物和LPS，使用本领域普通技术人员已知和选择的技术)。

发明的IMS可单独使用或者顺式或反式掺入重组自身载体(质粒、粘粒、病毒或逆转录病毒)，依次编码重组表达载体可传递的任何自身多肽。为了方便起见，IMSs优选没有掺入表达载体施用。然而，如果需要掺入表达载体，这种掺入可用本领域普通技术人员已知技术完成。对于综述，普通技术人员可参考Ausubel等，《新编分子生物学实验指南》，同上。

简要地，构建重组表达载体使用标准连接技术。为分析确认构建载体中的正确序列，连接混合物可用于转化宿主细胞且适当时通过抗生素抗性选择成功的转化子。制备来自转化子的载体，限制性分析和/或测序分析，例如通过Messing等，(Nucleic Acids Res.，9：309，1981)的方法、Maxam等，(Methods in Enzymology，65：499，1980)的方法或本领域技术人员已知的其它合适方法。大小分离切割的片段用常规凝胶电泳进行，如Maniatis等，(分子克隆，133-134页，1982)所述。

宿主细胞可用本发明表达载体转化并培养于常规营养培养基，培养基修改适合用于诱导启动子，选择转化子或扩增基因。培养条件如温度、pH等是以前用于选择表达的宿主细胞，对于普通技术人员是显而易见的。

如果重组表达载体用作发明IMS-ON的载体，质粒和粘粒由于缺乏致病性而优选。然而，质粒和粘粒受到的体内降解比病毒更快，因此不传递适当剂量的IMS-ON以防止或治疗炎症或自身免疫病。

大部分用于构建载体、转染和感染细胞的技术在本领域广泛实践，大部分实践者熟悉描述特定条件和过程的标准资源材料。

共施用试剂用于治疗自身免疫病

如上所示，本发明试剂(甲羟戊酸盐抑制剂和第2种免疫调节剂)共施用给受试者以治疗自身免疫病。共施用指试剂各以有效剂量施用给受试者，从而试剂同时在受试者中存在和具有活性。因而，共施用指施用给相同受试者且不一定到相同位置或通过相同施用途径。在一些实施方案中，试剂同时施用。在其它实施方案中，试剂协同施用，这样第一种试剂在第2种试剂施用前在受试者中存在并具有活性，施用第2种试剂后2种试剂都存在和具有活性。试剂通常作为单独制剂协同共施用。此外，试剂能通过相同施用途径或不同途径施用。不同施用途径可包括例如相同治疗方案中试剂的全身或局部途径。例如，联合疗法包括共施用抑制素和编码自身多肽的自身载体时，抑制素能口服传递而自身载体能肌肉内施用。

在本文所述发明的各实施方案中，试剂的传递方式与常规方法一致，这些方法与寻求治疗或防止自身免疫病的控制相关。根据本文说明，有效量的试剂施用给需要这种治疗的受试者，施用时间和条件足以治疗自身免疫反应。

根据发明的联合疗法受试者包括有高风险发展自身免疫病的病人以及存在自身免疫病的病人。通常，已诊断的受试者有寻求治疗的自身免疫病。此外，可监控受试者在治疗过程中响应治疗的自身免疫病症状中的任何变化。

为鉴定受试病人用于根据发明方法的治疗，使用公认的筛选方法以确定与特定自身免疫病相关的风险因素或确定受试者中鉴定的现有疾病状态。这种方法可包括例如确定个体是否有亲属诊断患自身免疫病。筛选方法可包括例如常规方法以确定已知有遗传成分的特定自身免疫或炎性疾病的家庭状况。为了此目的，核苷酸探针能常规用于鉴定携带与感兴趣特定自身免疫病相关的遗传标记的个体。另外，多种免疫学方法在本领域已知，用于鉴定特定自身免疫病的标记。例如，有各种ELISA免疫测定方法并在本领域熟知，它们使用单克隆抗体探针以检测与自身免疫病的特定生理标记相关的自身抗体。可进行这种筛选，如已知病人症状学、年龄因素、相关风险因素等所示。这些方法使临床医生能常规选择需要本文所述方法的病人以治疗自身免疫病。根据这些方法，联合疗法可作为单独防止或治疗程序进行或作为其它治疗的跟踪、辅助或协同治疗方案。

对治疗进行中的疾病特别感兴趣，其中治疗稳定或减少病人不理想的临床症状。这种治疗最好在受影响组织完全丧失功能前进行。受试者治疗最好在疾病症状阶段中施用，在一些病例中在疾病症状阶段后施用，其中疾病有复发症状(即是多阶段的)。症状前或临床前阶段定义为T细胞在疾病位置参与的阶段，如中枢神经系统等，但功能丧失未严重到足以产生指示明显疾病的临床症状。T细胞参与可由疾病位置上的T细胞数量增加、存在对自身抗原特异的T细胞、在疾病位置上释放穿孔素和粒酶、响应免疫抑制治疗等证明。

技术人员易理解剂量水平可随特定化合物、症状严重性和受试者对副作用易感性而变。一些特定化合物比其它更有效。用于给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种方法容易确定。优选方法是测量给定化合物的生理效价。

确定方案的有效性可用涉及确定T细胞反应的测定。测定能确定反应性的水平，如在样品中发现的反应T细胞数量的基础上，与来自原初宿主的负对照相比，或根据获得自一个或多个病人的数据曲线标准化。除了检测自身抗原反应性T细胞的定性和定量存在外，T细胞可测定为细胞因子的表达类型，已知增加或抑制炎症反应。也需要测定反应性T细胞的抗原表位特异性类型。

T细胞可分离自病人外周血液、淋巴结，或优选来自位置炎症。反应性测定可在初级T细胞上进行，或在融合产生杂交瘤的细胞上进行。这种反应性T细胞也能用于进一步分析疾病进程，通过监控其原位位置、T细胞受体利用等。监控T细胞响应的测定在本领域已知，包括增殖测定和细胞因子释放测定。

增殖测定测量响应特异性抗原的T细胞增殖水平，广泛用于本领域。在一个示范测定中，获得病人淋巴结、血液或脾细胞。制备并洗涤从约10⁴到10⁷个细胞的悬浮液，通常从约10⁵到10⁶个细胞，随后在对照抗原和测试抗原存在时培养。测试抗原可以是怀疑诱导炎性T细胞反应的任何自身抗原的肽。通常培养细胞几天。抗原诱导的增殖通过监控培养物的DNA合成来评估，例如在最后18小时培养中掺入的³H-胸苷。

酶联免疫吸附测定(ELISA)用于确定反应性T细胞的细胞因子分布，可用于监控细胞因子的表达，如IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、γ-IFN等。捕获抗体可以是对感兴趣细胞因子特异的任何抗体，其中上述来自T细胞增殖测定的上清方便地用作抗原的来源。封闭和洗涤后，加入标记的检测抗体，存在的蛋白浓度确定为结合标记的函数。

可用本发明方法治疗的哺乳动物种类包括犬和猫；马；牛；羊等和灵长类动物，特别是人。动物模型特别是小哺乳动物如鼠、兔形目动物等，可用于实验调研。其它用途包括的调研中需要研究缺乏T细胞介导的炎症时的特定效果。

要理解本发明不限于所述特定方法、操作、制剂和试剂，这些当然可以变化。也要理解本文所用术语仅用于描述特定实施方案，不想限制本发明的范围，范围仅由附加权利要求限制。

本文所述所有出版物全部纳入供参考，用于各种目的，包括描述和揭示例如出版物中所述方法和方法学，它们可结合发明所述使用。上面和全文中讨论的出版物仅提供它们在本申请提交日前的内容。本文没有一处解释为允许发明者没有权利根据先发明使这种披露提前发生。

提出下列例子以提供本领域普通技术人员关于如何完成和使用发明的完整披露和描述，且不想限制发明范围。努力确保关于所用数字(如量、温度、浓度等)的精确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，重量、分子量的部分是平均分子量，压力是大气压或接近大气压。

