CN101484176A - 预防和治疗疾病的方法及免疫调节核酸组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗或预防疾病的方法和组合物，包括给予具有一个或多个免疫调节序列(IMS)的免疫调节核酸。本发明还涉及鉴定IMS的手段和方法，用于预防或治疗疾病，更特别的是治疗和预防自身免疫性疾病或炎性疾病。本发明还涉及疾病的治疗和预防，包括免疫调节核酸的单独给药，或将其与编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的组合给药。本发明还涉及用于在个体中治疗疾病的方法和组合物，所述疾病与所述个体中一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽相关并与非生理学状态有关。

Description

预防和治疗疾病的方法及免疫调节核酸组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年6月13日提交的美国临时专利申请60/813,538和2006年10月5日提交的美国临时专利申请60/849,901的权益，因此，出于所有目的，这两个申请的全部公开物通过引用并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及治疗或预防疾病的方法和组合物。所述方法包括免疫调节序列的给药。本发明还涉及改进的免疫调节序列，用于预防或治疗疾病，更特别的是治疗和预防自身免疫性疾病或炎性疾病。本发明还涉及疾病的治疗或预防，包括免疫调节序列的单独给药。本发明还涉及疾病的治疗或预防，包括将免疫调节序列与编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的组合给药。例如，本发明的免疫调节序列被并入表达自身抗原的表达载体。本发明还涉及疾病的治疗或预防，包括将免疫调节序列与自身分子的组合给药，所述自身分子如自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白。本发明还涉及疾病的治疗或预防，包括将免疫调节序列与一个或多个另外的免疫调节治疗剂的组合给药。

本发明还涉及用于在个体中治疗疾病的方法和组合物，所述疾病与所述个体中的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽相关并与非生理学状态有关。本发明还涉及用于在个体中预防疾病的方法和组合物，所述疾病与所述个体中的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽相关并与非生理学状态有关。本发明还涉及包括免疫调节序列和多核苷酸的组合疗法的给药，所述多核苷酸编码存在于非生理学状态中与并与疾病相关的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽。本发明还涉及调节对一个或多个自身分子的免疫应答，所述自身分子存在于动物中并与非生理学状态有关且和疾病相关。更特别地，本发明涉及用于治疗或预防自身免疫性疾病的方法和组合物，所述自身免疫性疾病与存在于动物中的非生理性状态的一个或多个自身分子相关，如多发性硬化(MS)、风湿性关节炎(RA)、胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)、自身免疫性葡萄膜炎(AU)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、重症肌无力(MG)、斯耶格伦(氏)综合征(Sjogren’ssyndrome)、寻常天疱疮(PV)、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)和格雷夫斯病(Grave’s disease)。本发明还特别涉及与存在于动物中的非生理性状态的一个或多个自身分子相关的其他疾病，如骨关节炎、脊髓损伤、消化性溃疡病、痛风、偏头痛、血脂过多和冠状动脉病。

发明背景

自身免疫性疾病

自身免疫性疾病指由错误指向机体健康细胞和/或组织的适应性免疫引起的疾病。自身免疫性疾病影响3％的美国人口和可能类似比例的工业化世界人口(Jacobson et al.，Clin Immunol Immunopathol 84，223-43，1997)。自身免疫性疾病的特征为：异常地靶向自身分子的T和B淋巴细胞，由此造成体内器官、组织或细胞类型(例如，胰腺、脑、甲状腺或胃肠道)的损伤和/或机能失调，从而引起该疾病的临床表现(Marrack et al.，Nat Med 7，899-905，2001)，所述自身分子包括但不限于自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白和它们的衍生物。自身免疫性疾病包括影响特异组织的疾病和影响多组织的疾病。对某些疾病而言，这可能部分取决于自身免疫反应是针对局限于特定组织的自身分子抗原还是针对广泛分布于机体的自身分子抗原。组织特异性自身免疫的表征特征为选择性靶向或作用于单个组织或单一细胞类型。然而，靶向普遍存在的自身分子抗原的某些自身免疫性疾病也能影响特异组织。例如，在多肌炎中，自身免疫反应靶向广泛存在的蛋白组氨酰基-tRNA合成酶，然而主要涉及的临床表现为肌肉的自身免疫性破坏。

免疫系统采用高度复杂的机制用于产生反应以保护哺乳动物抵抗多种外源病原体并同时阻止对一个或多个自身抗原的反应。除了决定是否反应(抗原特异性)之外，免疫系统还必须选择适当的效应功能以处理每种病原体(效应特异性)。介导并调控这些效应功能的关键细胞是CD4⁺T细胞。此外，看起来，对来自CD4⁺T细胞的特异细胞因子的精细加工是T细胞介导其功能的主要机制之一。因此，表征CD4⁺T细胞产生的细胞因子类型及它们的分泌是如何控制的对理解免疫反应是如何被调节的极为重要。

10多年前初次发表了对长期小鼠CD4⁺T细胞克隆产生细胞因子的表征(Mosmann et al.，J.Immunol.136：2348-2357，1986)。在这些研究中，显示了CD4⁺T细胞产生细胞因子的两种不同方式，命名为T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)。已发现Th1细胞选择性产生白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和淋巴毒素(LT)，而Th2克隆选择性产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-13(Cherwinski et al.，J.Exp.Med.169：1229-1244，1987)。随后，从Th2克隆中分离出另外的细胞因子：IL-9和IL-10(VanSnick et al.，J.Exp.Med.169：363-368，1989；Fiorentino et al.，J.Exp.Med.170：2081-2095，1989)。最后，发现Th1和Th2细胞两者都分泌诸如IL-3、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的另外的细胞因子。

自身免疫性疾病包括能影响下表列出的机体内许多不同器官和组织的广谱疾病。参见例如Paul，W.E(ed.2003)Fundamental Immunology(基础免疫学)(第五版)，Lippincott Williams & Wilkins；ISBN-10：0781735149，ISBN-13：978-0781735148；Rose and Mackay(eds.2006)TheAutoimmune Diseases(自身免疫性疾病)(第四版)Academic Press，ISBN-10：0125959613，ISBN-13：978-0125959612；Erkan，et al.(eds.2004)The Neurologic Involvement in Systemic Autoimmune Diseases(系统性自身免疫性疾病的神经受累)，Volume 3(Handbook of Systemic AutoimmuneDiseases(系统性自身免疫性疾病手册))Elsevier Science，ISBN-10：0444516514，ISBN-13：978-0444516510；和Richter，et al.(eds.2003)Treatment of Autoimmune Disorders(自身免疫性疾病的治疗)，Springer，ISBN-10：3211837728，ISBN-13：978-3211837726。

人自身免疫性疾病的现有治疗包括糖皮质激素、细胞毒性剂和最近开发的生物学疗法。通常，治疗人系统性自身免疫性疾病根据经验且不能令人满意。在多种严重的自身免疫性疾病和炎性疾病中主要采用诸如皮质类固醇的广谱免疫抑制药物。除皮质类固醇之外，在治疗系统性自身免疫性疾病中使用其他免疫抑制剂。环磷酰胺是导致T和B两种淋巴细胞大量消减及细胞介导的免疫损害的烷化剂。环孢霉素、他克莫司和吗替麦考吩酯是具有抑制T淋巴细胞的特异性质的天然产物，并且已用于治疗SLE、RA，并在限定范围内用于治疗脉管炎和肌炎。这些药物伴有明显的肾脏毒性。甲氨蝶呤也作为“二线”试剂用于RA，目的为减缓疾病进展。它还用于多肌炎和其他结缔组织疾病。已尝试的其他方法包括意在阻断细胞因子作用或去除淋巴细胞的单克隆抗体。参见Fox，Am.J.Med；99：82-88 1995。MS的治疗包括干扰素β和共聚物1，它们降低复发率达20-30％且仅适度影响疾病进展。MS的治疗还使用包括甲强龙、其他类固醇、甲氨蝶呤、克拉屈滨和环磷酰胺的免疫抑制剂。在治疗MS中这些免疫抑制剂具有最小效力。RA的当前疗法采用诸如甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羟化氯喹、来氟米特(leflunamide)、强的松的非特异性抑制或调节免疫功能的药剂，以及近来开发的TNFα拮抗剂依那西普和因福利美(Moreland et al，JRheumatol 28，1431-52，2001)。依那西普和因福利美全面阻断TNFα，使患者更易死于败血症、慢性分枝杆菌感染的恶化和脱髓磷脂事件的发生。

在器官特异性自身免疫的情况下，已尝试过大量不同的治疗方法。全身性给予可溶性蛋白抗原以抑制随后针对该抗原的免疫反应。这些疗法包括向患有实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的动物和患有多发硬化的人递送髓磷脂碱性蛋白、其显性肽或髓磷脂蛋白混合物(Brockeetal.，Nature 379，343-6，1996；Critchfield et al.，Science 263，1139-43.，1994；Weiner et al.，Annu Rev Immunol 12，809-37，(1994))；对患有胶原蛋白诱导的关节炎的动物和患有风湿性关节炎的人给予II型胶原蛋白或胶原蛋白的混合物(Gumanovskaya et al.，Immunology 97，466-73，1999；McKown et al.，Arthritis Rheum 42，1204-8，1999；Trentham et al.，Science 261，1727-30，1993)；向患有自身免疫性糖尿病的人和动物递送胰岛素(Pozzilli and Gisella Cavallo，Diabetes Metab Res Rev 16，306-7，2000)；以及向患有自身免疫性葡萄膜炎的人和动物递送S-抗原(Nussenblatt et al.，Am J Ophthalmol 123，583-92，1997)。与该方法相关的问题是全身性注射抗原诱导的T细胞无反应性。基于T细胞受体和结合到主要组织相容性(MHC)分子上的肽之间的特异相互作用，另一种方法尝试设计用于肽抗原的全身性给药的合理治疗策略。在糖尿病动物模型中使用肽方法的一项研究导致了针对该肽的抗体的发生(Hurtenbach et al.，JExp.Med 177：1499，1993)。另一种方法是给予TCR肽免疫。参见例如，Vandenbark et al.，Nature 341：541，1989。另有一种方法还通过摄入肽或蛋白抗原诱导口服耐受。参见例如，Weiner HL，Immmunol Today，18：335 1997。

当前通过单独或与佐剂组合递送蛋白、多肽或肽来改变针对病原体或肿瘤的免疫反应。例如，乙型肝炎病毒疫苗包括作为佐剂的氢氧化铝配制的重组乙型肝炎病毒表面抗原(非自身抗原)。该疫苗诱导针对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫反应以抗感染。可选择方法涉及递送减毒的、复制缺陷的和/或非病原体形式的病毒或细菌(各自为非自身抗原)以引发针对该病原体的宿主保护性免疫反应。例如，口服脊髓灰质炎疫苗由减毒活病毒(非自身抗原)组成，该疫苗在已接种的个体内感染细胞并复制，从而诱导针对脊髓灰质炎病毒(外源或非自身抗原)的有效免疫，而不会引起临床疾病。作为选择，该失活脊髓灰质炎疫苗包括不能感染或复制的失活的或“灭活的”病毒，皮下给药该疫苗以诱导针对脊髓灰质炎病毒的保护性免疫。

免疫反应的启动和进展机制

与“非自身分子”相关的炎性疾病：微生物感染导致靶器官的炎症，在某些情况下为全身性炎症，所述微生物包括支原体、病毒、细菌、寄生虫和分枝杆菌。显著的实例包括细菌脓毒性关节炎、莱姆关节炎、感染性葡萄膜炎和感染性休克。作为先天免疫系统的一部分，诸如凝血级联的组分、缓激肽和补体的炎症介质被激活，促进炎症发生和发病。传染病中的免疫反应针对存在于微生物中的非自身分子，包括蛋白、脂质、糖类和核酸。包含被称为“CpG”基序(下述被更详细的定义)的某些基序的细菌DNA在动物模型中能启动炎症反应。例如，将细菌DNA或CpG基序(两者都为非自身分子)注射入滑膜关节模拟特征为脓毒性关节炎的炎症迹象和症状。

与“自身分子”相关的炎性疾病：在没有任何已知的传染病因学的情况下，许多人类疾病与急性或慢性炎症相关。在这些疾病中，免疫系统是活跃的，引起被感染的组织发炎和白细胞与淋巴细胞的异常渗入，但看起来与感染无关。实例包括骨关节炎、冠状动脉疾病、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s Disease)、某些形式的皮炎、胃炎和肺炎。在缺乏适应性免疫反应的情况下，主要的免疫反应是先天性免疫反应。

与“自身分子”相关的自身免疫性疾病：许多自身免疫性疾病已被描述，包括风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、糖尿病、牛皮癣和许多其他的疾病。如上述与自身分子相关的炎性疾病一样，免疫系统是活跃的，引起被感染的组织发炎和白细胞与淋巴细胞的异常渗入，但看起来与感染无关。与自身分子相关的炎性疾病不同的是，自身免疫性疾病的定义特征为存在特异于宿主表达的自身分子的自身抗体和/或T细胞。宿主T和B淋巴细胞选择性靶向自身分子的机制还不清楚。一些研究者提出自身免疫性疾病是由微生物病原体触发或加剧的。微生物CpG序列的刺激与动物模型中诸如EAE(Segal et al.，J.Immunology，158：5087，1997)和SLE(Gilkeson et al.，J.immunology，142：1482，1989)的自身免疫性疾病发生的增加的敏感性相关；然而，尽管炎性疾病能被诱发，很少的证据支持以下假设：CpG序列或微生物产物本身能够触发另外的健康动物中的自身免疫性疾病。例如，使用无菌动物系统(即，饲养在无菌环境中的动物)几个重要的试验已经证实在不暴露在天然存在的微生物或微生物CpG的情况下会有自身免疫性疾病的自发发生。实例包括在强直性脊柱炎的无菌转基因啮齿动物模型中的自身免疫性皮肤和生殖器疾病的发生(Taurog，J Exp Med，180：2359，1994，)；以及在SLE的两个不同模型中狼疮的发生(Maldonadoi et al.，J Immunol，162：6322，1999；Unni et al.，J Rheum，2：35，1975)。可诱导的SLE模型已被描述，其中用烃油、姥鲛烷对任何小鼠品系的单次注射导致SLE的发生，其特征为特征性自身抗体的产生以及免疫复合物介导的肾病的发生。总之，这些试验性模型提出了在不暴露在微生物DNA或CpG的情况下，能够发生自发的和可诱导的自身免疫性疾病。

免疫刺激序列(ISS)：先天免疫系统被认为是抵抗微生物和病原体的第一防线。先天免疫系统的最有效刺激物之一是微生物DNA，其包含免疫刺激序列(ISS)。细菌DNA中特异性免疫刺激序列对先天免疫的活化在小鼠中需要用于刺激的包含5’-嘌呤-嘌呤-胞嘧啶-鸟嘌呤-嘧啶-嘧啶-3’的非甲基化的核心六聚物序列基序，在人中需要用于刺激的包含5’-嘌呤-嘧啶-胞嘧啶-鸟嘌呤-嘧啶-嘧啶-3’的非甲基化的核心六聚物序列基序(Krieg et al.，Annu Rev.Immunol.，20：709-760，2002)。在免疫刺激序列基序中包含被称为“CpG”序列的二核苷酸基序的细菌DNA和合成的寡脱氧核苷酸(ODN)能够刺激B细胞增殖和分泌IL-6、IL-10和免疫球蛋白(Krieg et al.，Nature，374：546-549，1995；Yi et al，J.Immunol.，157：5394-5402，1996)。ISS DNA还直接激活树突细胞、巨噬细胞和单核细胞分泌诸如TNF-α、IL6和IL12的Th1样细胞因子并上调MHC和共刺激分子的表达(Klinman et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，93：2879-2883，1996；Martin-Orozco et al.，Int.Immunol.，11：1111-1118，1999；Sparwasser et al.，Eur.J.Immunol.，28：2045-2054，1998)。在小鼠中，Toll样受体-9(TLR-9)已被鉴定为识别CpG基序的关键受体。

在脊椎动物DNA中，CpG二核苷酸的频率被抑制到预测(期望)值的约1/4，在CpG二核苷酸中的C约80％的情况下被甲基化。相反，细菌DNA，与合成的ODN类似，CpG二核苷酸中的C优选地不被甲基化。因此，细菌DNA与脊椎动物DNA的结构上的不同在于其有增加的多于20倍的非甲基化CpG基序的含量。许多研究已确立了非甲基化的CpG基序作为激活免疫细胞的细菌DNA的分子模式(Krieg etal.，Annu.Rev.Immunol.，20：709-760，2002)。

由于CpG DNA能够诱导对诸如鸡卵溶菌酶、卵清蛋白的非自身抗原的强的抗体反应和Th1样T细胞反应，被公认为有效的佐剂(Chuet al.，J.Exp.Med.，186：1623-1631，1997；Lipford et al.，Eur.J.Immunol.，27：2340-2344，1997)。当前，CpG DNA和CpG ODN在传染病、肿瘤、过敏性疾病和自身免疫性疾病的各种动物模型中被用作治疗性疫苗(Krieg et al，Annu.Rev.Immunol，20：709-760，2002)。CpG用作疫苗的成功显然主要依赖于其在诱导强Th1样反应和在某些情况下如在过敏性哮喘模型中改变Th2反应为Th1反应的效力(Kline et al，J.Immunol，160：2555-2559，1998；Broide et al，J.Immunol，161：7054-7062，1998)。

对CpG DNA的先天性免疫激活的治疗性应用已给予了极大关注。CpG DNA诱导的有效的非抗原特异性先天性免疫细胞激活足以保护小鼠对抗细菌刺激，甚至足以治疗由细胞内病原体建立的感染(Agrawal et al.，Trends Mol.Med.，8：114-121，2002)。CpG DNA也诱导对小鼠中肿瘤的先天性免疫抗性和小鼠中已建立肿瘤的退化(Dow etal.，J.Immunol.，163：1552-1561，1999；Carpenter et al.，Cancer Res.，59：5429-5432，1999；Smith et al.，J.Natl.Cancer Inst.，90：1146-1154，1998)。CpG DNA的有效的Th1佐剂作用甚至取代先存在的Th2免疫反应；CpG DNA已被用作过敏性疫苗的佐剂，其中它在先存在Th2反应的情况下，诱导针对抗原的Th1反应，导致并发的过敏原吸入后的症状减轻(Van Uden et al.，J.Allergy Clin.Immunol，104：902-910，1999)。

免疫抑制序列(IIS)：免疫刺激序列寡脱氧核苷酸(ISS-ODN)的抑制剂作为用于降低对细菌和病毒中ISS-ODN的宿主免疫反应的抗炎剂，已被用于抑制ISS-ODN的免疫刺激活性，例如用于抑制存在于重组表达载体特别是在基因治疗的情况下的任何ISS-ODN的免疫刺激活性，作为与偶联的自身抗原或自身抗体组合的自身免疫调节剂，被用于抑制ISS-ODN刺激的Th1介导的IL-12产生，作为用于对胞外抗原的Th2免疫反应的佐剂，通常被用于将宿主免疫反应从Th1反应转变为Th2反应。参见，例如WO 04/047734和美国专利第6,255,292号。

Yamada et al，J.Immunol.，169；5590-5594，2002，使用多种体外免疫激活细胞系统评价了在CpG诱导的免疫刺激中的IIS寡脱氧核苷酸。Yamada等人发现IIS寡脱氧核苷酸的抑制优于寡脱氧核苷酸的刺激，并且对CpG诱导的免疫反应是特异性的。他们发现抑制性最强的寡核苷酸序列包含多聚G或G-C富集序列，但没有发现特异性六聚物基序。Krieg et al.，PNAS，95；12631-12636，1998，发现包含中和基序或在5’侧具有C或在3’侧具有G的合成寡核苷酸能阻断免疫刺激性CpG基序的免疫激活，所述中和基序被作者定义为CpG二核苷酸的同向重复簇。而且，六聚物免疫抑制序列没有被发现。在Zeuner et al.，Arthritisand Rheumatism，46：2219-2224，2002中，由上述Kreig等人描述的IIS被证明在动物模型中减少CpG诱导的关节炎。另外的IIS在US20050239732，Jurk et al.中被描述，特征为G富集寡聚物5’的CC二核苷酸，以及在Lenert et al.，(2003，DNA Cell Biol.22：621-31)中被描述，特征为临近嘧啶富集的CCT序列至末梢GGG三联体有3-5个核苷酸。然而，在两者中都没有发现六聚物免疫抑制序列。在US 6,225,292中，Raz等人描述了特异性六聚物基序，称为5’-嘌呤-嘌呤-[Y]-[Z]-嘧啶-嘧啶-3’，其中Y为除胞嘧啶外的任意核苷酸，Z为任意核苷酸，其中当Y不是鸟苷或肌苷时，Z为鸟苷或肌苷，鸟苷或肌苷阻断CpG免疫刺激序列的刺激活性。在每个上述实例中，IIS被证明特异性抑制刺激性CpG序列引起的免疫激活。

核苷酸治疗

反义治疗：反义寡核苷酸最初被设计为与特异性靶基因互补以降低它们的表达(Krieg，Annu.Rev.Immunol.，20：709-760，2002)。为了防止这些寡核苷酸的降解，骨架通常被修饰，例如为硫代磷酸骨架。尽管在很多情况下，反义寡核苷酸在组织培养细胞中的确抑制了靶基因的表达，然而体内试验在改变表达中很少成功。而且，许多研究者出乎意料地发现一些这样的寡核苷酸在体内刺激免疫反应。例如，针对人免疫缺陷性病毒(HIV)的rev基因的反义寡核苷酸具有免疫刺激作用，表现为增加的B细胞增殖和脾肿大(Branda et al.，Biochem.Pharmacol.，45：2037-2043，1993)。尽管从这些早期研究中没有鉴定出直接的免疫刺激序列基序，这些发现最终导致了针对特异性免疫刺激基序的研究。

基因治疗：多核苷酸治疗剂已被用于“基因治疗”，包括编码肽和/或多肽的裸DNA、在沉淀促进剂和转染促进剂中配制的DNA以及病毒载体。基因治疗为多核苷酸的递送，以提供蛋白或肽的表达来代替宿主中缺陷性或没有的蛋白或肽和/或增加期望的生理功能。基因治疗包括将DNA整合进个体基因组来达到治疗目的的方法。基因治疗的实例包括DNA的递送，所述DNA编码用于血友病的凝血因子、用于重症联合免疫缺陷的腺苷脱氨酶、用于家族性高胆固醇血症的低密度脂蛋白受体、用于葡萄糖脑苷脂沉积症(Gaucher’s disease)的葡糖脑苷脂酶、用于α₁-抗胰蛋白酶缺陷的α₁-抗胰蛋白酶、用于血红蛋白病的α-或β-球蛋白基因、以及用于囊肿性纤维化的氯化物通道(Verma andSomia，Nature 389，239-42，1997)。

治疗感染的DNA免疫：在DNA免疫中，无复制转录单位提供了蛋白或蛋白片断合成的模板，其诱导或提供宿主中特异性免疫反应。注射裸DAN促进了针对多种微生物和肿瘤的疫苗接种(Robinson andTorres，Semin Immunol，9，271-83.，1997)。编码存在于病毒(乙型肝炎病毒、人免疫缺陷性病毒、轮状病毒和流感)、细菌(结核分枝杆菌)和寄生虫(疟疾)、所有非自身抗原中特异性蛋白的DAN疫苗已在开发用于预防和治疗这些感染(Le et al.，Vaccine，18，1893-901，2000；Robinsonand Pertmer，Adv Virus Res，55，1-74，2000).

