CN100534436C - 多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供了治疗或防止动物疾病的方法，所述疾病与一个或多个存在于或参与非生理过程的自身-蛋白质、多肽或肽相关，所述方法包括施用自身载体给动物，自身载体含编码疾病相关自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸。施用含编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸的自身载体调节对自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答，自身-蛋白质、多肽或肽通过施用自身载体表达。本发明也提供组合物，它包括编码一种或多个非生理存在自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，用于治疗或防止的疾病与动物非生理过程中存在和/或作为其靶的自身-蛋白质、多肽或肽相关。

Description

多核苷酸

本发明涉及治疗受试者疾病的方法和组合物，疾病与一个或多个存在于受试者中或参与非生理状态的自身-蛋白质、多肽或肽相关。本发明也涉及预防受试者疾病的方法和组合物，疾病与一个或多个存在于受试者中或参与非生理状态的自身-蛋白质、多肽或肽相关。本发明进一步涉及鉴定在非生理状态中存在和疾病相关的自身-蛋白质、多肽或肽。本发明同样涉及施用多核苷酸，多核苷酸编码非生理状态中存在和疾病相关的自身-蛋白质、多肽或肽。本发明也涉及调节对自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答，自身-蛋白质、多肽或肽存在于动物中且参与非生理状态并与疾病相关。发明更特定涉及治疗或防止自身免疫疾病的方法和组合物，疾病与一个或多个存在于动物非生理状态中的自身-蛋白质、多肽或肽相关，如多发性硬化、风湿性关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性色素层炎、原发性胆硬化、重症肌无力、Sjogren综合征、寻常性天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)和葛雷夫斯氏病。发明也特定涉及治疗或防止神经变性疾病的方法和组合物，此疾病与一个或多个存在于动物非生理状态中的自身-蛋白质、多肽或肽相关，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿症和遗传性海绵状脑病(朊病毒疾病，最常见形式称为克雅氏病)。发明进一步特定涉及其它与一个或多个存在于动物非生理状态中自身-蛋白质、多肽或肽相关的疾病，如骨关节炎、脊髓损伤、肥胖、高血压、胃溃疡病、低压、痛风、偏头痛、高脂血和冠心病。发明更特定涉及疾病如弥漫性脑脊髓炎，与一个或多个来自例如天花疫苗施用的自身-蛋白质、多肽相关。发明也涉及治疗或防止疾病的方式和方法，疾病与存在于动物非生理状态中的自身-蛋白质、多肽或肽相关。发明进一步涉及治疗动物，包括施用多核苷酸，多核苷酸编码非生理状态存在或参与动物中非生理状态的自身-蛋白质、多肽或肽。

2.自身免疫疾病和调节免疫应答

自身免疫疾病是适应性免疫引起的任何疾病，误导向身体健康细胞和/或组织。自身免疫疾病影响3％的美国人和可能类似百分比的工业国家人口(Jacobson等，Clin Immunol Immunopathol 84，223-43，1997)。自身免疫疾病特征是T和B淋巴细胞异常靶向自身-蛋白质、多肽、肽和/或其它自身分子，引起体内器官、组织或细胞类型的损伤或功能失常(例如胰腺、脑、甲状腺或胃肠道)，导致疾病的临床表现(Marrack等，Nat Med 7，899-905，2001)。自身免疫疾病包括影响特定组织的疾病以及能影响多种组织的疾病。对于一些疾病，这部分取决于自身免疫反应是针对限于特定组织的抗原还是广泛分布于体内的抗原。组织-特异自身免疫的特征是选择性靶向单个组织或单独细胞类型。然而，一些靶向遍在自身蛋白质的自身免疫疾病也可影响特定组织。例如，在多肌炎中，自身免疫反应靶向遍在蛋白组氨酰-tRNA合成酶，而主要包括的临床表现是自身免疫破坏肌肉。

免疫系统使用高度复杂的机制，设计用于产生保护哺乳动物抗多种外源病原体的反应而同时防止抗自身抗原的反应。除了决定是否应答(抗原特异性)，免疫系统也必须选择适当效应子功能以处理各病原体(效应子特异性)。调节和控制这些效应子功能的关键细胞是CD4⁺T细胞。此外，来自CD4⁺T细胞的特定细胞因子似乎是T细胞调节它们功能的主要机制。因此，确定CD4⁺T细胞所产生细胞因子类型的特征以及它们的分泌如何受控制对于理解免疫系统如何被调节很重要。

从长期小鼠CD4⁺T细胞克隆产生的细胞因子特征在10年前出版(Mosmann等，J.Immunol.136：2348-2357，1986)。在这些研究中，显示CD4⁺T细胞产生两种不同模式的细胞因子生成，命名为T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)。发现Th1细胞主要产生白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和淋巴毒素(LT)，而Th2克隆主要产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-13(Cherwinski等，J.Exp.Med.169：1229-1244，1987)。稍后，另外的细胞因子IL-9和IL-10丛Th2克隆中分离(Van Snick等，J.Exp.Med.169：363-368，1989)(Fiorentino等，J.Exp.Med.170：2081-2095，1989)。最后，发现其它细胞因子如IL-3、粒细胞巨噬细胞-刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)都由Th1和Th2细胞分泌。

自身免疫疾病包括广泛的疾病，能影响许多不同体内器官和组织，如上表所概括(参见例如Paul，W.E.(1999)《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，第四版，Lippincott-Raven，New York.)

表1-主要靶向器官	疾病
		甲状腺	Hashimoto病
甲状腺	原发性粘液性水肿
		甲状腺	甲状腺毒症
胃	恶性贫血

胃	萎缩性胃炎
		肾上腺	爱迪生氏病
胰岛	胰岛素依赖型糖尿病
		肾	肺出血-肾炎综合征
神经肌肉接头	重症肌无力
		间质细胞	男性不育
皮肤	寻常性天疱疮
		皮肤	类天疱疮
眼	交感神经眼炎
		眼	晶状体眼色素层炎
脑	多发性硬化
		红细胞	溶血性贫血
血小板	特发性血小板减少性紫癜
		白细胞	自发性白血球减少症
胆管(biliary tree)	原发性胆硬化
		肠	溃疡性结肠炎
动脉	动脉硬化症
		唾腺和泪腺	Sjogren综合征
滑膜关节	风湿性关节炎
		肌肉	多肌炎
肌肉和皮肤	皮肌炎
		皮肤	硬皮病
皮肤、关节、肌肉、血细胞	混合结缔组织疾病
		凝血因子	抗磷脂病
皮肤	盘状红斑狼疮
		皮肤、关节、肾、脑、血细胞	系统性红斑狼疮(SLE)

目前治疗人自身免疫疾病包括糖皮质激素、细胞毒性剂和最近发展的生物治疗。一般，控制人全身性自身免疫疾病根据经验且不令人满意。对于大部分，广泛的免疫抑制药物如皮质甾类用于多种严重自身免疫和炎症紊乱。除了皮质甾类，其它免疫抑制剂用于控制全身性自身免疫疾病。环磷酰胺是烷化剂，导致T和B淋巴细胞都深度耗尽并损伤细胞-调节免疫。环孢霉素、血流谱(tacrolimus)和霉酚酸mofetil是具特异抑制T淋巴细胞性质的天然产物，它们用于治疗SLE、RA和有限程度的血管炎和肌炎。这些药物与显著肾毒性相关。氨甲蝶呤也在RA中用作“第二道防线”(second line)试剂，目的是减少疾病发展。它也用于多肌炎和其它结缔组织疾病。其它尝试方法包括单克隆抗体，旨在阻碍细胞因子作用或耗尽淋巴细胞(Fox，D.A.Am.J.Med.99：82-881995)。治疗多发性硬化(MS)包括干扰素β和共聚物1，它们使复发速度降低20-30％且对疾病发展仅有适度作用。MS也用免疫抑制剂治疗，包括甲强龙、其它类固醇、氨甲蝶呤、cladribine和环磷酰胺。这些免疫抑制剂在MS治疗中功效最小。风湿性关节炎(RA)的当前治疗使用非特异抑制或调节免疫功能的试剂，如氨甲蝶呤、硫氮磺胺吡啶、羟化氯喹、leuflonamide、强的松以及最近发展的TNFα拮抗物etanercept和infliximab(Moreland等，J Rheumatol 28，1431-52，2001)。Etanercept和infliximab全面阻碍TNFα，使病人更易因脓毒病死亡、加重慢性分枝杆菌感染和发展脱髓鞘。

在器官-特异自身免疫的情况中，尝试了一些不同治疗方法。全身施用可溶蛋白质抗原以抑制随后对此抗原的免疫应答。这种治疗包括传递髓鞘碱性蛋白、其主要肽或髓鞘蛋白混合物给患实验性自身免疫脑脊髓炎的动物和患多发性硬化的人(Brocke等，Nature 379，343-6，1996；Critchfield等，Science 263，1139-43，1994；Weiner等，Annu Rev Immunol 12，809-37，1994)，施用II型胶原或胶原蛋白混合物给患胶原-诱导关节炎的动物和患风湿性关节炎的人(Gumanovskaya等，Immunology 97，466-73，1999)；(McKown等，Arthritis Rheum 42，1204-8，1999)；(Trentham等，Science 261，1727-30，1993)，传递胰岛素给患自身免疫糖尿病的动物和人(Pozzilli和Gisella Cavallo，Diabetes Metab Res Rev 16，306-7，2000)，传递S抗原给患自身免疫性色素层炎的动物和人(Nussenblatt等，Am J Ophthalmol 123，583-92，1997)。此方法相关问题是全身注射抗原引起的T细胞无应答。另一种方法是尝试设计合理治疗策略用于全身施用肽抗原，以T细胞受体和结合MHC分子的肽间相互作用为基础。一种研究在动物糖尿病模型中使用肽方法，导致发展对应于肽的抗体生成(Hurtenbach，U等J Exp.Med 177：1499，1993)。另外一种方法是施用T细胞受体(TCR)肽免疫。参见例如(Vandenbark AA等，Nature 341：541，1989)。而另一种方法是通过摄取肽或蛋白质抗原来诱导口头耐受。参见例如(WeinerHL，Immunol Today，18：3351997)。

目前改变免疫应答是通过单独传递蛋白质、多肽或肽或结合佐剂(免疫刺激剂)。例如，乙肝病毒疫苗包含非自身抗原重组乙肝病毒表面抗原，在用作佐剂的氢氧化铝中制成。此疫苗诱导抗乙肝病毒疫苗表面抗原的免疫应答以保护抗感染。另一种方法包括传递减毒、复制缺陷和/或非致病形式的病毒或细菌以引起宿主抗病原体的保护性免疫应答，这些都是非自身抗原。例如，口服脊髓灰质炎疫苗包括非自身抗原活减毒病毒，感染细胞并在接种个体中复制以诱导有效免疫抗脊髓灰质炎病毒、外源或非自身抗原，而不引起临床疾病。另外，灭活脊髓灰质炎疫苗包含不能感染或复制的灭活或“死”病毒，皮下施用以诱导保护性免疫抗脊髓灰质炎病毒。

3.神经变性疾病

神经变性疾病是广范围的中枢神经系统疾病，特征都是神经细胞缓慢累积破坏或变性(Temlett，Curr Opin Neurol 9，303-7，1996)；(Dickson，Curr Opin Neurol 14，423-32，2001)；(Kaye，Neurology 51，S45-52；discussion S65-7，1998)；(Prusiner，ProcNatl Acad Sci USA 95，13363-83，1998)；(Cummings等，Neurology 51，S2-17；discussionS65-7，1998)；(Lin等，Neuron 24，499-502，1999)；(Chesebro，Neuron 24，503-6，1999)；(Ross，Neuron 19，1147-50，1997)；(Yankner，Neuron 16，921-32，1996)；(Selkoe，Neuron6，487-98，1991)。脑或脊髓中神经元变性导致永久破坏性的临床症状，包括一些情况中的深度痴呆、异常移动、震颤、步法共济失调或癫痫样行为。几乎所有神经变性疾病普遍发展痴呆，可表明自身完全不能照顾自己和总体缺乏对朋友和家人的识别。

这些疾病的另外普遍特征是缺乏有效治疗。现在可用的大部分治疗集中于支持性护理晚期症状，没有一个针对这些疾病潜在的病理生理原因。例如，帕金森氏症的药物治疗针对且通常有效暂时控制疾病相关的震颤，但没有药物有效停止痴呆发展和脑黑质中神经元的破坏(Jankovic，Neurology 55，S2-6，2000)。另一个例子中，对于阿尔茨海默氏病，直到最近没有治疗可用于痴呆发展，这是此疾病的特征。现在批准一些胆碱脂酶抑制剂用于阿尔茨海默氏病(Farlow和Evans，Neurology 51，S36-44；discussion S65-7，1998)(Hake，Cleve Clin J Med 68，608-9，613-4，616，2001)。这些药物可能增加脑中神经递质乙酰胆碱的量，导致使用乙酰胆碱作为递质的特定神经元功能改进。所有这些药物总体在临床试验中仅显示小功效，认知测试中的主要终点是改进。这些药物也不针对阿尔茨海默氏病的主要病理生理学，即破坏脑中胆碱能神经元。因此，目前没有治疗针对任何神经变性疾病的主要病理原因。

大部分神经变性疾病也普遍发现中枢神经系统区域中物质集合或积聚，大部分受变性过程影响。这些可胞外或胞内发现的异常积聚引起相关神经元的死亡和破坏。此外，积聚的特征和组成对特定疾病特异。例如，阿尔茨海默氏病中的集合由称为淀粉样β(Aβ)的蛋白质组成，而帕金森氏症中由称为α-突触核蛋白的蛋白质组成(Dickson，Curr Opin Neurol 14：423-432，2001)；(Cummings等，Neutology 51，S2-17；discussion S65-7，1998)。特征是这些集合发展和积聚的神经变性疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿症和朊病毒疾病(Yankner，Neuron 16：921-32，1996)；(Ross，Neuron 19：1147-50，1997)(Chesebro，Neuron 24：503-506，1999)；(Dickson，Curr Opin Neurol 14：423-432，2001)。

4.多核苷酸治疗

基因治疗。多核苷酸治疗包括编码肽和/或多肽的裸露DNA，DNA在沉淀-和转染-促进剂中制成，病毒载体用于“基因治疗”。基因治疗是传递多核苷酸以提供蛋白质或肽的表达，用于取代宿主中的缺陷或缺乏蛋白质或肽和/或增强所需生理功能。基因治疗包括的方法使DNA整合到个体基因组中用于治疗目的。基因治疗的例子包括传递DNA，DNA编码血友病的凝血因子、严重联合免疫缺陷的腺甙脱氨酶、家族高胆甾醇血的低密度脂蛋白受体、Gaucher病的葡糖脑苷脂酶、α1-抗胰蛋白酶缺陷的α1-抗胰蛋白酶、血红蛋白病的α或β球蛋白基因以及囊肿性纤维化的氯化物通道(Verma和Somia，Nature 389，239-42，1997)。

DNA免疫以治疗感染。在DNA免疫中，非复制转录单位可提供合成蛋白质或蛋白质部分的模板，蛋白质或蛋白质部分诱导或提供宿主中的特异免疫应答。注射裸露DNA促进抗多种微生物和肿瘤的疫苗接种(Robinson和Torres，SeminImmunol 9，271-83，1997)。编码特定蛋白质的DNA疫苗存在于病毒(乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、轮状病毒和流感病毒)、细菌(结核分枝杆菌)和寄生虫(疟疾)、所有非自身抗原，发展DNA疫苗以防止和治疗这些感染(Le等，Vaccine 18，1893-901.，2000)；(Robinson和Pertmer，Adv Virus Res 55，1-74，2000)。

治疗瘤形成的DNA。正在发展编码I类组织相容性抗原、细胞因子(IL-2、IL-12和IFN-γ)和肿瘤抗原的DNA疫苗以治疗瘤形成(Wlazol和Ertl，Arch ImmunolTher Exp 49：1-11，2001)。例如，施用编码B细胞免疫球蛋白个体基因型(抗原结合区)的病毒DNA以去除和保护抗B细胞淋巴瘤(Timmerman等，Blood97：1370-1377，2001)。

DNA免疫以治疗自身免疫疾病。其他人描述了编码免疫分子的DNA疗法用于治疗自身免疫疾病。这种DNA疗法包括编码T细胞受体抗原结合区的DNA以改变推动自身免疫反应的自动反应T细胞水平(Waisman等，Nat Med 2：899-905，1996)(美国专利5,939,400)。编码自身抗原的DNA粘附于颗粒且通过基因枪传递到皮肤以防止多发性硬化和胶原诱导的关节炎(专利WO 97/46253；Ramshaw等，Immunol.和Cell Bio.75：409-413，1997)。编码粘附分子、细胞因子(TNFα)、化学因子(C-C化学因子)和其它免疫分子(Fas-配基)的DNA用于自身免疫疾病的动物模型(Youssef等，J Clin Invest 106：361-371，2000)；(Wildbaum等，J Clin Invest 106：671-679，2000)；(Wildbaum等，J Immunol 165：5860-5866，2000)；(Wildbaum等，J Immunol161：6368-7634，1998)；(Youssef等，J Autoimmun 13：21-9，1999)。

本发明的一个目标是提供方法治疗或防止疾病，此疾病与动物非生理过程中存在的自身-蛋白质、多肽或肽相关。本发明的另一个目标是提供治疗或防止自身免疫疾病的特定方法，一般不削弱免疫系统。而本发明的又一个目标是提供治疗或防止神经变性疾病的特定方法。本发明的另外一个目标是提供组合物治疗或防止疾病，此疾病与动物非生理过程中存在的自身-蛋白质、多肽或肽相关。本发明的另一个目标是鉴定非生理存在和疾病相关的自身-蛋白质、多肽或肽。这些和本发明的其它目标总体通过说明书表现。

发明概述

本发明的目标伴随着治疗或防止动物疾病的新方法，疾病与一个或多个动物非生理存在的自身-蛋白质、多肽或肽相关，方法包括施用含多核苷酸的自身载体给动物，多核苷酸编码疾病相关的自身-蛋白质、多肽或肽。施用含编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸的自身载体调节对自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答，自身-蛋白质、多肽或肽通过施用自身载体表达。组合物包括编码一种或多个治疗动物中非生理存在自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，用于治疗的疾病与动物非生理过程中存在和/或作为其靶的自身-蛋白质、多肽或肽相关。本发明发现施用多核苷酸调节对自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答以治疗疾病，多核苷酸编码非生理存在或非生理过程靶向的自身-蛋白质、多肽或肽，疾病与参与动物中非生理的自身-蛋白质、多肽或肽相关。

在发明的一方面，提供治疗或防止自身免疫疾病的方法，如多发性硬化、风湿性关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性色素层炎、原发性胆硬化、重症肌无力、Sjogren综合征、寻常性天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)和葛雷夫斯氏病，包括施用含多核苷酸的自身载体给动物，多核苷酸编码自身免疫疾病相关的自身-蛋白质、多肽或肽。施用含编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸的自身载体调节对自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答，自身-蛋白质、多肽或肽通过施用自身载体表达。在发明的一方面，用于防止自身免疫疾病的自身载体施用途径不同于粒子调节的基因枪传递给皮肤，自身载体含编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸。