实施例1：用于治疗多发性硬化动物模型的阿托伐他汀

检测阿托伐他汀(Lipitor)是否能抑制实验自身免疫脑脊髓炎(EAE)中的促炎反应，EAE是Th1介导的中枢神经系统(CNS)脱髓鞘病，作为多发性硬化(MS)的模型。在C57BL/6小鼠中MOG p35-55-诱导慢性EAE的发作时开始每日口服施用阿托伐他汀逆转瘫痪。当在PLP p139-151-诱导的复发缓解EAE急性发作后给予时，阿托伐他汀也改善SJL/L小鼠中的复发。急性EAE也在MBPAc1-11治疗的Tg小鼠中防止。组织学评估取自阿托伐他汀-治疗小鼠的脑和脊髓，显示血管周损伤的数量以及这些损伤中的浸润程度都显著减少。CNS MHC II类反式激活蛋白(CIITA)表达，包括单独启动子(p)I、pIII和pIV转录物的表达，在阿托伐他汀-治疗小鼠中降低。阿托伐他汀治疗与CNS自身抗原特异增殖性T细胞反应减少、这些T细胞的IFN-γ和IL-2分泌降低以及IL-4和IL-10分泌增加相关。因此，阿托伐他汀治疗促进Tha偏性。这些结果证明阿托伐他汀是治疗脱髓鞘病的有效免疫调节剂。

方法：

实验过程

动物.雌性SJL/J、B10.PL和C57BL/6小鼠(8到12周龄)购自JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)。MBP Ac1-11转基因(tg)TCR小鼠与B10.PL小鼠回交以获得对EAE的敏感性。所有动物操作由Stanford的比较医学部门批准并根据国立卫生研究院指南。

肽.肽在肽合成仪(9050型；MilliGen，Burlington，MA)上通过标准9-芴甲氧羰基化学合成。肽由HPLC纯化。结构通过氨基酸分析和质谱确定。用于这些实验的肽是小鼠MBP Ac1-11 1(Ac-ASQKRPSQRHG)(SEQ ID NO：60)、MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)(SEQ ID NO：61)、PLP139-151(HCLGKWLGHPDKF)(SEQ ID NO：62)和HSVP16(DMTPADALDDRDLEM)(SEQID NO：63)-病毒肽用作增殖和细胞因子测定中的负对照。

药物治疗.阿托伐他汀(Lipitor)片剂商业获得并溶于PBS。小鼠每日一次口服施用0.5ML阿托伐他汀溶液(1或10mg/kg)或仅PBS，使用18mm饲针。阿托伐他汀治疗阶段示于结果部分。

EAE诱导.在SJL/J小鼠中用100μg PLP139-151肽诱导复发缓解EAE，在C57BL/6或MBP Ac1-11 TCR Tg小鼠中分别用100μg MOG35-55肽或100μgMBP Ac1-11肽诱导慢性进行性EAE。所有肽以2mg/ml溶于PBS并用等体积CFA乳化，CFA由补充4mg/ml热杀伤结核分支杆菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，MI)的不完全弗氏佐剂组成。小鼠皮下注射0.1ml肽乳剂。在肽免疫当天和48小时后，仅C57BL/6小鼠和MBP Ac1-11 TCR Tg小鼠也静脉内注射0.1ml PBS中的1μg/ml百日咳鲍特杆菌(Bordetella pertussis)毒素。小鼠临床打分如下：0，无瘫痪；1，尾部虚弱或瘫痪；2，后肢虚弱或瘫痪；3，后肢瘫痪且前肢虚弱；4，后肢和前肢瘫痪；5，濒死或死亡。

抗原特异活体外T细胞增殖测定.在所有不同品系中诱导EAE前2天开始1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀或者PBS每日治疗。EAE诱导10天后(即阿托伐他汀治疗后12天)，从对照、1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀治疗的SJL/J、C57BL/6和MBP Ac1-11转基因小鼠中取出排出的淋巴结和脾。淋巴结细胞(LNCs)或脾细胞体外培养用于对特定脑产生的肽(分别为PLP139-151、MOG35-55或MBP Ac1-11)的特异增殖性反应。LNCs在0.2ml/孔体积的96孔微量滴定板中制备，浓度为5×106个细胞/ml。培养基由富集RPMI(RPMI1640，补充L-谷氨酰胺[2mM]、丙酮酸钠[1mM]、非必需氨基酸[0.1mM]、青霉素[100U/ml]、链霉素[0.1mg/ml]、2-ME[5×10^-5M])组成，补充加入不同肽浓度的1％自身新鲜正常小鼠血清。培养物在含5％CO₂的湿润空气中37℃培养。取自SJL/J或C57BL/6小鼠的培养物培养72小时，而来自MBP Ac-1-11 Tg小鼠的培养物培养48小时且随后用1μCi/孔[³H]胸苷脉冲18小时。然后收集细胞并在β计数器中计数。

细胞因子分布测定.来自EAE供体的淋巴结细胞和脾细胞在24孔板中体外刺激(2.5×106个细胞/ml)，有或没有脑产生的肽或用CoA作为正对照。细胞培养上清在不同时间点收集用于测量细胞因子水平：对于IL-2是48小时，对于IFN-γ和TNFα是72小时，对于IL-4和IL-10是120小时。用相应的细胞因子的特定ELISA试剂盒根据厂商操作(PharMingen，San Diego，CA，USA)确定细胞因子的水平。

总RNA分离.杀死小鼠并用20ml冷的无菌PBS灌注。立即分离脑且总RNA用Trizol试剂(Invitrogen)分离，如厂商操作所建议。总RNA量随后在260nm测量。

通过实时(动力学)RT-PCR评估CIITA启动子特异mRNA表达.一步骤RT-PCR如Baranzini等(2000)J.Immunol 165：6576所述进行。制备主混合物用400μM dUTP和200μM各dATP、dCTP和dGTP；0.2μM各寡核苷酸引物，DMSO(1％终浓度)中的0.2X SYBR绿；2.5％甘油；1U尿嘧啶N-糖苷酶；4mM Mn(OAc)₂和5U rTth聚合酶。RT-PCR参数：45℃用活化尿嘧啶N-糖苷酶起始孵育10分钟，接着60℃室温30分钟；95℃ 50个循环15秒和57℃ 30秒。β-肌动蛋白从所有样品中作为管家基因扩增以使表达标准化。各套引物包括无模板的对照。为定量，10倍稀释的CIITA失控转录物(10⁷到10²初始CIITA拷贝)系列包括于各反应板。数据用软件“序列检测系统程序”分析并转至MS Excel表格程序用于分析。产生校准曲线，这是通过各10倍稀释的CIITA(失控转录物)相对各产物超过预定阈(Ct)所需的循环数作图。Ct值与标准曲线上所得值相比。用于普通CIITA(核苷酸2374-2458)的引物：5’-GCCCACGAGACACAGCAA(SEQ ID NO：64)和5’-TGAGCCGGGTGCCCAGGAA(SEQ ID NO：65)。5’(正向)启动子特异引物：pI CIITA(pl核苷酸259)5’-CCTGACCCTGCTGGAGAA(SEQ ID NO：66)；pIII CIITA(pIII核苷酸112)：5’-GCATCACTCTGCTCTCTAA(SEQ ID NO：67)；pIV CIITA(pIV核苷酸43)：5’-TGCAGGCAGCACTCAGM(SEQ ID NO：68)。用于启动子特异转录物的CIITA(核苷酸265)反向引物：5’-GGGGTCGGCACTGTTAA(SEQ ID NO：69)。β-肌动蛋白：(301-538)：5’-CGACCTGGGGATCTTCTA(SEQ ID NO：70)和5’-TCGTGCCCTCAGCTTCCAA(SEQ ID NO：71)。

