CN101489382A - 多核苷酸疗法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供治疗个体自体免疫性疾病的方法,所述疾病与非生理存在于个体内的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关,所述方法包括向个体给予:自身载体,其包括免疫抑制性载体骨架和编码与所述自体免疫性疾病相关的自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸;和浓度大于生理水平的二价阳离子。包括编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸的自身载体的给予调节针对从所述给予的自身载体表达的自身蛋白、自身多肽或者自身肽的免疫反应。本发明还提供治疗多发性硬化的方法,通过给予包括BHT-1载体骨架的自身载体,例如编码人髓磷脂碱性蛋白(MBP)的自身载体BHT-3009。本发明还提供药物组合物,其包括:BHT-1载体骨架和编码与自体免疫性疾病相关的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸;和浓度大于生理水平的二价阳离子。本发明还提供包括自身载体的药物组合物,所述自身载体包括BHT-1载体骨架,例如编码人髓磷脂碱性蛋白(MBP)的自身载体BHT-3009,以及给予个体BHT-1自身载体诸如BHT-3009的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有美国临时专利申请第60/813,552号的权益,为了全部目的其完整内容在此引入作为参考。
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不适用
发明背景
发明领域
本发明涉及治疗个体疾病的方法和组合物,所述疾病与存在于该个体内并且参与非生理状态的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关。本发明还涉及预防个体疾病的方法和组合物,所述疾病与存在于该个体内并且参与非生理状态的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关。本发明还涉及鉴定以非生理状态存在并且与疾病相关的自身蛋白、自身多肽或者自身肽。本发明还涉及多核苷酸的给予,所述多核苷酸编码以非生理状态存在并且与疾病相关的自身蛋白、自身多肽或者自身肽。本发明还涉及调节针对自身蛋白、自身多肽或者自身肽的免疫反应,所述自身蛋白、自身多肽或者自身肽存在于动物体内,参与非生理状态并且与疾病相关。更特别地,本发明涉及治疗或者预防自体免疫性疾病的方法和组合物,所述自体免疫性疾病与以非生理状态存在于动物中的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关,所述非生理状态诸如多发性硬化,风湿性关节炎,胰岛素依赖型糖尿病,自体免疫葡萄膜炎,原发性胆汁性肝硬变,重症肌无力,斯耶格伦(氏)综合征(Sjogren’s syndrome),寻常天疱疮,硬皮病,恶性贫血,系统性红斑狼疮(SLE)和格雷夫斯病(Grave′s disease)。
自体免疫性疾病及免疫反应调节
自体免疫性疾病指由错误指向机体健康细胞和/或组织的获得性免疫引起的疾病。自体免疫性疾病影响3%美国人口和可能类似比例的工业化世界人口(Jacobson et al.,Clin Immunol Immunopathol 84,223-43,(1997))。自体免疫性疾病的特征为:异常地靶向自身蛋白、自身多肽、自身肽和/或其他自身分子的T和B淋巴细胞造成体内器官、组织或细胞类型(例如,胰腺、脑、甲状腺或胃肠道)的损伤和/或机能失调,从而引起该疾病的临床表现(Marrack et al.,Nat Med 7,899-905,(2001))。自体免疫性疾病包括影响特异组织的疾病和可以影响多组织的疾病。对某些疾病而言,这可能部分取决于自体免疫反应是指向局限于特定组织的抗原还是指向广泛分布于机体的抗原。组织特异性自体免疫的表征特征为选择性靶向单个组织或单一细胞类型。然而,靶向普遍存在的自身蛋白的某些自体免疫性疾病也能影响特异组织。例如,在多肌炎中,自体免疫反应靶向广泛存在的蛋白组氨酰基-tRNA合成酶,然而主要涉及的临床表现为肌肉的自体免疫性破坏。
免疫系统采用高度复杂的机制用于产生反应以保护哺乳动物抵抗多种外源病原体并同时阻止对自身抗原的反应。除了决定是否反应(抗原特异性)之外,免疫系统还必须选择适当的效应功能以处理每种病原体(效应特异性)。介导并调控这些效应功能的关键细胞是CD4+T细胞。此外,对来自CD4+T细胞的特异细胞因子的精细加工表现为T细胞介导其功能的主要机制。因此,表征CD4+T细胞产生的细胞因子类型及它们的分泌是如何控制的对理解免疫反应是如何被调节的极为重要。
十多年前首次发表了对长期小鼠CD4+T细胞克隆产生细胞因子的表征(Mosmann et al.,J.Immunol.136:2348-2357,(1986))。在这些研究中,显示了CD4+T细胞引起细胞因子产生的两种不同方式,命名为T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)。已发现Th1细胞专门产生白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和淋巴毒素(LT),而Th2克隆专门产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-13(Cherwinski et al.,J.Exp.Med.169:1229-1244,(1987))。稍后,从Th2克隆分离到另外的细胞因子:IL-9和IL-10(Van Snick et al.,J.Exp.Med.169:363-368,(1989);Fiorentino et al.,J.Exp.Med.170:2081-2095,1989)。最后,发现Th1和Th2细胞两者都分泌诸如IL-3、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的另外的细胞因子。
自体免疫性疾病包括能影响下表1列出的机体内许多不同器官和组织的广谱疾病。参见,例如,Paul W.E.(ed.2003)Fundamental Immunology(基础免疫学)(5th Ed.)Lippincott Williams & Wilkins;ISBN-10:0781735149,ISBN-13:978-0781735148;Rose and Mackay(eds.2006)The AutoimmuneDiseases(自体免疫性疾病)(4th ed.)Academic Press,ISBN-10:0125959613,ISBN-13:978-0125959612;Erkan,et al.(eds.2004)The Neurologic Involvementin Systemic Autoimmune Diseases(全身性自体免疫性疾病的神经介入),Volume3(Handbook of Systemic Autoimmune Diseases(全身性自体免疫性疾病手册))Elsevier Science,ISBN-10:0444516514,ISBN-13:978-0444516510;and Richter,et al.(eds.2003)Treatment of Autoimmune Disorders(免疫性病症的治疗),Springer,ISBN-10:3211837728,ISBN-13:978-3211837726。
表1-靶向的主要器官 | 疾病 |
甲状腺 | 桥本病(Hashimoto’s Disease) |
甲状腺 | 原发性黏液水肿 |
甲状腺 | 甲状腺功能亢进 |
胃 | 恶性贫血 |
胃 | 萎缩性胃炎 |
肾上腺 | 阿狄森病(Addison’s disease) |
胰岛 | 胰岛素依赖的糖尿病 |
肾 | 古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome) |
肌神经接点 | 重症肌无力 |
间质细胞 | 男性不育 |
皮肤 | 寻常天疱疮 |
皮肤 | 类天疱疮 |
眼 | 交感性眼炎 |
眼 | 晶体原性葡萄膜炎(Phacogenic uveitis) |
脑 | 多发性硬化 |
血红细胞 | 溶血性贫血 |
血小板 | 先天性血小板减少性紫癜 |
白细胞 | 先天性白血球减少症 |
胆道系统 | 原发性胆汁性肝硬化 |
肠 | 溃疡性结肠炎 |
动脉 | 动脉硬化症 |
唾液腺和泪腺 | 斯耶格伦(氏)综合征 |
滑膜关节 | 风湿性关节炎 |
肌肉 | 多肌炎 |
肌肉和皮肤 | 皮肌炎 |
皮肤 | 硬皮病 |
皮肤、关节、肌肉、血细胞 | 混合性结缔组织病 |
凝固因子 | 抗磷脂病 |
皮肤 | 盘状红斑狼疮 |
皮肤、关节、肾、脑、血细胞 | 系统性红斑狼疮(SLE) |
当前人自体免疫性疾病的治疗包括糖皮质激素、细胞毒性剂和最近开发的生物学疗法。通常,治疗人全身性自体免疫性疾病根据经验且不能令人满意。在多种严重的自体免疫性病症和炎性病症中主要采用诸如皮质类固醇的广谱免疫抑制药物。除皮质类固醇之外,在治疗全身性自体免疫性疾病中使用其他免疫抑制剂。环磷酰胺是引起T和B两种淋巴细胞完全耗尽及细胞介导的免疫损害的烷化剂。环孢霉素、他克莫司和吗替麦考吩酯是具有抑制T淋巴细胞的特异性质的天然产物,并且已用于治疗SLE、RA并在限定程度内用于治疗脉管炎和肌炎。这些药物伴有明显的肾脏毒性。甲氨蝶呤也作为“二线”试剂用于RA,目的为减缓疾病进展。它还用于多肌炎和其他结缔组织疾病。已尝试的其他方法包括意在阻断细胞因子作用或去除淋巴细胞的单克隆抗体。(Fox,D.A.,Am.J.Med;99:82-88(1995))。多发性硬化(MS)的治疗包括干扰素β和共聚物1,它们降低复发率20-30%且仅适度影响疾病进展。MS的治疗还使用包括甲强龙、其他类固醇、甲氨蝶呤、克拉屈滨和环磷酰胺的免疫抑制剂。在治疗MS中这些免疫抑制剂具有最小效力。风湿性关节炎(RA)的当前疗法采用诸如甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羟化氯喹、路弗龙胺(leuflonamide)、强的松的非特异性抑制或调节免疫功能药剂,以及近来开发的TNFα拮抗剂依那西普和因福利美(Moreland et al,J Rheumatol 28,1431-52,(2001))。依那西普和因福利美全面阻断TNFα,使患者更易死于败血症、慢性分枝杆菌感染的恶化和脱髓磷脂事件的发生。
在器官特异性自体免疫的情况下,已尝试过大量不同的治疗方法。全身性给予可溶性蛋白抗原以抑制随后对该抗原的免疫反应。这些疗法包括对患有实验性自体免疫性脑脊髓炎的动物和患有多发硬化的人输送髓磷脂碱性蛋白、其显性肽或髓磷脂蛋白混合物(Brocke et al.,Nature 379,343-6,(1996);Critchfield et al.,Science 263,1139-43.,(1994);Weiner et al.,Annu Rev Immunol 12,809-37,(1994)),对患有胶原蛋白诱导的关节炎的动物和患有风湿性关节炎的人给予II型胶原蛋白或胶原蛋白的混合物(Gumanovskaya et al.,Immunology 97,466-73.,(1999);McKown et al.,Arthritis Rheum 42,1204-8.,(1999);Trentham et al.,Science 261,1727-30.,(1993)),对患有自体免疫性糖尿病的人和动物输送胰岛素(Pozzilli andGisella Cavallo,Diabetes Metab Res Rev 16,306-7,(2000)),以及对患有自体免疫性葡萄膜炎的人和动物输送S-抗原(Nussenblatt et al.,Am JOphthalmol 123,583-92.,(1997))。与该方法相关的问题是全身性注射抗原诱导的T细胞无反应性。基于T细胞受体和结合到MHC分子上的肽之间的特异相互作用,另一种方法尝试设计用于全身性给予肽抗原的合理治疗策略。在糖尿病动物模型中使用肽方法的一项研究导致了该肽抗体产生的开发(Hurtenbach,U.etal.,JExp.Med 177:1499,(1993))。另一种方法是给予T细胞受体(TCR)肽免疫。参见,例如,Vandenbark,A.A.et al.,Nature 341:541,(1989)。另有一种方法还通过摄入肽或蛋白抗原诱导口服耐受。参见,例如,Weiner,H.L,Immmunol Today,18:335(1997)。
当前通过单独或与佐剂(免疫刺激剂)联合输送蛋白、多肽或者肽来改变免疫反应。例如,乙型肝炎病毒疫苗包括作为佐剂的氢氧化铝配制的重组乙型肝炎病毒表面抗原(非自身抗原)。该疫苗诱导针对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫反应以抗感染。可选择的方法涉及输送减毒的、复制缺陷的、和/或非病原体形式的病毒或细菌(各自为非自身抗原)诱导针对该病原体的宿主保护性免疫反应。例如,口服脊髓灰质炎疫苗由活减毒病毒(非自身抗原)组成,其在已接种的个体内感染细胞并复制,从而诱导针对脊髓灰质炎病毒(外源或非自身抗原)的有效免疫,而不会引起临床疾病。可选择地,该失活脊髓灰质炎疫苗包含不能感染或复制的失活的或“被杀死的”病毒,皮下给予该疫苗以诱导针对脊髓灰质炎病毒的保护性免疫。
DNA疫苗接种/多核苷酸治疗
多核苷酸治疗或DNA疫苗接种是诱导针对外源病原体(Davis,1997;Hassett and Whitton,1996;and Ulmer et al.,1996)和癌症抗原(Stevenson etal.,2004)的免疫以及调节自体免疫过程(Waisman et al.,1996)的有效方法。肌内注射之后,质粒DNA被例如肌细胞吸收,允许表达编码的多肽(Wolff et al.,1992)以及发生对所表达蛋白的持久免疫反应(Hassett et al.,2000)。在自体免疫性疾病的情况下,效果为变换进行中的免疫反应以抑制自体免疫性破坏,并认为该效果包括将自身反应性淋巴细胞从Th1型反应变换为Th2型反应。该免疫反应的调节可以不是全身性的,而是仅局部发生在自体免疫攻击的靶器官中。
编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的给予不同于传统的“基因治疗”,该多核苷酸用沉淀促进剂和/或转染促进剂配制或使用病毒载体配制。基因治疗是输送多核苷酸以提供蛋白或肽的表达,从而替换宿主体内缺陷性或缺失蛋白或肽,和/或增强期望的生理功能。基因治疗包括出于治疗目的使得DNA整合到个体基因组的方法。基因治疗的实例包括输送DNA,所述DNA编码用于血友病的凝固因子、用于重症联合免疫缺陷的腺苷脱氨酶、用于家族性高胆固醇血症的低密度脂蛋白受体、用于葡萄糖脑苷脂沉积症(Gaucher’s disease)的葡糖脑苷脂酶、用于α1-抗胰蛋白酶缺陷的α1-抗胰蛋白酶、用于血红蛋白病的α-球蛋白基因或β-球蛋白基因、以及用于囊肿性纤维化的氯化物通道(Verma and Somia,Nature 389,239-42,(1997))。
研究者已描述了编码免疫分子以治疗自体免疫性疾病的DNA疗法。这些DNA疗法包括编码T细胞受体抗原结合区域的DNA改变驱动自体免疫反应的自体反应性T细胞的水平(Waisman et al.,Nat Med 2:899-905,(1996))(美国专利第5,939,400号)。将编码自体抗原的DNA附着到颗粒上,并用基因枪输送至皮肤以预防多发性硬化和胶原蛋白诱导的关节炎(国际专利申请公开号WO 97/46253;Ramshaw et al.Immunol.and Cell Bio.75:409-413,(1997))。编码粘附分子、细胞因子(例如,TNFα)、趋化因子(例如,C-C趋化因子)和其他免疫分子(例如,Fas-配体)的DNA已用于自体免疫性疾病的动物模型(Youssef et al.,J Clin Invest 106:361-371,(2000))(Wildbaum et al.,J Clin Invest 106:671-679,(2000))(Wildbaum et al,J Immunol 165:5860-5866,(2000);Wildbaum et al.,J Immunol161:6368-7634,(1998);Youssef et al.,J Autoimmun 13:21-9,(1999))。国际申请公开号WO 00/53019、WO 2003/045316和WO 2004/047734描述了通过给予编码一种或多种自体抗原的核酸治疗自体免疫性疾病的方法。尽管这些方法已获得成功,但是仍需要进一步的改进。
本发明的一个目的是提供治疗或者预防与自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关的疾病的方法,所述自身蛋白、自身多肽或者自身肽存在并参与动物的非生理过程。本发明的另一个目的是提供治疗或者预防通常不损害免疫系统的自体免疫性疾病的特定方法。本发明的又一个目的是提供治疗或者预防神经变性性疾病的特定方法。本发明的又一个目的是提供治疗或者预防与非生理存在于动物中的自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关的疾病的组合物。本发明的再一个目的是鉴定非生理存在并且与疾病相关的自身蛋白、自身多肽或者自身肽。将说明书作为一个整体来看,本发明的这些以及其他目的将变得清楚。
发明简述
本发明提供治疗或者预防动物中与一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关的疾病的新方法,所述自身蛋白、自身多肽或者自身肽非生理存在于动物体内,所述方法包括向动物给予包括编码与所述疾病相关的自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸的自身载体。包括编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸的自身载体的给予调节针对所述自身载体表达的自身蛋白、自身多肽或者自身肽的免疫反应。包括编码一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽(它们非生理存在于被治疗的动物中)的多核苷酸的组合物可用于治疗与动物体内存在的所述自身蛋白、自身多肽或者自身肽和/或非生理过程的靶标相关的疾病。本发明发现,编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽(它们非生理地存在或者被非生理过程作为靶标)的多核苷酸的给予调节针对所述自身蛋白、自身多肽或者自身肽的免疫反应,以治疗与动物中非生理涉及的自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关的疾病。