在发明的一方面，提供治疗神经变性疾病的方法，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿症和遗传性海绵状脑病(朊病毒疾病，最常见形式称为克雅氏病)，包括施用含多核苷酸的自身载体给动物，多核苷酸编码神经变性疾病相关的自身-蛋白质、多肽或肽。施用含编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸的自身载体调节对自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答，自身-蛋白质、多肽或肽通过施用自身载体表达。

本发明也提供方式和方法鉴定疾病相关的自身-蛋白质、多肽或肽和调节对自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答。

本发明同样提供方式和方法诊断和监控疾病，疾病与动物中非生理存在的自身-蛋白质、多肽或肽相关。

本发明也提供方式和方法监控治疗，包括施用多核苷酸，多核苷酸编码动物中非生理存在的自身-蛋白质、多肽或肽。

附图简述

图1A.编码来自自身蛋白蛋白脂蛋白(PLP)的肽的DNA降低T细胞增殖反应。淋巴结细胞(NLC)对PLP139-151的增殖反应在DNA免疫小鼠中减少。从急性期恢复后，杀死疾病动物并分离排水LNC，疾病动物用编码PLP139-151的DNA(A)或对照载体pTarget(B)注射。细胞在体外用不同浓度的肽PLP139-151(正方形)或对照肽PLP178-191(三角形)刺激。5只动物组的合并LNC的增殖反应表示为三倍孔的平均CPM±SD。伴刀豆球蛋白A(0.001mg/ml)刺激LNC的A组CPM是102401，B组是76702。

图1B.在ELISA分析基础上，细胞因子水平在来自DNA免疫动物DNA的LNC中降低。EAE急性期后，来自5只动物组的LNC用编码PLP139-151的质粒DNA或单独载体(pTarget)免疫，体外用免疫肽PLP139-151刺激。上清中γ-干扰素(条纹柱)或IL-2(虚线柱)水平用ELISA测试并与已知标准对照相比。结果以ng/ml表示。

图1C.在RNA酶保护测定基础上，细胞因子水平在来自DNA免疫动物DNA的LNC中降低。对于细胞因子mRNA检测，来自实验动物脑的RNA样品用多探针RNA酶保护测定测试，反应用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。跑胶结束后干胶并曝光到x-光胶片。

图2.编码自身蛋白胰岛素的DNA防止NOD小鼠中糖尿病的发展。4周大前驱糖尿病NOD小鼠组用编码胰岛素B链免疫优势肽(残基9-23)(胰岛素B)、胰岛素A链肽(胰岛素A)的DNA自身载体、单独载体(pcDNA)处理或没有处理。

图3.定量PCR测量来自NOD小鼠的LNC中细胞因子表达。定量PCR测量胰腺LNC的细胞因子表达，胰腺LNC来自用10μg/ml胰岛素B(9-23)肽培养的免疫NOD小鼠。NOD小鼠用pcDNA或InsB-pcDNA间隔10天免疫2次，来自NOD小鼠的胰腺LNC在第2次注射后5天收集。细胞在胰岛素B(9-23)肽存在72时时培养，随后沉淀以定量PCR分析细胞因子mRNA水平。pcDNA对照免疫水平(实心柱)用作标准，insB-pcDNA免疫值(阴影柱)与之比较。

图4.编码淀粉样β的DNA诱导保护性抗淀粉样β抗体效价。小鼠用编码淀粉样β(Aβ)氨基酸1-42的DNA免疫，2周后加强。预处理和第2次免疫后4周，获得血清且进行ELISA分析以确定抗淀粉样β效价。各动物左边的柱代表预处理效价，右边的柱代表处理后效价。B1-B4是磷酸缓冲盐水(含0.9mM Ca++)处理的动物，具免疫刺激CpG序列。动物B5、A1和A2用tris EDTA(不含Ca++)中编码淀粉样β的DNA处理，具免疫刺激CpG序列。A3-A5仅用tris EDTA(不含Ca++)中自身载体DNA(pTARGET)处理，具免疫刺激CpG序列。

图5.用编码自身蛋白骨桥蛋白的DNA处理降低EAE发生率和严重性。C57B6小鼠用编码骨桥蛋白的DNA处理，然后用完全弗氏佐剂中的MOGp35-55诱导EAE。EAE的临床分数在垂直轴上表示。

图6.用抑制性IMS的多核苷酸治疗抑制PLP_139-151调节的EAE。在0天，7周大雌性SJL/J小鼠用10μg PBS中的PLP_139-151皮下免疫，PLP_139-151在CFA中乳化，CFA由IFA和0.5mg热灭活结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)组成。从第7天开始每天给动物临床打分。在第12天，小鼠四头肌都注射总共0.1ml PBS中的0.25％布比卡因-HCL。2天后，肌肉注射所选小鼠的四头肌，用编码单独pTARGET质粒上各全长鼠PLP、MAG、MOG和MBP的DNA多核苷酸(各25ng)加50μg编码全长鼠IL-4的pTARGET质粒，它们在0.2ml TE的总体积中。DNA注射每隔一周进行，注射6周。在起始DNA治疗同时，200μl PBS体积中的50μg IMS腹膜内单独施用或与DNA多核苷酸治疗一起。IMS每隔一周给予，进行6周。

图7.细胞因子分布EAE处理组。诱导EAE疾病后57天，杀死小鼠，提取来自各小鼠的腹股沟和腋淋巴结且根据各组收集。分离细胞并用10μg/ml富集RPMI培养基中的PLP_139-151和10％FCS刺激。3天后，细胞用人-rIL2再刺激另外3天。收集上清并通过三明治ELISA测试细胞因子分布，使用标准鼠(A)IFN-γ、(B)IL-4和(C)来自BD Pharmingen的IL-10ELISA试剂盒。

图8.DNA多核苷酸疗法和IMS治疗NOD小鼠的糖尿病。获得7周大的NOD/Lt雌性小鼠且在一限制进入室中居住。从10周大开始每周测试小鼠的血糖水平(BGL)提高，使用单触超血糖监控系统。当BGL在200到250mg/dl间时开始治疗。从15周大开始，可用小鼠相继加入各组。小鼠四头肌都注射总共0.2mlPBS中的0.25％布比卡因-HCL。2天后，肌肉注射小鼠的四头肌，用：1)编码单独pVAX1载体上各全长鼠前胰岛素原-1和前胰岛素原-2的DNA多核苷酸，以50μg/剂量；或2)50μg/剂量的编码单独pVAX1载体上各全长鼠前胰岛素原-1和前胰岛素原-2的DNA多核苷酸加编码IL-4的pVAX1载体，它们在0.2ml PBS的总体积中。DNA注射每隔一周进行，注射4周。在起始DNA治疗同时，200μl PBS体积中的50μg IMS腹膜内单独施用或与DNA多核苷酸治疗一起。IMS每隔一周给予，进行4周。糖尿病百分比定义为BGL持续大于250mg/dl的小鼠。

发明详述

为更充分理解本文所述发明，给出下列描述。

本发明提供方法治疗或防止动物疾病，此疾病与一个或多个动物中非生理存在或参与非生理状态的自身-蛋白质、多肽或肽相关，方法包括施用自身载体给动物，自身载体含编码疾病相关自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸。施用含编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸的自身载体调节对自身载体表达的自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答。

本发明的治疗或防止方法可用于任何与动物中非生理存在和/或参与非生理状态的自身-蛋白质、多肽或肽相关的疾病。

自身免疫疾病

下表列出一些自身免疫疾病的例子并描述于下，疾病与动物中非生理存在的自身-蛋白质、多肽或肽相关。

多发性硬化多发性硬化(MS)是最普遍的CNS脱髓鞘疾病，影响350,000个美国人和全球100万人。症状通常在20和40岁间开始发生，表现为急性或亚急性攻击单侧视觉缺陷、肌肉虚弱、感觉异常、共济失调、眩晕、尿不便、构音困难或智力干扰(以频率减少的顺序)。这种症状来自脱髓鞘的集中损伤，导致由轴突传导缓慢引起的负传导异常和由异位脉冲产生(如Lhermitte综合征)引起的正传导异常。MS诊断以历史为基础，包括至少两种时间上分开的不同神经功能紊乱攻击，产生神经功能紊乱的客观证据，涉及CNS白质的不同区域。实验室研究提供另外客观证据支持MS诊断，包括CNS白质损伤的共振成像(MRI)、IgG的脑脊髓液(CSF)寡克隆带和异常诱发反应。尽管大部分病人经历逐步发展的复发-恢复疾病过程，MS的临床过程在个体间变化很大且范围可从被限制到终生的一些轻微攻击从而爆发慢性发展的疾病。能分泌IFN-γ的髓鞘-自动反应T细胞的定量增加与MS和EAE发病相关。

自身免疫脱髓鞘疾病如多发性硬化和实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)中自身免疫应答的自身-蛋白质、多肽或肽靶可包括的抗原表位来自蛋白脂蛋白(PLP)；髓鞘碱性蛋白(MBP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)；环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)和髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MBOP)；α-B-晶体蛋白(热激蛋白)；病毒和细菌模拟肽，如流感、疱疹病毒、乙肝病毒等；OSP(少突胶质细胞特异蛋白)；瓜氨酸-修饰的MBP(MBP的C8同工型，其中6个精氨酸已变成瓜氨酸)等。整合膜蛋白PLP是髓鞘的优势自身抗原。PLP抗原的决定簇在一些小鼠品系中鉴定，包括残基139-151、103-116、215-232、43-64和178-91。至少报导了26种MBP抗原表位(Meinl等，J Clin Invest 92，2633-43，1993)。残基1-11、59-76和87-99值得注意。一些小鼠品系中鉴定的免疫显性MOG抗原表位包括残基1-22、35-55、64-96。如本文所用，术语“抗原表位”理解为指自身-蛋白质、多肽或肽，其具有的特定形状或结构被动物免疫系统的B细胞或T细胞识别。

在人MS病人中，下列髓鞘蛋白和抗原表位鉴定为自身免疫T和B细胞反应。从MS脑空斑(brain plaque)洗脱的抗体识别髓鞘碱性蛋白(MBP)肽83-97(Wucherpfenning等，J Clin Invest 100：1114-1122，1997)。另一个研究发现约50％MS病人有抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的外周血淋巴细胞(PBL)T细胞反应性(6-10％对照)、20％抗MBP反应(8-12％对照)、8％抗PLP反应(0％对照)、0％反应MAG(0％对照)。在此研究中，10个MOG反应病人中7个具有T细胞增殖反应，集中在3种肽抗原表位之一，包括MOG 1-22、MOG 34-56、MOG 64-96(Kerlero de Rosbo等，Eur J Immunol 27，3059-69，1997)。T和B细胞(脑损伤-洗脱的抗体)反应集中在MBP 87-99(Oksenberg等，Nature 362，68-70，1993)。在MBP 87-99中，氨基酸基序HFFK是T和B细胞反应的主要靶(Wucherpfennig等，J Clin Invest100：1114-1122，1997)。另一个研究观察到淋巴细胞抗髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MBOP)的反应性，包括残基MBOP 21-39和MBOP37-60(Holz等，J Immunol164，1103-9，2000)。使用MOG和MBP肽的免疫金缀合物以染色MS和对照脑，MBP和MOG都被MS空斑-结合抗体识别(Genain和Hauser，Methods 10，420-34，1996)。

风湿性关节炎风湿性关节炎(RA)是慢性自身免疫发炎滑膜炎，，影响全球0.8％的人口。其特征是引起侵蚀性关节破坏的慢性发炎滑膜炎。RA由T细胞、B细胞和巨噬细胞调节。

T细胞在RA中发挥关键作用的证据包括(1)渗透滑膜的CD4+T细胞占优势、(2)与用药物如环孢霉素抑制T细胞功能相关的临床改进以及(3)RA与一些HLA-DR等位基因的相连。RA相关的HLA-DR等位基因包含β链第3个高变区中位置67-74的氨基酸类似序列，参与肽结合和呈递给T细胞。RA由自动反应的T细胞调节，T细胞识别滑膜关节中存在的自身-蛋白质或修饰的自身-蛋白质。本发明的自身-蛋白质、多肽或肽也称为自身抗原，是RA的靶且包括的抗原表位来自II型胶原；hnRNP；A2/RA33；Sa；聚丝蛋白；角蛋白；瓜氨酸；软骨蛋白，包含gp39；I、III、IV、V、IX和XI型胶原；HSP-65/60；IgM(类风湿因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心磷脂；醛缩酶A；瓜氨酸-修饰的聚丝蛋白和血纤蛋白。在高比例RA病人血清中鉴定的自身抗体识别含修饰精氨酸残基(de-iminate以形成瓜氨酸)的聚丝蛋白肽。自动反应T和B细胞反应都针对一些病人中的相同免疫显性II型胶原(CII)肽257-270。

胰岛素依赖型糖尿病人I型或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的特征是郎格罕氏胰岛中β细胞的自身免疫破坏。β细胞耗尽导致不能调节血中葡萄糖水平。当血中葡萄糖水平上升超过特定水平，通常约250mg/dl，产生明显的糖尿病。在人中，糖尿病开始前有一个长症状前阶段。在此阶段中，逐步损失胰岛β细胞功能。疾病发展通过自身抗体的存在暗示，自身抗体抗胰岛素、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)，各自是本发明自身-蛋白质、多肽或肽的例子。

症状前阶段中可评估的标记是胰腺中胰岛炎的存在、胰岛细胞抗体的水平和频率、胰岛细胞表面抗体、胰岛β细胞上II型MHC分子的异常表达、血中葡萄糖浓度和胰岛素血浆浓度。胰腺、岛细胞抗体和血糖中T淋巴细胞数量增加指示疾病，胰岛素浓度下降也如此。

非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是一种动物模型，许多临床、免疫和组织病理学特征与人IDDM相同。NOD小鼠同时发展岛炎症和β细胞破坏，引起高血糖症和明显糖尿病。CD4⁺和CD8⁺T细胞都需要用于糖尿病发展，尽管各自的作用还不清楚。在耐受条件下施用胰岛素或GAD作为蛋白质给NOD小鼠显示防止疾病并下调对其它自身抗原的反应。

血清中存在具多种特异性的自身抗体组合对于人I型糖尿病高度敏感且特异。例如，存在抗GAD和/或IA-2的自身抗体对来自对照血清的I型糖尿病约98％敏感和99％特异。在I型糖尿病患者的非糖尿病第一程度亲戚中，存在的自身抗体特异于3种自身抗原的2种，包括GAD、胰岛素和IA-2，使5年内发展I型DM的阳性预测值＞90％。

人胰岛素依赖型糖尿病中靶向的自身抗原可包括自身-蛋白质、多肽或肽酪氨酸磷酸酶IA-2；IA-2β；65和67kDa形式的谷氨酸脱羧酶(GAD)；羧肽酶H；胰岛素；胰岛素原；热激蛋白(HSP)；glima 38、岛细胞抗原69kDa(ICA69)；p52；两种神经节苷脂抗原(GT3和GM2-1)；岛细胞葡萄糖转运子(GLUT-2)。

目前治疗人IDDM通过监控血糖水平以指导注射或以泵为基础传递重组胰岛素。饮食和锻炼安排有助于获得适当血糖控制。

自身免疫性色素层炎自身免疫性色素层炎是眼的自身免疫疾病，估计影响400,000人，美国每年发生43,000起新病例。目前治疗自身免疫性色素层炎用类固醇、免疫抑制剂如氨甲蝶呤和环孢霉素、静脉内免疫球蛋白和TNFα-拮抗物。

实验性自身免疫性色素层炎(EAU)是T细胞调节的自身免疫疾病，靶向眼中的神经视网膜、眼色素层和相关组织。EAU与人自身免疫性色素层炎共享许多临床和免疫特征，通过外周施用眼色素层产生(uveitogenic)肽诱导，肽在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化。

人自身免疫性色素层炎中自身免疫反应靶向的自身-蛋白质可包括S-抗原、光感受器间类维生素A结合蛋白(IRBP)、视紫质和恢复蛋白。

原发性胆硬化原发性胆硬化(PBC)是器官特异的自身免疫疾病，主要影响40-60岁的妇女。此组中报导的发生率接近每1,000人中1个。PBC特征是发展肝内胆汁上皮细胞(IBEC)的破坏，IBEC沿小肝内胆管排列。这导致阻碍和干扰胆汁分泌，引起最终的硬化。报导了与其它自身免疫疾病的相连，其它自身免疫疾病特征是上皮排列/分泌系统损坏，包括Sjogren综合征、CREST综合征、自身免疫甲状腺疾病和风湿性关节炎。关于推动抗原的注意集中在线粒体上超过50年，发现抗线粒体抗体(AMA)(Gershwin等，Immunol Rev 174：210-225，2000)；(Mackay等，Immunol Rev 174：226-237，2000)。AMA很快成为实验室诊断PBC的基础，PBC在临床症状出现前存在于90-95％病人血清中。线粒体的自身抗原反应性命名为M1和M2。M2反应性针对48-72kDa组成家族。M2代表2-氧化酸脱氢酶复合体(2-OADC)酶的多种自身抗原亚基，是发明自身-蛋白质、多肽或肽的另一个例子。研究鉴定PBC发病机理中丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)抗原的作用，研究支持PDC在疾病诱导中发挥关键作用的观点(Gershwin等，Immunol Rev 174：226-237，2000)。95％PBC病例中最频繁的反应性是属于PDC-E2的E274kDa亚基。存在相关但不同的复合体，包括：2-酮戊二酸脱氢酶复合体(OGDC)和分支(BC)2-OADC。三种组成型酶(E1、2、3)有助于催化功能，将2-氧化酸底物转化成乙酰-辅酶A(CoA)，NAD⁺还原成NADH。哺乳动物PDC包含另外的成分，命名为蛋白X或E-3结合蛋白(E3BP)。在PBC病人中，主要的抗原反应针对PDC-E2和E3BP。E2多肽包含2个串列重复的硫辛酰结构域，而E3BP有单硫辛酰结构域。硫辛酰结构域在一些PBC自身抗原靶中发现且在本文称为“PBC硫辛酰结构域”。PBC用糖皮质激素和免疫抑制剂治疗，免疫抑制剂包括氨甲蝶呤和环孢霉素A。

实验性自身免疫胆管炎(EAC)的鼠模型使用哺乳动物PDC腹膜内(i.p.)致敏雌性SJL/J小鼠，包括非化脓破坏性胆管炎(NSDC)和AMA生成(Jones，.J Clin Pathol53：813-21，2000)。

其它自身免疫疾病和相关自身-蛋白质、多肽或肽。重症肌无力的自身抗原可包括乙酰胆碱受体中的抗原表位。寻常性天疱疮中靶向的自身抗原可包括桥粒芯蛋白-3。Sjogren综合征抗原可包括SSA(Ro)；SSB(La)和胞影蛋白。寻常性天疱疮的优势自身抗原可包括桥粒芯蛋白-3。肌炎组可包括tRNA合成酶(如苏氨酰、组氨酰、丙氨酰、异亮氨酰和甘氨酰)；Ku；Scl；SSA；U1Sn核糖核蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku和SRP。硬皮病组可包括Scl70；着丝粒；U1核糖核蛋白和纤维蛋白。恶性贫血组可包括内部因子和胃H/K ATP酶的糖蛋白β亚基。系统性红斑狼疮(SLE)的抗原表位抗原可包括DNA；磷脂；核抗原；Ro；La；U1核糖核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；钙网蛋白；Grp78；Scl-70；组蛋白；Sm蛋白和染色质等。Grave疾病的抗原表位可包括Na+/-同向转运子；促甲状腺素受体；Tg和TPO。

