ES2350576T3

ES2350576T3 - Métodos y composiciones de ácidos nucleicos inmunomoduladores para prevenir y tratar enfermedades.

Info

Publication number: ES2350576T3
Application number: ES03789883T
Authority: ES
Inventors: Hideki Garren; Lawrence Steinman; Peggy P. Ho
Original assignee: Leland Stanford Junior University; Bayhill Therapeutics Inc
Current assignee: Leland Stanford Junior University; Bayhill Therapeutics Inc
Priority date: 2002-11-21
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2011-01-25
Anticipated expiration: 2023-11-21
Also published as: DK1569696T3; EP2298360A3; DE60333786D1; SI1569696T1; WO2004047734A2; AU2003294400B2; ATE477000T1; NZ540276A; EP2329827A3; JP2006514933A; EP1569696A2; IL168715A; CN100546657C; AU2009201102A1; EP2353614A1; WO2004047734A3; CA2507249A1; CN101955976A; EP2329827A2; AU2003294400A1

Abstract

Un método para elaborar un vector plasmídico, método que consiste en modificar un vector que contiene un motivo CpG de la fórmula 5'-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' para sustituir una citosina por una no citosina dentro del dinucleótido CpG, en el que el vector además está compuesto por un polinucleótido que codifica una proteína mielina o una proteína insulina.

Description

Métodos y composiciones de ácidos nucleicos inmunomoduladores para prevenir y tratar enfermedades.

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio bajo el Título 35 del Código de Estados Unidos, Capítulo 119(e), de la Solicitud Provisional de Patente estadounidense nº 60/428.643, presentada el 21 de noviembre de 2002.

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Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención hace referencia a composiciones para tratar o prevenir enfermedades que comprenden secuencias de modulación inmunitaria. La solicitud hace referencia de forma adicional a los medios y métodos para la identificación de las secuencias de modulación inmunitaria para prevenir o tratar enfermedades, más específicamente el tratamiento y prevención de enfermedades autoinmunes o enfermedades inflamatorias. La solicitud también hace referencia al tratamiento o prevención de enfermedades que comprende la administración únicamente de las secuencias de modulación inmunitaria. La solicitud también hace referencia al tratamiento o prevención de enfermedades que comprende la administración de las secuencias de modulación inmunitaria en combinación con un polinucleótido que codifica auto-proteína(s), auto-polipéptido(s) o auto-péptido(s). La solicitud hace referencia de forma adicional al tratamiento o prevención de enfermedades que comprende la administración de las secuencias de modulación inmunitaria en combinación con auto-moléculas, tales como auto-lípidos, auto-proteína(s), auto-péptido(s), auto-polipéptido(s), auto-glicolípido(s), auto-carbohidrato(s), auto-glicoproteína(s), y auto-proteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s), modificado(s) de forma post-traslacional. La solicitud también hace referencia al tratamiento o prevención de enfermedades que comprende la administración de las secuencias de modulación inmunitaria en combinación con una o más terapéuticas adicionales de modulación inmunitaria.

La presente invención también hace referencia a composiciones para tratar enfermedades en un sujeto relacionadas con una o más auto-proteína(s), auto-polipéptido(s) o auto-péptido(s) que están presentes en el sujeto e implicados en un estado no fisiológico. La presente invención también hace referencia a composiciones para prevenir enfermedades en un sujeto relacionadas con una o más auto-proteína(s), auto-polipéptido(s) o auto-péptido(s) que están presentes en el sujeto e implicados en un estado no fisiológico. La solicitud también hace referencia a la administración de una terapia combinada que comprende una secuencia de modulación inmunitaria y un polinucleótido que codifica una(s) auto-proteína(s), uno(s) auto-polipéptido(s) o uno(s) auto-péptido(s) presentes en un estado no fisiológico y relacionados con una enfermedad. La solicitud también hace referencia a modular una respuesta inmunitaria para la(s) auto-molécula(s) presente(s) en un animal e implicada(s) en un estado no fisiológico y relacionada(s) con una enfermedad. La solicitud hace referencia más específicamente a los métodos y composiciones para tratar o prevenir enfermedades autoinmunes relacionadas con una o más auto-molécula(s) presente(s) en el animal en un estado no fisiológico tal como en la esclerosis múltiple (EM), la artritis reumatoide (AR), la diabetes mellitus insulinodependiente (DMID), la uveítis autoinmune (UA), la cirrosis biliar primaria (CBP), la miastenia gravis (MG), el síndrome de Sjögren, el pénfigo vulgar (PV), la esclerodermia, la anemia perniciosa, el lupus sistémico eritematoso (LSE) y la enfermedad de Graves.

La solicitud hace referencia aún más específicamente a otras enfermedades relacionadas con una o más auto-molécula(s) presente(s) en el animal en un estado no fisiológico tal como la osteoartritis, la lesión de médula espinal, la enfermedad ulcerosa péptica, la gota, las migrañas, la hiperlipidemia y la enfermedad arterial coronaria.

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2. Antecedentes Las enfermedades autoinmunes

Una enfermedad autoinmune es cualquier enfermedad causada por una inmunidad adquirida que se dirige erróneamente contra las células y/o tejidos sanos del cuerpo. Las enfermedades autoinmunes afectan al 3% de la población de los EE.UU., y probablemente a un porcentaje similar de la población del mundo industrializado (Jacobson et al., Clin Immunol Immunolpathol, 84, 223-43, 1997).

Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por linfocitos T y B que se dirigen de forma anómala contra las auto-moléculas, incluyendo pero sin limitarse a auto-lípidos, auto-proteína(s), auto-péptido(s), auto-polipéptido(s), auto-glicolípido(s), auto-carbohidrato(s), auto-glicoproteína(s), y auto-proteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificado(s) de forma post-traslacional, y derivados de los mismos, causando de ese modo una lesión o mal funcionamiento de un órgano, tejido, o algún tipo de célula dentro del cuerpo (por ejemplo, el páncreas, el cerebro, el tiroides o el tracto gastrointestinal) para causar las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Marrack et al., Nat Med, 7, 899-905, 2001). Entre las enfermedades autoinmunes se incluyen las enfermedades que afectan a tejidos específicos así como las enfermedades que pueden afectar a múltiples tejidos. Esto, en parte, para algunas enfermedades puede depender de si las respuestas autoinmunes se dirigen al antígeno de una auto-molécula con limitación a un tejido específico o al antígeno de una auto-molécula que está ampliamente distribuido por todo el cuerpo. El rasgo característico de la autoinmunidad sobre un tejido específico es el ataque selectivo contra un tejido en particular o un tipo de célula individual. Sin embargo, ciertas enfermedades autoinmunes que se dirigen contra antígenos de auto-moléculas ubicuos también pueden afectar a tejidos específicos. Por ejemplo, en la polimiositis, la respuesta autoinmune se dirige contra la proteína histidil-ARNt sintetasa ubicua, aunque las manifestaciones clínicas fundamentalmente implican la destrucción autoinmune del músculo.

El sistema inmunitario emplea un mecanismo enormemente complejo diseñado para generar respuestas para proteger a los mamíferos contra una diversidad de patógenos extraños y a la vez prevenir las respuestas contra los auto-antígenos. Además de decidir si responder (especificidad de los antígenos), el sistema inmunitario también debe elegir las funciones adecuadas de los efectores para enfrentarse a cada patógeno (especificidad de los efectores). Una célula crítica a la hora de mediar en y regular estas funciones de los efectores es la célula T CD4+. Además, es la elaboración de citoquinas específicas a partir de células T CD4+ lo que parece ser uno de los mecanismos más importantes a través de los que las células T median en sus funciones. Por consiguiente, el caracterizar los tipos de citoquinas fabricadas a partir de células T CD4+ así como la manera en la que se controla su secreción, es extremadamente importante para comprender cómo se regula la respuesta inmunitaria.

La caracterización de la producción de citoquinas a partir de clones de células T CD4+ de ratón de larga duración se publicó por primera vez hace más de 10 años (Mosmann et al., J. Immunol., 136: 2348-2357, 1986). En estos estudios, se mostró que las células T CD4+ producían dos patrones distintos de producción de citoquinas, que se designaron T colaborador 1 (Th1) y T colaborador 2 (Th2). Las células Th1 se descubrió que producían de forma selectiva interleuquina-2 (IL-2), interferón-gamma (IFN-gamma) y linfotoxina (LT), mientras que los clones Th2 producían de forma selectiva IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13 (Cherwinski et al., J. Exp. Med., 169: 1229-1244, 1987). Algo más tarde, se aislaron citoquinas adicionales, IL-9 e IL-10, de los clones Th2 (Van Snick et al., J. Exp. Med., 169: 363-368, 1989) (Fiorentino et al., J. Exp. Med., 170: 2081-2095, 1989). Por último, se descubrió que citoquinas adicionales, tales como IL-3, el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) eran secretados tanto por las células Th1 como por las Th2.

Las enfermedades autoinmunes abarcan un amplio espectro de enfermedades que pueden afectar a muchos órganos y tejidos diferentes del cuerpo tal y como viene explicado en la tabla de más adelante (Véase, por ejemplo, Paul, W.E. (1999) Fundamental Immunology, Cuarta Edición, Lippincott-Raven, Nueva York).

Entre las terapias actuales para las enfermedades autoinmunes humanas se incluyen los glucocorticoides, los agentes citotóxicos y las terapéuticas biológicas recientemente desarrolladas. En general, la gestión de enfermedades autoinmunes sistémicas humanas es empírica y poco satisfactoria. La mayoría de las veces, se utilizan por lo general fármacos inmunosupresores, tales como los corticosteroides, en una amplia variedad de enfermedades inflamatorias y autoinmunes graves. Además de los corticosteroides, se utilizan otros agentes inmunosupresores en la gestión de las enfermedades autoinmunes sistémicas. La ciclofosfamida es un agente alquilante que causa una enorme disminución de los linfocitos T y B y dificulta la inmunidad mediada por células. La ciclosporina, el tacrolimus y el micofenolato de mofetilo son productos naturales con propiedades específicas de supresión de linfocitos T, y se han utilizado para tratar el LSE, la AR y, en menor medida, en la vasculitis y la miositis. Estos fármacos están asociados a una importante toxicidad renal. También se utiliza el metotrexato como un agente de "segunda línea" en la AR, con el objetivo de reducir la progresión de la enfermedad. También se utiliza en la polimiositis y otras enfermedades del tejido conectivo. Entre otros enfoques que se han probado se incluyen los anticuerpos monoclonales con la intención de bloquear la acción de las citoquinas o para reducir los linfocitos. (Fox, D.A. Am. J. Med., 99: 82-88, 1995). Entre los tratamientos para la EM se incluyen el interferón Beta y el copolímero 1, que reducen el porcentaje de recaída en un 20-30% y solamente tienen un pequeño impacto sobre la progresión de la enfermedad. La EM también se trata con agentes inmunosupresores incluyendo la metilprednisolona, otros esteroides, el metotrexato, la cladribina y la ciclofosfamida. Estos agentes inmunosupresores tienen una eficacia mínima a la hora de tratar la EM. La terapia actual para la AR utiliza agentes que modulan o suprimen no específicamente la función inmunitaria tales como el metotrexato, la sulfasalazina, la hidroxicloroquina, la leflunomida, la prednisona, así como los recientemente desarrollados antagonistas del TNF alfa etanercept e infliximab (Moreland et al., J Rheumatol, 28, 1431-52, 2001). Etanercept e infliximab bloquean de forma global el TNF alfa, haciendo que los pacientes sean más propensos a morir por sepsis, empeoramiento de las infecciones micobacterianas crónicas y el desarrollo de casos de desmielinización.

En el caso de la autoinmunidad órgano-específica, se han intentado una serie de enfoques terapéuticos diferentes. Se han administrado antígenos proteicos solubles de forma sistémica para inhibir la posterior respuesta inmunitaria a ese antígeno. Entre dichas terapias se incluyen la administración de proteína básica de mielina, su péptido dominante, o una mezcla de proteínas mielina a animales con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y seres humanos con esclerosis múltiple (Brocke et al., Nature, 379, 343-6, 1996); (Critchfield et al., Science, 263, 1139-43, 1994); Weiner et al., Annu Rev Immunol, 12, 809-37, (1994); la administración de colágeno tipo II o una mezcla de proteínas de colágeno a animales con artritis colágeno-inducida y seres humanos con artritis reumatoide (Gumanovskaya et al., Immunology, 97, 466-73, 1999); (McKown et al., Arthritis Rheum, 42, 1204-8, 1999), (Trentham et al., Science, 261, 1727-30, 1993); la administración de insulina a animales y seres humanos con diabetes autoinmune (Pozzilli y Gisella Cavallo, Diabetes Metab Res Rev, 16, 306-7, 2000); y la administración del antígeno S a animales y seres humanos con uveitis autoinmune (Nussenblatt et al., Am J Ophthalmol, 123, 583-92, 1997). Un problema relacionado con este enfoque es la no respuesta de las células T inducida por la inyección sistémica de antígenos. Otro enfoque es el intento por diseñar estrategias terapéuticas racionales para la administración sistémica de un antígeno peptídico basadas en la interacción específica entre los receptores de células T y los péptidos unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CPH). Un estudio utilizando el enfoque peptídico en un modelo de diabetes animal dio por resultado el desarrollo de la producción de anticuerpos al péptido, (Hurtenbach U. et al., J Exp. Med, 177: 1499, 1993). Otro enfoque es la administración de inmunización con péptidos de RCT. Véase, por ejemplo, (Vandenbark AA et al., Nature, 341: 541, 1989). Aún otro enfoque es la inducción de la tolerancia oral mediante la ingestión de antígenos peptídicos o proteicos. Véase, por ejemplo, (Weiner HL, Immunol Today, 18: 335, 1997).

Las respuestas inmunitarias a los patógenos o tumores se alteran actualmente administrando proteínas, polipéptidos o péptidos, solos o en combinación con adyuvantes. Por ejemplo, la vacuna contra el virus de la hepatitis B contiene el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B recombinante, un antígeno exógeno, formulado en hidróxido de aluminio, que sirve como un adyuvante. Esta vacuna induce una respuesta inmunitaria contra el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B para proteger contra la infección. Un enfoque alternativo implica la administración de una forma atenuada, de duplicación deficiente, y/o no patógena de un virus o bacteria, cada uno antígenos exógenos, para provocar una respuesta inmunitaria protectora del huésped contra el patógeno. Por ejemplo, la vacuna oral contra la polio está compuesta por un virus vivo atenuado, un antígeno exógeno, que infecta a las células y se duplica en el individuo vacunado para inducir una inmunidad efectiva contra el virus de la polio, un antígeno exógeno o extraño, sin causar una enfermedad clínica. De manera alternativa, la vacuna inactiva contra la polio contiene un virus inactivo o "muerto" que es incapaz de infectar o duplicarse, y que se administra de forma subcutánea para inducir una inmunidad protectora contra el virus de la polio.

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Mecanismos de iniciación y propagación de las respuestas inmunitarias

Enfermedades inflamatorias relacionadas con "moléculas exógenas": La infección con microorganismos incluyendo micoplasma, virus, bacterias, parásitos y micobacterias lleva a la inflamación en los órganos objetivo, y en algunos casos a la inflamación sistémica. Entre los ejemplos destacados se incluyen la artritis séptica bacteriana, la artritis de Lyme, la uveitis infecciosa y el shock séptico. Como parte del sistema inmunitario innato, los mediadores inflamatorios tales como los componentes de la cascada de coagulación, las bradiquininas y los complementos se activan y contribuyen a la inflamación y la morbosidad. La respuesta inmunitaria en las enfermedades infecciosas se dirige contra las moléculas exógenas presentes en los microorganismos, incluyendo las proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos. El ADN bacteriano que contiene ciertos motivos denominados motivos "CpG", que se definen con más detalle a continuación, es capaz de iniciar respuestas inflamatorias en modelos animales. Por ejemplo, la inyección de ADN bacteriano o motivos CpG, siendo ambos moléculas exógenas, en articulaciones sinoviales imita muchos de los signos y síntomas inflamatorios que caracterizan a la artritis séptica.

Enfermedades inflamatorias relacionadas con "automoléculas": Muchas enfermedades humanas están relacionadas con una inflamación aguda o crónica con ausencia de cualquier etiología infecciosa conocida. En estas enfermedades, el sistema inmunitario está activo, provocando que los tejidos afectados se inflamen y se infiltren en ellos de forma anormal leucocitos y linfocitos, pero parece no haber ninguna infección relacionada. Entre los ejemplos de ello se incluyen la osteoartritis, la enfermedad arterial coronaria, la enfermedad de Alzheimer, ciertas formas de dermatitis, la gastritis y la neumonitis. La respuesta inmunitaria predominante es una respuesta inmunitaria innata, con ausencia de una respuesta inmunitaria adquirida.

Enfermedades autoinmunes relacionadas con "automoléculas": Se han descrito docenas de enfermedades autoinmunes, incluyendo la artritis reumatoide, el lupus sistémico eritematoso, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus, la psoriasis, y muchas otras. Como en el caso de las enfermedades inflamatorias relacionadas con automoléculas mencionadas anteriormente, el sistema inmunitario está activo, provocando que los tejidos afectados se inflamen y se infiltren en ellos de forma anormal leucocitos y linfocitos, y parece no haber ninguna infección relacionada. A diferencia de las enfermedades inflamatorias relacionadas con automoléculas, una característica distintiva de las enfermedades autoinmunes es la presencia de autoanticuerpos y/o células T específicas para automoléculas expresados por el huésped. Los mecanismos mediante los que los linfocitos huésped T y B se dirigen de forma selectiva contra las automoléculas son poco claros. Algunos investigadores han sugerido que las enfermedades autoinmunes las provocan o agravan infecciones con patógenos microbianos. La estimulación con secuencias CpG microbianas se asocia con una mayor propensión a desarrollar modelos animales de enfermedades autoinmunes tales como la EAE (Segal et al., J. Immunology, 158: 5087, 1997) y el LSE (Gilkeson et al., J. Immunology, 142: 1482, 1989); sin embargo, hay pocas pruebas que respalden la hipótesis de que las secuencias CpG o productos microbianos pueden por sí mismos provocar una enfermedad autoinmune en, de otro modo, un animal sano, aunque pueden inducirse enfermedades inflamatorias. Por ejemplo, varios experimentos importantes que utilizaban sistemas gnotobióticos (es decir, animales criados en un ambiente libre de gérmenes) han demostrado que el desarrollo espontáneo de enfermedades autoinmunes ocurre sin haber exposición a microbios o CpGs microbianas presentes de forma natural. Entre los ejemplos se incluyen el desarrollo de enfermedades autoinmunes de la piel y genitales en un modelo con roedores transgénicos libre de gérmenes de la espondilitis anquilosante (Taurog, J Exp Med, 180: 2359, 1994); y el desarrollo de lupus en 2 modelos diferentes del LSE (Maldonadoi et al., J Immunol, 162: 6322, 1999; Unni et al., J Rheum, 2: 35, 1975). También se ha descrito un modelo inducible del LSE en el que una sola inyección de cualquier variedad de ratón con el aceite de hidrocarburo, el pristano, lleva al desarrollo del LSE, caracterizado por la producción de autoanticuerpos característicos y la enfermedad renal mediada por complejos inmunes. Juntos, estos modelos experimentales sugieren que las enfermedades autoinmunes espontáneas e inducibles pueden desarrollarse con ausencia de una exposición a ADN ó CpGs microbianos.

Secuencias inmunoestimuladoras (SIE): Al sistema inmunitario innato se le considera la primera línea de defensa contra los microbios y los patógenos. Uno de los estimulantes más potentes del sistema inmunitario innato es el ADN microbiano, que contiene secuencias inmunoestimuladoras (SIE). La activación de la inmunidad innata por secuencias inmunoestimuladoras específicas en ADN bacteriano requiere un motivo secuencial hexamérico no metilado central que está compuesto por 5'-purina-purina-citosina-guanina-pirimidina-pirimidina-3' para la estimulación en ratones y por 5'-purina-pirimidina-citosina-guanina-pirimidina-pirimidina-3' para la estimulación en seres humanos (Krieg et al., Annu Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002). El ADN bacteriano y los oligodesoxinucleótidos (ODN) sintéticos que contienen este motivo dinucleótido, denominados secuencias "CpG", dentro de un motivo secuencial inmunoestimulador tienen la capacidad de estimular a las células B para proliferar y secretar IL-6, IL-7 e inmunoglobulina (Krieg et al., Nature, 374: 546-549, 1995; Yi et al., J. Immunol., 157: 5394-5402, 1996). El ADN de SIE también activa directamente las células dendríticas, los macrófagos y los monocitos para secretar citoquinas parecidas a Th1 tales como TNF-\alpha, IL-6 e IL-12 y regula por incremento la expresión del CPH y las moléculas coestimuladoras (Klinman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU., 93: 2879-2883, 1996; Martin-Orozco et al., Int. Immunol., 11: 1111-1118, 1999; Sparwasser et al., Eur. J. Immunol., 28: 2045-2054, 1998). En los ratones, se ha identificado el receptor parecido a Toll-9 (RPT-9) como el receptor clave en el reconocimiento de los motivos CpG.

En el ADN de los vertebrados, la frecuencia de los dinucleótidos CpG se suprime en aproximadamente un cuarto del valor previsto, y la C en el dinucleótido CpG es metilada aproximadamente el 80% del tiempo. En contraposición, en el ADN bacteriano, como en los ODN sintéticos, la C no es metilada de forma preferente en el dinucleótido CpG. Por consiguiente, el ADN bacteriano es estructuralmente diferente del ADN de los vertebrados debido a su contenido más de 20 veces mayor de motivos CpG no metilados. Numeroso estudios han establecido el motivo CpG no metilado como el patrón molecular dentro del ADN bacteriano que activa las células inmunitarias (Krieg et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002).

El ADN CpG se reconoce como un potente adyuvante por su habilidad para inducir una fuerte respuesta de anticuerpos y una respuesta de células T parecidas a Th1 ante tales antígenos exógenos como la ovoalbúmina y la lisozima de los huevos de gallina (Chu et al., J. Exp. Med., 186: 1623-1631, 1997; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 27: 2340-2344, 1997), Actualmente, el ADN CpG y los ODN CpG se están utilizando como vacunas terapéuticas en diversos modelos animales de enfermedades infecciosas, tumores, enfermedades alérgicas y enfermedades autoinmunes (Krieg et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002). El éxito de la CpG como vacuna radica enormemente en su eficacia para inducir una fuerte respuesta parecida a Th1, y en algunos casos, redirigir una respuesta de Th2 a una respuesta de Th1, tal como pasa en el modelo de asma alérgico (Kline et al., J. Immunol., 160: 2555-2559, 1998; Broide et al., J. Immunol., 161: 7054-7062, 1998).