在一个方面,本发明提供治疗个体自体免疫性疾病的方法,所述疾病与非生理存在于个体内的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关,所述方法包括向个体给予:自身载体,其包括免疫抑制性载体骨架和编码与所述自体免疫性疾病相关的自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸;和总浓度大于生理水平的一种或者多种二价阳离子。在一些实施方式中,所述自身载体骨架是BHT-1载体骨架。在一些实施方式中,所述自身载体骨架是非免疫刺激性的(例如,“免疫中性的”)。
在一些实施方式中,一种或者多种二价阳离子选自Ca2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+,Al2+,Cu2+,Ni2+,Ba2+,Sr2+,和其混合物。在一些实施方式中,所述二价阳离子是单独的钙。在一些实施方式中,所述二价阳离子是Ca2+和Mg2+的混合物。
在一些实施方式中,自体免疫性疾病是多发性硬化;在其他实施方式中,自体免疫性疾病是风湿性关节炎;以及又在其他实施方式中,自体免疫性疾病是狼疮。在一些实施方式中,自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂碱性蛋白(MBP)的多核苷酸;在其他实施方式中,自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人蛋白脂蛋白(PLP)的多核苷酸;在其他实施方式中,自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)的多核苷酸;又在其他实施方式中,自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂少突细胞蛋白(MOG)的多核苷酸。在优选的实施方式中,所述自身载体是BHT-3009,并且不含内毒素。在一些实施方式中,所述二价阳离子是钙。在一些实施方式中,钙的浓度大于大约2mM;在优选的实施方式中,钙的浓度大约是5.4mM。
在另一个方面,本发明提供治疗个体多发性硬化的方法,包括向个体给予包括BHT-3009(SEQ ID NO:3)的药物组合物。在一些实施方式中,所述药物组合物是不含内毒素的。在一些实施方式中,所述药物组合物还包括浓度大于生理水平的二价阳离子。在一些实施方式中,所述二价阳离子是钙。在一些实施方式中,钙的浓度大于大约2mM;在优选的实施方式中,钙的浓度大约是5.4mM。
在另一个方面,本发明提供药物组合物,其包括:包括免疫抑制性载体骨架和多核苷酸的自身载体,所述多核苷酸编码与自体免疫性疾病相关的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽;和浓度大于生理水平的二价阳离子。在一些实施方式中,所述自身载体骨架是BHT-1载体骨架。在一些实施方式中,所述自身载体骨架是非免疫刺激性的(例如,“免疫中性的”)。
在一些实施方式中,自体免疫性疾病是多发性硬化;在其他实施方式中,自体免疫性疾病是风湿性关节炎;以及又在其他实施方式中,自体免疫性疾病是狼疮。在一些实施方式中,所述药物组合物的自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂碱性蛋白(MBP)的多核苷酸;在其他实施方式中,自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人蛋白脂蛋白(PLP)的多核苷酸;在其他实施方式中,自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)的多核苷酸;以及又在其他实施方式中,自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂少突细胞蛋白(MOG)的多核苷酸。在优选的实施方式中,所述药物组合物的自身载体是BHT-3009,并且不含内毒素。在一些实施方式中,所述二价阳离子是钙。在一些实施方式中,钙的浓度大于大约2mM;在优选的实施方式中,钙的浓度大约是5.4mM。
在另一个方面,本发明提供包括BHT-3009的药物组合物。本发明的组合物通常不含内毒素,并且还可以包括浓度大于大约2mM的钙。
附图简述
图1:BHT-3009的载体结构图:用标记的组成部分显示自身载体BHT-3009。CMV启动子驱动人髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达。牛生长激素终止和多聚A序列(bGH pA)被插入hMBP的3′。分别通过pUC复制原点和卡那霉素抗性基因(Kanr)实现载体增殖和筛选。BHT-3009为3485个碱基对,在载体图的左方说明每个组分的位置。
图2:I期试验设计:将30名MS患者分配到3个BHT-3009剂量组之一。对于每个剂量组,患者被随机分配到下列治疗组之一:A组:BHT-安慰剂+阿托伐他汀-安慰剂(4名患者);B组:BHT-3009+阿托伐他汀-安慰剂(3名患者);C组:BHT-3009+阿托伐他汀(3名患者)。将随机分到A组的患者再随机分到接受下列之一的开放式(open label)治疗:D组:单独的BHT-3009(2名患者)或者E组:BHT-3009+阿托伐他汀(2名患者),使其接受治疗,并作为开始被随机分到B组或者C组的患者进行评价。
图3显示当利用高于生理浓度的钙转染BHT-1载体骨架时的改良的蛋白产生。在不含镁的条件下,将BHT-3021(0.25mg/ml)DNA,具有编码胰岛素原自身蛋白的序列的BHT-1载体骨架,在具有范围在0.9mM至9.0mM的浓度增加的钙的杜氏PBS(Dulbecco′s PBS)中配制。将配制的DNA冷冻过夜以促进DNA/磷酸钙颗粒的形成。然后解冻溶液,向包含0.4ml DMEM培养基的24孔组织培养板的约3×105HEK293细胞中添加5微克DNA。培养24小时后,用蛋白酶体抑制剂处理细胞以防止质粒产生的细胞质胰岛素原蛋白的降解,然后再培养24小时,收集、裂解细胞,并利用商品化的胰岛素原ELISA试剂盒测量胰岛素原蛋白。在用5.4mM钙配制的DNA中观察到最大的蛋白产生。
发明详述
为了更全面的理解本文描述的本发明,提供下列说明。
本发明提供治疗或者预防动物体内与一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关的疾病的方法,所述自身蛋白、自身多肽或者自身肽非生理存在于动物体内或者参与非生理状态,所述方法包括向动物给予包括编码与所述疾病相关的自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸的自身载体。包括编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸的自身载体的给予调节针对所述自身载体表达的自身蛋白、自身多肽或者自身肽的免疫反应。
所述自身载体与高于生理浓度的一种或者多种二价阳离子共给予或者共配制。令人惊讶地是,与总浓度等于或者低于生理水平的一种或者多种二价阳离子存在条件下DNA疫苗接种载体的共给予相比,DNA疫苗接种载体与总浓度高于生理水平的一种或者多种二价阳离子的共给予提高转染效率、被编码自体抗原的表达(即,转录和翻译)以及对不期望的免疫反应的治疗性抑制中的一种或者多种。
本发明的治疗或者预防方法可用于与动物中非生理存在和/或参与非生理过程的自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关的任意疾病。
自体免疫性疾病
在下表中列出与动物中非生理存在的自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关的自体免疫性疾病的数种实例,并在下文中描述。
表2
多发性硬化。本发明提供可用于治疗多发性硬化(MS)的组合物和方法,MS是最常见的CNS脱髓鞘病症,影响350,000名美国人和一百万世界人口。参见,例如,Cohen and Rudick(eds.2007)Multiple Sclerosis Therapeutics(多发性硬化治疗)(3d ed)Informa Healthcare,ISBN-10:1841845256,ISBN-13:978-1841845258;Matthews and Margaret Rice-Oxley(2006)Multiple Sclerosis:The Facts(多发性硬化:事实)(Oxford Medical Publications 4th Ed.)OxfordUniversity Press,USA,ISBN-10:0198508980,ISBN-13:978-0198508984;Cook(ed.2006)Handbook of Multiple Sclerosis(Neurological Disease andTherapy,4th Ed.)(多发性硬化手册(神经疾病和治疗,第4版))InformaHealthcare,ISBN-10:1574448277,ISBN-13:978-1574448276;Compston,et al.(2005)McAlpine′s Multiple Sclerosis(McAlpine多发性硬化)(4th edition)Churchill Livingstone,ISBN-10:044307271X,ISBN-13:978-0443072710;Burks and Johnson(eds 2000)Multiple Sclerosis:Diagnosis,MedicalManagement,and Rehabilitation(多发性硬化:诊断,医疗护理和康复)DemosMedical Publishing ISBN-10:1888799358,ISBN-13:978-1888799354;Waxman(2005)Multiple Sclerosis As A Neuronal Disease(作为神经元疾病的多发性硬化)Academic Press ISBN-10:0127387617,ISBN-13:978-0127387611;Filippi,et al.(eds.)Magnetic Resonance Spectroscopy in Multiple Sclerosis(Topics inNeuroscience)(多发性硬化的磁共振波谱(神经科学主题))Springer,ISBN-10:8847001234,ISBN-13:978-8847001237;Herndon(ed.2003)Multiple Sclerosis:Immunology,Pathology and Pathophysiology(多发性硬化:免疫学,病理学和病理生理学)Demos Medical Publishing,ISBN-10:1888799625,ISBN-13:978-1888799620;Costello,et al.(2007)"Combination therapies for multiplesclerosis:scientific rationale,clinical trials,and clinical practice"(多发性硬化的联合治疗:科学理论,临床试验和临床实践)Curr.Opin.Neurol.20(3):281-285,PMID:17495621;Burton and O′connor(2007)"Novel Oral Agents for MultipleSclerosis"(多发性硬化的新型口服剂)Curr.Neurol.Neurosci.Rep.7(3):223-230,PMID:17488588;Correale and Villa (2007)"Theblood-brain-barrier in multiple sclerosis:functional roles and therapeutictargeting"(多发性硬化的血脑屏障:功能作用和治疗靶标)Autoimmunity40(2):148-60,PMID:17453713;De Stefano,et al.(2007)"Measuring brainatrophy in multiple sclerosis"(测量多发性硬化中的脑萎缩)J.Neuroimaging17 Suppl 1:10S-15S,PMID:17425728;Neema,et al.(2007)"T1-and T2-basedMRI measures of diffuse gray matter and white matter damage in patients withmultiple sclerosis"(多发性硬化患者中弥散灰质和白质损伤的基于T1和T2的MRI检测)J.Neuroimaging 17 Suppl 1:16S-21S,PMID:17425729;DeStefano and Filippi(2007)"MR spectroscopy in multiple sclerosis"(多发性硬化的MR波谱)J.Neuroimaging 17 Suppl 1:31S-35S,PMID:17425732;和Comabella and Martin(2007)"Genomics in multiple sclerosis-Current state andfuture directions"(多发性硬化的基因组学-现状和未来方向)J.Neuroimmunol.Epub ahead of print]PMID:17400297。
症状发作通常发生在20岁至40岁,并且表现为单侧视觉损伤、肌无力、感觉异常、运动失调、眩晕症、小便失禁、构音障碍或精神障碍的(按频率降低的顺序)急性或亚急性发作。这些症状由脱髓磷脂的病灶性损害导致,其既造成归因于轴突转导放缓的阴性传导异常,还造成归因于异位冲动产生的阳性传导异常(例如,莱尔米特(Lhermitte)症状)。对MS的诊断基于病史,包括至少两次明显的神经失调的发作,其在时间上隔开、产生神经失调的客观临床迹象、和涉及CNS白质的分离区域。实验室研究提供了支持MS诊断的另外的客观证据,所述研究包括CNS白质损害的核磁共振成像(MRI)、IgG脑脊液(CSF)寡克隆带以及引起的异常反应。虽然大多数患者会经历渐进的复发缓解病程,但是MS的临床过程在个体间大相径庭,并且其范围可以从限于一生中的数次温和发作到慢性累积的爆发性疾病。具有分泌IFN-γ能力的髓磷脂-自体反应性T细胞数量的增加与MS和EAE的发病机理相关。
在诸如多发性硬化和实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)的自体免疫性脱髓鞘疾病中,自体免疫反应的自身蛋白、自身多肽或者自身肽靶标可以包括来自以下蛋白或者肽的表位:蛋白脂质蛋白(PLP);髓磷脂碱性蛋白(MBP);髓磷脂少突细胞蛋白(MOG);环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase);髓磷脂结合的糖蛋白(MAG);以及髓磷脂结合的少突细胞碱性蛋白(MBOP);α-B-晶体蛋白(热激蛋白);病毒和细菌模拟肽(例如,流感、疱疹病毒、乙型肝炎病毒,等等);OSP(少突细胞特异性蛋白);瓜氨酸修饰的MBP(MBP的C8异构体,其中6个精氨酸已脱亚胺基为瓜氨酸),等等。整合膜蛋白PLP为髓磷脂的主要自体抗原。在数种小鼠品系中已鉴定出PLP抗原性决定基,包括残基139-151、103-116、215-232、43-64和178-191。已报导了至少26个MBP表位(Meinl et al,J Clin Invest 92,2633-43,1993)。值得注意的是残基1-11、59-76和87-99。已在数种小鼠品系中鉴定的免疫显性MOG表位包括残基1-22、35-55、64-96。本文使用的术语“表位”应被理解为表示自身蛋白、自身多肽或者自身肽的一部分,其具有被动物免疫系统的B细胞或者T细胞识别的特定形状或者结构。
在人MS患者中,鉴定到作为自体免疫性T和B细胞反应靶标的下列髓磷脂蛋白和表位。从MS脑斑洗脱的抗体识别髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽83-97(Wucherpfennig et al,J Clin Invest 100:1114-1122,(1997))。另一项研究发现约50%的MS患者针对髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)具有外周血淋巴细胞(PBL)T细胞反应性(6-10%对照)、20%针对MBP具有反应性(8-12%对照)、8%针对PLP具有反应性(0%对照)、0%针对MAG具有反应性(0%对照)。在本研究中,7/10的MOG反应性患者具有T细胞增殖性反应,所述反应聚焦在3种肽表位之一,包括MOG 1-22、MOG 34-56、MOG 64-96(Kerlero de Rosbo et al.,Eur J Immunol 27,3059-69,(1997))。T细胞和B细胞(脑损伤洗脱的Ab)反应聚焦在MBP 87-99(Oksenberg et al,Nature 362,68-70,1993)。在MBP 87-99中,氨基酸基序HFFK为T和B两种细胞反应的主要靶标(Wucherpfennig et al.,J Clin Invest 100,1114-22,(1997))。另一研究观察到针对髓磷脂结合的少突细胞碱性蛋白(MOBP)的淋巴细胞反应性,其包括残基MOBP 21-39和MOBP 37-60(Holz et al.,JImmunol 164,1103-9,(2000))。使用MOG和MBP肽的免疫金偶联物对MS脑和对照脑染色,通过MS斑结合的Abs识别到MBP和MOG肽两者(Genain and Hauser,Methods 10,420-34,(1996))。