治疗瘤形成的DNA：编码主要组织相容性抗原类型I、细胞因子(IL-2、IL-12和IFN-γ)以及肿瘤抗原的DNA疫苗已在开发用于治疗瘤形成(Wlazlo and Ertl，Arch Immunol Ther Exp，49：1-11，2001)。例如，编码B细胞免疫球蛋白个体基因型(抗原结合区)的病毒DNA已被用于消除和防止B细胞淋巴瘤(Timmerman et al，Blood，97：1370-1377，2001)。

治疗自身免疫性疾病的DNA免疫：其他文献已经描述了编码免疫分子的DNA疗法治疗自身免疫性疾病。这样的DNA疗法包括编码T细胞受体的抗原结合区的DNA以改变启动自身免疫性反应的自身反应性T细胞的水平(Waisman et al，Nat Med，2：899-905，1996；美国专利第5,939,400号)。将编码自身抗原的DNA连接到微粒上通过基因枪递送到皮肤以预防多发性硬化和胶原诱导的关节炎。(PCT公开号WO97/46253；Ramshaw et al，Immunol，and Cell Bio.，75：409-413，1997)编码粘着分子、细胞因子(TNFα)、趋化因子(C-C趋化因子)和其他免疫分子(Fas-配体)的DNA已被用于治疗自身免疫性疾病的动物模型(Youssef et al，J Clin Invest，106：361-371，2000；Wildbaum et al，J ClinInvest，106：671-679，2000；Wildbaum et al，J Immunol，165：5860-5866，2000；Wildbaum et al，J Immunol，161：6368-7634，1998；和Youssef et al，J Autoimmun，13：21-9，1999)。

本发明的目的在于提供治疗或预防疾病特别是自身免疫性疾病或炎性疾病的方法和组合物，包括免疫调节核酸的给药。本发明的另一个目的是提供鉴定用于治疗疾病的免疫调节序列的手段。本发明还有另一目的是提供治疗疾病的方法和手段，所述疾病与存在于并涉及动物中非生理学过程的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽相关，所述方法和手段包括将免疫调节序列与编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸组合给药。本发明的另一个目的是提供用于治疗或预防疾病的组合物，所述疾病与动物中非生理性存在的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽相关。本发明还涉及疾病的治疗或预防，包括将免疫调节核酸与一个或多个自身分子组合给药。本发明的这些和其他目的在整个说明书中是显而易见的。

发明简述

本发明基于改进的免疫调节序列的发现，其单独或组合被用于预防或治疗与自身分子相关的自身免疫性疾病或炎性疾病。

具体地，本发明提供包括如下的改进的免疫调节序列(IMS)：

1)六聚物序列

5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’；

其中X和Y为任意天然存在或合成的核苷酸，除了

a.X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；

b.当嘧啶_[2]是胸腺嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶

c.当嘧啶_[1]是胞嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶

2)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及

3)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；

其中免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列。

作为选择，本发明提供了包括如下的改进的免疫调节序列：

1)六聚物序列

5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’；

其中X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤；

2)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及

3)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括2-10个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-10核苷酸；

其中免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列。

在本发明的一些实施方案中，六聚物序列的X和Y是GpG。在某些实施方案中，六聚物序列是5’-GTGGTT-3’。在一些实施方案中，CC二核苷酸位于六聚物序列5’的2核苷酸。在某些实施方案中，多聚G区包括3个邻接的鸟嘌呤碱基，并位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。在某些实施方案中，改进的免疫调节序列是5’-CCATGTGGTTATGGG T-3’。

实现本发明目的通过新方法和组合物治疗或预防疾病特别是自身免疫性疾病或炎性疾病，包括具有一个或多个免疫调节序列的免疫调节核酸的给药。免疫调节核酸可单独给药，或将其与编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸组合给药。也可将免疫调节核酸与其他自身分子组合给药以治疗与个体中非生理学存在的一个或多个自身分子相关的自身免疫性疾病或炎性疾病。

本发明还涉及药学上的组合物，用于治疗或预防自身免疫性疾病或炎性疾病，其中药学上的组合物包括诸如DNA多核苷酸的多核苷酸形式的免疫调节序列。可将免疫调节序列包含在载体中，通过修饰载体核苷酸序列元件包括免疫调节序列基序，当用于与个体中非生理学存在的自身分子相关的疾病如自身免疫性疾病或炎性疾病的情况中时，还包括抑制性二核苷酸基序。

通过治疗或预防动物中疾病的新方法来实现本发明的其他目的，所述疾病与动物中非生理学存在的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽相关，所述新方法包括给予动物免疫调节序列。本发明还涉及治疗或预防动物中疾病的新方法，所述疾病与动物中非生理学存在的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽相关，所述新方法包括给予动物与编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽组合的免疫调节序列。

本发明一方面提供了治疗或预防自身免疫性疾病的方法，所述自身免疫性疾病如多发性硬化、风湿性关节炎、胰岛素依赖的糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、斯耶格伦(氏)综合征(Sjogren’s syndrome)、寻常天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、强直性脊柱炎、自身免疫性皮肤病以及格雷夫斯病，所述方法包括给予动物单独的免疫调节序列，或与自身载体组合的免疫调节序列，所述自身载体包括编码与自身免疫性疾病相关的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸。在本发明另一方面，免疫调节序列与多核苷酸组合给药，所述多核苷酸包括编码以非生理学状态存在于个体中并与疾病相关的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的DNA。

本发明另一方面提供了治疗或预防炎性疾病的方法，所述炎性疾病如骨关节炎、痛风、假痛风、羟基磷灰石沉积疾病、哮喘、粘液囊炎、肌腱炎、结膜炎、尿道炎、膀胱炎、阴茎头炎、皮炎、冠状动脉疾病或偏头痛，所述方法包括给予动物单独的或组合的免疫调节序列。

本发明另一方面还提供了治疗或预防疾病的方法，所述疾病与器官或细胞移植相关，包括但不限于GVHD或移植排斥，所述方法包括给予动物单独的或与自身载体组合的免疫调节序列，所述自身载体包括编码与GVHD或移植排斥相关的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸。免疫调节序列和自身载体的给药调节对由自身载体表达的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的免疫反应，所述自身载体包括编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸。

在所述方法和组合物的一些实施方案中，很多(即两个或多个)免疫调节序列被单独或连接到一起使用，例如连续地或一前一后地连接到一起。所述两个或多个IMS可以是相同的或不同的。

附图简述

图1：抑制性IMS抑制CpG依赖的人PBMC细胞的增殖。存在刺激物CpG-ODN(5μg/ml)或CpG和抑制剂IMS的情况下，孵育人PBMC(5x10⁵/ml)。细胞用DNA孵育96小时，孔用1μCi[³H]TdR脉冲进行最后的24小时培养，接着测量掺入的放射性。每个数据点代表4次重复的平均值。a，b)在两个不同的细胞供者，即QB8(a)和QB10(b)中，刺激物CpG-ODN 2395(5μg/ml)被单独孵育(从左边的第二柱)，或与浓度逐渐增加的抑制剂IMS一起孵育(如括号中所示的1-25μg/ml+5μg/ml 2395)。

图2：IMS GpG.1和I18对CpG刺激的细胞因子产生的效应的剂量反应分析。在CpG ODN(2006，2395，C274，D19)单独存在或与剂量逐渐增加的IMS GpG.1和I18(所有IMS样品包含5μg/ml的CpG寡核苷酸)组合存在的情况下，将人PBMC(5x10⁶/ml)孵育48小时。通过ELISA测定培养基中细胞因子的水平。每个数据点代表3次重复的平均值。对于IL-10和IL-12(a和b)，随着IMS剂量增加，对细胞因子产生的抑制增强。对于IFN-γ(c)和IFN-α(d)，增加的IMS剂量引起对IMS和IMS I18的细胞因子表达增加，尽管相对于单独的CpG样品，对于IMS I18，低剂量抑制总的IFN-γ水平，所有I18剂量抑制IFN-α水平。

图3：ConA和多聚I:C对IMS GpG.1和I18的抑制作用。a)人PBMC(5x10⁶/ml)用单独的多聚I:C(10μg/ml)或与浓度逐渐增加的IMS一起孵育48小时。通过ELISA测定上清液中IFN-α蛋白水平。每个数据点代表3次重复的平均值。5μg(25μg/ml)剂量的I18和GpG.1在抑制多聚I:C诱导的IFN-α时是有效的。b)PBMC用单独的10μg/ml的ConA或与GpG.1和I18(每个为25μg/ml)组合孵育，且如图1所述分析增殖情况。

图4：抑制性IMS诱导不依赖于CpG的细胞因子产生。在无CpG寡核苷酸的情况下，将增加剂量的IMS与PBMC(供者QB11和QB12)孵育48小时，通过ELISA分析细胞因子。每个数据点代表3次重复的平均值。a)IL-6b)IL-10c)IFN-αd)IFN-γ。

图5：抑制性IMS在没有刺激物CpG ODN的情况下能刺激PBMC增殖。存在刺激物CpG-ODN 2395(5μg/ml)或浓度逐渐增加的IMSGpG.1和I18的情况下，孵育人PBMC(5x10⁵/ml)。如上所述(图1)测定细胞增殖。

图6：抑制性IMS在体内能抑制CpG诱导的IL-12表达。腹膜内注射给予寡核苷酸，24小时后眼眶后放血取出血清。通过ELISA分析血清中IL-12水平。

图7：每周一次50μgIMS寡核苷酸给药没有显著影响狼疮小鼠模型中向蛋白尿的进展。用TpT或GpG寡核苷酸处理的NZB/W F1雌性小鼠以及用PBS处理的对照组每周一次评分尿中蛋白的存在。显示蛋白尿小鼠的百分比随时间作图，蛋白尿被定义为通过阿尔伯狄克(Albustix)试剂条评分的两次连续评分>300mg/dl。在任何治疗组中没有观察到蛋白尿发作显著延迟。

图8：每周一次50μg IMS寡核苷酸给药没有显著影响狼疮小鼠模型中抗DNA自身抗体效价。用TpT或GpG寡核苷酸处理的NZB/WF1雌性小鼠以及用PBS处理的对照组在处死时收集血清。用购买的试剂盒测定抗双链DNA抗体效价。寡核苷酸治疗轻度降低了总的抗DNA反应，但没有达到统计上显著性。

图9：口强饲法给予GpG IMS寡核苷酸显著降低狼疮小鼠模型中肾的炎症的严重性。对取自已发展为蛋白尿的用TpT或GpG寡核苷酸处理的NZB/W F1雌性小鼠以及用PBS处理的对照组的肾进行组织病理学评分。评分系统被设计为测量炎症的程度，定义为1＝最小；2＝轻度；3＝中度以及4＝显著/严重。由合同兽医病理学家进行盲评。对每组组织学分值取平均值，下文表示为平均值+/-标准误差。在GpG处理组观察到肾脏炎症的减少，然而只有通过口强饲法给予GpG组达到统计上显著性。

图10：在用GpG IMS寡核苷酸处理的狼疮小鼠模型中，蛋白尿发作剂量依赖性延迟。用剂量逐渐增加的GpG寡核苷酸(50、200和500μg)每周一次通过腹膜内(IP)处理的NZB/W F1雌性小鼠以及用PBS赋形剂处理的对照动物被每周一次评分尿中蛋白的存在。显示蛋白尿小鼠的百分比随时间作图，蛋白尿被定义为通过阿尔伯狄克(Albustix)试剂条评分的两次连续评分>300mg/dl。在蛋白尿发作中存在剂量依赖性延迟，最高剂量的GpG提供了最显著的延迟(p＝0.03)。

图11：在用GpG IMS寡核苷酸处理的狼疮小鼠模型中，抗DNA抗体反应剂量依赖性降低。用剂量逐渐增加的GpG寡核苷酸(50、200和500μg)每周一次通过IP或皮内(ID)处理的NZB/W F1雌性小鼠以及用PBS赋形剂处理的对照动物在处死时收集血清。用购买的试剂盒测定抗双链DNA抗体。寡核苷酸治疗轻度降低了总的抗DNA反应，但没有达到统计上显著性。抗体效价图显示随着GpG浓度增加，抗DNA反应剂量依赖性降低。

图12：I-18m IMS寡核苷酸处理显著降低狼疮小鼠模型中抗DNA抗体反应。用50μg GpG、I-18h、I18m或TpT每天一次通过IP注射处理的NZB/W F1雌性小鼠以及用PBS赋形剂单独处理的对照组在处死时收集血清。用购买的试剂盒测定抗双链DNA抗体。抗体效价图显示I-18m处理与对照相比显著降低针对DNA的自身抗体水平。

图13：GpG IMS寡核苷酸与低剂量类固醇组合降低与EAU相关的炎症。用hIRBP_161-180肽免疫的B10.RIII小鼠每周一次ID被给予200μg GpG或TpT加低剂量甲基泼尼松龙(Depromedrol)(1mg/kg)。第21天眼睛的组织学评价由EAU的专家盲评给予每个实验组的平均严重度分值。尽管单独的类固醇或类固醇加TpT IMS寡核苷酸的给药对葡萄膜炎的严重性没有显著影响，用类固醇加GpG显著降低疾病分值。

图14：单独的GpG IMS寡核苷酸处理显著降低EAU中炎症的严重度。腹膜内或皮内给予用hIRBP_161-180肽免疫的B10.RIII小鼠单独的或与低剂量甲基泼尼松龙(1mg/kg)组合的200μg GpG或TpT寡核苷酸，处死所述小鼠，收集眼睛用于组织学评价。眼睛由EAU专家盲法评分。虽然观察到单独的类固醇或其与GpG寡核苷酸的组合对葡萄膜炎没有显著影响，但单独的GpG IP递送显著改进了类似于抗CD3阳性对照的严重度分值。

图15：每天一次IMS寡核苷酸的IP递送不影响EAU疾病的严重度。第0天开始，用I-18h、I-18m、GpG或TpT每天一次通过IP注射给予用hIRBP_161-180肽免疫的B10.RIII小鼠。第21天，动物被处死，收集眼睛用于组织学分析。眼睛组织学由EAU专家盲法评分。IMS寡核苷酸对EAU疾病严重度没有显著影响。

图16：过继转移后用GpG IMS寡核苷酸的处理降低EAU疾病严重度分值。来自hIRBP_161-180免疫的小鼠的淋巴结和脾细胞在体外与诱导肽一起培养三天。在第四天，3 x 10⁷细胞被转移到首次用于实验的B10.RIII动物，该动物随后每周一次通过IP递送用200μg GpG寡核苷酸或PBS处理。观察到降低疾病严重度的趋势。

图17：I-18h IMS寡核苷酸在胶原抗体诱导的关节炎模型中显著降低平均的关节炎发病率。第0天静脉内(IV)注射单克隆抗胶原致关节炎抗体的Balb/c小鼠在第4-10天通过IP注射每天一次给予50μgIMS寡核苷酸进行处理。观察动物，每天对疾病进行评分。显示了随时间变化每个实验组的平均关节炎分值。I-18h寡核苷酸的处理相比于PBS对照组和GpG寡核苷酸的处理显著降低了平均关节炎分值。

图18：I-18h在胶原抗体诱导的关节炎模型中显著降低关节炎发病率。第0天IV注射单克隆抗胶原致关节炎抗体的Balb/c小鼠在第4-10天通过IP注射每天一次给予50μg IMS寡核苷酸进行处理。观察动物，每天对疾病进行评分。I-18h寡核苷酸的处理相比于PBS对照组和GpG寡核苷酸的处理显著降低了关节炎发病率。

图19：用GpG寡核苷酸的预处理降低响应于TNBS诱导的结肠炎的并发的体重减轻。第-5天用致结肠炎亚剂量的TNBS(0.5％)经直肠处理的C3H小鼠从第-5天到第0天每天一次给予GpG寡核苷酸，第0天时给予致结肠炎剂量的TNBS(3.5％)。计算每组的平均体重减轻和标准误差(SEM)并作图。未处理的对照为没有给予TNBS的动物。赋形剂对照在与寡核苷酸处理相同的进度中用TNBS处理和用PBS处理。统计分析显示用10或者100μg剂量的GpG寡核苷酸的处理显著优于赋形剂处理的对照组，而GpG寡核苷酸50μg剂量组没有达到统计学显著性。

图20：用I-18h寡核苷酸的预处理降低响应于TNBS诱导的结肠炎的并发的体重减轻。第-5天用致结肠炎亚剂量的TNBS(0.5％)经直肠处理的C3H小鼠从第-5天到第0天每天一次给予I-18h寡核苷酸，第0天时给予致结肠炎剂量的TNBS(3.5％)。计算每组的平均体重减轻和标准误差(SEM)并作图。未处理的对照为没有给予TNBS的动物。赋形剂对照在与寡核苷酸处理相同的进度中用TNBS处理和用PBS处理。统计分析显示用所有剂量的I-18h寡核苷酸的处理显著优于赋形剂处理的对照组。

图21：用I-18m寡核苷酸的预处理降低响应于TNBS诱导的结肠炎的并发的体重减轻。第-5天用致结肠炎亚剂量的TNBS(0.5％)经直肠处理的C3H小鼠从第-5天到第0天每天一次给予I-18h寡核苷酸，第0天时给予致结肠炎剂量的TNBS(3.5％)。计算每组的平均体重减轻和标准误差(SEM)并作图。未处理的对照为没有给予TNBS的动物。赋形剂对照在与寡核苷酸处理相同的进度中用TNBS处理和用PBS处理。统计分析显示用50μg的I-18m寡核苷酸的处理显著优于赋形剂处理的对照组，而100μg剂量水平没有达到统计学显著性。

图22：用GpG的预处理降低与DSS诱导的结肠炎相关的体重减轻。从第-2天开始用IP注射50或200μgGpG寡核苷酸预处理的雌性C3H小鼠从第0-7天通过饮用水被喂以3.5％DSS以诱导急性结肠炎。计算每组的平均体重减轻和标准误差(SEM)并作图。未处理的对照为没有给予DSS的动物。赋形剂对照组在与寡核苷酸处理相同的进度中用DSS处理和给予PBS。统计分析显示用50μg GpG寡核苷酸处理的组相比于赋形剂处理的对照组显著降低体重减轻(p<0.05；用邓奈特多比较(Dunnett′s Multiple Comparison)单向方差分析)。200μg剂量水平没有达到统计学显著性(p>0.05)。