Se ha prestado bastante atención a las aplicaciones terapéuticas de la activación inmunitaria innata por el ADN CpG. La potente activación de células inmunitarias innatas específicas no antigénicas inducida por el ADN CpG es suficiente para proteger a los ratones contra los desafíos bacterianos, e incluso para tratar infecciones establecidas con patógenos intracelulares (Agrawal et al., Trends Mol. Med., 8: 114-121, 2002). El ADN CpG también induce la resistencia inmunitaria innata ante tumores y la represión de tumores establecidos en ratones (Dow et al., J. Immunol., 163: 1552-1561, 1999; Carpenter et al., Cancer Res., 59: 5429-5432, 1999; Smith et al., J. Natl. Cancer Inst., 90: 1146-1154, 1998). El potente efecto adyuvante Th1 del ADN CpG puede incluso anular respuestas inmunitarias Th2 preexistentes; se ha utilizado como un adyuvante para las vacunas contra las alergias, donde induce respuestas Th1 ante antígenos en presencia de una respuesta Th2 preexistente, llevando a la disminución de los síntomas después de la posterior inhalación de alérgenos (Van Uden et al., J. Allergy Clin. Immunol., 104: 902-910, 1999).

Secuencias inmunoinhibidoras (SII): Se han utilizado inhibidores de oligodesoxinucleótidos con secuencia inmunoestimuladora (ODN-SIE) para inhibir la actividad inmunoestimuladora de ODN-SIE, por ejemplo, para suprimir la actividad inmunoestimuladora de cualquier ODN-SIE presente en vectores de expresión recombinantes en particular en el contexto de la terapia génica, como agentes antiinflamatorios para reducir las respuestas inmunitarias del huésped ante ODN-SIE en bacterias y virus, como modulador autoinmune en combinación con un conjugado de autoantígenos o autoanticuerpos para inhibir la producción de IL-12 mediada por Th1 y estimulada por ODN-SIE, para su uso como adyuvante para las respuestas inmunitarias Th2 ante los antígenos extracelulares, y en general para cambiar una respuesta inmunitaria del huésped de una respuesta Th1 a una Th2. Véase la Patente estadounidense
nº 6.255.292.

Yamada et al., J. Immunol., 169: 5590-5594, 2002, utilizando diversos sistemas celulares de activación inmunitaria in vitro, evaluaron los oligodesoxinucleótidos de SII en la estimulación inmunitaria inducida por CpG. Yamada et al. descubrieron que la supresión por parte de los oligodesoxinucleótidos de SII predomina sobre la estimulación por los oligodesoxinucleótidos y es específica para las respuestas inmunitarias inducidas por CpG. Descubrieron que las secuencias de oligonucleótidos más supresoras contenían secuencias ricas en G-C ó poliG, pero no se descubrió ningún motivo hexamérico específico. Krieg et al., PNAS, 95: 12631-12636, 1998, descubrió que los oligonucleótidos sintéticos que contenían motivos neutralizadores definidos por él como dinucleótidos CpG en regiones de repetición directa o con una C en el lado 5' ó una G en el lado 3', podían bloquear la activación inmunitaria mediante motivos CpG inmunoestimuladores. De nuevo, no se descubrió ninguna secuencia inmunoinhibidora hexamérica. En Zeuner et al., Arthritis and Rheumatism, 46: 2219-2224, 2002, la SII descrita por Kreig et al. más arriba, demostró que reducía la artritis inducida por CpG en un modelo animal. En US 6.225.292, Raz et al. describen un motivo hexamérico específico designado 5'-purina-purina-[Y]-[Z]-pirimidina-pirimidina-3' donde Y es cualquier nucleótido excepto la citosina, y Z es cualquier nucleótido, en el que cuando Y no es guanosina o inosina, Z es guanosina o inosina, que bloquea la actividad estimuladora de las secuencias inmunoestimuladoras CpG. En cada uno de los ejemplos anteriores, se demostró que la SII inhibe de forma específica la activación inmunitaria provocada por las secuencias CpG estimuladoras.

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Terapia con ácido nucleico

Terapia antisentido: Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron originariamente como algo complementario a los genes objetivo específicos para disminuir su expresión (Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002). Para impedir la degradación de estos oligonucleótidos, se modificaron en general las espinas dorsales, tales como a una espina dorsal de fosforotioato. Aunque en muchos casos los oligonucleótidos antisentido sí suprimieron la expresión de los genes objetivo en las células de los cultivos tisulares, los experimentos in vivo tuvieron menos éxito a la hora de alterar la expresión. En vez de ello, muchos investigadores descubrieron de forma imprevista que algunos de estos oligonucleótidos estimulaban la respuesta inmunitaria in vivo. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido contra el gen rev del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tenía un efecto inmunoestimulador tal y como se manifestaba por el aumento de la proliferación de células B y la esplenomegalia (Branda et al., Biochem. Pharmacol., 45: 2037-2043, 1993). Aunque se identificó ningún motivo secuencial inmunoestimulador inmediato en estos primeros estudios, estos descubrimientos llevaron a la eventual búsqueda de motivos inmunoestimuladores específicos.

Terapia génica: Se han utilizado terapéuticas con polinucleótidos, incluyendo ADN desnudo que codifica péptidos y/o polipéptidos, ADN formulado en agentes facilitadores de precipitación - y transfección-, y vectores virales para la "terapia génica". La terapia génica es la administración de un polinucleótido para proporcionar la expresión de una proteína o péptido, para sustituir una proteína o péptido defectuoso o ausente en el huésped y/o para aumentar una función fisiológica que se desee. La terapia génica incluye métodos que dan por resultado la integración del ADN en el genoma de un individuo a efectos terapéuticos. Ejemplos de terapia génica incluyen la administración de ADN que codifica factores de coagulación para la hemofilia, adenina deaminasa para la inmunodeficiencia combinada grave, el receptor de lipoproteínas de baja densidad para la hipercolesterolemia familiar, glucocerebrosidasa para la enfermedad de Gaucher, \alpha1-antitripsina para la deficiencia de \alpha1-antitripsina, genes de la globina alfa o Beta para hemoglobinopatías, y los canales de cloruro para la fibrosis quística (Verma y Somia, Nature, 389, 239-42, 1997).

Inmunización con ADN para tratar infecciones: En la inmunización con ADN una unidad de transcripción no replicante puede proporcionar el patrón para la síntesis de proteínas o segmentos de proteínas que inducen o proporcionan respuestas inmunitarias específicas en el huésped. La inyección de ADN desnudo promueve la vacunación contra una diversidad de microbios y tumores (Robinson y Torres, Semin Immunol, 9, 271-83, 1997). Las vacunas con ADN que codifican proteínas específicas, presentes en los virus (el virus de la hepatitis B, el virus de la inmunodeficiencia humana, el rotavirus, y el virus de la gripe), las bacterias (mycobacterium tuberculosis), y los parásitos (Malaria), todos ellos antígenos exógenos, están siendo desarrolladas para prevenir y tratar estas infecciones (Le et al., Vaccine, 18, 1893-901, 2000); (Robinson y Pertmer, Adv Virus Res, 55, 1-74, 2000).

ADN para tratar la neoplasia: Las vacunas con ADN que codifican el antígeno principal de histocompatibilidad de clase I, las citoquinas (IL-2, IL-12 e IFN-gamma), y los antígenos tumorales, están siendo desarrolladas para tratar la neoplasia (Wlazlo y Ertl, Arch Immunol Ther Exp, 49: 1-11, 2001). Por ejemplo, se ha administrado ADN viral que codifica el idiotipo de la inmunoglobulina de células B (región de unión a antígeno) para eliminar y proteger contra los linfomas de células B (Timmerman et al., Blood, 97: 1370-1377, 2001).

Inmunización con ADN para tratar las enfermedades autoinmunes: Otras personas han descrito terapias con ADN que codifican moléculas inmunitarias para tratar enfermedades autoinmunes. Dichas terapias con ADN incluyen ADN que codifica regiones de unión a antígeno del receptor de células T para alterar los niveles de células T autoreactivas que conducen la respuesta autoinmune (Waisman et al., Nat Med, 2: 899-905, 1996) (Patente estadounidense 5.939.400). El ADN que codifica autoantígenos se adjuntó a partículas y se administró mediante una pistola génica a la piel para prevenir la esclerosis múltiple y la artritis colágeno-inducida. (Patente WO 97/46253) (Ramshaw et al., Immunol. and Cell Bio., 75: 409-413, 1997). Se han utilizado ADN que codifica moléculas de adhesión, citoquinas (TNF alfa), quimioquinas (quimioquinas C-C) y otras moléculas inmunitarias (ligando Fas) para tratar modelos animales de las enfermedades autoinmunes (Youssef et al., J Clin Invest, 106: 361-371, 2000); (Wildbaum et al., J Clin Invest, 106: 671-679, 2000); (Wildbaum et al., J Immunol, 165: 5860-5866, 2000); (Wildbaum et al., J Immunol, 161: 6368-7634, 1998); (Youssef et al., J Autoimmun, 13: 21-9, 1999).

Es un objeto de la presente invención el proporcionar un método y composición para tratar o prevenir una enfermedad, en particular una enfermedad autoinmune o inflamatoria, lo que implica la administración de ácidos nucleicos inmunomoduladores.

Otro objeto de esta invención es el de proporcionar los medios de identificación de las secuencias inmunomoduladores para tratar la enfermedad. Aún otro objeto de esta invención es el de proporcionar el método y los medios para tratar una enfermedad relacionada con autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) que está(n) presente(s) e implicado(s) en un proceso no fisiológico en un animal y que implica la administración de una secuencia inmunomoduladora en combinación con un polinucleótido que codifica autoproteína(s), autopolipéptido(s) o péptido(s). Otro objeto de la presente invención es el de proporcionar una composición para tratar o prevenir una enfermedad relacionada
con autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) que está(n) presente(s) de forma no fisiológica en un animal.

La invención además hace referencia al tratamiento o prevención de enfermedades implicando la administración de los ácidos nucleicos inmunomoduladores en combinación con automolécula(s). Éstos y otros objetos de esta invención serán evidentes a partir del conjunto de las reivindicaciones.

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Breve resumen de la invención

La invención proporciona un método para elaborar un vector plasmídico, método que consiste en modificar un vector que contiene un motivo CpG de la fórmula 5'-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' para sustituir una citosina por una no citosina dentro del dinucleótido CpG, en el que el vector además está compuesto por un polinucleótido que codifica una proteína mielina o una proteína insulina. La invención además proporciona un vector pVAX1^{TM} modificado que está compuesto por los siguientes nucleótidos en la espina dorsal del vector:

G: en los nucleótidos 784, 1161, 1218 y 1966;

A: en los nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 y 1997; y

T: en los nucleótidos 1963 y 1987, y

G: en los nucleótidos 1831, 1876, 1942 y 1999.

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Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que está compuesta por dicho vector modificado.

Pueden utilizarse composiciones de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune seleccionada de entre la esclerosis múltiple y la diabetes mellitus insulinodependiente.

Pueden utilizarse composiciones de la invención en un método para tratar una enfermedad autoinmune seleccionada de entre la esclerosis múltiple y la diabetes mellitus insulinodependiente.

La presente invención está basada en el descubrimiento de que las secuencias inmunomoduladoras solas o combinadas podrían utilizarse para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias relacionadas con las automoléculas. No se había apreciado hasta esta invención que las secuencias inmunomoduladoras que contienen un dinucleótido GpG u otro dinucleótido modulador tal y como se describe en el presente documento en ciertos motivos secuenciales inmunomoduladores pueden utilizarse para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias que no dependen de la estimulación inmediata o concurrente de SII (p. ej., ADN microbiano o vectores recombinantes que contienen CpGs). Algunos ejemplos de los motivos secuenciales inmunomoduladores son:

5'-Purina-Pirimidina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3';

y,

5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3'.

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Los objetos de la presente invención se consiguen mediante una novedosa composición para tratar o prevenir una enfermedad, específicamente una enfermedad autoinmune o inflamatoria, que está compuesta por ácidos nucleicos inmunomoduladores que tienen una o más secuencias inmunomoduladoras. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores pueden administrarse solos o en combinación con un polinucleótido que codifica autoproteína(s), autopolipéptido(s), autopéptido(s). Los ácidos nucleicos inmunomoduladores también pueden administrarse en combinación con otras automoléculas para tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria relacionada con una o más automoléculas que está(n) presente(s) en el individuo de forma no fisiológica. La invención además hace referencia a composiciones farmacéuticas para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune o inflamatoria en las que la composición farmacéutica está compuesta por una secuencia inmunomoduladora en forma de un polinucleótido, tal como un polinucleótido de ADN. La secuencia inmunomoduladora también puede estar incorporada dentro de un vector, mediante la modificación de elementos de la secuencia de nucleótidos de un vector para incluir motivos secuenciales inmunomoduladores que están compuestos además por un motivo dinucleótido inhibidor cuando se utiliza en el contexto de enfermedades relacionadas con automoléculas presentes en el sujeto de forma no fisiológica, tal como en las enfermedades autoinmunes o inflamatorias.

Otros objetos de la presente invención se consiguen mediante una novedosa composición para su uso a la hora de tratar o prevenir la esclerosis múltiple o la diabetes mellitus insulinodependiente, que son enfermedades relacionadas con una o más autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) presente(s) en el animal de forma no fisiológica, comprendiendo dicho tratamiento la administración al animal de una secuencia inmunomoduladora.

La solicitud además hace referencia a un novedoso método para tratar o prevenir una enfermedad en un animal relacionada con una o más autoproteína(s), autopolipéptido(s) o péptido(s) que está(n) presente(s) en el animal de forma no fisiológica y que comprende la administración al animal de una secuencia inmunomoduladora en combinación con un polinucleótido que codifica la(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s).

En un aspecto de la invención se proporciona una composición para tratar o prevenir la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus insulinodependiente, comprendiendo dicho tratamiento o prevención la administración al animal de una secuencia inmunomoduladora bien sola o en combinación con un autovector compuesto por un polinucleótido que codifica una(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) relacionados con la enfermedad autoinmune. En otro aspecto de la invención la secuencia inmunomoduladora es para administrarla en combinación con un polinucleótido compuesto por ADN que codifica la(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) o péptido(s) presente(s) en el sujeto en un estado no fisiológico y relacionados con una enfermedad.

En otro aspecto de la solicitud se proporciona aquí un método para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias tales como la osteoartritis, la gota, la pseudogota, la enfermedad de la deposición de hidroxiapatita, el asma, la bursitis, la tendonitis, la conjuntivitis, la uretritis, la cistitis, la balanitis, la dermatitis, la enfermedad arterial coronaria o las migrañas comprendiendo la administración al animal de una secuencia inmunomoduladora, bien sola o en combinación.

En aún otro aspecto de la solicitud se proporciona un método para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con el trasplante de células u órganos incluyendo pero sin limitarse a la EICH o el rechazo a trasplantes que comprende la administración al animal de una secuencia inmunomoduladora, bien sola o en combinación con un autovector compuesto por un polinucléotido que codifica una(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) relacionados con la EICH o el rechazo a los trasplantes. La administración de la secuencia inmunomoduladora y del autovector compuesto por un polinucléotido que codifica la(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) modula una respuesta inmunitaria ante la(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) expresados por el autovector.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La SIM (SIM inhibidora) suprime la proliferación esplenocítica al completo con mediación de la SIE (ODN-CpG) y depende de RPT-9. (A) Se cultivaron esplenocitos completos con ODN-CpG estimuladores y concentraciones cada vez mayores de SIM inhibidora tal y como se indica durante 72 h. Se sometió a los pocillos a impulsos con 1 \muCi[^{3}H]TdR durante las últimas 16 h de cultivo antes de medir la radioactividad incorporada. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados +/- SD. (B) Se aislaron y cultivaron esplenocitos completos de ratones de tipo salvaje con RPT-9 (barras sombreadas) y KO con RPT-9 (barras negras) con ODN-CpG estimuladores, SIM inhibidora o LPS durante 72 h. Se sometió a los pocillos a impulsos con 1 \muCi[^{3}H]TdR durante las últimas 16 h de cultivo antes de medir la radioactividad incorporada. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados +/- SD. (C) La SIM inhibe la fosforilación de l\kappaB-\alpha en Serina 32. Se cultivaron esplenocitos naive en presencia del oligo indicado a 5 \mug/ml durante 72 h. La fosforilación de l\kappaB-\alpha en Serina 32 se determinó mediante el análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western de 20 \mug de cada extracto de proteína. l\kappaB-\alpha se activa en presencia de la CpG estimuladora (carril 2) o CpG estimuladora y oligo de control (carril 6), pero se reduce su activación con la adición de la SIM al oligo CpG estimulador (carril 5).

Figura 2: La SIM inhibidora reduce el CPH de clase II de la superficie celular y la expresión molecular co-estimuladora. (A) Se cultivaron esplenocitos naive en ausencia o presencia de o bien ODN-CpG estimuladores (5 \mug/ml) o SIM inhibidora (5 \mug/ml). Las células se recogieron tras 72 h. El ADNc se sintetizó a partir de ARN purificado para el análisis de RCP cuantitativo. La cantidad de ARN para el CPH de clase II se indica como las unidades relativas en comparación con la cantidad de \beta-actina presente en cada muestra. (B) Se cultivaron esplenocitos naive en presencia de la cantidad indicada de cada oligonucleótido (en \mug/ml). El porcentaje de células positivas para la expresión del CPH de clase II se analizó mediante FACS, y tal y como se muestra existe una inhibición dosis-dependiente de la expresión del CPH de clase II con unas concentraciones cada vez mayores del oligonucleótido inhibidor. (C a F) Efecto de la SIM inhibidora (oligo inhibidor) sobre la expresión de los marcadores de activación de la CPA. Se cultivaron esplenocitos naive con las concentraciones indicadas de ODN-CpG estimuladores, SIM inhibidora, u ODN de control. Se recogieron las células tras 72 h. Se utilizó el análisis mediante escáner FACScan para evaluar la expresión de CD40 (C), CD80 (D), CD86 (E) y CD1d (F). Hay una reducción dosis-dependiente en la expresión de CD40, CD80 y CD86, pero un incremento dosis-dependiente en la expresión de CDId con la SIM inhibidora.

Figura 3: La SIM inhibidora suprime la producción de citoquinas Th1. Se cultivaron esplenocitos naive con las concentraciones indicadas de ODN-CpG estimuladora, SIM inhibidora u ODN de control. Se recogieron los sobrenadantes tras 72 h. La producción de IL6 (A) e IL12p40 (B) se midió mediante ELISA. Tal y como se indica, existe una inhibición dosis-dependiente de la producción tanto de IL6 como de IL12p40 con concentraciones cada vez mayores de la SIM. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados.

Figura 4: La terapia preventiva con SIM inhibidora suprime la EAE mediada por PPL_{139-151}. Se inmunizó a ratones SJL/J de forma subcutánea con 100 \mug de péptido de PPL_{139-151} en solución salina tamponada con fosfato (SSTF) emulsionada en adyuvante completo de Freund (ACF). Se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de la SIM resuspendida en SSTF catorce y siete días antes de la inmunización con péptidos. Se clasificó clínicamente a los animales a diario. Grado 1, parálisis de la cola, grado 2, paraparesia en las patas traseras, grado 3, parálisis de las patas traseras, grado 4, parálisis completa (tetraplegia), grado 5, muerte.

Figura 5: La terapia preventiva con SIM inhibidora suprime la EAE mediada por PPL_{139-151}. Se inmunizó a ratones SJL/J de forma subcutánea con 100 \mug de péptido de PPL_{139-151} en ACF que constaba de adyuvante incompleto de Freund y 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis inactivada por calor. Se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de los ODN indicados resuspendidos en SSTF el mismo día (día 0) como la inmunización con péptidos. Se clasificó clínicamente a los animales a diario. Grado 1, parálisis de la cola, grado 2, parapesia en las patas traseras, grado 3, parálisis de las patas traseras, grado 4, parálisis completa (tetraplegia), grado 5, muerte.

Figura 6: Los efectos de la proliferación diferencial de la SIM sobre las células T antígeno-específicas purificadas. (A) La SIM inhibidora suprime las células Th1. Se co-cultivaron esplenocitos completos naive con péptido de PPL_{139-151} y los ODN indicados durante 24 h. Después de la radiación de los esplenocitos cargados de péptidos, se añadió una línea celular Th1 específica de PPL_{139-151} durante otras 72 h. La SIM no estimula la proliferación celular Th1 y de hecho disminuye ligeramente la proliferación inducida por ODN-CpG. (B) Por contraste, la SIM inhibidora no inhibe la proliferación de una línea celular Th2 específica de PPL_{139-151}. Se debe tener en cuenta que los ODN-CpG reducen la proliferación de esta línea celular Th2. En cada uno de estos tres experimentos, se sometió a los pocillos a impulsos con 1 \muCi[^{3}H]TdR durante las últimas 16 h de cultivo antes de medir la radioactividad incorporada. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados +/- SD.

Figura 7: Las modificaciones en el vector pBHT1 reducen la actividad proliferativa de los esplenocitos. (A) Se cultivaron esplenocitos completos con oligonucleótido CpG estimulador y oligonucleótido GpG inmunomodulador durante 24 h. Se sometió a los pocillos a impulsos con 1 \muCi[^{3}H]-timidina durante las últimas 4 h de cultivo antes de medir la radioactividad incorporada. El índice de estimulación se calculó basándose en el grado de proliferación sobre la proliferación de los esplenocitos incubados solamente con el medio. (B) Se cultivaron esplenocitos completos con el vector vacío pVAX1 o el vector vacío pBHT1 en las concentraciones indicadas durante 24 h. Se sometió a los pocillos a impulsos con 1 \muCi[^{3}H]-timidina durante las últimas 4 h de cultivo antes de medir la radioactividad incorporada. El índice de estimulación se calculó basándose en el grado de proliferación sobre la proliferación de los esplenocitos incubados solamente con el medio.

Figura 8: La activación reducida de las CPA con el vector pBHT1. Se cultivaron esplenocitos naive con 10 \mug/ml de oligonucléotido CpG o GpG (A) o 100 \mug/ml de pVAX1 o pBHT1 durante 48 horas. Se recogieron las células, se tiñeron o expresión de CD16/32 y análisis mediante escáner FACScan. La gráfica sin marcar representa las células incubadas solamente con el medio.

Figura 9: La producción reducida de citoquinas con el vector pBHT1. Se cultivaron esplenocitos naive con 10 \mug/ml de oligo CpG estimulador, oligo GpG inmunomodulador, 100 \mug/ml de ADN pVAX1 ó 100 \mug/ml de ADN pBHT1. Se recogieron los sobrenadantes tras los tiempos indicados y se midió la producción de IL6, IL10 e IFN\gamma mediante sándwich ELISA. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados.

Figura 10: El vector pBHT1 que codifica un autoantígeno reduce la gravedad de la EAE. El ADN que codifica el autoantígeno, PPL (proteína proteolipídica) de ratón, se incorporó dentro del vector pBHT1 y se administró de forma intramuscular a ratones SJL. Se indujo primero a los ratones para la EAE con el péptido de PPL_{139-151} en ACF (adyuvante completo de Freund) en el día 0, y después, varios días tras la aparición de la enfermedad (en el día 20) se les dividió de forma aleatoria en diferentes grupos de tratamiento. Se administraron entonces de forma intramuscular cincuenta \mug de PPL de ratón codificado dentro del vector pBHT1 o cincuenta \mug de un vector pBHT1 de control vacío en tres frecuencias de dosis diferentes: (A) una vez a la semana, (B) una vez cada dos semanas, y (C) una vez cada cuatro semanas. A los ratones se les clasificó a diario con referencia a la gravedad de la enfermedad de la EAE en una escala del 1 al 5 y la puntuación media de la enfermedad de un grupo del tratamiento es el que aparece la gráfica. Hay una reducción en la puntuación media de la enfermedad en todos los grupos del tratamiento, más notablemente en una frecuencia de cada dos o cada cuatro semanas.