风湿性关节炎。风湿性关节炎(RA)是慢性自体免疫性炎性滑膜炎,影响着世界人口的0.8%。它由造成侵蚀性关节破坏的慢性炎性滑膜炎来表征。参见,例如,St.Clair,et al.(2004)Rheumatoid Arthritis(风湿性关节炎)Lippincott Williams & Wilkins,ISBN-10:0781741491,ISBN-13:978-0781741491;Firestein,et al.(eds.2006)Rheumatoid Arthritis(风湿性关节炎)(2d Ed.)Oxford University Press,USA,ISBN-10:0198566301,ISBN-13:978-0198566304;Emery,et al.(2007)"Evidence-based review of biologicmarkers as indicators of disease progression and remission in rheumatoidarthritis"(作为风湿性关节炎疾病进展和症状缓解指标的生物标志物的基于证据的综述)Rheumatol.Int.[印刷前电子出版]PMID:17505829;Nigrovic,etal.(2007)"Synovial mast cells:role in acute and chronic arthritis"Immunol.Rev.217(1):19-37,PMID:17498049;and Manuel,et al.(2007)"Dendritic cells inautoimmune diseases and neuroinflammatory disorders"(自体免疫性疾病和神经炎性病症中的树突状细胞)Front.Biosci.12:4315-335,PMID:17485377。RA由T细胞、B细胞和巨噬细胞介导。
证明T细胞在RA中起关键作用的证据包括1)侵润滑膜的CD4+T细胞的主导性,2)与使用诸如环孢霉素的药物抑制T细胞功能相关的临床改善,以及3)RA与某些HLA-DR等位基因间的相关性。与RA相关的HLA-DR等位基因包括β链第三高变区的位点67-74的相似氨基酸序列,所述位点参与肽结合与呈递到T细胞。RA由自体反应性T细胞介导,该自体反应性T细胞识别在滑膜关节中存在的自身蛋白或经修饰的自身蛋白。本发明的自身抗原(self-antigens)、自身蛋白、自身多肽或自身肽又称为自体抗原(autoantigens),在RA中被作为靶标,包括来自以下的表位:II型胶原蛋白;hnRNP;A2/RA33;Sa;微丝聚集蛋白;角蛋白;瓜氨酸;包括gp39的软骨蛋白;I、III、IV、V、IX、XI型胶原蛋白;HSP-65/60;IgM(风湿性因子);RNA聚合酶;hnRNP-B1;hnRNP-D;心磷脂;醛缩酶A;瓜氨酸修饰的微丝聚集蛋白和纤维蛋白。已在高比例的RA患者的血清中鉴定到识别微丝聚集蛋白肽的自体抗体,所述微丝聚集蛋白肽包含经修饰的精氨酸残基(脱亚胺基以形成瓜氨酸)。一些患者中,自体反应性T细胞和B细胞反应都指向同样的免疫显性的II型胶原蛋白(CII)肽257-270。
胰岛素依赖的糖尿病。人I型或胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)由郎格罕氏(Langerhans)胰岛内β细胞的自体免疫性破坏所表征。去除β细胞导致不能调节血糖水平。参见,例如,Sperling(ed.2001)Type 1 Diabetes inClinical Practice(Contemporary Endocrinology)(临床实践中的1型糖尿病(当代内分泌学))Humana Press,ISBN-10:0896039315,ISBN-13:978-0896039315;Eisenbarth(ed.2000)Type 1 Diabetes:Molecular,Cellular andClinical Immunology(Advances in Experimental Medicine and Biology)(1型糖尿病:分子,细胞和临床免疫学(实验医学和生物学进展))Springer,ISBN-10:0306478714,ISBN-13:978-0306478710;Wong and Wen(2005)"B cells inautoimmune diabetes"(自体免疫性糖尿病中的B细胞)Rev.Diabet.Stud.2(3):121-135,Epub 2005 Nov 10,PMID:17491687;Sia(2004)"Autoimmunediabetes:ongoing development of immunological intervention strategies targeteddirectly against autoreactive T cells"(自体免疫性糖尿病:直接针对自体反应性T细胞的免疫介入策略的进展)Rev.Diabet.Stud.1(1):9-17,Epub 2004 May 10,PMID:17491660;Triplitt(2007)"New technologies and therapies in themanagement of diabetes"(糖尿病控制的新技术和新疗法)Am.J.Manag.Care13(2Suppl):S47-54,PMID:17417933;and Skyler(2007)"Prediction andprevention of type 1 diabetes:progress,problems,and prospects"(1型糖尿病的预测和预防:进展,问题和展望)Clin.Pharmacol.Ther.81(5):768-71,Epub2007 Mar 28,PMID:17392722。
血糖水平升高到特定水平(通常约250mg/dl)之上时,即发生明显的糖尿病。人类糖尿病发作前有一段长时间的前症状期。该时期内,胰腺β细胞功能会渐渐丧失。抗胰岛素、抗谷氨酸脱羧酶和抗酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)(以上都是本发明自身蛋白、自身多肽或者自身肽的实例)的自体抗体的存在提示疾病进展。
前症状期可以评价的标志物是胰腺中胰岛炎的存在;胰岛细胞抗体、胰岛细胞表面抗体的水平和频率;MHC II类分子在胰腺β细胞的异常表达;血糖浓度和胰岛素的血浆浓度。像胰岛素浓度的降低一样,胰腺T淋巴细胞、胰岛细胞抗体和血糖的量的增加指示所述疾病。
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠作为动物模型,具有许多与人IDDM相同的临床上、免疫学上和组织病理学上的特征。NOD小鼠自发地发生胰岛炎性和对所述β细胞的破坏,其导致高血糖和明显的糖尿病。糖尿病的发生需要CD4+和CD8+两种T细胞,尽管每一种的作用尚不清楚。已表明,在耐受化条件下,向NOD小鼠给予作为蛋白的胰岛素或GAD,预防疾病和对其他自身抗原下调反应。
血清中具有各种特异性的自体抗体的组合存在对人I型糖尿病高度敏感并高度特异。例如,抗GAD和/或IA-2自体抗体的存在对从对照血清鉴定I型糖尿病具有约98%的敏感性和99%的特异性。在I型糖尿病患者的非糖尿病一级亲属中,存在特异于包括GAD、胰岛素和IA-2的三种自体抗原中的两者的自体抗体,则表示大于90%的阳性预期值,其代表五年内I型DM的进展。
人胰岛素依赖性糖尿病靶向的自体抗原可以包括自身蛋白、自身多肽或者自身肽酪氨酸磷酸酶IA-2;IA-2β;65kDa和67kDa两种形式的谷氨酸脱羧酶(GAD);羧肽酶H;胰岛素;胰岛素原;热休克蛋白(HSP);glima38;胰岛细胞抗原69kDa(ICA69);p52;两种神经节苷脂抗原(GT3和GM2-1);以及胰岛细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT2)。
当前通过监测血糖水平来指导重组胰岛素的注射或基于泵的输送,从而治疗人IDDM。膳食和运动方式有助于达到足够血糖控制。
自体免疫性葡萄膜炎。自体免疫性葡萄膜炎是眼的自体免疫性疾病,据估计影响400,000人,并且美国发病率为每年新增43,000例。当前对自体免疫性葡萄膜炎的治疗使用类固醇、诸如甲氨蝶呤和环孢霉素的免疫抑制剂、静脉免疫球蛋白以及TNFα-拮抗物。参见,例如,Pleyer andMondino(eds.2004)Uveitis and Immunological Disorders(Essentials inOphthalmology)(葡萄膜炎和免疫病症(眼科学要点))Springer,ISBN-10:3540200452,ISBN-13:978-3540200451;Vallochi,et al.(2007)"The role ofcytokines in the regulation of ocular autoimmune inflammation"(细胞因子在调节眼自体免疫性炎症中的作用)Cytokine Growth Factor Rev.18(1-2):135-141,Epub 2007 Mar 8,PMID:17349814;Bora and Kaplan(2007)"Intraoculardiseases-anterior uveitis"(眼内疾病-前葡萄膜炎)Chem.Immunol.Allergy.92:213-20,PMID:17264497;和Levinson(2007)"Immunogenetics of ocularinflammatory disease"(眼炎性疾病的免疫遗传学)Tissue Antigens69(2):105-112,PMID:17257311。
实验性自体免疫性葡萄膜炎(EAU)是T细胞介导的自体免疫性疾病,该疾病以神经视网膜、葡萄膜及眼中相关组织为靶标。EAU具有与人自体免疫性葡萄膜炎相同的许多临床上和免疫学上的特征,并且由外周给予用完全弗氏佐剂(CFA)乳化的葡萄膜炎肽诱导。
在人自体免疫性葡萄膜炎中,自体免疫反应靶向的自身蛋白可以包括S-抗原、光感受器间类维生素A结合蛋白(IRBP)、视紫质和恢复蛋白。
原发性胆汁性肝硬化。原发性胆汁性肝硬化(PBC)是器官特异性的自体免疫性疾病,主要影响40岁至60岁的女性。在该组中报导的发病率接近1/1000。PBC的特征在于肝内胆管上皮细胞(IBEC)的进行性破坏,所述IBEC为小肝内胆管内衬。这导致对胆汁分泌的阻碍与干扰,造成最终的硬化。已报导由上皮衬里/分泌系统损坏表征的其他自体免疫性疾病的相关性,所述疾病包括斯耶格伦(氏)综合征、CREST综合征、自体免疫性甲状腺疾病以及风湿性关节炎。对驱动抗原的关注已集中在线粒体上超过50年,导致抗线粒体抗体(AMA)的发现(Gershwin et al.,ImmunolRev 174:210-225,(2000);Mackay et al,ImmunolRev174:226-237,(2000))。AMA很快成为实验室诊断PBC的基础,它在临床症状出现很久以前便存在于90%-95%的患者血清中。线粒体内的自体抗原性反应性命名为M1和M2。M2反应性指向48-74kDa组分家族。M2代表2-含氧酸脱氢酶复合体(2-OADC)的多种自体抗原性酶亚单位,并且是本发明所述自身蛋白、自身多肽或自身肽的另一实例。
鉴定PBC发病机理中丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)抗原作用的研究支持了这样的观点:PDC在所述疾病的诱导中起中心作用(Gershwin et al.,Immunol Rev 174:210-225,(2000);Mackay et al.,Immuno lRev 174:226-237,(2000))。在95%的PBC病例中,最频繁的反应性是属于PDC-E2的E2 74kDa亚基。存在的相关但不同的复合体包括:2-酮戊二酸脱氢酶复合体(OGDC)和支化链(BC)2-OADC。三种组成型酶(E1、E2、E3)有助于催化功能,该催化功能为将2-含氧酸底物转换成酰基辅酶A(CoA),同时将NAD+还原成NADH。哺乳动物PDC包括另外的组分,称蛋白X或E-3结合蛋白(E3BP)。在PBC患者中,所述的主要的抗原反应指向PDC-E2和E3BP。E2多肽包含两个串联重复的硫辛酰结构域,而E3BP具有单一的硫辛酰结构域。用糖皮质激素和包括甲氨蝶呤和环孢霉素A的免疫抑制剂治疗PBC。参见,例如,Sherlock and Dooley(2002)Diseases of the Liver& Biliary System(肝和胆系统的疾病)(11th ed.)Blackwell Pub.,ISBN-10:0632055820,ISBN-13:978-0632055821;Boyer,et al.(eds.2001)LiverCirrhosis and it sDevelopment(肝硬化及其进展)(Falk Symposium,Volume115)Springer,ISBN-10:0792387600,ISBN-13:978-0792387602;Crispe(ed.2001)T Lymphocytes in the Liver:Immunobiology,Pathology and Host Defense(肝中的T淋巴细胞:免疫生物学,病理学和宿主防御)Wiley-Liss,ISBN-10:047119218X,ISBN-13:978-0471192183;Lack(2001)Pathology of thePancreas,Gallbladder,Extrahepatic Biliary Tract,andAmpullary Region(Medicine)(胰腺,胆囊,肝外胆道和壶腹部的病理学(医学))Oxford UniversityPress,USA,ISBN-10:0195133927,ISBN-13:978-0195133929;Gong,et al.(2007)"Ursodeoxycholic Acid for Patients With Primary Biliary Cirrhosis:AnUpdated Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Clinical TrialsUsing Bayesian Approach as Sensitivity Analyses"(用于原发性胆汁性肝硬化患者的熊去氧胆酸:更新的系统综述和利用贝斯分析法作为灵敏度分析的随机临床试验后分析)Am.J.Gastroenterol.[印刷前电子出版]PMID:17459023;Lazaridis and Talwalkar(2007)"Clinical Epidemiology of Primary BiliaryCirrhosis:Incidence,Prevalence,and Impact of Therapy"(原发性胆汁性肝硬化的临床流行病学:发生,流行和治疗影响)J.Clin.Gastroenterol.41(5):494-500,PMID:17450033;和Sorokin,etal.(2007)"Primary biliary cirrhosis,hyperlipidemia,and atherosclerotic risk:A systematic review"(原发性胆汁性肝硬化,高脂血症和动脉粥样硬化风险:系统综述)Atherosclerosis[印刷前电子出版]PMID:17240380。
实验性自体免疫性胆管炎(EAC)的鼠模型采用在SJL/J雌性小鼠中使用哺乳动物PDC进行的腹膜内(i.p.)致敏化,从而诱导非化脓的破坏性胆管炎(NSDC)及AMA的产生(Jones,J Clin Pathol 53:813-21,(2000))。
其他自体免疫性疾病与相关的自身蛋白、自身多肽或自身肽。重症肌无力的自体抗原可以包括乙酰胆碱受体内的表位。寻常天疱疮中靶向的自体抗原可以包括桥粒芯糖蛋白-3。斯耶格伦(氏)综合征抗原可以包括SSA(Ro);SSB(La);以及胞衬蛋白。寻常天疱疮的主要自体抗原可以包括桥粒芯糖蛋白-3。肌炎组可以包括tRNA合成酶(例如,苏氨酰基、组氨酰基、丙氨酰基、异亮氨酰基和甘氨酰基);Ku;Scl;SSA;U1Sn核糖核蛋白;Mi-1;Mi-1;Jo-1;Ku;以及SRP。硬皮病组可以包括Scl-70;着丝粒;U1核糖核蛋白;以及微丝聚集蛋白。恶性贫血组可以包括内因子;以及胃H/K ATP酶的糖蛋白β亚基。系统性红斑狼疮(SLE)的表位抗原可以包括DNA;磷脂;核抗原;Ro;La;U1核糖核蛋白;Ro60(SS-A);Ro52(SS-A);La(SS-B);钙网蛋白;Grp78;Scl-70;组蛋白;Sm蛋白;以及染色质,等等。在格雷夫斯病中,表位可以包括Na+/I-同向转运蛋白;促甲状腺素受体;Tg;以及TPO。
多核苷酸治疗-材料和方法
在详细描述本发明前,应当理解本发明不限于特定的制剂或者工艺参数,因为它们理所当然可以变化。还应理解本文使用的术语只是用于描述本发明的特定实施方式,而不是旨在限制。
尽管与本文描述的相似或者等同的大量材料和方法可用于实施本发明,本文描述了优选的材料和方法。
术语“多核苷酸”和“核酸”指磷酸二酯键连接的多个核苷酸单位(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或相关的结构上的变体)组成的聚合物。多核苷酸或核酸基本上可以是任意长度,通常从约六(6)个核苷酸至约109个核苷酸至约4000个核苷酸或更大。多核苷酸和核酸包括RNA、DNA、合成形式和混合的聚合物、有义链和反义链、双链或单链,也可以是化学或生物学修饰的或者能包含非天然或衍生的核苷酸碱基,本领域技术人员会容易地理解这点。这些修饰包括:例如,标记;甲基化;用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸;诸如不带电连接(例如,膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电连接(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧基部分(例如,多肽)、嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂、和修饰的连接(例如,α异头核酸等)的核苷酸间的修饰。还包括在通过氢键和其他化学相互作用结合指定序列的能力上模拟多核苷酸的合成分子。这些分子为本领域已知,包括,例如,在分子骨架上肽键取代磷酸键的那些分子。