表中显示一些神经变性疾病的例子并描述于下，疾病与动物中非生理存在的自身-蛋白质、多肽或肽相关。

阿尔茨海默氏病阿尔茨海默氏病(AD)是人群中最普遍的神经变性疾病(Cummings等，Neurology 51，S2-17；discussion S65-7，1998)。AD影响约10％大于65岁的人和几乎50％大于85岁的人。估计到2005年，约2200万人会受AD折磨。AD特征是缓慢发展的痴呆。如果mortern后发现三个一起的痴呆、神经原纤维混乱和老年斑，确定诊断为AD。老年斑总是在阿尔茨海默氏病患者脑中发现。老年斑的主要构成是淀粉样β蛋白(Aβ)(lwtsubo等，Neuron 13：45-53，1994)(Lippa等，Lancet 352：1117-1118，1998)，这是本发明自身-蛋白质、多肽或肽的另一个例子。Aβ是获得自淀粉样前体蛋白(APP)的42个氨基酸肽，APP是具多种生理作用的跨膜糖蛋白，包括细胞增殖、粘附、细胞信号和神经突生长(Sinha等，Ann NY Acad Sci 920：206-8，2000)。APP通常在Aβ结构域中切割以产生分泌片段。然而，另外的加工导致APP切割以产生能在老年斑中积聚的可溶Aβ。

目前AD治疗受限于功效且不针对Aβ积聚。可用药物是中枢胆碱脂酶抑制剂，用于增加脑中突触后乙酰胆碱浓度(Farlow和Evans，Neurology 51，S36-44；discussion S65-7，1998)；(Hake，Cleve Clin J Med 68，608-9：613-4，616，2001)。这些药物仅在一些认知参数中提供最小临床益处。用于人Aβ的转基因小鼠显示许多特征与人AD相同(Games等，Nature 375：523-527，1995)；(Hsiao等，Science274：99-102，1996)。在这些转基因小鼠中，用Aβ肽免疫证明在改进认知和降低组织病理中有效(Morgan等，Nature 408：982-985，2000)；(Schenk等，Nature400：173-177，1999)。研究也显示在阿尔茨海默氏病动物模型中用肽疫苗产生抗Aβ的抗体反应能反转异常组织病理以及这些模型中观察到的行为变化(Bard等，Nat Med 6：916-19，2000)；(Demattos等，Proc Natl Acad Sci USA 98：8850-8855，2001)。

帕金森氏症帕金森氏症是锥体外运动系统的神经变性疾病，具有很高的普及率，每100,000人中128-168个(Schrag等，Bmj 321：21-22，2000)主要临床特征是静止震颤、运动徐缓、僵化和姿势不稳定。痴呆也在大部分病例晚期发生。病理生理标志是失去脑锥体外系统中的神经元，特别是黑质中。帕金森氏症患者脑中许多神经元具有称为路易小体的胞内包涵体(Forno和Norville，ActaNeuropathol(Berl)34：183-197，1976)。发现路易小体的主要构成是称为α-突触核蛋白的蛋白质，它是本发明自身-蛋白质、多肽或肽的另一个例子(Dickson，CurrOpin Neurol 14：423-432，2001)。发现含α-突触核蛋白的路易小体积聚与疾病表型相关。

目前帕金森氏症治疗针对所得疾病症状的控制，但不是潜在原因(Jankovic，Neurology 55：S2-6，2000)。帕金森氏症的可用药物分类为多巴胺能剂(如卡比多巴/左旋多巴和司来吉兰)、多巴胺激动剂(如培高利特和罗匹尼罗)和茶酚-o-甲基-转移酶或COMT抑制剂(如恩他卡朋和托卡朋)。所有这些治疗针对提高受影响神经元中多巴胺存在量。总体上，这些药物在大部分病人中开始有效减少一些运动系统症状如震颤和僵化，但不有效缓解神经变性过程发展，此过程导致黑质神经元破坏。

亨廷顿症亨廷顿症是以常染色体显性方式遗传的遗传疾病并与称为亨廷顿(huntingtin)的基因所含CAG三核苷酸重复长度中异常扩增相连(Cell 72，971-983，1993)。主要临床特征由称为舞蹈病的异常无法控制移动和发展痴呆组成。病理生理上有纹状体和大脑皮层中的选择性神经元死亡和变性。这些区域中的神经元显示积聚突变蛋白亨廷顿蛋白的胞内集合，亨廷顿蛋白是本发明的另一个自身-蛋白质、多肽或肽，此积聚与疾病表型相关(DiFiglia等，Science 277：1990-1993，1997)；(Scherzinger等，Cell 90：549-558，1997)；(Davies等，Cell 90：537-548，1997)。

目前没有治疗用于亨廷顿症症状或发病原因。结果，这些病人缓慢发展，平均在症状首次出现后17年必然死亡。

朊病毒疾病朊病毒疾病也称为遗传性海绵状脑病，是影响动物和人的潜在传染病，特征是脑的海绵样变性(Prusiner，Proc Natl Acad Sci USA 95，13363-833，1998)。此疾病最普遍形式也称为克雅氏病。另一种疾病形式称为新变异克雅氏病，对公众健康有重要影响，因为认为它通过跨种传播发生，例如从牛到人。此疾病组的临床特征包括迅速发展的痴呆、肌阵挛、虚弱和共济失调。病理生理上，文献报导正常朊病毒蛋白的构象变化引起朊病毒聚集成β片层类型结构，导致中枢神经系统中所见的变性，朊病毒蛋白是本发明的一个自身-蛋白质、多肽或肽。目前没有治疗用于朊病毒疾病。临床进程迅速，通常在诊断2年内必然死亡，没有发明能改变此进程。

表中列出一些其它疾病的例子并描述于下，疾病与动物中非生理存在的自身-蛋白质、多肽或肽相关。

骨关节炎和变性关节疾病骨关节炎(0A)影响30％大于60岁的人，是最普遍的人关节疾病。骨关节炎代表滑膜关节变性和衰竭，包括关节软骨分解。

软骨主要包括蛋白聚糖和胶原，蛋白聚糖提供硬度和抵挡负荷的能力，胶原提供张力和绝对强度(sheer strength)抗性。软骨细胞更新和重塑正常软骨，通过产生和分泌潜在胶原酶、潜在溶基质素、潜在白明胶酶、组织纤溶酶原激活物和其它相关酶，各自或组合是本发明的自身-蛋白质、多肽或肽。一些抑制剂包括金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)，也由软骨细胞生成且限制中性金属蛋白酶、组织纤溶酶原激活物和其它酶的降解活性。这些降解酶和抑制剂单独或组合是本发明的自身-蛋白质、多肽或肽。这些降解酶和抑制剂调整重塑和维持正常软骨。在OA中，此过程失去调控导致软骨退化和降解。

在早期OA中，胶原纤维排列和大小有异常变化。金属蛋白酶、组织蛋白酶和纤溶酶单独或组合是本发明的自身-蛋白质、多肽或肽，引起显著软骨基质损失。软骨细胞开始增加蛋白聚糖和软骨生成导致关节软骨比正常厚。随后关节软骨由于降解酶作用而变薄和变软，酶包括胶原酶、溶基质素、白明胶酶、组织纤溶酶原激活物和其它相关酶，它们单独或组合是本发明的自身-蛋白质、多肽或肽。更软和更薄的软骨更易由于机械压力损坏。这些因素导致软骨表面分解和形成垂直裂缝(纤维性颤动)。软骨表面形成侵蚀且延伸到疾病末期的骨中。软骨细胞开始复制和形成簇，软骨在末期细胞减少。骨重塑和肥大是OA的显著特征。

目前OA治疗包括休息、理疗以增强支持关节的肌肉、支柱和其它稳定关节的支持装置、非甾族抗炎症剂、Tylenol和其它止痛剂。在末期骨上骨(bone-on-bone)OA中，对每日生活行动关键的关节如膝盖或臀，进行手术置换。

肥胖肥胖是美国和其它工业国家面临的主要健康问题。估计肥胖影响20％的美国人。肥胖是脂肪组织过多。当长期能量摄入超过长期消耗时，过多卡路里被保存为导致肥胖的脂肪组织。因此肥胖可来自摄入增加和/或消耗减少。摄入取决于饮食行为，这是由大脑皮层控制的复杂过程。下丘脑不同区域包括摄食中枢和饱中枢，发出信号到大脑皮层以促进摄食调节。血糖、胰岛素、甘油和其它水平可通过下丘脑的摄食和饱中枢检测以帮助调节摄食行为。

人能通过一些机制部分适应于过多卡路里射入。过多摄入碳水化合物和蛋白质可通过增加静止代谢速度部分补偿，所用机制增加三碘甲状腺氨酸的血浆水平和减少反向T3(rT3)水平。增加中枢和外周交感神经流出也提高儿茶酚胺-诱导的卡路里使用和热生成。饮食生热作用或身体对食物的热反应包括使热和代谢消耗在摄入食物后增加到静止代谢速度以上几小时，且以蛋白质为基础的食物大于以碳水化合物或脂肪为基础的食物。

摄食行为和脂肪生成受复杂机制控制。包括多配体聚糖-3的分子调节摄食和增加下丘脑中的摄食行为(Reizes等，Cell 106：105-116，2001)。影响食物摄入和代谢的其它分子和受体包括食欲肽、甘丙肽、促肾上腺皮质激素-释放因子、黑色素-浓缩激素、瘦蛋白、缩胆囊素、生长激素抑制素、抑肠肽(enterostating)、胰高血糖素-类似肽1和2以及蛙皮素，它们都单独或组合是本发明的自身-蛋白质、多肽或肽(Chiesi等，Trends Pharmacological Sciences，22：247-54，2001)。在肥胖的动物模型中，一些这种分子的拮抗物和激动剂证明对减肥有效(Chiesi等，Trends Pharmacological Sciences，22：247-54，2001)。围脂滴蛋白包被脂肪细胞的脂滴并调节三酰甘油水解，围脂滴蛋白干扰使小鼠抗饮食-诱导的肥胖而正常耐受葡萄糖(Tansey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6494-99)。

当肥胖次于二级代谢或其它疾病状态时，治疗二级原因。治疗初级肥胖通过饮食安排和摄食行为修饰以减少热量摄取以及锻炼安排以增加消耗。食欲缺乏剂(苯异丙胺(amphetimine)-类似试剂)、甲状腺激素药物和人慢性促性腺激素用于治疗肥胖。手术小肠旁路(jujunoileal分流)也用于治疗病态肥胖的严重病例。

脊髓损伤估计美国每年有约11,0000起脊髓损伤新病例，美国目前总普及率为183,000到230,000个总病例(Stover等，Arch Phys Med Rehabil 80，1365-71，1999)。脊髓损伤恢复很差且导致破坏性不可逆的神经无功能。目前治疗急性脊髓损伤由机械稳定损伤位置和施用肠胃外类固醇组成，机械稳定例如通过手术干预。这些干预对于减少脊髓损伤后永久性瘫痪发生率作用很小。治疗慢性脊髓损伤集中于维持生活质量如控制疼痛、痉挛状态和膀胱功能。目前没有可用治疗针对神经功能恢复。

造成脊髓损伤后恢复差的因素之一是髓鞘中存在轴突再生抑制剂。这些因子在损伤后不久释放且防止轴突跨伤口生长以重建功能连接。这些轴突再生抑制剂之一是称为Nogo-A的蛋白质，这是本发明的一个自身-蛋白质、多肽或肽(Huber和Schwab，Biol Chem 381，407-19.，2000；Reilly，J Neurol 247，239-40，2000；Chen等，Nature 403，439-9，2000)。Nogo-A显示在体外抑制神经突生长，抗Nogo-A的中和抗体显示反转此生长抑制性质。此外，抗Nogo-A的单克隆抗体显示在脊髓损伤动物模型中体内促进轴突再生(Raineteau等，Proc Natl Acad Sci USA98，6929-34，2001；Merkler等，J Neurosci 21，3665-73，2001；Blochlinger等，J Comp Neurol 433，426-36，2001；Brosamle等，J Neurosci 20，8061-8，2000)。Nogo-A是跨膜蛋白，主要在大脑皮层和脊髓的少突胶质细胞中表达。Nogo-A分子的两个区域被鉴定为对此分子的抑制能力有潜在作用，即胞外66个氨基酸环和名为AS472的胞质内C-末端区。

移植物抗宿主病人中组织和器官移植的一个最大限制是受体免疫系统对组织移植的排斥。很好确立了供体和受体间MHC I和II型(HLA-A、HLA-B和HLA-DR)等位基因匹配越高，移植存活越好。移植物抗宿主病(GVHD)在接受移植病人中引起显著病态和死亡率，移植含异源造血细胞。造血细胞存在于骨髓移植、干细胞移植和其它移植中。约50％接受来自HLA-匹配兄弟姐妹移植的病人会从中等发展到严重GVHD，发病率比非HLA-匹配移植高许多。三分之一从中等发展到严重GVHD的病人会因此死亡。供体移植中的T淋巴细胞和其它免疫细胞攻击受体细胞，受体细胞表达氨基酸序列中的多肽变化，特定是人染色体6上主要组织相容性复合体(MHC)基因复合体中编码蛋白的变化。在含异源造血细胞的移植中对GVHD有影响的大部分蛋白是高度多态(广泛的人之间氨基酸变化)I型蛋白(HLA-A、-B和-C)和II型蛋白(DRB1、DQB1和DPB1)(Appelbaum，Nature 411：385-389，2001)。即使当供体和受体间MHC I型等位基因在血清学上‘匹配’时，DNA测序显示30％病例中有等位基因水平的错配，甚至在匹配供体-受体对中提供I型-定向GVHD的基础(Appelbaum，Nature 411：385-389，2001)。次要组织相容性自身抗原GVHD常引起皮肤、肠、肝、肺和胰腺损伤。GVHD用糖皮质激素、环孢霉素、氨甲蝶呤、fludarabine和OKT3治疗。

组织移植排斥免疫排斥组织移植包括肺、心、肝、肾、胰腺和其它器官及组织，通过移植受体中针对移植器官的免疫应答调节。异源移植器官包含与移植受体相比氨基酸序列变化的蛋白质。因为移植器官氨基酸序列不同于移植受体，它们常在受体中引起抗移植器官的免疫应答。排斥移植器官是组织移植的主要并发症和限制，可导致受体中移植器官的衰竭。排斥引起的慢性炎症常导致移植器官功能紊乱。

目前治疗移植受体用多种免疫抑制剂以防止和抑制排斥。这些试剂包括糖皮质激素、环孢霉素A、Cellcept、FK-506和OKT3。

多核苷酸治疗-材料和方法

详细描述本发明前，要理解本发明不限于特定制剂或加工参数，因为它们可以变化。也要理解本文所用术语仅用于描述发明特定实施方案，不想要限制。

尽管一些与本文所述类似或相当的材料和方法可用于实践本发明，本文描述优选材料和方法。

“自身载体”指一个或多个载体，它们一起包括编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，可以是DNA或RNA。如本文所用，多核苷酸是一系列含DNA的脱氧核糖核酸或含RNA的核糖核酸以及它们的衍生物，编码本发明的自身-蛋白质、多肽或肽。自身-蛋白质、多肽或肽编码序列插入适当质粒自身表达盒。一旦编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸插入自身表达盒，载体称为“自身载体”。在待施用的多核苷酸编码超过一个自身-蛋白质、多肽或肽的情况中，单个自身载体可编码多种不同自身-蛋白质、多肽或肽。在一个实施方案中，编码一些自身-蛋白质、多肽或肽的DNA在单个自身质粒中连续编码，使用内部核糖体再进入位点(IRES)或其它方法以从单个DNA分子中表达多种蛋白质。编码自身-蛋白质、多肽或肽的DNA表达自身载体用分离质粒DNA的普通技术制备和分离，如商业购买自Qiagen公司的。无细菌内毒素的纯化DNA作为治疗剂传递给人。另外，各自身-蛋白质、多肽或肽在单独DNA表达载体上编码。

如本文所用，“自身-蛋白质、多肽或肽”指任何蛋白质、多肽或肽或其衍生物片段：在动物基因组中编码；在动物中生成或产生；可在动物生命中某些时候翻译后修饰；在动物中非生理存在。当术语“非生理”或“非生理地”用于描述本发明自身-蛋白质、多肽或肽时，指来自或衍生自动物中自身-蛋白质、多肽或肽的正常作用或过程。当自身-蛋白质、多肽或肽称为“与疾病相关”或“参与疾病”时，要理解是指自身-蛋白质、多肽或肽可修饰结构形式并因而不能行使其生理作用或过程；或可参与情况或疾病的病理生理学，通过诱导病理生理、调节或促进病理生理过程；和/或作为病理生理过程的靶。例如，在自身免疫疾病中，免疫系统异常攻击自身-蛋白质，引起细胞和组织损伤和功能紊乱，自身-蛋白质在这些细胞和组织中表达和/或存在。另外，自身-蛋白质、多肽或肽可自己以非生理水平表达和/或非生理发挥功能。例如，自身-蛋白质在神经变性疾病中异常表达，积聚在脑损伤中，从而引起神经功能紊乱。在其它情况中，自身-蛋白质加重不需要的情况或过程。例如在骨关节炎中，含胶原酶和基质金属蛋白酶的自身-蛋白质异常降解覆盖连接关节表面的软骨。自身-蛋白质、多肽或肽翻译后修饰的例子是糖基化、脂基加入、通过磷酸酶脱磷酸、二甲基精氨酸残基加入、通过肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)瓜氨酸化聚丝蛋白(fillaggrin)和血纤蛋白；αB晶体蛋白磷酸化；瓜氨酸化MBP；通过胱冬酶和粒酶蛋白裂解SLE自身抗原。免疫学上，自身-蛋白质、多肽或肽都被认为是宿主自身抗原且在正常生理条件下被宿主免疫系统忽略，这是通过去除、失活或缺乏活化免疫细胞，免疫细胞能经名为“免疫耐受”的过程识别自身抗原。抗原指任何能被免疫系统即B细胞或T细胞或两者都识别的分子。自身-蛋白质、多肽或肽不包括免疫蛋白质、多肽或肽，它们是免疫系统细胞生理、特异和专一表达的分子，用于调节免疫功能。免疫系统是防御机制，提供方法产生迅速、高特异和保护性反应抗动物世界存在的潜在致病微生物。免疫蛋白质、多肽或肽的例子包括T细胞受体、免疫球蛋白、含I类白介素的细胞因子、含干扰素和IL-10的II类细胞因子、TNF、淋巴毒素和化学因子如巨噬细胞炎症蛋白-1α和β、单核细胞-趋化蛋白和RANTES、其它直接参与免疫功能的分子如Fas-配基。有一些免疫蛋白质、多肽或肽包括在本发明自身-蛋白质、多肽或肽中，它们是：MHC I型膜糖蛋白、MHC II型糖蛋白和骨桥蛋白。自身-蛋白质、多肽或肽不包括受试者完全或几乎没有的蛋白质、多肽和肽，由于遗传或获得性缺陷引起代谢或功能紊乱，它们通过施用所述蛋白质、多肽或肽或施用编码所述蛋白质、多肽或肽的多核苷酸(基因治疗)取代。这种疾病的例子包括杜兴氏肌营养不良、贝克型肌营养不良、囊肿性纤维化、苯丙酮尿症、半乳糖血症、槭糖尿病和高胱氨酸尿。自身-蛋白质、多肽或肽不包括细胞特异和专一表达的蛋白质、多肽和肽，具有的特征使它们与它们正常对应物区别，包括：(1)克隆性(clonality)，代表具遗传变化的单个细胞增殖以形成恶性细胞克隆，(2)自主性，表示生长不受适当调节，(3)退行发育或缺乏正常协调的细胞分化。具有一个或多个上述三种标准的细胞称为赘生性、癌或恶性细胞。