图23：用I-18h寡核苷酸的预处理显著降低与DSS诱导的结肠炎相关的体重减轻。从第-2天开始用IP注射50或200μgI-18h寡核苷酸预处理的雌性C3H小鼠从第0-7天通过饮用水被喂以3.5％ DSS以诱导急性结肠炎。计算每组的平均体重减轻和标准误差(SEM)并作图。未处理的对照为没有给予DSS的动物。赋形剂对照组在与寡核苷酸处理相同的进度中用DSS处理和给予PBS。统计分析显示用50μg I-18h处理的组相比于赋形剂处理的对照组显著降低体重减轻(p<0.05；用邓奈特多比较单向方差分析)。200μg剂量水平没有达到统计学显著性(p>0.05)。

图24：从疾病诱发时开始用GpG寡核苷酸的处理显著降低与DSS诱导的结肠炎相关的体重减轻。第0天用IP注射GpG寡核苷酸处理的雌性C3H小鼠从第0-7天通过饮用水被喂以3.5％ DSS以诱导急性结肠炎。计算每组的平均体重减轻和标准误差(SEM)并作图。未处理的对照为没有给予DSS的动物。赋形剂对照组在与寡核苷酸处理相同的进度中用DSS处理和给予PBS。统计分析显示用50μg(p<0.01)和200μg(p<0.05)GpG寡核苷酸处理的组相比于赋形剂处理的对照组显著降低体重减轻(用邓奈特多比较单向方差分析)。而且，50μg GpG寡核苷酸处理的组与未处理(没有DSS)的对照组没有显著不同(p>0.05)，提示了在该剂量水平的GpG寡核苷酸对DSS诱导的结肠炎的完全阻断。

图25：从疾病诱发时开始用I-18h寡核苷酸的处理对与DSS诱导的结肠炎相关的体重减轻没有显著影响。第0天用IP注射I-18h寡核苷酸处理的雌性C3H小鼠从第0-7天通过饮用水被喂以3.5％DSS以诱导急性结肠炎。计算每组的平均体重减轻和标准误差(SEM)并作图。未处理的对照为没有给予DSS的动物。赋形剂对照组在与寡核苷酸处理相同的进度中用DSS处理和给予PBS。统计分析显示用50μg和200μgI-18h寡核苷酸处理的组相比于赋形剂处理的对照组没有显著降低体重减轻(用邓奈特多比较单方差分析)。

图26：I18诱变。存在刺激物CpG-ODN(5μg/ml)和衍生自I18的抑制剂IMS的情况下孵育人PBMC。细胞用DNA孵育96小时，孔用1μCi[³H]TdR脉冲进行最后的24小时培养，接着测量掺入的放射性。显示了I18衍生的序列(上)与CpG刺激的增殖的百分比抑制(下)。多聚G区内的突变(I18.M3-6和8)显著降低了含有六聚物序列5’-GTGGTT-3’的寡核苷酸抑制两个不同供者中PBMC增殖的能力。

图27：I18诱变。存在刺激物CpG-ODN(5μg/ml)和衍生自I18的抑制剂IMS的情况下孵育人PBMC。细胞用DNA孵育96小时，孔用1μCi[³H]TdR脉冲进行最后的24小时培养，接着测量掺入的放射性。显示了I18衍生的序列(上)与CpG刺激的增殖的百分比抑制(下)。六聚物序列的5’突变(I18.M10-12)显著降低了含有六聚物序列5’-GTGGTT-3’的寡核苷酸抑制PBMC增殖的能力。而且，六聚物序列和多聚G之间的核苷酸增加适度地降低了PBMC增殖(I18.M13-16)。

图28显示了人I18和小鼠I18核苷酸序列的比较。

图29：I18抑制TLR3、5、7和9。表达TLR2、3、4、5、7、8或9的HEK 293细胞在存在对应的TLR配体的情况下，用包含25μg/mL I18的免疫调节序列孵育，测定NF-κB的激活。第一排显示无配体的情况下基线信号传导(无配体)，而最后一排显示TLR由其对应的配体的激活(对照+)。存在配体的情况下，I18抑制TLR3、5、7和9的信号传导(I18+配体；从前数第二排)。

图30：I18抑制TLR7配体诱导的pDC的IFN-α产生。A.从供者1分离的pDC当用TLR7配体洛索立宾或R-837孵育时产生IFN-α。IFN-α产生被5μg/mL或25μg/mL的I18完全阻断。B.类似的，5μg/mL的I18完全阻断由供者2分离的pDC的IFN-α响应于TLR7配体的表达(洛索立宾与lox+I18相比)。

图31：I18抑制TLR3配体诱导的PBMC的IFN-α产生。A.从供者1分离的PBMC产生响应于多聚I：C的IFN-α，这被25μg/mL的I18阻断。B.在由供者2分离的PBMC中由TLR3激活的IFN-α产生被5μg/mL和25μg/mL的I18阻断。

图32：I18抑制CpG诱导的pDC的IFN-α产生。A.从供者1和2分离的pDC用单独的免疫刺激性CpG序列(CpG)或与逐渐增加量的I18一起(CpG+I18)孵育后，产生的IFN-α用ELISA测量。I18抑制IFN-α产生。C，D.从供者1和2分离的pDC用单独的CpG序列(C274)孵育，或在用其孵育前用等摩尔比率的I18(I18(1)(To)+C274(1)(24hrs))或5倍过量的I18(I18(5)(To)+C274(1)(24hrs)预孵育24小时产生的IFN-α。用I18的预孵育完全阻断IFN-α产生。

图33：来自SLE患者的免疫复合物与抗-dsDNA抗体一起诱导pDC的IFN-α产生。A.来自四名SLE患者(SLE 19558；SLE 22914；SLEKP491；SLE KP504)的血清相比于正常对照(正常)用ELISA分析抗-dsDNA抗体。B.从四名SLE患者(SLE 19558；SLE 22914；SLE KP491；SLE KP504)与正常对照(正常)中分离的血清免疫复合物。C.用分离的人pDC孵育分离的免疫复合物，通过ELISA分析IFN-α产生。单独的pDCs(仅细胞)产生很少的IFN-α，但被免疫刺激物CpG序列和来自具有抗-dsDNA抗体的SLE患者(19558和22914)的免疫复合物诱导。相反，来自没有抗-dsDNA抗体的SLE患者(KP491和KP504)或正常对照(正常SG)的免疫复合物不诱导IFN-α产生。

图34：I18抑制SLE-免疫复合物诱导的pDC的IFN-α。从血清中含有抗-dsDNA抗体的SLE患者和正常对照中纯化的Ig在有或没有I18的情况下用分离的pDC孵育24小时。分离的(仅细胞)或用来自正常对照(正常)的免疫复合物孵育的pDC产生很少的IFN-α。相反，用来自SLE患者的免疫复合物孵育的pDC产生显著量的IFN-α(SLE19558；SLE 22914)。IFN-α产生被I18抑制(SLE 19558+I18；SLE 22914+I18)。

图35：I18抑制正常外周CD19+B细胞的CpG激活。A，B.CD19+B细胞被单独孵育(无DNA)、与5μg/mL刺激物CpG-ODN一起孵育(CpG(5))、或存在5μg/mL I18的情况下与5μg/mL刺激物CpG-ODN一起孵育(CpG+I18(5))，通过ELISA分析细胞因子水平。I18抑制CpG刺激的IL-6(A)和IL-10(B)表达。C.CD 19+B细胞被单独孵育(无DNA)、与5μg/mL刺激物CpG-ODN一起孵育(CpG)、存在5μg/mL I18的情况下与5μg/mL刺激物CpG-ODN一起孵育(CpG+I18(5))、或存在25μg/mL I18的情况下与5μg/mL刺激物CpG-ODN一起孵育(CpG+I18(25))。通过[³H]胸腺嘧啶掺入分析细胞增殖。I18在两个剂量上都显著抑制CpG刺激的B细胞增殖。

图36：I18抑制来自诊断为SLE的患者的外周CD19+B细胞的CpG激活。A，B.CD19+B细胞被单独孵育(仅细胞)、与5μg/mL刺激物CpG一起孵育(CpG(5))、存在5μg/mL I18的情况下与5μg/mL刺激物CpG一起孵育(CpG+I18(5))、或与5μg/mL刺激物CpG和25μg/mLI18一起孵育(CpG+I18(25))，通过ELISA分析细胞因子水平。I18抑制CpG刺激的IL-6(A)和IL-10(B)表达。C.CD19+B细胞被单独孵育(仅细胞)，与5μg/mL刺激物CpG一起孵育(CpG-5)，与5μg/mL刺激物CpG一起孵育时存在1μg/mL I18(CpG+I18-1)、5μg/mL I18(CpG+I18-5)或25μg/mL I18(CpG+I18-25)。通过[³H]胸腺嘧啶掺入分析细胞增殖。I18在所有剂量上都显著抑制CpG刺激的C细胞增殖。

图37：I18激活正常B细胞中IL-6表达。A.分离的CD19+CD27+记忆B细胞被单独孵育(无dna)、与5μg/mL CpG一起孵育(CpG(5))、与5μg/mL I18一起孵育(I18(5))、或与25μg/mL I18一起孵育(I18(25))，通过ELISA分析IL-6表达。I18相比于CpG序列诱导IL-6在记忆B细胞中的低水平表达。B.分离的CD19+CD27-初始B细胞(naive Bcells)被单独孵育(无dna)、与5μg/mL CpG一起孵育(CpG(5))、与5μg/mL I18一起孵育(I18(5))、或与25μg/mL I18一起孵育(I18(25))，通过ELISA分析IL-6表达。I18在初始B细胞中激活IL-6表达的程度与CpG序列类似。

图38：I18激活IL-10在正常B细胞中的表达。A.分离的CD19+CD27+记忆B细胞被单独孵育(无dna)、与5μg/mL CpG一起孵育(CpG(5))、与5μg/mL I18一起孵育(I18(5))、或与25μg/mL I18一起孵育(I18(25))，通过ELISA分析IL-10表达。I18相比于CpG序列诱导IL-10在记忆B细胞中的低水平表达。B.分离的CD19+CD27-初始B细胞被单独孵育(无dna)、与5μg/mL CpG一起孵育(CpG(5))、与5μg/mL I18一起孵育(I18(5))、或与25μg/mL I18一起孵育(I18(25))，通过ELISA分析IL-10表达。I18相比于CpG序列诱导IL-10在初始B细胞中较低水平表达。

图39：I18激活共刺激性标志物在正常B细胞中表达。分离的CD19+B细胞被单独孵育(无dna)、与单独的5μg/mL CpG一起孵育(CpG-1826)、或存在氯奎的情况下与5μg/mL CpG一起孵育(CpG-1826+Ch1)、或单独的与5μg/mL I18一起孵育(I18)、或存在氯奎的情况下与5μg/mL I18一起孵育(I18+Ch1)。FACs测定CD80和CD86的表达，显示了表达每个共刺激性标志物的细胞的百分比。I18相比于CpG序列激活CD80和CD86的较低水平表达。

图40：I18不刺激正常B细胞的长期存活或增殖。分离的CD19+B细胞被单独孵育(仅细胞)；与1μg/mL的三种不同的CpG序列(1018；2395；2006)一起孵育；或与0.2μg/mL、1μg/mL或5μg/mL I18一起孵育。显示了细胞的起始浓度，13天后对每种情况下的细胞总数作图。I18不增加B细胞的存活或增殖。

图41：I18是狼疮B细胞的弱激活剂。来自狼疮患者的分离的CD19+B细胞被单独孵育(无dna)；与1μg/mL、5μg/mL或25μg/mL I18一起孵育；与5μg/mL CpG一起孵育；或存在5μg/mL或25μg/mL I18的情况下与5μg/mL CpG一起孵育。分析IL-6表达(A)、IL-10表达(B)以及细胞增殖(C)。I18弱激活IL-6和IL-10表达，以及轻度增加细胞增殖。

图42：在SLE动物模型中I18给药降低产生抗-dsDNA抗体的动物的百分比。I18IMS寡核苷酸通过皮内递送被每周一次给予NZB/WF1雌性小鼠10μg、50μg和250μg。相比于PBS阴性对照和类固醇阳性对照(甲基泼尼松龙+环磷酰胺)，对具有抗-dsDNA抗体的动物的百分比作图。具有抗-dsDNA抗体的动物的百分比在接受50μg(p＝0.17)和250μg(p＝0.04)的每周一次I18剂量组中统计上较小。

图43：在SLE动物模型中I18给药延迟疾病发作。NZB/W F1雌性小鼠被每天一次、每周三次或每周一次共45周给予10μg、50μg或250μgI18。评价蛋白尿发作，对每组显示随时间的具有蛋白尿动物的百分比。A.10μg I18的给药不影响疾病发作。B.每天一次、每周三次或每周一次的50μg I18的给药相比于PBS对照显示降低疾病发作的趋势。C.每周一次和每周三次的250μg I18的给药显示相比于PBS对照的降低疾病发作的趋势。

图44：在SLE动物中250μg I18给药延迟疾病发作。NZB/W F1雌性小鼠被每天一次、每周三次或每周一次共45周给予10μg、50μg或250μg I18。评价蛋白尿发作，对每组显示随时间的具有蛋白尿动物的百分比。A.每天一次10μg或50μg I18的给药不影响疾病发作。B.每周三次的250μg I18给药相比于10μg和50μg I18的给药显示统计上显著趋势(时序检验(LogRank Test)p＝0.31)。C.每周一次250μgI18的给药相比于10μg和50μg I18的给药显示了显著的统计学上的趋势(时序检验(LogRank Test)p＝0.03)。

图45：I18衍生的寡核苷酸抑制人B细胞的CpG刺激的IL-6产生。分离的人B细胞用单独的5μg/mL刺激物CpG-ODN或I18衍生的寡核苷酸(左边的柱)、或存在5μg/mL I18或I18衍生的寡核苷酸的情况下与刺激物CpG-ODN一起(右边的柱)孵育48小时。ELISA分析培养基中细胞因子水平，并以pg/ml记录在y轴上。

图46显示I18和M49之间的序列比较。

图47显示I18和M49在体外的抑制活性比较：从健康C57B1/6小鼠中分离小鼠脾细胞，并在存在a)TLR9(CpG寡核苷酸1018 10μg/ml)和b)TLR7(加德喹莫特(gardiquimod)1μg/ml)激动剂和剂量范围的抑制性寡核苷酸的情况下，以1x10⁶细胞/ml的密度培养。抑制性寡核苷酸和激动剂被同时加入到培养物。加入寡核苷酸和激动剂后24小时分离培养物上清，并用购买的ELISA试剂盒测定IL-6水平。通过计算每个寡核苷酸剂量的IL-6水平相比于单独的激动剂水平的量确定抑制百分比。I18化合物在这些分析中是TLR9和TLR7的适度良好的抑制剂。

图48显示I18和M49在体内的抑制性活性比较：相比于I18，M49适度地降低TLR9抑制性活性并降低在CD40L协同分析中评价的B细胞激动剂活性。M19在NZB/W模型中具有改善存活率和降低蛋白尿分值的效力，并且抗-dsDNA抗体效价优于I18。M49显示在六聚物核心区的序列变化影响活性，如“CCC”相比于I18中“GTT”的取代。M49在NZB模型中增加的效力和降低的激动剂活性。M49在脾细胞分析中作为TLR9抑制剂的效果较差，但在体内具有良好的效力。NZB/W F1小鼠(每组n＝15)从21周龄开始皮下注射250μg(0.05mL的5mg/ml PBS溶液)寡核苷酸(I18，M49)持续到40周龄。对照小鼠每周一次给予0.05mL PBS。预采血和每月一次采血用于自身抗体谱，每周一次测量蛋白尿水平。测量重量，观察到体重25％降低后使动物安乐死。M49寡核苷酸处理导致蛋白尿水平降低(a)，致死率的完全抑制(b)，以及抗-dsDNA抗体水平的降低(c)，所述抗体水平由购买的ELISA试剂盒在研究的终点(处理的第20周)所测定。

图49显示与重组CD40配体和寡核苷酸M49组合一起孵育的人B细胞的降低的激活。从健康供者血液中纯化的人B细胞与单独的重组CD40配体孵育或存在1μM剂量的抑制性寡核苷酸(I18或M49)时用重组CD40配体孵育。24小时孵育后从培养基移除上清液，通过ELISA测定IL-6蛋白水平。

发明详述

详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的制剂或处理参数，它们当然可以变化。还应理解本文使用的术语目的在于仅描述本发明特定的实施方案，而不是旨在限定。

定义

本文使用的“核酸”和“多核苷酸”是同义的，指核苷酸的多聚物(例如，脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或其类似物，包括单链或双链形式)。

本文使用的“寡核苷酸”指长约6-175或更多个核苷酸的核酸的子集。本发明典型的寡核苷酸长达约14高至50、75或100个核苷酸。寡核苷酸指寡聚核糖核苷酸和寡聚脱氧核糖核苷酸两者，后者在下文中称作ODN。ODN包括寡核苷酸和其他含有聚合物的有机碱。

核苷酸是包括连接到磷酸基团和可互换的有机碱上的糖(优选核糖或脱氧核糖)的分子，所述可互换的有机碱是可取代的嘌呤(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或次黄嘌呤(I))或可取代的嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))。

免疫调节序列(IMS)。本文使用的“免疫调节序列”或“IMS”指核酸的核苷酸序列或能够调节自身免疫性疾病或炎性疾病的核酸的区域。IMS例如可以是寡核苷酸或并入载体例如表达载体的核苷酸序列。本发明IMS通常长约14-50个核苷酸，更普遍的约15-30个核苷酸。本文使用的“免疫调节核酸”指包括一个或多个IMS的核酸分子。术语IMS与免疫抑制序列(IIS)可互换使用。

在两个或多个核酸或肽序列情况下的术语“一致性”或“百分比一致性”指两个或多个序列或子序列，当使用诸如例如PILEUP或BLAST的序列比较算法或类似算法(参见例如Higgins and Sharp，CABIOS，5：151-153，1989；Altschul et al，J.Mol.Biol，215：403-410，1990)测量，比较和比对最大一致性时，它们是相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比。可进行用于比较的最佳序列比对，例如通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482，1981的局部同源性算法，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443，1970的同源性比对算法，Pearson & Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，85：2444，1988的搜索相似性方法，这些算法的计算机化实现(在威斯康星遗传性软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，遗传性计算机组，575 ScienceDr.，Madison，WI)，或通过目测(通常参见Ausubel et al.，上述)。

用于两个核酸或多肽的短语“大体上一致的”指两个或多个序列或子序列，当比较和比对最大一致性时，它们具有至少60％、优选至少约70％、更优选至少约80％和最优选至少约90％或至少约95％、97％或99％的核苷酸或氨基酸残基一致性。优选地，大体上一致存在于长至少约50个残基的序列区，更优选至少约100个残基的区域，最优选所述序列至少约150个残基大体上一致。在优选的实施方案中，所述序列在给定的核酸或多肽全长上大体上一致。在本发明某些实施方案中，核酸或多肽(例如自身蛋白、自身多肽或自身肽，或编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的核酸)与本文公开的特定核酸或多肽大体上一致。