本文使用的术语“启动子”指为起始RNA合成或“转录”而被RNA聚合酶识别的多核苷酸区域。启动子是自身载体的功能性元件之一,其调节转录效率并且因而调控自身载体编码的自身多肽的蛋白表达水平。启动子可以是“组成型的”,从而允许相关基因的持续转录,或者是“诱导型的”,并且因此受环境中不同物质的存在或缺失的调节。另外,启动子还可以是通用的,用于广泛的不同细胞类型的表达,或者具有细胞类型特异性,因此只在诸如肌肉细胞的特定细胞类型中活化或诱导。控制载体转录的启动子可以从各种来源中获得,例如,诸如多瘤病毒、猿病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒以及优选的巨细胞病毒的病毒基因组,或者获得自异源哺乳动物启动子,例如b-肌动蛋白启动子。所述SV40病毒的早期和晚期启动子就像人巨细胞病毒的即时早期启动子一样可方便地获得。
“增强子”指长约10-300个碱基对的顺式作用多核苷酸区域,其作用于启动子以增强该启动子的转录。增强子的方向和位置相对独立,并且可置于转录单位的5’或3’端、内含子内部或者该编码序列本身内。
本文使用的“终止序列”指向RNA聚合酶发出DNA转录终止信号的多核苷酸序列。终止序列产生RNA3’端,通常会在其上游处通过多聚腺苷化进行明显加工。使用的“多聚腺苷化”指向经转录的信使RNA的3’端非模板地添加约50个至约200个多聚腺苷酸(polyA)的核苷酸链。已在mRNA的3’非翻译区(UTR)内发现了“多聚腺苷化信号”(AAUAAA),并且该信号指定了转录本的切割位点及polyA尾巴的添加位点。转录终止和多聚腺苷化在功能上相联系,同时有效切割/多聚腺苷化所需的序列还构成了终止序列的重要元件(Connelly and Manley,1988)。
术语“DNA疫苗接种”、“DNA免疫”和“多核苷酸疗法”在本文中可以互换使用,是指以调节免疫反应为目的,向个体给予多核苷酸。使用表达外源微生物抗原的质粒的“DNA疫苗接种”是诱导保护性抗病毒或抗细菌免疫的公知方法(Davis,(1997);Hassett and Whitton,(1996);andUlmer et al.,(1996))。为了本发明的目的,“DNA疫苗接种”、“DNA免疫”或“多核苷酸疗法”是指给予编码一种或多种自身多肽的多核苷酸,所述自身多肽包括与疾病相关的一种或多种自体抗原表位。“DNA疫苗接种”的目的在于调节进行中的免疫反应以抑制自体免疫性破坏,用于治疗或预防自体免疫性疾病。对“DNA疫苗接种”做出反应的免疫反应调节可以包括将自身反应性淋巴细胞从Th1型转换为Th2型反应。对该免疫反应的调节可以全身发生或仅仅局部发生于遭受自体免疫性攻击的靶器官。
“自身载体”表示一种或者多种载体,其合起来包括编码一种或者多种自身蛋白、自身多肽、自身肽的多核苷酸,DNA或者RNA。本文使用的多核苷酸是编码本发明自身蛋白、自身多肽或者自身肽的一系列脱氧核糖核酸(包括DNA)或者核糖核酸(包括RNA)以及它们的衍生物。自身蛋白、自身多肽或者自身肽编码序列被插入合适的质粒表达自身盒(self-cassette)。一旦编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸被插入所述表达自身盒,则该载体被称作“自身载体”。在给予编码不止一种自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸的情况下,单个自身载体可以编码多种分离的自身蛋白、自身多肽或者自身肽。在一个实施方式中,利用内部核糖体再进入序列(IRES)或者其他从单个DNA分子表达多种蛋白的方法,在单个自身质粒中顺序编码DNA,所述DNA编码数种自身蛋白、自身多肽或者自身肽。制备并分离编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽的DNA表达自身载体,其利用用于分离质粒DNA的通常可获得的技术,所述技术诸如Qiagen公司商业化提供的那些。将DNA纯化为不含细菌内毒素,以便输送给人作为治疗剂。可选择地,在分离的DNA表达载体上编码各个自身蛋白、自身多肽或者自身肽。
术语“载体骨架”是指质粒载体部分而非编码自身抗原、自身蛋白、自身多肽或者自身肽的序列部分。
“免疫抑制性载体骨架”是指符合以下条件的载体骨架:(i)与亲代载体骨架相比,引发减弱的免疫反应,或者(ii)阻止或者抑制免疫反应。可以利用本领域已知的体外或者体内分析测量所述免疫反应。例如,通过测量暴露于载体骨架的淋巴细胞增殖,或者测量指示免疫刺激的细胞因子生成(例如,IL-2,IFN-γ,IL-6)(在细胞培养基、血清中,等等),来确定免疫反应。在一些实施方式中,与亲代载体骨架相比,免疫抑制性载体骨架包含更少的免疫刺激性序列(例如,CpG序列)。在一些实施方式中,免疫抑制性载体骨架包含一种或者多种免疫抑制性序列(IIS),例如,在本文中描述和本领域已知的。在一些实施方式中,免疫抑制性载体骨架促进Th2免疫反应,但抑制Th1免疫反应。
本文使用的“自身抗原、自身蛋白、自身多肽或者自身肽”是指符合下列条件的任意蛋白、多肽或者肽或者其片段或者衍生物:在动物基因组内编码;在该动物中产生或者生成;可以在该动物生命过程的某段时间进行翻译后修饰;并且,非生理地存在于该动物中。本发明的自身抗原、自身蛋白、自身多肽或者自身肽还被称为自体抗原。通过缺失部分编码序列,以及在某些情况下插入新的编码甲硫氨酸的ATG起始密码子,插入新的终止密码子,和/或缺失、去除或者修饰其他序列以产生自身蛋白、自身多肽或者自身肽的片段或者衍生物,可以生成片段和衍生物。术语“非生理的”或“非生理地”用于描述本发明所述自身蛋白、自身多肽或自身肽时,指对所述自身蛋白、自身多肽或自身肽在动物体内的正常作用或过程的脱离或偏差。把所述自身蛋白、自身多肽或自身肽称作“疾病相关的”或“参与疾病”时,应理解为所述自身蛋白、自身多肽或自身肽可以在形式上或结构上被修饰,并因此不能发挥其生理作用或进行其生理过程,或者可以参与所述状况或疾病的病理生理,所述参与是通过诱导病理生理,介导或促进病理生理过程;和/或通过成为病理生理过程的靶标而进行的。例如,在自体免疫性疾病中,免疫系统异常攻击自身蛋白,造成表达和/或存在该自身蛋白的细胞和组织的损伤和机能障碍。自身蛋白、自身多肽或自身肽的翻译后修饰的实例是糖基化、添加脂质基团、通过磷酸酶的去磷酸化、添加二甲基精氨酸残基、通过肽基精氨酸脱亚氨酸酶(PAD)将微丝聚集蛋白和纤维蛋白瓜氨酸化、α□-晶体蛋白的磷酸化、MBP的瓜氨酸化,以及通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)和颗粒酶(granzymes)的SLE自体抗原蛋白水解。在免疫学上,认为自身蛋白、自身多肽或自身肽都是宿主自身抗原,并且在正常生理情况下,宿主免疫系统会通过称为“免疫耐受”的过程经清除、灭活、或失活具有识别自身抗原能力的免疫细胞来忽略自身蛋白、自身多肽或自身肽。抗原是指可以被免疫系统识别即被B细胞或者T细胞或者这两者识别的分子。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括免疫蛋白、多肽或肽,所述免疫蛋白、多肽或肽是出于调节免疫功能的目的专门由免疫系统的细胞生理地、特异地表达的分子。免疫系统是防御机制,该防御机制提供的手段可对居住在动物界的无数的潜在致病微生物进行快速、高度特异且是保护性的反应。免疫蛋白、多肽或肽的实例是蛋白,所述蛋白包括T细胞受体、免疫球蛋白、包括I型白介素的细胞因子、和包括干扰素与IL-10的II型细胞因子、TNF、淋巴毒素、和诸如巨噬细胞炎性蛋白-1α和β、单核细胞-趋化性蛋白和RANTES的趋化因子、以及诸如Fas-配体的直接参与免疫功能的其他分子。存在包括在本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽中的某些免疫蛋白、多肽或肽,其为:I类MHC膜糖蛋白、II类MHC糖蛋白和骨桥蛋白。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括蛋白、多肽和肽,所述蛋白、多肽和肽由于造成代谢或功能病症的遗传性或获得性缺陷而在个体中完全或基本上不存在,并且通过给予所述蛋白、多肽或肽或者通过给予编码所述蛋白、多肽或肽的多核苷酸(基因治疗)被替代。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括细胞特异且专门表达的蛋白、多肽和肽,所述细胞具有可将它们与正常细胞区分的特性,其包括:(1)克隆性,它代表遗传改变后的单一细胞的增殖,从而形成恶性T细胞克隆,(2)自律性,它表示对生长的不适当调节,以及(3)退变性,或正常协同细胞分化的缺乏。具有前述三条标准的一条或多条的细胞称作肿瘤T细胞、癌症T细胞或恶性T细胞。
本文使用的“调节(modulation of)、调节(modulating)或者改变免疫反应”指对针对自身分子的现存的或潜在的免疫反应的改变,所述自身分子包括但不限于,核酸、脂质、磷脂、糖、自身蛋白、自身多肽、自身肽、蛋白复合体或核蛋白复合体或者其衍生物,所述改变是给予编码自身蛋白、自身多肽、自身肽、核酸的多核苷酸或者其片段或者其衍生物的结果。这种调节包括对参与或能够参与免疫反应的免疫细胞的存在、能力或功能的改变。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、NK T细胞、专职抗原呈递细胞、非专职抗原呈递细胞、炎性细胞或能够参与或影响免疫反应的另外细胞。调节包括对现存免疫反应、正在进展的免疫反应、潜在的免疫反应造成的任何变化,或诱导、调节、影响或反应免疫反应的能力。调节包括对作为免疫反应一部分的免疫细胞内基因、蛋白和/或其他分子的表达和/或功能的改变。
“免疫反应的调节”包括但不限于:免疫细胞的清除、去除或隔离;免疫细胞的诱导或产生,所述免疫细胞能调节诸如自体反应性淋巴细胞、APCs或炎性细胞的其他细胞的功能性能力;免疫细胞无反应状态的诱导,称为无反应性;免疫细胞活性或功能的提高、降低或改变或者进行这样(包括但不限于改变所述细胞表达的蛋白类型)的能力。实例包括某些类的分子的经改变的生产和/或分泌,所述分子例如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、协同刺激分子或其他细胞表面受体;或者所述调节性事件的组合。
例如,编码自身蛋白、自身多肽、自身肽的多核苷酸能调节免疫反应,其通过清除、隔离或着灭活调节或能够调节不希望免疫反应的免疫细胞;诱导、产生或开启调节或能够调节保护性免疫反应的免疫细胞;改变免疫细胞的生理性或功能性性质;或这些效果的组合。测量免疫反应的调节的实例包括但不限于,检验免疫细胞群的存在与否(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微术、聚合酶链式反应);测量免疫细胞功能性能力,其包括在对信号反应时增殖或分裂的能力或抵抗力(例如使用基于3H-胸苷掺入跟踪刺激(3H-thymidine incorporation followingstimulation)的T细胞增殖分析和肽扫描分析,其使用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、PMA、载有肽或蛋白抗原的抗原呈递细胞;B细胞增殖试验);测量杀死或裂解其他细胞的能力(例如细胞毒性T细胞试验);测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验、蛋白印记分析、蛋白微阵列分析、免疫沉淀分析);测量免疫细胞活化生化标志物或免疫细胞内的信号通路(对酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割和蛋白复合体形成或解离的蛋白印记和免疫沉淀分析;蛋白阵列分析;使用DNA阵列或差减杂交的DNA转录图谱);测量凋亡、坏死或其他机制导致的细胞死亡(测量DNA梯状条带、组织学的微管连接蛋白V染色、TUNEL试验、凝胶电泳;荧光天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶试验,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶底物的蛋白印记分析);测量免疫细胞产生的基因、蛋白和其他分子(Northern印记分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白微阵列、双向凝胶电泳、蛋白印记分析、酶联免疫吸附试验、流式细胞术);测量临床后果,例如对自体免疫性疾病、神经变性性疾病、和涉及非生理的自身蛋白的其他疾病的改善(临床评分、使用附加疗法的要求、功能性状态、成像研究)。
本文使用的“免疫调节序列(IMSs)”是指由脱氧核苷酸、核糖核苷酸或者其类似物组成的化合物,它们调节自体免疫性或者炎性疾病。IMSs可以是整合入载体的核苷酸序列。“寡核苷酸”表示多个核苷酸。核苷酸是包括与磷酸基以及可互换的有机碱基连接的糖(优选核糖或者脱氧核糖)的分子,其可以是被取代的嘌呤(鸟嘌呤(G),腺嘌呤(A)或者肌苷(I))或者被取代的嘧啶(胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))。寡核苷酸是指寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸,后者在本文中被称为ODNs。ODNs包括寡核苷(即去除磷酸盐的寡核苷酸)和其他含有机碱的聚合物。寡核苷酸包括来自两个或者更多连接的核苷酸链的任意长度的多个核苷酸,包括了包含百万个连接的核苷酸的染色体材料。
在某些变化中,用于治疗自体免疫性疾病的方法包括给予包括CpG寡核苷酸的调节免疫反应的佐剂,以便增强免疫反应。CpG寡核苷酸或者刺激性IMSs已经被证明增强DNA疫苗接种的抗体反应(Krieg et al.,Nature,374:546-9(1995))。CpG寡核苷酸将由纯化的骨架寡核苷酸组成,所述骨架在体内抗降解,诸如硫代磷酸酯骨架。可用于本发明的刺激性IMS包括下列核心六聚物:
5′-嘌呤-嘧啶-[C]-[G]-嘧啶-嘧啶-3′
或者
5′-嘌呤-嘌呤-[C]-[G]-嘧啶-嘧啶-3′;
免疫刺激性IMSs核心六聚物的5’和/或3’可以侧翼连接任何组合或任意数目的核苷酸或核苷。优选地,刺激性IMSs的长度范围为6到100碱基对,并且最优选地,长16-50碱基对。刺激性IMSs还可作为更大DNA片段的部分输送,其范围从100到100,000碱基对。刺激性IMSs能引入或已存在于DNA质粒、病毒载体和基因组DNA。最优选地,刺激性IMSs的大小范围还能从6(无侧翼序列)到10,000碱基对或者更大。可以构建位于该六聚物核心侧翼的序列,使其基本上匹配出现在任何已知免疫刺激性序列(ISS)中的侧翼序列。例如,侧翼序列TGACTGTG-Pu-Pu-C-G-Pyr-Pyr-AGAGATGA,其中TGACTGTG和AGAGATGA为侧翼序列。另一优选侧翼序列并入一系列的嘧啶(C、T和U),或作为重复两次或多次的单一嘧啶,或作为两个长或更长的不同嘧啶的混合物。已使用不同侧翼序列测试抑制性调节序列,并可以被改造为刺激性调节序列。侧翼序列的进一步实例包括在下列参考文献中:美国专利第6,225,292号和第6,339,068号,以及Zeuner et al.,Arthritis andRheumatism,46:2219-24,(2002)。
适于使用本发明的修饰的自身载体给药的特定刺激性IMSs包括了包含下列六聚物序列的寡核苷酸:
5′-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3′IMSs,包含CG二核苷酸核心:GTCGTT,ATCGTT,GCCGTT,ACCGTT,GTCGCT,ATCGCT,GCCGCT,ACCGCT,GTCGTC,ATCGTC,GCCGTC,ACCGTC,等等;
鸟嘌呤和肌苷通常可以取代腺嘌呤,和/或尿苷通常可以取代胞嘧啶或者胸腺嘧啶,并且基于上述指导的阐述可以实现这些取代。可选择地,可以按照上文关于IMSs的详细描述,将ISS-ODNs包含进自身载体。特别有用的ISS包括小鼠最适CpG元件AACGTT。可以在载体的单个或者多个位点向修饰的自身载体添加单个ISS或者多个ISS,只要不破坏其他功能候选物(electors)。在一个示例性的实施例中,被添加到修饰的自身载体的ISS包括紧挨启动子上游的一组5个小鼠最适CpG元件(AACGTT)。
在某些变化中,用于治疗自体免疫性疾病的方法还包括给予包括抑制性IMS或者免疫抑制性序列(IIS)的多核苷酸。用于本发明的IISs包括下列核心六聚物:
5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’
或
5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’;
其中X和Y是任何天然存在或合成的核苷酸,除了X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。
IMSs核心六聚物的5’和/或3’可以侧翼连接任何组合或任意数目的核苷酸或核苷。优选地,IMSs的长度范围为6到100碱基对,并且最优选地,长16-50碱基对。IMSs还可作为更大DNA片段的部分输送,其范围从100到100,000碱基对。IMSs能并入或已存在于DNA质粒、病毒载体和基因组DNA。最优选地,IMSs的大小范围还能从6(无侧翼序列)到10,000碱基对或者更大。可以构建位于该六聚物核心侧翼的序列,使其基本上匹配出现在任何已知免疫抑制性序列(IIS)中的侧翼序列。例如,侧翼序列TTGACTGTG-Pu-Pyr-X-Y-Pyr-Pyr-AGAGATGA,其中TTGACTGTG和AGAGATGA为侧翼序列。另一优选侧翼序列并入一系列的嘧啶(C、T和U),或作为重复两次或更多次的单一嘧啶,或作为两个长或更长的不同嘧啶的混合物。已使用不同侧翼序列测试抑制性调节序列。作为抑制性寡核苷酸的侧翼序列的进一步实例包括在下列参考文献中:美国专利第6,225,292号和第6,339,068号,以及Zeuner et al.,Arthritis andRheumatism,46:2219-24,(2002)。
本发明的特定IISs包括了包含下列六聚物序列的寡核苷酸:
1.5′-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3′IMSs,包含CG二核苷酸核心:GTGGTT,ATGGTT,GCGGTT,ACGGTT,GTGGCT,ATGGCT,GCGGCT,ACGGCT,GTGGTC,ATGGTC,GCGGTC,ACGGTC,等等。