Figura 11: La terapia con polinucleótidos con SIM inhibidora suprime la EAE mediada por PPL_{139-151}. En el día 0, se inmunizó de forma subcutánea a ratones SJL/J hembras de siete semanas de edad con 100 \mug de PPL_{139-151} en SSTF emulsionada en ACF, consistiendo en AIF y 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis inactivada por calor. Se clasificó clínicamente a los animales a diario comenzando en el día 7. En el día 12, se inyectó a los ratones en ambos cuádriceps un total de 0,1 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectaron de forma intramuscular a ratones seleccionados en ambos cuádriceps el polinucleótido de ADN que codifica PPL, MAG, MOG y PBM murinas completas cada una de ellas en un plásmido pTARGET diferente (25 \mug de cada) más 50 \mug de plásmido pTARGET que codifica IL-4 murino completo en un volumen total de 0,2 ml de TE. Las inyecciones de ADN se pusieron en intervalos semanales durante seis semanas. Al mismo tiempo que el tratamiento inicial con ADN, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM en un volumen de 200 \mul en SSTF solo o con tratamiento con polinucleótido de ADN. La SIM se administró cada dos semanas durante seis semanas.

Figura 12: El perfil de las citoquinas de los grupos tratados de EAE. Cincuenta y siete días después de la inducción de la enfermedad de la EAE, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron nódulos linfáticos inguinales y axilares de cada ratón y se agruparon de conformidad con los grupos respectivos. Se aislaron las células y se estimularon con 10 \mug/ml en PPL_{139-151} en medios RPMI enriquecidos y SFB al 10%. Tres días más tarde, se recogieron los sobrenadantes de las células y se sometieron a ensayo en busca de los perfiles de las citoquinas mediante sándwich ELISA utilizando kits ELISA de (A) IFN-gamma, (B) IL-4 y (C) IL-10 murinos estándar de BD Pharmingen.

Figura 13: El análisis de dispersión de epítopos de autoanticuerpos de mielina utilizando tecnología de microsecuencia proteica. Catorce días tras la aparición de y después de la recuperación parcial de la EAE paralítica aguda inducida con PPL_{139-151}, se trató a los ratones SJL/J semanalmente con vehículo de SSTF, SIM, pTARGET que expresa PBM, PPL, MOG, y MAG (DPT) e IL-4; DPT e IL-4 más SIM; DPT e IL-4 más CpG. Después de las seis semanas de tratamiento, se obtuvo suero de cada grupo del tratamiento incluyendo suero normal de ratón (SNR), se llevó a cabo el análisis de microsecuencia proteica de mielina y se utilizó SAM para identificar y crear un análisis conjunto jerárquico para ordenar las características del antígeno.

Figura 14: La SIM inhibidora sola y en combinación con la terapia con polinucleótidos suprime la EAE mediada por PPL_{139-151}. En el día 0, se inmunizó de forma subcutánea a ratones SJL/J hembras de siete semanas de edad con 100 \mug de PPL_{139-151} en SSTF emulsionada en ACF, consistente en AIF y 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis inactivada por calor. Se clasificó clínicamente a los animales a diario comenzando en el día 7. En el día 14, se inyectó a los ratones en ambos cuádriceps un total de 0,1 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectaron de forma intramuscular a ratones seleccionados en ambos cuádriceps el polinucleótido de ADN que codifica PPL, MAG, MOG y PBM murinas completas cada una de ellas en un plásmido pTARGET diferente (25 \mug de cada) más 50 \mug de plásmido pTARGET que codifica IL-4 murino completo en un volumen total de 0,2 ml de TE. Las inyecciones de ADN se pusieron en intervalos semanales durante seis semanas. Al mismo tiempo que el tratamiento inicial con ADN, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM en un volumen de 200 \mul en SSTF solo (A), o con tratamiento con polinucleótido de ADN (B). La SIM se administró cada dos semanas durante seis semanas.

Figura 15: La terapia con polinucléotido de ADN y SIM trata la diabetes en los ratones NOD. Se obtuvieron ratones hembras NOD/Lt a las 7 semanas de edad y se metieron en una habitación de acceso restringido. Los ratones se sometieron a ensayo semanal en busca de niveles elevados de glucosa en sangre (BGL) comenzando a las 10 semanas de vida y utilizando el Sistema de Monitorización de la Glucosa Sanguínea One Touch Ultra. Se inició el tratamiento cuando el BGL estaba entre 200 y 250 mg/dl. Se fueron añadiendo ratones de forma secuencial a cada grupo a medida que estaban disponibles, comenzando a la edad de 15 semanas. Se inyectó a los ratones en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectó a los ratones de forma intramuscular en ambos cuádriceps bien con: 1) polinucleótido de ADN que codifica preproinsulina-1 y preproinsulina-2 murinas completas cada una en un vector pVAX1 diferente a 50 \mug/dosis; o, 2) polinucléotido de ADN que codifica preproinsulina-1 y preproinsulina-2 murinas completas cada una en un vector pVAX1 diferente a 50 \mug/dosis más un plásmido pVAX1 que codifica IL4 en un volumen total de 0,2 ml de SSTF. Las inyecciones se pusieron en intervalos semanales durante cuatro semanas. Al mismo tiempo que el tratamiento inicial con ADN, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM en un volumen de 200 \mul en SSTF solo o con tratamiento con polinucleótido de ADN. La SIM se administró en intervalos semanales durante cuatro semanas. Se examinó el porcentaje de supervivencia sobre la progresión de la diabetes observada durante nueve semanas tras el tratamiento inicial (A). El porcentaje diabético en la semana 29 de edad se define como los ratones con un BGL constante de más de 250 mg/dl (B).

Figura 16: La terapia con polinucléotido de ADN y SIM trata la diabetes en los ratones NOD. Se obtuvieron ratones hembras NOD/Lt a las 7 semanas de edad y se metieron en una habitación de acceso restringido. Los ratones se sometieron a ensayo semanal en busca de niveles elevados de glucosa en sangre (BGL) comenzando a las 10 semanas de vida y utilizando el Sistema de Monitorización de la Glucosa Sanguínea One Touch Ultra. Se inició el tratamiento cuando el BGL estaba entre 200 y 250 mg/dl. Se fueron añadiendo ratones de forma secuencial a cada grupo a medida que estaban disponibles, comenzando a la edad de 15 semanas. Se inyectó a los ratones en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectó a los ratones de forma intramuscular en ambos cuádriceps bien con: 1) SSTF tratado, 2) plásmido pVAX1 vacío a 200 ug/dosis, 3) SIM a 50 ug/dosis administrado de forma intramuscular, 4) la combinación de plásmido pVAX1 vacío más SIM (de forma intramuscular), 5) la combinación de polinucleótido de ADN que codifica preproinsulina-1 y preproinsulina-2 murinas completas cada una en un vector pVAX1 diferente a 50 \mug/dosis, 6) la combinación de polinucleótido de ADN más SIM (de forma intramuscular), 7) la combinación de polinucleótido de ADN más 50 \mug/dosis de un plásmido pVAX1 que codifica IL-4, 8) la combinación de polinucleótido de ADN más IL-4 más SIM (de forma intramuscular), 9) la combinación de polinucleótido de ADN más IL-4 y una inyección intraperitoneal por separado de 50 \mug/dosis de SIM con un volumen total de 0,2 ml en SSTF.

Todas las inyecciones se pusieron en intervalos semanales durante ocho semanas. El porcentaje diabético se define como los ratones con un BGL constante de más de 250 mg/dl. Se examinó el porcentaje de supervivencia sobre la progresión de la diabetes observada durante ocho semanas tras el tratamiento inicial.

Figura 17: La terapia con ADN con SIM inhibidora suprime la ACI inducida por colágeno de Tipo II. Se pre-trataron grupos de 20 ratones DBA/1 machos de seis semanas de vida de forma intramuscular con 50 \mug de las vacunas de ADN indicadas 14 y 7 días antes de inducir la ACI con CII emulsionado en Adyuvante Completo de Freund. Los ratones recibieron una tercera dosis de la vacuna tolerizante de ADN 1 semana después de la inducción de la ACI. A los ratones se les dio una dosis de refuerzo 2 semanas más tarde con CII emulsionado en Adyuvante Incompleto de Freund. Se puntuó la artritis utilizando el sistema de clasificación visual tal y como se describe en Current Protocols in Immunology (los protocolos actuales de inmunología). (A) El ADN que codifica el colágeno de tipo II (CII) al completo en combinación con el ADN que codifica IL-4 con y sin SIM, dio por resultado reducciones significativas en la gravedad media de la artritis en comparación con los grupos de control tratados con el vector de la vacuna de ADN (pTarget) +
IL-4 con o sin SIM. (B) El porcentaje global de incidencia de la enfermedad era equiparable en todos los grupos.

Figura 18: Ensayo de proliferación de grupos tratados de ACI. Veintisiete días después de la dosis de refuerzo de inmunización a ACI, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron nódulos linfáticos inguinales y axilares de cada ratón y se agruparon de conformidad con los grupos respectivos. Se aislaron las células y se estimularon con 100 \mug/ml de colágeno de tipo II desnaturalizado en medios RPMI enriquecidos y SFB al 10% durante 72 horas. Se sometió a las células a impulsos con 1 \muCi[^{3}H]TdR durante las últimas 16 h de cultivo antes de medir la radioactividad incorporada. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados +/- SD.

Figura 19: Perfil de citoquinas de grupos tratados de ACI. Veintisiete días después de la dosis de refuerzo de inmunización a ACI, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron nódulos linfáticos inguinales y axilares de cada ratón y se agruparon de conformidad con los grupos respectivos. Se aislaron las células y se estimularon con 100 \mug/ml de colágeno de tipo II desnaturalizado en medios RPMI enriquecidos y SFB al 10% durante 72 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se sometieron a ensayo en busca de los perfiles de las citoquinas mediante sándwich ELISA utilizando kits ELISA de (A) IL-6, (B) IL-4, (C) IFN-gamma y (D) TNF-alfa murinos estándar de BD Pharmingen.

Figura 20: La terapia con ADN con SIM inhibidora suprime la ACI inducida por colágeno de Tipo II. Se pre-trataron grupos de 20 ratones DBA/1 machos de seis semanas de vida de forma intramuscular con 50 \mug de las vacunas de ADN indicadas y de forma intraperitoneal con SIM 14 y 7 días antes de inducir la ACI con CII emulsionado en Adyuvante Completo de Freund. Los ratones recibieron una tercera dosis de la vacuna tolerizante de ADN y SIM 1 semana después de la inducción de la ACI. A los ratones se les dio una dosis de refuerzo 2 semanas más tarde con CII emulsionado en Adyuvante Incompleto de Freund. Se puntuó la artritis utilizando el sistema de clasificación visual tal y como se describe en Current Protocols in Immunology (los protocolos actuales de inmunología). (A) Los ratones tratados con SIM, dieron por resultado reducciones significativas en la gravedad media de la artritis en comparación con el grupo de control no tratado y el grupo tratado con ADN que codifica el colágeno de tipo II (CII) al completo en combinación con SIM. (B) El porcentaje global de incidencia de la enfermedad disminuyó en el grupo tratado con SIM en comparación con los otros dos grupos equiparables.

Figura 21: La SIM inhibidora suprime la proliferación de células B mediada por SIE (ODN-CpG). Se aislaron células B primarias del bazo mediante una técnica de lavado en batea de células B estándar utilizando IgG e IgM anti-ratón de cabra, anticuerpo específico de cadena ligera y pesada con gammaglobulina de cabra como proteína portadora, y se determinó una pureza >97% de células B220+ mediante análisis de escáner FACScan. Se cultivaron las células B con 5 ug/ml del oligo indicado durante 72 h. Se co-cultivó LPS a 100 ng/ml. Se sometió a los pocillos a impulsos con 1 pCi[^{3}H]TdR durante las últimas 16 h de cultivo antes de medir la radioactividad incorporada. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados +/- SD.

Figura 22: La SIM inhibidora suprime la producción de citoquinas Th1 de las células B. Se cultivaron células B primarias naive con las concentraciones indicadas de ODN-CpG estimuladores, SIM inhibidora u ODN de control. Se recogieron los sobrenadantes tras 72 h. La producción de IL6 (A), IFN-gamma (B), IL-10 (C) e IL12p40 (D) se midió mediante ELISA. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados.

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Descripción detallada de la invención

Antes de describir la presente invención en detalle, se debe comprender que esta invención no se limita a parámetros de proceso o formulaciones específicos ya que pueden, por supuesto, variar. También debe comprenderse que la terminología utilizada en el presente documento es solamente a efectos de describir las realizaciones concretas de la invención y no se pretende que sea restrictiva.

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Definiciones

"Ácido nucleico" y "polinucleótido" tal y como se utilizan en el presente documento son sinónimos y hacen referencia a un polímero de nucleótidos (p. ej. desoxinucleótidos, ribonucleótidos o análogos de los mismos).

"Oligonucleótido" tal y como se utiliza en el presente documento hace referencia a un subconjunto de ácido nucleico de desde aproximadamente 6 a aproximadamente 175 nucleótidos o más de largo. Los oligonucleótidos habituales poseen una longitud de hasta aproximadamente 100 nucleótidos. Con oligonucleótido se hace referencia tanto a los oligorribonucleótidos como a los oligodesoxirribonucleótidos, denominados en lo sucesivo ODNs. Los ODNs incluyen oligonucleósidos y otras bases orgánicas que contienen polímeros.

Los nucleótidos son moléculas que constan de un azúcar (preferentemente ribosa o desoxirribosa) unido a un grupo fosfato y una base orgánica intercambiable, que puede ser o bien una purina sustituida (guanina (G), adenina (A) o inosina (I)) o una pirimidina sustituida (timina (T), citosina (C) o uracil (U)).

Secuencias Inmunomoduladoras (SIM). "Secuencia inmunomoduladora" o "SIM" tal y como se utiliza en el presente documento hace referencia a una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico o región de un ácido nucleico que es capaz de modular una enfermedad autoinmune o inflamatoria. Una SIM puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido o una secuencia de nucleótidos incorporados a un vector. Un "ácido nucleico inmunomodulador" tal y como se utiliza en el presente documento significa una molécula de ácido nucleico que está compuesta de una o más SIMs.

Los términos "identidad" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas o de ácido nucleico, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o poseen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean en busca de la máxima correspondencia, tal y como se mide utilizando o bien un algoritmo de comparación de secuencias tal como, por ejemplo, PILEUP ó BLAST o un algoritmo similar (Véase, p. ej. Higgins y Sharp, CABIOS, 5: 151-153, 1989; Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de la homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970, mediante el método de búsqueda de la similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 85: 2444, 1988, mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin) o mediante inspección visual (véase, en general, Ausubel et al., supra).

La frase "sustancialmente idénticas", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que poseen al menos un 60%, preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, y lo más preferentemente al menos un 90% o al menos un 95% de identidad de nucleótidos o residuos de aminoácidos, cuando se comparan y alinean en busca de la máxima correspondencia. Preferentemente, la identidad sustancial existe sobre una región de las secuencias que es al menos de aproximadamente 50 residuos de largo, más preferentemente sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y lo más preferentemente las secuencias son sustancialmente idénticas sobre al menos aproximadamente 150 residuos. En una realización preferente, las secuencias son sustancialmente idénticas sobre la longitud total de un ácido nucleico o polipéptido determinado. En ciertas realizaciones de la invención, un ácido nucleico o polipéptido (p. ej. autoproteína, autopolipéptido o autopéptido o un ácido nucleico que codifica la autoproteína, autopolipéptido o autopéptido) es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico o polipéptido específico que se revela en el presente documento.

"Automoléculas" tal y como se utiliza en el presente documento incluye autolípidos, autoproteína(s),
autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificado(s) de forma post-traslacional. "Autoproteína(s), polipéptido(s), o péptido(s), o fragmento(s) o derivado(s)" incluyen proteína(s), polipéptido(s) o péptido(s) codificados dentro del genoma del animal; se producen o generan en el animal; pueden modificarse de forma post-traslacional en algún momento de la vida del animal; o están presentes en el animal de forma no fisiológica. El término "no fisiológico" o "de forma no fisiológica" cuando se utiliza para describir las autoproteínas, autopolipéptidos o autopéptidos de esta invención significa un cambio o desviación del rol o proceso normal en el animal para esa autoproteína, autopolipéptido o autopéptido. Cuando se hace referencia a la autoproteína, autopolipéptido o autopéptido como "relacionado con una enfermedad" o "implicado en una enfermedad" se entiende que significa que la autoproteína, autopolipéptido o autopéptido pueden modificarse en su forma o estructura y por consiguiente ser incapaces de llevar a cabo su rol o proceso fisiológico; o pueden estar implicados en la patofisiología del estado o enfermedad bien induciendo la patofisiología, mediando o facilitando un proceso patofisiológico; y/o siendo el objetivo de un proceso patofisiológico. Por ejemplo, en las enfermedades autoinmunes, el sistema inmunitario ataca de forma anómala las automoléculas tales como los autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s),
y la(s) autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificado(s) de forma post-traslacional, causando daños y disfunción de las células y tejidos en los que la automolécula se expresa y/o está presente. De manera alternativa, la molécula puede ella misma expresarse a niveles no fisiológicos y/o funcionar de forma no fisiológica. Por ejemplo, en las enfermedades neurodegenerativas las autoproteínas se expresan de forma anómala y se agrupan en lesiones en el cerebro causando de ese modo la disfunción neural. En otros casos, la automolécula agrava un estado o proceso no deseado. Por ejemplo en la osteoartritis, las autoproteínas incluyendo las colagenasas y las metaloproteinasas de matriz degradan de forma anómala el cartílago que cubre la superficie articular de las articulaciones. Ejemplos de modificaciones post-traslacionales de autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) son la glicosilación, la adición de grupos lipídicos, la defosforilación mediante fosfatasas, la adición de residuos de dimetilarginina, la citrulinación de filagrina y fibrina mediante peptidilarginina deiminasa (PAD); la fosforilación de alfa B-cristalina; la citrulinación de PBM; y la proteolisis de autoantígenos del LSE mediante caspasas y granzimas. Inmunológicamente, la autoproteína, autopolipéptido o autopéptido se considerarían todos ellos autoantígenos huésped y en condiciones fisiológicas normales son ignorados por el sistema inmunitario huésped a través de la eliminación, inactivación o falta de activación de las células inmunitarias que poseen la capacidad de reconocer los autoantígenos a través de un proceso designado "tolerancia inmunitaria". Autoproteína, autopolipéptido o autopéptido no incluye a las proteínas, polipéptidos o péptidos inmunitarios que son moléculas expresadas fisiológica, específica y exclusivamente por células del sistema inmunitario a efectos de regular la función inmunitaria. El sistema inmunitario es el mecanismo de defensa que proporciona los medios para producir respuestas rápidas, protectoras y enormemente específicas contra la miríada de microorganismos potencialmente patógenos que habitan el mundo animal. Ejemplos de proteína(s), polipéptido(s) o péptido(s) inmunitarios son las proteínas que comprenden el receptor de células T, las inmunoglobulinas, las citoquinas incluyendo las interleuquinas de tipo I, y las citoquinas de tipo II, incluyendo los interferones e IL-10, el TNF-\alpha, la linfotoxina, y las quimioquinas tales como la proteína-1alfa y beta inflamatoria macrófaga, la proteína monocito-quimiotáctica y RANTES, y otras moléculas directamente implicadas en la función inmunitaria tal como el ligando Fas. Existen ciertas proteínas, polipéptido(s) o péptido(s) inmunitarios que están incluidos en la autoproteínas, autopolipéptido o péptido de la invención y son los siguientes: glicoproteínas de membrana del CPH de clase I, glicoproteínas del CPH de clase II y osteopontina. La autoproteína, el autopolipéptido o autopéptido no incluyen proteínas, polipéptidos y péptidos que están ausentes en el sujeto, bien completamente o sustancialmente, debido a una deficiencia genética o adquirida causando así una afección metabólica o funcional, y se sustituyen o bien mediante la administración de dicha proteína, polipéptido o péptido o mediante la administración de un polinucleótido que codifica dicha proteína, polipéptido o péptido (terapia génica). Ejemplos de dichas afecciones incluyen la distrofia muscular de Duchenne, la distrofia muscular de Becker, la fibrosis quística, la fenilcetonuria, la galactosemia, la enfermedad de la orina de jarabe de arce y la homocistinuria. La autoproteína, autopolipéptido o péptido no incluyen proteínas, polipéptidos y péptidos expresados específica y exclusivamente por células que poseen características que las distinguen de sus homólogos normales, incluyendo: (1) la clonalidad, que representa la proliferación de una única célula con una alteración genética para formar un clon de células malignas, (2) la autonomía, que indica que el crecimiento no se está regulando de la forma adecuada, y (3) la anaplasia, o la falta de diferenciación celular coordinada normal. Las células poseen uno o más de los tres criterios antes mencionados y se denominan células neoplásicas, cancerígenas o malignas.

Los "plásmidos" y "vectores" se designan mediante una p minúscula seguida por letras y/o números. Los plásmidos iniciales están disponibles comercialmente, a disposición del público sin limitaciones o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, hay plásmidos equivalentes a los que se describen que son conocidos en la técnica y serán evidentes para los medianamente expertos en la técnica. Un "vector" o "plásmido" hace referencia a cualquier elemento genético que es capaz de replicarse al constar de elementos reguladores y de control adecuados cuando están presentes en una célula huésped. A efectos de esta invención, entre los ejemplos de vectores o plásmidos se incluyen, pero sin limitarse a ellos, los plásmidos, fagos, transposones, cósmidos, virus y similares.

"Ácido nucleico desnudo" tal y como se utiliza en el presente documento hace referencia a una molécula de ácido nucleico que no se encapsula (tal como, p. ej., dentro de una partícula viral, célula bacteriana o liposoma) y no forma complejo con una molécula que se une al ácido nucleico (tal como, p. ej., DEAE-dextrano) ni se conjuga de otra manera con el ácido nucleico (p. ej., partículas de oro o soportes basados en polisacáridos).

"Tratar", "tratamiento" o "terapia" de una enfermedad o afección significará ralentizar, detener o invertir la progresión de una enfermedad establecida, tal y como queda evidenciado por una disminución, cese o eliminación de los síntomas clínicos o diagnósticos, mediante la administración del ácido nucleico inmunomodulador de esta invención. "Enfermedad establecida" significa que el sistema inmunitario está activo, causando que los tejidos afectados se inflamen y se infiltren en ellos de forma anormal leucocitos y linfocitos. "Tratar", "tratamiento" o "terapia" de una enfermedad o afección también significará ralentizar, detener o invertir la progresión de la enfermedad mediante la administración de un ácido nucleico inmunomodulador en combinación con una automolécula. "Automoléculas" tal y como se utiliza en el presente documento hace referencia a autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificados de forma post-traslacional. "Tratar", "tratamiento" o "terapia" de una enfermedad o afección significará además ralentizar, detener o invertir la progresión de la enfermedad mediante la administración de un ácido nucleico inmunomodulador en combinación con una terapéutica inmunomoduladora. "En combinación con" cuando se hace referencia a un régimen terapéutico compuesto por un ácido nucleico inmunomodulador y otro compuesto, por ejemplo ADN que codifica una autoproteína, autopéptido o autopolipéptido, incluye dos o más compuestos administrados por separado pero juntos físicamente como co-administración en un vial, unidos por ejemplo mediante conjugación, codificados por ADN en uno o más vectores, o administrados por separado en diferentes ubicaciones pero temporalmente tan cerca uno del otro como para que una persona medianamente experta en la técnica considere que se administran "en combinación". Tal y como se utilizan en el presente documento, mejorar una enfermedad y tratar una enfermedad son equivalentes.