用于STAT-6和STAT-4磷酸化的蛋白质印迹分析.蛋白质印迹分析如Garren等(2001)Immunity 15：15所述进行，有小修改。来自对照和阿托伐他汀治疗小鼠的淋巴结在T-PER蛋白提取缓冲液(Pierce)中搅匀，缓冲液中有20μg/ml抑肽酶、20μg/ml亮抑酶肽、1.6mM Pefablock SC(Roche)、10mM NaF、1mM Na₃VO₄和1mMNa₄P₂O₇(Sigma，St.Louis，MO)。所有过程在冰上操作。作为正对照，分离来自首次用于实验的鼠的淋巴结细胞，用小鼠重组IL-4(10ng/ml)或IFN-γ(100单位/ml)培养1小时，分别用于STAT-6和STAT-4表达。蛋白浓度通过BCA蛋白测定(Pierce)确定。裂解物加入有40mM DTT的3x SDS加样缓冲液(Cell Signaling Technology)。产物在4-15％SDS-PAGE梯度凝胶(BioRad)上电泳分离。预染色标记(Invitrogen)用于确定分子量。凝胶以100V在125mM Tris、192mM甘氨酸和20％(v/v)甲醇中印迹到PVDF膜，随后用含0.1％吐温-20和5％脱脂奶粉的Tris-缓冲盐水(TBS)室温封闭1小时。TBS和0.1％吐温20洗涤后，膜用抗磷酸STAT6抗体或抗磷酸STAT4抗体(Zymed，South San Francisco，CA)4℃过夜杂交，抗体在TBS、0.1％吐温20和5％BSA中1∶1000稀释，膜随后用ECL加prebetween操作(Amersham Life Sciences)处理以通过化学发光检验带。膜在100mM 2-巯基乙醇、2％(w/v)SDS和62.5mMTris(pH7.4)中60℃剥离30分钟，然后用抗CD3ζ(Pharmingen，San Diego，CA)或者抗Stat6或抗Stat4(均获得自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)作为对照探测以确认加样量相等。

组织病理学.杀死小鼠并用20ml冷PBS灌注，接着用20ml冷的4％低聚甲醛。分离脑和脊髓并进行石蜡包埋程序；随后切片进行苏木精和曙红染色。对各小鼠的10个切片进行组织学检测，各切片在组织学分数上评估而不知道动物的治疗状态。

统计分析.数据表示为平均值±SE。2组间的显著差异用斯图顿特检验检测。p＜0.05的值认为是显著的。也进行具有p＜0.05显著水平的单向多范围ANOVA检验用于多重加压(multiple compression)。

结果：

阿托伐他汀在小鼠中逆转和防止进行中的慢性复发EAE或慢性进行性EAE。开始，测试阿托伐他汀防止C57B1/6雌性小鼠中的慢性EAE，EAE通过用髓鞘少突细胞糖蛋白(MOG)免疫显性决定簇p35-55免疫来诱导。如图1A所示，EAE发作时开始用1mg/kg(大致相当于批准的成人最高剂量80mg)或10mg/kg阿托伐他汀每日口服治疗，抑制EAE诱导。发作后治疗也改善EAE(图1B)。阿托伐他汀治疗在SJL/L小鼠的慢性复发EAE中测试，EAE通过致脑炎蛋白脂质蛋白(PLP)肽p139-151免疫来诱导。阿托伐他汀不仅有效防止EAE复发(图1C)，当治疗在从急性EAE恢复后开始时也逆转进行中的复发EAE(图1D)。阿托伐他汀成功地防止MBP Ad-11 Tg小鼠中的急性EAE进展，EAE通过致脑炎髓鞘碱性蛋白(MBP)肽pAd-li免疫来诱导(图1E)。

杀死来自所有5次实验各组的小鼠且取脑和脊髓用于CNS组织学评估。图2显示取自实验A的脑的代表性H和E染色(见图1A)，这是在阿托伐他汀治疗开始后11天，从而是C57BL/6小鼠的EAE诱导后22天。H&E矢状脑切片取自PBS处理的C57BL/6小鼠(a)、1mg/kg治疗(b)、10mg/kg治疗(c)和作为负对照的首次用于实验的C57BL/6(d)。切片是来自各组2只小鼠的代表性切片。

苏木精和曙红染色显示阿托伐他汀治疗小鼠中CNS浸润的数量和大小(如图2B和2C所示)，与PBS处理的小鼠和首次用于实验的小鼠相比(分别为图2A和2D)。因此，通过阿托伐他汀口服治疗抑制和防止疾病体现在炎症位置(CNS)被确认和组织学证明。对来自其它4个动物实验的代表性成员的脊髓和脑进行相同分析，获得类似结果。

阿托伐他汀在EAE期间下调炎症位置(CNS)上的CIITA表达。在正常中枢神经系统(CNS)中，MHC II型的表达最小，尽管发现它在小鼠中诱导的EAE中的小神经胶质细胞上高度上调。此表达由因子II类反式激活蛋白(CIITA)调节，CIITA需要用于活化MHC II类基因，特别是调节小神经胶质细胞(CNS中的主要抗原呈递细胞)中表达的CIITA pVI。还报导阿托伐他汀能通过对CIITA pIV基因的作用来抑制MHC II的表达。由于组织学结果指出阿托伐他汀治疗小鼠的脑浸润相比对照EAE小鼠减少，研究阿托伐他汀是否体内抑制炎症位置中的CIITA表达。3组SJL/J小鼠用1mg/kg阿托伐他汀、10mg/kg或仅PBS(对照)口服治疗。加入第4组首次用于实验的小鼠作为CIITA表达的负对照。3个治疗组在EAE诱导前2天开始每日治疗。诱导后10天(不同治疗的12天)，杀死所有4组的小鼠并用20ml冷PBS灌注。分离脑并进行总RNA制备，如方法部分所述。RNA进行实时PCR(PT-PCR)以测量阿托伐他汀治疗和载体处理的EAE体内对炎症位置(CNS)上的启动子特异CIITA转录物的效果。结果示于图3。

阿托伐他汀治疗以剂量响应方式抑制CIITA转录物的总表达(图3A)。特定CIITA分析显示阿托伐他汀治疗抑制所有3种特定CIITA的同种型(图3B、3C和3D)。有趣的是，阿托伐他汀显示剂量依赖性抑制CIITA Ply转录物(已知对调节ONS中小神经胶质细胞上的MHC II表达特异)，但也意外地抑制PI和PIII转录物，PI和PIII转录物已知分别对树突细胞和B细胞特异。Pl和Pill转录物显示体外受阿托伐他汀影响。

这些结果证明用阿托伐他汀治疗直接抑制脑中的CIITA同种型，这可能是抑制CNS中MHC II表达的主要因素并因而防止单核细胞大量浸润到CNS中和逆转EAE。

阿托伐他汀促进Th2偏性的发展.SJL/L雌性小鼠用PLP p139-151免疫用于EAE诱导并用阿托伐他汀或载体(对照)治疗，分离自此小鼠脾和淋巴结的淋巴细胞在治疗10天后分离且检测增殖和细胞因子生成。如图4A所示，PLP p139-151特异的增殖性反应以剂量相关方式抑制。Th1细胞因子IL-2生成减少，尽管在10mg/kg治疗小鼠中的程度大许多(图4B)。标志性Th1细胞因子IFN-γ的分泌在2种治疗剂量都显著减少(图4C)。关键的抗炎症细胞因子IL-4在2种治疗剂量都诱导(图4D)，而在此实验中，另一种抗炎症Th2细胞因子IL-10的分泌在较高治疗剂量观察到(图4E)。因此，阿托伐他汀抑制Th1细胞因子生成且促进Th2细胞因子。这些实验在C57BL/6和MBP Ac1-11特异转基因小鼠中重复。获得类似数据。如上面SJL/L小鼠所述，阿托伐他汀在这些小鼠中促进几乎相同的Th2偏性。在这些体外实验中，我们没有观察到细胞死亡增加。