2.5′-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3′IMSs,包含CG二核苷酸核心:GTGCTT,ATGCTT,GCGCTT,ACGCTT,GTGCCT,ATGCCT,GCGCCT,ACGCCT,GTGCTC,ATGCTC,GCGCTC,ACGCTC,等等。
鸟嘌呤和肌苷取代腺嘌呤,和/或尿苷取代胞嘧啶或者胸腺嘧啶,并且基于上述指导的阐述可以实现这些取代。
在本发明的某些实施方式中,所述IMS核心六聚物区域的5’或3’末端侧翼连接多聚G区域,或者5’和3’末端侧翼均连接多聚G区域。本文使用的“多聚G区域”或“多聚G基序”指由至少两(2)个邻接鸟嘌呤碱基组成的核酸区域,其通常由2-30或2-20个邻接鸟嘌呤组成。在一些实施方式中,所述多聚G区域具有2-10、4-10或4-8个邻接鸟嘌呤碱基。在某些优选实施方式中,所述侧翼多聚G区域邻接于该核心六聚物。但是在其他实施方式中,所述多聚G区域通过非多聚G区域(非多聚G连接子)与该核心六聚物连接;通常,所述非多聚G连接子区域具有不超过6个、更典型地不超过4个和最典型地不超过2个核苷酸。
本发明的其他实施方式中,治疗自体免疫性疾病的方法包括给予改进的免疫调节序列,所述免疫调节序列包括:
1.)六聚物序列5′-嘌呤-嘧啶[1]-[X]-[Y]-嘧啶[2]-嘧啶[3]-3′;其中X和Y是任意天然存在或者合成的核苷酸,除了
a.X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤;
b.当嘧啶[2]是胸腺嘧啶时,X和Y不能是胞嘧啶-胞嘧啶;
c.当嘧啶[1]是胞嘧啶时,X和Y不能是胞嘧啶-胸腺嘧啶
2.)所述六聚物序列5′的CC二核苷酸,其中所述CC二核苷酸是所述六聚物序列的1-5个核苷酸的5′;和
3.)所述六聚物序列的多聚G区域3′,其中多聚G包括至少3个邻接G,并且是所述六聚物序列的2-5个核苷酸的3′,其中所述免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列。
在本发明的另外其他实施方式中,治疗自体免疫性疾病的方法包括给予改进的免疫调节序列,所述免疫调节序列包括:
1.)六聚物序列5′-嘌呤-嘧啶-[Y]-[Z]-嘧啶-嘧啶-3′;其中X和Y是鸟嘌呤-鸟嘌呤;
2.)所述六聚物序列5′的CC二核苷酸,其中CC二核苷酸是六聚物序列的1-5个核苷酸的5′;和
3.)所述六聚物序列的多聚G区域3′,其中多聚G包括至少2-10个邻接G,并且是所述六聚物序列的2-10个核苷酸的3′,
其中所述免疫调节序列不包含胞嘧啶-鸟嘌呤序列。
在优选的实施方式中,所述六聚物序列的X和Y是GpG。在其他优选的实施方式中,所述六聚物序列是5′-GTGGTT-3′。在其他优选的实施方式中,CC二核苷酸是所述六聚物序列的2个核苷酸的5′。在其他优选的实施方式中,所述多聚G区域包括3个邻接的鸟嘌呤碱基,并且是所述六聚物序列的2个核苷酸的3′。在一个优选的实施方式中,改进的免疫调节序列是5′-CCATGT GGTTATGGGT-3′。
IMS还包括长至少8个核苷酸的抑制性寡核苷酸,其中该寡核苷酸形成G四分体,该G四分体的圆二色性(CD)值大于约2.9,并且鸟苷的数量至少为2(国际专利申请号WO 2004/012669通过引用整体并入本文)。CD定义为左手和右手圆偏振光的差异吸收。G四分体是G富集的DNA片段,能形成复杂的二级和/或三级结构。更为具体地,1)G四分体包括平面连接的四个鸟苷,其按环状氢键排列,其包括非Watson Crick碱基配对,和2)G四分体需要两个更为邻接的鸟苷或六聚物区域,其中超过50%的所述碱基是鸟苷。实例包括具有至少1个并且优选地2-20个TTAGGG基序的寡核苷酸。其他有用的抑制性寡核苷酸包括但不限于符合下列之一的有用的抑制性寡核苷酸:(TGGGCGGT)X,其中x优选地为2-100,并且更为优选地为2-20;GGGTGGGTGGGTATTACCATTA;TTAGGGTTAGGGTCAACCTTCA;或(G)GG(C/G)AAGCTGGACCTTGGGGG(G)。
寡核苷酸可以从现有的核酸来源获得,包括基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA和cDNA,但优选的是通过寡核苷酸合成产生的合成寡核苷酸。IMS可以是单链或者双链DNA、RNA和/或寡核苷的一部分。
IMS优选地是包含非甲基化的GpG寡核苷酸的寡核苷酸。可选择的实施方式包括其中一种或多种腺嘌呤或胞嘧啶残基被甲基化的IMS。在真核细胞中,胞嘧啶和腺嘌呤残基通常可以被甲基化。
寡核苷可以被并入IMS的内部区域和/或5′和/或3′末端,并且这类寡核苷可以被用作其他自身分子的连接点,所述自身分子包括自身脂,自身蛋白,自身肽,自身多肽,自身糖脂,自身糖,自身糖蛋白和翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或者自身糖蛋白,或者作为其他免疫调节治疗剂的连接点。可以修饰末端、磷酸基、碱基和糖部分以构建具有其它性能的IMSs。
IMS可以是稳定的和/或不稳定的寡核苷酸。稳定的寡核苷酸指在体内相对抗降解的寡核苷酸,该降解通过核酸外切酶、核酸内切酶和其他降解途径进行。优选的稳定的寡核苷酸具有修饰的磷酸盐骨架,并且最为优选的寡核苷酸具有硫代磷酸酯修饰的磷酸盐骨架,其中至少一种所述磷酸氧由硫替代。骨架磷酸盐基团修饰包括膦酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键,其能向IMS提供抗菌性质。IMS优选稳定的寡核苷酸,优选地使用硫代磷酸酯稳定的寡核苷酸。
可选择的稳定的寡核苷酸包括:烷基磷酸三酯和磷酸二酯,其中带电氧被烷化;芳基膦酸酯和烷基膦酸酯,它们是非离子DNA类似物,其中带电膦酸氧由芳基或烷基替代;或/和在一端或两端含六聚乙二醇或四聚乙二醇、或另一个二醇的寡核苷酸。可使用可选择的空间构型将糖部分附于IMS的核苷碱基上。
位于竞争性二核苷酸侧翼的IMS的核苷酸碱基可以是已知天然存在的碱基或者合成的非天然碱基。使用常规技术可以将寡核苷并入IMS-ON的内部区域和/或末端作为其他化合物的连接点,所述化合物包括自身脂,自身蛋白,自身肽,自身多肽,自身糖脂,自身糖,自身糖蛋白和翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或者自身糖蛋白,或者作为其他免疫调节治疗剂的连接点。还可以采用本领域普通技术人员已知的任意方式修饰IMS-ON的碱基、糖部分、磷酸基和末端,以构建具有除IMS-ON调节活性之外的所需性质的IMS-ON。例如,糖部分可以采用任意空间构型连接于IMS-ON的核苷酸碱基。
对寡核苷酸进行这些磷酸盐基团修饰的技术为本领域公知,并且不需要详细的解释。为回顾这样的有用技术,制备用作靶核苷酸产物的磷酸三酯中间体,并且使用含水碘或诸如无水胺的其他试剂将其氧化为天然存在的磷酸三酯。产生的寡核苷酸氨基磷酸酯可使用硫处理以产生硫代磷酸酯。可以应用同样的常规技术(除硫处理步骤之外)以从膦酸甲酯产生甲基亚磷酰胺。美国专利第4,425,732号、第4,458,066号、第5,218,103号和第5,453,496号,以及Tetrahedron Lett,at 21:414925(1995),7:5575(1986)和25:1437(1984)和Journal Am.ChemSoc.,93:6657(1987)进一步描述了关于磷酸盐基团修饰技术的细节,本领域普通技术人员可能希望参考,将这些的公开内容并入本文,以达到说明本领域关于IMS的组合物及制备的知识水平的目的。
特别有用的磷酸盐基团修饰是转化为该IMS-ON寡核苷酸的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯形式。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯较之其未经修饰的寡核苷酸对应物,在体内更能抵抗降解,这使所述宿主更能获得本发明的IMS-ON。
可以使用本领域公知的技术和核酸合成设备合成IMS-ON。这方面的文献可以参见,例如,Ausubel,et al,Current Protocols in Molecular Biology,Chs.2 and 4(分子生物学当前实验操作,第2章和4章)(Wiley Interscience,(1989));Maniatis,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册)(Cold Spring Harbor Lab.,New York,(1982));美国专利第4,458,066号;和美国专利第4,650,675号。为了证明本领域关于制备合成寡核苷酸的知识水平,将这些文献通过引用并入本文。
可选择地,通过突变分离到的微生物免疫刺激性序列(ISS),用竞争性二核苷酸取代天然存在的CpG基序和侧翼核苷酸,可以获得IMS-ON。依赖核酸杂交的筛选步骤实现了从任何生物体分离任何多核苷酸序列,前提是能获得所述合适的探针或抗体。能够化学合成寡核苷酸探针,该寡核苷酸探针对应编码所述蛋白的序列的一部分。这需要已知氨基酸序列的寡肽小段。还能从遗传密码推导编码该蛋白的DNA序列,但是必须考虑所述密码子的简并度。
例如,可以筛选cDNA文库,所述cDNA文库据信包括含ISS的多核苷酸,所述筛选通过向卵母细胞注射源自cDNA的各种mRNA,留出足够时间,使所述cDNA基因产物开始表达,并通过测试所需cDNA表达产物的存在而完成,所述测试例如,通过使用特异于所关注多核苷酸编码的肽的抗体,或者通过使用针对由所关注多核苷酸编码的肽的重复基序和组织表达类型特征的探针。可选择地,使用特异于该肽的抗体可以间接筛选cDNA文库,寻找所关注的具有至少一个表位的肽的表达。所述抗体可以是多克隆来源的或单克隆来源的,并且可用于检测表达产物,该表达产物指示所关注cDNA的存在。
一旦获得所述包含ISS的多核苷酸,便可以使用常规技术通过例如酶切将其缩短至所需的长度。随后将ISS-ODN寡核苷酸产物内的CpG基序突变,用“抑制性”二核苷酸(使用本发明方法鉴定)取代该CpG基序。在具有已知序列的DNA内的特定位点进行取代突变的技术是公知的,例如通过PCR的M13引物突变。该IMS是非编码的,因此进行取代突变时,无需关心维持开放阅读框。然而,为在体内使用,应当使该多核苷酸起始材料、ISS-ODN寡核苷酸中间体或IMS突变产物是基本上纯的(即,使用本领域普通技术人员公知和选择的可用技术时,尽可能不含天然存在的污染物和LPS)。
可以单独使用本发明的IMS,或者将该IMS以顺式或反式并入重组自身载体(质粒、粘粒、病毒或逆转录病毒),其反过来可以编码可由重组表达载体输送的任意自身蛋白、自身多肽或者自身肽。为方便起见,优选地,给予未并入表达载体的IMS。然而,如果需要并入表达载体,这种并入可以使用本领域普通技术人员已知的常规技术实现。为了回顾的目的,普通技术人员可以参考Ausubel,Current Protocols in MolecularBiology(分子生物学当前实验操作),上文。在一些实施方式中,IMS可以与超过生理水平的一种或者二价阳离子共给予。
简单来说,重组表达载体的构建使用标准连接技术。为了进行分析以证实构建载体中正确的序列,可以将连接混合物转化宿主T细胞,并通过合适的抗生素抗性选择成功的转化体。制备来自转化体的载体,将其通过例如Messing等人的方法(Nucleic AcidsRes.,9:309(1981)),Maxam等的方法(Methods in Enzymology,65:499(1980))或者本领域技术人员已知的其他合适方法,进行限制性分析和/或测序。利用Maniatis等描述的常规凝胶电泳法(Molecular Cloning(分子克隆),pp.133-134(1982),进行被切割片段的大小分离。
可以用本发明的表达载体转化宿主T细胞,并将其在被修饰成适合诱导启动子、筛选转化体或者扩增基因的常规营养培养基中培养。培养条件诸如温度、pH等等与之前选择宿主T细胞的表达所使用的一样,这对普通技术人员来说是显而易见的。
如果重组表达载体被用作本发明IMS-ON的载体,质粒和粘粒是特别优选的,因为它们不具有致病性。但是,质粒和粘粒在体内比病毒降解得更快,因此可能不会输送足够剂量的IMS-ON以预防或者治疗炎性或者自体免疫性疾病。
大部分构建载体以及转染和感染T细胞的技术在本领域被广泛实施,并且大部分从业者熟悉描述特定条件和步骤的标准资源材料。
“质粒”和“载体”用小写p后接字母和/或数字来命名。起始质粒是商品化供应的,公众可以不受限制的获得,或者可以根据公开的步骤利用现有质粒构建。此外,与那些描述的质粒等同的质粒是本领域已知的,并且对普通技术人员来说是显而易见的。“载体”或者“质粒”是指遗传成分,当其存在于宿主T细胞时,通过包括合适的控制和调控元件能够复制。为本发明的目的,载体或者质粒的实例包括,但不限于,质粒,噬菌体,转座子,粘粒,病毒,等等。
本发明载体的构建使用标准连接和限制性技术,这是本领域公知的(参见Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学当前实验操作),(1987),Wiley-Interscience或者Maniatis et al.,Molecular Cloning:Alaboratory Manual(分子克隆:实验手册)(Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.),(1992))。分离的质粒、DNA序列或者合成的寡核苷酸以所需形式被切割、定制和降解(relegate)。通过DNA序列分析(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,74:5463-5467(1977))确认所有并入合成DNA的DNA构建体的序列。
DNA的“消化”是指限制性酶对DNA的催化切割,所述限制性酶只作用于DNA的某些序列,即限制性位点。本文使用的各种限制性酶是商品化供应的,它们的反应条件、辅助因子和其他要求是普通技术人员已知的。对于分析目的,1μg质粒或者DNA片段通常使用溶于大约20μl缓冲液的大约2单位酶。可选择地,使用过量的限制性酶以确保DNA底物的完全消化。在大约37℃大约1小时到2小时的孵育时间是可行的,但是变化也是可以接受的。每次孵育后,通过苯酚/氯仿萃取去除蛋白,可以继之用乙醚萃取,通过乙醇沉淀从水性部分回收核酸。如果需要,可以利用标准技术通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳进行切割片段的大小分离。在MethodsofEnzymology(酶学方法),65:499-560(1980)中可以发现大小分离的概述。
在4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)存在的条件下,在50mM Tris(ph7.6)、50mM NaCl、6mM MgCl2、6mM DTT和5-10μM dNTP中20℃孵育大约15-25分钟,利用大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的大片段(Klenow)处理使限制性切割片段成为平末端。即使存在4种dNTP,Klenow片段仍然填充5′粘性末端,但消化突出的3′单链。如果需要,通过只提供dNTP的一种,或者提供挑选的dNTP,可以进行选择性修复,但这受到粘性末端特性的限制。经Klenow处理后,所述混合物用苯酚/氯仿萃取,并用乙醇沉淀。合适条件下用S1核酸酶或者Bal-31处理导致单链部分的水解。
在下列标准条件和温度的15-50μl体积中进行连接:20mM Tris-Cl pH7.5,10mM MgCl2,10mM DTT,33mg/ml BSA,10mM-50mM NaCl,以及40um ATP,0.01-0.02(Weiss)单位T4DNA连接酶,0℃下(为了“粘性末端”连接),或者1mM ATP,0.3-0.6(Weiss)单位T4DNA连接酶,14℃下(为了“平末端”连接)。通常在33-100μg/ml总DNA浓度(5-100mM总末端浓度)进行分子间“粘性末端”连接。在1μM总末端浓度进行分子间平末端连接(通常使用10-30倍摩尔的过量连接子)。
表达自身盒将使用在宿主T细胞中起作用的启动子。通常,对于特定宿主T细胞使用的载体,其包含的启动子和调控序列源自与宿主T细胞相容的物种。适用于原核宿主的启动子例如包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统,碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统以及杂交启动子诸如tac启动子。但是,其他功能性细菌启动子也是合适的。除原核生物外,还可以使用真核微生物诸如酵母培养物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者常见的面包酵母是使用最普遍的真核微生物,尽管通常还提供大量其他菌株。在哺乳动物宿主T细胞中控制载体转录的启动子可以获得自各种来源,例如,病毒的基因组诸如:多瘤病毒,猿病毒40(SV40),腺病毒,逆转录病毒,乙型肝炎病毒以及优选的巨细胞病毒,或者来自异源哺乳动物启动子,例如,β-肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子可以方便的作为SV40限制性片段获得,所述SV40限制性片断还包含SV40病毒复制原点。人巨细胞病毒的即时早期启动子可以方便的作为HindIII限制性片段获得。当然,来自宿主T细胞或者相关物种的启动子也可以在本文中使用。
本文使用的载体可以包含选择基因,又被称为选择性标志物。选择基因编码蛋白,该蛋白对所述载体转化的宿主T细胞的存活或者生长是必需的。用于哺乳动物细胞的合适选择性标志物的实例包括二氢叶酸还原酶基因(DHFR),鸟氨酸脱羧酶基因,多药耐药基因(mdr),腺苷脱氨酶基因,和谷氨酰胺合酶基因。当这类选择性标志物被成功转入哺乳动物宿主T细胞时,如果被置于选择压力下,被转化的哺乳动物宿主T细胞可以存活。存在两种广泛使用的不同类型的选择方式。第一种类型是基于细胞代谢并使用突变的T细胞系,所述突变T细胞系缺乏独立于补充培养基生长的能力。第二种类型被称作显性选择,是指在任意细胞类型中使用的选择方案,不需要使用突变的T细胞系。这些方案通常使用药物抑制宿主T细胞的生长。那些具有新基因的细胞将表达具有抗药性的蛋白,并将在选择中存活。这类显性选择的实例使用药物新霉素(Southern and Berg,J.Molec.Appl.Genet.,1:327(1982)),霉酚酸(Mulligan and Berg,Science,209:1422(1980))或者潮霉素(Sugden et al.,Mol Cell.Bio.,5:410-413(1985))。上文给出的3个实例使用受真核控制的细菌基因以分别传递针对适当药物新霉素(G418或者庆大霉素)、xgpt(霉酚酸)或者潮霉素的抗性。