"Prevenir", "profilaxis" o "prevención" de una enfermedad o afección tal y como se utiliza en el contexto de esta invención hace referencia a la administración de una secuencia inmunomoduladora bien sola o en combinación con otro compuesto tal y como se describe en el presente documento, para prevenir la incidencia o aparición de una enfermedad o afección o algunos o todos los síntomas de una enfermedad o afección o reducir la probabilidad de aparición de una enfermedad o afección. "Prevenir", "profilaxis" o "prevención" de una enfermedad o afección tal y como se utiliza en el contexto de esta invención hace referencia a la administración de una secuencia inmunomoduladora en combinación con automoléculas para prevenir la incidencia o aparición de una enfermedad o afección o algunos o todos los síntomas de una enfermedad o afección o reducir la probabilidad de aparición de una enfermedad o afección. "Prevenir", "profilaxis" o "prevención" de una enfermedad o afección tal y como se utiliza en el contexto de esta invención hace referencia a la administración de una secuencia inmunomoduladora en combinación con una terapéutica inmunomoduladora para prevenir la incidencia o aparición de una enfermedad o afección o algunos o todos los síntomas de una enfermedad o afección o reducir la probabilidad de aparición de una enfermedad o afección.

Tal y como se utiliza en el presente documento "terapéuticas inmunomoduladoras" hace referencia a las moléculas que poseen una función reguladora o inmunomoduladora cuando se administran a un sujeto. Dichas terapéuticas inmunomoduladoras incluyen las citoquinas, quimioquinas, esteroides o anticuerpos a los antígenos o autoantígenos. "Sujetos" significará cualquier animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, un caballo, una vaca, un perro, un gato, un ratón, una rata, una cobaya o un conejo.

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Enfermedades autoinmunes

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento son útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes. Varios ejemplos de enfermedades autoinmunes relacionadas con automoléculas incluyendo autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s), glicoproteína(s) o derivados de automoléculas modificados de forma post-traslacional presentes en el animal de forma no fisiológica se exponen en la tabla siguiente y se describen a continuación.

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1

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(Continuación)

2

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(Continuación)

3

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Esclerosis múltiple: La esclerosis múltiple (EM) es la afección desmielinizante más común del sistema nervioso central (SNC) y afecta a 350.000 americanos y a un millón de personas en todo el mundo. La aparición de los síntomas normalmente se produce entre los 20 y 40 años y se manifiesta como un ataque agudo o subagudo de dificultad visual unilateral, debilidad muscular, parestesias, ataxia, vértigo, incontinencia urinaria, disartria o alteración mental (ordenadas en frecuencia decreciente). Dichos síntomas son el resultado de lesiones focales de desmielinización que causan tanto anomalías de conducción negativa debido a conducción axonal ralentizada como anomalías de conducción positiva debido a la generación de impulsos ectópicos (p. ej. el síntoma de Lhermitte). El diagnóstico de la EM está basado en un historial que incluya al menos dos ataques distintos de disfunción neurológica que estén separados en el tiempo, presenten pruebas clínicas objetivas de disfunción neurológica e impliquen áreas diferentes de la materia blanca del SNC. Entre los estudios de laboratorio que proporcionan pruebas objetivas adicionales que respaldan el diagnóstico de la EM se incluyen las imágenes por resonancia magnética (IRM) de las lesiones de la materia blanca del SNC, la formación de bandas oligoclonales de IgG en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y respuestas provocadas anómalas. Aunque la mayoría de los pacientes experimentan un curso de la enfermedad gradualmente progresivo de recaídas y remisiones, el curso clínico de la EM varía enormemente de unos individuos a otros y puede ir de estar limitado a varios ataques leves a lo largo de la vida a una enfermedad progresiva crónica fulminante. Un aumento cuantitativo en las células T mielina-reactivas con la capacidad para secretar IFN-gamma está relacionado con la patogénesis de la EM y la EAE.

Artritis reumatoide: La artritis reumatoide (AR) es una sinovitis inflamatoria autoinmune crónica que afecta al 0,8% de la población mundial. Se caracteriza por una sinovitis inflamatoria crónica que causa destrucción erosiva de las articulaciones. La AR está mediada por células T, células B y macrófagos.

Entre las pruebas de que las células T juegan un papel crítico en la AR se incluyen el (1) predominio de células T CD4+ que infiltran el sinovio, (2) la mejora clínica relacionada con la supresión de la función de las células T con fármacos tales como la ciclosporina, y (3) la asociación de la AR con ciertos alelos HLA-DR. Los alelos HLA-DR relacionados con la AR contienen una secuencia similar de aminoácidos en las posiciones 67-74 en la tercera región hipervariable de la cadena beta que están implicados en la unión peptídica y la presentación a las células T. La AR está mediada por células T autoreactivas que reconocen una automolécula tal como autolípidos, autoproteína(s),
autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificados de forma post-traslacional o una autobiomolécula no identificada presente en las articulaciones sinoviales o en cualquier otra parte del huésped. La(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s)
o péptidos de esta invención también designados autoantígenos son el objetivo en la AR y constan de epítopos del colágeno de tipo II; hnRNP; A2/RA33; Sa; filagrina; queratina; citrulina; proteínas cartilaginosas incluyendo gp39; colágenos de tipo I, III, IV, V, IX, XI; HSP-65/60; IgM (factor reumatoide); ARN polimerasa; hnRNP-B1; hnRNP-D; cardiolipina; aldolasa A; fibrina y filagrina modificadas por citrulina. Se han identificado autoanticuerpos que reconocen los péptidos de filagrina que contienen un residuo de arginina modificado (deiminado para formar citrulina) en el suero de una gran proporción de pacientes con AR. Las respuestas de las células B y T autoreactivas se dirigen ambas contra el mismo péptido 257-270 del colágeno de tipo II (CII) inmunodominante en algunos pacientes.

Diabetes mellitus insulinodependiente: La diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) o de tipo I humana se caracteriza por la destrucción autoinmune de las células Beta en los islotes pancreáticos de Langerhans. La reducción de células Beta da por resultado en una incapacidad para regular los niveles de glucosa en la sangre. La diabetes manifiesta se produce cuando el nivel de glucosa en la sangre se eleva por encima de un nivel específico, normalmente de aproximadamente 250 mg/dl. En los seres humanos un largo periodo presintomático precede a la aparición de la diabetes. Durante este periodo se produce una pérdida gradual de la función de las células beta pancreáticas. El desarrollo de la enfermedad se insinúa por la presencia de autoanticuerpos contra la insulina, la descarboxilasa del ácido glutámico y la tirosina fosfatasa IA2 (IA2), cada una un ejemplo de una autoproteína, autopolipéptido o péptido de conformidad con esta invención.

Los marcadores que pueden evaluarse durante la fase presintomática son la presencia de insulitis en el páncreas, el nivel y frecuencia de anticuerpos contra las células de los islotes, los anticuerpos contra la superficie celular de los islotes, la expresión anómala de las moléculas del CPH de Clase II sobre las células beta pancreáticas, la concentración de glucosa en la sangre y la concentración de insulina en plasma. Un aumento en el número de linfocitos T en el páncreas, anticuerpos contra las células de los islotes y glucosa en sangre es indicativo de la enfermedad, como también lo es la disminución de la concentración de insulina.

El ratón no obeso diabético (NOD) es un modelo animal con muchas características clínicas, inmunológicas e histopatológicas en común con la DMID humana. Los ratones NOD desarrollan de forma espontánea la inflamación de los islotes y la destrucción de las células Beta, lo que lleva a la hiperglicemia y la diabetes manifiesta. Tanto las células T CD4+ como las CD8+ son necesarias para que se desarrolle la diabetes, aunque los papeles de cada una continúan estando poco claros. Se ha mostrado tanto con insulina como con GAD que cuando se administran como proteínas bajo condiciones tolerizantes, la enfermedad puede prevenirse y pueden reducirse las respuestas a los otros autoantígenos.

Lo que es más importante, los ratones NOD desarrollan diabetes autoinmune en jaulas para ratones limpias y libres de patógenos, y en entornos libres de gérmenes.

La DMID humana se trata actualmente controlando los niveles de glucosa en sangre para guiar la inyección, o administración a base de bomba, de insulina recombinante. Los regímenes a base de dieta y ejercicio contribuyen a conseguir un control adecuado de la glucosa en sangre.

Uveitis autoinmune: La uveitis autoinmune es una enfermedad autoinmune de los ojos que se calcula que afecta a 400.000 personas, con una incidencia de 43.000 nuevos casos al año en los EE.UU. La uveitis autoinmune se trata actualmente con esteroides, agentes inmunosupresores tales como el metotrexato y la ciclosporina, la inmunoglobulina intravenosa y los antagonistas del TNF-alfa. La uveitis autoinmune experimental (UAE) es una enfermedad autoinmune mediada por células T que ataca la retina neural, la úvea y los tejidos relacionados en los ojos. La UAE comparte muchas características clínicas e inmunológicas con la uveitis autoinmune humana y es inducida por la administración periférica del péptido uveitogénico emulsionado en Adyuvante Completo de Freund (ACF).

Las autoproteínas atacadas por la respuesta autoinmune en la uveitis autoinmune humana pueden incluir el antígeno S, la proteína de unión del retinoide interfotoreceptor (IRBP), la rodopsina y la recoverina.

Cirrosis biliar primaria: La Cirrosis Biliar Primaria (CBP) es una enfermedad autoinmune órgano-específica que afecta predominantemente a las mujeres de entre 40 y 60 años. La prevalencia de la que se ha informado en este grupo se acerca al 1 por 1.000. La CBP se caracteriza por la destrucción progresiva de las células epiteliales biliares intrahepáticas (CEBI) que revisten los conductos biliares intrahepáticos pequeños (Nishio et al., Semin Liver Dis, 22: 291, 2002). Esto lleva a la obstrucción e interferencia con la secreción de bilis, causando una eventual cirrosis. Se ha informado de la relación con otras enfermedades autoinmunes caracterizadas por daños al revestimiento epitelial/sistema secretor, incluyendo el Síndrome de Sjögren, el Síndrome de CREST, la Enfermedad del Tiroides Autoinmune y la Artritis Reumatoide.

Un modelo murino de colangitis autoinmune experimental (CAE) utiliza la sensibilización intraperitoneal (ip) con CDP de mamíferos en ratones SJL/J hembras, induciendo la colangitis destructiva no supurativa (CDNS) y la producción de AAM (Jones, J Clin Pathol, 53: 813-21, 2000). También se ha mostrado que el modelo de ratón MRL/lpr del LSE desarrolla una enfermedad parecida a la CBP caracterizada por el desarrollo de autoanticuerpos dirigidos contra el complejo alfa cetoglutarato deshidrogenasa.

Otras enfermedades autoinmunes y la(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s) relacionados: Los autoantígenos de la miastenia gravis pueden incluir epítopos dentro del receptor de acetilcolina. Los autoantígenos atacados en el pénfigo vulgar pueden incluir la desmogleína-3. Los antígenos del síndrome de Sjogren pueden incluir el SSA (ro); SSB (La); y la fodrina. El autoantígeno dominante para el pénfigo vulgar puede incluir la desmogleína-3. Los paneles para la miositis pueden incluir sintetasas de ARNt (p. ej. treonilo, histidilo, alanilo, isoleucilo y glicilo); Ku; Scl; SS-A; proteínas U1-sn-ribonucleares; Mi-1; Mi-1; Jo-1; Ku y la PRS. Los paneles para la esclerodermia pueden incluir Scl-70; centrómero; proteínas U1-sn-ribonucleares y fibrilarina. Los paneles para la anemia perniciosa pueden incluir el factor intrínseco y la subunidad beta de la glicoproteína de la ATPasa H/K gástrica. Los epítopos de los antígenos para el lupus sistémico eritematoso (LSE) pueden incluir ADN; fosfolípidos; antígenos nucleares; ribonucleoproteína U1; Ro60 (SS-A); Ro52 (SS-A); La (SS-B); calreticulina; Grp78; Scl-70; histona; proteína Sm; factores de empalme serina-arginina y cromatina, etc. Para la enfermedad de Graves los epítopos pueden incluir el simportador Na+/l-; el receptor de tirotropina; Tg; y la POT.

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Otras enfermedades

En la tabla se exponen diversos ejemplos de otras enfermedades relacionadas con autoproteína(s), autopolipépti-
do(s) o autopéptido(s) presentes en el animal de forma no fisiológica y que se describen a continuación.

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Enfermedades inflamatorias

Osteoartritis y enfermedades degenerativas de las articulaciones: La osteoartritis (OA) afecta al 30% de las personas mayores de 60 años y es la enfermedad de las articulaciones más común en los seres humanos. La osteoartritis representa la degeneración y fallo de las articulaciones sinoviales e implica el deterioro del cartílago articular.

El cartílago está compuesto principalmente por proteoglicanos, que proporcionan rigidez y la capacidad para soportar cargas, y colágenos que proporcionan tracción y resistencia a la pura fuerza. Los condrocitos dan la vuelta y remodelan el cartílago normal produciendo y secretando colagenasas latentes, estromelisina latente, gelatinasa latente, activador del plasminógeno tisular y otras enzimas relacionadas, cada uno de los cuales solos o en combinación son autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificados de forma post-traslacional de esta invención. Los condrocitos también producen diversos inhibidores, incluyendo el inhibidor tisular de la metaloproteinasa (ITMP) y el inhibidor del activador del plasminógeno (IAP-1), y limitan la actividad degradativa de las metaloproteinasas neutrales, el activador tisular del plasminógeno y otras enzimas. Estas enzimas e inhibidores degradativos, solos o en combinación, son la(s) autoproteína(s), polipéptido(s) o péptido(s) de esta invención. Estas enzimas e inhibidores degradativos coordinan la remodelación y mantenimiento del cartílago normal. En la OA, la desregulación de este proceso da por resultado el deterioro y degradación del cartílago. La mayoría de los pacientes con OA también sufren algún grado de inflamación, incluyendo el calentamiento e hinchazón de las articulaciones. En el comienzo de la OA se producen alteraciones anómalas en la disposición y tamaño de las fibras de colágeno. Las metaloproteinasas, catepsinas, plasmina y otras automoléculas solas o en combinación son autolípidos, autoproteína(s),
autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificados de forma post-traslacional de esta invención, causan una significativa pérdida de la matriz del cartílago. La producción condrocítica inicialmente incrementada de proteoglicanos y cartílago da por resultado que el cartílago articular sea más grueso de lo normal. El cartílago articular entonces reduce el grosor y se ablanda como resultado de la acción de las enzimas degradativas incluyendo las colagenasas, la estromelisina, la gelatinasa, el activador tisular del plasminógeno y otras enzimas relacionadas, solas o en combinación son automoléculas tales como los autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificados de forma post-traslacional de esta invención. Las moléculas inflamatorias tales como IL-1, las catepsinas y la plasmina pueden potenciar la degeneración y deterioro del cartílago, solas o en combinación, y son autolípidos, autoproteína(s),
autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificados de forma post-traslacional de esta invención. El cartílago más blando y delgado es mucho más propenso a sufrir daños debido al esfuerzo mecánico. Estos factores llevan al deterioro de la superficie del cartílago y a la formación de grietas verticales (fibrilación). Se forman erosiones en la superficie del cartílago y se extienden al hueso en la última fase de la enfermedad. Los condrocitos se duplican inicialmente y forman grupos, y en la última fase el cartílago se vuelve hipocelular. La remodelación y la hipertrofia del hueso son características importantes de la OA.

Entre las terapias actuales para tratar la OA se incluyen el descanso, la terapia física para fortalecer los músculos que soportan la articulación, férulas y otros dispositivos de soporte para estabilizar la articulación, agentes antiinflamatorios no esteroideos, acetaminofeno y otros analgésicos. En la última fase hueso con hueso de la OA de las articulaciones fundamentales para las actividades de la vida cotidiana, tales como las rodillas o las caderas, se lleva a cabo una sustitución quirúrgica de las articulaciones.

Lesión de la médula espinal: Se calcula que se producen aproximadamente 11.000 nuevos casos de lesiones de médula espinal cada año en los EE.UU. y que la prevalencia general es de un total de 183.000 a 230.000 casos en los EE.UU. actualmente (Stover et al., Arch Phys Med Rehabil, 80, 1365-71, 1999). Las recuperaciones de las lesiones de médula espinal son muy escasas y dan por resultado una discapacidad neurológica irreversible devastadora. El tratamiento actual para la lesión de médula espinal aguda consiste en la estabilización mecánica del sitio de la lesión, por ejemplo mediante intervención quirúrgica, y la administración de esteroides parenterales. Estas intervenciones han hecho muy poco por reducir la incidencia de la parálisis permanente que sigue a la lesión de médula espinal. El tratamiento de la lesión de médula espinal crónica se centra en el mantenimiento de la calidad de vida tal como el manejo del dolor, la espasticidad y la función de la vejiga. No hay ningún tratamiento actualmente disponible que afronte la recuperación de la función neurológica. En la fase aguda que sigue inmediatamente a la lesión, la inflamación es prominente, y la hinchazón relacionada con el daño medular es una causa importante de morbosidad. Esta inflamación se controla en parte con altas dosis de corticoesteroides sistémicos.

Enfermedad injerto contra huésped: Una de las grandes limitaciones del trasplante de tejidos y órganos en los seres humanos es el rechazo del trasplante tisular por el sistema inmunitario del receptor. Está muy demostrado que cuanto mayor sea la compatibilidad de los alelos del CPH de clase I y II (HLA-A, HLA-B y HLA-DR) entre el donante y el receptor mayor será la supervivencia del injerto. La enfermedad injerto contra huésped (EICH) causa una morbosidad y mortalidad significativas en pacientes que reciben trasplantes que contienen células hematopoyéticas alogeneicas. Esto es debido en parte a la inflamación en la piel y en otros órganos objetivo. Las células hematopoyéticas están presentes en los trasplantes de médula ósea, los trasplantes de células madre y en otros trasplantes. Aproximadamente el 50% de los pacientes que reciben un trasplante procedente de un hermano con HLA compatible desarrollará EICH de moderada a grave, y la incidencia es mucho mayor en injertos con HLA no compatible. Un tercio de los pacientes que desarrollan EICH de moderada a grave morirá como resultado de ello. Los linfocitos T y otras células inmunitarias del injerto del donante atacan las células del receptor que expresan variaciones polipeptídicas en sus secuencias de aminoácidos, en particular variaciones en proteínas codificadas en el complejo principal de histocompatibilidad (CPH), complejo génico en el cromosoma 6 de los seres humanos. Las proteínas más influyentes para la EICH en los trasplantes que implican células hematopoyéticas alogeneicas son las proteínas de clase I altamente polimórficas (amplia variación de aminoácidos de unas personas a otras) (HLA-A, -B y -C) y las proteínas de clase II (DRB1, DQB1 y DPB1) (Appelbaum, Nature, 411: 385-389, 2001). Incluso cuando los alelos del CPH de clase I son "compatibles" serológicamente entre el donante y el receptor, la secuenciación del ADN revela que hay incompatibilidades a nivel de los alelos en el 30% de los casos, lo que proporciona una base para la EICH dirigida contra la clase I incluso en parejas compatibles de donante-receptor (Appelbaum, Nature, 411, 385-389, 2001). La EICH a menudo provoca daños en la piel, el intestino, el hígado, el pulmón y el páncreas. La EICH se trata con glucocorticoides, ciclosporina, metotrexato, fludarabina y OKT3.

Rechazo a los trasplantes tisulares: El rechazo inmunitario a los trasplantes tisulares, incluyendo el pulmón, corazón, hígado, riñón, páncreas y otros órganos y tejidos, es mediado por las respuestas inmunitarias en el receptor del trasplante dirigidas contra el órgano trasplantado. Los órganos alogeneicos trasplantados contienen proteínas con variaciones en sus secuencias de aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos del receptor del trasplante. Dado que las secuencias de aminoácidos del órgano trasplantado difieren de aquellas del receptor del trasplante con frecuencia provocan una respuesta inmunitaria en el receptor contra el órgano trasplantado. La respuesta inmunitaria engloba respuestas tanto por el sistema inmunitario innato como por el adquirido y se caracteriza por inflamación del órgano objetivo.

El rechazo de los órganos trasplantados es una complicación y limitación importantes del trasplante tisular y puede causar el fallo del órgano trasplantado en el receptor. La inflamación crónica que resulta del rechazo con frecuencia lleva a la disfunción del órgano trasplantado. Actualmente se trata a los receptores de trasplantes con una diversidad de agentes inmunosupresores para prevenir y suprimir el rechazo. Estos agentes incluyen los glucocorticoides, la ciclosporina A, Cellcept, FK-506 y OKT3.

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Ácidos nucleicos inmunomoduladores y composiciones relacionadas

En un aspecto, los ácidos nucleicos inmunomoduladores de la invención comprenden el siguiente hexámero central:

5'-purina-pirimidina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3'.

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También se han revelado los ácidos nucleicos inmunomoduladores que comprenden el siguiente hexámero central:

5'-purina-purina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3'.

en el que X e Y son cualesquiera nucleótidos sintéticos o presentes de forma natural, con la excepción de que X e Y no pueden ser citosina-guanina.

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El hexámero central de las SIMs, denominado en el presente documento el motivo secuencial inmunomodulador compuesto por un motivo dinucleótido, puede estar flanqueado en 5' y/o 3' por cualquier composición o número de nucleótidos o nucleósidos. Preferentemente, los ácidos nucleicos inmunomoduladores compuestos por motivos secuenciales inmunomoduladores son oligonucleótidos que poseen entre 6 y 100 pares de bases en tamaño, y más preferentemente 16-50 pares de bases en tamaño. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores también pueden administrarse como parte de porciones más largas de ADN, que van de 100 a 100.000 pares de bases. Las SIMs pueden incorporarse a, o ya producirse en, plásmidos de ADN, vectores virales y ADN genómico. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores también pueden tener entre 6 (sin secuencias flanqueadoras) a 10.000 pares de bases, o más, en tamaño. Las secuencias presentes que flanquean el centro del hexámero pueden construirse para que se correspondan sustancialmente con las secuencias flanqueadoras presentes en cualesquiera secuencias inmunoinhibidoras conocidas. Por ejemplo, la SIM que posee la secuencia TGACTGTG-Purina-Pirimidina-X-Y-Pirimidina-Pirimidina-AGAGATGA, comprende las secuencias flanqueadoras TGACTGTG y AGAGATGA. Otra secuencia flanqueadora preferente incorpora una serie de pirimidinas (C, T y U), bien como una pirimidina individual repetida dos o más veces, o una mezcla de diferentes pirimidinas de dos o más en longitud. Se han utilizado diferentes secuencias flanqueadoras a la hora de someter a ensayo las secuencias moduladoras inhibidoras. Se incluyen más ejemplos de secuencias flanqueadoras para los ácidos nucleicos inhibidores en las siguientes referencias: Patente estadounidense nº 6.225.292 y 6.339.068; Zeuner et al., Arthritis and Rheumatism, 46: 2219-24, 2002.