本文使用的“自身分子”包括自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白。“一个或多个自身蛋白、自身多肽或自身肽、或片断或衍生物”包括动物基因组内被编码的一个或多个蛋白、多肽或肽；在动物中产生或生成；在动物的生命过程中某些时间被翻译后修饰；或非生理学存在于动物中。术语“非生理学的(non-physiological)”“非生理学地(non-physiologically)”当用于描述本发明自身蛋白、自身多肽或自身肽时，指偏离或背离这些自身蛋白、自身多肽或自身肽在动物中的正常作用或过程。本发明一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽还称为自身抗原。当提及自身蛋白、自身多肽或自身肽是“与疾病相关的”或“与疾病有关的”，应理解为是指所述自身蛋白、自身多肽或自身肽可在形式或结构上被修饰，因此不能进行其生理学作用或过程；或通过诱导病理生理学、调节或促进病理生理学过程与疾病状态或疾病的病理生理学有关；和/或成为病理生理学过程的靶标。例如，在自身免疫性疾病中，免疫系统异常攻击自身分子，如自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白，造成表达和/或存在该自身分子的细胞和组织的损伤和机能障碍。可选择地，所述自身分子本身可在非生理的水平下表达和/或非生理地发挥作用。例如在神经退化疾病中，自身蛋白被异常表达，并且在脑内以损伤形式聚集，从而造成神经机能障碍。在其他情况下，该自身蛋白会加重不希望的状态或过程。例如在骨关节炎中，包含胶原酶和基质金属蛋白酶的自身蛋白会异常地降解覆盖于关节的关节面的软骨。一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的翻译后修饰的实例是糖基化、添加脂质基团、磷酸酶的脱磷酸作用、添加二甲基精氨酸残基、通过肽基精氨酸脱亚氨酸酶(PAD)将微丝聚集蛋白和纤维蛋白瓜氨酸化；αβ-晶体蛋白的磷酸化、MBP的瓜氨酸化；以及caspase(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)和粒酶作用的SLE自身抗原蛋白水解。在免疫学上，认为自身蛋白、自身多肽或自身肽都是宿主自身抗原，并且在正常生理情况下，宿主免疫系统会通过命名为“免疫耐受”的过程清除、灭活、或失活具有识别所述自身抗原能力的免疫细胞来忽略自身蛋白、自身多肽或自身肽。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括如下免疫蛋白、多肽或肽：出于调节免疫功能的目的专门由免疫系统的细胞生理上表达的分子。免疫系统是防御机制，该防御机制提供的手段可对居住在动物界的无数的潜在致病微生物进行快速、高度特异且是保护性的反应。一个或多个免疫蛋白、多肽或肽的实例是如下蛋白：包括T细胞受体、免疫球蛋白、包括I型白细胞介素细胞因子、和包括干扰素与IL-10的II型细胞因子、TNF-α、淋巴毒素、和诸如巨噬细胞炎性蛋白-1α和β、单核细胞-趋化性蛋白和RANTES的趋化因子、以及诸如Fas-配体的直接参与免疫功能的其他分子。本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽包括某些免疫蛋白、多肽或肽，它们是：I类MHC膜糖蛋白、II类MHC糖蛋白和骨桥蛋白。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括如下蛋白、多肽和肽：由于造成代谢或功能失调的遗传性或获得性缺陷个体完全或基本上缺失的，并通过给予所述蛋白、多肽或肽或者通过给予编码所述蛋白、多肽或肽的多核苷酸(基因治疗)替代的蛋白、多肽和肽。这些病症的实例包括杜兴(氏)(Duchenne)肌营养不良、贝克尔(氏)(Becker)肌营养不良、囊肿性纤维化、苯丙酮酸尿症、半乳糖血症、槭糖尿病以及高胱氨酸尿。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括下述细胞特异且专门表达的蛋白、多肽和肽，即细胞具有可将它们与其正常对应物明显区分的特性，其包括：(1)克隆性，它代表遗传改造后的单一细胞的增殖，从而形成恶性细胞克隆，(2)自律性，它表示对生长的不适当调控，以及(3)退变性，或正常协同细胞分化的缺乏。具有前述三条标准之一条或多条的细胞称作肿瘤细胞、癌细胞或恶性细胞。

“质粒”和“载体”以小写p及其后的字母和/或数字命名。所述起始质粒可从商业渠道获得、非限制地向公众开放，或者可以根据公开的程序用可获得的质粒构建。此外，与描述质粒等同的质粒为本领域已知，并且对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。“载体”或“质粒”指通过包括适当的控制和调节元件存在于宿主细胞时能进行复制的任何遗传成分。为达到本发明的目的，载体或质粒的实例包括，但不限于，质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒等。

本文使用的“裸核酸”指没有被包装的核酸分子(诸如例如在病毒颗粒、细菌细胞或脂质体内)，不与结合到核酸的分子(诸如例如DEAE-葡聚糖)复合，也不偶联到核酸上(例如金颗粒或基于多糖的支持物)。

疾病或病症的“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法”指减慢、停止或逆转已建立的疾病的进展，其证据为通过给予本发明的免疫调节核酸，减少、停止或去除了临床上或诊断上的症状。“已建立的疾病”指免疫系统是活跃的，引起受影响的组织发炎及白细胞和淋巴细胞的异常渗入。疾病或病症的“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法”还指通过免疫调节核酸与自身分子的组合给药，减慢、停止或逆转疾病的进展。本文使用的“自身分子”指自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白。疾病或病症的“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法”还指通过免疫调节核酸与免疫调节治疗剂的组合给药，减慢、停止或逆转疾病的进展。当提及包括免疫调节核酸与另外的化合物如编码自身蛋白、自身肽或自身多肽的DNA的治疗方案时，“组合”包括如下的两个或多个化合物：分别给药但物理上以小瓶中共给药被一起给予、例如通过偶联连接到一起、由一个或多个载体上的DNA编码、或在不同部位分别给药但时间上如此接近在一起以致于本领域普通技术人员认为被“组合”给予。如本文所使用的，改善疾病和治疗疾病是等同的。

本发明上下文使用的疾病或病症的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”、或“预防(prevention)”指单独或与本文所述的另外的化合物组合给予免疫调节序列，以预防疾病或病症，或者疾病或病症的一些或全部症状的出现或发作，或者减小疾病或病症发作的可能性。本发明上下文使用的疾病或病症的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”、或“预防(prevention)”指将免疫调节序列与自身分子组合给药，以预防疾病或病症，或者疾病或病症的一些或全部症状的出现或发作，或者减小疾病或病症发作的可能性。本发明上下文使用的疾病或病症的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”、或“预防(prevention)”指将免疫调节序列与免疫调节治疗剂组合给药，以预防疾病或病症，或者疾病或病症的一些或全部症状的出现或发作，或者减小疾病或病症发作的可能性。本文使用的“免疫调节治疗剂”指这样的分子：当给予个体时具有免疫调节或调控功能。这样的免疫调节治疗剂包括细胞因子、趋化因子、类固醇、或针对抗原或自身抗原的抗体。

“个体”指任何动物，例如，人、非人灵长类、马、母牛、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。

自身免疫性疾病

本文描述的组合物和方法用于治疗或预防自身免疫性疾病。与自身分子相关的自身免疫性疾病的一些实例列于下表并在下文描述，所述自身分子包括自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽、糖蛋白或非生理学存在于动物中的自身分子衍生物。

表1

多发性硬化：多发性硬化(MS)是最常见的中枢神经系统(CNS)脱髓磷脂病症，并且影响350,000名美国人和一百万的世界人口。参见例如Cohen and Rudick(eds.2007)Multiple Sclerosis Therapeutics(多发性硬化治疗)(第三版)Informa Healthcare，ISBN-10：1841845256，ISBN-13：978-1841845258；Matthews and Margaret Rice-Oxley(2006)Multiple Sclerosis：The Facts(多发性硬化：现状)(Oxford MedicalPublication第四版)Oxford University Press，USA，ISBN-10：0198508980，ISBN-13：978-0198508984；Cook(ed.2006)Handbook of MultipleSclerosis(多发性硬化手册)(Neurological Disease and Therapy(神经学疾病和治疗)，第四版)Informa Healthcare，ISBN-10：1574448277，ISBN-13：978-1574448276；Compston，et al.(2005)McAlpine′s MultipleSclerosis(麦卡尔平多发性硬化)(第四版)Churchill Livingstone，ISBN-10：044307271X，ISBN-13：978-0443072710；Burks and Johnson(eds 2000)Multiple Sclerosis：Diagnosis，Medical Management，andRehabilitation(多发性硬化：诊断、医学治疗及康复)Demos MedicalPublishing ISBN-10：1888799358，ISBN-13：978-1888799354；Waxman(2005)Multiple Sclerosis As A Neuronal Disease(作为神经元疾病的多发性硬化)Academic Press ISBN-10：0127387617，ISBN-13：978-0127387611；Filippi，et al.(eds.)Magnetic Resonance Spectroscopy inMultiple Sclerosis(多发性硬化中的磁共振波谱分析)(神经系统科学中的主题)Springer，ISBN-10：8847001234，ISBN-13：978-8847001237；Herndon(ed.2003)Multiple Sclerosis：Immunology，Pathology andPathophysiology(多发性硬化：免疫学、病理性、病理生理学)DemosMedical Publishing，ISBN-10：1888799625，ISBN-13：978-1888799620；Costello，et al.(2007)“Combination therapies for multiple sclerosis：scientific rationale，clinical trials，and clinical practice(多发性硬化的组合疗法：科学原理、临床试验及临床实践)”Curr.Opin.Neurol.20(3)：281-285，PMID：17495621；Burton and O′connor(2007)＂NovelOral Agentsfor Multiple Sclerosis(多发性硬化的新口服剂)＂Curr.Neurol.Neurosci.Rep.7(3)：223-230，PMID：17488588；Correale and Villa(2007)＂The blood-brain-barrier in multiple sclerosis：functional roles andtherapeutic targeting(多发性硬化的血脑屏障：功能性作用及治疗剂靶向)＂Autoimmunity 40(2)：148-60，PMID：17453713；De Stefano，et al.(2007)＂Measuring brain atrophy in multiple sclerosis(多发性硬化中测量脑萎缩)＂J.Neuroimaging 17 Suppl 1：10S-15S，PMID：17425728；Neema，et al.(2007)＂T1-and T2-based MRI measures of diffuse graymatter and white matter damage in patients with multiple sclerosis(多发性硬化患者中弥漫性灰质和白质损伤的基于T1和T2的MRI测量)＂J.Neuroimaging 17 Suppl 1：16S-21S，PMID：17425729；De Stefano andFilippi(2007)＂MR spectroscopy in multiple sclerosis(多发性硬化中的MR光谱学)＂J.Neuroimaging 17 Suppl 1：31S-35S，PMID：17425732；以及Comabella and Martin(2007)＂Genomics in multiple sclerosis-Current state and future directions(多发性硬化当前状态和将来趋向的基因组学)＂J.Neuroimmunol.印刷前电子版]PMID：17400297。

症状发作通常发生在20到40岁之间，并且表现为单侧视觉损伤、肌无力、感觉异常、运动失调、眩晕症、小便失禁、构音障碍或精神障碍的(按频率降低的顺序)急性或亚急性发作。这些症状由脱髓磷脂的病灶性损害导致，其既造成归因于轴突传导放缓的负性传导异常，还造成归因于异位冲动产生的正性传导异常(例如，莱尔米特(Lhermitte)症)。对MS的诊断基于病史，包括至少两次明显的时间上隔开的神经失调的发作、产生神经失调的客观临床迹象、和涉及CNS白质的分离区域。实验室研究提供了支持MS诊断的另外的客观证据，所述研究包括CNS白质损害的核磁共振成像(MRI)、IgG脑脊液(CSF)寡克隆带以及引起的异常反应。虽然大多数患者会经历渐进的复发缓解病程，但是MS的临床过程在个体间变化极大，其范围可以从限于一生中的数次温和发作到爆发性的持续进行性疾病。具有分泌IFN-γ能力的髓磷脂-自身反应性T细胞数量的增加与MS和EAE的发病机理相关。

风湿性关节炎：风湿性关节炎(RA)是慢性自身免疫性炎性滑膜炎，影响着世界人口的0.8％。它由造成侵蚀性关节破坏的慢性炎性滑膜炎来表征。参见，例如St.Clair，et al.(2004)Rheumatoid Arthritis(风湿性关节炎)Lippincott Williams & Wilkins，ISBN-10：0781741491，ISBN-13：978-0781741491；Firestein，et al.(eds.2006)Rheumatoid Arthritis(风湿性关节炎)(2d Ed.)Oxford University Press，USA，ISBN-10：0198566301，ISBN-13：978-0198566304；Emery，et al.(2007)＂Evidence-based reviewof biologic markers as indicators of disease progression and remission inrheumatoid arthritis(生物标志物作为风湿性关节炎中疾病进展和缓解的指示剂的基于迹象的综述)＂Rheumatol.Int.[印刷前电子版]PMID：17505829；Nigrovic，et al.(2007)＂Synovial mast cells：role in acute andchronic arthritis(滑液肥大细胞：在急性和慢性关节炎中的作用)＂Immunol.Rev.217(1)：19-37，PMID：17498049；and Manuel，et al.(2007)＂Dendritic cells in autoimmune diseases and neuroinflammatory disorders(在自身免疫性疾病和神经炎症病症中的树突细胞)＂Front.Biosci.12：4315-335，PMID：17485377。RA由T细胞、B细胞和巨噬细胞介导。

证明T细胞在RA中起关键作用的证据包括1)侵润滑膜的CD4⁺T细胞的主导性，2)与使用诸如环孢霉素的药物抑制T细胞功能相关的临床改善，以及3)RA与某些HLA-DR等位基因间的相关性。与RA相关的所述HLA-DR等位基因包括与β链第三高变区的位点67-74相似的氨基酸序列，所述位点参与肽结合与呈递到T细胞。RA由识别自身分子的自身反应性T细胞介导，所述自身分子如自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白、或在宿主含滑液的关节内或在别处存在的未鉴定的自身生物分子。RA中靶向的本发明的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽(也被称为自身抗原)包括源自II型胶原蛋白的表位；hnRNP；A2/RA33；Sa；微丝聚集蛋白；角蛋白；瓜氨酸；包括gp39的软骨蛋白；I、III、IV、V、IX、XI型胶原蛋白；HSP-65/60；IgM(风湿性因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心磷脂；醛缩酶A；瓜氨酸修饰的微丝聚集蛋白和纤维蛋白。已在高比例的RA患者的血清中鉴定到识别微丝聚集蛋白肽的自身抗体，所述微丝聚集蛋白肽包含经修饰的精氨酸残基(脱亚胺基以形成瓜氨酸)。一些患者中，自身反应性T和B细胞反应都针对同样的免疫显性的II型胶原蛋白(CII)肽257-270。

胰岛素依赖的糖尿病：人I型或胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)的特征是郎格罕氏(Langerhans)胰岛内β细胞的自身免疫性破坏。去除β细胞导致不能调节血糖水平。参见，例如Sperling(ed.2001)Type 1Diabetes in Clinical Practice(临床实践中的I型糖尿病)(当代内分泌学)Humana Press，ISBN-10：0896039315，ISBN-13：978-0896039315；Eisenbarth(ed.2000)；Type I Diabetes：Molecular，Cellular and ClinicalImmunology(I型糖尿病：分子、细胞和临床免疫学)(实验医学与生物学进展)Springer，ISBN-10：0306478714，ISBN-13：978-0306478710；Wong and Wen(2005)＂B cells in autoimmune diabetes(自身免疫性糖尿病中的B细胞)＂Rev.Diabet.Stud.2(3)：121-135，Epub 2005 Nov 10，PMID：17491687；Sia(2004)＂Autoimmune diabetes：ongoingdevelopment of immunological intervention strategies targeted directlyagainst autoreactive T cells(自身免疫性糖尿病：直接靶向自身反应性T细胞的免疫学干预策略的进展)＂Rev.Diabet.Stud.1(1)：9-17，Epub2004 May 10，PMID：17491660；Triplitt(2007)＂New technologies andtherapies in the management of diabetes(治疗糖尿病中的新技术和疗法)＂Am.J.Manag.Care 13(2 Suppl)：S47-54，PMID：17417933；以及Skyler(2007)＂Prediction and prevention of type 1 diabetes：progress，problems，and prospects(1型糖尿病的预测和预防：进展、问题与展望)＂Clin.Pharmacol.Ther.81(5)：768-71，Epub 2007 Mar 28，PMID：17392722。

血糖水平升高到特定水平(通常约250mg/dl)之上时，即发生显著性糖尿病。人类糖尿病发作前有一段长的症状发生前时期。该时期内，胰腺β细胞功能会渐渐丧失。抗胰岛素、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)(每个为本发明自身蛋白、自身多肽或自身肽的实例)的自身抗体的存在暗示发生了疾病。

症状发生前时期可被评价的标志物是胰腺内胰岛炎的存在；胰岛细胞抗体、胰岛细胞表面抗体的水平和频率；MHC II类分子在胰腺β细胞的异常表达；血糖浓度和胰岛素的血浆浓度。如胰岛素浓度的降低一样，胰腺T淋巴细胞、胰岛细胞抗体的数量增加和血糖升高指示所述疾病。

非肥胖糖尿病(NOD)小鼠作为动物模型，具有许多与人IDDM相同的临床上、免疫学上和组织病理学上的特征。NOD小鼠自发地发生胰岛炎性和对所述β细胞的破坏，其导致高血糖和显著性糖尿病。糖尿病的发生需要CD4⁺和CD8⁺两种T细胞，尽管每一种的作用尚不清楚。已表明，在耐受条件下，给予NOD小鼠作为蛋白的胰岛素或GAD，能预防疾病和下调针对其他一个或多个自身抗原的反应。

重要的是，NOD小鼠在清洁的无病原体的小鼠饲养室及在无菌环境中发生自身免疫性糖尿病。

当前通过监控血糖水平治疗人IDDM，以指导重组胰岛素的注射或基于泵的递送。膳食和运动方式有助于达到对血糖的适当控制。

自身免疫性葡萄糖炎：自身免疫性葡萄膜炎是眼部自身免疫性疾病，据估计影响400,000人，并且美国发病率为每年新增43,000例。当前对自身免疫性葡萄膜炎的治疗使用类固醇、诸如甲氨蝶呤和环孢霉素的免疫抑制剂、静脉免疫球蛋白以及TNFα-拮抗物。参见，例如Pleyer and Mondino(eds.2004)Uveitis and Immunological Disorders(葡萄膜炎和免疫学病症)(眼科学基础)Springer，ISBN-10：3540200452，ISBN-13：978-3540200451；Vallochi，et al.(2007)＂The role of cytokinesin the regulation of ocular autoimmune inflammation(细胞因子在调节眼睛自身免疫性炎症中的作用)＂Cytokine Growth Factor Rev.18(1-2)：135-141，Epub 2007 Mar 8，PMID：17349814；Bora and Kaplan(2007)＂Intraocular diseases-anterior uveitis(眼内疾病—前葡萄膜炎)＂Chem.Immunol.Allergy.92：213-20，PMID：17264497；以及Levinson(2007)＂Immunogenetics of ocular inflammatory disease(眼睛炎症疾病的免疫遗传学)＂Tissue Antigens 69(2)：105-112，PMID：17257311。

实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是T细胞介导的自身免疫性疾病，该疾病以神经视网膜、葡萄膜及眼内相关组织为靶点。EAU具有许多与人自身免疫性葡萄膜炎相同的临床上和免疫学上的特征，并且由乳化于完全弗氏佐剂(CFA)的葡萄膜炎肽的外周给药而引发。

在人自身免疫性葡萄膜炎中，自身免疫反应靶向的自身蛋白可以包括S-抗原、感光细胞间维生素A类结合蛋白(IRBP)、视紫质和视觉恢复蛋白。

原发性胆汁性肝硬化：原发性胆汁性肝硬化(PBC)是器官特异性的自身免疫性疾病，主要影响40-60岁之间的女性。在该组中报导的发病率接近1/1000。PBC的特征是内衬于小的肝内胆管的肝内胆管上皮细胞(IBEC)的进行性破坏。这导致对胆汁分泌的阻碍与干扰，造成最终的硬化。已报道由上皮衬里/分泌系统损坏表征的其他自身免疫性疾病的相关性，所述疾病包括斯耶格伦(氏)综合征、CREST综合征、自身免疫性甲状腺疾病以及风湿性关节炎。对驱动一个或多个抗原的关注已集中在线粒体上超过50年，导致抗线粒体抗体(AMA)的发现(Gershwin et al.，Immunol Rev 174：210-225，2000)；(Mackay et al，Immunol Rev 174：226-237，2000)。AMA很快成为实验室诊断PBC的基础，它存在于90-95％的临床症状出现很久以前的患者血清中。线粒体内的自身抗原性反应性命名为M1和M2。M2反应性指向抗48-74kDa组分家族。M2代表2-酮酸脱氢酶复合体(2-OADC)的多种自身抗原性亚单位，并且是本发明所述自身蛋白、自身多肽或自身肽的另一实例。