如本文所用，“调节、调整或改变免疫应答”指任何对现有或潜在抗自身-蛋白质免疫应答的改变，包括但不限于核酸、脂类、磷脂、碳水化合物、自身-蛋白质、多肽、肽、蛋白质复合体、核糖核蛋白复合体或它们的衍生物，通过施用编码自身-蛋白质、多肽、肽、核酸或片段或其衍生物的多核苷酸而产生。这种调节包括任何对任意免疫细胞存在、能力或功能的改变，免疫细胞参与或能参与免疫应答。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、NK T细胞、专门的抗原呈递细胞、非专门抗原呈递细胞、炎症细胞、或任何其它能参与或影响免疫应答的细胞。调节包括改变现有免疫应答、发展免疫应答、潜在免疫应答、或者诱导、调控、影响或响应免疫应答的能力。调节包括免疫细胞中基因、蛋白质和/或其它分子表达和/或功能的任何改变，免疫细胞作为免疫应答的一部分。

调节免疫应答包括但不限于：去除、缺失或隔绝免疫细胞；诱导或产生能调节其它细胞功能的免疫细胞，其它细胞如自动反应淋巴细胞、APCs或炎症细胞；诱导免疫细胞中无应答状态，称为无反应力；增加、减少或改变免疫细胞活性或功能或这样做的能力，包括但不限于改变这些细胞表达蛋白质的模式。例子包括改变生成和/或分泌一些分子种类如细胞因子、化学因子、生长因子、转录因子、激酶、共同刺激分子或其它细胞表面受体；或任何这些调节事件的组合。

例如，编码自身-蛋白质、多肽、肽的多核苷酸可调节免疫应答，通过去除、隔绝或关闭免疫细胞，免疫细胞调节或能调节不需要的免疫应答；诱导、产生或打开免疫细胞，免疫细胞调节或能调节保护性免疫应答；改变免疫细胞物理和功能性质；或这些效果的组合。测量免疫应答调节的例子包括但不限于检测免疫细胞群的存在或缺乏(用流式细胞仪、免疫组化、组织学、电镜、聚合酶链式反应)；测量免疫细胞功能，包括对应于信号而增殖或分裂的能力或抗性(如使用T细胞增殖测定和以³H-胸苷纳入为基础的肽扫描分析，分析前用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、PMA、负荷肽或蛋白抗原的抗原呈递细胞刺激；B细胞增殖测定)；测量细胞因子、化学因子、细胞表面分子、抗体和其它细胞产物(用流式细胞仪、酶联免疫吸收测定、蛋白质印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或化或免疫细胞中信号途径的生化标记(蛋白质印迹和免疫沉淀分析酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割、蛋白质复合体形成或分离；蛋白质微阵列分析；用DNA阵列或扣除杂交的DNA转录分布)；测量通过细胞凋亡、坏死或其它机制的细胞死亡(膜联蛋白V染色、TUNEL测定、凝胶电泳以测量DNA梯、组织学；荧光胱冬酶测定、蛋白质印迹分析胱冬酶底物)；测量免疫细胞产生的基因、蛋白质和其它分子(RNA印迹分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白质微阵列、双相(2-dimentional)凝胶电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸收测定、流式细胞仪)；测量临床结果如自身免疫、神经变性和其它含非生理自身蛋白质的疾病的改进(临床分数、用于另外治疗的需求、功能状态、成像研究)。

如本文所用，“免疫调节序列(IMS)”所指化合物由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其调节自身免疫或炎症疾病的类似物。IMS可以是载体中结合的寡核苷酸或核苷酸序列。“寡核苷酸”指多种核苷酸。核苷酸包括与磷酸基团和可交换有机碱基相连的糖(优选核糖或脱氧核糖)，碱基可以是取代的嘌呤(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或肌苷(I))或取代的嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))。寡核苷酸指寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸，下文称为ODNs。ODNs包括寡核苷酸和其它含聚合体的有机碱基。寡核苷酸包括任何长度的多种核苷酸，来自两个或多个相连核苷酸的链，且包括含数百万相连核苷酸的染色体物质。

一方面，发明的免疫调节序列是合成的寡核苷酸，包括下列一级结构：

5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’

或

5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’

其中X和Y是任何天然产生或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。

IMS的核心六聚体5’和/或3’-侧翼可以是任意组成或数量的核苷酸或核苷。IMS范围优选在6和100个碱基对长度间，最优选16-50个碱基对长度。IMS也可作为部分较长DNA片段传递，范围从100到100,000个碱基对。IMS可纳入或已在DNA质粒、病毒载体和基因组DNA中产生。IMS范围也可最优选从6(五侧翼序列)到10,000个碱基对或更长尺寸。在六聚体核心侧翼存在的序列能构建成与任何已知免疫抑制序列(IIS)中存在的侧翼序列大致匹配。例如，侧翼序列TGACTGTG-Pu-Pu-X-Y-Pyr-Pyr-AGAGATGA，其中TGACTGTG和AGAGATGA是侧翼序列。另一种优选侧翼序列包括一系列嘧啶(C、T和U)，作为单独嘧啶重复2次或多次，或作为不同嘧啶的复合体，长度为2个或多个。不同侧翼序列用于测试抑制调节序列。更多抑制寡核苷酸的侧翼序列例子包含于下列参考文献：美国专利号6,225,292和6,339,068 Zeuner等，Arthritis and Rheumatism，46：2219-24，2002。

发明的特定IMS所包括寡核苷酸含下列六聚体序列：

5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含GG二核苷酸核心：GTGGTT、ATGGTT、GCGGTT、ACGGTT、GTGGCT、ATGGCT、GCGGCT、ACGGCT、GTGGTC、ATGGTC、GCGGTC、ACGGTC等。

5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含GC二核苷酸核心：GTGCTT、ATGCTT、GCGCTT、ACGCTT、GTGCCT、ATGCCT、GCGCCT、ACGCCT、GTGCTC、ATGCTC、GCGCTC、ACGCTC等。

腺嘌呤的鸟嘌呤和肌苷取代物和/或胞嘧啶或胸腺嘧啶的尿苷取代物和这些取代可在上述指南基础上产生。

上述免疫抑制序列或IIS显示抑制免疫刺激序列(ISS)活性，此ISS含美国专利号6,225,292的核心二核苷酸CpG。缺乏ISS时，本发明第一次显示此IIS防止和治疗自身免疫疾病，单独或结合DNA多核苷酸治疗。此IIS包含核心六聚体AAGGTT。该序列在本文称为免疫调节序列或IMS。本发明IMS所含具类似基序的其它相关IISs是：

5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含GG二核苷酸核心：GGGGTT、AGGGTT、GAGGTT、AAGGTT、GGGGCT、AGGGCT、GAGGCT、AAGGCT、GGGGTC、AGGGTC、GAGGTC、AAGGTC等。

5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含GC二核苷酸核心：GGGCTT、AGGCTT、GAGCTT、AAGCTT、GGGCCT、AGGCCT、GAGCCT、AAGCCT、GGGCTC、AGGCTC、GAGCTC、AAGCTC等。

腺嘌呤的鸟嘌呤和肌苷取代物和/或胞嘧啶或胸腺嘧啶的尿苷取代物可在上述指南基础上产生。

寡核苷酸可获得自现有核酸来源，包括基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA和cDNA，但优选通过寡核苷酸合成产生的合成寡核苷酸。IMS可以是部分单链或双链DNA、RNA和/或寡核苷酸。

IMS优选是寡核苷酸，包含未甲基化GpG寡核苷酸。另外的实施方案包括IMS，其中一个或多个腺嘌呤或胞嘧啶残基被甲基化。在真核细胞中，通常胞嘧啶和腺嘌呤残基可被甲基化。

IMS可以是稳定和/或未稳定的寡核苷酸。稳定寡核苷酸所指寡核苷酸相对抗体内核酸外切酶、内切酶和其它降解途径的降解。优选稳定寡核苷酸具有修饰的磷酸主链，最优选的寡核苷酸具有硫代磷酸(phophorothioate)修饰的磷酸主链，其中至少一个磷酸氧被硫取代。主链磷酸基团修饰包括甲基磷酸酯、硫代磷酸、磷酸酰胺(phophoroamidate)和二硫代磷酸核苷酸间键合，可提供IMS抗菌性质。IMS优选是稳定寡核苷酸，优选使用硫代磷酸稳定的寡核苷酸。

另外的稳定寡核苷酸包括：烷基磷酸三酯和磷酸二酯，其中带电的氧被烷基化；芳基磷酸酯和烷基磷酸酯，它们是非离子DNA类似物，其中带电的磷酸酯氧被芳基或烷基取代；或/和寡核苷酸，在任意或两个末端含六乙二醇或四乙二醇或另一种二醇。另外的空间构象可用于使糖部分附于IMS的核苷碱基。

IMS的核苷碱基在调节二核苷酸侧翼，可以是已知天然产生的碱基或合成的非天然碱基。寡核苷可结合到IMS-0N的内部区域和/或末端，使用常规技术作为其它化合物的附着点，即粘附或连接其它分子的方法，包括自身脂类、自身蛋白质、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身碳水化合物、自身糖蛋白和翻译后修饰的自身蛋白质、肽、多肽或糖蛋白，或者作为另外免疫调节治疗的附着点。IMS-ON的碱基、糖部分、磷酸基团和末端也可以本领域普通技术人员已知的任何方式修饰以构建具所需性质的IMS-ON，除了IMS-ON的调节活性。例如，糖部分能以任意空间构象附于IMS-ON的核苷酸碱基。

对寡核苷酸进行这些磷酸基团修饰的技术在本领域已知且不需要详细解释。回顾一个这种有用技术，制备靶寡核苷酸产物的中间磷酸三酯并用水合碘或其它试剂氧化成天然产生的磷酸三酯，其它试剂如无水胺。所得寡核苷酸氨基磷酸酯可用硫处理以产生硫代磷酸。相同的一般技术(除了硫处理步骤)可用于从甲基磷酸酯产生甲基磷酸酰胺。对于涉及磷酸基团修饰技术的更多细节，本领域普通技术人员可参考美国专利号4,425,732；4,458,066；5,218,103和5,453,496以及Tetrahedron Lett.21：414925(1995)，7：5575(1986)，25：1437(1984)和JorunalAm.ChemSoc.，93：6657(1987)，所揭示的纳入本文用于阐明本领域涉及IMS组成和制备的知识水平。

特定有用的磷酸基团修饰是转变成IMS-ON寡核苷酸的的硫代磷酸或二硫代磷酸形式。硫代磷酸和二硫代磷酸比它们未修饰的寡核苷酸对应物更抗体内降解，使发明的IMS-ON更能用于宿主。

IMS-ON可用本领域熟知的技术和核酸合成设备来合成。此方面的参考文献参加例如Ausubel等，《分子生物的当前操作》(Current Protocols in MolecularBiology)，第2和4章(Wiley Interscience，1989)；Maniatis等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Lab.，New York，1982)；美国专利号4,458,066和美国专利号4,650,675。这些参考文献纳入本文供参考，用于证明本领域涉及合成寡核苷酸生成的知识水平。

另外，获得IMS-ON可通过突变分离的微生物ISS-ODN，使竞争二核苷酸取代天然产生的CpG基序和侧翼核苷酸。取决于核酸杂交的筛选过程能从任何生物体分离任意多核苷酸序列，只要存在适当探针或抗体。寡核苷酸探针对应于编码讨论蛋白质的部分序列，可化学合成。这需要氨基酸序列的短、寡肽延伸必须已知。编码蛋白质的DNA序列也能从遗传密码中推出，然而必须考虑密码子简并性。

例如，可筛选认为含ISS-包含多核苷酸的cDNA文库，通过将多种获得自cDNA的mRNA注射到卵母细胞，可有足够时间表达cDNA基因产物，测试所需cDNA基因产物的存在，例如通过使用特异于感兴趣多核苷酸编码肽的抗体或使用重复基序和组织表达模式的探针，组织表达模式是感兴趣多核苷酸编码的肽的特征。另外，可用特异于肽的抗体间接筛选cDNA文库对感兴趣肽的表达，肽具有至少一种抗原表位。这种抗体可以是多克隆或单克隆获得并用于检测指示感兴趣cDNA存在的表达产物。

一旦获得含ISS的多核苷酸，它可缩短至所需长度，例如用常规技术进行酶消化。随后突变ISS-ODN寡核苷酸产物中的CpG基序以使“抑制”二核苷酸-用本发明方法鉴定-取代CpG基序。在具已知序列的DNA特定位点进行取代突变的技术熟知，例如经PCR的M13引物突变。由于IMS是非编码的，在取代突变中没有涉及维持可读框。然而为用于体内，多核苷酸起始物质ISS-ODN寡核苷酸中间物或IMS突变产物应充分纯化(即尽量没有天然产生的污染物和LPS，用本领域普通技术人员已知和选择的技术)。

发明的IMS可单独使用或者顺式或反式结合到重组自身载体(质粒、粘粒、病毒或逆转录病毒)，自身载体随之编码重组表达载体可传递的任何自身-蛋白质、多肽或肽。为了方便，IMS优选没有结合到表达载体施用。然而，如果需要结合到表达载体，这种结合可用本领域普通技术人员已知的常规技术完成。对于综述，普通技术人员可参考Ausubel《分子生物的当前操作》，同上。

简要地，构建重组表达载体使用标准连接技术。为分析以确认构建载体中的正确序列，连接混合物可用于转化宿主细胞且成功的转化子通过适当抗生素抗性选择。制备来自转化子的载体，通过限制性分析和/或测序，例如通过Messing等，(Nucleic Acids Res.，9：309，1981)、Maxam等，(《酶学方法》(Methods inEnzymology)，65：499，1980)的方法或本领域技术人员已知的任何适当方法。切割片段的大小分离用常规凝胶电泳进行，例如Maniatis等，(《分子克隆》，133-134页，1982)所述。

宿主细胞能用本发明表达载体转化并在常规营养培养基中培养，培养基适当修改用于诱导启动子、选择转化子或扩增基因。培养条件如温度、pH等在前面用于选择表达的宿主细胞，对于普通技术人员是显然的。

如果重组表达载体用作发明IMS-ON的载体，质粒和粘粒由于缺乏病原性而特定优选。然而，质粒和粘粒在体内比病毒降解更快，因此不传递合适剂量的IMS-ON以防止或治疗炎症或自身免疫疾病。

大部分用于构建载体、转染和感染细胞的技术在本领域广泛实践，大部分实践者熟悉描述特定条件和过程的标准资源材料。

“质粒”和“载体”指定为小写字母p，接着是字母和/或数字。起始质粒可商业获得、在不限制基础上公开获得或可根据发表的过程从可用质粒构建。此外，与所述相当的质粒在本领域已知且对于普通技术人员是显然的。“载体”或“质粒”指任何遗传元件，存在于宿主细胞时能通过包括适当控制和调节元件来复制。为了本发明目的，载体或质粒的例子包括但不限于质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒等。

构建发明的载体使用本领域熟知的标准连接和限制性技术(参见Ausubel等，(1987)《分子生物的当前操作》，Wiley-Interscience或Maniatis等，(1992)《分子克隆：实验室手册》(Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.)。分离的质粒、DNA序列或合成寡核苷酸被切割、适应并归入所需形式。所有含合成DNA的DNA构建序列通过DNA序列分析确定(Sanger等，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463-5467)。

“消化”DNA指用限制性酶催化切割DNA，限制性酶仅作用于DNA中的一些序列、限制性位点。本文所用多种限制性酶可商业购买，它们的反应条件、辅因子和其它需要对普通技术人员已知。为用于分析，通常在约20μl缓冲溶液中，1μg质粒或DNA片段使用2单位酶。另外，过量限制性酶用于确保DNA底物完全消化。在约37℃孵育约1小时或2小时可行，尽管可忍受变化。各孵育后，蛋白质用酚/氯仿抽提，接着乙醚提取，核酸通过乙醇沉淀从含水部分回收。如果需要，切割片段的大小分离可通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳用标准技术进行。大小分离的综合描述发现于《酶学方法》65：499-560(1980)。

限制性切割片段可以是钝端，通过在4种脱氧核糖核苷三磷酸存在时用大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow)处理，在50mM Tris(pH7.6)50mM NaCl、6mM MgCl₂、6mM DTT和5-10μM dNTPs中20℃孵育约15到25分钟的时间。Klenow片段填补5’粘端但后退去除突出的3’单链，尽管存在4种dNTPs。如果需要，在粘端性质决定的限制中进行选择性修补可通过仅提供一种dNTPs或选择的dNTPs。Klenow处理后，混合物用酚/氯仿抽提并乙醇沉淀。适当条件下用S1核酸酶或Bal-31处理导致任何单链部分水解。

连接在下列标准条件和温度下于15-50μl体积中进行：20mM Tris-Cl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、33mg/ml BSA、10mM-50mM NaCl，以及40μM ATP、0.01-0.02(Weiss)单位T4 DNA连接酶于0℃(用于“粘端”连接)或者1mM ATP、0.3-0.6(Weiss)单位T4 DNA连接酶于14℃(用于“钝端”连接)。分子间“粘端”连接通常在33-100μg/ml总DNA浓度进行。分子间钝端连接用摩尔过量的接头(linkersover)末端进行。

自身表达盒使用在宿主细胞中有功能的启动子。一般，含启动子和控制序列的载体与特定宿主细胞一起使用，序列获得自与宿主细胞相容的种类。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子。然而，其它有功能的细菌启动子适合。除了原核，真核微生物如酵母培养物也可使用。酿酒酵母或普通面包酵母是最常使用的真核微生物，尽管一些其它菌株可商业购买。控制哺乳动物宿主细胞中载体转录的启动子可获得自多种来源，例如病毒基因组如：多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和优选的细胞巨化病毒，或者来自异源哺乳动物启动子，如β-肌动蛋白。SV40病毒的早和晚期启动子可作为SV40限制性片段方便获得，片段也包含SV40病毒复制起点。人细胞巨化病毒的直接早期启动子可作为HindIII限制性片段方便获得。当然，来自宿主细胞或相关种类的启动子也用于本文。

本文所用载体可包含选择基因，选择基因也称为可选择标记。选择基因编码蛋白质的是转化载体的宿主细胞存活或生长所必需。用于哺乳动物细胞的适当可选择标记例子包括二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、鸟氨酸脱羧酶基因、多种药物抗性基因(mdr)、腺苷脱氨酶基因和谷氨酸合酶基因。当这种可选择标记成功转入哺乳动物宿主细胞时，转化的哺乳动物宿主细胞如果置于选择压力下能存活。有两种广泛使用的不同选择方案种类。第一种类以细胞代谢和使用突变细胞系为基础，突变细胞系缺乏不依赖添加培养基生长的能力。第二种类称为显性选择，指选择方案用于任何细胞类型且不需使用突变细胞系。这些方案通常使用药物以抑制宿主细胞生长。这些具新基因的细胞表达传递药物抗性的蛋白质且在选择时存活。这种显性选择的例子使用药物新霉素(Southern和Berg(1982)J.Molec.Appl.Genet.1，327)、霉酚酸(Mulligan和Berg(1980)Science 209，1422)或潮霉素(Sugden等，(1985)Mol.Cell.Bio.5，410-413)。上述三个例子使用真核控制下的细菌基因以分别传递对适当药物新霉素(G418或genticin)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。