SIMs concretas de la invención comprenden las siguientes secuencias hexaméricas:

SIMs 5'-purina-pirimidina-[x]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' que contienen centros dinucleótidos GG: GTGGTT, ATGGTT, GCGGTT, ACGGTT, GTGGCT, ATGGCT, GCGGCT, ACGGCT, GTGGTC, ATGGTC, GCGGTC,
ACGGTC, etcétera.

También se han revelado SIMs 5'-purina-pirimidina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' que contienen centros dinucleótidos GC: GTGCTT, ATGCTT, GCGCTT, ACGCTT, GTGCCT, ATGCCT, GCGCCT, ACGCCT, GTGCTC, ATGCTC, GCGCTC, ACGCTC, etcétera;

3. Sustitución de la adenina por guanina e inosina y/o sustitución de la citosina o timina por uridina y esas sustituciones pueden realizarse tal y como se expone basándose en las directrices anteriores.

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Una secuencia inmunoinhibidora o SII que se ha revelado anteriormente se vio que inhibía la actividad de las secuencias inmunoestimuladoras (SII) que contenían un dinucleótido central, CpG. Patente estadounidense 6.225.292. Esta invención mostró por primera vez que esta SII, en ausencia de una SIE, prevenía y trataba las enfermedades autoinmunes bien sola o en combinación con la terapia con polinucleótidos de ADN. Esta SII contenía la región hexamérica central con la secuencia AAGGTT. Esa secuencia se denomina en el presente documento una secuencia inmunomoduladora o SIM. Otras SIIs relacionadas con un motivo similar incluidas dentro de las SIMs de esta invención son:

1. SIMs 5'-purina-purina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' que contienen centros dinucleótidos GG: GGGGTT, AGGGTT, GAGGTT, AAGGTT, GGGGCT, AGGGCT, GAGGCT, AAGGCT, GGGGTC, AGGGTC, GAGGTC, AAGGTC, etcétera;

2. SIMs 5'-purina-purina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' que contienen centros dinucleótidos GC: GGGCTT, AGGCTT, GAGCTT, AAGCTT, GGGCCT, AGGCCT, GAGCCT, AAGCCT, GGGCTC, AGGCTC, GAGCTC,
AAGCTC, etcétera;

3. Las sustituciones de la adenina por guanina e inosina y/o las sustituciones de la citosina o timina por uridina pueden realizarse tal y como se expone basándose en las directrices anteriores.

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En ciertas realizaciones de la presente invención, la región hexamérica central de la SIM está flanqueada en el extremo 5' o en el 3', o tanto en el extremo 5' como en el 3', por una región poliG. Una "región poliG" o "motivo poliG" tal y como se utiliza en el presente documento se refiere a una región de ácido nucleico que consiste en al menos dos (2) bases de guanina contiguas, normalmente de entre 2 y 30 o de entre 2 y 20 guaninas contiguas. En algunas realizaciones, la región poliG posee entre 2 y 10, entre 4 y 10, o entre 4 y 8 bases de guanina contiguas. En ciertas realizaciones preferentes, la región poliG flanqueadora es adyacente al hexámero central. En aún otras realizaciones, la región poliG está unida al hexámero central mediante una región que no es poliG (enlazador no poliG); habitualmente, la región enlazadora no poliG no posee más de 6, más habitualmente no más de 4 nucleótidos, y lo más habitualmente no más de 2 nucleótidos.

Pueden obtenerse ácidos nucleicos inmunomoduladores a partir de fuentes existentes de ácido nucleico, incluyendo ADN genómico, ADN plasmídico, ADN viral y ADNc. En ciertas realizaciones preferentes, los ácidos nucleicos inmunomoduladores son oligonucleótidos sintéticos producidos mediante la síntesis de los oligonucleótidos. La SIM puede ser parte de ADN, ARN y/o oligonucleósidos de hebra única o de hebra doble.

Los ácidos nucleicos inmunomoduladores son de forma preferente ácidos nucleicos que poseen una o más regiones de SIM que contienen oligonucleótidos GpG no metilados. En realizaciones alternativas, uno o más residuos de adenina o citosina de la región de SIM están metiladas. En las células eucarióticas, habitualmente pueden estar metilados los residuos de citosina y adenina.

Los ácidos nucleicos inmunomoduladores pueden ser oligonucleótidos estabilizados y/o no estabilizados. Oligonucleótidos estabilizados significa oligonucleótidos que son relativamente resistentes a la degradación in vivo por exonucleasas, endonucleasas y otros medios de degradación. Los oligonucleótidos estabilizados preferentes poseen espinas dorsales de fosfato modificadas, y los oligonucleótidos más preferentes poseen espinas dorsales de fosfato modificadas con fosforotioato en las que al menos uno de los oxígenos fosfáticos es sustituido por sulfuro.

Las modificaciones del grupo fosfático de las espinas dorsales, incluyendo los enlaces internucleótidos de fosforoditionato, fosforoamidato, fosforotioato y metilfosfonato, pueden proporcionar propiedades antimicrobianas a las SIMs. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores son preferentemente oligonucleótidos estabilizados, utilizando de forma preferente oligonucleótidos estabilizados de fosforotioato.

Entre los oligonucleótidos estabilizados alternativos se incluyen: los alquilfosfotriesters y los fosfodiesters, en los que el oxígeno cargado está alquilado; los arilfosfonatos y alquilfosfonatos, que son análogos de ADN no iónicos en los que el oxígeno de fosfonato cargado se sustituye por un grupo arilo o alquilo; o/y oligonucleótidos que contienen hexaetilenglicol o tetraetilenglicol, u otro diol, en uno de los dos extremos terminales o en ambos. Se pueden utilizar configuraciones estéricas alternativas para unir las partes de la molécula de azúcar a las bases de nucleósidos en las regiones de SIM.

Las bases de nucleótidos de la región de SIM que flanquean los dinucleótidos moduladores pueden ser las bases presentes de forma natural o las bases sintéticas no naturales conocidas. Los oligonucleótidos pueden incorporarse a la región interna y/o los extremos terminales de los ON-SIM utilizando técnicas convencionales para su uso como puntos de enlace, esto es, como un medio de enlazar o unir otras moléculas, para otros compuestos, incluyendo las automoléculas o como puntos de enlace para terapéuticas inmunomoduladoras adicionales. La(s) base(s), la parte de la molécula de azúcar, los grupos fosfato y los extremos terminales de los ON-SIM también pueden modificarse de cualquier manera conocida para las personas medianamente expertas en la técnica para construir un ON-SIM que tenga propiedades deseadas además de la actividad moduladora del ON-SIM. Por ejemplo, las partes de la molécula de azúcar pueden enlazarse con las bases de nucleótidos de los ON-SIM en cualquier configuración estérica.

Las técnicas para realizar estas modificaciones de los grupos fosfato en los oligonucleótidos son conocidas en este campo y no requieren una explicación detallada. Para revisar una de tales útiles técnicas, el producto intermedio triéster fosfato para el producto oligonucleótido objetivo se prepara y oxida al triéster fosfato presente de forma natural con yodo acuoso o con otros agentes, tales como las aminas anhidras. Los fosforamidatos de oligonucleótido resultantes pueden tratarse con sulfuro para producir fosforotioatos. La misma técnica general (exceptuando el paso del tratamiento con sulfuro) puede aplicarse para producir metilfosfoamiditos a partir de metilfosfonatos. Para más detalles referentes a las técnicas de modificación de los grupos fosfato, aquellas personas medianamente expertas en la técnica podrían desear consultar las Patentes estadounidenses nº 4.425.732; 4.458.066; 5.218.103 y 5.453.496, así como el Tetrahedron, Lett. en 21: 4149 25 (1995), 7: 5575 (1986), 25: 1437 (1984) y el Journal Am. Chem Soc., 93: 6657 (1987), los descubrimientos de los cuales se han incorporado al presente documento a efectos de ilustrar el nivel de conocimientos en la técnica referentes a la composición y preparación de ácidos nucleicos inmunomoduladores.

Una modificación de los grupos fosfato particularmente útil es la conversión a las formas fosforotioato o fosforoditioato de los oligonucleótidos ON-SIM. Los fosforotioatos y fosforoditioatos son más resistentes a la degradación in vivo que sus homólogos oligonucleótidos no modificados, haciendo que los ON-SIM de la invención estén más disponibles para el huésped.

El ON-SIM puede sintetizarse utilizando técnicas y equipos para la síntesis de ácidos nucleicos que son bien conocidos en la técnica. Para referencia a este respecto, véase, p. ej., Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulos 2 y 4 (Wiley Interscience, 1989); Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Nueva York, 1982); la Patente estadounidense nº 4.458.066 y la Patente estadounidense nº 4.650.675. Estas referencias se han incorporado al presente documento como referencia a efectos de demostrar el nivel de conocimientos en la técnica con respecto a la producción de oligonucleótidos sintéticos.

De forma alternativa, los ON-SIM pueden obtenerse mediante la mutación de ODN-SIE microbianos aislados para sustituir el motivo CpG presente de forma natural y los nucleótidos flanqueadores por un dinucleótido competidor. Los procedimientos de criba que dependen de la hibridización de los ácidos nucleicos hacen que sea posible aislar cualquier secuencia de polinucleótidos de cualquier organismo, siempre y cuando esté a disposición el anticuerpo o sonda adecuado. Las sondas de oligonucleótidos, que corresponden a una parte de la secuencia que codifica la proteína en cuestión, pueden sintetizarse químicamente. Esto requiere conocer tramos oligopeptídicos cortos de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ADN que codifica la proteína también puede deducirse del código genético, sin embargo, se debe tener en cuenta la degeneración del código.

Por ejemplo, una biblioteca de ADNc que se cree que contiene un polinucleótido con SIE puede cribarse inyectando diversos ARNm derivados de ADNcs en oocitos, permitiendo un tiempo suficiente para que se produzca la expresión de los productos génicos de ADNc, y sometiéndolo a ensayo para comprobar la presencia del producto de expresión de ADNc deseado, por ejemplo, utilizando un anticuerpo específico para un péptido codificado por el polinucleótido de interés o utilizando sondas para los motivos de repetición y una característica de patrón de expresión tisular de un péptido codificado por el polinucleótido de interés. De forma alternativa, se puede cribar una biblioteca de ADNc indirectamente en busca de la expresión de los péptidos de interés haciendo que al menos un epítopo utilice anticuerpos específicos para los péptidos. Tales anticuerpos pueden derivarse policlonal o monoclonalmente y utilizarse para detectar el producto de expresión indicativo de la presencia del ADNc de interés.

Una vez que se ha obtenido el polinucleótido que contiene SIE, puede acortarse para adquirir la longitud deseada mediante, por ejemplo, digestión enzimática utilizando técnicas convencionales. El motivo CpG en el producto de oligonucleótido ODN-SIE se muta entonces para sustituir el motivo CpG por un dinucleótido "inhibidor" - identificado utilizando los métodos de esta invención-. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios concretos del ADN con una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo la mutagénesis del cebador M13 a través de RCP. Dado que la SIM no es codificadora, no hay interés por mantener un marco abierto de lectura a la hora de realizar la mutación de sustitución. Sin embargo, para el uso in vivo, el material de inicio polinucleótido, el producto intermedio oligonucleótido ODN-SIE o el producto de mutación de SIM deberían considerarse sustancialmente puros (esto es, tan libres de contaminantes presentes de forma natural y LPS como sea posible utilizando las técnicas disponibles familiares para y elegidas por una persona medianamente experta en el campo).

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Los ácidos nucleicos inmunomoduladores de la presente invención pueden contener SIMs solas o incorporadas en cis o en trans con otras regiones de ácido nucleico tales como, por ejemplo, en un autovector recombinante (plásmido, cósmido, virus o retrovirus) que puede a su vez codificar cualquier/cualesquiera autoproteína(s), autopolipéptido(s) o péptido(s) suministrables mediante un vector de expresión recombinante. En ciertas realizaciones, las SIMs se administran sin incorporarlas en un vector. De forma alternativa, en otras realizaciones, las SIMs se incorporan en un vector tal como, por ejemplo, un vector de expresión, lo que puede conseguirse utilizando técnicas convencionales conocidas para una persona medianamente experta en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, supra).

Por ejemplo, la construcción de vectores de expresión recombinantes emplea técnicas de ligación estándar. Para que el análisis confirme las secuencias correctas en los vectores construidos, pueden utilizarse las mezclas de ligación para transformar una célula huésped y seleccionar los transformados satisfactorios por la resistencia antibiótica según sea apropiado. Los vectores de los transformados se preparan, analizan mediante restricción y/o secuencian mediante, por ejemplo, el método de Messing, et al., Nucleic Acids Res., 9: 309, 1981, el método de Maxam, et al., Methods in Enzymology, 65: 499, 1980, u otros métodos adecuados que serán conocidos para aquellas personas expertas en la técnica. La separación por tamaño de los fragmentos partidos se lleva a cabo utilizando electroforesis en gel convencional tal y como se describe, por ejemplo, en Maniatis, et al., Molecular Cloning, pp. 133-134, 1982.

Las células huésped pueden transformarse con los vectores de expresión de esta invención y cultivarse en medios nutrientes convencionales tal y como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformados o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares son aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para la persona medianamente experta en la técnica.

Si se utiliza un vector recombinante como portador para los ON-SIM de la invención, se prefieren en especial los plásmidos y cósmidos debido a su falta de patogenicidad. Sin embargo, los plásmidos y cósmidos están sujetos a degradación in vivo más rápidamente que los virus y por consiguiente puede que no suministren una dosis adecuada de ON-SIM para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria o autoinmune.

En un aspecto relacionado, se proporciona un vector de ácido nucleico en el que uno o más dinucleótidos CpG de la fórmula 5'-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' ó 5'-purina-purina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' se sustituye(n) por un dinucleótido que no es CpG, produciendo de ese modo un vector en el que se reduce la actividad inmunoestimuladora relacionada con la SII. Dichos vectores son útiles, por ejemplo, en métodos para administrar ácidos nucleicos inmunomoduladores y/o para administrar un autovector que codifica una o más autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s). Por ejemplo, la citosina del dinucleótido CpG puede sustituirse con guanina, produciendo de ese modo una región de SIM que posee un motivo GpG de la fórmula 5'-purina-pirimidina-G-G-pirimidina-pirimidina-3' ó 5'-purina-purina-G-G-pirimidina-pirimidina-3'. La citosina puede ser sustituida también con cualquier otro nucleótido que no posea citosina. La sustitución puede conseguirse, por ejemplo, utilizando mutagénesis sitiodirigida. Habitualmente, los motivos CpG sustituidos son aquellos CpGs que no están ubicados en regiones de control importantes del vector (p. ej., las regiones promotoras). Además, cuando el CpG está ubicado dentro de una región codificadora de un vector de expresión, normalmente se selecciona la sustitución de no citosinas para producir una mutación silenciosa o un codón correspondiente a una sustitución conservadora del aminoácido codificado.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se proporciona un vector pVAX1 modificado en el que se mutan(n) uno o más dinucleótidos CpG de la fórmula 5'-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' sustituyendo la citosina del dinucleótido CpG con un nucleótido que no posea citosina. El vector pVAX1 es conocido en la técnica y está disponible comercialmente a través de Invitrogen (Carlsbad, California). En una realización de ejemplo, el vector pVAX1 modificado posee las siguientes sustituciones de citosina a no citosina dentro de un motivo CpG:

citosina a guanina en los nucleótidos 784, 1161, 1218 y 1966;

citosina a adenina en los nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 y 1997; y

citosina a timina en los nucleótidos 1963 y 1987;

con mutaciones adicionales de citosina a guanina en los nucleótidos 1831, 1876, 1942 y 1999. (Las designaciones de los números de los nucleótidos tal y como se han expuesto anteriormente se hacen de conformidad con el sistema de numeración para pVAX1 proporcionado por Invitrogen). (Véase el Ejemplo 3, infra).

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Propiedades funcionales de las SIMs

Existen diversos mecanismos para explicar las propiedades inmunomoduladoras de las SIMs, y entre éstos se incluyen mecanismos independientes de la estimulación inmunitaria mediada por SIE (CpG).

"Modulación de, que modula o altera una respuesta inmunitaria" tal y como se utiliza en el presente documento hace referencia a cualquier alteración de una(s) respuesta(s) inmunitaria(s) existente(s) o potencial(es) contra automoléculas, incluyendo, pero sin limitarse a, los ácidos nucleicos, lípidos, fosfolípidos, carbohidratos, autoproteína(s), autopolipéptido(s), autopéptido(s), complejos proteicos, complejos ribonucleoproteicos, o derivado(s) de los mismos que se producen como resultado de la administración de un ácido nucleico inmunomodulador. Dicha modulación incluye cualquier alteración en la presencia, capacidad o función de cualquier célula inmunitaria implicada en o capaz de verse implicada en una respuesta inmunitaria. Entre las células inmunitarias se incluyen las células B, células T, células NK, células T NK, células profesionales presentadoras de antígenos, células no profesionales presentadoras de antígenos, células inflamatorias o cualquier otra célula capaz de verse implicada o influir en una respuesta inmunitaria. La modulación incluye cualquier cambio impartido en una respuesta inmunitaria existente, una respuesta inmunitaria en desarrollo, una respuesta inmunitaria potencial o la capacidad de inducir, regular, influir en o responder a una respuesta inmunitaria. La modulación incluye cualquier alteración en la expresión y/o función de genes, proteínas y/u otras moléculas en células inmunitarias como parte de una respuesta inmunitaria.

La modulación de una respuesta inmunitaria incluye, pero sin limitarse a ello: la eliminación, supresión o secuestro de células inmunitarias; la inducción o generación de células inmunitarias que pueden modular la capacidad funcional de otras células tales como los linfocitos autoreactivos, las células presentadoras de antígenos o las células inflamatorias; la inducción de un estado indiferente en las células inmunitarias, llamado anergia,; el aumento, disminución o cambio de la actividad o función de las células inmunitarias o la capacidad para hacerlo, incluyendo, pero si limitarse a ello, la alteración del patrón de las proteínas expresadas por estas células. Entre los ejemplos se incluyen la producción y/o secreción de ciertas clases de moléculas tales como las citoquinas, las quimioquinas, los factores de crecimiento, los factores de transcripción, las quinasas, las moléculas coestimuladoras u otros receptores de superficie celular; o cualquier combinación de estos casos moduladores.

Las respuestas inmunitarias se caracterizan por células T colaboradoras y respuestas inmunitarias que producen citoquinas incluyendo IL-12 e IFN gamma, y están relacionadas con células B que producen anticuerpos de ciertos isotipos (generalmente, IgG2a en los ratones; generalmente, IgG1 e IgG3 en los seres humanos). Las respuestas inmunitarias de tipo Th1 predominan en las enfermedades autoinmunes y están relacionadas con lesiones tisulares mediadas de forma autoinmune. Por contraste, las respuestas inmunitarias Th2 se caracterizan por células T colaboradoras y respuestas inmunitarias que producen citoquinas incluyendo IL-4 e IL-10 y están relacionadas con células B que producen anticuerpos de ciertos isotipos (generalmente, IgG1 en los ratones; generalmente, IgG2 e IgG4 en los seres humanos). Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 están relacionadas con la protección contra las lesiones tisulares mediadas de forma autoinmune en la autoinmunidad de los roedores y de los seres humanos.

Los ácidos nucleicos inmunomoduladores podrían modular respuestas inmunitarias eliminando, secuestrando o desactivando las células inmunitarias que median o son capaces de mediar una respuesta inmunitaria no deseada; induciendo, generando o activando las células inmunitarias que median o son capaces de mediar una respuesta inmunitaria protectora; cambiando las propiedades físicas o funcionales de las células inmunitarias (por ejemplo suprimiendo una respuesta de tipo Th1 y/u induciendo una respuesta de tipo Th2); o una combinación de estos efectos. Entre los ejemplos de las mediciones de la modulación de una respuesta inmunitaria se incluyen, pero sin limitarse a ello, el examen de la presencia o ausencia de poblaciones de células inmunitarias (utilizando la citometría de flujo, la inmunohistoquímica, la histología, la microscopía de electrones, la reacción en cadena de polimerasa); la medición de la capacidad funcional de las células inmunitarias incluyendo la habilidad o resistencia para proliferar o dividir en respuesta a una señal (por ejemplo utilizando ensayos de proliferación de células T y análisis pepscan basados en la incorporación de 3H-timidina tras la estimulación con anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-receptor de células T, anticuerpo anti-CD28, ionoforos de calcio, PMA, células presentadoras de antígenos cargadas con un antígeno peptídico o proteico; ensayos de proliferación de células B); la medición de la habilidad para matar o provocar la lisis de otras células (como por ejemplo los ensayos con células T citotóxicas); las mediciones de las citoquinas, las quimioquinas, las moléculas de la superficie celular, los anticuerpos y otros productos de las células (mediante citometría de flujo, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western, análisis de microsecuencias proteicas, análisis de inmunoprecipitación); la medición de los marcadores bioquímicos de la activación de las células inmunitarias o vías de señalización dentro de las células inmunitarias (análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western y de inmunoprecipitación de la fosforilación de tirosina, serina o treonina, división polipeptídica y formación o disociación de complejos proteicos; análisis de secuencias proteicas; perfilado transcripcional de ADN utilizando secuencias de ADN o hibridización sustractiva); las mediciones de la muerte celular mediante apoptosis, necrosis u otros mecanismos (tinción con anexina V, ensayos TUNEL, electroforesis en gel para medir la fragmentación del ADN, histología; ensayos con caspasas fluorogénicas, análisis de inmunoelectrotransferecia de tipo Western de los sustratos de caspasa); la medición de los genes, proteínas y otras moléculas producidas por las células inmunitarias (análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern, reacción en cadena de polimerasa, microsecuencias de ADN, microsecuencias proteicas, electroforesis en gel en 2 dimensiones, análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, citometría de flujo); y la medición de resultados clínicos tales como la mejora de resultados autoinmunes, neurodegenerativos y otros resultados de las enfermedades (puntuaciones clínicas, requisitos para el uso de terapias adicionales, estado funcional, estudios de imágenes).

Otros investigadores han llevado a cabo experimentos para evaluar los mecanismos de acción de las SIIs. Esos investigadores demostraron que los motivos de SIIs neutralizadores o supresores (GpGs), bloquean la estimulación inmunitaria de SIE (CpG) (Krieg et al., PNAS, 95: 12631, 1998; Patentes estadounidenses 6.225.292 y 6.339.068). Las SIIs en esos experimentos se utilizaron para contrarrestar, inhibir, competir contra o superar los efectos de las SIEs (de tales fuentes como las bacterias, virus, parásitos y ADN administrados de forma exógena tal como en la vacunación con ADN o la terapia génica). Las SIEs y las SIIs han mostrado que se introducen en la misma célula, lo que sugiere que un mecanismo por el que las SIIs inhiben SIEs es a través de la competición directa dentro de la misma célula (Yamada et al., J. Immunology, 2002, 169: 5590).