阿托伐他汀导致Stat6的活化。为证明阿托伐他汀中的IL-4生成导致从Th1偏向Th2，我们想探索功能性IL-4细胞因子是否确实在阿托伐他汀治疗期间表达。已知IL-4经IL-4受体作用以特异地活化STAT6，STAT6是信号转导物和转录家族活物的成员，因此预期它在IL-4依赖的Th2偏性发生时被磷酸化。SJL/L小鼠通过口服施用阿托伐他汀(1mg/kg和10mg/kg)或仅PBS每日治疗，在抑制素治疗开始后2天通过施用PLP/CFA诱导EAE。

EAE诱导后10天，杀死所有组并解剖排出的淋巴结。蛋白裂解物分离自淋巴结细胞并通过蛋白质印迹探测活性STAT6的存在，使用对STAT6的磷酸化形式特异的多克隆抗体。对于正对照，淋巴结细胞分离自首次用于实验的小鼠并用小鼠重组IL-4(10ng/ml)孵育1小时。蛋白裂解物以类似方式提取。如图5所示，磷酸化STAT6发现于阿托伐他汀治疗的小鼠淋巴结(泳道2和3)和正对照(泳道4)，而PBS治疗的小鼠没有显示可检测的磷酸化STAT6(泳道1)。鉴定的磷酸化STAT6根据预染色标记以约100kDa走电泳。

实施例2：多核苷酸治疗包括施用编码自身蛋白PLP的DNA以防止多发性硬化的动物模型

PLP自身载体.构建编码PLP自身蛋白的抗原表位的多核苷酸，这是通过退火有16聚体重叠互补序列(下划线)的2个寡核苷酸，用DNA聚合酶和dNTPs延伸：

PLP(139-151)：

5’-CTCGAGACCATGCATTGTTTGGGAAAATGGCTAGGACATCCCGA

CAAGTTTTCTAGATAGCTA-3’(SEQ ID NO：72)；

PLP(139-151)L144/R147：

5’-CTCGAGACCATGCATTGTTTGGGAAAACTACTAGGACGCCCCG

ACAAGTTTTCTAGATAGCTA-3’(SEQ ID NO：73)。

这些寡核苷酸双链体设计用于掺入XhoI和XbaI限制性位点。产物克隆入pTARGET载体(Promega，Madison，WI)的多克隆区，此载体是CMV启动子驱动的哺乳动物表达载体。阳性克隆通过颜色筛选鉴定且插入物的正确方向通过DNA自动测序确认。质粒DNA的纯化用Wizard plus Maxipreps(Promega)根据厂商说明书完成，在相同肌肉中注射0.05ml质粒DNA(PBS中1mg/ml)。

多核苷酸治疗操作.实验动物的左四头肌注射PBS中的0.1ml 0.25％盐酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)。2和10天后，小鼠的相同肌肉注射0.05ml质粒DNA(PBS中1mg/ml)。

EAE诱导.PLP139-151肽溶于PBS至2mg/ml的浓度并用等体积的不完全弗氏佐剂乳化，佐剂补充4mg/ml热杀伤结核分支杆菌H37Ra(DifcoLaboratories，Detroit，MI)。小鼠皮下注射0.1ml肽乳剂，在当天和48小时后，静脉内注射PBS中的0.1ml 4□g/ml百日咳鲍特杆菌毒素。实验动物打分如下：0＝无临床疾病；1＝尾部虚弱或瘫痪；2＝后肢虚弱；3＝后肢瘫痪；4＝前肢虚弱或瘫痪；5＝动物濒死或死亡。

为确定注射编码PLP序列的DNA是否有效保护小鼠不受EAE诱导，以一周间隔2次肌肉内注射PLP139-151。最后1次注射后10天，小鼠用CFA中乳化的PLP139-151肽攻击。与对照质粒组相比，在PLP139-151自身载体治疗动物中观察到急性临床疾病的改善。疾病发作相比对照质粒组延迟(11.5±0.5天，p＜0.008)，平均最高疾病严重性减少(p＜.005)，平均疾病分数降低(p＜0.0005)。此外，其它组注射a)自身载体，载体含编码改变肽配基PLP p139-151(W144＞L，H147＞R)的多核苷酸，b)自身载体，载体含编码PLP抗原表位p178-191的多核苷酸。用编码改变自身肽配基(W144，H147)的自身载体，疾病发作延迟(11.6±0.5天，p＜0.009)且平均最高疾病分数减少(p＜.02)。同样，用含编码PLP自身肽p178-191的多核苷酸的自身载体，疾病发作延迟(11.5±0.4天，p＜0.003)，平均最高疾病严重性减少(p＜.007)且平均疾病分数降低(p＜0.0001)。

小鼠注射DNA并进一步用致脑炎肽PLP139-151攻击，在临床疾病的急性阶段消退后杀死小鼠。排出的LNC体外用PLP139-151自身肽再刺激并测试它们的增殖性反应和细胞因子生成。图6A显示来自注射编码PLP139-151自身肽的DNA的小鼠的LNC的增殖性反应低于来自对照动物的LNC(p＜0.01)。图6(B)显示用PLP139-151刺激时，来自自身载体治疗小鼠的LNC分泌的IL-2和□-干扰素水平低于对照组，载体包含编码PLP139-151自身肽的DNA。对分离自脑组织的mRNA的核糖核酸酶保护测定用于评估发炎脑中的细胞因子mRNA转录物的水平。图6(C)显示自身载体治疗小鼠中□-干扰素和IL-15的mRNA水平下降，载体包含编码PLP139-151自身肽的DNA。因此，临床疾病的低发病率、细胞反应减少与低水平IL-2、IL-15和□-干扰素间的相关性在PLP139-151 DNA治疗小鼠中明显。图6(C)中所示细胞因子mRNA带的相对表达水平通过光密度测定法测量。为纠正加样差异，值根据各样品内管家基因GAPDH的表达水平标准化。光密度测定分析确认与pTargeT和含编码PLP139-151(L/R)自身肽的DNA的自身载体相比，用含编码PLP139-151自身肽的DNA的自身载体治疗的小鼠脑中测试细胞因子的表达水平减少。

实施例3：用IMS结合编码多种自身蛋白的DNA治疗多发性硬化的动物模型

DNA多核苷酸治疗由全长cDNAs编码4种主要髓鞘成分MBP、MAG、MOG和PLP组成，当它们在疾病开始发作后给予时治疗EAE动物模型中的复发疾病。此外，加入编码IL-4的DNA到髓鞘DNA多核苷酸治疗，治疗功效进一步提高，复发率减少。然而，尽管复发降低，总体疾病严重性仍可与对照组相比。在一系列单独研究中，SJL/L小鼠皮下免疫用于疾病诱导，诱导用完全弗氏佐剂(CFA)中的PLP139-151肽，同时以单一注射腹膜内施用重悬浮于磷酸缓冲盐水的IMS。用单一注射抑制IMS的治疗小鼠与PBS-治疗和刺激性CpG-ODN治疗小鼠相比，表现出总体疾病严重性减少(图7)。

实施例4：有序肽用于以MHC TCR结合基序为基础的免疫调节

髓鞘碱性蛋白(MBP)的氨基酸85到99间的区域包含用于T细胞的免疫显性抗原表位和MS脑损伤中的自身抗体。T细胞和自身抗体识别的主要MBP区发现于MS脑，是核心基序{SEQ ID NO：8}HFFK，来自HLA-DRB1^*1501 DQB1^*0602(HLA DR2)的病人中的MBPp87-99。

我们以前比较了识别自身抗体的结构要求和对MBP p87-99反应的T细胞克隆。抗MBP抗体亲和纯化自12个研究的死后病例的CNS损伤。MBP p87-99肽在所有病例中免疫显性，它抑制超过90％的自身抗体结合MBP。有助于自身抗体结合的残基位于10-氨基酸区段p86-95({SEQ ID NO：9}VVHFFKNIVT)，此区段也包含MHC T-细胞受体接触残基，在DRB1^*1501和DQB1^*0602中用于T细胞识别MBP。在抗原表位中心，相同残基{SEQ ID NO：10}VHFFK对于T细胞结合和MHC识别是重要的。近来，具有MBP p87-99的HLA-DR2的晶体结构被解决，确认K91是主要TCR接触残基的预测，而F90是进入MHC分子的疏水P4袋的主要锚。