鉴定PBC发病机理中丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)抗原作用的研究支持了这样的观念：PDC在所述疾病的引发中起中心作用(Gershwin etal，Immunol Rev 174：210-225，2000)；(Mackay et al.，Immunol Rev174：226-237，2000))。在PBC中，95％的案例的最频繁反应性是E274kDa亚基，它属于PDC-E2。所存在的相关但明显不同的复合体包括：2-酮戊二酸脱氢酶复合体(OGDC)和支化链(BC)2-OADC。三种组成型酶(E1、E2、E3)有助于催化功能，该催化功能为将2-酮酸底物转换成酰基辅酶A(CoA)，同时将NAD⁺还原成NADH。哺乳动物PDC包括另外的组分，称蛋白X或E-3结合蛋白(E3BP)。在PBC患者中，所述的主要的抗原反应针对PDC-E2和E3BP。E2多肽包含两个串联重复的硫辛酰结构域，而E3BP具有单一的硫辛酰结构域。用糖皮质激素和包括甲氨蝶呤和环孢霉素A的免疫抑制剂治疗PBC。参见，例如Sherlock and Dooley(2002)Diseases of the Liver & Biliary System(肝胆系统的疾病)(第11版)Blackwell Pub.，ISBN-10：0632055820，ISBN-13：978-0632055821；Boyer，et al.(eds.2001)Liver Cirrhosis and itsDevelopment(肝硬化及其进展)(Falk Symposium，Volume 115)Springer，ISBN-10：0792387600，ISBN-13：978-0792387602；Crispe(ed.2001)TLymphocytes in the Liver：Immunobiology(肝中T淋巴细胞：免疫生物学)，Pathology and Host Defense Wiley-Liss，ISBN-10：047119218X，ISBN-13：978-0471192183；Lack(2001)Patho logy of the Pancreas，Gallbladder，Extrahepatic Biliary Tract，and Ampullary Region(胰腺、胆囊、肝外胆道及壶腹区的病理学)(内科学)Oxford University Press，USA，ISBN-10：0195133927，ISBN-13：978-0195133929；Gong，et al.(2007)＂Ursodeoxycholic Acid for Patients With Primary Biliary Cirrhosis：An Updated Systematic Review and Meta-Analysis of RandomizedClinical Trials Using Bayesian Approach as Sensitivity Analyses(原发性胆汁性肝硬化患者的熊去氧胆酸：使用贝叶斯方法对随机化临床试验以敏感性分析的最新的系统性综述和总和数据分析)＂Am.J.Gastroenterol.[印刷前电子版]PMID：17459023；Lazaridis andTalwalkar(2007)＂Clinical Epidemiology of Primary Biliary Cirrhosis：Incidence，Prevalence，and Impact of Therapy(原发性胆汁性肝硬化的临床流行病学：发病率、影响及疗效)＂J.Clin.Gastroenterol.41(5)：494-500，PMID：17450033；以及Sorokin，et al.(2007)＂Primary biliarycirrhosis，hyperlipidemia，and atherosclerotic risk：A systematic review(原发性胆汁性肝硬化、高脂血症及动脉粥样硬化风险：系统性综述)＂Atherosclerosis[印刷前电子版]PMID：17240380。

实验性自身免疫性胆管炎(EAC)的鼠模型采用在SJL/J雌性小鼠中使用哺乳动物PDC进行腹膜内(i.p.)致敏化，引发非化脓的破坏性胆管炎(NSDC)及AMA的产生(Jones，J Clin Pathol 53：813-21，2000)。

其他自身免疫性疾病与相关的一个或多个自身蛋白、自身多肽或自身肽：重症肌无力的自身抗原可以包括乙酰胆碱受体内的表位。寻常天疱疮中靶向的自身抗原可以包括桥粒芯糖蛋白-3。斯耶格伦(氏)综合征抗原可以包括SSA(Ro)；SSB(La)；以及胞衬蛋白。寻常天疱疮的主要自身抗原可以包括桥粒芯糖蛋白-3。肌炎组可以包括tRNA合成酶(例如，苏氨酰基、组氨酰基、丙氨酰基、异亮氨酰基和甘氨酰基)；Ku；Scl；SSA；U1-Sn-核糖核蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku；以及SRP。硬皮病组可以包括Scl-70；着丝粒；U1-Sn-核糖核蛋白；以及微丝聚集蛋白。恶性贫血组可以包括内因子；以及胃H/K ATP酶的糖蛋白β亚基。系统性红斑狼疮(SLE)的表位抗原可以包括DNA；磷脂；核抗原；U1核糖核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；钙网蛋白；Grp78；Scl-70；组蛋白；Sm蛋白；丝氨酸-精氨酸剪接因子以及染色质，等等。在格雷夫斯病中，表位可以包括Na⁺/I^-同向转运；促甲状腺素受体；Tg；以及TPO。

其他疾病

与非生理学存在于动物中的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽相关的其他疾病的一些实例列于下表并描述如下。

炎性疾病

骨关节炎和退行性关节病：骨关节炎(OA)影响年龄为60岁人的30％，并且是最常见的人关节病。骨关节炎表现为滑膜关节变性和衰退，并涉及关节软骨的损坏。

软骨主要由蛋白多糖和胶原质组成，蛋白多糖提供了硬度和承受负荷的能力，胶原质提供了张力和对纯粹强度的抗性。软骨细胞周转并重新塑造正常的软骨通过产生和分泌潜在活性胶原酶、潜在基质降解酶、潜在明胶酶、组织纤溶酶原激活剂和其他相关的酶，它们中每一个单独的或其组合是本发明的自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白。包括金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的一些抑制剂也通过软骨细胞产生，并且限制中性金属蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂和其他酶的降解活性。这些降解酶和抑制剂单独的或其组合是本发明的一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽。这些降解酶和抑制剂协同重新塑造和维持正常软骨。在OA中，该过程的调节异常导致软骨的变质和降解。大多数OA患者还具有某些程度的炎症，包括关节温热和肿胀。早期OA中在胶原纤维的排列和大小上有异常改变。金属蛋白酶、组织蛋白酶、纤溶酶和其他自身分子单独的或其组合是本发明的自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白，造成显著的软骨基质损失。最初增加的软骨细胞产生蛋白聚糖和软骨导致关节软骨比正常的厚。关节软骨随后由于降解酶的作用变薄变软，所述降解酶包括胶原酶、基质降解酶、明胶酶、组织型纤溶酶原激活剂和其他相关的酶，这些降解酶单独的或其组合是本发明的自身分子，如自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白。诸如IL-1、组织蛋白酶和纤溶酶的炎性分子促进软骨的变性和降解，这些炎性分子单独的或其组合是本发明的自身分子，如自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白。较薄和较软的软骨及易受物理应力的损伤。这些因子导致软骨表面的降解和垂直裂缝的形成(纤维性颤动)。软骨表面的侵蚀形成，并在末期疾病中延伸至骨。软骨细胞最初复制并形成群，在末期软骨是细胞过少的。骨改型和肥大是OA的显著特征。

OA的当前疗法包括休息、增强肌肉支撑关节，吊带和其他的支撑装置以稳固关节的物理治疗、非类固醇抗炎剂、醋胺酚和其他止痛剂。对日常生活行为紧要的关节(如膝盖或髋部)的骨上骨OA末期，进行外科关节复位。

脊髓损伤：据估计在美国每年有约11,000个脊髓损伤的新病例，目前在美国总的发病率为共183,000-230,000个病例(Stover et al.，ArchPhys Med Rehabil，80，1365-71，1999)。脊髓损伤的恢复非常困难，且导致破坏性的不可逆的神经残疾。急性脊髓损伤的当前治疗包括损伤部位的机械稳固，例如外科手术和肠胃外类固醇的给药。这些手术几乎很少能减少脊髓损伤后持久性瘫痪的发生率。慢性脊髓损伤的治疗集中在生活品质的维持，如疼痛、痉挛状态和膀胱功能的治疗。当前没有可用的治疗针对神经机能的恢复。在损伤后紧接着的急性期，炎症是主要的，与脊髓损伤相关的肿胀是发病率的主要原因。该炎症在高剂量的全身性皮质类固醇下被部分控制。

移植物抗宿主病：人组织和器官移植的最大限制之一是受者免疫系统的组织移植排斥。已经确立供者和受者之间的I类和II类MHC(HLA-A、HLA-B和HLA-DR)等位基因匹配越好，移植物存活越好。移植物抗宿主病(GVHD)导致接受含有异源造血细胞的移植物的患者的显著发病率和死亡率。这部分由于皮肤和其他靶器官的炎症。造血细胞存在于骨髓移植物、干细胞移植物和其他移植物。接受来自HLA匹配的同胞的移植物的患者中约50％发生中度至严重的GVHD，发病率比在非HLA匹配的移植物中高很多。发生中度至严重的GVHD患者的1/3的结果是死亡。供者移植物中T淋巴细胞和其他免疫细胞攻击受者细胞，所述受者细胞表达多肽在其氨基酸序列上的变体，尤其是蛋白变体，所述蛋白由人染色体6上的主要组织相容性复合物(MHC)基因复合物编码。在涉及异源造血细胞的移植物中对GVHD最有影响的蛋白是高度多态性(人之间的大量的氨基酸变化)的I类蛋白(HLA-A、HLA-B和HLA-C)和II类蛋白(DRB1、DQB1和DPB1)(Appelbaum，Nature 411：385-389，2001)。甚至当I类MHC等位基因在供者和受者之间是血清学上“匹配的”，DNA测序显示在提供I类指向的GVHD基础的病例中30％、甚至在匹配的供者-受者对中具有等位基因水平的错配(Appelbaum，Nature，411，385-389，2001)。GVHD经常引起皮肤、肠、肝、肺和胰腺的损伤。用糖皮质激素、环孢霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨和OKT3治疗GVHD。

组织移植排斥：包括肺、心脏、肝、肾、胰腺和其他器官和组织的组织移植物的免疫排斥由针对移植的器官的移植物受者的免疫反应介导。异源移植的器官包含蛋白与其氨基酸序列变体，所述变体相比于移植物受者的氨基酸序列。因为移植的器官的氨基酸序列不同于移植物受者的氨基酸序列，它们经常引发受者对移植的器官的免疫反应。免疫反应包括先天性和获得性免疫系统的反应，并在靶器官中以炎症为特征。移植的器官的排斥是组织移植的主要并发症和限制，并能引起在受者中移植的器官失败。由排斥引起的慢性炎症经常导致移植的器官功能异常。当前用多种免疫移植剂治疗移植受者以预防和抑制排斥。这些药剂包括糖皮质激素、环孢素A、骁悉、FK-506和OKT3。

免疫调节核酸和使用的方法 在某些实施方案中，本发明提供了药学上的组合物，包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中X和Y为任意天然存在或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；当嘧啶_[2]是胸腺嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶，当嘧啶_[1]是胞嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中X和Y为任意天然存在或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；当嘧啶_[2]是胸腺嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶，当嘧啶_[1]是胞嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的2核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中X和Y为任意天然存在或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；当嘧啶_[2]是胸腺嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶，当嘧啶_[1]是胞嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中X和Y为任意天然存在或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；当嘧啶_[2]是胸腺嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶，当嘧啶_[1]是胞嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的2核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中六聚物序列的X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的2核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的2核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中六聚物序列是GTGGTT，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中六聚物序列是GTGGTT，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的2核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中六聚物序列是GTGGTT，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：(i)六聚物序列5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’，其中六聚物序列是GTGGTT，以及免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的2核苷酸；以及(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2核苷酸；以及(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药学上的组合物包括：(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，其中所述免疫调节核酸是CCATGTGGTTATGGGT；以及(b)药学上可接受的载体。在某些实施方案中，药学上的组合物包括为寡核苷酸的本发明免疫调节核酸。在某些实施方案中，药学上的组合物包括被并入载体的本发明免疫调节核酸。在某些实施方案中，药学上的组合物包括被并入表达载体的本发明免疫调节核酸。

在某些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗疾病的方法，所述疾病与所述个体中与非生理学存在的一个或多个自身分子相关，所述方法包括给予所述个体本发明的免疫调节序列。在某些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗疾病的方法，所述疾病与所述个体中与非生理学存在的一个或多个自身分子相关，所述方法包括给予所述个体本发明的药学上的组合物。在某些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括给予所述个体本发明的免疫调节序列。在某些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括给予所述个体本发明的药学上的组合物。

一方面，本发明改进的免疫调节序列包括：

1)六聚物序列

5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’；

其中X和Y为任意天然存在或合成的核苷酸，除了

a.X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；

b.当嘧啶_[2]是胸腺嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶

c.当嘧啶_[1]是胞嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶

2)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及

3)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；

其中所述免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列。

作为选择，本发明改进的免疫调节序列包括：

1)六聚物序列

5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’；

其中X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤；

2)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及

3)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括a)2-10个邻接G，并且b)位于六聚物序列3’的2-10核苷酸；

其中所述免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列。

在本发明的某些实施方案中，六聚物序列的X和Y是GpG。在某些实施方案中，六聚物序列是5’-GTGGTT-3’。在某些实施方案中，CC二核苷酸位于六聚物序列5’的2核苷酸。在某些实施方案中，多聚G区包括3个邻接鸟嘌呤碱基，并位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。在某些实施方案中，改进的免疫调节序列是5’-CCATGTGGTTATGGG T-3’。

本发明的核心六聚物，在本文中被称为免疫调节序列基序，包括二核苷酸基序，其5’和/或3’可以侧翼连接任何组合物或任意数目的核苷酸或核苷。在一些实施方案中，包括一个或多个免疫调节序列的免疫调节核酸是大小为14-50、75-100、最通常为15-50个碱基对的寡核苷酸。免疫调节核酸也可以是更大片断的DNA，例如100-100,000个碱基对，并且可以是表达载体和例如其他质粒。可以构建侧翼于本发明免疫调节序列基序的序列，使其大体上匹配存在于任何已知免疫调节序列的侧翼序列。例如，具有序列TGACTGTG-CCNN-嘌呤-嘧啶-X-Y-嘧啶-嘧啶-NNGGG-AGAGATGA(其中N为任意核苷酸)的IMS包括侧翼序列TGACTGTG和AGAGATGA。另一优选的侧翼序列包括一连串嘧啶(C、T和U)，或者作为重复两次或多次单一嘧啶，或者作为两个或更长的不同嘧啶的混合物。不同的侧翼序列被用于试验的抑制性调节序列。抑制性核酸的侧翼序列的另外实例包含在如下参考文献中：美国专利第6,225,292和6,339,068号；Zeuner et al，Arthritis andRheumatism，46：2219-24，2002。

本发明特定的IMS包括如下六聚物序列：

1. 5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，其包含如下GG二核苷酸核心：GTGGTT、ATGGTT、GCGGTT、ACGGTT、GTGGCT、ATGGCT、GCGGCT、ACGGCT、GTGGTC、ATGGTC、GCGGTC、ACGGTC等等；

2. 5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，其包含如下GC二核苷酸核心：GTGCTT、ATGCTT、GCGCTT、ACGCTT、GTGCCT、ATGCCT、GCGCCT、ACGCCT、GTGCTC、ATGCTC、GCGCTC、ACGCTC等等；

3.鸟嘌呤和次黄嘌呤取代腺嘌呤，和/或尿嘧啶取代胞嘧啶或胸腺嘧啶，并且基于上述方针可进行这些取代。

前述免疫抑制序列或IIS显示抑制包含核心二核苷酸CpG的免疫刺激序列(ISS)。美国专利第6,225,292号。该IIS，在WO04/047734中显示在无ISS的情况下，单独的或与DNA多核苷酸疗法组合，预防或治疗自身免疫性疾病。该IIS包含具有序列AAGGTT的核心六聚物区域。包括在本发明的IMS内的具有类似基序其他相关的IIS是：

1. 5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，其包含如下GG二核苷酸核心：GGGGTT、AGGGTT、GAGGTT、AAGGTT、GGGGCT、AGGGCT、GAGGCT、AAGGCT、GGGGTC、AGGGTC、GAGGTC、AAGGTC等等；

2. 5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，其包含如下GC二核苷酸核心：GGGCTT、AGGCTT、GAGCTT、AAGCTT、GGGCCT、AGGCCT、GAGCCT、AAGCCT、GGGCTC、

AGGCTC、GAGCTC、AAGCTC等等；

3.鸟嘌呤和次黄嘌呤取代腺嘌呤，和/或尿嘧啶取代胞嘧啶或胸

腺嘧啶，并且基于上述方针可进行这些取代。

在本发明的某些实施方案中，所述IMS核心六聚物区域通过多聚G区域侧翼于所述5’或3’末端，或者同时位于该5’和3’末端。本文使用的“多聚G区域”或“多聚G基序”指由至少两(2)个邻接鸟嘌呤碱基组成的核酸区域，通常由2-30或2-20个邻接鸟嘌呤组成。在一些实施方案中，所述多聚G区域具有2-10、4-10或4-8个邻接鸟嘌呤碱基。在某些实施方案中，所述侧翼多聚G区域邻近(即邻接)于所述核心六聚物。在某些实施方案中，所述多聚G区域通过非多聚G区域(非多聚G连接子)与所述核心六聚物连接。在一些实施方案中，所述非多聚G连接子区域具有不超过6个、更典型地不超过4个和最典型地不超过2个核苷酸。

在本发明的某些实施方案中，所述IMS核心六聚物区域通过CC二核苷酸区域侧翼于所述5’或3’末端，或者同时位于该5’和3’末端。本文使用的“CC二核苷酸区域”或“CC二核苷酸基序”指包括2个邻接胞嘧啶碱基的核酸区域。在一些实施方案中，所述CC二核苷酸区域是长为2，3，4，5，6，7，8，9或10个核苷酸碱基，但可以更长。在某些实施方案中，所述侧翼CC二核苷酸区域邻近(即邻接)于所述核心六聚物。在某些实施方案中，所述CC二核苷酸区域通过非CC二核苷酸区域(非CC二核苷酸连接子)与所述核心六聚物连接。在一些实施方案中，所述非CC二核苷酸连接子区域具有约8，7，6，5，4，3或2个核苷酸。

免疫调节核酸可获自现有的核酸来源，包括基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA和cDNA。在某些实施方案中，免疫调节核酸是寡核苷酸合成产生的合成寡核苷酸。IMS能是单链或双链DNA、RNA和/或寡核苷酸的一部分。

免疫调节核酸优选地是具有一个或多个IMS区域的核酸，所述IMS区域包含未甲基化的GpG寡核苷酸。在可选择的实施方案中，IMS区域的一个或多个腺嘌呤或胞嘧啶残基被甲基化。在真核细胞中，胞嘧啶和腺嘌呤残基通常能被甲基化。

免疫调节核酸可以是稳定的和/或不稳定的寡核苷酸。稳定的寡核苷酸指在体内相对地抵抗降解的寡核苷酸，该降解通过核酸外切酶、核酸内切酶和其他降解途径进行。优选的稳定的寡核苷酸具有经修饰的磷酸盐骨架，并且最为优选的寡核苷酸具有硫代磷酸酯修饰的磷酸盐骨架，其中至少一种所述磷酸根氧由硫替代。骨架磷酸盐基团修饰包括磷酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键，其能向IMS提供抗菌特性。免疫调节核酸优选稳定的寡核苷酸，优选地使用硫代磷酸酯稳定的寡核苷酸。

可选择地，稳定的寡核苷酸包括：烷基磷酸三酯和磷酸二酯，其中带电氧被烷化；芳基磷酸酯和烷基磷酸酯，它们是非离子DNA类似物，其中带电磷酸根氧由芳香基或烷基替代；或/和在一端或两端含六聚乙二醇或四聚乙二醇、或另一个二醇的寡核苷酸。可使用可选择的空间构型将糖部分附于IMS区域的核苷碱基上。

侧翼于所述调节二核苷酸的IMS区域的核苷酸碱基可以是已知天然存在的碱基或合成的非天然碱基。使用常规技术可以将寡核苷酸并入所述IMS-ON的内部区域和/或端部作为其他化合物的附着点，即作为附着或连接包括自身分子的其他分子的手段，或作为另外的免疫调节治疗剂的附着点。还可以以本领域普通技术人员公知的任何方式修饰该IMS-ON的一个或多个碱基、糖部分、磷酸盐基团和/或端部，以构建具有除IMS-ON的调节性活性之外的所需性质的IMS-ON。例如，糖部分可以以任何空间构型连接于IMS-ON的核苷酸碱基。

对寡核苷酸进行这些磷酸盐基团修饰的技术为本领域公知，并不需要详细的解释。为回顾这样的有用技术，制备用作靶核苷酸产物的磷酸三酯中间体，并且使用含水碘或诸如无水胺的其他试剂将其氧化为天然存在的磷酸三酯。产生的寡核苷酸氨基磷酸酯可使用硫处理以产生硫代磷酸酯。可以应用同样的常规技术(除硫处理步骤之外)以从磷酸甲酯产生甲基亚磷酰胺。关于磷酸基团修饰技术的更多细节，本领域技术人员可参考美国专利第4,425,732、4,458,066、5,218,103和5,453,496号；和Tetrahedron Lett，at 21：414925(1995)，7：5575(1986)和25：1437(1984)；以及Journal Am.ChemSoc.，93：6657(1987)，其公开内容出于说明本领域关于免疫调节核酸的组合物和制备的知识水平的目的被并入本文。

特别有用的磷酸盐基团修饰是转化为该IMS-ON寡核苷酸的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯形式。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯较之其未经修饰的寡核苷酸对应物，在体内更能抵抗降解，这使所述宿主更能获得本发明的IMS-ON。

使用本领域公知的技术和核酸合成设备能够合成IMS-ON寡核苷酸。有关参考文献参见，例如，Ausubel，et al，Current Protocols inMolecular Biology，Chs.2 and 4(分子生物学现行规范，第2和4章)(Wiley Interscience，1989)；Maniatis，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(Cold Spring Harbor Lab.，New York，1982)；美国专利第4,458,066号；和美国专利第4,650,675号，这些参考文献出于说明本领域关于合成寡核苷酸的产生的知识水平的目的通过引用并入本文。