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Métodos de administración

Los ácidos nucleicos inmunomoduladores se preparan como una composición que comprende un portador farmaceúticamente aceptable. Los portadores farmaceúticamente aceptables preferentes para el uso con el ácido nucleico inmunomodulador de la invención pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas esterilizadas. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, los aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Entre los portadores acuosos se incluyen el agua, las soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo los medios salinos y tamponados. Entre los vehículos parenterales se incluyen la solución de cloruro sódico, la dextrosa de Ringer, el cloruro de sodio y dextrosa, la solución de Ringer lactatada o los aceites fijos. Entre los vehículos intravenosos se incluyen los regeneradores de fluidos y nutrientes, los regeneradores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer) y vehículos similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelatantes y gases inertes y similares. Una composición de ácidos nucleicos inmunomoduladores puede también liofilizarse utilizando medios bien conocidos en la técnica, para una reconstitución y uso posteriores de conformidad con la invención. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores pueden mezclarse para formar una composición farmacéutica que contenga múltiples copias de una SIM individual, una combinación de diferentes SIMs, una combinación de SIMs donde cada una esté presente en la misma concentración molar relativa, una combinación de SIMs donde cada una esté presente en diferentes concentraciones molares relativas, o SIMs individuales y/o diferentes incorporadas a plásmidos vector de expresión recombinantes, polinucleótidos lineales, virus y vectores virales, bacterias, y otras composiciones vivas, inactivadas o sintéticas que contengan oligonucleótidos.

Los ácidos nucleicos inmunomoduladores de esta invención pueden formularse con sales para su uso como productos farmacéuticos. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores pueden prepararse con bases orgánicas o inorgánicas no tóxicas. Entre las sales con base inorgánica se incluyen el sodio, el potasio, el zinc, el calcio, el aluminio, el magnesio, etc. Entre las bases orgánicas no tóxicas se incluyen las sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, y similares. Dichos ácidos nucleicos inmunomoduladores pueden formularse con forma liofilizada para su reconstitución antes de su administración, tal como el agua esterilizada o una solución salina. De manera alternativa, los ácidos nucleicos inmunomoduladores pueden formularse en soluciones, suspensiones o emulsiones que implican vehículos con base acuosa o de aceite para su administración. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores pueden liofilizarse y después reconstituirse con agua esterilizada antes de su administración.

Como es conocido para las personas medianamente expertas en la técnica, existe una gran variedad de métodos para administrar ácidos nucleicos a los sujetos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunomodulador se administra como un ácido nucleico desnudo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se mezclan partículas virales (p. ej. partículas de adenovirus, véase, p. ej., Curiel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 6: 247-52, 1992, supra) con el ácido nucleico desnudo antes de administrarlo para producir una formulación que contenga partículas virales sin encapsular el ácido nucleico pero que aún así facilitará su administración. De manera alternativa, en otras realizaciones, el ácido nucleico inmunomodulador se encapsula o forma complejo con una molécula que se une al ácido nucleico tal como, por ejemplo, las substancias catiónicas (p. ej., lípidos catiónicos o DEAE-dextrano). Por ejemplo, los liposomas representan los medios efectivos para formular y administrar los oligonucleótidos y/o autopolinucleótidos. En otras realizaciones específicas, el ácido nucleico inmunomodulador se incorpora a un vector viral, partícula viral o bacteria para su administración farmacológica. Los vectores virales pueden ser competentes desde el punto de vista de la infección, atenuados (con mutaciones que reducen la capacidad para inducir la enfermedad) o deficientes desde el punto de vista de la replicación. En otras realizaciones, el ácido nucleico se conjuga con soportes sólidos incluyendo partículas de oro, soportes con base de polisacáridos u otras partículas o perlas que pueden inyectarse, inhalarse o administrarse mediante el bombardeo de partículas (administración balística).

Los métodos para administrar preparados de ácido nucleico son conocidos en la técnica. Véanse p. ej., las Patentes estadounidenses nº 5.399.346, 5.580.859 y 5.589.466. Se han desarrollado cierto número de sistemas con base viral para la transferencia a las células de mamíferos. Por ejemplo, se han descrito sistemas retrovirales (Patente estadounidense nº 5.219.740); (Miller et al., Biotechniques, 7: 980-990, 1989); (Miller, A.D., Human Gene Therapy, 1: 5-14, 1990); (Scarpa et al., Virology, 180: 849-852, 1991); (Bums et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8033-8037, 1993) y (Boris-Lawrie y Temin, Cur. Opin. Genet. Develop., 3: 102-109, 1993). También se han descrito cierto número de vectores de adenovirus, véanse, p. ej., (Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57: 267-274, 1986); (Bett et al., J. Virol., 67: 5911-5921, 1993); (Mittereder et al., Human Gene Therapy, 5: 717-729, 1994); (Seth et al., J. Virol., 68: 933-940, 1994); (Barr et al., Gene Therapy, 1: 51-58, 1994); (Berkner, K.L., BioTechniques, 6: 616-629, 1988) y (Rich et al., Human Gene Therapy, 4: 461-476, 1993). También se han desarrollado sistemas de vectores de virus adeno-asociado (VAA) para la administración de ácido nucleico. Los vectores de VAA pueden elaborarse fácilmente utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las Patentes estadounidenses nº 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales nº WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); (Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol., 8: 3988-3996, 1988); (Vincent et al., Vaccines, 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) 1990); (Carter, B.J., Current Opinion in Biotechnology, 3: 533-539, 1992); (Muzyczka, N., Current Topics in Microbiol. and Immunol., 158: 97-129, 1992); (Kotlin, R.M., Human Gene Therapy, 5: 793-801, 1994); (Shelling et al., Gene Therapy, 1: 165-169, 1994) y (Zhou et al., J. Exp. Med., 179: 1867-1875, 1994).

Las SIMs de esta invención también pueden administrarse sin un vector. Por ejemplo, la molécula puede introducirse en liposomas antes de administrarla al sujeto. La encapsulación lipídica se consigue generalmente utilizando liposomas que son capaces de unir de forma estable o atrapar y retener el ácido nucleico. Para una revisión del uso de los liposomas como portadores a la hora de administrar los ácidos nucleicos, véanse, (Hug et al., Biochim. Biophys. Acta., 1097: 1-17, 1991); (Straubinger et al., en Methods of Enzymology, Vol. 101, pp. 512-527, 1983). Por ejemplo, los lípidos que pueden utilizarse de conformidad con la invención incluyen, pero sin limitarse a ello, DOPE (dioleoil fosfatidiletanolamina), colesterol y CUDMEDA (N-(5-calostro-3-ol 3 uretanil)-N',N-dimetiletilendiamina). Como ejemplo, el ADN puede administrarse en una solución que contenga una de las siguientes formulaciones de liposomas catiónicos: Lipofectin^{TM} (LTI/BRL), Transfast^{TM} (Promega Corp), Tfx50^{TM} (Promega Corp), Tfx.10^{TM} (Promega Corp) ó Tfx20^{TM} (Promega Corp).

Se administran "cantidades terapéuticamente efectivas" de los ácidos nucleicos inmunomoduladores de conformidad con las enseñanzas de esta invención y será suficiente para tratar o prevenir la enfermedad por ejemplo mejorando o eliminando los síntomas y/o la causa de la enfermedad. Por ejemplo, las cantidades terapéuticamente efectivas están dentro de una amplia gama y son determinadas mediante ensayos clínicos y para un paciente en concreto se determinan basándose en factores conocidos por el médico medianamente experto en la técnica incluyendo la gravedad de la enfermedad, el peso del paciente, la edad y otros factores. Las cantidades terapéuticamente efectivas de los ácidos nucleicos inmunomoduladores están dentro de la gama de aproximadamente 0,001 microgramos a aproximadamente 1 gramo. Una cantidad terapéutica preferente de ácido nucleico inmunomodulador se encuentra dentro de la gama de aproximadamente 5 microgramos a aproximadamente 1000 microgramos de cada. Una cantidad terapéutica más preferente de un ácido nucleico inmunomodulador se encuentra dentro de la gama de aproximadamente 50 a 200 microgramos. La terapia con ácido nucleico inmunomodulador se administra a diario, cada dos días, dos veces a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas o una vez al mes de forma continuada. Si se administra en conjunción con terapias de polinucleótidos que codifican autoproteínas, autopolipéptidos o péptidos, entonces, el régimen terapéutico puede administrarse durante diversos periodos tales como 6-12 meses, y después cada 3-12 meses como dosis de mantenimiento. Pueden desarrollarse regímenes de tratamiento alternativos dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, el oligonucleótido y/o polinucleótido que codifica autoproteína(s), autopolipéptido(s)
o autopéptido(s) que se esté administrando y tales otros factores que el médico que haga el tratamiento ordinario considere.

En una realización, los ácidos nucleicos inmunomoduladores se administran mediante una inyección intramuscular. En otra realización, los ácidos nucleicos inmunomoduladores se administran de forma intranasal, oral, subcutánea, intradérmica, intravenosa, aplicados a través de la piel, intraocular, intraarticular, intravaginal, intrarectal, a través de las mucosas o unidos a partículas de oro administradas a o a través de la dermis (véase, p. ej., WO 97/46253). De manera alternativa, el ácido nucleico puede administrarse a las células de la piel mediante una aplicación tópica con o sin liposomas o lípidos cargados (véase, p. ej., la Patente estadounidense nº 6.087.341). Aún otra alternativa es la de administrar el ácido nucleico como un agente inhalado. En el caso de la terapia de combinación que comprende la administración de ácidos nucleicos inmunomoduladores y polinucleótidos que codifican autoproteína(s), autopolipéptido(s) o autopéptido(s), el ácido nucleico inmunomodulador y el polinucleótido pueden administrarse en el mismo sitio, o en diferentes sitios, así como al mismo tiempo, o en momentos diferentes.

Antes de administrar los ácidos nucleicos inmunomoduladores, el sitio de administración puede precondicionarse mediante el tratamiento con bupivacaína, cardiotoxina u otro agente que puede mejorar la administración de una posterior terapia con polinucleótidos. Tales regímenes precondicionantes se administran generalmente de 12 a 96 horas antes de la administración del polinucleótido terapéutico, más frecuentemente de 24 a 48 horas antes de la administración de los ácidos nucleicos inmunomoduladores terapéuticos. De manera alternativa, no se da ningún tratamiento precondicionante antes de la terapia con SIM.

Los ácidos nucleicos inmunomoduladores y/o el autovector que comprenden un polinucleótido que codifica la(s) autoproteína(s), el/los autopolipéptido(s) o autopéptido(s) pueden administrarse en combinación con otras substancias, tales como agentes farmacológicos, adyuvantes, citoquinas, autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s) y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s)
y glicoproteína(s) modificados de forma post-traslacional y terapias basadas en ADN, o en conjunción con la administración de vectores que codifican citoquinas.

En otra realización, los ácidos nucleicos inmunomoduladores se administran en combinación con otras terapias. Dichas terapias podrían incluir, por ejemplo, ácidos nucleicos inmunomoduladores administrados en combinación con automoléculas incluyendo, pero sin limitarse a ello, ADN que codifica automoléculas, por ejemplo en el caso de la terapia con polinucleótidos (véase la Publicación de la Solicitud de Patente USA 20030148983), o con autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), autocarbohidrato(s), autoglicoproteína(s)
y autoproteína(s), péptido(s), polipéptido(s) o glicoproteína(s) modificados de forma post-traslacional, o cualquier otro compuesto terapéutico utilizado para tratar enfermedades autoinmunes.

Se conseguirá una comprensión más profunda de la presente invención con la referencia de la siguiente descripción que presenta realizaciones ilustrativas.

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Ejemplo 1 Confirmación de estudios previos que muestran que la SIM inhibe la activación de linfocitos inducidos por SIE y previene la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental

Se llevaron a cabo una serie de experimentos que confirman diversos estudios previos que indicaban que una SIM puede inhibir la estimulación por secuencias que contienen SIE (CpG). Esos experimentos son los siguientes:

Se sabe que los ODN-CpG estimuladores activan las células inmunitarias derivadas del bazo incluyendo las células dendríticas, los macrófagos, las células T y las células B (véanse, Krieg et al., Nature, 374: 546-549, 1995; Yi et al., J. Immunol., 157: 5394-5402, 1996; Klinman et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA, 93: 2879-2883, 1996; Martin-Orozco et al., Int. Immunol., 11: 1111-1118, 1999; Sparwasser et al., Eur. J. Immunol., 28-2045-2054, 1998). Se evaluaron los efectos de la SIM midiendo la proliferación global de los esplenocitos naive. Elaboramos una secuencia de oligonucleótidos 22-mer que contenía una única secuencia 5'-AACGTT-3' (ODN-CpG) o una secuencia de SIM 5'-AAGGTT-3' con una espina dorsal de fosforotioato para proteger el ADN de la degradación por nucleasas. Para determinar si la adición de la SIM contrarrestaría los efectos de los ODN-CpG estimuladores; se cultivaron esplenocitos completos naive aislados con 5 \mug/ml de ODN-CpG estimuladores solo y con concentraciones cada vez mayores de SIM. Tras 48 horas, la proliferación de esplenocitos completos disminuyó a la mitad ante la adición de 1 \mug/ml de SIM, y disminuyó a un tercio con la adición de 5 \mug/ml y 10 \mug/ml de SIM (Figura 1A).

Se ha mostrado que el RPT-9 reconoce los motivos CpG de ADN bacteriano (Hemmi et al., Nature, 408: 740-745, 2000). Para determinar si un simple cambio de C a G en un par de bases alteraría este reconocimiento, se cultivaron por separado esplenocitos completos naive aislados de ratones de tipo salvaje (WT) con RPT-9 y de tipo knockout (KO) con RPT-9 con ODN-CpG, SIM y combinaciones de ambos. Como control independiente, se añadió lipopolisacárido (LPS) para mostrar que los esplenocitos KO con RPT-9 aún eran capaces de proliferar ante un estímulo mitogénico no específico. La adición de ODN-CpG estimuladores dio por resultado una fuerte respuesta proliferativa que se suprimió de forma significativa mediante la adición de SIM (Figura 1B). La combinación de LPS con ODN-CpG estimuladores incrementó la proliferación de los esplenocitos en comparación con la estimulación con LPS solo. Sin embargo, los efectos moduladores de la SIM eran aún evidentes incluso con la adición de LPS.

La ausencia del receptor RPT-9 de los esplenocitos KO con RPT-9 derogó los efectos proliferativos de los ODN-CpG en comparación con los esplenocitos WT con RPT-9. De manera similar, los esplenocitos KO con RPT-9 no respondieron a la SIM. Al añadir LPS a los esplenocitos KO con RPT-9, la SIM sola y en combinación con ODN-CpG estimuladores no influyó en la respuesta proliferativa cuando se compara con los esplenocitos WT con RPT-9. Esto implica que la SIM puede que esté impidiendo que los ODN-CpG estimuladores continúen a través de la vía de señalización de RPT-9.

El reconocimiento de ODN-CpG estimuladores mediante RPT-9 desencadena la inducción de las vías de señalización celular que culmina en la activación de NF-\kappaB (Krieg, Ann. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002). Para esclarecer el mecanismo de la SIM sobre los ODN-CpG estimuladores, se investigó el papel de la actividad de NF-\kappaB a través de la fosforilación de l\kappaB-\alpha en Serina 32. El análisis por inmunoelectrotransferencia de tipo Western de extractos de esplenocitos activados con el oligo indicado confirma la fosforilación de l\kappaB-\alpha en Serina 32 por parte de los ODN-CpG estimuladores (Figura 1C, fila 2). En consecuencia, la SIM no indujo la fosforilación de l\kappaB-\alpha en Serina 32 (Figura 1C, fila 3). Curiosamente, la combinación de ODN-CpG estimuladores y SIM dio por resultado una marcada reducción en la fosforilación de l\kappaB-\alpha en Serina 32 (Figura 1C, fila 5). Este resultado indica que un mecanismo por el que las SIMs funcionan es el de competir con los ODN-CpG estimuladores por el reconocimiento y la unión por parte de elementos de la vía de señalización de RPT-9.

Se ha mostrado que los ODN-CpG incrementan la expresión del CPH de clase II (Martin-Orozco et al., Int. Immunol., 11: 1111-1118, 1999). Para cuantificar la concentración relativa del mensaje para la molécula del CPH de clase II, se llevó a cabo un análisis de RCP cuantitativo (RCPC) en ADNc a partir de muestras de ARN purificado de cultivos de esplenocitos completos. Se normalizaron las señales en relación con la cantidad de mensaje para la \beta-actina. Se incrementó el ARNm del CPH de clase II en los esplenocitos estimuladores incubados con ODN-CpG, pero no en los esplenocitos incubados con SIM (Figura 2A). La disminución de la expresión de la superficie celular del CPH de clase II por la SIM se confirmó mediante análisis con escáner celular activado por fluorescencia (FACScan). La SIM suprimió la activación de la expresión de la superficie celular del CPH de clase II por los ODN-CpG estimuladores de una manera dosis-dependiente (Figura 2B).

Para determinar si la SIM reducía la activación de las células presentadoras de antígenos (CPA), también se analizó la expresión de la superficie celular de diversos marcadores de activación de CPA. Se incubaron esplenocitos naive durante 72 horas con las concentraciones indicadas de oligonucleótidos de control irrelevantes, estimuladores o inhibidores. El análisis con FACScan indica que la SIM suprimía la expresión de la superficie celular inducida por ODN-CpG estimuladores de CD40 (Figura 2C), CD80 (Figura 2D) y CD86 (Figura 2E) de una manera dosis-dependiente. Por contraste, se incrementó la expresión de la molécula de presentación glicolipídica, CDId (Figura 2F) mediante la SIM de una manera dosis-dependiente.

Para perfilar el efecto sobre la producción de citoquinas de las células inmunitarias por el oligonucleótido inmunomodulador, se extrajeron esplenocitos naive de animales y se incubaron durante 72 horas con las concentraciones indicadas de SIM, ODN-CpG estimuladores u oligonucleótido de control irrelevante. La SIM sola no indujo la producción de IL6 (Figura 3A) e IL12p40 (Figura 3B), pero cuando se combinó con ODN-CpG estimuladores, suprimió la producción de citoquinas de una manera dosis-dependiente.

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad animal mediada por Th1 de la esclerosis múltiple. La inflamación del sistema nervioso central inducida en la enfermedad de EAE da por resultado una parálisis incremental como resultado de la desmielinización y la infiltración inflamatoria de la materia blanca. La inducción activa de la EAE requiere la inmunización del animal con péptido o antígeno de mielina en adyuvante completo de Freund, que contiene micobacterias inactivadas por calor.

Después investigamos la administración de SIM in vivo como un método de prevención de la inducción de la EAE. Se inmunizó a ratones SJL/J de forma subcutánea contra la inducción de la enfermedad con péptido de PPL_{139-151} en ACF. Simultáneamente, se administró de forma intraperitoneal el oligonucleótido indicado resuspendido en solución salina tamponada con fosfato como una única inyección. Los ratones tratados con solamente una única inyección de SIM inhibidora mostraron una disminución de la gravedad global de la enfermedad en comparación con los ratones tratados con SSTF y los ratones tratados con ODN-CpG estimulador (Figura 4).

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Ejemplo 2 La SIM modula las células Th2 protectoras, suprime las células Th1 autoreactivas y previene la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ausencia de SIE (CpG)

Habiendo demostrado que la SIM suprimía las células T mielina-específicas naive no comprometidas, analizamos si podría tener efectos diferenciales en las células Th1 o Th2 comprometidas en ausencia y presencia de ODN-CpG. Los ODN-CpG estimuladores incrementaban la proliferación de una línea celular Th1 específica de PPL_{139-151}, mientras que la SIM suprimía su proliferación (Figura 5A). La combinación de SIM y ODN-CpG estimulador disminuía el aumento de la proliferación de células Th1 específicas de PPL_{139-151} causada por ODN-CpG solo.

Se emprendieron investigaciones similares con una línea celular Th2 específica de PPL_{139-151}. Los ODN-CpG estimuladores suprimían la proliferación de la línea celular Th2 específica de PPL_{139-151} (Figura 5B). Sorprendentemente, la SIM aumentó la proliferación de la línea celular Th2. Por consiguiente, los ODN-CpG actúan como un inhibidor de las células Th2 específicas de PPL_{139-151}, mientras que la SIM sola, esto es, en ausencia de SIE, modula las células Th2 específicas de PPL_{139-151}. En su conjunto, estos inesperados y sorprendentes resultados establecen que la SIM de esta invención inhibe las células Th1 autoinmunes y aumenta la función protectora de las células Th2, independientemente de los ODN-SIE (CpG).

Se administraron SIM a ratones SJL 14 y 7 días antes de la inducción de la EAE con PPL_{139-151} en ACF. Este protocolo introduce la SIM en el sistema inmunitario durante dos semanas en ausencia de cualquier SIE añadida. Los ratones tratados con SIM sufrieron un retraso en la aparición de la enfermedad y una disminución de la gravedad global de la enfermedad en comparación con los ratones sin tratar (Figura 6).

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Ejemplo 3 Terapia con polinucleótidos con una espina dorsal del vector plasmídico modificada con GpG

Basándonos en los resultados del oligonucleótido de SIM demostrando el beneficio de las secuencias GpG a la hora de reducir la gravedad de una enfermedad y a la hora de producir un cambio de Th2 en la población de células T autoreactivas, hemos creado un vector modificado incorporando secuencias GpG dentro de la espina dorsal del vector. Comenzamos con el vector pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, California) que es el vector plasmídico utilizado de forma predominante en nuestros experimentos de la EAE y que ha sido diseñado para satisfacer todos los requisitos reglamentarios para su uso en seres humanos. Entonces examinamos el vector en busca de los motivos CpG que se corresponden con el motivo CpG humano consenso conocido para analizar la estimulación inmunitaria, esto es, Pu-Py-C-G-Py-Py. Determinamos que en una hebra del pVAX1, existen 16 de dichos elementos CpG. Utilizando la mutagénesis sitio-dirigida modificamos 12 de esos sitios tal y como se resume en la Tabla 1. Los sitios CpG restantes tenían lugar dentro de regiones de control importantes del vector y, por consiguiente, no se modificaron. Donde fue posible, se cambió la C en el motivo CpG a una G para que se correspondiera con el motivo secuencial de las secuencias oligo GpG utilizadas en el oligonucleótido de SIM. Esto se hizo en cuatro de los 12 sitios modificados. Los otros ocho sitios se modificaron no a GpG sino de tal manera que la C dentro del motivo CpG se cambiara a o bien una A ó una T. De esta forma, se eliminó el motivo CpG inmunoestimulador potencialmente impulsor de Th1. El vector así construido se ha denominado pBHT1.

TABLA 2

4

El vector pBHT1 se examinó mediante ensayos in vitro para determinar si existe de hecho un grado reducido de inmunoestimulación en comparación con el pVAX1 no modificado. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando esplenocitos frescos completos de ratones SJL/J como una fuente de células inmunitarias. Se utilizaron esplenocitos completos porque se sabe que los oligonucleótidos CpG estimuladores activan las células inmunitarias derivadas del bazo incluyendo las células dendríticas, los macrófagos, las células T y las células B. Entre los ensayos que se llevaron a cabo estaban incluidos el ensayo de proliferación, el análisis con FACS y el ELISA para medir la producción de citoquinas. Se utilizaron oligonucleótidos CpG como un control de la activación inmunitaria y se utilizaron oligonucleótidos de SIM GpG como control de la inhibición inmunitaria.