可选择地利用基于抑制物滴定法的无抗生素选择,将本文使用的载体在宿主T细胞中增殖(Cranenburgh et al.,2001)。将所述载体修饰为包含lac操纵子,其或作为lac启动子的一部分,或具有采取最适间隔的lacO1和lacO3操纵基因,所述最适间隔是在质粒载体的pUC系列中发现的。可选择地,lacO1操纵基因或者lacO的回文形式可以用于分离作为单个或者多个拷贝(Cranenburgh et al.,2004)。可以将lac操纵子序列并入所述载体内任意位置的单个或者多个位点,以便不干扰所述载体的其他功能组分。在优选的实施方式中,使用合成的大肠杆菌lac操纵子二聚体操纵基因(Genbank登录号K02913)。lac操纵子可以被添加到不含合适选择性标志物的载体以提供选择性,可以在另一选择性标志物之外再被添加,或者用于代替选择性标志物,尤其是抗生素抗性标志物,以制备更适于治疗应用的载体。利用关键基因在遗传修饰的大肠杆菌中选择包含lac操纵子的载体,所述关键基因包括dapD,其受lac启动子(lacOP)控制,因此可以通过滴定lacOP的lac抑制并允许dapD表达使修饰的宿主T细胞存活。合适的大肠杆菌菌株包括DH1lacdapD和DH1lacP2dapD(Cranenburgh et al.,2001)。
可用于本文所述方法的特别合适的一种核酸载体是核酸表达载体,其中用非CpG二核苷酸取代式5′-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3′或者5′-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3′所示的一个或者多个CpG二核苷酸,从而产生免疫刺激活性降低的载体。例如,CpG二核苷酸的胞嘧啶可以用鸟嘌呤取代,从而产生具有式5′-嘌呤-嘧啶-G-G-嘧啶-嘧啶-3′或者5′-嘌呤-嘌呤-G-G-嘧啶-嘧啶-3′所示GpG基序的IMS区。还可以用任意其他的非胞嘧啶核苷酸取代所述胞嘧啶。取代可以利用例如定点诱变来实现。被取代的CpG基序通常是那些没有位于载体重要调控区(例如,启动子区域)的CpGs。此外,当所述CpG位于表达载体的编码区域内时,非胞嘧啶取代通常经选择以产生沉默突变或者对应于编码氨基酸保守取代的密码子。
例如,在某些实施方式中,用于构建自身载体的载体是经修饰的pVAX1载体(SEQ ID NO:1),其中通过用非胞嘧啶核苷酸取代CpG二核苷酸的胞嘧啶,来突变式5′-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3′所示的一个或者多个CpG二核苷酸。pVAX1载体是本领域已知的,由Invitrogen(Carlsbad,CA)商品化供应。在一个示例性的实施方式中,经修饰的pVAX1载体在CpG基序内具有下列胞嘧啶到非胞嘧啶的取代:核苷酸784、1161、1218和1966的胞嘧啶变为鸟嘌呤;核苷酸1264、1337、1829、1874、1940和1997的胞嘧啶变为腺嘌呤;以及核苷酸1963和1987的胞嘧啶变为胸腺嘧啶;还有核苷酸1831、1876、1942和1999的其他胞嘧啶向鸟嘌呤的突变。(上文描述的核苷酸数字命名根据Invitrogen提供的pVAX1编号系统。)pVAX1中剩余的4个原型CpG元件位于该载体的重要调控区内,因此没有被修饰。将如此构建的载体命名为BHT-1(SEQ ID NO:2)。WO 2004/047734描述了BHT-1的制备和使用。
在一些实施方式中,本发明提供包括BHT-1表达载体骨架和多核苷酸的自身载体,所述多核苷酸编码与多发性硬化相关的自身蛋白、自身多核苷酸或者自身肽。在某些实施方式中,所述自身载体的多核苷酸编码人蛋白脂蛋白(PLP)。在其他实施方式中,所述自身载体的多核苷酸编码人髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)。在另外其他实施方式中,所述自身载体的多核苷酸编码人髓磷脂少突细胞蛋白(MOG)。在优选的实施方式中,所述自身载体的多核苷酸编码人髓磷脂碱性蛋白(MBP)。在本发明最优选的实施方式中,所述自身载体是BHT-3009(SEQ ID NO:3),其中BHT-3009包括BHT-1表达载体骨架和编码人髓磷脂碱性蛋白的多核苷酸。
“转染”表示将DNA引入宿主T细胞以便所述DNA被表达,不论是否是功能性表达;所述DNA还可以作为染色体外元件或者通过染色体整合进行复制。除非另有规定,本文实施例中使用的转化宿主T细胞的方法是Graham和van der Eb(Virology,52:456-457(1973))的磷酸钙共沉淀方法。可以利用本领域已知的适于将胞外核酸引入宿主T细胞的任意方法进行转染,所述方法包括但不限于,使用转染促进剂或者步骤,所述步骤例如磷酸钙共沉淀,锌或其他相关金属阳离子诱导的沉淀(金属阳离子产生磷酸盐或者氢氧化物的沉积颗粒,DNA对该颗粒具有强亲和力,导致DNA:金属磷酸盐共沉淀-需要亚毫摩(submillimolar)或者毫摩浓度的锌或者其他金属)(参见Kejnovsky and Kypr,Nucleic Acids Research,26:5295-99(1998)),超浓缩溶液以诱导DNA沉淀,将DNA与金或者其他颗粒结合,病毒转导,原生质体融合,DEAE-葡聚糖或者其类似物介导的转染,聚凝胺(polybrene)介导的转染,脂质体融合,显微注射,微粒轰击(基因枪(biolistics))或者电穿孔(Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(基因转移和表达:实验手册),Stockton Press(1990))。
在优选的实施方式中,将感兴趣的核酸与总浓度大于生理水平的一种或者多种二价阳离子配制,用于注射动物以便被该动物的宿主T细胞摄取。在一些实施方式中,可以使用一种或者多种生理上可接受的二价阳离子,例如,Ca2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+,Al2+,Cu2+,Ni2+,Ba2+,Sr2+,或者其他二价阳离子,及其混合物。在一些实施方式中,所述二价阳离子是单独的钙。在一些实施方式中,镁、钙或者其混合物可以分别以大约1.5mM和1mM存在于细胞外。在优选的实施方式中,用浓度为大约0.9mM(1×)-大约2M的钙配制待转染的核酸;在更优选的实施方式中,钙浓度为大约2mM-大约8.1mM(9×);在最优选的实施方式中,钙浓度为大约2mM-大约5.4mM(6×)。两种或更多种二价阳离子的混合物可以组合使用,其总浓度为约0.9mM,2mM,4mM,5mM,6mM,7mM,8mM,9mM,10mM,12mM,15mM,20mM,45mM,65mM,90mM,130mM,170mM,220mM,280mM,320mM,350mM,500mM,750mM,1000mM,1500mM,等等,并且多达大约2M。
在某些优选的实施方式中,补偿离子可以包括PO4,Cl,OH,CO2或者其混合物。在其他实施方式中,所述制剂可以造成DNA形成微粒或者沉淀物,其粒径分布的平均大小或者80%的颗粒超过大约0.1,0.3,0.5,1,3,5,8,15,20,35,50,70或者100微米。可以通过离心,流式细胞分析,碘化丙啶或者类似的染料标记,或者动态光散射,评估这些微粒的大小。
使用浓度大于生理水平的二价阳离子适于与任意DNA疫苗接种载体骨架使用。对于本发明的方法,还发现浓度大于生理水平的二价阳离子可以与任意免疫抑制性载体骨架一起使用。示例性的免疫抑制性载体骨架包括那些(i)与亲代载体骨架相比,具有数量减少的免疫刺激性序列(ISS)(例如,数量减少的“CpG”序列),(ii)包含一个或多个免疫抑制性序列(IIS),和(iii)具有数量减少的ISS以及一个或多个IIS。示例性的免疫抑制性载体骨架包括BHT-1载体骨架。
转化方法是本领域已知的,类似于以下报道的方法:Bishop(参见Bio.com),Jordan et al.(1996)Nucleic Acids Research 15:24(4):596-601;美国专利5593875;Chen and Okayama(1987)Mol.Cell Biol.7(8):2745-2752;和Welzel,et al.(2004)"Transfection of cells with custom-made calcium phosphatenanoparticles coated with DNA"(用定制的包被DNA的磷酸钙纳米颗粒转染细胞)J.Mater.Chem.14:2213-2217。还可以使用其他组分,例如,组蛋白,各种盐,脂质体,带电实体诸如多聚赖氨酸,精胺,亚精胺,等等。参见,例如,Simonson,et al.(2005)"Bioplex technology:novel synthetic gene deliverypharmaceutical based on peptides anchored to nucleic acids"(生物复合体技术:基于锚定到核酸的肽的新合成基因输送药物)Curr.Pharm.Des.11(28):3671-680;Roche,et al.(2003)"Glycofection:facilitated gene transfer bycationic glycopolyme rs"(Glycofection:通过阳离子含糖聚合物促进的基因转移)CellMol.Life Sci.60(2):288-297;Pichon,et al.(2001)"Histidine-richpeptides and polymers for nucleic acids delivery"(用于核酸输送的组氨酸富集肽和聚合物)Adv.Drug Deliv.Rev.53(1):75-94;Mahat,et al.(1999)"Peptide-based gene delivery"(基于肽的基因输送)Curr.Opin.Mol.Ther.(2):226-243;and Lee and Kim(2005)"Polyethylene glycol-conjugatedcopolymers for plasmid DNA delivery"(用于质粒DNA输送的聚乙二醇偶联共聚物)Pharm.Res.22(1):1-10。还可参见,Pack,et al.(2005)"Design andDevelopment of Polymersfor Gene Delivery"(用于基因输送的聚合物的设计和发展)NatureDrug Discovery 4:581-493。
特定二价阳离子、特定阴离子或者补偿离子、不同二价阳离子混合物的组合以及二价阳离子和补偿离子的组合的效果可以在至少3个不同水平上测量:(i)转染水平,(ii)表达水平(即,转录或者翻译),和(iii)免疫反应或者免疫抑制水平。在转染水平,可以利用本领域已知的任意方法(例如,利用定量PCR分析)测量体外或者体内的转染效率。在表达水平上,可以利用本领域已知的任意方法在体外或者体内测量转录或者翻译。例如,在ELISA或者蛋白印迹分析中,可以使用抗体检测来自培养细胞或者体内靶细胞(例如,肌细胞,树突状细胞,角质化细胞,成纤维细胞,上皮细胞,以及其他靶细胞类型或者靶器官的细胞)的自身抗原或者自身蛋白的翻译。在免疫反应水平,可以利用本领域已知的任意方法在体外或者体内测量由这类转染或者注射造成的免疫反应的提高、抑制或者阻止。例如,可以测量活化淋巴细胞的增殖,自体反应淋巴细胞的存在,自身抗体的产生,或者淋巴细胞或者暴露于转染靶细胞的其他免疫细胞(例如浆细胞样树突状细胞)的细胞因子生成。在用超生理浓度的一种或者多种二价阳离子转染或者注射自身载体后,还可以测量动物模型中自体免疫性疾病症状(例如,炎症,组织损伤,自体抗体或者自体反应淋巴细胞的存在),或者其改善。本文描述了用于多种自体免疫性疾病的动物模型。
可以将本发明的自身载体配制为用作药物的多核苷酸盐。可以用无毒的无机或者有机碱制备多核苷酸盐。无机碱盐包括钠,钾,锌,钙,铝,镁,等等。无毒的有机碱基包括伯胺、仲胺和叔胺盐,等等。可以将这类自身DNA多核苷酸盐配制成冻干形式以便输送前成原状,诸如用无菌水或者盐溶液。可选择地,可以将自身DNA多核苷酸盐配制成用于输送的溶液、悬液,或者包括基于水或者油的媒介的乳液。在一个优选的实施方式中,将DNA在具有生理水平的钙(0.9mM)或者另一种二价阳离子的磷酸盐缓冲液中冻干,然后在给予前用无菌水使其成原状。在一些实施方式中,用含有高于生理量的一种或者多种二价阳离子的溶液配制DNA,按照上文的描述,用例如总浓度1μM-2M的一种或者多种二价阳离子。在一些实施方式中,用含有高于生理量的Ca++(例如,1μM-2M)的溶液配制DNA。在没有特定离子物质的情况下也能够配制DNA。
本领域普通技术人员都清楚,存在多种向本文定义的个体输送多核苷酸的方法。“个体”意指任意动物,诸如,例如,人,非人灵长类动物,马,奶牛,狗,猫,小鼠,大鼠,豚鼠或者兔。可以用包括阳离子脂质体的阳离子聚合物配制编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸。其他脂质体也代表配制和输送自身多核苷酸的有效手段。可选择地,该自身DNA可并入用于药理输送的病毒载体、病毒颗粒或细菌。病毒载体可以是具有感染活性的、减毒的(具有降低疾病诱导能力的突变)或复制缺陷型的。颗粒还代表输送DNA的有效方法,并且DNA可以结合金或其它颗粒,继而注射进个体或通过基因枪输送。使用自身DNA以预防致病性自身蛋白沉淀、积聚或活性的方法可以通过使用病毒载体或其他输送系统来增强,所述输送系统增强对编码的自身蛋白的体液反应。在其他实施方式中,该DNA可偶联到固体支持物,所述固体支持物包括金颗粒、基于多糖的支持物,或者能够注射、吸入或通过粒子轰击(基因枪输送)而输送的其他颗粒或珠。
用于输送核酸制剂的方法是本领域已知的。参见,例如,美国专利第5,399,346号、第5,580,859号和第5,589,466号。已开发了大量基于病毒的系统,用于转移至哺乳动物细胞。例如,已描述了逆转录病毒系统(美国专利第5,219,740号;Miller et al,Biotechniques 7:980-990,(1989);Miller,Human Gene Therapy 1:5-14,(1990);Scarpa et al,Virology 180:849-852,(1991);Burns et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037,1993;和Boris-Lawrie and Temin,Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109,1993)。还描述了大量腺病毒载体(参见,例如,Haj-Ahmad et al.,J.Virol.57:267-274,(1986);Bett et al,J.Virol.67:5911-5921,1993;Mittereder et al,HumanGene Therapy 5:717-729,(1994);Seth et al,J.Virol.68:933-940,(1994);Barr et al,Gene Therapy 1:51-58,(1994);Berkner,Bio Techniques 6:616-629,(1988);and,Rich etal,Human Gene Therapy 4:461-476,1993)。也已开发出用于核酸输送的腺相关病毒(AAV)载体系统。使用本领域公知技术可容易地构建AAV载体(参见,例如,美国专利第5,173,414号和第5,139,941号;国际公开号WO 92/01070和WO 93/03769;Lebkowski et al,Molec.Cell.Biol.8:3988-3996,(1988);Vincent et al,Vaccines,90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)(1990);Carter,B.J.,Current Opinion inBiotechnology 3:533-539,(1992);Muzyczka,N.,Current Topics in Microbiol.And Immunol.158:97-129,(1992);Kotin,R.M.,Human Gene Therapy5:793-801,(1994);Shelling et al,Gene Therapy 1:165-169,(1994);和Zhouetal.,J.Exp.Med.179:1867-1875,(1994))。
输送本发明的多核苷酸也可以无需病毒载体。例如,可以在向个体输送前用脂质体包装该分子。通常使用能稳定地结合或包埋并滞留核酸的脂质体来完成脂质封装。为了解脂质体作为载体输送核酸的应用,可以参见,例如,Hug et al,Biochim.Biophys.Acta.1097:1-17,(1991);Straubinger et al,Methods of Enzymology,101:512-527,(1983)。还可参见,Pack,et al.(2005)"Design and Development of Polymers for Gene Delivery"(用于基因输送的多聚物的设计和发展)Nature Drug Discovery 4:581-493。
疾病或者病症的“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或者“疗法(therapy)”表示通过编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸的单独给予或者与本文描述的另一种化合物的联合给予,减缓、终止或者逆转该病的进展,这通过临床或者诊断症状的终止或者消除来证明。在优选的实施方式中,治疗疾病表示逆转或者终止该病的进展,理想地达到消除该病本身的程度。本文使用的改善疾病和治疗疾病是等同的。
在本发明范围内,疾病或者病症的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”或者“预防(prevention)”是指编码自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸的单独给予或者与本文描述的另一种化合物的联合给予,从而预防疾病或者病症的存在或者发生,或者预防疾病或者病症的一些或者全部症状,或者减小疾病或者病症发生的可能性。