“转染”指将DNA导入宿主细胞，从而表达DNA，无论功能性表达或其它；DNA也可作为染色体外元件或通过染色体整合复制。除非另外提供，本文所用转化宿主细胞的方法是Graham和van der Eb(1973)Virology 52，456-457的磷酸钙共沉淀方法。另外的转染方法是电穿孔、DEAE-葡聚糖方法、脂转染和生物射弹(Kriegler(1990)《基因转移和表达：实验室手册》(Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual)，Stockton Press)。

本发明的自身载体可制成多核苷酸盐用作药物。多核苷酸盐能用非毒性无机或有机碱基制备。无机碱基盐包括钠、钾、锌、钙、铝、镁等。有机非毒性碱基包括一级、二级和三级胺的盐等。这种DNA多核苷酸盐可制成冻干形式以在传递前复水，如无菌水或盐溶液。另外，自身DNA多核苷酸盐可在溶液、悬浮液或乳剂中制成，包括以水或油为基础的载体用于传递。在一个较佳实施方案中，DNA在具生理水平钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中冻干，随后在施用前用无菌水复水。另外，DNA在溶液中制成，溶液含1mM和2M间的高量Ca++。DNA也可在缺乏特定离子种类时制成。

如本领域普通技术人员已知，存在多种方法将多核苷酸传递给受试者，如本文所定义。“受试者”指任何动物，例如人、非人的灵长类动物、马、牛、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸可用阳离子聚合体制成，聚合体含阳离子脂质体。其它脂质体也代表有效制成和传递自身多核苷酸的方法。另外，自身DNA可结合到病毒载体、病毒颗粒或细菌用于药物传递。病毒载体可以是感染活性、减毒(突变降低诱导疾病的能力)或复制缺陷。用自身DNA防止致病自身蛋白质沉积、积聚或活性的方法可用病毒载体或其它传递系统提高，传递系统增强体液反应抗编码自身蛋白质。在其它实施方案中，DNA可结合固体支持物，包括金粒、以多糖为基础的支持物或其它颗粒或珠，能通过颗粒轰击(弹道传递)注射、吸入或传递。

传递核酸制品的方法在本领域已知。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859和5,589,466。发展一些以病毒为基础的系统用于转入哺乳动物细胞。例如，描述了逆转录病毒系统(美国专利号5,219,740；Miller等，Biotechniques7：980-990，1989；Miller A.D.，Human Gene Therapy 1：5-14，1990；Scarpa等，Virology 180：849-852，1991；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037.1993；Boris-Lawrie和Termin，Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109，1993)。也描述了一些腺病毒载体，参见例如(Hai-Ahmad等，J.Virol.57：267-274，1986；Bett等，J.Virol.67：5911-5921，1993；Mittereder等，Human Gene Therapy 5：717-729，1994；Seth等，J.Virol.68：933-940，1994；Barr等，Gene Therapy 1：51-58，1994；Berkner，K.L.，BioTechniques 6：616-629，1988；Rich等，Human GeneTherapy 4：461-476，1993)。也发展了腺-相关病毒(AAV)载体系统用于核酸传递。AAV载体可用本领域熟知技术构建。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际出版号WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.8：3988-3996，1988；Vincent等，Vaccines 90(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)1990；Carter，B.J.，Current Opinion in Biotechnology 3：533-539，1992；Muzyczka，N.，Current Topics in Microbiol.And Immunol.158：97-129，1992；Kotin，R.M.，Human Gene Therapy 5：793-801，1994；Shelling等，Gene Therapy1：165-169，1994；Zhou等，J.Exp.Med.179：1867-1875，1994)。

本发明的多核苷酸也可没有病毒载体传递。例如，传递给受试者前分子可包入脂质体。脂包装一般用脂质体完成，脂质体能稳定结合或截留和保持核酸。对于将脂质体用作传递核酸载体的综述，参见(Hug等，Biochim.Biophys.Acta 1097：1-17，1991；Straubinger等，《酶学方法》，101卷，512-527页，1983)。

疾病或紊乱的“处理”、“治疗”或“疗法”指减缓、停止或反转疾病发展，通过减少、停止或去除临床或诊断症状所证明，施用编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，单独或结合本文所述另外的化合物。“处理”、“治疗”或“疗法”也指急性或慢性疾病或紊乱的症状严重性减少或复发速度降低，例如在复发或减轻疾病过程的情况中。在较佳实施方案中，治疗疾病指反转、停止疾病发展，理想到去除疾病本身。如本文所用，改善疾病和治疗疾病相等。

如本发明所用，疾病或紊乱的“防止”、“预防”或“防范”指施用编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，单独或结合本文所述另外的化合物，以防止疾病或紊乱的产生或开始或防止疾病或紊乱的一些或所有症状或者减少疾病或紊乱开始的可能性。

自身载体包括编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，“治疗有效量”的自身载体根据本发明教授施用且足以治疗或防止疾病，如改善或去除症状和/或疾病原因。例如，治疗有效量处于广泛范围中并经临床试验确定，对于特定病人，在普通熟练的临床医生已知的因素基础上确定，包括疾病严重性、病人重量、年龄和其它因素。治疗有效量的自身载体在约0.001微克到约1克的范围中。治疗有效量的自身载体优选在约10微克到约5毫克的范围中。治疗有效量的自身载体最优选在约0.025mg到约5mg的范围中。多核苷酸治疗每月传递，传递6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可发展另外的治疗方案且范围可从每天到每周到每隔一月到每年到一次施用，取决于疾病严重性、病人年龄、施用的自身-蛋白质、多肽或肽和其它因素如普通治疗医师会考虑的因素。

在一个实施方案中，多核苷酸通过肌肉注射传递。在另一个实施方案中，多核苷酸鼻内、口头、皮下、皮内、静脉内、粘膜传递，经皮肤压，或附于金粒，金粒传递给或经皮肤(参见例如WO 97/46253)。另外，核酸可通过局部应用传递给皮肤细胞，有或没有脂质体或带电脂类(参见例如美国专利号6,087,341)。另一种选择是核酸作为吸入剂传递。多核苷酸在具生理水平钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中制成。另外，多核苷酸在溶液中制成，溶液含1mM和2M间的高量Ca++。多核苷酸可用其它离子制成，如锌、铝和其它。另外或此外，制成多核苷酸可用阳离子聚合体、阳离子脂质体-形成化合物或在非阳离子脂质体中。用于DNA传递的阳离子脂质体例子包括用1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(1，2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammionio)propane)(DOTAP)和其它这类分子产生的脂质体。

传递多核苷酸前，预处理传递位点用布比卡因(bupivicane)、心脏毒素或另一种能提高随后多核苷酸治疗传递的试剂处理。这种预处理安排一般在传递治疗多核苷酸前传递12到96小时，更常在传递治疗DNA前传递24到48小时。另外，DNA治疗前没有预处理治疗。

除了编码自身-蛋白质、多肽或肽的自身载体，调节免疫应答的佐剂由CpG寡核苷酸组成，可共施用佐剂以增强免疫应答。CpG寡核苷酸显示提高DNA疫苗的抗体反应(Krieg等，Nature 374：546-9，1995)。CpG寡核苷酸由纯化的寡核苷酸主链组成，主链抗体内降解如硫代磷酸主链。寡核苷酸中所含特定序列是嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶或嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶。所有这些构建施用的方式产生抗编码自身-蛋白质、多肽或肽的免疫应答。免疫应答通常是抗体反应，影响自身-蛋白质、多肽或肽相关的非生理作用或过程。

自身载体包括编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，能结合其它物质施用如药理剂、佐剂、细胞因子，或结合编码细胞因子的载体传递。此外，使用细胞因子共传递时为防止引起不需要的抗自身细胞因子反应的可能性，也可使用化学免疫调节剂如维生素D3的活性形式。在此方面，1，25-二羟基维生素D3显示经肌肉DNA免疫产生佐剂效果。

多核苷酸序列编码的蛋白质、多肽或肽已知刺激、修饰或调节宿主免疫应答，如细胞因子，多核苷酸序列能与自身载体共施用，自身载体包括编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸。因此，编码一种或多个不同细胞因子(或其功能片段)的基因可用于本发明，细胞因子如白介素、干扰素和集落刺激因子。一些这种物质的基因序列已知。例如，编码IL-4和IL-10的基因可与自身载体共施用，自身载体包括编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸。因此，在发明的一个实施方案中，自身载体包括编码自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，传递自身载体与共施用一个或多个下列免疫反应修饰物偶联：IL-4；IL-10；IL-13和IFN-γ。

选择用于本发明的核苷酸序列可获得自已知来源，例如用标准技术从含所需基因或核苷酸序列的细胞中分离核酸。类似的，核苷酸序列可用本领域熟知的多核苷酸合成标准模式合成产生。参见例如(Edge等，Nature 292：756，1981)；(Nambair等，Science 223：1299 1984)；(Jay等，J.Biol.Chem.259：6311 1984)。一般，合成寡核苷酸可用(Edge等，(同上)和(Duckworth等，Nucleic Acids Res.9：16911981)所述磷酸三酯方法或(Beaucage等，Tet.Letts.22：18591981)和(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103：31851981)所述亚磷酰胺方法制成。合成寡核苷酸也可用商业购买的自动寡核苷酸合成仪制成。因此核苷酸序列能用特定氨基酸序列的合适密码子设计。一般，选择在计划宿主中表达的优选密码子。完整序列从标准方法制备的重叠寡核苷酸中聚集并装配到完整编码序列中。参见例如Edge等(同上)；Nambair等(同上)和Jay等，(同上)。

另一种获得本文所用核酸序列的方法是重组方法。因此，所需核酸序列可用标准限制性酶和过程从携带核酸的质粒中切除。点特异DNA切割通过适当限制性酶和过程处理进行。点特异DNA切割通过适当限制性酶在本领域一般理解的条件下进行，细节由商业购买限制性酶的厂商详细说明。如果需要，切割片段的大小分离可用标准技术通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳进行。

另外一种分离特定核酸分子的方便方法是聚合酶链式反应(PCR)。(Mullis等，Methods Enzymol.155：335-350，1987)。

下列例子是完成本发明的特定实施方案。提供例子仅用于阐述目的，不想以任何方式限制本发明范围。

实施例1

多核苷酸治疗包括施用编码自身蛋白质PLP的DNA，用于防止多发性硬化的动物 模型

PLP自身载体构建编码PLP自身蛋白质抗原表位的多核苷酸通过退火2个有16聚体重叠互补序列(下划线)的寡核苷酸，用DNA聚合酶和dNTPs延伸：PLP(139-151)：

N5’-CTCGAGACCATGCATTGTTTGGGAAAATGGCTAGGACATCCCGACAAGTTTTCTAGATAGCTA-3’；PLP(139-151)L144/R147：

N5’CTCGAGACCATGCATTGTTTGGGAAAACTACTAGGACGCCCCGACAAGTTTTCTAGATAGCTA-3’

这些寡核苷酸双链设计成含XhoI和XbaI限制性位点。产物克隆到pTATGET载体(Promega，Madison，WI)的多克隆区域，pTATGET是CMV启动子驱动的哺乳动物表达载体。阳性克隆通过颜色筛选鉴定且正确方向的插入通过DNA自动测序确认。纯化质粒DNA用Wizard plus Maxipreps(Promega)根据厂商说明进行，在相同肌肉中注射0.05ml质粒DNA(PBS中1mg/ml)。

多核苷酸治疗操作实验动物的左四头肌(quadraceps)注射0.1ml PBS中的0.25％布比卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)。2和10天后，小鼠的相同肌肉中注射0.05ml质粒DNA(PBS中1mg/ml)。

EAE诱导PLP139-151肽溶于PBS至2mg/ml的浓度并用等体积不完全弗氏佐剂乳化，佐剂添加4mg/ml加热杀死的结核分枝杆菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，MI)。小鼠皮下注射0.1ml肽乳剂，同一天和48小时后，静脉内注射0.1mlPBS中的4μg/ml百日咳博德特氏菌毒素。实验动物大分如下：0＝没有临床疾病；1＝尾部虚弱或瘫痪；2＝后肢虚弱；3＝后肢瘫痪；4＝前肢虚弱或瘫痪；5＝垂死或死亡动物。

为确定注射编码PLP序列的DNA是否有效保护小鼠不受EAE诱导，PLP139-151自身载体每隔一周肌肉注射2次。最后一次注射后10天，小鼠用CFA中乳化的PLP139-151肽攻击。与对照质粒组相比，用PLP139-151自身载体治疗的动物中观察到急性临床疾病改善。疾病开始相较对照质粒组延迟(11.5±0.5天，p＜0.008)，平均峰值疾病严重性降低(p＜.005)，平均疾病分数减小(p＜0.0005)。此外，其它组注射a)含多核苷酸的自身载体，多核苷酸编码改变的肽配基PLP p139-151(W144＞L，H147＞R)，b)含多核苷酸的自身载体，多核苷酸编码PLP抗原表位p178-191。疾病的开始延迟(11.6±0.5天，p＜0.009)，具自身载体的平均峰值疾病分数降低(p＜.02)，自身载体编码改变的自身肽配基(W144，H147)。同样，疾病的开始延迟(11.5±0.4天，p＜0.003)，平均峰值疾病严重性降低(p＜.007)，具自身载体的平均疾病分数减小(p＜0.0001)。自身载体包括编码PLP自身肽p178-191的多核苷酸。

小鼠注射DNA并进一步用致脑炎肽PLP139-151攻击，在分辨临床疾病急性阶段后杀死。排出的LNC体外用PLP139-151自身肽再刺激且测试它们的增殖反应和细胞因子生成。图1A显示来自注射DNA小鼠的LNC与来自对照动物的LNC相比增殖反应低(p＜0.01)，DNA编码PLP139-151自身肽。图1(B)显示当用PLP139-151刺激时，来自自身载体处理小鼠的LNC分泌的IL-2和γ-干扰素水平低于对照组，自身载体含编码PLP139-151自身肽的DNA。核糖核酸酶保护测定分离自脑组织的mRNA用于评估发炎脑中细胞因子mRNA转录本水平。图1(C)显示自身载体处理的小鼠中γ-干扰素和IL-5的mRNA水平降低，自身载体含编码PLP139-151自身肽的DNA。因此，临床疾病低发生率、细胞反应减少与IL-2、IL-5和γ-干扰素水平低之间的关系在PLP139-151DNA处理小鼠中明显。图1(C)所示细胞因子mRNA带的相对表达水平通过光密度测定测量。为纠正上样差异，值根据各样品中管家基因GADPH的表达水平标准化。小鼠用含编码PLP139-151自身肽的DNA的自身载体处理，光密度测定分析确定此处理小鼠脑中测试细胞因子的表达水平小于pTargeT和含编码PLP139-151(L/R)自身肽的DNA的自身载体。

实施例2

多核苷酸治疗包括施用编码多种自身蛋白质的DNA，用于治疗多发性硬化的动物 模型

实施例1所述相同的方法用于证明含编码四种主要髓鞘自身蛋白MBP、MOG、MAG和PLP的DNA的载体甚至比编码单个自身肽的DNA更有效治疗确立的、发生中、复发EAE，EAE是用于人MS的最典型动物模型(表5和6)。

表5

含编码多种自身蛋白质的DNA的自身载体每周一次肌肉施用给小鼠，剂量为50μg各编码MBP、MOG、MAG和PLP的四种载体。从EAE起始急性发作恢复后开始治疗(如从疾病诱导后第一次临床瘫痪事件恢复之后)。恶化速度表示第87天发生的临床瘫痪数量。p值用斯氏两端t检验计算。

实施例3

多核苷酸治疗包括施用编码自身肽或自身蛋白质的DNA加编码细胞因子的DNA， 用于治疗多发性硬化的动物模型

遵循实施例1所述方法，修改是自身载体编码PLP自身肽或多种髓鞘蛋白。编码细胞因子IL-4的DNA表达构建同时施用。DNA治疗通过施用编码髓鞘自身肽或髓鞘自身蛋白的自身载体，结合编码细胞因子IL-4的DNA，进一步提高保护效果(表6)。

表6

DNA治疗每周一次肌肉施用给小鼠，剂量为25μg各编码MBP、MOG、MAG和PLP的四种DNA质粒。所有其它DNA以50μg质粒每只动物的剂量每周一次给予。从EAE起始急性发作恢复后开始治疗(如从疾病诱导后第一次临床瘫痪事件恢复之后)。临床复发计算到第81天。p值用斯氏两端t检验计算。

实施例4

多核苷酸治疗包括施用编码自身-蛋白质、多肽和肽的DNA，用于治疗人多发性 硬化

治疗人多发性硬化的多核苷酸治疗如下进行。构建的自身载体包括细胞巨化病毒或另一种有效转录启动子；获得自SV40大T抗原的多腺苷酸信号、牛生长激素或另一种普通技术人员已知的有效多腺苷酸信号；卡那霉素或其它FDA-可接受抗性基因，能使质粒有效生长。

编码一种或多个人髓鞘自身蛋白的DNA序列克隆到DNA自身载体。编码这些髓鞘自身蛋白的DNA克隆到自身载体，髓鞘自身蛋白在MS病人中被自身免疫反应靶向，包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂蛋白(PLP)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)。使用本发明的教授选择特定自身抗原包含到多核苷酸治疗是以多种因素为基础，包括因素如受试者中致病自身抗体的存在。在一个实施方案中，各髓鞘自身蛋白在单独或不同自身质粒中编码。在另一个实施方案中，编码一些髓鞘自身蛋白的DNA在单个自身质粒中连续编码，使用内部核糖体再进入序列(IRESs)或其它方法以从单个质粒DNA中表达多种蛋白质。编码髓鞘蛋白的DNA表达自身质粒用分离质粒DNA的普通技术制备和分离，如商业购买自Qiagen Corporation的。无细菌内毒素的纯化DNA作为治疗剂传递给人。在一个实施方案中，施用仅编码MBP的自身载体DNA以治疗多发性硬化患者。在另一个实施方案中，施用编码两种或多种髓鞘自身蛋白质、多肽或肽的多种自身质粒。治疗有效量的自身载体根据本发明教授施用，自身载体包括编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸。例如，治疗有效量的自身载体在约0.001微克到约1克的范围中。自身载体的优选治疗量在约10微克到约5毫克的范围中。自身载体的最优选治疗量在约0.025mg到约5mg的范围中。多核苷酸治疗每月传递，传递6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可发展另外的治疗方案且范围可从每天到每周到每隔一月到每年到一次施用，取决于疾病严重性、病人年龄、施用的自身-蛋白质、多肽或肽和其它因素如普通治疗医师会考虑的因素。

在一个实施方案中，DNA通过肌肉注射传递。在另一个实施方案中，DNA作为吸入剂鼻内、口头、皮下、经皮肤、静脉内传递，经皮肤压，或附于颗粒或珠，颗粒或珠传递给或经皮肤。这种颗粒或珠可以是金、其它金属、聚苯乙烯或其它颗粒。在一个实施方案中，DNA在具生理水平钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中制成。另外，DNA在溶液中制成，溶液含1mM和2M间的高量Ca++。在另一个实施方案中，DNA用其它阳离子制成，如锌、铝和其它。制成DNA也可用阳离子聚合体、阳离子脂质体或在其它阳离子脂质体中。DNA也可传递编码于病毒载体、病毒颗粒或细菌。