合成的肽含3个氨基酸的重复序列，氨基酸有序排列以结合MS相关MHC分子中存在的袋并因此干扰致病T细胞的活化。这些预测序列之一({SEQ ID NO：4}EYYKEYYKEYYK)有效防止和治疗刘易斯大鼠中的实验自身免疫脑脊髓炎，刘易斯大鼠是多发性硬化的动物模型。

材料和方法

动物.雌性刘易斯大鼠(6-8周龄)，购自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)。

肽.为免疫和疾病逆转，肽在肽合成仪(9050型；MilliGen，Burlington，MA)上通过标准9-芴甲氧羰基化学合成。肽由HPLC纯化。结构通过氨基酸分析和质谱确定。用于这些实验的肽是：{SEQ ID NO：11}ENPVVHFFKNIVTPR(MBPp85 99)、{SEQ ID NO：4}EYYKEYYKEYYK、{SEQ ID NO：5}KYYKYYKYYKYY。

EAE诱导.合成肽MBPp85 99溶于PBS至2mg/ml的浓度并用等体积的不完全弗氏佐剂(IFA)乳化，佐剂补充4mg/ml热杀伤结核分支杆菌H37Ra(DifcoLaboratories，Detroit，MI)。大鼠皮下注射0.1ml肽乳剂。实验动物打分如下：0，无临床疾病；1，尾部虚弱或瘫痪；2，后肢虚弱；3，后肢瘫痪；4，前肢虚弱或瘫痪；5，动物濒死或死亡。

EAE治疗.大鼠以前用MBPp85 99免疫以诱导EAE，大鼠在肽注射后8天打分。在平均疾病发作日，动物腹膜内注射PBS中的0.5mg肽溶液(1剂量为0.25ml)。

结果

注射含TCR-MHC结合基序的有序肽逆转EAE的发展。为测试预测序列逆转进行中的EAE发展的潜力，我们传递单一剂量的PBS溶液，0.25ml溶液中含0.5mg肽。如图8所见，当与对照组相比时，此剂量足以治疗进行中的疾病。

实施例5：结合阿托伐他汀和多核苷酸疗法用于治疗多发性硬化的动物模型

PLP自身载体.编码PLP自身蛋白的多核苷酸用标准技术构建。简要地，小鼠全长PLP基因克隆自小鼠cDNA文库并克隆入哺乳动物表达载体pVAXl(Invtirogen，Carlsbad，CA)的多克隆位点。大规模生成和纯化质粒DNA通过标准技术用商业质粒纯化操作(Elim Biopharmaceuticals，Hayward，CA)进行。

多核苷酸治疗操作.实验动物的四头肌各注射PBS中的0.05ml 0.25％盐酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)。2到3天后，小鼠肌肉内注射0.05mg质粒DNA(PBS中0.25mg/ml)。

阿托伐他汀施用.阿托伐他汀(Pfizer Inc.，Groton，CT)(处方制剂)置于PBS中的悬浮液。阿托伐他汀每日一次以0.5ml(0.04mg/ml用于1mg/kg剂量或0.4mg/ml用于10mg/kg剂量)口服施用，使用20mm饲针(Popper and Sons Inc，New HydePark，NY)。施用PBS作为对照。

EAE诱导.PLP139-151肽溶于PBS至2mg/ml的浓度并用等体积的不完全弗氏佐剂乳化，佐剂补充4mg/ml热杀伤结核分支杆菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，MI)。小鼠皮下注射0.1ml肽乳剂。实验动物打分如下：0＝无临床疾病；1＝尾部虚弱或瘫痪；2＝后肢虚弱；3＝后肢瘫痪；4＝前肢虚弱或瘫痪；5＝动物濒死或死亡。用此方法诱导EAE的小鼠发展疾病的方式是一些小鼠产生复发-缓解EAE，而另外的小鼠产生慢性进行性疾病。

为确定编码PLP序列的DNA结合阿托伐他汀注射是否有效治疗进行中的EAE，小鼠如上诱导EAE并允许达到最大急性疾病。在EAE诱导后约17天，小鼠随机分成不同治疗组。仅接受阿托伐他汀的小鼠每天口服施用1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀来治疗。接受阿托伐他汀或DNA组合的小鼠每日口服施用1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀，以及编码PLP的DNA每周一次肌肉内施用，剂量为0.05mg每小鼠。对照小鼠每日口服施用PBS。随后从EAE诱导开始总共跟踪约45天的EAE临床疾病。

与施用PBS的对照小鼠以及仅施用阿托伐他汀的小鼠相比，平均最高疾病严重性在接受阿托伐他汀和PLP的DNA的小鼠中显著减少(图9)。甚至更显著的是，DNA在1和10mg/kg阿托伐他汀剂量时提供相等益处。这提示DNA甚至能在更低、更耐受的阿托伐他汀剂量时提供益处。此外，这些结果提示此联合疗法可用于治疗复发-缓解以及慢性进行性疾病。

实施例6：抑制素和多核苷酸联合疗法用于治疗复发-缓解及慢性进行性人多发性硬化

治疗人多发性硬化的多核苷酸疗法如下完成。构建自身载体，载体包括巨细胞病毒或另一个有效的转录启动子；来源于SV40大T抗原的聚腺苷酸化信号、牛生长激素或普通技术人员已知的另一种有效的聚腺苷酸化信号序列；卡那霉素或其它FDA-接受的抗性基因，它使质粒有效生长。

编码一种或多种人髓鞘自身蛋白的DNA序列克隆入DNA自身载体。编码这些髓鞘自身蛋白的DNA在MS病人中被自身免疫反应靶向，包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘相关少突细胞碱性蛋白(MOBP)，DNA克隆入自身载体。选择特定自身抗原包括在多核苷酸治疗中是以多种因素为基础，使用本发明的讲授，包括因素如受试者中致病自身抗体的存在。在一个实施方案中，各髓鞘自身蛋白在单独或不同自身质粒中编码。在另一个实施方案中，编码一些髓鞘自身蛋白的DNA在单个自身质粒中连续编码，使用内部核糖体再进入序列(IRESs)或其它方法以从单个质粒DNA中表达多种蛋白。制备编码髓鞘蛋白的DNA表达自身质粒并用分离质粒DNA的常用技术分离，如商业购买自Qiagen公司的技术。纯化DNA无细菌内毒素，用于作为治疗剂传递给人。在一个实施方案中，施用仅编码MBP的自身载体DNA治疗患多发性硬化的病人。在另一个实施方案中，施用编码2种或多种髓鞘自身-蛋白、-多肽或-肽的多个自身质粒。根据本发明讲授，施用治疗有效量的自身载体，载体包括编码一种或多种自身多肽的多核苷酸。例如，治疗有效量的自身载体在约0.001微克到约1克的范围内。优选的治疗量的自身载体在约10微克到约5毫克的范围内。最优选的治疗量的自身载体在约0.025mg到5mg的范围内。多核苷酸治疗每月传递，连续6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可制定另外的治疗方案且范围可从每日到每周、到每隔一月、到每年、到一次施用，这取决于疾病严重性、病人年龄、施用的自身多肽和其它因素如普通治疗医师会考虑的因素。

在一个实施方案中，DNA通过肌肉内注射传递。在另一个实施方案中，DNA作为吸入剂鼻内、口服、皮下、皮内、静脉内传递，经皮肤施加，或附于颗粒或珠传递给皮肤或通过皮肤。这种颗粒或珠可以是金、其它金属、聚苯乙烯或其它颗粒。在一个实施方案中，DNA在有生理水平的钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中制成。另外，DNA在含较高量的Ca++溶液中制成，量在1mM和2M间。在另一个实施方案中，DNA用其它阳离子制成，如锌、铝和其它。DNA也可用阳离子聚合物、阳离子脂质体制成，或在脂质体中制成。DNA也能编码于病毒载体、病毒颗粒或细菌来传递。