根据本发明的教导,给予“治疗有效量”的自身载体,这足以治疗或者预防疾病例如改善或者消除该病的症状和/或病因,所述自身载体包括编码一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸。例如,治疗有效量属于较宽的范围,可以通过临床试验确定,对于特定患者来说,可以根据有经验的普通临床医生已知的包括疾病的严重性、患者体重、年龄和其他因素的因素确定治疗有效量。治疗有效量的自身载体为约0.001μg到约1g的范围。优选的治疗量的自身载体为约10μg至约5mg的范围。最为优选的治疗量的自身载体为约0.025mg至5mg的范围。每月输送多核苷酸疗法,持续6-12个月,随后每3-12个月输送多核苷酸疗法作为维持剂量。可以发展可选择的治疗方案,并且所述可选择的治疗方案的范围可以从每天到每周、到每隔一月、到每年、到一次给药,这取决于疾病的严重性、患者年龄、所给予的自身蛋白、自身多肽或自身肽,以及普通治疗医师会考虑的此类其他因素。
在一个实施方式中,通过肌内注射输送该多核苷酸。在另一个实施方式中,所述多核苷酸的输送通过鼻内、口服、皮下、皮内、静脉内、粘膜进行,按压该多核苷酸穿过皮肤,或者将其附着于金粒以输送到或穿过真皮(参见,例如WO 97/46253)。可选择地,可以通过使用或不使用脂质体或带电脂质的局部应用将核酸输送进皮肤细胞(参见,例如,美国专利第6,087,341号)。另一种选择是将该核酸作为吸入剂输送。
可以在含有生理水平钙(0.9mM)的磷酸盐缓冲液中配制多核苷酸,所述多核苷酸是不含内毒素的。可选择地,可以用含有一种或者多种二价阳离子的溶液配制多核苷酸,或者所述多核苷酸可以与含有一种或者多种二价阳离子的溶液共给予,所述二价阳离子诸如,Ca2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+,Al2+,Cu2+,Ni2+,Ba2+,Sr2+,以及其混合物,它们的浓度高于生理浓度,例如,如本文的描述,2mM-2M。当同时共给予或者连续给予自身载体和一种或者多种阳离子时,可以提高一种或者多种转染、自体抗原表达的效率,并且增强治疗效果。当连续给予时,可以首先给予自身载体,或者一种或者多种二价阳离子。
可选择地,或此外,可以使用阳离子聚合物、形成阳离子脂质体的化合物或在非阳离子脂质体中配制多核苷酸。用于DNA输送的阳离子脂质体的实例包括使用1,2-双(油酰氧)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)和其他此类分子产生的脂质体。
在输送该多核苷酸之前,可以预处理输送位点,其通过使用布比卡因(bupivicane)、心脏毒素或可以增强随后的多核苷酸疗法输送的其他试剂。此类预处理方案的输送通常在输送治疗性多核苷酸前12-96小时进行;更常见的,在输送治疗性DNA前24-48小时进行。可选择地,在DNA疗法之前不进行预处理。在一些实施方式中,通过给予大于生理浓度的一种或者多种二价阳离子预处理输送位点。
自身载体可以和其他物质联合给予,诸如,例如,药理学试剂,佐剂,细胞因子,或者编码细胞因子的载体。此外,当利用细胞因子共输送时,为了防止引发有害的抗自身细胞因子反应的可能性,还可以使用化学免疫调节剂诸如维生素D3的活性形式。关于这一点,已经表明1,25-二羟维生素D3通过肌内DNA免疫发挥佐剂作用。
可以将自身载体与编码一种蛋白的多核苷酸共给予,已知所述蛋白(例如,细胞因子)调节宿主的免疫反应。因此,根据本发明可以使用编码免疫调节细胞因子(例如,白介素,干扰素或者集落刺激因子)的基因,或者其功能片段。大量这些细胞因子的基因序列是已知的。因此,在本发明的一个实施方式中,自身载体的输送与下列免疫调节蛋白或者编码所述蛋白的多核苷酸中至少一种的共给予偶联:IL-4;IL-10;IL-13;TGF-β;或者IFN-γ。
经选择用于本发明的核苷酸序列可以衍生自已知来源,例如,使用标准技术通过从包含所需基因或核苷酸序列的细胞中分离该核酸。类似的,使用本领域公知的多核苷酸合成的标准模式可以合成产生所述核苷酸序列(参见,例如,Edge et al.,Nature 292:756,(1981);Nambair et al.,Science223:1299,(1984);Jay et al.,J.Biol.Chem.259:6311,(1984))。通常,可以通过Edge等人(上文)和Duckworth等人(Nucleic Acids Res.9:1691,(1981))描述的磷酸三酯方法、或者通过Beaucage等人(Tet.Letts.22:1859,(1981))和Matteucci等人(J.Am.Chem.Soc.103:3185,(1981))描述的亚磷酰胺方法制备合成的寡核苷酸。也可以使用商业上可获得的寡核苷酸自动合成仪制备合成的寡核苷酸。因而可使用用于特定氨基酸序列的适合密码子设计所述核苷酸序列。一般来说,会选择用于在指定宿主中表达的优选密码子。从标准方法制备的重叠寡核苷酸组装该全序列,并组装为完整的编码序列。参见,例如,Edge et al.(上文);Nambair et al.(上文)和Jay etal.(上文)。
本文使用的获得核酸序列的另一种方法是通过重组手段。因而,可以使用标准限制酶和步骤从携带该核酸的质粒上切下所需核苷酸序列。通过使用适合的限制酶和步骤进行处理,完成位点特异性DNA切割。在本领域通常理解的条件下,通过使用合适的一种或多种限制酶进行处理,进行位点特异性DNA切割,所述条件的特别之处由商业上可获得的限制酶厂家具体说明。如果需要,使用标准技术通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳可以进行所切片段的大小分离。
用于分离特定核酸分子的再一方便方法是通过聚合酶链式反应(PCR)(Mullis et al.,Methods Enzymol.155:335-350,(1987))或反转录PCR(RT-PCR)。通过RT-PCR可以从RNA分离特定核酸序列。通过本领域技术人员已知的技术从例如细胞、组织或整个生物体中分离RNA。随后使用多聚dT或随机六聚物引物、脱氧核苷酸以及合适的反转录酶产生互补DNA(cDNA)。随后通过PCR可以从产生的cDNA中扩增所需的多核苷酸。可选择地,可以从适当的cDNA文库直接扩增所关注的多核苷酸。合成与所关注多核苷酸序列的5’及3’两端杂交的引物并用于所述PCR。所述引物还可以包含位于5’端的容易消化和容易将扩增序列连接到类似的限制性消化后的质粒载体的特异性限制酶位点。
下列实施例为实现本发明的具体实施方式。提供所述实施例仅出于说明目的,并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
DNA粒径测量
从Bayhill Therapeutics获得干冰保存的DNA样品(BHT-3021),将其在-80℃保存直至下一步使用。DNA样品浓度是2mg/ml。在存在和不存在氯化钙的条件下,采用两种不同的DNA浓度进行动态光散射分析。使用4种不同的氯化钙浓度(0.9mM、3mM、5.4mM和8mM)进行分析。用磷酸盐缓冲液稀释DNA母液,得到两种不同浓度的DNA(0.25mg/ml和1.5mg/ml)。利用装备了50mW二极管泵浦激光器(λ=532nm)的光散射装置(BrookhavenInstruments Corp,Holtszille,NY),在20℃测量DNA样品的流体动力学直径,所述激光器入射到浸于十氢化萘浴中的样品室(sample cell)。通过与入射光束成90°的PMT(EMI9863)监测散射光,并通过数字相关器(BI-9000AT)产生自相关函数。对于每一样品,连续收集数据,共5个30秒的间隔,并计算平均值。通过各种方法分析数据,获得有关所述制品多分散性以及存在的各种组分的相对大小的信息。通过累积量方法拟合所述自相关函数,获得DNA和/或复合物的平均扩散系数。根据斯-爱氏方程(Stokes-Einstein equation),从所述扩散系数中获得有效流体动力学直径。此外,将所述数据拟合到非负约束最小平方算法以产生多重模态分布。此外,为了进行更全面的分析,利用群体的数均值和强度均值进行这些方法。
通过颗粒计数设备分析颗粒大小
实验:使用总体大小范围为0.4-1200μm的库尔特颗粒计数仪3(CoulterMultisizer3)(Beckman CoulterInc.)进行DNA/磷酸钙复合物的聚集态分析。对所有DNA样品都使用560μm口管。
实施例2
利用BHT-3009治疗多发性硬化以确立安全性以及针对hMBP免疫反应的初步评估
目前已被批准治疗MS的药剂是非特异性免疫调节剂。通常利用短期疗程的大剂量皮质激素治疗来控制急性复发,该治疗加快急性复发后的改善速率,但与安慰剂相比,没有明显增加总的康复率(Brusaferri et al.,J.Neurol.,247:435-42(2000))。用于降低攻击频率和严重性的免疫调节剂包括干扰素β1B(Betaseron,Berlex)、干扰素β1A(Avonex,Biogen;Rebif,Serono)、醋酸格拉替雷(Copaxone,Teva Neuroscience)、那他珠单抗(Tysabri,B iogenIdec)和米托蒽醌(Novantrone,Amgen)。但是这些药剂中没有一种直接解决根本的自身免疫反应。相反,它们调节一种或者多种由导致疾病相关的组织损伤的正常免疫过程共用的效应途径。此外,这些产品对疾病进展的作用最多是中等的(Goodin et al.,Neurol,58:169-78(2002);Filippini et al.,Lancet,361:545-52(2003);Scott & Friggitt,CNS Drugs,18:379-96(2004);Simpson et al.,CNSDrugs,16:825-50(2002);Miller et al.,N.Engl.J.Med.,348:15-23(2003)),而且都有明显的副作用。具体来说,干扰素经常造成患者的流感样症状(Goodin etal.,Neurol.,58:169-78(2002);Filippini et al.,Lancet,361:545-52(2003));米托蒽醌造成骨髓抑制,伴随感染风险增加(Scott & Friggitt,CNS Drugs,18:379-96(2004));醋酸格拉替雷引起过敏性反应(Simpson et al.,CNS Drugs,16:825-50(2002)),以及那他珠单抗(Tysabri)减少淋巴细胞迁移(Miller et al.,N.Engl.J.Med.,348:15-23(2003))并可以增加包括渐进性多病灶脑白质病的感染风险。与这些非特异性免疫抑制剂相反,BHT-3009经设计可选择性地减少针对髓磷脂碱性蛋白的免疫反应。希望抗原特异性的免疫抑制比现有疗法更加安全有效。
招募MS患者参加多中心、随机化、双盲、3组、安慰剂对照的I期临床试验,以评估BHT-3009(SEQ ID NO:3)单用或者与阿托伐他汀联用的免疫治疗的安全性。BHT-3009是质粒载体,其包括BHT-1表达载体骨架和编码全长人髓磷脂碱性蛋白(hMBP)的多核苷酸,其中所述多核苷酸被插入BHT-1多克隆序列的EcoR I和Xba I位点。BHT-3009的重要功能和调控特征包括人巨细胞病毒(CMV)即时早期基因启动子/增强子、牛生长激素基因多腺苷酸化信号、卡那霉素抗性基因和用于载体在大肠杆菌中增殖的pUC复制原点。图1是显示BHT-3009主要结构特征的示意图。BHT-3009的肌内给予造成hMBP蛋白在注射部位以及迁移到引流淋巴结的细胞内的瞬时低水平表达。在实验性自体免疫性脑脊髓炎的小鼠和大鼠动物模型(MS的临床前模型)中已经证实,新免疫环境下自身抗原的这种受限表达减弱进行中的自体免疫性反应。该研究的目标人群是患有复发疾病的患者,包括患有复发的缓解型MS(RRMS)并且病程相对稳定的的患者,以及患有复发的继发-渐进性MS(SPMS)并且病程相对稳定的患者。具体的包含和排除标准如下:
包含标准:
·根据McDonald标准的多发性硬化确诊
·下列的一种或者多种所示的复发疾病:在之前两年内急性复发;在之前两年期间临床恶化;MRI中的钆增强损害(gadolinium enhancing lesions)
·临床稳定>3个月。
·脑MRI中的至少一个钆增强损害
·在基线评估前停用干扰素>3个月。
·停用免疫抑制性和细胞毒性疗法(例如米托蒽醌、克拉屈滨)>12个月或者>6个月,并且CD4计数>400。
·EDSS<7
·年龄≥18岁。
·能够签署知情同意书。
·WBC和血小板在正常范围内,血红蛋白>10.0g/dl。
·AST,ALT,bili<正常值上限。
·肌酐<正常值上限。
排除标准:
·之前3个月使用高剂量皮质激素(例如>500mg甲基氢化泼尼松或等效物)。
·之前任何时间接受过疫苗疗法、干细胞移植或者全淋巴结照射,或者在之前12个月内接受格拉替雷治疗。
·怀孕或者哺乳妇女。
·不愿意使用医学上可接受的节育形式。
·已知感染或者怀疑感染HIV、乙肝或者丙肝。
·临床显著的ECG异常。
·研究人员认为医疗条件或者社会环境阻止了完全参与试验或者评估研究终点。
·植入的心律调整器、去纤颤器或者限制进行MRI扫描的体表或体内的其他金属物体。
将30名MS患者分到3个BHT-3009剂量组之一。对于每个剂量组,将10名患者随机分配到下列治疗组之一:A组:BHT-安慰剂+阿托伐他汀-安慰剂(4名患者);B组:BHT-3009+阿托伐他汀-安慰剂(3名患者);C组:BHT-3009+阿托伐他汀(3名患者)。将随机分到A组的患者再随机分配接受下列之一的开放式治疗:D组:单独的BHT-3009(2名患者)或者E组:BHT-3009+阿托伐他汀(2名患者),使其接受治疗,并分别作为开始被随机分到B组或者C组的患者进行评估,如下文所述(图2)。在-2周到0周评估全部患者的基线观察,包括利用钆的MRI。在第0周患者被随机化分配接受第1周开始的治疗。按照0.5mg、1.5mg和3.0mg剂量在第1、3、5和9周肌内(IM)给予BHT-3009和BHT-安慰剂。按照GMP标准制备BHT-3009活性生物制剂。BHT-3009的最终制剂是含有0.9mM钙的无菌、无内毒素的PBS等渗溶液(1×),其浓度为1.5mg/mL。在本发明其他的实施方案中,用浓度为约2mM-约2M的诸如钙的二价阳离子配制BHT-3009;在更优选的实施方式中,钙浓度为约2mM-约8.1mM(9×);在最优选的实施方式中,钙的浓度为约2mM-约5.4mM(6×)。BHT-安慰剂是含有0.9mM钙的无菌、无内毒素的PBS等渗溶液。在第一次BHT-3009/BHT-安慰剂注射前2天开始每日口服80mg片剂的阿托伐他汀和阿托伐他汀-安慰剂,一直持续到该治疗解盲(unblinded)。在基线以及第5和9周进行MRI和其他安全性评估。在第13周,每位患者都接受全面评估,在该评估之后,揭晓盲治疗。被随机分到B和C组的患者在第14周终止全部实验方案-特定的治疗,在第26、38和50周追踪其安全性。
表3.BHT-3009和阿托伐他汀的剂量
剂量水平 | 患者数 | BHT-3009剂量 | 阿托伐他汀的剂量 |
1 | 10 | 500μg | 80mg |
2 | 10 | 1500μg | 80mg |
3 | 10 | 3000μg | 80mg |
表4.治疗和评价时间表一览
全部患者·-2到0周:基线观察,包括利用钆的MRI·第0周:随机分配 |
A,B或者C组·第1、3、5、9周:BHT-3009/BHT-安慰剂注射·第1-14周(解盲):每日阿托伐他汀/阿托伐他汀-安慰剂片剂·第5和第9周:利用钆的MRI,中间安全性评估·第13周:全面安全性评估·第14周:解盲,再随机分配A组患者 |
将A组患者再随机分配到D或者E组·第14、16、18、22周:BHT-3009注射-开放式·第14-26周:每日阿托伐他汀(只针对E组患者)·第18和22周:利用钆的MRI,中间安全性评估·第26周:全面安全性评估·第38、50和62周:全面安全性评价 |
B组和C组患者·第26、38和50周:全面安全性评估 |
评估下列安全性变量:
·临床
o 病史和身体检查包括全面的神经学检查
o 问题导向记录(problem-oriented history)和身体检查
o 生命体征
o 伴随药物
o 注射部位评估
o Kurtzke扩展的残疾状态量表(EDSS)
·实验室
o 化学性质(扩展的):葡萄糖,BUN,肌酐,AST,ALT,碱性磷酸酶,总胆红素,电解质(钠,钾,氯化物,重碳酸盐,钙和镁),LDH,淀粉酶,白蛋白,总蛋白。
o 化学性质:葡萄糖,BUN,肌酐,AST,ALT,碱性磷酸酶,总胆红素。
o ANA,抗DNA抗体。
o 血清肌酸激酶。
o 胆固醇。
o CBC:血细胞比容,血红蛋白,分化的WBC(自动的),血小板
o 尿分析:如果快速试纸(dipstick)上临床显著异常,利用快速试纸加显微镜检查
o 只对有怀孕潜力的妇女进行尿妊娠试验
o 对于寡克隆带和IgG指数、细胞计数以及蛋白水平,任选的进行腰椎穿刺
o SPEP(血清蛋白电泳)-只有当进行LP时
o 具有心律纸带的EKG-12导联图
·放射成像
o 胸部PA和侧面
o 钆增强的脑磁共振成像(MRI)
·特殊检验
o 血液中的载体表达
o 血液中的MBP蛋白
前10例个体的初步安全性数据显示2例严重的有害事件。尽管1例事件与研究药物无关,但另一事件,加重了已有抑郁个体的抑郁,被认为可能是治疗相关的。所有其他研究药物相关的有害事件是轻度/中等的严重的,与在安慰剂和研究药物组中的发生率类似。具体来说,在注射安慰剂(n=2)和BHT-3009(红斑,n=1)后,观察到具有类似频率的轻度速发型注射部位反应。没有观察到提示迟发型超敏反应的迟发型注射部位反应。此外,不存在提示过敏反应的速发型全身反应,在该研究后也不存在明显的迟发型全身反应。存在3例BHT-3009相关的不利事件:腹泻、消化不良和盗汗,所有这些都是短暂的1级事件。不存在与BHT-3009相关的临床显著的实验室异常。
除了安全性之外,还评价下列免疫反应变量:1)针对特定抗原包括MBP、PLP、MOG、破伤风菌和醋酸格拉替雷的T细胞增殖和胞内细胞因子生成;2)针对特定抗原包括MBP、PLP和MOG的B细胞抗体反应;3)通过流式细胞术评价的外周血单核细胞(PBMC)表型;和4)通过定量PCR评价的炎症的全血标志物。对于大部分分析来说,收集并保存细胞和血清样品直至个体完成所述治疗。初步结果说明,接受BHT-3009治疗的个体显示针对MBP的Th1反应,这通过针对MBP的细胞增殖(通过CSFE染料稀释分析)和IFNγ的生成(通过胞内细胞因子染色)来指征。