人MS病人用所示DNA疗法治疗，在临床复发数量基础上监控疾病活性，MRI监控新的钆-增强损伤数量和增强损伤的体积。

实施例5

多核苷酸治疗包括施用编码胰岛素β链自身肽的DNA，用于防止胰岛素依赖型糖 尿病

NOD小鼠同时发展自身免疫糖尿病，与人IDDM共享许多临床、免疫和组织病理学特征。自身载体包括的DNA编码胰岛素B链氨基酸9-23的自身肽、胰岛素的免疫显性抗原表位，自身载体施用给NOD小鼠。对照是含DNA的载体，DNA编码胰岛素A链的对应肽。编码自身肽的重叠寡核苷酸引物插入自身表达盒pcDNA。用编码自身肽胰岛素B(9-23)(insB-pcDNA)的自身载体处理保护动物不发展糖尿病。疾病发作以显著降低的速度发生，完全发展疾病的动物少很多。InsB-pcDNA引起胰腺中胰岛素B-特异细胞的细胞因子表达转变：IL-10和IFN-γ表达在胰岛素B(9-23)肽培养的胰腺淋巴结细胞中下调。胰岛素A(+)链的核苷酸序列是

5’CCGGAATTCGCCATGTGCACGTCAATCTGTTCACTGTACCAGCTAGAGAACTACTGCAACTAGTCTAQGAGC-3’；

胰岛素B(+)链的核苷酸序列是

5’-CCGGAATTCGCCATGAGCCACCTAGTAGAAGCACTATACCTCGTATGCGGCGAACGAGGTTAGTCTAGAGC-3’

这些多核苷酸设计成含EcoRI和XbaI限制性位点用于克隆。产物克隆到pcDNA3.1+自身表达盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)的多克隆区域。纯化自身质粒DNA用Qiagen Endo-free Mega-prep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA.)完成。

3到4周大雌性NOD小鼠购买自Taconic Farms(Germantown，NY)。实验动物在3到4周大时注射，四头肌注射0.1ml PBS(每块四头肌0.05ml)中的0.25％布比卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)。2天后，小鼠注射0.05ml质粒DNA，每块四头肌10mg/ml。质粒DNA以10天间隔再注射2次。每周用Chemstrip(BoehringerMannheim Co.，Indianapolis，IN)测试小鼠的糖尿，糖尿病用单触II仪表(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通过血浆葡萄糖测量确定。重复血浆葡萄糖水平高于250mg/dl的动物被认为患糖尿病。胰腺从实验和对照动物中取出，在10％甲醛中固定，石蜡包埋。切下分开50μm的三个水平薄切片，用于苏木精和曙红染色。渗透的严重性通过光学显微镜评估。来自各组的3和5只动物分别对于2个单独实验分析。每个胰腺检测至少25个岛。

多核苷酸治疗包括施用编码自身肽胰岛素B(9-23)的自身载体，治疗在NOD小鼠模型中进行。10只4周大的NOD小鼠组用50μl 0.25％布比卡因注射四头肌肌肉，48小时后注射100μg自身质粒DNA。自身质粒DNA以10天间隔再注射2次(每块四头肌50μg)。每周监控小鼠的糖尿病，监控＞30周，通过糖尿和高血糖症确定。结果代表2个单独实验。在未处理和质粒对照(pcDNA)注射组中，70％的小鼠到34周大时发展糖尿病(图2)。然而在insB-pcDNA注射组中，仅20％到相同年龄时发展糖尿病(p＝0.02，X²分析)。此外，疾病发作在此组中也显著延迟，从未处理组中第一只变成糖尿病动物的＜14周到insB-pcDNA注射组的＞23周。pcDNA和未处理对照组的糖尿病发病速度是insB-pcDNA组速度的3倍(pcDNA和未处理组分别为0.035和0.036，与之相比，insB-pcDNA组为0.012)。

在自身肽(insB-pcDNA)处理NOD小鼠的情况中，即使动物没有显示糖尿病临床症状，观察到胰岛炎。胰腺从7周大的免疫和对照动物中取出，7周时岛的起始渗透可通过组织染色NOD胰腺清楚看见。各组中5只动物最少25个岛被打分用于胰岛炎。染色来自较大(16周大)小鼠的胰腺产生类似结果。尽管动物注射含编码自身肽的DNA的自身载体，没有显示糖尿病的临床症状，渗透的可见水平能与生病的对照动物相比。因此，胰岛素DNA处理不影响淋巴细胞运输到胰岛。

用胰岛素B(9-23)DNA的多核苷酸治疗在胰腺淋巴结中诱导抗原-特异反应。为检测体外抗原-特异反应，我们使用定量PCR评估细胞因子mRNA生成水平(图3)。在3个单独实验中，动物组用insB-pcDNA自身载体或pcDNA对照质粒注射2次。第2次注射后5天，收集胰腺淋巴结且单细胞悬浮液用10μg/mL胰岛素B(9-23)肽平板培养。72小时后沉淀细胞，定量PCR分析IL-4、TGF-β、IL-10和IFN-γ信使水平。定量PCR比较胰腺淋巴结细胞中细胞因子信使水平，显示insB-pcDNA处理动物中IFN-γ和IL-10水平显著低于pcDNA-处理的对照。对应于胰岛素B肽刺激，来自insB-pcDNA-处理淋巴结的IFN-γ水平是pcDNA-处理淋巴结的38％(p＜0.05)。此外，insB-pcDNA处理小鼠中IL-10水平是pcDNA对照水平的30％(p＜0.01)。IL-4和TGF-β的mRNA水平变化在这3个实验中不显著。

实施例6

多核苷酸治疗包括施用编码自身多肽胰岛素和自身蛋白谷氨酸脱羧酶及酪氨酸 磷酸酶IA-2的DNA，用于治疗胰岛素依赖型糖尿病

NOD小鼠用多核苷酸治疗处理，包括编码全胰岛素原多肽的DNA以及编码谷氨酸脱羧酶(GAD)65kDa和岛酪氨酸磷酸酶IA-2的DNA。编码胰岛素原、GAD-65和IA-2的cDNAs被分离并克隆到自身表达盒pTARGET载体。DNA用Qiagen Endo-freeMega-prep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA.)纯化。NOD小鼠3到4周大时注射，四头肌注射0.1ml PBS(每块四头肌0.05ml)中的0.25％布比卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)。2天后，小鼠各四头肌中注射0.05ml各自身质粒DNA，质粒DNA以1.0mg/ml在具0.9mM钙的磷酸缓冲盐水中。质粒DNA以10天间隔再注射2次。每周用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)测试小鼠的糖尿，糖尿病用单触II仪表(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通过血浆葡萄糖测量确定。重复血浆葡萄糖水平高于250mg/dl的动物被认为患糖尿病。

实施例7

多核苷酸治疗包括施用编码自身多肽胰岛素和/或自身蛋白谷氨酸脱羧酶及酪 氨酸磷酸酶IA-2的DNA，用于治疗和反转确立胰岛素依赖型糖尿病中的明显高血糖 症

在糖尿基础上鉴定NOD小鼠具有明显临床糖尿病，用Chemstrip(BoehringerMannheim Co.，Indianapolis，IN)分析尿检测，用单触II仪表(Johnson & Johnson，Milpitas，Ca)通过血浆葡萄糖测量确定。具明显临床糖尿病的NOD小鼠用多核苷酸治疗处理，包括编码上面例子所述自身肽胰岛素B(9-23)(insB-pcDNA)的DNA。胰岛素B(+)链序列是5’-CCGGAATTCGCCATGAGCCACCTAGTAGAAGCACTATACCTCGTATGCGGCGAACGAGGTTAGTCTAGAGC-3’，此多核苷酸设计成含EcoRI和XbaI限制性位点用于克隆。产物克隆到pcDNA3.1+自身表达盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)的多克隆区域。纯化自身质粒DNA用Qiagen Endo-free Mega-prep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA.)完成。在糖尿和血清葡萄糖提高基础上具明显临床糖尿病的小鼠用编码自身肽胰岛素B(9-23)(insB-pcDNA)的DNA处理，反转高血糖症和糖尿，从而反转确立的糖尿病。用编码自身肽胰岛素的DNA结合谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶处理动物显著增加DNA治疗功效，用于治疗和反转确立的自身免疫糖尿病。

实施例8

多核苷酸治疗包括施用编码自身蛋白质的DNA，用于治疗人胰岛素依赖型糖尿病

修饰实施例5中构建的自身质粒DNA以施用给人且包括编码人岛细胞自身蛋白的DNA，自身蛋白包含酪氨酸磷酸酶IA-2；65kDa和67kDa形式的谷氨酸脱羧酶(GAD)；胰岛素原；岛细胞抗原69kDa(ICA69)。如上所述，DNA用PCR分离并克隆到自身表达盒。自身载体包括编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，治疗有效量的自身载体根据本发明教授施用。例如，治疗有效量的自身载体在约0.001微克到约1克的范围中。治疗有效量的自身载体优选在约10微克到约5毫克的范围中。治疗有效量的自身载体最优选在约0.025mg到约5mg的范围中。多核苷酸治疗每月传递，传递6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可发展另外的治疗方案且范围可从每天到每周到每隔一月到每年到一次施用，取决于疾病严重性、病人年龄、施用的自身-蛋白质、多肽或肽和其它因素如普通治疗医师会考虑的因素。在一个实施方案中，DNA通过肌肉注射传递。另外，DNA自身载体作为吸入剂鼻内、口头、皮下、经皮肤、静脉内传递，经皮肤压，在治疗IDDM的情况中附于金粒，金粒通过基因枪或经皮肤传递。DNA在具生理水平钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中制成。另外，DNA在溶液中制成，溶液含1mM和2M间的高量Ca++。DNA用其它阳离子制成，如锌、铝和其它。

人糖尿病患者用所示DNA疗法治疗，监控疾病活性的基础是对外源胰岛素需求减少、血清自身抗体分布改变、糖尿减少和糖尿病并发症减少如白内障、血管不足、关节病和神经病。

实施例9

多核苷酸治疗包括施用编码自身蛋白质II型胶原的DNA，用于防止自身免疫滑 膜炎和风湿性关节炎

RA来自侵入促进自身耐受机制的致病T细胞。小鼠中胶原诱导的关节炎(CIA)是T细胞调节的自身免疫模型，与RA共享许多特征，包括与RA组织学相似的滑膜炎和骨侵蚀。CIA复发模型具有临床复发和炎症侵蚀性滑膜炎的减轻，方式与人RA患者中观察到的相似(Malfait等，Proc Natl Acad Sci USA，97：9561-6，2000)。诱导CIA通过用II型胶原(CII)注射遗传感性品系小鼠，CII在完全弗氏佐剂中。

编码鼠II型胶原的cDNA用聚合酶链式反应分离。另外的滑膜自身蛋白如IV和IX型胶原、热激蛋白65，可包含在多核苷酸治疗中。获得编码所述肽的DNA是用寡核苷酸引物通过PCR从鼠CII cDNA中扩增相关DNA片段。框内起始翻译位点的甲硫氨酸以及XhoI和XbaI限制性内切酶位点纳入寡核苷酸引物。PCR产生的DNA片段克隆到pTATGET载体(Promega，Madison，WI)自身表达盒的XhoI和XbaI限制性内切酶位点，pTATGET是CMV启动子驱动的哺乳动物表达载体。测序分离的克隆以确定产生了所需DNA序列。

6-9周大的雄性DBA/1LacJ(H-2^q)小鼠在实验开始使用。100μg各纯化自身载体每隔一周肌肉注射到胫腓骨前部肌肉，注射3次，自身载体包括编码滑膜关节自身蛋白的DNA，这在诱导疾病用于防止CIA的实验之前，或在复发CIA实验治疗中临床CIA发作之后。DNA治疗后，小鼠用100μg完全弗氏佐剂(CFA)中的纯化牛CII蛋白在尾底部皮内攻击以诱导急性CIA。在视觉打分系统(Coligan等，JohnWiley and Sons，Inc 15.5.1-15.5.24，1994)基础上每天跟踪小鼠的临床CIA表现，跟踪12周：0，没有红斑和膨胀表现；1，红斑和限于足中部(跗骨)或踝关节的适度膨胀；2，红斑和适度膨胀，膨胀从踝延伸到足中部；3，红斑和中等膨胀，膨胀从踝延伸到跖骨关节；4，红斑和严重膨胀，膨胀涵盖踝、足和指。各动物的临床分数是其四只爪视觉分数的总和。对来自发展临床关节炎的小鼠的关节进行组织分析。具最高视觉分数的肢的第一个爪脱钙、切片、用苏木精和曙红染色，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad Sci USA 91：2762-2766，1994)。检测染色切片的淋巴渗透、滑膜增生和侵蚀，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad SciUSA 91：2762-2766，1994)。

实施例10

多核苷酸治疗包括施用编码自身蛋白质II型胶原的DNA，用于治疗确定的自身 免疫滑膜炎

确定正患CIA的动物用自身载体DNA处理以反转确定发展中的CIA，DNA编码CII、BiP和/或GP-39。在视觉打分系统(Coligan等，John Wiley and Sons，Inc15.5.1-15.5.24，1994)基础上每天跟踪小鼠的临床CIA表现，跟踪12周。用自身DNA处理可在视觉打分系统基础上降低关节炎严重性，DNA编码CII、BiP、GP-39和/或滑膜关节中存在的另外蛋白质。

实施例11

多核苷酸治疗包括施用编码自身滑膜蛋白的DNA，用于防止或治疗人风湿性关节 炎和其它自身免疫疾病靶向关节

修饰前2个例子中构建的自身载体DNA以施用给人且包括编码人自身蛋白质的DNA，如滑膜关节中表达的蛋白质，包括II型胶原、BiP、gp39、IV型胶原、葡萄糖-6-磷酸异构酶和/或血纤蛋白。如上所述，DNA用PCR分离并克隆到自身表达盒。100μg质粒DNA在具钙的磷酸缓冲盐水中每月肌肉内施用。也可能施用的DNA以不同剂量方案、在不同缓冲液中制成或经不同施用途径，如上面实施例1所讨论。

CIA新发作或发展中的人在美国风湿病学标准学会基础上诊断(4/7标准须用于诊断：(i)对称多发性关节炎，(ii)涉及MCPs、PIPs或手腕，(iii)涉及超过3个不同关节区域，(iv)手或足X射线的关节侵蚀，(v)阳性类风湿因子测试，(iv)早晨僵硬大于1小时和(vii)伸肌表面的节结)，用自身多核苷酸治疗，多核苷酸编码II型胶原、BiP、gp39、IV型胶原、葡萄糖-6-磷酸异构酶和/或血纤蛋白。监控RA的DNA治疗功效，以柔软和肿胀关节数减少超过20％的病人部分为基础(美国风湿病学标准学会20％反应(ACR20)、50％(ACR50)和70％(ACR70)。另外测量人RA包括类固醇使用中的炎症标记(含ESR和CRP)减少、放射线发展减少(包括侵蚀和关节空间变窄)和无劳动能力分数(如健康评估问卷-HAQ)改进。也监控自身抗体效价和分布的变化。相同方法用于相关关节炎，如牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、Reiter综合征、强直性脊柱炎和多肌痛风湿病。

近来的研究表明一些具风湿性关节炎高特异性的自身抗体(如Bip、抗瓜氨酸抗体、抗聚丝蛋白抗体)可先于临床诊断几个月，或甚至几年。这提出了一种可能性，能在疾病发作前鉴定病人并用预防性多核苷酸治疗有效处理。筛选健康、无症状病人中诊断自身抗体的存在，包括但不限于上述血清学测试之一。阳性测试的病人用上述和其它例子中的多核苷酸治疗处理，尝试防止疾病发作和严重性。随后的诊断和反应用上面标准监控。

实施例12

多核苷酸治疗包括施用编码眼色素层自身蛋白的DNA，用于防止自身免疫性色 素层炎

实验性自身免疫性色素层炎(EAU)是T细胞调节的自身免疫疾病，影响小鼠的眼色素层和视网膜，与人自身免疫性色素层炎共享许多临床、免疫和组织病理学特征。编码S抗原和光感受器间类维生素A结合蛋白(IRBP)的DNA用PCR分离并克隆到pTATGET载体自身表达盒，如上所述，100μg各纯化自身质粒每隔一周注射到B10.IIIR小鼠的胫腓骨前部肌肉，注射3次，然后诱导EAU。在注射位置施用布比卡因(bupivicane)、心脏毒素或另一种预处理剂或没有这种试剂，接着开始DNA治疗。DNA治疗后，B10.RIII小鼠用免疫显性IRBP 161-80肽攻击用于EAU，肽在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化。在fundoscopic检测基础上用标准打分系统(Coligan等)跟踪小鼠临床EAU表现8周：0，没有疾病；0.5(痕量)，1-2很少外周集中损伤，血管炎/玻璃体炎最小；1，轻微血管炎，＜5集中损伤，＜1线性损伤；2，多个(＞5)脉络视网膜损伤和/或渗透，严重血管炎，＜5线性损伤；3，线性损伤、大汇合损伤、亚视网膜新血管化的模式；4，大视网膜脱离，视网膜萎缩。小鼠组定期杀死，对各眼进行组织分析和打分。

实施例13

多核苷酸治疗包括施用编码眼色素层自身蛋白的DNA，用于治疗确立的自身免 疫性色素层炎

如上所述，编码S抗原和光感受器间类维生素A结合蛋白(IRBP)的DNA用PCR分离并克隆到pTATGET载体自身表达盒。用免疫显性IRBP 161-80肽诱导B10.RIII小鼠发展EAU，肽在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化。确定正患EAU的动物可通过定期施用100μg各纯化自身质粒来有效治疗。发展临床EAU后，自身多核苷酸可每周或以另外间隔施用到B10.IIIR小鼠的胫腓骨前部肌肉。功效在12周临床监控段的基础上证明，用标准打分系统(Coligan等)监控fundoscopic检测基础上的EAU疾病活性。

实施例14

多核苷酸治疗包括施用编码眼色素层自身蛋白的DNA，用于治疗人自身免疫性 色素层炎

如实施例1所述，人S抗原、光感受器间类维生素A结合蛋白(IRBP)、视紫质和恢复蛋白用PCR分离并克隆到DNA自身表达盒。修饰实施例7构建的自身载体可以包括编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，自身-蛋白质、多肽或肽选自人S抗原、光感受器间类维生素A结合蛋白、视紫质和恢复蛋白。治疗有效量的自身载体根据本发明教授施用，自身载体包括编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸。例如，治疗有效量的自身载体在约0.001微克到约1克的范围中。治疗有效量的自身载体优选在约10微克到约5毫克的范围中。治疗有效量的自身载体最优选在约0.025mg到约5mg的范围中。DNA治疗每月传递，传递6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可发展另外的治疗方案且范围可从每天到每周到每隔一月到每年到一次施用，取决于疾病严重性、病人年龄、施用的自身-蛋白质、多肽或肽和其它因素如普通治疗医师会考虑的因素。