结合上述多核苷酸治疗，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂或“抑制素”以目前批准用于高胆固醇血症的剂量口服施用。例如，病人以10到80mg的剂量范围每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的优选剂量作为维持剂量。

用所示抑制素和多核苷酸疗法联合治疗的人MS病人在总无力分数、临床复发数和MRI监控基础上监控疾病活动性，MRI监控新的钆增强损伤数量和增强损伤体积。此联合疗法用于治疗复发-缓解以及慢性进行性MS。

实施例7：抑制素和多核苷酸治疗的联合包括施用编码胰岛素β链的自身肽的 DNA用于防止胰岛素依赖性糖尿病

NOD小鼠发展自发性自身免疫糖尿病，与人IDDM共享许多临床、免疫学和组织病理学特征。多核苷酸治疗用自身载体进行，载体包括的DNA编码胰岛素β链的氨基酸9-23的自身肽，胰岛素免疫显性抗原表位施用给NOD小鼠。对照是含编码胰岛素A链的相应肽的DNA的载体。编码自身肽的重叠寡核苷酸引物插入表达自身盒PcDNA。用编码自身肽胰岛素B(9-23)(insB-PcDNA)的自身载体治疗预计有效保护动物不产生糖尿病。胰岛素A(+)链的核苷酸序列是5’-CCGGAATTCGCCATGTGCACGTCAATCTGTTCACTGTACCAGCTAGAGAACTACTGCAACTAGTCTAQGAGC-3’(SEQ ID NO：74)；胰岛素B(+)链的序列是5’-CCGGAATTCGCCATGAGCCACCTAGTAGAAGCACTATACCTCGTATGCGGCGAACGAGGTTAGTCTAGAGC-3’(SEQ ID NO：75)。设计这些多核苷酸掺入EcoRI和XbaI限制性位点用于克隆。产物克隆入适当表达载体的多克隆区，如PcDNA3.1+(Invitrogen，Carlsbad，CA)。纯化自身质粒DNA用Qiagen Endo-free Mega-prep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)完成。

3到4周龄雌性NOD小鼠购自Taconic Farms(Germantown，NY)。实验动物在3到4周龄时用PBS中的0.1ml 0.25％盐酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)注射四头肌(0.05ml每四头肌)。2天后，小鼠的四头肌各注射0.05ml的1.0mg/ml质粒DNA。质粒DNA以10天间隔注射2次或多次。

结合上述多核苷酸治疗，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂或“抑制素”以1mg/kg或10mg/kg口服施用，如实施例5所述。

小鼠每周用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)测试糖尿，用One Touch II仪(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通过血浆葡萄糖测量确认糖尿病。血浆葡萄糖水平重复大于250mg/dl的动物认为患糖尿病。从实验和对照动物中取出胰，10％甲醛固定，石蜡包埋。薄切片有分开50□m的3个水平面，切割用于苏木精和曙红染色。浸润的严重性通过光学显微镜评估。此外，胰淋巴结中的抗原特异反应由用于细胞因子如IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β的ELISA和RT-PCR检测。

实施例8：抑制素和多核苷酸治疗的联合包括施用编码自身多肽胰岛素和自身蛋白谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶的DNA用于治疗胰岛素依赖性糖尿病

NOD小鼠用多核苷酸疗法治疗，包括编码完整胰岛素原多肽的DNA以及编码谷氨酸脱羧酶(GAD)65kDa或岛酪氨酸磷酸酶IA-2的DNA。分离编码胰岛素原、GAD 65和IA-2的cDNAs并克隆入表达自身盒pTARGET载体。DNA用QiagenEndo-free Mega-prep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。

NOD小鼠在3到4周龄时用PBS中的0.1ml 0.25％盐酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)注射四头肌(0.05ml每四头肌)。2天后，小鼠的四头肌各注射磷酸缓冲盐水中的0.05ml的1.0mg/ml各自身质粒DNA，磷酸缓冲盐水有0.9mM钙。质粒DNA以10天间隔注射2次或多次。

小鼠每周用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)测试糖尿，用One Touch II仪表(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通过血浆葡萄糖测量确认糖尿病。血浆葡萄糖水平重复大于250mg/dl的动物认为患糖尿病。

实施例9：抑制素和多核苷酸治疗的联合包括施用编码自身多肽胰岛素和/或自身蛋白谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶的DNA用于在确定的胰岛素依赖性糖尿病中治疗和逆转明显的高血糖症

NOD小鼠在糖尿检测基础上鉴定有明显的临床糖尿病，检测使用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)分析尿，用One Touch II仪(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通过血浆葡萄糖测量确认糖尿病。有明显临床糖尿病的NOD小鼠用多核苷酸疗法治疗，包括编码自身肽胰岛素B(9-23)(insB-PcDNA)的DNA或编码完整胰岛素原多肽的DNA以及编码谷氨酸脱羧酶(GAD)65kDa或岛酪氨酸磷酸酶IA-2的DNA，如实施例7和8。

小鼠每周用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)测试糖尿，用One Touch II仪(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通过血浆葡萄糖测量确认糖尿病。血浆葡萄糖水平重复大于300mg/dl的动物认为患糖尿病。

实施例10：抑制素和多核苷酸联合疗法用于治疗人胰岛素依赖性糖尿病

构建自身载体，载体包括的DNA编码人岛细胞自身蛋白如酪氨酸磷酸酶IA-2、谷氨酸脱羧酶(GAD)(65kDa或67kDa形式)、前胰岛素原或岛细胞抗原69KDa(ICA69)。DNA用PCR分离并克隆入表达自身盒，如上所述。治疗有效量的自身载体根据本发明讲授施用，载体包括编码一种或多种自身多肽的多核苷酸。例如，治疗有效量的自身载体在约0.001微克到约1克的范围内。优选治疗量的自身载体在约10微克到约5毫克的范围内。最优选的治疗量的自身载体在约0.025mg到约5mg的范围内。DNA治疗每月传递，连续6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可制定另外的治疗方案且范围可从每日到每周、到每隔一月、到每年、到一次施用，这取决于疾病严重性、病人年龄、施用的自身多肽和其它因素如普通治疗医师会考虑的因素。在一个较佳实施方案中，DNA通过肌肉内注射传递。另外，DNA自身载体作为吸入剂鼻内、口、皮下、皮内、静脉内传递，经皮肤施加，在治疗IDDM的病例中附于金粒，经基因枪传递给上肤或通过皮肤。DNA在有生理水平的钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中制成。另外，DNA在含较高量的Ca++溶液中制成，量在1mM和2M间。DNA用其它阳离子制成，如锌、铝和其它。

人糖尿病患者用所示抑制素和多核苷酸治疗的联合治疗，在对外源胰岛素需求减少、血清自身抗体分布改变、糖尿降低、糖尿病并发症减少的基础上监控患者的疾病活的性，糖尿病并发症如白内障、血管性功能不全、关节病和神经病。

实施例11：抑制素和多核苷酸联合治疗合包括施用编码自身蛋白II型胶原的DNA 用于防止自身免疫性滑膜炎和类风湿性关节炎(RA)

RA产生致病T细胞，致病T细胞回避促进自身耐受的机制。小鼠中胶原诱导的关节炎(CIA)是T细胞介导的自身免疫的模型，与RA共享许多特征，包括与RA中组织学类似的滑膜炎和骨侵蚀。CIA的复发模型有炎症糜烂性滑膜炎的临床复发和缓解，方式类似于RA病人中观察到的(Malfait等，Proc Natl Acad Sci USA，97：9561-6，2000)。CIA通过用完全弗氏佐剂中的II型胶原(CII)注射遗易感性小鼠品系来诱导。

用聚合酶链式反应分离编码鼠II型胶原的cDNA。另外的滑膜自身蛋白如IV和IX型胶原以及热激蛋白65可包括于多核苷酸治疗。编码所述肽的DNA用寡核苷酸引物获得以通过PCR从鼠CII cDNA扩增相关DNA的片段。框内甲硫氨酸起始翻译位点以及XhoI和XbaI限制性内切酶位点掺入寡核苷酸引物内。PCR产生的DNA片段克隆入表达自身盒的XhoI和XbaI限制性内切酶位点，如pTARGET载体(Promega，Madison，WI)，此载体是由CMV启动子驱动的哺乳动物表达载体。测序分离的克隆以确定生成的所需DNA序列。