En los ensayos de control, la proliferación se llevó a cabo incubando esplenocitos aislados con 10 \mug/ml de o bien oligo CpG u oligo de SIM GpG durante 24 horas. Además, los esplenocitos se incubaron durante 24 horas con tres concentraciones diferentes de vector vacío pVAX1 o vector vacío pBHT1 como en la Figura 7. Tal y como muestran los índices de estimulación, el vector pVAX1 tenía un grado mayor de proliferación en comparación con el vector pBHT1 en cada una de las concentraciones del vector. Aunque la magnitud de la estimulación es menor (probablemente porque la cantidad molar de las secuencias estimuladoras es mayor en una concentración dada de oligo que en el plásmido), la tendencia resultante en la estimulación guardaba correlación con la observada con los dos oligos. Esto es, que existe menos estimulación con el oligo de SIM GpG y también hay menos estimulación con el vector pBHT1.

Para determinar si el oligonucleótido de SIM GpG reducía la activación de las células presentadoras de antígenos (CPA), se analizó la expresión de la superficie celular de CD16/32 como un marcador de para la activación de CPAs. Se incubaron esplenocitos naive durante 48 horas con 10 \mug/ml de o bien oligo CpG u oligos de SIM GpG. Se recogieron las células y se midieron mediante análisis con FACScan en busca de la expresión de CD16/32. Mientras que los oligos CpG causan la activación de CD16/32, el oligo de SIM GpG inmunomodulador suprimía la expresión de la superficie celular de CD16/32 casi al nivel del de los medios solos (Figura 8A). Entonces determinamos si el vector pBHT1 modificado se comportaba de una manera similar en términos de activación de CD16/32. Los esplenocitos se incubaron durante 48 horas con 100 \mug/ml de o bien vector vacío pVAX1 o vector vacío pBHT1. De nuevo, se produjo una reducción en la activación de CD16/32 con el vector pBHT1, indicado por una reducción en la activación de las CPAs (Figura 8B).

Se sabe que los oligonucleótidos CpG causan la activación de las células inmunitarias de tal manera que se incrementa la secreción de múltiples citoquinas. Llevamos a cabo ensayos de la forma antes mencionada en los que los esplenocitos se incubaron con oligo CpG u oligo de SIM GpG durante el tiempo indicado y la secreción de diversas citoquinas se midió mediante sándwich ELISA. Además, los esplenocitos se incubaron con vector vacío pVAX1 y pBHT1 para determinar si las modificaciones en pBHT1 tenían un efecto similar en la producción de citoquinas. Tal y como se muestra en la Figura 9, el oligo CpG causa la inducción de la secreción de IL6, IL10 e IFN-\gamma a partir de esplenocitos naive. El oligo de SIM GpG, sin embargo, no induce la producción de ninguna de estas citoquinas. Cuando la producción de citoquinas inducida por el vector pVAX1 se compara con la del vector pBHT1, existe una tendencia similar en la reducción de producción de IL6, IL10 e IFN-\gamma con pBHT1. Aunque sigue existiendo una inducción algo mayor de la producción de citoquinas por pBHT1 en contraste con la SIM GpG en la que no había casi ninguna inducción de las citoquinas, el grado de inducción es mucho menor que el que existe con pVAX1. Este pequeño grado de inducción es probablemente debido a las secuencias CpG que no pudieron modificarse y que permanecen en la espina dorsal del vector. De hecho, probablemente no querríamos un vector completamente inocuo que no causara ninguna inducción inmunitaria, como tal, un vector puede que no tenga ninguna eficacia a la hora de causar que el sistema inmunitario reaccione de una manera favorable ante la vacuna con ADN.

En el modelo de la EAE se han llevado a cabo experimentos in vivo que evalúan la eficacia del enfoque terapéutico con ADN polinucleótido tolerizante utilizando un autoantígeno dentro del vector pBHT1. El ADN que codifica el autoantígeno, PPL (proteína proteolipídica) de ratón, se incorporó dentro del vector pBHT1 y se administró de forma intramuscular a ratones SJL (véase la Figura 10). El modelo utilizado en el presente documento es un modelo de tratamiento en vez de un modelo de prevención en que en los ratones primero se indujo la EAE con el péptido PPL_{139-151} en ACF (adyuvante completo de Freund), y después, varios días después de la aparición de la enfermedad (en el día 20) éstos se repartieron de forma aleatoria en diferentes grupos de tratamiento. Después se administraron de forma intramuscular cincuenta \mug de PPL de ratón codificado dentro del vector pBHT1 o cincuenta \mug de un vector de control vacío pBHT1 en tres frecuencias de dosis diferentes. Tal y como se muestra en la Figura 10, existe una reducción en la clasificación media de la enfermedad de la EAE en todos los grupos de tratamiento, más notablemente en una frecuencia de cada dos o cada cuatro semanas. Estudios previos que utilizaban terapia polinucleótida con autoantígenos con un vector que no es pBHT1 han demostrado una reducción en las tasas de recaída en este tipo de modelo de tratamiento de la EAE. Sin embargo, esos estudios previos no han demostrado una reducción de este parámetro de la gravedad de la EAE (esto es, la clasificación media de la enfermedad) en un modelo de tratamiento, tal y como se demuestra aquí con la terapia polinucleótida con autoantígenos en el vector pBHT1.

Nuestra conclusión es que el vector pBHT1 actual está ahora más optimizado para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunes mediadas por Th1 tales como la EM. Por consiguiente, los genes de autoantígenos humanos están clonados en el vector pBHT1 para su uso como terapia polinucleótida en las enfermedades humanas.

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Ejemplo 4 Tratamiento de un modelo animal de esclerosis múltiple utilizando SIM en combinación con ADN que codifica múltiples autoproteínas

Una terapia polinucleótida con ADN compuesta de ADNcs de longitud completa que codifican los cuatro componentes más importantes de la mielina, PBM, MAG, MOG y LPL trató la enfermedad recidiva en el modelo animal de la EAE cuando se administró tras la aparición inicial de la enfermedad. Además, con la adición de ADN que codifica IL-4 a la terapia polinucleótida con ADN de mielina, la eficacia del tratamiento aumenta más aún al producirse un descenso en la tasa de recaídas. Sin embargo, a pesar de la reducción en las recaídas, la gravedad global de la enfermedad es aún comparable a la del grupo de control.

Se inmunizó a ratones SJL/J hembras de forma subcutánea con 100 \mug de PPL_{139-151} en SSTF emulsionada en ACF, consistente en AIF y 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis inactivada por calor. Doce días después de la inmunización, en el momento de la aparición de la enfermedad, se inyectó a los ratones en ambos cuádriceps con un total de 0,1 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectó de forma intramuscular en ambos cuádriceps a ratones seleccionados con una mezcla de ADN que contenía 25 \mug de cada uno de los cuatro plásmidos pTARGET diferentes (Promega Corp. Wisconsin) que codifican PPL, MAG, MOG y PBM murinas de longitud completa más 50 \mug de plásmido pTARGET que codifica IL-4 murino de longitud completa en un volumen total de 0,2 ml. Se administraron inyecciones de ADN en intervalos semanales a lo largo de seis semanas. Al mismo tiempo que la vacunación con ADN inicial, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM en un volumen de 200 \mul de SSTF solo o con vacunación con ADN. La SIM se administró cada dos semanas durante seis semanas. En comparación con los ratones no tratados y los ratones tratados con terapia polinucleótida con ADN más un plásmido que codifica IL-4, los ratones tratados con SIM solo experimentaron una disminución en la gravedad global media de la enfermedad a lo largo de todo el curso de la enfermedad (Figura 11). La reducción de la gravedad global media de la enfermedad era significativamente más espectacular cuando los ratones se trataban con un cocktail de ADN más IL-4 en combinación con SIM (Figura 11).

Cincuenta y siete días tras la inducción de la enfermedad de la EAE, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron nódulos linfáticos inguinales y axilares de los ratones y se agruparon de conformidad con los grupos respectivos. Se aislaron las células y se estimularon con 10 \mug/ml en PPL_{139-151} en medios RPMI enriquecidos y SFB al 10%. Tres días después de la re-estimulación, se recogieron los sobrenadantes y se cribaron en busca de la producción de IFN-\gamma, IL-4 e IL-10 mediante sándwich ELISA. Los perfiles de las citoquinas para los ratones no tratados y los ratones tratados con SIM solo o con terapia polinucleótida con ADN más IL-4 tenían todos una inclinación hacia Th1 con un incremento de la producción de IFN-\gamma (Figura 12). El grupo tratado con terapia polinucleótida con ADN más IL-4 en combinación con SIM tenía una inclinación hacia Th2 con un incremento en la producción de IL-4 e IL-10.

Se aislaron los cerebros y médulas espinales de este experimento in vivo para realizar un análisis histológico perfundiendo en los ratones formalina tamponada al 10%, tras lo cual se extraerán el cerebro y médula espinal y se fijarán adicionalmente en formalina tamponada al 10%. Se tiñeron muestras embebidas en parafina con hematoxilina-eosina y tinción de azul Luxol rápido e impregnación de Bielschowsky. Tal y como se resume en la Tabla 2, el número total de focos inflamatorios en las meninges y parénquima y el número de focos de desmielinización se vieron disminuidos de forma significativa en el grupo tratado con SIM en comparación con el grupo de control. El número total de focos inflamatorios en las meninges y parénquima y el número de focos de desmielinización en los ratones tratados con terapia polinucleótida con ADN e IL-4 más CpG se vieron aumentados de forma significativa en comparación con el grupo de control.

Se produjo una disminución tanto en el número total de focos inflamatorios como en el número de focos de desmielinización en el grupo tratado con terapia polinucleótida con ADN e IL4. El número de focos inflamatorios y el número de focos de desmielinización se vieron disminuidos adicionalmente en el grupo tratado con polinucleótidos de ADN e IL4 más SIM.

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TABLA 3

5

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Las muestras de suero recogidas en el día cincuenta y siete de ratones tratados en la Figura 11 se analizó mediante una novedosa tecnología de microsecuencias proteicas que permite la perfilación a gran escala de la especificidad de las respuestas de autoanticuerpos de mielina entre las muestras de la enfermedad y las de control. Se llevó a cabo un análisis secuencial y se utilizó SAM para identificar y crear un análisis de grupo jerárquico para ordenar las características de los antígenos. En la Figura 13, hubo un incremento significativo en la dispersión de epítopos de autoanticuerpos de mielina mediante el tratamiento con terapia polinucleótida con ADN e IL-4 más CpG en comparación con los ratones de control y los ratones tratados con SIM solo y terapia polinucleótida con ADN e IL-4. El tratamiento con terapia polinucleótida con ADN e IL-4 más SIM incrementó adicionalmente la dispersión de epítopos de autoanticuerpos de mielina.

Este experimento in vivo se repitió con resultados similares. En la Figura 14A, en el momento máximo de la EAE aguda, los ratones fueron tratados con 50 \mug/dosis de o bien SIM o CpG cada dos semanas. A lo largo de cincuenta y siete días, hubo una disminución significativa en la gravedad global media de la enfermedad en los ratones tratados con SIM en comparación con los ratones tratados con SSTF y los ratones tratados con CpG. En la Figura 14B, en el momento máximo de la EAE aguda, los ratones fueron tratados con inyecciones semanales de terapia polinucleótida con ADN e IL-4, terapia polinucleótida con ADN e IL-4 más CpG, o terapia polinucleótida con ADN e IL-4 más SIM. A lo largo de cincuenta y siete días, la gravedad global media de la enfermedad de los ratones tratados con terapia polinucleótida con ADN e IL-4 más CpG era comparable a la de los ratones tratados con SSTF. Hubo una disminución significativa en la gravedad global media de la enfermedad en los ratones tratados con terapia polinucleótida con ADN e IL-4 en comparación con los ratones tratados con SSTF. La gravedad global media de la enfermedad se vio reducida más aún en los ratones tratados con terapia polinucleótida con ADN e IL-4 más SIM.

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Ejemplo 5 Tratamiento de la diabetes mellitus insulinodependiente utilizando SIM en combinación con ADN que codifica la autoproteína insulina

Los ratones no obesos diabéticos (NOD) desarrollan diabetes autoinmune espontánea y comparten muchas características clínicas, inmunológicas e histopatológicas con la diabetes mellitus insulinodependiente humana (DMID). La enfermedad se caracteriza por la inflamación de los islotes pancreáticos de Langerhans y la destrucción de las células \beta, lo que lleva a la hiperglicemia y la diabetes manifiesta. Tanto las células T CD4+ como las CD8+ son necesarias para que se desarrolle la enfermedad. Se ha identificado la reactividad ante diversos autoantígenos, incluyendo la insulina, IA-2 y la descarboxilasa del ácido glutámico.

La eficacia del tratamiento con SIM en combinación con ADN que codifica la autoproteína insulina se había puesto en marcha durante la insulitis invasiva pero antes de la aparición completa de la DMID. Se obtuvieron ratones hembras NOD/Lt a las 7 semanas de edad y se metieron en una habitación de acceso restringido. Los ratones se sometieron a ensayo semanal en busca de niveles elevados de glucosa en sangre (BGL) comenzando a las 10 semanas de vida y utilizando el Sistema de Monitorización de la Glucosa Sanguínea One Touch Ultra. Se inició el tratamiento cuando el BGL estaba entre 200 y 250 mg/dl. Se fueron añadiendo ratones de forma secuencial a cada grupo a medida que estaban disponibles, comenzando a la edad de 15 semanas. Se inyectó a los ratones en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectó a los ratones de forma intramuscular en ambos cuádriceps un vector pVAX1 a 50 \mug/dosis o una mezcla de ADN conteniendo 50 \mug de cada uno de los tres plásmidos pVAX1 diferentes que codifican Preproinsulina-1, Preproinsulina-2 murinas de longitud completa e IL4 en un volumen total de 0,2 ml de SSTF. Las inyecciones se pusieron en intervalos semanales durante cuatro semanas. Al mismo tiempo que la vacunación inicial con ADN, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM en un volumen de 200 \mul en SSTF solo o con vacunación con ADN. La SIM se administró en intervalos semanales durante cuatro semanas.

El porcentaje diabético se define como los ratones con un BGL constante de más de 250 mg/dl. Tras cuatro inyecciones del tratamiento, se observó la tasa de supervivencia de cada grupo (Figura 15A). Para la semana 9, la tasa de supervivencia del grupo de control era del 10%, la del grupo con solo SIM era del 20%, la del grupo con solo plásmido era del 54%, la de la combinación de polinucleótidos de ADN más IL-4 era del 45% y la de la combinación de polinucleótidos de ADN más IL4 y SIM era del 73%. Cuando se compara la edad de los ratones con respecto a los protocolos de tratamiento correspondientes, los ratones que recibieron SIM solo sufrieron una incidencia de la diabetes del 80,0% para la semana 29 (Figura 15B). Los ratones que recibieron plásmido vacío pVAX1 (Invitrogen, California) sufrieron una incidencia de la diabetes del 45,4% (p = 0,635). Los ratones tratados con una combinación de polinucleótidos de ADN que codifican autoantígenos y la citoquina IL-4, junto con secuencias inmunomoduladoras, desarrollaron una incidencia de la diabetes de solamente el 27,3% (p = 0,0075) en comparación con la incidencia de la diabetes del 90% en el grupo no tratado para la semana 29 (Figura 15B). En este experimento, se inyectaron plásmidos de ADN de forma intramuscular, mientras que se inyectaron SIMs de forma intraperitoneal, sugiriendo enérgicamente que los plásmidos de ADN (SIEs) y las SIMs se dirigían a poblaciones celulares diferentes. Además, en este estudio no se expuso a los ratones NOD a las SIEs. En su conjunto, este sorprendente e inesperado resultado demuestra que las SIMs tratan de manera efectiva una enfermedad autoinmune presente de forma natural.

Este estudio se repitió para incluir grupos de tratamiento adicionales y el curso del tratamiento se modificó a intervalos semanales durante 8 semanas. Los grupos de tratamiento fueron 1) tratados con SSTF, 2) plásmido vacío pVAX1 a 200 ug/dosis, 3) SIM a 50 ug/dosis administrada de forma intramuscular, 4) la combinación de plásmido vacío pVAX1 más SIM (de forma intramuscular), 5) la combinación de polinucleótido de ADN, 6) la combinación de polinucleótido de ADN más SIM (de forma intramuscular), 7) la combinación de polinucleótido de ADN más IL-4, 8) la combinación de polinucleótido de ADN más IL-4 más SIM (de forma intramuscular), 9) la combinación de polinucleótido de ADN más IL-4 y una inyección intraperitoneal por separado de SIM. Tal y como se indica en la Figura 16, el porcentaje de supervivencia de cada grupo fue 1) tratados con SSTF (0%), 2) plásmido vacío pVAX1 (36%), 3) SIM administrada de forma intramuscular (14%), 4) la combinación de plásmido vacío pVAX1 más SIM (47%), 5) la combinación de polinucleótido de ADN (36%), 6) la combinación de polinucleótido de ADN más SIM (25%), 7) la combinación de polinucleótido de ADN más IL-4 (31%), 8) la combinación de polinucleótido de ADN más IL-4 más SIM (38%), 9) la combinación de polinucleótido de ADN más IL-4 y una inyección intraperitoneal por separado de SIM (54%).

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Ejemplo 6 Tratamiento de la artritis colágeno-inducida utilizando SIM en combinación con ADN que codifica la autoproteína colágeno completo de tipo II e IL4

La artritis colágeno-inducida (ACI) murina es un modelo animal de la artritis reumatoide (AR). La ACI se induce inyectando cepas genéticamente susceptibles de ratón con colágeno completo de tipo II (CII) emulsionado en adyuvante completo de Freund (ACF). El CII, la principal proteína constituyente de los cartílagos en las articulaciones diartrodiales, es el sitio predominante de inflamación en la AR (Myers et al., Life Sciences, 61: 1861-1878, 1997). La artritis poliarticular severa resultante se caracteriza por la sinovitis y la erosión crónica de cartílagos y huesos que se parecen histológicamente al ARN (Courtenay et al., Nature, 283(5748): 666-668, 1980). Como en la AR, la propensión a padecer ACI en los roedores está vinculada con la expresión de moléculas específicas del complejo principal de histocompa-
tibilidad de clase II (Wooley et al., J. Exp. Med., 154: 688-700, 1981; Griffiths, Int. Rev. Immunol., 4: 1-15, 1988).

Se examinó la eficacia del tratamiento con SIM en combinación con ADN que codifica la autoproteína colágeno completo de tipo II (CII) e IL-4. Se inyectó de forma intramuscular (IM) a grupos de 20 ratones DBA/1 machos de seis semanas de vida en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectaron de forma intramuscular a los ratones en ambos cuádriceps 50 \mug/dosis de cada una de las vacunas con ADN indicadas y al mismo tiempo que la vacunación inicial con ADN, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM en un volumen de 200 \mul de SSTF. Los grupos de tratamiento fueron: 1) SSTF solo, 2) plásmido pTarget e IL-4 en pTarget, 3) plásmido pTarget e IL-4 en pTarget más SIM, 4) CII completo en pTarget e IL-4 en pTarget, 5) CII completo en pTarget e IL-4 en pTarget más SIM. El tratamiento se administró 14 y 7 días antes de la inducción de la ACI con CII emulsionado en Adyuvante Completo de Freund. Los ratones recibieron una tercera dosis de la vacuna tolerizante de ADN y/o dosis de SIM 1 semana después de la inducción de la ACI. A los ratones se les dio una dosis de refuerzo 2 semanas más tarde con CII emulsionado en Adyuvante Incompleto de Freund. Se puntuó la artritis utilizando el sistema de clasificación visual tal y como se describe en Current Protocols in Immunology (los protocolos actuales de inmunología). Los ratones tratados con ADN que codifica el colágeno completo de tipo II (CII) más ADN que codifica IL-4, con y sin SIM, dieron por resultado unas reducciones significativas en la gravedad media de la artritis si se compara con los grupos de control tratados con vector de la vacuna de ADN (pTarget) + IL-4 con o sin SIM (Figura 17A). El porcentaje global de incidencia de la enfermedad era comparable en todos los grupos (Figura 17B). La proliferación de células T ante el CII completo desnaturalizado indicaba la presencia de células T CII-reactivas en todos los grupos de tratamiento (Figura 18). El análisis de citoquinas indicó que el tratamiento con plásmidos de ADN con y sin SIM tenía una eficacia significativa a la hora de suprimir la producción de IL-6 e TNF-alfa a la vez que aumentaba la producción de IL-4 (Figura 19).

En un segundo experimento in vivo, se examinó la eficacia del tratamiento con SIM solo y en combinación con ADN que codifica la autoproteína colágeno completo de tipo II (CII). Se inyectó de forma intramuscular (IM) a grupos de 20 ratones DBA/1 machos de seis semanas de vida en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectaron de forma intramuscular a los ratones en ambos cuádriceps 50 \mug/dosis de cada una de las vacunas con ADN indicadas y al mismo tiempo que la vacunación inicial con ADN, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM en un volumen de 200 \mul de SSTF. Los grupos de tratamiento fueron: 1) SSTF solo, 2) SIM solo, y 3) CII completo en pTarget más SIM. El tratamiento se administró 14 y 7 días antes de la inducción de la ACI con CII emulsionado en Adyuvante Completo de Freund. Los ratones recibieron una tercera dosis de la vacuna tolerizante de ADN y/o dosis de SIM 1 semana después de la inducción de la ACI. Se puntuó la artritis utilizando el sistema de clasificación visual tal y como se describe en Current Protocols in Immunology (los protocolos actuales de inmunología). El tratamiento con SIM solo dio por resultado unas reducciones significativas en la gravedad media de la artritis en comparación con el grupo de control y el grupo tratado con CII completo con SIM (Figura 20A) así como una reducción en la incidencia de la enfermedad (Figura 20B).

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Ejemplo 7 La SIM bloquea los efectos estimuladores de los CpGs en las células B primarias

En las células B maduras primarias, se ha mostrado que el ADN CpG funciona como un factor coestimulador en presencia de un antígeno específico amplificando la producción de inmunoglobulina y la proliferación de células B (Krieg et al., Nature, 374: 546, 1995; Yi et al., J. Immunol., 157: 5394, 1996). Las células B primarias se aislaron de los bazos SJL/J mediante una técnica de lavado en batea de células B estándar utilizando IgG e IgM anti-ratón de cabra, anticuerpo específico de cadena ligera y pesada con gammaglobulina de cabra como proteína portadora, y se determinó una pureza >97% de células B220+ mediante análisis de escáner FACScan. Se cultivaron las células B primarias con 5 ug/ml del oligo indicado durante 72 h. Se co-cultivó LPS a 100 ng/ml. Se sometió a los pocillos a impulsos con 1 \muCi[^{3}H]TdR durante las últimas 16 h de cultivo antes de medir la radioactividad incorporada. Cada punto de datos representa la media de pocillos triplicados +/- SD. Tal y como se describe en la Figura 21, un ensayo de proliferación de células B enriquecidas confirmó que los CpGs pueden provocar una fuerte proliferación mientras que la SIM fue capaz de suprimir los efectos de los ODN-CpG sobre las células B maduras. El co-cultivo de células B con LPS y ODN-CpG parecía tener un efecto proliferativo aditivo que fue suprimido por la adición de SIM pero no del oligo de control. El análisis de citoquinas indicó que el incremento en la producción de IL-6 (Figura 22A), IFN-gamma (Figura 22B), IL-10 (Figura 22C) e IL-12(p40) (Figura 22D) por parte de ODN-CpG se vio reducido de forma efectiva mediante la adición de SIM.