在一个较佳实施方案中，DNA通过肌肉注射传递。另外，DNA自身载体作为吸入剂鼻内、口头、皮下、经皮肤、静脉内传递，经皮肤压，在治疗自身免疫性色素层炎的情况中附于金粒传递到或通过皮肤。在另一个实施方案中，DNA在具生理水平钙(0.9mM)的磷酸缓冲盐水中制成。另外，DNA可在溶液中制成，溶液含1mM和2M间的高量Ca++。DNA能用其它阳离子制成，如锌、铝和其它。

实施例15

多核苷酸治疗包括施用编码线粒体酶自身蛋白质的DNA，用于防止原发性胆硬化

原发性胆硬化(PBC)的鼠模型是实验性自身免疫胆管炎(EAC)并用哺乳动物丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)或合成PDC肽在雌性SJL/J小鼠中i.p.致敏(Jones，JClin Pathol 53：813-21，2000)。抗线粒体抗体在许多品系中观察到，但NSDC在单个小鼠品系(SJL/J)中观察到，表明诱导IBEC损坏需要另外的反应因子。小鼠用纯化的牛PDC(500μg在100μl盐水中，与不完全弗氏佐剂(IFA)1∶1(v/v)混合，浓度为10mg/mL)i.p.致敏。所有致敏在8-12周大时进行。尾部静脉放血在抗原攻击前和致敏后4、8、12、16、20及30周进行。肝功能测试包括胆红素、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)，在相同时间间隔进行。致敏后30周杀死动物(各组10只)。肝组织学用苏木素&曙红染色和定期酸性希夫(Schiff)评估。也检测胆管异常、门管(portal tract)的坏死-发炎变化和肉芽肿性渗透。

编码PDC-E2和-E3的DNA用PCR分离并克隆到pTATGET(Promega，Madison，WI)自身表达盒，在大肠杆菌中扩增并用无内毒素的质粒纯化试剂盒(Qiagen^TM)根据厂商说明纯化，如前所述。多核苷酸治疗在诱导疾病前施用给动物，治疗包括编码自身蛋白质PDC-E2和-E3的DNA。选择待施用的自身-蛋白质、多肽或肽在上述一系列实验基础上确定，包含总共约1到8个抗原自身-蛋白质、多肽或肽，优选2到6个，最优选3到5个抗原。载体所含DNA编码细胞因子，如IL-4，可用自身载体施用。

实施例16

多核苷酸治疗包括施用编码线粒体酶自身蛋白质的DNA，用于防止原发性胆硬化 和治疗确立的原发性胆硬化

编码人PDC-E2和-E3的DNA用PCR分离并克隆到适当哺乳动物表达载体的自身表达盒，在大肠杆菌中扩增并用无内毒素的质粒纯化方法纯化。多核苷酸治疗施用给患确立PBC的人，治疗包括编码自身蛋白质PDC-E2和-E3的DNA。载体所含DNA编码细胞因子，如IL-4，可用自身载体施用。DNA治疗人中PBC的功效通过测量连续肝功能测试确定，包括胆红素、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)以及发展肝衰竭的时间延迟。经皮肤的肝活组织切片后，肝组织学用苏木素&曙红染色和定期酸性希夫评估。也检测胆管异常、门管的坏死-发炎变化和肉芽肿性渗透用于证明疾病活性。

患PBC或有发展PBC风险的病人可通过鉴定血清自身抗体有效诊断，抗体针对线粒体蛋白如丙酮酸脱氢酶复合体。无症状的的人类患者用有效血清学试验如ELISA、蛋白质印迹、或蛋白质阵列测试诊断自身抗体的存在。血清学测试阳性的病人用上述多核苷酸治疗预防处理以防止疾病发作。DNA治疗人中PBCs的功效通过测量连续肝功能测试确定，包括胆红素、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)以及发展肝衰竭的时间延迟。经皮肤的肝活组织切片后，肝组织学用苏木素&曙红染色和定期酸性希夫评估。也检测胆管异常、门管的坏死-发炎变化和肉芽肿性渗透用于证明疾病活性。同样分析血清自身抗体的分布。

实施例17

多核苷酸治疗包括施用编码淀粉样β自身蛋白的DNA，用于治疗阿尔茨海默氏病

构建的自身载体包括编码人淀粉样β(构建Aβ多肽)的DNA。如上所述，盒具有转录和翻译调节序列用于在受体细胞中表达DNA。

此自身载体包括编码自身肽Aβ的DNA，通过肌肉注射施用给小鼠。施用自身载体48小时前，50μl 0.25％布比卡因肌肉注射给两块四头肌肌肉。自身载体包括编码Aβ自身肽的DNA，载体用标准技术纯化，包括去除内毒素的步骤。DNA重悬浮和保存于无内毒素、无热原的水。注射前，自身载体在PBS中以1mg/ml终浓度制成，载体包括编码Aβ自身肽的DNA。随后50μl的此DNA制剂通过肌肉注射施用给两块四头肌肌肉。另外，免疫刺激CpG寡核苷酸以10μg每只动物的剂量肌肉内施用。初次免疫后2周进行第二次加强布比卡因和具CpG寡核苷酸的DNA。然后从起始DNA施用后4到6周的小鼠中取出血清，以测试抗Aβ肽的抗体存在。抗体水平通过标准ELISA技术测量(图4)。根据上面操作处理的正常小鼠发展出抗Aβ肽的显著抗体效价。

用此操作在人Aβ转基因小鼠中进行实验，使用的自身载体包括编码Aβ的DNA。构建转基因小鼠通过用人Aβ基因构建注射单个细胞胚胎，随后将这些胚胎重导入适当宿主小鼠品系中(Games等，Nature 373：523-527，1995)；(Hsiao等，Science 274：99-102，1996)。然后筛选所得子代的基因组中Aβ基因构建的存在。这些小鼠表现出特征性的病理生理和行为异常，模拟人阿尔茨海默氏病。年轻的症状前小鼠和年长的症状小鼠用自身载体处理，载体包括编码构建的DNA。测量的功效参数包括认知行为测试和组织病理学的改进。年轻的症状前小鼠在DNA处理后12-18个月检测以确定认知缺陷和组织学上淀粉样斑的发生率。年长的症状小鼠在DNA处理后3-6个月检测，检测临床测试的绝对临床分数改进和组织学上淀粉样斑总数的减少。

实施例18

多核苷酸治疗包括施用编码淀粉样β自身蛋白的DNA，用于防止和治疗人阿尔茨 海默氏病

自身载体包括编码人淀粉样β(构建Aβ多肽)的DNA。如上所述，盒具有转录和翻译调节序列用于在受体细胞中表达DNA。被治疗受试者包括的人类患者发展阿尔茨海默氏病的临床可能性很高或者证明有早期认知损伤或其它进一步发展阿尔茨海默氏病的的证据，或者患临床确定阿尔茨海默氏病的的患者。此自身载体包括编码自身肽Aβ的DNA，通过肌肉注射施用。自身载体包括编码Aβ自身肽的DNA，载体用标准技术纯化，包括去除内毒素的步骤。DNA重悬浮和保存于无内毒素、无热原的水。注射前，自身载体在PBS中以1mg/ml终浓度制成，载体包括编码Aβ自身肽的DNA。随后1ml的此DNA制剂通过肌肉注射施用给四头肌肌肉。另外，自身载体构建可包含Aβ多聚体，Aβ编码由间插序列连接的DNA，从而编码多聚体Aβ多肽。这样，不仅一级肽结构作为免疫原被靶向，而且二级肽结构(如多个Aβ肽形成的β折叠片层)也作为免疫原被靶向。初次免疫后2到4周加强自身多核苷酸，重复直到获得足够的抗淀粉样β抗体，水平与临床疾病减少相关。然后每3-4个月从人中取出血清以监控抗Aβ抗体的存在和效价。这通过标准ELISA技术测量。传递其它Aβ自身多核苷酸强化剂以维持抗Aβ抗体的治疗效价。

人中的功效通过认知缺陷发展变慢和/或认知功能改进来证明。

实施例19

一种用编码α-突触核蛋白的DNA疗法治疗帕金森氏症的方法

构建的DNA自身载体编码人α-突触核蛋白多肽，包括适当控制和调节元件。盒、所用载体和施用类似于实施例6所述。测量抗α-突触核蛋白的抗体生成。随后DNA构建施用给年轻的症状前小鼠和年长的症状小鼠，小鼠是人α-突触核蛋白基因的转基因小鼠。现在有一些α-突触核蛋白基因的转基因小鼠模型。这些转基因系之一发展胞内内含体且运动原受损(Masliah等，Science 287：1265-1269，2000)。然后评估这些处理动物在疾病临床和病理生理参数中的改进。年轻的症状前小鼠在DNA自身载体处理后9-12个月检测以确定运动原损伤和组织学上胞内内含体的发生率。年长的症状小鼠在DNA自身载体处理后3-6个月检测，检测运动原测试的绝对临床分数改进和组织学上胞内内含体总数的减少。

实施例20

一种用编码亨廷顿蛋白的DNA疗法治疗亨廷顿症的方法

构建的DNA自身载体编码不同长度的CAG三核苷酸重复且通过实施例6所述途径和方案施用。测量抗亨廷顿蛋白的抗体生成。DNA构建施用给年轻的症状前小鼠和年长的症状小鼠，小鼠是突变人亨廷顿基因的转基因小鼠，其CAG三核苷酸重复数增加。突变亨廷顿基因的转基因小鼠具有的临床和病理生理特征几乎与人类疾病相同。这些小鼠发展由突变亨廷顿蛋白组成的胞内内含体并具有人类疾病中的运动原异常。最近的研究证明如果突变基因的表达终止，疾病组织病理学被反转且临床症状改进(Yamamoto等，Cell 101：57-66，2000)。评估DNA处理动物在疾病临床和病理生理参数中的改进。年轻的症状前小鼠在DNA处理后9-12个月检测以确定运动原缺陷和组织学上亨廷顿蛋白内含体的发生率。年长的症状小鼠在DNA处理后3-6个月检测，检测运动原测试的绝对临床分数改进和组织学上核内内含体总数的减少。

实施例21

一种用编码亨廷顿蛋白的DNA疗法防止和治疗亨廷顿症的方法

确立亨廷顿症的人或突变人亨廷顿基因测试阳性并因而易发展亨廷顿症的人可用编码亨廷顿蛋白的自身多核苷酸治疗，以防止确立的亨廷顿症发展或治疗此病。构建的DNA自身载体编码不同长度的CAG三核苷酸重复且肌肉内施用，4-8周后加强。它能用免疫刺激DNA序列和/或融合C3d施用以增加自身多核苷酸治疗功效。测量抗亨廷顿蛋白的抗体生成，传递其它DNA自身载体强化以获得治疗水平相关的抗亨廷顿蛋白抗体效价。功效在亨廷顿症神经特征的临床改进基础上监控。

实施例22

一种用编码朊病毒自身蛋白的DNA疗法治疗朊病毒疾病的方法

构建的DNA自身载体编码参与β片层形成的朊病毒蛋白结构域。质粒载体如实施例6所述施用。测量抗朊病毒蛋白的抗体生成。DNA构建施用给年轻的症状前小鼠和年长的症状小鼠，小鼠是用于朊病毒疾病的转基因模型。这些小鼠转朊病毒基因，此基因所含突变使这些小鼠发展神经变性疾病缓慢，该疾病模拟人朊病毒疾病的行为和病理生理异常(Chiesa等，Neuron 21：1339-1351，1998)。年轻的症状前小鼠在DNA处理后9-12个月检测以确定认知和与异常组织学一起的运动原缺陷的发生率。年长的症状小鼠在DNA处理后3-6个月检测，检测认知和运动原测试的绝对临床分数改进和组织学检测上异常严重性的减少。

实施例23

一种用编码自身蛋白质的DNA治疗肥胖的方法，自身蛋白质参与调节摄食行为、 脂肪形成和/或代谢

自身载体包括编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，自身-蛋白质、多肽或肽选自多配体聚糖-3、围脂滴蛋白、食欲肽、甘丙肽、胰高血糖素-类似肽受体以及其它本领域普通技术人员已知的蛋白质，使用本发明的教授，它们参与调节摄食行为、脂肪形成和/或代谢，载体在如上所述用PCR获得编码自身-蛋白质、多肽或肽的DNA后构建。这些DNA自身载体通过肌肉注射施用给小鼠。施用DNA 48小时前，50μl 0.25％布比卡因肌肉注射给两块四头肌肌肉。质粒DNA用标准技术纯化，包括去除内毒素的步骤。DNA自身载体重悬浮和保存于无内毒素、无热原的水。注射前，DNA自身载体在具0.9mM钙的PBS中以1mg/ml终浓度制成。随后50μl的此DNA自身载体制剂通过肌肉注射施用给两块四头肌肌肉。在一个实施方案中，DNA自身载体没有佐剂施用，在另一个实施方案中，施用DNA，免疫刺激CpG寡核苷酸以10μg每只动物的剂量肌肉内施用，或用另一种试剂。初次免疫后2周进行第二次加强布比卡因和具CpG寡核苷酸的DNA。然后从起始DNA施用后4到6周的小鼠中取出血清，以测试抗编码自身蛋白的抗体存在。这通过标准ELISA技术测量。单独评估此DNA自身载体治疗以及结合其在C57BL/6小鼠中减少重量增加和促进重量减少的能力，小鼠用促进肥胖的高脂肪饮食喂养(55％脂肪来自卡路里[货号#93075，Harlan Taklad，Madison，WI]，与仅9％卡路里来自脂肪的常规小鼠chow相反)。

实施例24

一种用编码自身蛋白质的DNA防止骨关节炎的方法，自身蛋白质参与调节软骨 重塑、降解和生长

编码组织蛋白酶、纤溶酶、胶原酶、金属蛋白酶的DNA用PCR分离并克隆到质粒DNA表达载体，与实施例1所述类似。携带6拷贝proαl(II)胶原转基因的Dell小鼠在3个月大时出现骨关节炎，转基因具有短的缺失突变(Salminen等，Arthritis Rheum 44：947-955，2001)；(Rintala等，J Anat 190：201-208，1997)。从4周大开始，这些小鼠每隔一周接受DNA自身载体注射，载体单独或组合编码组织蛋白酶、纤溶酶、胶原酶、金属蛋白酶。小鼠组以每月间隔杀死，用于组织分析它们的膝软骨。

实施例25

一种用编码自身蛋白质Nogo-A的DNA疗法防止脊髓损伤的方法

脊髓损伤的治疗靶是名为Nogo-A的蛋白质。抗Nogo-A的抗体显示在脊髓损伤动物模型中促进轴突再生。构建的自身载体所含DNA编码小鼠、大鼠和人序列的两个Nogo-A分子区，此区域被鉴定为可能对此分子抑制能力有作用，即胞外66氨基酸环和名为AS472的胞质内C-末端区。DNA克隆到适当DNA表达载体，形成本发明的自身载体并施用以产生中和抗体反应抗这些Nogo-A区。为测试所产生抗体的中和效果，体外测定用于评估重组Nogo蛋白存在时的3T3成纤维细胞扩散、背根神经中枢(鸡E12DRG培养物)神经突生长以及小鼠P4小脑粒神经元萌生。在被证明的动物模型中测试DNA构建的脊髓损伤。这些模型包括大鼠脊髓粉碎和脊髓切片模型。遵循三种不同的实验处理操作：即预防性DNA自身载体处理(施用DNA自身载体，接着损伤脊髓)、急性处理(损伤后立即施用DNA自身载体)和慢性处理(延长DNA自身载体施用以评估慢性损伤神经元中恢复生长的潜能)。轴突恢复用标准组织学技术和轴突标记的免疫组化来测量。测试运动轴突再生使用生物素葡聚糖胺顺行性追踪用于皮层脊髓束和免疫组化用于血清素能(脊髓缝(raphespinal))及去甲肾上腺素能(coerulospinal)神经元。评估功能性恢复用临床评定的标准方法。使用运动原恢复测试如21-点BBB运动等级、格子步(gridwalk)、窄光速交叉(beam crossing)和爬行测试(Ramon-Cueto等，Neuron 25：425-435，2000)；(Merkler等，J Neurosci 21：3665-3673，2001)。腿肌肉的肌电图记录用于评估后肢运动原恢复。测试灵敏性使用对光接触(接触放置)的反应、关节弯曲(本体感受)和尾部轻打(疼痛)测试。

实施例26

一种用编码主要组织相容性自身蛋白质和另外自身蛋白质的DNA疗法防止和治 疗移植物抗宿主病的方法

移植物抗宿主病(GVHD)在接受异源造血细胞移植的病人中引起显著病态和死亡率。GVHD通过移植免疫细胞攻击受体细胞表达的自身蛋白质来调节。使用的骨髓细胞从Balb/c(H-2^d)转移到Balb/k(H-2^k)小鼠，编码H-2^d I和II型MHC自身蛋白的DNA显示减少GVHD。对于造血干细胞移植，骨髓获得自Balb/c小鼠的大腿骨，选择c-Kit表达阳性细胞，使用MiniMACS/MidiMACS分离系统(MiltenyiBiotech，Aburn，CA)。分开剂量的800cGy致命辐照以2部分传递后，c-Kit选择的细胞注射到Balb/k受体尾部静脉。受体小鼠用每周一次、3周剂量的自身载体预处理，自身载体包括的DNA编码H-2^dI和II型MHC自身蛋白质以减少GVHD。监控GVHD以测量肝脏酶(天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素)和组织分析GVHD中普遍影响的器官(皮肤、胃肠道、肝等)为基础，用于证明炎症和坏死(急性GVHD)以及慢性炎症、纤维化和萎缩(慢性GVHD)。进行淋巴细胞混合培养以评估忍受诱导的程度，在移植淋巴细胞对受辐照的宿主抗原呈递细胞反应减少的基础上。

编码人MHC I和II型等位基因的DNA自身载体如上所述制备。测试造血干细胞移植受体以确定它们表达的特异MHCI和II型等位基因。用编码受体I和II型等位基因的DNA治疗，体外预处理待移植的细胞以防止GVHD。编码这些自身MHC分子的DNA用于治疗正患GVHD的移植后受体。DNA治疗可减少GVHD相关的移植后死亡率并降低GVHD临床表现，包括皮疹、涉及胃肠和涉及含肝的其它器官(通过检测肝损伤的血清标记监控，包括天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素)。

实施例27

一种用编码骨桥蛋白的DNA治疗多发性硬化和其它自身免疫疾病的方法

骨桥蛋白是最近鉴定的多效分子，在多发性硬化和其动物模型EAE中起致病作用。骨桥蛋白也可在炎症关节炎和其它人自身免疫疾病中发挥关键作用。用编码自身蛋白骨桥蛋白的DNA处理小鼠在宿主中诱导抗骨桥蛋白的免疫球蛋白反应，抑制骨桥蛋白使疾病连续的有害作用。编码骨桥蛋白的自身载体DNA通过克隆编码骨桥蛋白的DNA到pCDNA3哺乳动物表达载体中产生。pCDNA3包含CMV启动子和SV-40大T抗原多腺苷酸信号。此编码骨桥蛋白的自身载体在大肠杆菌中生成并用Qiagen Endo-free Mega-prep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA.)纯化无内毒素的DNA。小鼠四头肌注射0.1ml PBS(每块四头肌0.05ml)中的0.25％布比卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)。2天后，小鼠各四头肌中注射0.05ml各自身质粒DNA，质粒DNA以1.0mg/ml在具0.9mM钙的磷酸缓冲盐水中。质粒DNA以2到4周间隔再注射2次。编码骨桥蛋白的自身载体诱导抗骨桥蛋白抗体的功效可提高，通过共传递CpG免疫刺激寡核苷酸(如下所述)和/或用编码骨桥蛋白的DNA融合一个或多个C3d成分处理(如下所述)。酶联免疫吸收测定用于监控抗骨桥蛋白抗体的水平，诱导抗骨桥蛋白抗体代表治疗功效。随后用完全弗氏佐剂中的髓鞘肽(通常PLPp139-151)攻击小鼠以发展EAE，用编码骨桥蛋白的自身载体预处理的小鼠EAE发生率和严重性降低，如图5所证明。另外，可诱导易慢性复发EAE的小鼠品系(例如SJL小鼠)发展EAE(例如用完全弗氏佐剂中的PLPp139-151)，在确立EAE的小鼠中以双周间隔开始骨桥蛋白-自身载体治疗，用于诱导抗骨桥蛋白抗体以治疗疾病。测量功效以总体疾病严重性和临床瘫痪新事件数量的减少为基础，使用标准打分系统(如上所述)。