可选择地，通过突变分离的微生物ISS-ODN以用竞争性二核苷酸取代所述天然存在的CpG基序和侧翼核苷酸能够获得IMS-ON。依赖核酸杂交的筛选步骤实现了从任何有机体分离任何多核苷酸序列，前提是能获得所述合适的探针或抗体。能够化学合成寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针对应编码所述蛋白的序列的一部分。这需要已知氨基酸序列的寡肽小段。还能从遗传密码推导编码该蛋白的DNA序列，尽管必须考虑所述密码子的简并度。

例如，可以筛选cDNA文库，所述cDNA文库据信包括含ISS的多核苷酸，所述筛选通过向卵母细胞注射源自cDNA的各种mRNA，留出足够时间，使所述cDNA基因产物开始表达，并通过测试所需cDNA表达产物的存在而完成，所述测试例如，通过使用特异于所关注多核苷酸编码的肽的抗体，或者通过使用针对由所关注多核苷酸编码的肽的重复基序和组织表达类型特征的探针。可选择地，使用特异于该肽的抗体可以间接筛选cDNA文库，寻找所关注的具有至少一种表位肽的表达。所述抗体可以是多克隆来源的或单克隆来源的，并且可用于检测表达产物，该表达产物指示所关注cDNA的存在。

一旦获得所述包含ISS的多核苷酸，便可以使用常规技术通过例如酶消化将其缩短至所需的长度。随后将该ISS-ODN寡核苷酸产物内的CpG基序突变以用“抑制性”二核苷酸(使用本发明方法鉴定的)取代该CpG基序。公知在具有已知序列DNA内的特定位点进行取代突变的技术，例如通过PCR的M13引物诱变。该IMS是非编码的，因此进行取代突变时，无需关心维持开放阅读框。然而，为在体内使用，应给予基本上纯的该多核苷酸起始材料、ISS-ODN寡核苷酸中间体或IMS突变产物(即使用本领域普通技术人员公知和选择的可获得的技术时，尽可能不含天然存在的污染物和LPS)。

本发明的免疫调节核酸可以包含单独的IMS，或如下IMS：其被以顺式或反式与其他核苷酸区域诸如例如并入重组自身载体(质粒、粘粒、病毒或反转录病毒)，接着可以编码由重组表达载体递送的任何一个或多个自身蛋白、自身多肽或自身肽。在某些实施方案中，给予未并入载体的该IMS。在某些实施方案中，IMS被并入载体，诸如例如表达载体，这可用例如本领域技术人员公知的常规技术实现(参见，例如Ausubel，Current Protocols in Molecular′Biology，上述)。

例如，重组表达载体的构建使用标准连接技术。为了分析证实构建的载体正确的序列，连接混合物被用于转化宿主细胞，成功的转化体通过合适的抗生素抗性进行选择。来自转化体的载体被制备，并通过限制性和/或测序分析，例如通过Messing，et al.，Nucleic Acids Res.，9：309，1981中的方法，Maxam，et al，Methods in Enzymology，65：499，1980中的方法，或本领域技术人员公知的其他适合的方法。切割片断的大小分离的进行使用常规的凝胶电泳，例如Maniatis，et al.，Molecular Cloning，pp.133-134，1982中所描述的。

宿主细胞被本发明的表达载体转化，并在常规的营养培养基中培养，所述培养基被改良以适于诱导启动子、选择转化体或扩增基因。诸如温度、pH等的培养条件是选择表达的宿主细胞先前使用的，并对普通技术人员是显而易见的。

如果重组载体被用作本发明IMS-ON的载体，质粒和粘粒由于它们缺乏致病性是特别优选的。然而，质粒和粘粒比病毒易经受更快速的体内降解，因此不能递送足够剂量的IMS-ON以预防或治疗炎性疾病或自身免疫性疾病。

在相关方面，提供了核酸载体，其中非CpG二核苷酸被取代为化学式为5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’的一种或多种CpG二核苷酸，由此产生IIS相关的免疫刺激性活性降低的载体。这样的载体例如用于如下方法中：给予免疫调节核酸和/或给予编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的自身载体。例如，CpG二核苷酸的胞嘧啶可用鸟嘌呤取代，因而产生化学式为5’-嘌呤-嘧啶-G-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-G-G-嘧啶-嘧啶-3’的具有GpG基序的IMS区域。该胞嘧啶还可用其他任何非胞嘧啶核苷酸取代。可以使用，例如定位突变完成所述取代。通常，被取代的CpG基序是没有定位于该载体重要控制区域(例如，启动子区域)的CpG。此外，如果CpG位于表达载体的编码区域内，通常选择非胞嘧啶取代以产生沉默突变或对应于编码的氨基酸的保守取代的密码子。

例如，在某些实施方案中，提供修饰的pVAX1载体，其中化学式为5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’的一种或多种CpG二核苷酸通过用非胞嘧啶核苷酸取代该CpG二核苷酸的胞嘧啶而发生突变。所述pVAX1载体为本领域公知，并且可从Invitrogen(Carlsbad，CA)商购。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的pVAX1载体在CpG基序内具有下列胞嘧啶向非胞嘧啶的取代：

在核苷酸784、1161、1218和1966，胞嘧啶向鸟嘌呤；

在核苷酸1264、1337、1829、1874、1940和1997，胞嘧啶向腺嘌呤；以及

在核苷酸1963和1987，胞嘧啶向胸腺嘧啶；

另外有在核苷酸1831、1876、1942和1999，胞嘧啶向鸟嘌呤的突变。(前述核苷酸编号指定根据Invitrogen提供的pVAX1的编号系统。)(参见下文实施例3。)

在所述方法和组合物的一些实施方案中，会用到如本文所描述的许多(即两个或多个)免疫抑制序列。许多IMS或IIS分子可分别地或例如一前一后或连续地连接到一起被给药或配制。两个或多个免疫抑制序列能是相同或不同的序列，并能被一起连接到相同的分子。在一个实施方案中，IMS或IIS包括两个或多个M49序列。在一个实施方案中，IMS或IIS包括两个或多个I18序列。

IMS的功能特性

存在一些解释IMS的免疫调节特性的机制，这些包括不依赖ISS(CpG)-介导的免疫刺激的机制。

本文使用的“免疫反应的调节、调节或改变免疫反应”指对针对自身分子的现存的或潜在的免疫反应的任何改变，所述自身分子包括但不限于核酸、脂质、磷脂、糖类、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽、自身肽、蛋白复合体或核蛋白复合体，或它们的衍生物，所述改变是给予免疫调节核酸的结果。所述调节包括对任何免疫细胞的存在、能力或功能的改变，所述免疫细胞参与或能够参与免疫反应。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、NK T细胞、专职抗原呈递细胞、非专职抗原呈递细胞、炎性细胞或能够参与或影响免疫反应的任何其他细胞。调节包括对现存免疫反应、正在发展的免疫反应、潜在的免疫反应造成的任何变化，或引发、调控、影响或反应免疫反应的能力。调节包括对作为免疫反应一部分的免疫细胞内基因、蛋白和/或其他分子的表达和/或功能的改变。

免疫反应的调节包括但不限于：免疫细胞的清除、删除或隔离；免疫细胞的诱导或产生，所述免疫细胞能调节诸如自身反应性淋巴细胞、APC或炎性细胞的其他细胞的功能性能力；免疫细胞无反应状态的引发(即无反应性)；免疫细胞活性或功能的提高、降低或改变或者这样的能力，包括但不限于所述细胞表达的蛋白类型的改变。实例包括某些种类的分子的经改变的生产和/或分泌，所述分子例如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、协同刺激分子或其他细胞表面受体；或者所述调节性事件的任意组合。

免疫反应的特征为产生包括IL-12和IFNγ的细胞因子的T辅助细胞和免疫反应，并与产生某些同种型抗体(在小鼠中通常为IgG2a；在人中通常为IgG1和IgG3)的B细胞相关。Th1型免疫反应在自身免疫型疾病中起主要作用，并与自身免疫介导的组织损伤相关。相反，Th2免疫反应的特征为产生包括IL-4和IL-10的细胞因子的T辅助细胞和免疫反应，并与产生某些同种型抗体(在小鼠中通常为IgG1；在人中通常为IgG2和IgG4)的B细胞相关。Th2型免疫反应与防止啮齿动物和人自身免疫中的自身免疫介导的组织损伤相关。

免疫调节核酸能调节免疫反应，其通过清除、隔离或断开调节或能够调节不希望免疫反应的免疫细胞；诱导、产生或开启调节或能够调节保护性免疫反应的免疫细胞；改变免疫细胞的生理性或功能特性(如抑制Th1型免疫反应和/或诱导Th2型免疫反应)；或这些效果的组合。测量免疫反应的调节的实例包含，但不限于，检验免疫细胞群的存在与否(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微术、聚合酶链式反应)；测量免疫细胞功能性能力，其包括在响应信号时增殖或分裂的能力或抵抗力(例如使用基于3H-胸苷掺入跟踪刺激的T细胞增殖试验和肽扫描分析，其使用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、PMA、装有肽或蛋白抗原的抗原呈递细胞；B细胞增殖试验)；测量杀死或裂解其他细胞的能力(例如细胞毒性T细胞试验)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验、蛋白印记分析、蛋白微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞活化生化标志物或免疫细胞内的信号传导通路(对酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割和蛋白复合体形成或解离的蛋白印记和免疫沉淀分析；蛋白阵列分析；使用DNA阵列或差减杂交的DNA转录图谱)；测量凋亡、坏死或其他机制导致的细胞死亡(测量DNA梯状条带、组织学的微管连接蛋白V染色、TUNEL试验、凝胶电泳；荧光caspase试验，caspase底物的蛋白印记分析)；测量免疫细胞产生的基因、蛋白和其他分子(Northern印记分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白微阵列、双向凝胶电泳、蛋白印记分析、酶联免疫吸附试验、流式细胞术)；测量临床后果，例如对自身免疫性疾病、神经退化性疾病、和其他疾病后果的改善(临床评分、使用附加疗法的要求、功能性状态、图像研究)。

其他研究者进行实验以评价IIS的作用机制。那些研究者证实中和或抑制性IIS(GpG)基序阻断ISS(CpG)免疫刺激(Krieg et al，PNAS，95：12631，1998；美国专利第6,225,292和6,339,068号)。那些实验中的IISs被用于中和、抑制、竞争或克服ISS(来自这样的来源：细菌、病毒、寄生虫和诸如在DNA疫苗或基因疗法中的给定来源的DNA)的作用。已经表明ISS和IIS进入同样的细胞，提示IIS抑制ISS的一个机制是通过在相同细胞内的直接竞争(Yamada et al.，J.Immunology，2002，169：5590)。

给药方法

免疫调节核酸被制备为包括药学上可接受的载体的组合物。优选的用于本发明免疫调节核酸的药学上可接受的载体包括无菌水或无水溶液、悬浮液和乳剂。无水溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，诸如橄榄油的植物油，以及诸如油酸乙酯的可注射有机酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、林格(Ringer′s)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格或非挥发油。静脉内赋形剂包括液体和营养补充物、电解液补充物(如基于林格葡萄糖的那些)等。还存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。还可以使用本领域公知的方法冻干免疫调节核酸的组合物，用于随后本发明的再溶解和应用。免疫调节核酸能被混和入药学上的组合物，其包含多个拷贝的单一IMS、不同IMS的组合、每个以相同的相对摩尔浓度存在的IMS的组合、每个以不同的相对摩尔浓度存在的IMS的组合，或者单一的和/或不同的IMS，其被并入重组表达载体质粒、线性多核苷酸、病毒和病毒载体、细菌和其他含有寡核苷酸的活的、灭活的或合成的组合物。

本发明的免疫调节核酸能配制成用作药物的多核苷酸盐。可以使用非毒性无机或有机碱制备免疫调节核酸。无机碱盐包括钠、钾、锌、钙、铝、镁等等。有机非毒性碱包括一级胺盐、二级胺盐和三级胺盐等。能以冻干形式配制该免疫调节核酸，递送前再溶解，例如无菌水或盐溶液。可选择地，能在溶液、悬浮液或包含用于递送的水基或油基载体的乳剂中配制免疫调节核酸。免疫调节核酸能被冻干，随后在给药前使用无菌水再溶解。

本领域技术人员公知，存在将核酸递送给个体的广泛多样的方法。在一些实施方案中，免疫调节核酸作为裸核酸被给药。例如，在某些实施方案中，病毒颗粒(例如腺病毒颗粒，参见例如Curiel et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol，6：247-52，1992，上述)与裸核酸在给药前混和以产生含有病毒颗粒的制剂，其不封装核酸但仍促进核酸的递送。在某些实施方案中，免疫调节核酸与分子封装或复合，所述分子结合至核酸，诸如例如阳离子物质(例如，DEAE-葡聚糖或阳离子脂质)。例如，脂质体代表配制和递送寡核苷酸和/或自身多核苷酸的有效手段。参见Pack，et al.(2005)＂Design and Development of Polymers for GeneDelivery(设计和开发用于基因递送的聚合物)＂Nature Drug Discovery4：581-493。在某些实施方案中，免疫调节核酸被并入病毒载体、病毒颗粒或细菌用于药理学递送。病毒载体能是减毒的(具有降低诱导疾病能力的突变)或复制缺陷的感染组分。在一些实施方案中，核酸被偶联到固体载体，包括金颗粒、基于多糖的支持物，或能通过颗粒轰击(基因枪递送)被注射、吸入或递送的其他颗粒或珠。

本领域已知用于递送核酸制剂的方法。参见，例如，美国专利第5,399,346、5,580,859和5,589,466号。已开发了大量基于病毒的系统，用于转移至哺乳动物细胞。例如，已描述了反转录病毒系统(美国专利第5,219,740号；(Miller et al，Biotechniques 7：980-990，1989；Miller，Human Gene Therapy 1：5-14，1990；Scarpa et al，Virology 180：849-852，1991；Burns et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037，1993)；和(Boris-Lawrie and Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109，1993)。还已经描述了大量腺病毒载体，参见，例如，(Haj-Ahmad et al.，J.Virol.57：267-274，1986；Bett et al，J.Virol.67：5911-5921，1993；Mittereder etal，Human Gene Therapy 5：717-729，1994；Seth et al，J.Virol.68：933-940，1994；Barr et al，Gene Therapy 1：51-58，1994；Berkner，BioTechniques6：616-629，1988；以及Rich et al，Human Gene Therapy 4：461-476，1993)。也已开发出腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。使用本领域公知技术可容易地构建AAV载体。参见，例如，美国专利第5,173,414和5,139,941号；国际公开号WO92/01070(1992年1月23日公布)和WO 93/03769(1993年3月4日公布)；Lebkowski et al，Molec.Cell.Biol.8：3988-3996，1988；Vincent et al，Vaccines 90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)1990；Carter，B.J.，Current Opinion inBiotechnology 3：533-539，1992；Muzyczka，N.，Current Topics inMicrobiol.And Immunol.158：97-129，1992；Kotin，R.M.，Human GeneTherapy5：793-801，1994)；Shelling et al.，Gene Therapy 1：165-169，1994；和Zhou etal.，J.Exp.Med.179：1867-1875，1994)。

本发明IMSs也能在无载体的情况下被递送。例如，所述分子在递送给个体前被包装在脂质体中。通常使用能稳固结合或捕获及保留核酸的脂质体实现脂质封装。脂质体作为递送核酸的载体的应用的综述参见(Hug et al，Biochim.Biophys.Acta.，1097：1-17，1991)；Straubingeret al.，in Methods of Enzymology，Vol.101，pp.512-527，1983)。例如，本发明使用的脂质包括但不限于DOPE(二油酰基脑磷酯)、胆固醇和CUDMEDA(N-(5-胆固醇-3-醇3尿烷基)-N′，N′-二甲基乙基烯二胺)。作为实例，DNA能在含有下列阳离子脂质体制剂之一的溶液中递送：Lipofectin^TM(LTI/BRL)、Transfast^TM(Promega Corp)、Tfx50^TM(PromegaCorp)、Tfx10^TM(Promega Corp)或Tfx20^TM(Promega Corp)。还参见Pack，et al.(2005)＂Design and Development of Polymersfor Gene Delivery(设计和开发用于基因递送的多聚物)＂Nature Drug Discovery 4：581-493。

免疫调节核酸的“治疗有效量”根据本发明的教导被给药，并足以治疗或预防疾病，例如，通过改善或去除疾病的症状和/或病因。例如，治疗有效量落在广泛的范围内，并且由临床试验所决定，同时对每一位特殊的病人而言，其由有经验的临床医师公知的因素决定，包括疾病的严重性、患者体重、年龄和其他因素。治疗有效量的免疫调节核酸为约0.001μg到约1g的范围。优选的治疗量的免疫调节核酸为约5μg至约1000μg的范围。最为优选的治疗量的免疫调节核酸为约50-200μg的范围。免疫调节核酸治疗的递送在进行的基础上可以每天一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、或每月一次。如果与编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸疗法联合递送，那么治疗方案可在不同时期，如6-12个月，随后每3-12个月，以维持剂量给药。根据疾病的严重性、患者年龄、给予的编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的寡核苷酸和/或多核苷酸，以及普通治疗医师会考虑的此类其他因素，可以开发可选择的治疗方案。

在某些实施方案中，通过肌肉内注射递送免疫调节核酸。在某些实施方案中，所述免疫调节核酸的递送通过鼻内、口服、皮下、皮内、静脉内、按压穿过皮肤、眼内、关节内、叶鞘内、直肠内、粘膜，或者将其附着于金粒以递送到或穿过真皮(参见，例如WO 97/46253)。可选择地，可以通过使用或不使用脂质体或带电脂质的局部施用将核酸递送进皮肤细胞(参见，例如，美国专利第6,087,341号)。然而另一种选择是将该核酸作为吸入剂递送。在包括给予免疫调节核酸和编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的组合疗法的情况下，免疫调节核酸和多核苷酸可以在相同位点，或在不同位点，以及同时或在不同时间给药。

在递送免疫调节核酸之前，可以预处理该递送位点，其通过使用布比卡因(bupivicane)、心脏毒素或可能增强随后的多核苷酸治疗递送的其他试剂。此类预处理方案的递送通常在递送治疗性多核苷酸前12-96小时进行；更为频繁地，在递送治疗性免疫调节核酸前24-48小时进行。可选择地，IMS疗法之前不进行预处理。

免疫调节核酸和/或包括编码一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的自身载体能与其他物质组合或与编码细胞因子的载体的递送结合给药，所述其他物质如药理学上的药剂、佐剂、细胞因子、自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽、糖蛋白、基于DNA的疗法。

在本发明某些实施方案中，免疫调节核酸与其他疗法组合给药。这样的疗法能包括例如给予的免疫调节核酸与自身分子组合，所述自身分子包括但不限于编码表1所述的自身分子的DNA，例如在多核苷酸疗法的情况下(参见，美国专利申请公开20030148983)；与如下物质组合：自身脂质、一个或多个自身抗原、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身糖类、自身糖蛋白，和翻译后修饰的一个或多个自身蛋白、肽、多肽或糖蛋白，或用于治疗自身免疫性疾病的其他治疗性化合物。在某些实施方案中，免疫调节核酸与多核苷酸疗法组合被给予SLE患者，所述多核苷酸疗法使用与表1所述的与SLE相关的一个或多个自身分子。在某些实施方案中，本发明免疫调节核酸与用于治疗狼疮的药物组合被给予SLE患者，所述药物包括但不限于：非类固醇抗炎药物(NAIDS)；抗疟药、皮质类固醇、细胞毒素和免疫抑制剂。在某些实施方案中，被给予SLE患者的免疫调节核酸是I18。在某些实施方案中，免疫调节核酸与多核苷酸疗法组合被给予多发性硬化患者，所述多核苷酸疗法使用与表1所述的与多发性硬化相关的一个或多个自身分子。在某些实施方案中，免疫调节核酸与用于治疗多发性硬化的药物组合被给予多发性硬化患者，所述药物包括但不限于：α-干扰素、β-干扰素和Copaxone。在某些实施方案中，被给予多发性硬化患者的免疫调节核酸是I18。在某些实施方案中，免疫调节核酸与多核苷酸疗法组合被给予胰岛素依赖的糖尿病患者，所述多核苷酸疗法使用与表1所述的与胰岛素依赖的糖尿病相关的一个或多个自身分子。在某些实施方案中，被给予胰岛素依赖的糖尿病患者的免疫调节核酸是I18。