BHT-3009是安全的,良好耐受的,在脑MRI中提供有利倾向,并产生有益的抗原特异性免疫变化。这些免疫变化由以下所组成:产生干扰素γ的髓磷脂反应活性CD4+T细胞(来自外周血)的增殖显著下降,以及来自脑脊髓液的髓磷脂特异性自体抗体的滴度(通过蛋白微阵列评价)降低。我们没有观察到阿托伐他汀组合相对单独BHT-3009的实质益处。
在MS患者中,BHT-3009是安全的,并诱导抗原特异性的免疫耐受,并且伴随着脑MRI中的炎性损害协调地减少。
实施例3
利用BHT-3009治疗多发性硬化以评估CNS炎症的减轻
招募MS患者加入多中心、随机、双盲、安慰剂对照的2b期临床试验以评价BHT-3009的安全性、耐受性和功效。根据CNS炎症的减轻来评估功效,而CNS炎症的减轻通过钆增强的损害和指示可能的临床益处的其他MRI测量来评价。阳性结果将支持进行直接检验BHT-3009临床功效的其他试验。尽管所述试验不足以支持这种第二目的,但该试验也将寻找临床功效(即复发减少和功能分数的提高)的初步证据。
该试验的目标人群是患有复发缓解型MS的个体,其EDSS<3.5,并且接受疾病调节剂治疗低于6个月,且他们最有可能受益于抗原特异性的免疫疗法。具体的包括和排除标准如下:
包括标准:
·MS通过McDonald标准(34)确诊。
·筛查显示符合MS的颅MRI损害。
·在前一年内一次或者多次复发。
·在开始筛查程序前和筛查期间临床稳定(无复发)>50天。
·EDSS,包括0至3.5。
·年龄>18岁并且<55岁。
·愿意并且能够签署知情同意书。
·WBC>3,000;血小板>100,000;血红蛋白>10.0g/dl
·AST,ALT,胆红素<2.0×正常值上限
·肌酐<2.0×正常值上限。
·HIV检验阴性。
排除标准:
·原发渐进性、继发渐进性或者渐进性复发MS。
·在第一次筛查MRI上超过15个钆增强。
·在开始筛查程序前50天内,高剂量皮质激素(例如每天>500mg甲基氢化波尼松或等效物,持续3天或者更多天)。
·先前的干细胞移植、全淋巴结照射或者细胞毒治疗。
·利用干扰素、醋酸格拉替雷或者其他批准的疾病调节剂治疗>180天(所有药剂全部的使用期限)。
·在开始筛查程序180天内利用批准的疾病调节剂治疗。
·先前利用实验性药剂治疗MS,包括批准药物的药品核准标示外使用(offlabel)。(得到医务监督批准)。
·利用那他珠单抗(Tysabri)的在先治疗。
·怀孕或者哺乳妇女。
·不愿意使用医学上可接受的节育形式(例如激素避孕、子宫避孕器、双重屏障、自身或者伴侣的绝育)。
·临床上显著的ECG异常(例如急性局部缺血或者危急生命的心律不齐)。
·研究人员认为医疗条件或者社会环境阻止了完全参与试验或者评估研究终点。
·植入的心律调整器、去纤颤器或者限制了进行MRI扫描的体表或者体内其他金属物体。
·已知的对钆的超敏反应或者变态反应。
将合格的患者(n=252)按照相等数目随机分到3组:A组:0.5mgBHT-3009;B组:1.5mg BHT-3009;和C组:BHT-安慰剂。按照GMP标准制备BHT-3009活性生物制品。BHT-3009的最终制剂是含有0.9mM钙的无菌、无内毒素的PBS等渗溶液(1×),其浓度为1.5mg/mL。在本发明的其他实施方案中,用浓度为约0.05mM-约2M的诸如钙的二价阳离子配制BHT-3009;在更优选的实施方式中,钙的浓度为约2mM-约8.1mM(9×);在最优选的实施方式中,钙浓度为约2mM-约5.4mM(6×)。在第0、2、4周肌内给予研究药物,然后每隔4周给予,直至第44周,共13次剂量。通过两个注射器在两个单独的注射部位给予研究药物,注射器#1中为0.33mL,注射器#2中为0.67mL。手臂是优选的注射部位,因为手臂上有广泛的淋巴结引流。如果不能注射到三角肌,则可以注射到第二或者第三候选部位。第二候选注射部位是前大腿的四头肌肌肉中央,而第三候选部位则是臀部。
表5.BHT-3009的剂量
主要终点是颅MRIs上新Gd增强损害发生的平均4周速率,从第28周直至第48周每4周进行所述颅MRIs(总共6次MRIs)。次要终点包括以下:
·MRI
o 从基线到第48周的T2损害体积变化。
o 从第28周至第48周期间每4周进行的颅MRIs上新T2损害的平均4周速率。
o 从基线到第48周的T1低强度损害体积变化和慢性T1低强度损害体积变化。
o 从第28周至第48周期间进行的颅MRIs上平均Gd增强损害体积。
·复发
o 按年计算的复发率。
o 到第一次复发的时间,检查退出的受试者。
·功能分数(EDSS和MSFC)
o 与基线相比,第48周评估中EDSS恶化的个体比例。
o 与基线相比,第48周评估中证实的MSFC恶化的个体比例。
MRI在筛查期间进行两次,并在第8、16、28、32、36、40、44和48周进行。通过1.5特斯拉或者更高的磁体获得该试验的全部图像(除非得到主办者的批准),其利用模拟运行(dummy run)期间计算出各个部位的定制序列参数组。个体将在相同扫描仪上利用相同序列进行MRI扫描,以包括完整的脑覆盖度、最少的个体移动和时间的一致性。按照研究的标准剂量给出对照。对志愿者进行1-3次模拟MRIs以确认足够的图像质量,并建立传输和数据管理程序。
在复发后应尽快进行评估,并必须由检验医生确认。复发被定义为一种或者多种显著的神经学异常的出现或者再现,其持续至少48小时,并且在这之前直接是至少30天的疾病相对稳定期或者好转期。个体MS症状的正常反复自身不构成复发,伴有明显的突发事件诸如感染或者发烧的神经学异常的出现或者再现也不被认为是复发。当个体的症状伴随有神经学检查的客观变化以及Kurtzke扩展的残疾状况量表(EDSS)增加至少1.0个点时,认为复发得到确认。肠/膀胱功能的变化,已有体觉缺陷严重程度的变化或者认知功能的变化,不能单独用来确认复发。
利用两种不同的常规研究评价标准来评价残疾状态:Kurtzke扩展的残疾状态量表(EDSS;Kurtzke,Neurol,33:1444-52(1983))和多发性硬化功能复合评分(MSFC;Cutter et al.,Brain,122:871-82(1999))评价。在筛查期间以及第40和48周进行EDSS和MSFC。由“检验医生”进行EDSS,所述“检验医生”不是“治疗医生”且不了解个体的临床状态。MSFC可以由经培训的合格的医护人员、治疗医生或者检验医生进行。第48周恶化的EDSS被定义为EDSS的初始增加,这与第40周的恶化一致,其在8周后即第48周得到确认。不被认为正经历复发的个体具有恶化的EDSS,直到他们的状况已经稳定。恶化的MSFC被定义为MSFC z分数降低1个单位或者更多,这在至少8周后得到确认。第48周恶化的MSFC被定义为,与第48周确认的筛查MSFC z分数相比,第40周的z分数降低1个单位或者更多。不被认为正经历复发的个体具有恶化的MSFC,直到他们的情况已经稳定。
利用假定泊松分布的广义线性模型并利用ITT群的对数关联函数(linkfunction),以治疗组和集合中心(pooled center)作为因子,并以基线MRI扫描中的钆(Gd)增强损害数量的对数值作为协变量,通过检测治疗组之间主要变量的差异,进行BHT-3009两种剂量中的任一种优于安慰剂的初步试验。当基线处损害的数量是零时,其将接近log(0.1)。将考虑过度分散,并通过偏移值进行估算。BHT-3009对安慰剂的优势将通过以下形式的零假设进行检验:H0:BHT-3009与安慰剂没有区别,相对于H1:BHT-3009与安慰剂有区别。这两种零假设及它们的相应选项将分别指定不同剂量的BHT-3009:0.5mg和1.5mg。通过对在治疗组的最小二乘法(least-squares means)中差异估值的Wald卡方检验,检查所述零假设。将提供这些估值以及它们的95%置信区间(CIs)。将使用Hochberg多重检验法来说明CIs计算中的多重性(multiplicity)。假定所述主要变量符合具有偏移值估算的过度分散的泊松分布。利用Hosmer-Lemeshow统计拟合度,评价所述模型的拟合度。利用Q-Q曲线还可以直观的评价所述假定的有效性。如果泊松分布明显不适用,进行双侧Wilcoxon检验,通过集合中心和基线MRI扫描中Gd+损害的数量(0,1-5,>5个损害)进行分层;并且将提供治疗差异的未分层的Hodges-Lehmann估值和它们的CIs。
随机选取289名患者。272名患者完成了计划中的44周治疗。治疗是良好耐受的。到目前为止199名患者(68.9%)报告了一种或者多种治疗急性有害事件(AEs)。只在44名患者(15.2%)中感觉这些AEs可能是相关的,在39名患者(13.5%)中可能与研究药物相关。大部分AEs是轻度/中等严重程度的。迄今为止还没有显著的临床实验室异常。在3个治疗组之间不存在AEs的不平衡。对77名患者的基线ELISPOT分析显示,63名患者(81.8%)对针对一种或者多种MBP肽的干扰素-γ生成是阳性的,58名(75.3%)对PLP肽是阳性的,和53名(68.8%)对MOG肽是阳性的。在第44周进行随访ELISPOT和CSF分析。
第I/II期的试验数据表明BHT-3009是安全的,并且可以以抗原特异性的方式抑制免疫反应。
实施例4
BHT-3021高钙制剂活性的表征
为了评价包含钙浓度增加的BHT-3021制剂的生物活性,可以使用各种体外和体内分析法。首先,可以将质粒DNA直接添加到转染感受态细胞系(例如HEK293,HeLa,CHO,等等),并通过商业化的ELISA测量所述细胞产生的胰岛素原蛋白的水平(图3)。其次,可以通过IM注射将BHT-3021的不同制剂递送给小鼠,然后在注射后的不同时间,利用BHT-3021特异性定量PCR分析,测量并入肌肉的质粒数量(表6)。最后,可以按照不同剂量和频率向前糖尿病(pre-diabetic)NOD小鼠IM注射不同的制剂,并检验预防自体抗体、自体反应性T细胞、胰腺的炎症的进展和明显的糖尿病发作的能力。此外,可以通过注射BHT-3021制剂治疗已经患有高血糖症的小鼠,以确定所述疾病是否可得到终止或者逆转。
表6-在IM注射BHT-3021质粒DNA的高钙制剂后,肌肉质粒的计数分析。
样品ID | BHT-3021拷贝数/μgDNA | 平均CT值 | 样品ID | BHT-3021拷贝数/μgDNA | 平均CT值 |
2D1X-1 | >1×106 | 16.06 | 2D 6X-1 | NA | 4.51 |
2D1X-2 | >1×106 | 16.89 | 2D 6X-2 | NA | 5.90 |
2D1X-3 | >1×106 | 17.49 | 2D 6X-3 | NA | 5.36 |
2D1X-4 | >1×106 | 17.70 | 2D 6X-4 | NA | 7.17 |
7D1X-1 | 1161 | 29.52 | 7D 6X-1 | NA | 5.42 |
7D1X-2 | 582 | 27.99 | 7D 6X-2 | NA | 6.18 |
7D1X-3 | 1986 | 28.24 | 7D 6X-3 | NA | 5.98 |
7D1X-4 | 422 | 31.28 | 7D 6X-4 | NA | 5.87 |
14D1X-1 | 26899 | 24.74 | 14D 6X-1 | >1×106 | 14.50 |
14D1X-2 | 16590 | 25.70 | 14D 6X-2 | >1×106 | 16.35 |
14D1X-3 | 297 | 31.74 | 14D 6X-3 | >1×106 | 15.66 |
14D1X-4 | 1403 | 29.54 | 14D 6X-4 | NA | 5.73 |
在含有0.9mM氯化钙(1×)或者5.4mM氯化钙(6×)的杜氏PBS中配制BHT-3021质粒。将各种制剂注射到6只C57B1/6小鼠的背部四头肌,并在第2天(2D)、第7天(7D)和第14天(14D)从2只小鼠收集肌肉(n=4块肌肉),利用BHT-3021质粒特异性定量PCR分析,对每块肌肉中质粒的拷贝数进行定量。来自6×制剂组的所注射肌肉在所有时间点在其肌肉中均存在水平高得多的质粒DNA,表明当用高钙配制时DNA在体内的稳定性和持久性更好。缩写:NA-用于定量的质粒#过高;CT(循环阈值)-PCR循环,在所述循环,样品达到高于分析背景的可定量水平。
尽管参考一种或多种具体实施方式,已基本上详细描述了本发明,但是本领域技术人员知道,可以改变本申请具体公开的实施方式,但是所述改变和改进位于随后的权利要求中所描述的本发明范围和精神内。本说明书引用的所有出版物或专利文件以引用的方式并入本文,如同将每一所述出版物或文件具体地并单独地指出以引用的方式并入本文。引用上述出版物或文件并非意在承认任何前述出版物或文件为相关现有技术,也不构成对所述出版物或文件的内容或日期的承认。
序列表
SEQ ID NO:1(pVAX1)
SEQ ID NO:2(BHT-1)
SEQ ID NO:3(BHT-3009)
Claims (39)
1.治疗个体自体免疫性疾病的方法,所述疾病与非生理存在于所述个体中的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽相关,所述方法包括向所述个体给予自身载体和浓度大于生理水平的二价阳离子,所述自身载体包括免疫抑制性载体骨架和编码与所述自体免疫性疾病相关的自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述自体免疫性疾病是多发性硬化。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述自体免疫性疾病是风湿性关节炎。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述自体免疫性疾病是狼疮。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂碱性蛋白(MBP)的多核苷酸。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人蛋白脂蛋白(PLP)的多核苷酸。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)的多核苷酸。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂少突细胞蛋白(MOG)的多核苷酸。
10.如权利要求3所述的方法,其中所述自身载体是BHT-3009(SEQ IDNO:3)。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述自身载体BHT-3009是不含内毒素的。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述二价阳离子是钙。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述钙的浓度大于大约2mM。
14.如权利要求12所述的方法,其中所述钙的浓度为大约5.4mM。
15.治疗个体多发性硬化的方法,包括向所述个体给予包括自身载体和浓度大于生理水平的二价阳离子的药物组合物,所述自身载体包括免疫抑制性载体骨架。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架。
17.如权利要求15所述的方法,其中所述自身载体是BHT-3009(SEQ IDNO:3)。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述药物组合物是不含内毒素的。
19.如权利要求15所述的方法,其中所述二价阳离子是钙。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述钙的浓度大于大约2mM。
21.如权利要求19所述的方法,其中所述钙的浓度为大约5.4mM。
22.药物组合物,包括自身载体和浓度大于生理水平的二价阳离子,所述自身载体包括免疫抑制性载体骨架和编码与自体免疫性疾病相关的一种或者多种自身蛋白、自身多肽或者自身肽的多核苷酸。
23.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架。
24.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自身载体是BHT-3009(SEQ ID NO:3)。
25.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自体免疫性疾病是多发性硬化。
26.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自体免疫性疾病是风湿性关节炎。
27.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自体免疫性疾病是狼疮。
28.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂碱性蛋白(MBP)的多核苷酸。
29.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人蛋白脂蛋白(PLP)的多核苷酸。
30.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂结合的糖蛋白(MAG)的多核苷酸。
31.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述自身载体包括BHT-1载体骨架和编码人髓磷脂少突细胞蛋白(MOG)的多核苷酸。
32.如权利要求25所述的药物组合物,其中所述自身载体是BHT-3009(SEQ ID NO:3)。
33.如权利要求32所述的药物组合物,其中所述药物组合物是不含内毒素的。
34.如权利要求22所述的药物组合物,其中所述二价阳离子是钙。
35.如权利要求34所述的药物组合物,其中所述钙的浓度大于大约2mM。
36.如权利要求34所述的药物组合物,其中所述钙的浓度为大约5.4mM。
37.药物组合物,包括BHT-3009(SEQ ID NO:3)和浓度大于生理水平的二价阳离子。
38.如权利要求37所述的药物组合物,其中BHT-3009是不含内毒素的。
39.自身载体BHT3009(SEQ ID NO:3)。
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