在患多发性硬化的人中，诊断后开始骨桥蛋白-自身载体治疗。监控功效以患多发性硬化病人中抗骨桥蛋白抗体的诱导为基础，如ELISA分析所测。进一步证明功效的基础是脑MRI扫描上损伤数量和尺寸的减少、疾病复发(临床瘫痪事件)数量的减少和残疾发展变慢。

实施例28

一种用编码自身组织移植蛋白的DNA防止和治疗组织移植排斥的方法

目前组织和器官移植(肾、肝、心脏、肺、输血、胰腺、岛细胞、造血细胞等)的最大限制之一是受体免疫排斥组织移植。免疫排斥由受体免疫系统调节，免疫系统识别组织移植蛋白中的等位基因变化。这些组织移植变成自身的，以这些组织移植基因组中编码的相关自身蛋白等位基因变化为基础。将组织和其基因组移植到受体使这些蛋白质成为受体自身蛋白。组织移植排斥由受体免疫反应调节，免疫反应抗组织移植中的MHCI和II型蛋白、抗组织移植中其它组织相容性和另外抗原，它们与受体相比具有等位基因变化。

用Balb/c(H-2^d)和Balb/k(H-2^k)小鼠间的组织移植，编码H-2^dI和II型MHC分子的DNA自身载体施用给移植受体，减少固定器官组织移植的排斥。用标准操作将心脏从H-2^d小鼠移植到H-2^k小鼠的异位腹部位置(异位移植能通过简单触诊紧密监控移植心脏)。受体小鼠用每周一次、3周剂量的pTARGET预处理(移植前)，pTARGET包含编码H-2^dI和II型MHC分子的DNA，和/或移植后用编码H-2^dI或II型分子的DNA每周或双周或每月处理。如触诊移植心脏所监控，用DNA自身载体预处理和/或移植后处理延长受体小鼠中的移植存活，自身载体编码组织移植的自身MHC和其它自身蛋白。

编码人MHC I和II型等位基因的DNA自身载体如上所述产生。测试移植供体和受体以确定它们表达的特异MHC I和II型等位基因。使用DNA自身载体治疗包括施用编码组织移植供体I和II型MHC等位基因的自身载体，预处理移植器官的受体以防止组织移植排斥。施用编码自身MHC分子的DNA以在移植后受体中治疗组织移植排斥。包括施用自身载体的DNA治疗减少免疫器官移植排斥和延长组织移植存活。

实施例29

一种天花疫苗接种后防止和治疗免疫-调节脑脊髓炎的方法

接种天花疫苗的主要限制之一是接种后急性散播的脑脊髓炎，在接受目前所用天花疫苗的病人中以约1∶1000发生。此接种后急性散播的脑脊髓炎由疫苗诱导的自身免疫反应调节，自身免疫反应针对髓鞘和其它中枢神经系统蛋白。

本发明的多核苷酸疗法治疗人天花疫苗接种诱导的免疫-调节脑脊髓炎，如下进行。编码一种或多个人髓鞘自身蛋白的DNA序列克隆到pTARGET或另一种适当DNA自身载体中。编码这些髓鞘自身蛋白的DNA被这类自身免疫反应靶向，包括髓鞘碱性蛋白、蛋白脂蛋白、髓鞘相关糖蛋白、环核苷酸磷酸二酯酶、髓鞘相关糖蛋白、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白和α-B-晶体蛋白。纯化没有细菌内毒素的DNA作为治疗剂传递给人，如前所述。DNA自身载体治疗每月或双月传递，传递6-12个月，随后每3-12个月传递作为维持剂量。可发展另外的治疗方案且范围可从每天到每周到每隔一月。所述DNA治疗靶向的人类患者在临床症状(包括运动原动力、感觉和认知测量)和MRI监控基础上监测疾病活性，MRI监控中枢神经系统损伤的数量和程度。

实施例30

一种使用免疫刺激DNA序列增加抗自身多肽免疫球蛋白效价的方法，结合编码 自身多肽的DNA治疗

用编码自身多肽的DNA单独处理小鼠一般诱导弱免疫反应，具抗编码自身多肽的低抗体效价，这是由于自身耐受所施加的阻碍。为诱导高抗体效价抗自身多肽以治疗致病自身蛋白引起或促进的疾病，佐剂加入自身载体DNA以加强其免疫能力。一个这种佐剂是已知免疫刺激的核苷酸序列。报导所谓的CpG序列能加强免疫反应抗DNA中编码的抗原(Krieg等，Nature 374：546-549，1995；Klinman等，PNAS(USA)93：2879-2883，1996；Sato等，J Rheumatol.26：294-301，1999)。CpG序列结合到DNA自身载体制剂中，通过内源增加质粒中存在的CpG序列数量或加入含寡核苷酸的外源CpG。任意情况中的CpG序列具有基序嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶。多种内源CpG序列用定点突变结合到质粒非编码区。外源CpG寡核苷酸包含1到10个CpG序列的任意位置且长度从10到100个核苷酸。另外，修饰这些寡核苷酸主链以减少降解可能，例如用硫代磷酸主链。免疫刺激的CpG寡核苷酸以10到100μg每只动物的剂量肌肉内施用。当需要增加抗体效价时，此策略应用于任何编码自身多肽的多核苷酸。

如实施例12所述，外源CpG寡核苷酸用于加强抗体反应抗通过DNA施用的自身蛋白Aβ(Aβ)。自身载体包括编码自身肽Aβ的DNA，载体通过肌肉注射施用给小鼠。50μl 0.25％布比卡因肌肉注射到两块四头肌肌肉，48小时后施用自身载体。另外，DNA治疗包括有效施用自身载体，没有预处理安排。自身载体包括编码Aβ的DNA，载体用标准技术纯化，包括去除内毒素的步骤。DNA重悬浮和保存于无内毒素、无热原的水。注射前，自身载体在PBS中以1mg/ml终浓度制成，载体包括编码Aβ的DNA。随后50μl的此DNA制剂通过肌肉注射施用给两块四头肌肌肉。另外，免疫刺激CpG寡核苷酸以10μg每只动物的剂量肌肉内施用。初次免疫后2周进行第二次加强布比卡因和具CpG寡核苷酸的DNA自身载体。然后从起始DNA施用后4到6周的小鼠中取出血清，以测试抗Aβ肽的抗体存在。这通过标准ELISA技术测量。根据上面操作处理的正常小鼠发展出抗Aβ肽的显著抗体效价。当CpG寡核苷酸用作佐剂时，效价显著增加。

实施例31

多核苷酸治疗包括施用编码自身蛋白质文库的DNA，自身蛋白质在自身免疫反应 靶向的器官和组织中表达

另一种治疗自身免疫的策略是在免疫攻击下施用编码组织或器官中存在的许多或所有自身蛋白质的DNA。cDNA表达文库包含编码许多或绝大部分自身蛋白质的cDNA，自身蛋白质在特定组织、器官或细胞类型中表达。这种cDNA表达文库在自身载体中产生以在施用给宿主时能表达它们编码的多肽。确立多发性硬化的动物和人用编码cDNA文库的自身载体治疗，cDNA在脑的少突胶质细胞中表达。患风湿性关节炎的动物和人用编码cDNA文库的自身载体治疗，cDNA在滑膜关节中表达，滑膜关节是风湿性关节炎中自身免疫反应的靶。患自身免疫糖尿病的动物和人用编码cDNA文库的自身载体治疗，cDNA在胰腺的β细胞中表达。编码胰腺β细胞中所表达cDNA的自身载体也可用于防止个体发展临床糖尿病，个体被鉴定为发展自身免疫糖尿病的风险很高。另外，自身载体中编码的cDNA文库大亚群可用于治疗自身免疫，而不用完整cDNA文库，。

实施例32

多核苷酸治疗包括施用编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的DNA以及免疫 调节分子用于不同疾病

实施例1、2和9到23所述方法描述了自身蛋白质、多肽或肽的鉴定、自身载体的制备和用于治疗不同疾病的施用。遵循这些例子中的方法，修改是自身载体与免疫调节分子一起施用，包括例如免疫调节序列(ISS)、C3d、IL-4、IL-10和IL-13。

多核苷酸治疗包括施用编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的DNA以及另外的免疫调节分子用于治疗和防止表7所列自身免疫疾病。

多核苷酸治疗包括施用编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的DNA以及另外的免疫调节分子用于治疗和防止表8所列神经变性疾病。

多核苷酸治疗包括施用编码一种或多个自身-蛋白质、多肽或肽的DNA以及另外的免疫调节分子用于治疗和防止表9所列多种疾病。

表7

表8

神经变性疾病多核苷酸治疗包括编码自身-蛋白质、多肽或肽的DNA以及另外编码免疫调节蛋白、肽或多肽的DNA阿尔茨海默氏病淀粉样β蛋白(Aβ)+免疫刺激序列(ISS)；Aβ+C3d；Aβ+ISS+C3d；tau+ISS；tau+C3d；tau+ISS+C3d帕金森氏症α-突触核蛋白+ISS；α-突触核蛋白+C3d；α-突触核蛋白+ISS+C3d亨廷顿症亨廷顿蛋白+ISS；亨廷顿蛋白+C3d；亨廷顿蛋白+ISS+C3d朊病毒疾病朊病毒蛋白+ISS；朊病毒蛋白+C3d；朊病毒蛋白+ISS+C3d

表9

实施例33

多核苷酸治疗包括施用编码自身-蛋白质、多肽或肽的DNA，结合编码共刺激分 子、能调节共刺激的分子或其它免疫调节分子的DNA

检测共刺激分子阻碍的研究包括CD40/CD40L阻碍(抗CD40/CD40L抗体)和B7-CD28阻碍(CTLA4-Ig)，证明在治疗自身免疫的动物模型和人临床试验中都有显著功效，可和自身免疫疾病的DNA多核苷酸治疗一起使用。B7-1和B7-2结合T细胞表面的CD28和CTLA4。经CD28传递的信号刺激T细胞，而CTLA4的参与是抑制性的。我们产生和使用的DNA编码CTLA4-特异免疫球蛋白(Ig)的跨膜形式，结合DNA多核苷酸疗法以治疗CIA。生成编码共刺激分子CTLA4-特异Ig膜结合形式的DNA，用RT-PCR将编码Ig跨膜区的DNA移植到CTLA4-特异Ig重链cDNA上(从杂交瘤扩增，从ATCC产生CTLA4-特异Mab)。本发明的DNA多核苷酸治疗结合编码共刺激分子或其它免疫调节分子的DNA，例如CD153和Fas，可用于治疗自身免疫疾病。

实施例34

用IMS结合编码多种自身蛋白的DNA治疗多发性硬化的动物模型

DNA多核苷酸治疗包括的全长cDNAs编码4种主要髓鞘成分MBP、MAG、MOG和PLP，当在疾病发作后给予时治疗EAE动物模型中的疾病复发。此外，将编码IL-4的DNA加入髓鞘DNA多核苷酸治疗，治疗功效进一步通过复发速度减小而提高。然而，尽管复发减少，总体疾病严重性仍可与对照组相比。

雌性SJL/J小鼠用100μgPBS中的PLP_139-151皮下免疫，PLP_139-151在CFA中乳化，CFA由IFA和0.5mg热灭活结核分枝杆菌组成。免疫后12天，在疾病发作时，小鼠四头肌都注射总共0.1ml PBS中的0.25％布比卡因-HCL。2天后，肌肉注射所选小鼠的四头肌，所用DNA混合物含25μg编码全长鼠PLP、MAG、MOG和MBP的4个单独pTARGET(Promega Corp.Wisconsin)质粒加50μg编码全长鼠IL-4的pTARGET质粒，总体积0.2ml。DNA注射每隔一周进行，注射6周。在起始DNA接种疫苗同时，200μl PBS体积中的50μg IMS腹膜内单独施用或与DNA疫苗接种一起。IMS每隔一周给予，进行6周。与未处理和DNA多核苷酸治疗+编码IL-4的质粒处理的小鼠相比，IMS单独处理的小鼠在整个疾病过程中总体平均疾病严重性下降(图6)。当小鼠用DNA混合物加IL-4结合IMS处理时，总体平均疾病严重性下降明显更剧烈(图6)。

诱导EAE疾病后57天，杀死小鼠，提取来自小鼠的腹股沟和腋淋巴结且根据各组收集。分离细胞并用10μg/ml富集RPMI培养基中的PLP_139-151和10％FCS刺激。3天后，细胞用人-rIL2再刺激。再刺激3天后，收集上清并通过三明治ELISA筛选IFN-γ、IL-4和IL-10。未处理和IMS单独处理或用DNA多核苷酸治疗加IL-4处理小鼠的细胞因子分布都有Th1偏向的IFN-γ生成增加(图7)。用DNA多核苷酸治疗加IL-4结合IMS处理的组具有Th2偏向的IL-4和IL-10生成增加。

实施例35

用IMS结合编码自身蛋白胰岛素的DNA治疗胰岛素依赖型糖尿病

非肥胖糖尿病(NOD)小鼠同时发展自身免疫糖尿病，许多临床、免疫和组织病理学特征与人胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)相同。疾病特征是胰岛炎症和β细胞破坏，引起高血糖症和明显糖尿病。CD4⁺和CD8⁺T细胞都需要用于糖尿病发展。鉴定了对于一些自身抗原的反应性，包括胰岛素、IA-2和谷氨酸脱羧酶。

IMS治疗结合编码自身蛋白胰岛素的DNA的功效在入侵胰岛炎中开始，但在IDDM完全发作前。获得7周大的NOD/Lt雌性小鼠且在一限制进入室中居住。从10周大开始每周测试小鼠的血糖水平(BGL)提高，使用单触超血糖监控系统。当BGL在200到250mg/dl间时开始治疗。从15周大开始，可用小鼠相继加入各组。小鼠四头肌都注射总共0.2ml PBS中的0.25％布比卡因-HCl。2天后，肌肉注射小鼠的四头肌，用50μg/剂量的pVAX1载体或DNA混合物，DNA混合物含50μg编码全长鼠前胰岛素原-1、前胰岛素原-2和IL-4的3个单独pVAX1质粒，总体积0.2ml PBS。注射每隔一周进行，注射4周。在起始DNA疫苗接种同时，200μl PBS体积中的50μg IMS腹膜内单独施用或与DNA疫苗接种一起。IMS每隔一周给予，进行4周。

糖尿病百分比定义为BGL持续大于250mg/dl的小鼠。4次治疗注射后，单独接受IMS的小鼠到第24周糖尿病发生率为87.5％(图8)。接受空pVAX1(Invitrogen，CA)质粒的小鼠糖尿病发生率为50％。用编码自身抗原和细胞因子IL-4的DNA多核苷酸结合免疫调节序列处理小鼠，到第24周糖尿病发生率仅为20％，与此相比，未处理小鼠中糖尿病发生率为100％(图8)。在此实验中，DNA质粒IM注射，而IMS IP注射，强烈暗示DNA质粒(ISSs)和IMS靶向不同细胞群。此外，在此研究中，NOD小鼠不暴露于ISSs。结合到一起，此令人惊讶和未预料到的结果证明IMS有效治疗天然产生的自身免疫疾病。

对上述系统可作出许多修改而不离开其基本教授。尽管本发明关于一个或多个特定实施方案详细描述，本领域技术人员认识到可对本专利申请所示特定实施方案进行改变，而这些修改和改进在发明的范围和精神内，如下列权利要求所列。此说明书所引用的全部出版物或专利文献纳入本文供参考，各出版物或文献特定和单独指出纳入本文供参考。

引用上面的出版物或文献不作为允许任何前述内容与现有领域相关，也不允许这些出版物或文献的内容或日期与现有领域相关。

Claims (24)

1.一种下述(a)与(b)的组合：

(a)DNA质粒载体，含有编码胰岛素依赖型糖尿病中靶向的自身抗原；和

(b)选自5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’的免疫调节序列，其中X和Y是任何天然产生或合成的核苷酸，但X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；

其中，该组合用于治疗对象的胰岛素依赖型糖尿病，其中，所述质粒载体用于肌肉内给予。

2.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述自身抗原选自胰岛素、胰岛索B链、前胰岛素原、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶65kDa和67kDa形式、酪氨酸磷酸酶IA2或IA-2b、羧肽酶H、岛细胞抗原69kDa、神经节苷脂抗原GT3、神经节苷脂抗原GM2-1和岛细胞葡萄糖转运子GLUT-2。

3.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述自身抗原选自胰岛素、胰岛素B链、前胰岛素原、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶65kDa和67kDa形式和酪氨酸磷酸酶IA2。

4.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述自身抗原是前胰岛素原。

5.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述自身抗原是胰岛素原。

6.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述免疫调节序列结合在所述DNA质粒载体中。

7.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述免疫调节序列未结合在所述DNA质粒载体中。

8.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述免疫调节序列全身给予。

9.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述免疫调节序列肌肉内给予。

10.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述自身抗原是多肽。

11.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述自身抗原是肽。

12.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述DNA质粒载体含有编码胰岛素依赖型糖尿病中靶向的第二自身抗原。

13.下述(a)和(b)所述物质在制备用于治疗对象的胰岛素依赖型糖尿病的药剂中的用途：

(a)DNA质粒载体，含有编码胰岛素依赖型糖尿病中靶向的自身抗原；和

(b)选自5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’的免疫调节序列，其中X和Y是任何天然产生或合成的核苷酸，但X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；

其中，所述治疗载体用于肌肉内给予。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述自身抗原选自胰岛素、胰岛素B链、前胰岛素原、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶65kDa和67kDa形式、酪氨酸磷酸酶IA2或IA-2b、羧肽酶H、岛细胞抗原69kDa、神经节苷脂抗原GT3、神经节苷脂抗原GM2-1和岛细胞葡萄糖转运子GLUT-2。

15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述自身抗原选自胰岛素、胰岛素B链、前胰岛素原、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶65kDa和67kDa形式和酪氨酸磷酸酶IA2。

16.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述自身抗原是前胰岛素原。

17.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述自身抗原是胰岛素原。

18.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述免疫调节序列结合在所述DNA质粒载体中。

19.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述免疫调节序列未结合在所述DNA质粒载体中。

20.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述免疫调节序列全身给予。

21.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述免疫调节序列肌肉内给予。

22.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述自身抗原是多肽。

13.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述自身抗原是肽。

24.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述DNA质粒载体含有编码胰岛素依赖型糖尿病中靶向的第二自身抗原。

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