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Ejemplo 8 Tratamiento del lupus sistémico eritematoso utilizando SIM solo y en combinación con ADN que codifica autoproteínas contra las macromoléculas intracelulares

Existen diversos modelos murinos de una enfermedad parecida al lupus espontánea e inducida que comparten muchas características con el lupus humano. Entre estos se incluyen el modelo híbrido espontáneo de Nueva Zelanda (híbrido NZB/NZW F1), el modelo MRL-lpr/lpr espontáneo, y el modelo Balb/c inducido por pristano. La producción de autoanticuerpos dirigidos contra macromoléculas intracelulares tales como los nucleosomas, el ADN y las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas juega un papel importante en el mecanismo de patogénesis de las lesiones tisulares y la glomerulonefritis.

Se analizó la eficacia del tratamiento con SIM solo y en combinación con ADN que codifica las autoproteínas ribonucleoproteínas nucleares pequeñas U1A o U1C en ratones hembras Balb/c. Se inyectó de forma intramuscular (IM) a grupos de 10 ratones Balb/c hembras de seis semanas de vida en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectaron de forma intramuscular a los ratones en ambos cuádriceps las vacunas con ADN indicadas; 1) plásmido pTarget (100 \mug/dosis); 2) U1A en pTarget más pTarget vacío (cada uno a 50 \mug/dosis); 3) U1C en pTarget más pTarget vacío (cada uno a 50 \mug/dosis); y 4) la combinación de U1A y U1C (cada uno a 50 \mug/dosis). Al mismo tiempo que la vacunación inicial con ADN, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM o CpG en un volumen de 200 \mul de SSTF solo o con vacunación con ADN. Las inyecciones se administraron semanalmente durante dos semanas. La inducción del LSE se hizo mediante una única inyección intraperitoneal de 0,5 ml de Pristano. Los ratones después recibieron una tercera dosis de la vacuna tolerizante de ADN y/o dosis de oligo 1 semana después de la inducción del LSE. Las inyecciones mensuales del mismo régimen de tratamiento deben continuar durante un periodo total de 9 meses. La progresión del LSE se evalúa mediante una comprobación mensual de los niveles de proteína en la orina. A la conclusión del experimento, se evalúan los daños en los tejidos renales mediante tinción histológica con hematoxilina y eosina, ácido periódico-Schiff, tricromo y tinciones de reticulina con base de plata. Se clasifican las lesiones renales para medir la gravedad de la hipercelularidad mesangial, el aumento de la matriz mesangial, la acentuación lobular y el alcance de la tinción de IgG y C3.

Se analiza la eficacia del tratamiento con SIM solo y en combinación con ADN que codifica las autoproteínas ribonucleoproteínas nucleares pequeñas U1A, U1C y U170, y las histonas nucleosomales H2B y H3 en ratones hembras MRL-MpJFAS lpr. Se inyecta de forma intramuscular (IM) a grupos de 10 ratones MRL-MpJFAS lpr hembras de seis semanas de vida en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectan de forma intramuscular a los ratones en ambos cuádriceps 50 \mug/dosis de cada una de las vacunas con ADN indicadas (pBHT1, U1A en pBHT1, U1C en pBHT1, H2B en pBHT1 y H3 en pBHT1) durante 3 semanas consecutivas. El vector pBHT1 se describe en el Ejemplo 3. Al mismo tiempo que la vacunación inicial con ADN, se administran de forma intraperitoneal 50 \mug/dosis de SIM o CpG en un volumen de 200 \mul de SSTF solo o con vacunación con ADN. Los ratones reciben dos inyecciones mensuales más de dosis de la vacuna tolerizante de ADN y/o dosis de oligo. La progresión del LSE se evalúa mediante una comprobación mensual de los niveles de proteína en la orina. A la conclusión del experimento, se evalúan los daños en los tejidos renales mediante tinción histológica con hematoxilina y eosina, ácido periódico-Schiff, tricromo y tinciones de reticulina con base de plata. Se clasifican las lesiones renales para medir la gravedad de la hipercelularidad mesangial, el aumento de la matriz mesangial, la acentuación lobular y el alcance de la tinción de IgG y C3.

Se analiza la eficacia del tratamiento con SIM solo y en combinación con ADN que codifica las autoproteínas histonas nucleosomales H2B o H3 en ratones hembras híbridos (NZB x NZW) F1. Se inyecta de forma intramuscular (IM) a grupos de 10 ratones híbridos (NZB x NZW) F1 hembras de cinco meses de vida en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectan de forma intramuscular a los ratones en ambos cuádriceps 50 \mug/dosis de cada una de las vacunas con ADN indicadas (plásmido pBHT1, H2B en pBHT1, H3 en pBHT1, y la combinación de H2B y H3) durante 3 semanas consecutivas. Al mismo tiempo que la vacunación inicial con ADN, se administran de forma intraperitoneal 50 \mug/dosis de SIM o CpG en un volumen de 200 \mul de SSTF solo o con vacunación con ADN. La progresión del LSE se evalúa mediante una comprobación mensual de los niveles de proteína en la orina. A la conclusión del experimento, se evalúan los daños en los tejidos renales mediante tinción histológica con hematoxilina y eosina, ácido periódico-Schiff, tricromo y tinciones de reticulina con base de plata. Se clasifican las lesiones renales para medir la gravedad de la hipercelularidad mesangial, el aumento de la matriz mesangial, la acentuación lobular y el alcance de la tinción de IgG y C3.

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Ejemplo 9 Tratamiento de la cirrosis biliar primaria utilizando SIM solo y en combinación con ADN que codifica las autoproteínas complejo piruvato deshidrogenasa e IL-4

La cirrosis biliar primaria (CBP) es una enfermedad colestásica crónica autoinmune del hígado mediada por células T CD4+. La colangitis autoinmune experimental (CAE) es el modelo de enfermedad animal que produce lesiones parecidas a las de la CBP en las células epiteliales biliares que revisten los conductos biliares intrahepáticos pequeños en ratones SJL sensibilizados ante el autoantígeno, complejo piruvato deshidrogenasa (CPD).

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Se analizó la eficacia del tratamiento con SIM solo y en combinación con ADN que codifica las autoproteínas dihidrolipoamida acetiltransferasa (E2) y los componentes proteicos de unión de E3 del CPD en ratones hembras SJL/J. Se inyectó de forma intramuscular (IM) a grupos de 15 ratones SJL/J hembras de ocho semanas de vida en ambos cuádriceps un total de 0,2 ml de Bupivacaína-HCL al 0,25% en SSTF. Dos días más tarde, se inyectaron de forma intramuscular a los ratones en ambos cuádriceps 50 \mug/dosis de cada una de las vacunas con ADN indicadas (plásmido pTarget, CPD-E2 en pTarget, y la combinación de CPD-E2 e IL-4) ascendiendo a tres dosis semanales. Al mismo tiempo que la vacunación inicial con ADN, se administraron de forma intraperitoneal 50 \mug de SIM o CpG en un volumen de 200 \mul de SSTF solo o con vacunación con ADN. A los ratones se les indujo con péptido de CPD-E2 GDLLAEIETD-KATI (500 \mug en 100 \mul de SSTF) emulsionado 1:1 (v/v) con ACF (conteniendo 10 mg/ml de la cepa H37RA de Mycobacterium tuberculosis) con una única inyección intraperitoneal de 200 \mul. La CAE se evalúa 30 semanas después de la sensibilización. Las secciones del hígado con tinción de hematoxilina y eosina se utilizan para la evaluación morfológica de la necroinflamación y las lesiones de los conductos hepáticos.

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Ejemplo 10 Cribado de oligonucleótidos de SIM adicional que se prevé modulan enfermedades autoinmunes

Se prevé que los oligonucleótidos de SIM adicional tendrán una eficacia similar o mejorada a la hora de alterar el curso de una enfermedad autoinmune. La secuencia de estos oligonucleótidos de SIM adicional está basada en los datos sobre eficacia obtenidos con el oligonucleótido de SIM descrito anteriormente (esto es, 5'TGACTGTGAAGGT
TAGAGATGA-3'). Los oligonucleótidos de SIM adicional que se prevé tienen una eficacia similar o mejorada siguen el patrón siguiente: 5'-TGACTGTGTGRR\alpha\betaYYAGAGATGA-3', donde R representa las purinas (A ó G), Y representa las purimidinas (C ó T), y q y \beta son dinucleótidos o bien GpG o no GpG. Estos oligonucleótidos se prevé que tienen la eficacia más sólida en los ensayos con roedores ya que el consenso se basa en lo que se ha informado como lo que resulta más activo en los sistemas con roedores. Se ofrece un listado completo de estos oligonucleótidos de SIM en la Tabla 4. En la tabla, "I" representa la inosina.

De forma similar, los oligonucleótidos de SIM adicional que se prevé tienen una eficacia similar o mejorada siguen el patrón siguiente: 5'-TGACTGTGTGRY\alpha\betaYYAGAGATGA-3' donde R representa las purinas (A ó G), Y representa las purimidinas (C ó T), y \alpha y \beta son dinucleótidos o bien GpG o no GpG. Estos oligonucleótidos se prevé que tienen la eficacia más sólida en los ensayos con seres humanos ya que el consenso se basa en lo que se ha informado como lo que resulta más activo en los sistemas con seres humanos. Se ofrece un listado completo de estos oligonucleótidos de SIM en la Tabla 5. En la tabla, "I" representa la inosina.

Todos los oligonucleótidos se sintetizan con una espina dorsal de fosfotioato en todos y cada uno de los nucleótidos para incrementar la estabilidad del oligonucleótido. Estos oligonucleótidos se criban individualmente mediante ensayos in vitro para ver los efectos sobre la activación de las células inmunitarias. Estos cribados incluyen ensayos de proliferación celular, perfiles de secreción de citoquinas y análisis de expresión de los marcadores de la superficie celular mediante FACS. Los oligonucleótidos de SIM candidatos que muestran actividad inmunoinhibidora se someten a ensayo después utilizando ensayos in vivo para ver la inmunomodulación. Estos ensayos in vivo incluyen el análisis de las células inmunitarias mediante los parámetros de activación anteriores tras la administración del oligonucleótido de SIM al animal, así como los modelos de enfermedad autoinmune (p. ej., EAE, NOD, LSE y ACI).

Tanto en la Tabla 4 como en la Tabla 5, se ofrecen ejemplos de secuencias flanqueadoras tanto 5' como 3' alrededor del hexámero central (esto es, RR\alpha\betaYY ó RY\alpha\betaYY). Se crean secuencias flanqueadoras adicionales que rodean este hexámero central sustituyendo las secuencias flanqueadoras por cualquier secuencia nucleótida de cualquier longitud. Esto viene representado en las siguientes secuencias:

5'-NNNNNNNNNNRY\alpha\betaYYNNNNNNNNNN-3' y

5'-NNNNNNNNNNRR\alpha\betaYYNNNNNNNNNN-3',

donde N representa cualquier nucleótido. Entre los ejemplos específicos se incluyen, pero sin limitarse a ello, los siguientes oligonucleótidos:

6

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TABLA 4

7

TABLA 4 (continuación)

8

TABLA 4 (continuación)

9

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TABLA 5

10

TABLA 5 (continuación)

11

TABLA 5 (continuación)

12

Los ejemplos anteriores son realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente a efectos ilustrativos, y no tienen la intención de limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Otras variantes de la invención serán muy evidentes para aquellas personas medianamente expertas en la técnica y están englobadas en las reivindicaciones adjuntas.

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<110> Bayhill Therapeutics, Inc.

\hskip1cm

El Consejo de Administración de la Universidad Leland Stanford Junior

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<120> Métodos y composiciones de ácido nucleico inmunomodulador para prevenir y tratar enfermedades

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<130> AHB/FP6303689

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<140> EP 03789883.0

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<141> 21-11-2003

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<150> PCT/US2003/037157

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<151> 21-11-2003

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<150> US 60/428,643

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<151> 21-11-2003

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<160> 296

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<170> Version PatentIn 3.3

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<210> 1

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 1

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gtggtt

\hfill

6

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<210> 2

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 2

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atggtt

\hfill

6

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<210> 3

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 3

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gcggtt

\hfill

6

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<210> 4

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 4

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acggtt

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6

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<210> 5

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 5

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gtggct

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6

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<210> 6

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 6

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atggct

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6

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<210> 7

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 7

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gcggct

\hfill

6

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<210> 8

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 8

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acggct

\hfill

6

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<210> 9

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 9

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gtggtc

\hfill

6

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<210> 10

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 10

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atggtc

\hfill

6

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<210> 11

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 11

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gcggtc

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6

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<210> 12

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 12

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acggtc

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6

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<210> 13

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 13

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gtgctt

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6

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<210> 14

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 14

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atgctt

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6

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<210> 15

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 15

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gcgctt

\hfill

6

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<210> 16

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 16

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acgctt

\hfill

6

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 17

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\hfill

6

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<210> 18

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 18

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atgcct

\hfill

6

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<210> 19

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 20

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acgcct

\hfill

6

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<210> 21

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 21

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gtgctc

\hfill

6

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<210> 22

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 22

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atgctc

\hfill

6

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<210> 23

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 23

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctc

\hfill

6

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<210> 24

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgctc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggtt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agggtt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggtt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agggct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggtc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agggtc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggtc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggctt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggctt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagctt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagcct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcct

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggctc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggctc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagctc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgtt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggtt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> antígeno peptídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ggttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nn es GpG o no GpG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgtg rrnnyyagag atga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nn es GpG o no GpG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgtg rynnyyagag atga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es cualquier nucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nn es GpG o no GpG

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nnnnnnnnnn rynnyynnnn nnnnnn

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es cualquier nucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nn es GpG o no GpG

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nnnnnnnnnn rrnnyynnnn nnnnnn

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggggggggg aaggttgggg gggggg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggggggggg atggttgggg gggggg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggggggggg acggttgggg gggggg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggggggggg aagcttgggg gggggg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggggggggg atgcttgggg gggggg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggggggggg acgcttgggg gggggg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccccccccc aaggttcccc cccccc

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccccccccc atggttcccc cccccc

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

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cccccccccc acggttcccc cccccc

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 26

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cccccccccc aagcttcccc cccccc

\hfill

26

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<211> 26

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<212> ADN

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<400> 67

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\vskip0.400000\baselineskip

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cccccccccc atgcttcccc cccccc

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

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<211> 26

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<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

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cccccccccc acgcttcccc cccccc

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

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\hfill

22

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<211> 22

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<212> ADN

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<400> 70

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa gctcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 71

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa gcctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa gcccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag gcttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag gctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag gcctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag gcccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga gcttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga gctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga gcctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga gcccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg gcttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg gctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg gcctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg gcccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ggttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ggtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ggctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ggccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ggttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ggtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ggctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ggccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ggttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ggtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ggctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ggccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ggttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ggtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ggctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ggccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa agttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa agtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa agctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

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<211> 22

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<212> ADN

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<400> 104

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa agccagagat ga

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22

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<400> 105

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hfill

22

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<211> 22

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\hfill

22

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<212> ADN

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<400> 107

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag agctagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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<400> 108

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag agccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 109

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga agttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<400> 110

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga agtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<400> 111

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tgactgtgga agctagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga agccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg agttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg agtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg agctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg agccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ngttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ngtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ngctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ngccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ngttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ngtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ngctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ngccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ngttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ngtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ngctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ngccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ngttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ngtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ngctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ngccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ncttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa nctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ncctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ncccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ncttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag nctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ncctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag ncccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ncttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga nctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ncctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga ncccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ncttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg nctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ncctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg ncccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa tgttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa tgtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa tgctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa tgccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag tgttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag tgtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag tgctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag tgccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga tgttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga tgtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 159

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22

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tgactgtgga tgccagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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22

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<211> 22

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<212> ADN

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<400> 162

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tgactgtggg tgtcagagat ga

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22

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22

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tgactgtggg tgccagagat ga

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22

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22

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22

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22

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tgactgtgaa taccagagat ga

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22

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22

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\hfill

22

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<400> 171

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\hskip-.1em\dddseqskip

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\hfill

22

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 172

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgag taccagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga tattagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<400> 174

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga tatcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<400> 175

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga tactagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<400> 176

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgga taccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg tattagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<400> 178

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg tatcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg tactagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggg taccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa cgttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgaa ccttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat gcttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat gctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat gcctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat gcccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac gcttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

<212 > ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac gctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac gcctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac gcccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt gcttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt gctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt gcctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt gcccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc gcttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc gctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc gcctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc gcccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ggttagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ggtcagagat ga

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22

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tgactgtgat ggctagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ggccagagat ga

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22

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ggttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<400> 204

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ggtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ggctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ggccagagat ga

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22

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<400> 207

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ggttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<400> 208

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ggtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 209

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ggctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 210

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tgactgtggt ggccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 211

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ggttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 212

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ggtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ggctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ggccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat agttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat agtcagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat agctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat agccagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac agttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac agtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac agctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac agccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt agttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt agtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt agctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt agccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc agttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc agtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc agctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc agccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ngttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ngtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ngctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ngccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ngttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ngtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ngctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ngccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 239

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ngttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<213> oligonucleótido

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ngtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ngctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ngccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ngttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ngtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ngctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ngccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ncttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11).. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat nctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ncctagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat ncccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ncttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac nctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ncctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac ncccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ncttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt nctcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ncctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt ncccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ncttagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc nctcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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tgactgtggc ncctagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> varios_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc ncccagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat tgttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat tgtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat tgctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat tgccagagat ga

\hfill

22

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac tgttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac tgtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac tgctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac tgccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt tgttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt tgtcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt tgctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt tgccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc tgttagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc tgtcagagat ga

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc tgctagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggc tgccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat tattagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat tatcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat tactagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgat taccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac tattagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac tatcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac tactagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtgac taccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt tattagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt tatcagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt tactagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgtggt taccagagat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 291

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tgactgtggc tattagagat ga

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22

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<210> 292

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 292

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tgactgtggc tatcagagat ga

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22

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<210> 293

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 293

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tgactgtggc tactagagat ga

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22

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<210> 294

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 294

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tgactgtggc taccagagat ga

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22

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<210> 295

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 295

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tgactgtgat cgttagagat ga

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22

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<210> 296

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido

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<400> 296

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tgactgtgac cgttagagat ga

\hfill

22

Claims

1. Un método para elaborar un vector plasmídico, método que consiste en modificar un vector que contiene un motivo CpG de la fórmula 5'-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' para sustituir una citosina por una no citosina dentro del dinucleótido CpG, en el que el vector además está compuesto por un polinucleótido que codifica una proteína mielina o una proteína insulina.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la sustitución de una citosina por una no citosina es de citosina por guanina.

3. El método de la reivindicación 1, en el que se realizan una multitud de sustituciones de una citosina por una no citosina.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el vector que se modifica es el vector pVAX1^{TM}.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el vector pVAX^{TM} se modifica para comprender las siguientes sustituciones de una citosina por una no citosina:

C a G en los nucleótidos 784, 1161, 1218 y 1966;

C a A en los nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 y 1997; y

C a T en los nucleótidos 1963 y 1987, y

C a G en los nucleótidos 1831, 1876, 1942 y 1999.

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6. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el vector plasmídico es para utilizarlo en el tratamiento de la diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) y en el que el mencionado polinucleótido codifica una proteína insulina.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la proteína insulina se selecciona de entre la insulina, la proinsulina o la preproinsulina.

8. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el vector plasmídico es para utilizarlo en el tratamiento de la esclerosis múltiple y en el que el mencionado polinucleótido codifica una proteína mielina.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la proteína mielina es una proteína básica de mielina.

10. Un vector pVAX1^{TM} modificado que está compuesto por los siguientes nucleótidos en la espina dorsal del vector:

G en los nucleótidos 784, 1161, 1218 y 1966;

A en los nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 y 1997; y

T en los nucleótidos 1963 y 1987, y

G en los nucleótidos 1831, 1876, 1942 y 1999.

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11. El vector de la reivindicación 10 que además está compuesto por un polinucleótido que codifica una proteína mielina o una proteína insulina.

12. El vector de la reivindicación 11, en el que la proteína mielina es una proteína básica de mielina
(PBM).

13. El vector de la reivindicación 11, en el que la proteína insulina es la insulina, la proinsulina o la preproinsu-
lina.

14. Una composición farmacéutica que está compuesta por el vector de cualesquiera de las reivindicaciones 10 a la 13 y un portador farmaceúticamente aceptable.

15. El uso de una composición que comprende:

a): un vector plasmídico que está compuesto por un ácido nucleico inmunomodulador que consta de una región hexamérica de la fórmula 5'-purina-pirimidina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' en la que X e Y son cualesquiera nucleótidos sintéticos o presentes de forma natural con la excepción de que X e Y no pueden ser citosina-guanina, y una región polinucleótida que codifica una proteína mielina o una proteína insulina; y

b): un portador farmaceúticamente aceptable;

: en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune seleccionada de entre la esclerosis múltiple y la diabetes mellitus insulinodependiente.

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16. Una composición que comprende:

b): un portador farmaceúticamente aceptable;

: para su uso en un método para tratar una enfermedad autoinmune seleccionada de entre la esclerosis múltiple y la diabetes mellitus insulinodependiente.

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17. El uso de la reivindicación 15 o la composición de la reivindicación 16 donde el vector plasmídico es un vector pVAX1^{TM} modificado.

18. El uso o la composición de la reivindicación 17 donde el vector pVAX1^{TM} modificado está compuesto por los siguientes nucleótidos en la espina dorsal del vector:

G en los nucleótidos 784, 1161, 1218 y 1966;

A en los nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 y 1997; y

T en los nucleótidos 1963 y 1987, y

G en los nucleótidos 1831, 1876, 1942 y 1999.

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19. El uso de la reivindicación 15 o la composición de la reivindicación 16 donde la enfermedad autoinmune es la diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) y la autoproteína es una proteína insulina.

20. El uso o la composición de la reivindicación 19 donde la proteína insulina se selecciona de entre la insulina, la proinsulina y la preproinsulina.

21. El uso de la reivindicación 15 o la composición de la reivindicación 16 donde la enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple y la autoproteína es una proteína mielina.

22. El uso o la composición de la reivindicación 21 donde la proteína mielina es una proteína básica de mielina.

23. El uso de la reivindicación 15 o la composición de la reivindicación 16 donde X e Y son ambos guanina.