实验开始时使用6-9周龄雄性DBA/1LacJ(H-2q)小鼠。100μg各纯化的自身质粒以每周间隔三次肌肉内注入前胫肌肉，然后诱导疾病用于防止CIA试验，或者在治疗复发CIA实验中在临床CIA发作后注射，自身质粒包括编码滑膜关节自身蛋白的DNA。这种DNA治疗在施用位置注射后开始，施用bupivicane、心脏毒素或另一种预处理剂或者没有这种试剂。

联合治疗后，小鼠的尾底部用完全弗氏佐剂(CFA)中的100μg纯化的异源CII蛋白皮内攻击以诱导急性CIA，或用CFA中的同源CII以诱导复发性CIA(Malfait等，Proc Natl Acad Sci USA，97：9561-66)。在目测记分系统(Coligan等，John Wiley andSons，Inc 15.5.1-15.5.24，1994)基础上每日跟踪小鼠的临床CIA表现，跟踪12周：0，无红斑和肿胀迹象；1，红斑和轻微肿胀，限于足中部(跗骨)或踝关节；2，红斑和轻微肿胀，从踝延伸到足中部；3，红斑和中等肿胀，从踝延伸到跖骨关节；4，红斑和严重肿胀，涵盖踝、足和趾。各动物的临床分数是其四爪目测分数的总和。产生临床关切炎的小鼠的关节上进行组织学分析。肢的第1个爪目测分数最高，它被脱钙、切片、用苏木精和曙红染色，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad SciUSA 91：2762-2766，1994)。检测染色切片的淋巴细胞糜烂、滑膜增生和侵蚀，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad Sci USA 91：2762-2766，1994)。

实施例2：抑制素和多核苷酸联合治疗包括施用编码自身蛋白II型胶原的DNA 用于治疗确定的自身免疫性滑膜炎和类风湿性关节炎

患确定进行中CIA的动物用自身载体DNA治疗以逆转确定的进行中CIA，DNA编码CII、BiP和/或GP-39。在目测记分系统(Coligan等，John Wiley and Sons，Inc15.5.1-15.5.24，1994)基础上每日跟踪小鼠的临床CIA表现，跟踪12周：0，无红斑和肿胀迹象；1，红斑和轻微肿胀，限于足中部(跗骨)或踝关节；2，红斑和轻微肿胀，从踝延伸到足中部；3，红斑和中等肿胀，从踝延伸到跖骨关节；4，红斑和严重肿胀，涵盖踝、足和趾。各动物的临床分数是其四爪目测分数的总和。对产生临床关节炎的小鼠的关节进行组织学分析。肢的第1个爪目测分数最高，它被脱钙、切片、用苏木精和曙红染色，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad Sci USA91：2762-2766，1994)。检测染色切片的淋巴细胞浸润、滑膜增生和糜烂，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad Sci USA 91：2762-2766，1994)。用抑制素和自身DNA的联合治疗会减少滑膜炎的临床复发数并降低目测记分系统基础上的关节炎严重性，自身DNA编码CII、Bip、GP-39和/或滑膜关节中存在的另外蛋白。

实施例13：结合抑制素和多核苷酸联合疗法用于防止或治疗人类风湿性关节炎和其它靶向关节的自身免疫病

构建自身质粒，质粒包括的DNA编码人自身蛋白如滑膜关节中表达的蛋白，包括II型胶原、Bip、gp39、IV型胶原、葡萄糖-6-磷酸异构酶和/或纤维蛋白。DNA用PCR分离并克隆入表达自身盒，如上所述。100μg质粒DNA在有钙的磷酸缓冲盐水中每月肌肉内施用。也能施用不同剂量方案、不同缓冲液中制成的DNA，或经不同施用途径，如以上实施例中所讨论。

有新发作或进行中RA的人用自身多核苷酸联合抑制素治疗，自身多核苷酸编码II型胶原、Bip、gp39、IV型胶原、葡萄糖-6-磷酸异构酶和/或纤维蛋白，RA在美国风湿病标准学会的基础上诊断(诊断需要4/7标准：(i)对称多关节炎，(ii)包含MCPs、PIPs或腕，(iii)包含大于3个不同的关节区，(iv)手或足的X光上有关节侵蚀，(v)阳性类风湿症因子测试，(vi)早晨僵硬超过1小时和(vii)伸肌表面上的小结。用于RA的联合疗法的功效在部分病人的基础上监控，他们的脆弱和肿胀关节计数的减少大于20％(美国风湿病学会的20％反应，ACR20)、50％(ACR50)和70％(ACR70)。另外的人RA测量包括类固醇使用中炎症标记(包括ESR和CRP)减少、射线照相进程中的减少(包括侵蚀和关节空间变窄)和无力状态分数(如健康评估调查表-HAQ)改善。也监控自身抗体效价和分布的变化。相同的方法用于相关关节炎如牛皮癣关节炎、反应性关节炎、赖特尔综合征、脊柱炎和风湿性多肌痛。

近来的研究提示一些对类风湿性关节炎有高特异性的自身抗体(如BiP、抗瓜氨酸抗体、抗聚丝蛋白抗体)可能先于临床诊断几个月或甚至几年。这提出一种可能性，能在疾病发作前鉴定病人并用预防性多核苷酸疗法有效治疗。筛选健康、无症状病人的诊断抗体的存在，包括但不限于上述一种血清学测试。测试阳性的病人用上述抑制素和多核苷酸疗法的联合治疗，在其它例子中尝试防止疾病发作和严重性。随后用上面的标准监控诊断和反应。

实施例14：抑制素和多核苷酸联合疗法用于治疗人自身免疫性葡萄膜炎

人S-抗原、光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP)、视紫质和恢复蛋白用PCR分离并克隆入DNA表达自身盒，如实施例5所述。构建自身质粒，质粒包括编码多核苷酸的DNA，多核苷酸编码的一种或多种自身多肽选自人S-抗原、光受体间类视黄醇结合蛋白、视紫质和恢复蛋白。治疗有效量的自身载体根据本发明讲授施用，载体包括编码一种或多种自身多肽的多核苷酸。例如，治疗有效量的自身载体在约0.001微克到约1克的范围内。优选治疗量的自身载体在约10微克到约5毫克的范围内。最优选的治疗量的自身载体在约0.025mg到约5mg的范围内。DNA治疗每月传递，连续6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可制定另外的治疗方案且范围可从每日到每周、到每隔一月、到每年、到一次施用，这取决于疾病严重性、病人年龄、施用的自身多肽和其它因素如普通治疗医师会考虑的因素。

在一个较佳实施方案中，DNA通过肌肉内注射传递。另外，DNA自身载体作为吸入剂鼻内、口、皮下、皮内、静脉内传递，经皮肤施加，在治疗自身免疫性葡萄膜炎的病例中附于金粒，经基因枪传递给皮肤或通过皮肤。在另一个实施方案中，DNA在有生理水平的钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中制成。另外，DNA在含较高量的Ca++溶液中制成，量在1mM和2M间。DNA能用其它阳离子制成，如锌、铝和其它。

实施例15：抑制素和多核苷酸联合疗法用于防止原发性胆汁性肝硬变并治疗确定的原发性胆汁性肝硬变

编码人PDC-E2和-E3的DNA用PCR分离并克隆入合适的哺乳动物表达载体的表达自身盒，在大肠杆菌中扩增，用无内毒素的质粒纯化方法纯化。多核苷酸治疗施用给患确定PBC的人，多核苷酸包括编码自身蛋白PDC-E2和-E3的DNA。载体可与自身载体一起施用，此载体包括编码细胞因子如IL-4的DNA。