对本发明的进一步了解可通过参考下述示例性实施方案的描述。

实施例1：IMS在人外周血单核细胞(hPBMC)中抑制CpG-ODN诱导的细胞增殖和细胞因子产生

进行系列实验以证实IMS能抑制PBMC响应包含寡核苷酸的CpG(CpG-ODN)。抑制刺激性CpG-ODN直接作用于人B细胞和类浆细胞树突细胞(pDC)，刺激B细胞中IL-6和IL-10的增殖和分泌，及pDC的IFN-α产生(Hartmann et al.，PNAS 96：9305；Krug et al.，Eur.J.Immunol.31：2154；Vollmer et al.，Eur.J.Immunol.34：251；Fearon et al.，Eur.J.Immunol.33：2114；Marshall et al.，J.Leuk.Biol.73：781；Hartmann et al.，Eur.J.Immunol.33：1633)。此外，在PBMC培养物中，“旁观”细胞(单核细胞、NK细胞、巨噬细胞)响应由B和pDC细胞产生的细胞因子，并产生另外的免疫调节剂(Hornung et al.，J.Immunol.168：4531；Krug et al.，Eur.J.Immunol.31：2154；Krieg，Ann.Rev.Immunol.20：709；Kranzer，Immunol.99：170)。

列于表2的IMS组被合成，并检测抑制这些CpG-ODN刺激的反应的能力。所有IMS包含核心＂RYGGYY＂基序的至少一个拷贝，并且在长度上(约14-42个碱基)及在侧翼于该核心基序的碱基的序列一致性上变化。一些寡核苷酸包含多聚G序列，其具有形成寡核苷酸多体或四重G的潜能(Gursel et al.，J.Immunol.171：1393；Petraccone et al.，International J.Biol.Macromolecules 31：131；Wu et al.，J.Biol.Chem.279：33071；Lee et al.，NAR 8：4305；Phillips et al.，J.Mol.Biol.273：171)。大多数寡核苷酸具有完全硫代磷酸化的骨架，而其他被部分硫代磷酸化，在寡核苷酸5’和3’端具有一些修饰的碱基，如表2所示。

表2

 

IMS ID	IMS序列
			RYGGYY类
I1	T*C*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊C*C*T*G*A*C*C*A*T*
		I5	G*G*T*G*C*A＊T＊G＊G＊T＊T*G*C*A*G*
I6	T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T*T*T*G*G*C*C*T*T*T*T*G*G*C*C*
		I7	T*G*A*C*T*G*T*G*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*C*A*G*A*T*G*A*
I19	C*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*T*T*T*
		I20	C*T*G*T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*G*A*G*A*
I18.5	C*C*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*T*
		I18.13	C*C*T*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*T*GG*T*
I18.17	C*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*T*G*G*T*

 

IMS ID	IMS序列
		118.18	C*C*A*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*T*G*G*T*
GpG.1	T*G*A*C*T*G*T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*G*A*G*A*T*G*A*
		GpG.2	C*T*G*T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*G*A*G*A*
GpG.3	C*T*C*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*G*A*G*
		GpG.4	C*T*C*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊C*C*C*C*
GpG.5	G*A*G*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*G*A*G*
		GpG.6	G*A*G*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊C*C*C*C*
GpG.7	C*C*G*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*C*G*G*
		GpG.8	T*G*G*C*G＊T＊G＊G＊C＊C＊T*G*G*C*
GpG.9	A*A*A*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊C*C*C*C*
		GpG.10	A*A*A*A*G＊T＊G＊G＊C＊C＊T*T*T*T*    ．
GpG.11	A*A*AAGTGGCCTTT*T*
		GpG.12	A*A*A*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*A*A*A*
GpG.cc	T*G*A*C*T*G*T*G*G＊T＊G＊G＊C＊C＊A*G*A*G*A*T*G*A*
		I41	C*C*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊C*C*T*
	多聚G+RYGGY类
		I2	T*T*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊C*C*T*G*A*C*C*A*G*G*G*G*G*
I3	A*T*T*A*T*G*G*G*G*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊T*T*C*C*A*C*A*C*C*C*C*G*G*G*G*G*
		I4	A*T*T*A*T*G*G*G*G*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*T*T*C*C*A*C*A*C*C*C*C*
I11	A*T*T*A*T*GGGGTGTGGTTTTCCACACCCCG*G*G*G*G
		I13	T*G*A*C*T*G*T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*G*A*G*A*T*G*G*G*T*
I14	T*G*A*C*T*G*T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*G*A*G*A*T*G*G*G*T*T*T*T*G*G*G*T*
		I16	T*G＊T＊G＊G＊T＊T*ACAG＊T＊G＊G＊T＊TGTG＊G＊T＊T＊G*G*G*G*
I17	C*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*T*G*G*G*G*
		I18	C*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*G*T*
I21	T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T＊T*T*G*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
		I23	G*G*TGCAT＊G＊G＊T＊TGCA G*G*G*G*G*G*
I27	C*C*T*C*A＊T＊G＊G＊T＊T*G*A*G*G*G*G*
		I28	G*G*G*G*C*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*G*G*
I29	T*G*C*T*G*C*A*C*A＊T＊G＊G＊T＊T＊G*A*G*G*G*G*
		I30	G*G*G*G*G*G*T*G*C*T*G*C*A*C*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊C＊A*G*G*G*G*G*G*
I31	C*C*T*C*A＊T＊G＊G＊C＊C＊A*A*G*G*G*G*
		I33	T*G*G*G*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*G*T*
I36	C*C*A*C*G＊T＊G＊G＊C＊C＊A*T*G*G*G*T*
		I39	C*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*G*T*
I40	T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T＊G*G*G*T*
		I18.2	C*C*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*G*T*
I18.3	T*C*C*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*G*T*
		I18.4	T*G*G*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*G*T*
I18.6	C*C*GTGGTTGG*G*T*
		I18.7	C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C＊T*G*G*G*T*
I18.8	A*A*A*G＊T＊G＊G＊C＊C＊T*G*G*G*T*
		I18.9	C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C＊T*G*G*G*T*

 

IMS ID	IMS序列
		I18.10	C*C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C＊T*G*G*G*T*
I18.11	C*C*A*GTGGCCTGG*G*T*
		I18.14	A*A*AAGTGGCCTTTGGGTC*C*
I18.15	C*C*A*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*T*G*G*G*T*
		I18.16	G*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*T*G*G*G*T*
I18.19	A*A*A*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊A*T*G*G*G*T*
			多个RYGGYY基序
I8	T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*C*A*G＊C＊G＊G＊T＊T*G＊T＊G＊G＊C＊C*
		I9	T*G*G*T*G*G*T*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*C*A*G＊T＊G＊G＊T＊T*G＊T＊G＊G＊C＊C*
I10	T*G*G*T*G*G*T*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*C*A*G＊T＊G＊G＊T＊T*
		I12	T*G＊T＊G＊G＊TTACAGCGGTTGTG＊G＊T＊T
I15	T*G＊T＊G＊G＊T＊T*ACAG＊T＊G＊G＊T＊TGTG＊G＊T＊T＊
		I22	T*G*G＊T＊G＊G＊T＊T＊T*T＊G＊T＊G＊G＊T＊T*T*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊
I26	G*G*T*T*G*G*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊G*G*A*C*A*G＊T＊G＊G＊T＊T＊G*T*T*G*G*T*T*G*G*T*G＊T＊G＊G＊T＊T＊G*G*
		I34	T*G*G*T*G*G*T*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C*G＊T＊G＊G＊C＊C*
I37	T*G*C*T*G*C*T*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C*G＊T＊G＊G＊C＊C*
			多个RYGGYY基序+多聚G
I35	T*G*G*T*G*G*T*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C*T*G＊G*G*T*
		I38	T*G*C*T*G*C*T*G＊T＊G＊G＊C＊C*A*C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C*G＊T＊G＊G＊C＊C*T*G*G*G*T*
I42	C*C*A*GTGGCCCAGTGGCCTGG*G*T*
		I43	C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C*C*A*G＊T＊G＊G＊C＊C＊T*G*G*G*T*
	RYGGYY+G-四联体
		I24	C*C*A*T*G＊T＊G＊G＊T＊T*A*T*G*G*T*G*T*G*G*T*G*T*G*G*T*G*T*G*G*
I25	T*G*G*T*G*G*T*G＊T＊G＊G＊C＊C＊T＊G*G*T*G*T*G*G*T*G*T*G*G*T*G*T*G*G*

从Stanford血库的健康供者分离人PBMC。柠檬酸葡萄糖被用作抗凝血剂和白血球富集血沉棕黄层(约30mls)。在三个50ml锥形瓶的10mls中，每个血沉棕黄层用PBS 1:4稀释，以8mls的IsoPrep(1.077g/ml，pH6.8，9.6％w/v甲泛影钠，5.6％w/v多糖)铺于其下，不破碎的情况下室温400g离心30分钟。分裂间期细胞(淋巴细胞和单核细胞)被转移至新的50ml锥形管，补充PBS，混合并在室温200g离心10分钟。移除上清液，并重复洗涤步骤。最终的细胞沉淀被重悬浮在5mls珠缓冲液(PBS pH7.2，0.5％ BSA，2mM EDTA)，所述细胞用ViCell(Beckman-Coulter)计数，并培养在具有10％ FBS的RPMI-1640。

为测定IMS是否能抑制CpG ISS ODN对细胞增殖的刺激，将PBMC与单一的IMS或存在5μg/ml ISS ODN的情况下剂量逐渐增加的IMS一起孵育4天。在孵育的最后24小时期间通过测定[³H]胸腺嘧啶掺入分析细胞增殖。IMS ODN(在5μg/ml剂量约15-70％抑制，图1a，b)之间的抑制效力显著不同，且剂量从1至25μg/ml逐渐增加的所测试的IMS增加了对ISS增殖性反应的抑制。

为了描述IMS对CpG-ODN刺激的细胞因子产生的作用，将hPBMC与所示浓度的IMS和刺激物CpG-ODN孵育48小时，通过ELISA分析培养基中的细胞因子水平。如图2所示，IMS以剂量依赖的方式抑制CpG刺激的IL-10和IL-12表达。相反，IMS通常增强CpG诱导的IFN-γ表达，尤其是在25μg/ml剂量，然而观察到不同的IMS影响。尽管IMS I18通常抑制CpG对IFN-α的诱导，IMS如GpG.1增强表达(图2c，d)。

I18和GpG.1除了抑制CpG刺激的免疫反应，还抑制在PBMC培养物中ConA依赖的细胞增殖和多聚I：C刺激的IFN-α表达(图3)。ConA直接作用于T细胞，已显示多聚I：C诱导IFN-α在人单核细胞子集中的表达。已公布的数据提出这些细胞不表达功能性TLR9受体(Hornung et al.，J.Immunol.168：4531)，提示了本发明IMS以TLR9非依赖性方式影响免疫反应，这与小鼠免疫细胞中公布的结果一致(Shirota et al.，J.Immunol.173：5002)。

发表的研究证实硫代磷酸化的非CpG ODN具有类似于CpG ODN特性的免疫刺激性特性。特别地，这些寡核苷酸能引起B细胞激活，导致B细胞增殖和IL-6与IL-10的分泌(Vollmer et al.，Immunol.113：212；Liang et al.，J.Clin.Invest.98：1119；Vollmer et al.，2002，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.12：165-75)。为了测定本发明IMS是否能在PBMC培养物中刺激这些作用，我们将细胞在没有CpG-ODN的情况下与浓度逐渐增加的IMS一起孵育。增殖(图5)和IL-6、IL-10和IFN-γ产生的分泌都被>25μg/ml的IMS刺激(图4a，b，d)。相反，在使用的任何寡核苷酸浓度没有观察到对IFN-α的诱导。

实施例2：IMS-ODN抑制体内CpG ODN诱导的细胞因子和趋化因子产生

为了测定IMS-ODN是否能在体内抑制CpG-ODN作用，给小鼠注射CpG和IMS寡核苷酸的混合物。为了测试IMS作用的体内动力学，将50μg的I18经腹膜内注射入4组小鼠(D0-D3；n＝3)。在组1(D0)，将刺激物CpG-ODN(mCpG)与I18同时注射；在组2(D1)，注射I18后24小时注射刺激物CpG-ODN(mCpG)；在组3(D2)，注射I18后48小时注射刺激物CpG-ODN(mCpG)；在组4(D3)，注射I18后72小时注射刺激物CpG-ODN(mCpG)。注射后24小时，血清被采集，并用ELISA分析促炎蛋白IL-12和MCP-1的表达。图6证实在1:1和1:3质量比的IMS:CpG ODN都观察到对IL-12的显著抑制。也观察到对MCP-1水平的显著抑制(数据未显示)。

实施例3：IMS生物效应在体内持续几天

体外研究显示一些IMS对CpG-ODN的抑制效应能持续16小时(Stunz et al.，Eur.J.Immunol.32：1212)。为了测试IMS作用在体内的持续性，在第0天给小鼠注射IMS，随后在第1、2或3天注射刺激物CpG ODN。CpG注射后24小时，采集血清，并测量IL-12。图6证实在第0天注射的IMS仍抑制3天后注射的CpG的作用。

实施例4：IMS在SLE小鼠模型中延迟疾病发作

测试IMS寡核苷酸在狼疮动物模型中影响疾病发作的能力。NZB/WF1雌性小鼠自发发生蛋白尿、肾病理学和产生针对DNA的抗体，类似于系统性红斑狼疮(SLE)的个体。通过皮内递送(ID)每周一次给予NZB/W F1雌性小鼠50μg的TpT和GpG IMS寡核苷酸。可选择地，通过口强饲法给予GpG IMS寡核苷酸(PO；50μg，QW)。对照动物接受每周一次的赋形剂PBS注射。当通过口强饲法给予寡核苷酸时，尽管在任何实验组中都没有观察到在蛋白尿发作中的显著延迟(图7)，以及针对DNA的自身抗体反应没有以统计学上的显著量降低(图8)，但对肾的分析显示了GpG寡核苷酸在降低炎症中的显著效应(图9)。通过ID给药递送的GpG还降低分值，但没有达到统计学上的显著性。

考虑到50μgGpG IMS寡核苷酸对所述SLE小鼠模型中肾病理学的影响，我们进行了实验以检测剂量反应。通过IP注射每周一次给予NZB/W F1雌性小鼠50、200和500μg的GpG IMS寡核苷酸。观察到蛋白尿发作的剂量依赖性延迟和对DNA的自身抗体反应的降低，在500μg GpG IMS寡核苷酸注射的小鼠中具有蛋白尿发作的高显著性延迟和最小的中值DNA自身抗体效价(图10和11)。肾病理学在这些动物中进行。

上述体外实验证实了第三个寡核苷酸I-18性质上不同于TpT和GpG寡核苷酸。为了比较这些不同的寡核苷酸在狼疮中作用，通过IP注射每天一次给予NZB/W F1雌性小鼠50μg的TpT、GpG和I-18(人和小鼠分别为I-18h和I-18m)、寡核苷酸。在第34周处死动物，该时间为对照组的约30％显示蛋白尿。自身抗体分析显示在相比于赋形剂处理的对照组的I-18m处理的组中抗DNA反应的显著降低(图12)。肾病理学在这些动物中进行。

实施例5：IIS寡核苷酸降低患实验诱导的葡萄膜炎的小鼠中炎症的严重度

为了测定在狼疮动物模型中观察到的效力是否能普及到其他自身免疫性疾病，IMS寡核苷酸对葡萄膜炎(眼睛的自身免疫性疾病)的作用被测试。实验诱导的葡萄膜炎(EAU)是与人类疾病有许多共同特征的葡萄膜炎小鼠模型(Animal Models for Autoimmune andInflammatory Disease(自身免疫性疾病和炎性疾病的动物模型)，Current Protocols in Immunology(现代免疫学实验操作)，2003第15.6章)。通过用乳化于CFA中的人视网膜内结合蛋白hIRBP_161-180的肽片段在B10.RIII小鼠中的免疫作用诱导EAU。随后每周一次通过ID注射给予200μg的每个IMS寡核苷酸，其与低剂量的类固醇甲基泼尼松龙(1mg/kg)(对人葡萄膜炎的标准护理)组合。在第21天通过眼窝病理学评价EAU的程度。观察到GpG IMS寡核苷酸与低剂量类固醇的给药降低疾病严重性的趋势(图13)，而TpT显示与类固醇没有协同效应。

对延伸到这些观察，在没有类固醇治疗的IMS寡核苷酸和皮内与腹内给药被测试。通过用乳化于CFA中的hIRBP_161-180肽在B10.RIII小鼠中的免疫作用诱导EAU。随后每周一次通过IP或ID注射给予单独的200μg的每种IMS寡核苷酸，或与其组合的低剂量的类固醇甲基泼尼松龙(1mg/kg)。作为阳性对照，从第0天开始通过IV给药以每只动物5μg每天一次给予抗CD3抗体持续5天。然而每周一次GpG IMS寡核苷酸与类固醇的皮内或腹膜内递送导致比仅类固醇更低的严重性分值，都没有统计上显著性(图14)。相反，通过IP的GpG寡核苷酸单独给药比当其与类固醇治疗组合时更有效，导致疾病严重度与未处理的对照相比有统计学上的显著改善(p<0.01)(图14)。所述作用与用抗CD3处理的阳性对照组是相当的(p<0.05)。

为进一步分析IMS寡核苷酸对EAU的作用和测定最低有效剂量，我们比较了50μg GpG、TpT、I18h和I18m寡核苷酸的IP给药。与200μg GpG每周一次的IP给药(图14)相反，每天50μg剂量的GpG与任意其他IMS寡核苷酸的给药没有显著改善疾病严重度(图15)。

因为EAU由CFA诱导，GpG寡核苷酸降低疾病严重度的一个可能的作用机制是通过在CFA的分枝杆菌组分中与CpG竞争。为了测定GpG IMS寡核苷酸在无CFA的情况下对疾病进程的影响，进行了过继转移实验。hIRBP_161-180肽/CFA处理的动物中诱导的致葡萄膜炎细胞被收集，并与hIRBP_161-180肽一起体外生长3天。在第4天，所述细胞被过继转移至首次接受实验的受者，它们的一半接受每周一次200μgGpG寡核苷酸的IP注射，一半接受PBS赋形剂作为对照。用GpG寡核苷酸处理的动物与赋形剂处理的组相比显示较轻的严重性炎症(图16)，提示了GpG对与CpG阻断效应无关的疾病具有作用。

实施例6：ISS寡核苷酸在关节炎动物模型中延迟发作并降低严重度

接着在自身免疫性疾病的关节炎模型中测试本发明IMS寡核苷酸，其中是抗体而不是如EAU中的T细胞驱动炎症。第0天通过单一IV注射200μg四种单克隆抗胶原致关节炎抗体在Balb/c小鼠中诱导胶原抗体诱导的关节炎(CIA)(Terato，K.et al.1992)，两天后注射LPS使所述疾病同步。因此没有分枝杆菌DNA或其他外生来源CpG被用来诱导疾病。随后在第4天到第10天通过IP给予50μg GpG和I18h IMS寡核苷酸。每天观察一次动物，使用如下评分系统：0＝正常；1＝限于足中段(跗骨)和踝关节的轻微肿胀的红斑；2＝红斑和轻微肿胀，从踝延伸至足中段；3＝红斑和中度肿胀，从踝延伸至跖骨关节；4＝红斑和严重肿胀，包括踝、足和足趾。每个脚爪可以设定最大分值4，每个小鼠最大分值16。平均关节炎分值的测定通过对来自每个实验组动物的每个脚爪的关节炎分值取平均值。然而，用50μg GpG寡核苷酸的治疗在疾病严重性和疾病发病率上显示无疾病，但在用I18h寡核苷酸处理的动物中观察到关节炎严重度的显著降低和疾病发作的延迟(图17和18)。

实施例7：IIS寡核苷酸在结肠炎小鼠中抑制体重减轻

已发表的研究提出，CpG寡核苷酸在结肠炎动物模型中最小化体重减轻(Rachmilewitz，D.et al.2002)。然而在一些研究中，定时给药与预处理是关键的，其提供了显著的保护效应，但疾病发作后处理加重了疾病(Obermeier，F.et al.，2003；Obermeier，F.，2002)。为了测定本发明IMS寡核苷酸是否能类似的影响结肠炎，使用IL-2介导的炎性肠病动物模型、TNBS诱导的结肠炎模型(Animal Models of AutoimmuneDisease(自身免疫性动物模型)，Current Protocols in Immunology(现代免疫学实验操作)，第15.19章，2003)。在第-5天，用致结肠炎亚剂量的TNBS(0.5％)经直肠处理C3H小鼠。在同一天开始用GpG、I18h或I18m寡核苷酸IP处理，并持续5天。随后通过第二次TNBS给药(3.5％，经直肠)诱导疾病，之后停止寡核苷酸处理。每天称一次动物体重，初始体重(第0天)除以体重的变化被用于测定每个治疗组的平均体重减轻。所有用寡核苷酸处理的动物当与赋形剂对照组相比时显示降低的体重减轻(图19、20和21)。