患PBC或有发展PBC风险的病人能通过鉴定血清自身抗体有效诊断，自身抗体针对线粒体蛋白如丙酮酸脱氢酶复合体。无症状的人类病人用现有的血清学试验测试，如ELISA、蛋白质印迹或蛋白质阵列用于诊断自身抗体的存在。血清学测试阳性的病人用上述多核苷酸疗法预防性治疗以防止疾病发作。用于PBCs的联合疗法在人中的功效通过测量连续肝功能试验以及肝功能衰竭进程的时间延迟来确定，肝功能试验包括胆红素、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。经皮肝活组织检查后，肝组织学通过苏木精和曙红染色和高碘酸希夫染色来评估。也检测胆管异常、门道(portal tract)中的坏死-炎症性变化和肉芽肿性浸润作为疾病活动性的证据。也分析血清自身抗体分布。

实施例16：用抑制素和编码骨桥蛋白的DNA联合治疗多发性硬化和其它自身免疫病的方法

骨桥蛋白是多效分子，近来被鉴定在多发性硬化和其动物模型EAE中发挥致病作用。骨桥蛋白也可在炎性关节炎和其它人自身免疫病中发挥重要作用。用编码自身蛋白骨桥蛋白的DNA治疗治疗小鼠诱导宿主中抗骨桥蛋白的免疫球蛋白反应，抑制骨桥蛋白在持续疾病中的有害影响。

在患多发性硬化的人中，骨桥蛋白-自身载体治疗在诊断后开始。结合此多核苷酸治疗，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂或“抑制素”以目前批准用于高胆固醇血症的剂量口服施用。例如，病人以10到80mg的剂量范围每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的优选剂量作为维持剂量。功效在诱导多发性硬化病人中抗骨桥蛋白抗体的基础上监控，如通过ELISA分析测量。在脑MRI扫描中损伤数和大小的减少、疾病复发数的降低(临床瘫痪的发作)和到无力的进展变慢的基础上进一步证明功效。

实施例17：抑制素和多核苷酸联合治疗包括施用编码自身免疫反应靶向器官或组织中表达自身蛋白文库的DNA

另一种治疗自身免疫的策略是施用DNA，DNA编码免疫攻击下组织或器官内存在的许多或所有自身蛋白。cDNA表达文库包含的cDNA编码特定组织、器官或细胞类型中表达的许多或绝大部分自身蛋白。这种cDNA表达文库在自身载体中产生以能在施用给宿主时表达它们编码的多肽。患确定多发性硬化的动物和人用自身载体治疗，载体编码脑中少突细胞表达的cDNA文库。患类风湿性关节炎的动物和人用自身载体治疗，载体编码滑膜关节中表达的cDNA文库，滑膜关节是类风湿性关节炎中自身免疫反应的靶。患自身免疫性糖尿病的动物和人用自身载体治疗，载体编码胰β细胞中表达的cDNA文库。编码胰β细胞中表达cDNA文库的自身载体也能用于防止个体中产生临床糖尿病，个体被鉴定有高风险发展自身免疫性糖尿病。另外，自身载体中编码的在亚群的cDNA表达文库能用于治疗自身免疫，而不是使用完整cDNA文库。

实施例18：抑制素和有序肽用于联合治疗多发性硬化

以前显示一些含3个氨基酸重复序列的有序肽能减少MS动物模型中的疾病严重性，氨基酸有序排列以结合MS相关MHC分子中存在的口袋。例如，证明MBP p87-99序列基础上的特定氨基酸序列(EYYKEYYKEYYK)能有效防止和治疗刘易斯大鼠中的EAE，发现此序列在MS病人中免疫显性。

在本发明的联合疗法中，有序肽如EYYKEYYKEYYK每日、一周两次、每周、每月二次、每月皮下施用给MS病人，或者偶尔联合抑制素施用，如实施例6所述。

用所示抑制素和有序肽联合治疗的人MS病人在临床复发数和MRI监控基础上监控疾病活动性，MRI监控新的钆增强损伤的数量和增强损伤的体积。

实施例19：抑制素和免疫调节序列(IMS)用于联合治疗多发性硬化

以前显示一些有称为IMS’s的硫代磷酸主链的单链寡核苷酸能减少MS动物模型中的疾病严重性，IMS优选包含六聚体基序5’-嘌呤-嘌呤-G-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘧啶-G-G-嘧啶-嘧啶3’。

在本发明的联合疗法中，IMS寡肽每日、一周两次、每周、每月二次、每月皮下施用给MS病人，或者偶尔联合抑制素施用，如实施例6所述。

用所示抑制素和IMS联合治疗的人MS病人在临床复发数和MRI监控基础上监控疾病活动性，MRI监控新的钆增强损伤的数量和增强损伤的体积。

Claims

1.一种治疗自身免疫病的方法，其特征在于，所述方法包括：

共施用有效量的抑制素和有效量的抗原特异性免疫调节剂给罹患自身免疫病的病人。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，抗原特异性免疫调节剂是包含多核苷酸的自身载体，多核苷酸编码与自身免疫病相关的自身多肽。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，自身多肽是自身蛋白或自身肽。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，抗原特异性免疫调节剂是多肽。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，多肽是蛋白或肽。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，多肽是衍生多肽。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，多肽包含与疾病相关的自身多肽。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，多肽包含的氨基酸对应于疾病相关的自身多肽的自身抗原表位。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，对应于自身抗原表位的氨基酸随机化形成随机共聚物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，随机共聚物是肽。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，对应于自身抗原表位的氨基酸是有序的，从而多肽包含有序的氨基酸基序。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，自身免疫病是脱髓鞘自身免疫病，有序的氨基酸基序是[¹E²Y³Y⁴K]_n，其中n从2到6。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，自身免疫病选自多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、类风湿性关节炎和自身免疫性葡萄膜炎。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，自身免疫病是多发性硬化。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，抑制素选自罗苏伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、昔伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀和西伐他汀。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，抑制素是阿托伐他汀。

17.如权利要求2所述的方法，其特征在于，多核苷酸编码的多肽选自髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、髓鞘相关少突细胞碱性蛋白(MBOP)、髓鞘少突细胞蛋白(MOG)和α-B晶体。

18.如权利要求2所述的方法，其特征在于，自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，多核苷酸编码的多肽选自胰岛素、胰岛素B链、前胰岛素原、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶的65kDa形式、谷氨酸脱羧酶的67kDa形式、酪氨酸磷酸酶IA2或IA-2b、羧肽酶H、热激蛋白、glima38、岛细胞抗原的69kDa形式、p52和岛细胞葡萄糖转运子(GLUT 2)。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，自身载体包含编码一种自身多肽的多核苷酸。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，自身多肽是前胰岛素原。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，自身多肽是胰岛素B链9-23。

23.如权利要求2所述的方法，其特征在于，自身免疫病是类风湿性关节炎。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，多核苷酸编码的多肽选自II型胶原；hnRNP A2/RA33；Sa；聚丝蛋白；角蛋白；包括gp39的软骨蛋白；I、III、IV、V、IX、XI型胶原；HSP-65/60；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；和醛缩酶A。

25.如权利要求2所述的方法，其特征在于，自身免疫病是自身免疫性葡萄膜炎。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，多核苷酸编码的多肽选自S抗原、光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP)、视紫质和恢复蛋白。

27.一种治疗自身免疫病的方法，其特征在于，所述方法包括：

共施用有效量的抑制素和有效量的非抗原特异性免疫调节剂给罹患自身免疫病的病人。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，非抗原特异性免疫调节剂是免疫调节序列。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，免疫调节序列选自

(a)5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’和

(b)5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶3’，

30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，非抗原特异性免疫调节剂是骨桥蛋白。

31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，非抗原特异性免疫调节剂是自身载体，载体包含编码骨桥蛋白的多核苷酸。

32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，自身免疫病选自多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、类风湿性关节炎和自身免疫性葡萄膜炎。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，自身免疫病是多发性硬化。

34.如权利要求27所述的方法，其特征在于，抑制素选自罗苏伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、昔伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀和西伐他汀。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，抑制素是阿托伐他汀。