也测试了炎性肠病的另外一个模型。口服葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导急性结肠炎，这不同于TNBS，是由先天性免疫系统专有介导的。从第-2天开始每天一次通过腹膜内注射用50或200μg的GpG、I-18h或I-18m寡核苷酸预处理雌性C3H小鼠，随后通过饮用水饲以3.5％DSS7天(第0-7天)。可选择地，疾病诱导的当天开始寡核苷酸处理。每天称一次动物体重，初始体重(第0天体重)除以体重的变化被用于测定。在预防和治疗实验中，IMS寡核苷酸当相比于赋形剂处理的对照组时都提供了显著的体重减轻的保护(图22，23，24和25)。在每个病例中，第0天开始的处理提供了最大的保护。

实施例8：I18诱变

为进一步评价对I18免疫调节负责的结构性基序，I18诱变对CpG介导的人外周血单核细胞(PBMC)的增殖作用如上述被测定。多聚G区(I18.M3-6和8；图26)和六聚物序列的5′(I18.M10-12；图27)内的突变显著降低了含有六聚物序列5′-GTGGTT-3′的寡核苷酸抑制PBMC增殖的能力。而且，六聚物序列和多聚G之间核苷酸的增加适度地降低了PBMC增殖(I18.M13-16；图27)。

实施例9：I18和通过Toll样受体的信号传导

为了测定I18调节免疫反应的机制，I18对Toll样受体(TLR)激活的作用被评价。通过在表达TLR2，3，4，5，7，8和9的培养的HEK293细胞中的NF-κB激活检测TLR信号传导。为了筛选TLR激动剂，包括I18的每个免疫调节寡核苷酸以最高浓度(25μg/ml)被测试两次，将TLR激活与对应的TLR的对照配体(列于下文)相比较。类似的，通过比较免疫调节寡核苷酸和对照配体的混合物与单独的对照配体的活性来鉴定TLR拮抗剂。I18抑制TLR3，5，7和9由它们对应的配体引起的激活。参见图29。使用的对照配体包括：TLR2：HKLM(热致死的单核细胞增多性李司忒(氏)菌(Listeria monocytogenes)，10⁸细胞/ml；TLR3：多聚(I:C)，100ng/ml；TLR4：大肠杆菌K12LPS，10ng/ml；TLR5：S.Typhimurium鞭毛蛋白，10ng/ml；TLR7：洛索立宾，1mM；TLR8：ssPolyU/LyoVec，50μg/ml；TLR9：CpG ODN 2006，1μg/ml。

实施例10：I18抑制TLR7和TLR3配体诱导的IFN-α产生

类浆细胞树突细胞(pDC)是IFN-α的主要内生来源以及系统性红斑狼疮(SLE)患者中升高的IFN-α水平的来源。为了测定IMS I18是否能影响响应于TLR7激动剂的pDC的IFN-α产生，pDC被分离，并在有或无I18的情况下与TLR7激动剂一起孵育。

通过密度梯度离心使用IsoPrep从两个不同的供者分离的PBMC中分离人pDC。细胞悬浮液在300g离心10分钟，弃去上清。所述细胞沉淀被重悬浮，400uL珠缓冲液(PBS pH7.2、0.5％ BSA和2mMEDTA)/108细胞。100uL非-PDC生物素抗体鸡尾酒被添加至每10⁸细胞，混合并在4-8℃温育10分钟。细胞用5-10ml珠缓冲液/10⁸细胞洗涤，在300g离心10分钟，移除上清。所述细胞沉淀被重悬浮在混合充分的珠缓冲液(400uL/10⁸总细胞)和抗生物素微珠(100uL/10⁸总细胞)中，并在4-8℃温育15分钟。所述细胞随后用添加的5-10ml珠缓冲液/10⁸细胞洗涤，在300g离心10分钟，移除上清。所述细胞被重悬浮，终体积500uL/10⁸细胞，并被添加至LS柱，该柱被预先通过漂洗用3mL珠缓冲液洗涤，并定位在MACS磁柱架。所述柱子用3x3mL珠缓冲液洗涤，含有未标记的类浆细胞树突细胞富集的馏分的全部流出物被收集。

从供者1分离的pDC与TLR7激动剂洛索立宾(Invivogen；Cat #tlrl-lox)和咪喹莫特(R-837；Invivogen；Cat # tlrl-imq)单独的或具有5μg/mL或25μg/mL I18的情况下孵育，根据厂商的实验操作通过ELISA(PBL Biomedicals；Cat #41105-2)测定IFN-α产生。任一浓度的I18完全消除pDC的IFN-α产生(图30A)。从供者2分离的pDC在没有寡核苷酸的情况下与TLR7激动剂洛索立宾和洛索立宾加5μg/mL I18孵育。同样，I18完全阻断TLR7的IFN-α产生(图30B)。

类似地，PBMC与TLR3激动剂多聚I：C的孵育导致IFN-α产生，其在两个不同供者中被25μg/mL I18阻断(图31)。

实施例11：I18抑制CpG诱导的pDC的IFN-α产生

SLEH患者血清中的内生核酸免疫复合物中存在的CpG介导类浆细胞树突细胞(pDC)的IFN-α产生。为了测定IMS I18是否能影响响应于CpG序列的pDC的IFN-α产生，pDC被分离，并在有或无I18的情况下与CpG免疫调节寡核苷酸一起孵育。

如上述分离的pDC与单独的CpG或具有增加量的I18情况下一起孵育。如上述通过ELISA测量IFN-α产生。当存在等摩尔比率的CpG寡核苷酸时I18显著降低IFN-α产生，并且在较高比率几乎消除来自两个不同供者pDC的IFN-α产生(图32A，B)。引入CpG寡核苷酸前将pDC与I18预孵育24小时完全消除来自两个供者的IFN-α产生(图32C，D)。

实施例12：I18在pDC中抑制SLE-免疫复合物诱导IFN-α

SLE患者血清中含有抗dsDNA抗体和免疫复合物，其促进pDC在这些患者中通过TLR9和FcγRIIa的IFN-α生产过剩。为了测定I18是否影响IFN-α产生，分离的pDC与来自四个不同患者的SLE血清或SLE-IC一起孵育，检测I18的抑制。

首先通过ELISA与正常对照相比评价从SLE患者分离的血清中抗ds-DNA抗体和免疫复合物的存在。患者19558和22914具有高水平的抗DNA抗体，而患者KP491和KP504接近正常(图33A)。通过在5cm层析柱(Pharmacia)中的蛋白A琼脂糖速流珠(2ml；SigmaP3476)，从人血清分离免疫复合物。所述柱用含0.02％叠氮化钠的10mlPBS洗涤。人血清(1-2mL)以1:3被稀释在PBS中，并经0.2um注射器式滤器过滤。稀释的血清被施用到柱，所述柱用10-15mL PBS洗涤，用10mL 0.1M柠檬酸pH2.6洗脱，收集至含有2mL 1M Tris缓冲液pH7.5的50mL锥形瓶中。洗脱液对PBS透析过夜，无菌过滤，测量OD280以测定蛋白浓度，使用1.5作为消光系数。所有SLE患者比正常对照具有更高水平的免疫复合物(图33B)。而且，来自SLE患者的1μg/mL纯化的Ig与分离的pDC的孵育仅在有抗dsDNA抗体的患者中诱导IFN-α产生(图33C)。

接着测试了I18抑制pDC响应SLE患者免疫复合物的IFN-α产生，所述SLE患者血清含有抗dsDNA抗体。来自SLE患者和正常对照的纯化的Ig在有或无I18的情况下与分离的pDC一起孵育24小时。分离的pDC或与正常对照的免疫复合物一起孵育的pDC产生很少的IFN-α(图34)。相反，与SLE患者的免疫复合物一起孵育的pDC产生显著量的IFN-α，并且IFN-α的产生被I18抑制。

实施例13：I18抑制正常外周B细胞(CD19+)的CpG激活

为了测定I18对免疫刺激性CpG序列激活的B细胞的作用，CD19+外周B细胞被从人外周血分离，并且在有或无免疫调节寡核苷酸I18的情况下测试细胞因子产生和细胞增殖。

使用添加到10⁷个总细胞的20μL CD19微珠，将CD19+外周B细胞从人血PBMC分离并将其在4℃孵育15分钟。细胞用2mLs/10⁷细胞洗涤，在300×g离心10分钟，移除上清。所述细胞沉淀被重悬浮在珠缓冲液(500ul/10⁸细胞)，并上样至放置在MACS分离器中的LS柱。所述柱用3x 3mL缓冲液洗涤，随后添加洗脱缓冲液，磁性标记的细胞通过稳固应用所述柱提供的柱塞从所述柱冲洗。洗脱的CD19+细胞在300×g离心10分钟，并被重悬浮在10ml RPMI-1640(具有10％FBS)。

为了测定I18对CpG-ODN刺激的IL-6和IL-10细胞因子产生的作用，CD19+B细胞与单独的5μg/mL刺激性CpG-ODN或存在5μg/mLI18的情况下一起孵育48小时。培养基中的细胞因子水平根据厂商的实验操作通过ELISA(Pharmingen，人IL-6，Cat#555220；人IL-10，Cat#555157)分析。如图35所示，I18抑制CpG刺激的IL-6(图35A)和IL-10(图35B)表达。

为了测定I18是否能抑制CpG-ODN刺激细胞增殖，CD19+B细胞与单独的5μg/mL刺激性CpG-ODN或存在5μg/mL或25μg/mL I18的情况下一起孵育4天。在孵育的最后24小时期间，通过[³H]胸腺嘧啶掺入分析细胞增殖。I18在两个剂量都显著抑制CpG刺激的C细胞增殖(图35C)。

实施例14：I18抑制狼疮患者外周B细胞(CD19+)的CpG激活

为了测定I18对免疫刺激性CpG序列激活的狼疮B细胞的作用，CD19+外周B细胞被从SLE患者中分离，并且在有或无I18的情况下测试细胞因子产生和增殖。所述患者是诊断为接受硫酸羟氯喹片少于一年的SLE的23岁女性。

CD19+B细胞如上所详述被分离。I18对CpG-ODN刺激的狼疮CD19+B细胞的IL-6和IL-10细胞因子产生的作用被测试，其通过与单独的5μg/mL刺激性CpG-ODN或存在5μg/mL或25μg/mL I18的情况下一起孵育细胞48小时。培养基中的细胞因子水平如上述通过ELISA分析。如图36所示，I18抑制CpG刺激的IL-6(图36A)和IL-10(图36B)表达。

为了测定I18是否能抑制CpG-ODN刺激的CD19+B细胞的增殖，细胞与单独的5μg/mL刺激性CpG-ODN或存在1μg/mL、5μg/mL或25μg/mL I18的情况下一起孵育4天。在孵育的最后24小时期间，通过[³H]胸腺嘧啶掺入分析细胞增殖。I18在所有剂量都显著抑制CpG刺激的C细胞增殖(图36C)。

实施例15：I18激活正常细胞和狼疮B细胞

将I18对外周B细胞的激活作用与免疫刺激性CpG序列比较。分离的CD19+CD27-初始B细胞与5μg/mL或25μg/mL I18的孵育诱导IL-6表达到类似于如CpG序列所诱导的程度(图37B)。相反，与分离的CD19+CD17+记忆B细胞孵育的5μg/mL或25μg/mL I18诱导IL-6表达到比CpG序列所诱导的更低的程度(图37A)。在5μg/mL和25μg/mL的I18还诱导IL-10在初始和记忆B细胞中表达，但比CpG-ODN所诱导的水平低(图38)。类似的，I18以氯喹敏感的方式激活B细胞共刺激性标志物CD80和CD86表达，比CpG序列激活的水平低，如FACS所测定的(图39)。然而，当有或无寡核苷酸的情况下B细胞被培养在10％FBS中13天时，I18不增加B细胞存活或增殖，CpG序列也如此(图40)。最后，I18是SLE患者B细胞的IL-6(图41A)、IL-10(图41B)和细胞增殖(图41C)的较弱的激活剂。

实施例16：I18在SLE小鼠模型中延迟疾病发作

测试I18寡核苷酸在狼疮动物模型中影响疾病发作的能力。NZB/W F1雌性小鼠自发发生蛋白尿、肾病理学和产生针对DNA的抗体，类似于系统性红斑狼疮(SLE)的个体。每周一次通过皮内注射给予NZB/W F1雌性小鼠I18IMS寡核苷酸10μg、50μg和250μg。具有抗dsDNA抗体的动物的百分比在统计学上小于接受每周一次50μg(p＝0.17)和250μg(p＝0.04)剂量的I18的组(图42)。

接着测试不同的给药频率。NZB/W F1雌性鼠被每天一次、每周三次或每周一次共45周给予10μg、50μg或250μg I18，评价蛋白尿发作。10μg I18的给药不影响疾病发作(图43A)。相反，所有50μg和250μg的给药方案相比于PBS对照显示降低疾病发作的趋势(图43B，C)。重要的是，每周三次(图44B)和每周一次(图44C)的250μg I18的给药相比于10μg和50μg I18显示统计学上的显著趋势(时序检验分别为p＝0.31和p＝0.03)。

实施例17：用I18对人SLE的治疗

免疫调节寡核苷酸I18被用于治疗人SLE患者。诊断为SLE的患者首先通过ELISA被筛选在其血清中的抗dsDNA抗体的存在。存在抗dsDNA抗体的的患者随后用治疗有效量的I18约0.001微克至约1克治疗。优选的I18治疗量是约5微克至约500微克。最优选的I18治疗量是约50-200微克。I18治疗在进行的基础上被每天一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、或每月一次递送。在优选的治疗方案中，I18治疗是在6-12个月每月一次被递送，随后每3-12个月，以维持剂量给药。监测人SLE患者的疾病活性。

实施例18：I18和相关的寡核苷酸抑制CpG对人B细胞的IL-6刺激

免疫调节寡核苷酸I18的诱变鉴定出5个相关的寡核苷酸具有增强的免疫调节活性。I18的系统性改变产生相关的寡核苷酸：I18.M7(CCATGTGGAAATGGGT)；I18.M49(CCATGTGGCCCTGGGT)；I18.M51(CCATGTGGAAAAGGGT)；I18.M52(CCATGTGGAAAAGGGA)；I18.M53(CCATGTGCCCAAGGGA)。为了测定I18衍生的寡核苷酸对CpG-ODN刺激的IL-6细胞因子产生的作用，人B细胞与单独的5μg/mL刺激性CpG-ODN或I18衍生的寡核苷酸或存在5μg/mL I18或I18衍生的寡核苷酸的情况下与5μg/mL CpG-ODN一起孵育(图45)。根据厂商的实验操作通过ELISA(Pharmingen，人IL-6，Cat#555220)分析培养基中细胞因子水平。然而人B细胞与I18的孵育导致导致对IL-6产生的小刺激，没有I18衍生的寡核苷酸触发可检测的细胞因子产生(图1，左边的柱)。类似地，I18衍生的寡核苷酸抑制CpG-ODN的IL-6产生优于I18。尽管所有的免疫调节寡核苷酸导致统计学上的显著抑制(图45，右边的柱)。

实施例19：具有显著不同水平的免疫抑制性和刺激性特性的寡核苷酸的表征

筛选分析中的抑制性寡核苷酸以测定每个寡核苷酸所具有的免疫抑制性和刺激性活性的相对水平。为了测定抑制性活性，小鼠脾细胞与单独的TLR7和TLR9激动剂和存在抑制性寡核苷酸的情况下一起孵育，炎性细胞因子如IL-6的激活被测量(图47)。为了测试免疫刺激性特性的存在，人B细胞与重组CD40配体和寡核苷酸的组合一起孵育，B细胞激活的测定通过检测短期培养物或存活物中细胞因子产生和长期培养物中免疫球蛋白产生(图49)。选择具有显著不同水平的激活和抑制活性的寡核苷酸用于在动物模型中的进一步测试。使用NZB/W F1品系进行动物研究。每周一次通过IP或皮下途径递送寡核苷酸，评价动物的存活、蛋白尿水平和抗dsDNA抗体水平(图48)。

前述实施例是实现本发明的特定实施方案。提供的所述实施例仅出于示例性目的，并不是旨在以任何方式限制本发明的范围。本发明的其他变化对本领域普通技术人员是显而易见的，并包括在所附权利要求中。本文引用的所有公开物、专利、专利申请和其他参考文献因此通过引用并入。

Claims (48)

1.药学上的组合物，包括：

(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：

(i)六聚物序列

5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’；

其中X和Y为任意天然存在或合成的核苷酸，除了

a.X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；

b.当嘧啶_[2]是胸腺嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶；

c.当嘧啶_[1]是胞嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶；

(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及

(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；

其中所述免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；以及

(b)药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的药学上的组合物，其中所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸。

3.如权利要求1所述的药学上的组合物，其中所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

4.如权利要求1所述的药学上的组合物，其中所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

5.如权利要求1所述的药学上的组合物，其中所述六聚物序列的X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤。

6.如权利要求1所述的药学上的组合物，其中所述免疫调节核酸是寡核苷酸。

7.如权利要求1所述的药学上的组合物，其中所述免疫调节核酸被并入载体。

8.如权利要求7所述的药学上的组合物，其中所述载体是表达载体。

9.药学上的组合物，包括：

(a)包含免疫调节序列的免疫调节核酸，包括：

(i)六聚物序列

5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’

其中X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤；

(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及

(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；

其中所述免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列；以及

(b)药学上可接受的载体。

10.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸。

11.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

12.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

13.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述六聚物序列是GTGGTT。

14.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述六聚物序列是GTGGTT，所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

15.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述六聚物序列是GTGGTT，并且所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸。

16.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述六聚物序列是GTGGTT，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

17.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述免疫调节序列是CCATGTGGTTATGGGT。

18.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述免疫调节核酸是寡核苷酸。

19.如权利要求9所述的药学上的组合物，其中所述免疫调节核酸被并入载体。

20.如权利要求19所述的药学上的组合物，其中所述载体是表达载体。

21.在个体中治疗疾病的方法，所述疾病与个体中非生理学存在的一个或多个自身分子相关，所述方法包括：给予所述个体包含免疫调节序列的免疫调节序列，所述免疫调节序列包括：

(i)六聚物序列

5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’；

其中X和Y为任意天然存在或合成的核苷酸，除了：

d.X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤；

e.当嘧啶_[2]是胸腺嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶；

f.当嘧啶_[1]是胞嘧啶时，X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶；

(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及

(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；

其中所述免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

25.如权利要求21所述的方法，其中所述六聚物序列的X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤。

26.如权利要求21所述的方法，其中所述六聚物序列是GTGGTT。

27.如权利要求21所述的方法，其中所述六聚物序列是GTGGTT，所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

28.如权利要求21所述的方法，其中所述六聚物序列是GTGGTT，并且所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸。

29.如权利要求21所述的方法，其中所述六聚物序列是GTGGTT，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

30.如权利要求21所述的方法，其中所述核苷酸序列是CCATGTGGTTATGGGT。

31.如权利要求21所述的方法，其中所述免疫调节核酸是寡核苷酸。

32.如权利要求21所述的方法，其中所述免疫调节核酸被并入载体。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述载体是表达载体。

34.如权利要求21所述的方法，其中所述与个体中非生理学存在的一个或多个自身分子相关的疾病是系统性红斑狼疮。

35.在个体中治疗疾病的方法，所述疾病与个体中非生理学存在的一个或多个自身分子相关，所述方法包括：给予所述个体包含免疫调节序列的免疫调节序列，所述免疫调节序列包括：

(i)六聚物序列

5’-嘌呤-嘧啶_[1]-[X]-[Y]-嘧啶_[2]-嘧啶_[3]-3’

其中X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤；

(ii)六聚物序列5’的CC二核苷酸，其中所述CC二核苷酸位于六聚物序列5’的1-5核苷酸；以及

(iii)六聚物序列3’的多聚G区，其中所述多聚G包括至少三个邻接G，并位于所述六聚物序列3’的2-5核苷酸；

其中所述免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸。

37.如权利要求35所述的方法，其中所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

38.如权利要求35所述的方法，其中所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

39.如权利要求35所述的方法，其中所述六聚物序列是GTGGTT。

40.如权利要求35所述的方法，其中所述六聚物序列是GTGGTT，并且所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸。

41.如权利要求35所述的方法，其中所述六聚物序列是GTGGTT，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

42.如权利要求35所述的方法，其中所述六聚物序列是GTGGTT，所述CC二核苷酸位于所述六聚物序列5’的2核苷酸，并且所述多聚G区位于所述六聚物序列3’的2核苷酸。

43.如权利要求35所述的方法，其中所述核苷酸序列是CCATGTGGTTATGGGT。

44.如权利要求35所述的方法，其中所述免疫调节核酸是寡核苷酸。

45.如权利要求35所述的方法，其中所述免疫调节核酸被并入载体。

46.如权利要求35所述的方法，其中所述载体是表达载体。

47.如权利要求35所述的方法，其中所述与个体中非生理学存在的一个或多个自身分子相关的疾病是系统性红斑狼疮。

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