CN100546657C - 预防和治疗疾病的方法及免疫调节核酸组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗或预防疾病的方法和组合物，该方法包括给予含有一个或多个免疫调节序列(IMS)的免疫调节核酸。本发明还涉及鉴定用于预防或治疗疾病、特别是自身免疫性疾病或炎性疾病的免疫调节序列的手段和方法。本发明还涉及通过单独或者联合编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸给予免疫调节核酸来治疗或预防疾病。本发明还涉及在受试者体内治疗与存在于受试者体内并处于非生理状态的一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽相关的疾病的方法和组合物。

Description

预防和治疗疾病的方法及免疫调节核酸组合物
相关申请的交叉参考
根据35 USC 119(e)，本申请要求2002年11月21日提交的第60/428,643号美国临时专利申请的优先权，，本文已将其完整叙述纳入作为参考。
发明背景
1.发明领域
本发明涉及治疗或预防疾病的方法和组合物，该方法包括给予免疫调节序列。本发明还涉及鉴定用于预防或治疗疾病、特别是自身免疫性疾病或炎性疾病的免疫调节序列的手段和方法。本发明还涉及通过单独给予免疫调节序列、或者联合编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的核酸来治疗和预防疾病。本发明还涉及通过联合给予自身免疫调节序列和自身分子，如自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身多糖、自身糖蛋白以及经翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白来治疗或预防疾病。本发明还涉及通过联合给予免疫调节序列和一种或多种其他免疫调节药物来治疗或预防疾病。
本发明还涉及治疗受试者疾病的方法和组合物，该疾病与受试者体内的参与非生理状态的一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽相关。本发明还涉及预防受试者疾病的方法和组合物，该疾病与受试者体内的参与非生理状态的一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽相关。本发明还涉及联合治疗的方法，这种联合治疗包括免疫调节序列和参与非生理状态的与疾病相关的自身蛋白、自身多肽或自身肽的编码核酸。本发明还涉及调节免疫反应的方法，其中该免疫反应是针对存在于动物体内的、与疾病相关的、参与非生理状态的自身分子的。本发明特别提供了治疗或预防自身免疫性疾病的方法和组合物，这些自身免疫性疾病与处于非生理状态的动物体内的一种或多种自身分子有关，如多发性硬化症(MS)、类风湿关节炎(RA)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫性色素层炎(AU)、原发性胆汁性肝硬变(PBC)、重症肌无力(MG)、Sjogren综合征、寻常性天疱疮(PV)、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)和Grave病。本发明还特别涉及与处于非生理状态的动物体内的一种或多种自身分子相关的其他疾病，如骨关节炎、脊索损伤、消化性溃疡、痛风、偏头痛、高脂血症和冠状动脉疾病。
2.发明背景
自身免疫性疾病
自身免疫性疾病是指由错误攻击肌体的健康细胞和/或组织的适应性免疫引起的任何疾病。自身免疫性疾病在美国人群中的患病率为3％，其他工业化国家的人群患病率与此相似(Jacobson等，Clin Immunol Immunopathol，84，223-43，1997)。自身免疫性疾病的特征是T淋巴细胞和B淋巴细胞异常地攻击自身分子，这些自身分子包括而不限于自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白及其衍生物，从而引起肌体内器官、组织或细胞的损伤(如胰腺、脑、胸腺或胃肠道)，出现疾病的临床表现(Marrack等，Nat Med，7，899-905，2001)。自身免疫性疾病包括影响特定组织的疾病，也包括影响多种组织的疾病。对于某些疾病，这可能部分取决于自身免疫应答是涉及属于特定组织的自身分子抗原还是广泛分布在机体内的自身分子抗原。组织特异性自身免疫反应的特征是免疫反应针对的是单一组织或某一类型的细胞。但是，某些针对广泛存在的自身抗原的自身免疫性疾病也可能只影响特定的组织。例如，多肌炎中自身免疫反应针对的是普遍存在的蛋白组氨酰-tRNA合成酶，但是其临床表现主要是肌肉的自身免疫性损伤。
免疫系统通过一种非常复杂的机制产生反应来保护哺乳动物免受外源致病原的攻击，同时又能避免出现针对自身抗原的免疫反应。除了决定是否产生反应(抗原特异性)以外，免疫系统针对不同的致病原还可以选择相应的效应子功能进行处理(效应子特异性)。介导和调节这些效应子功能的一种关键细胞是CD4+T细胞。另外，可以确定的是CD4+T分泌特异性的细胞因子是T细胞发挥功能的一个主要机制。因此，确定CD4+T分泌的细胞因子类型以及其分泌如何调控对于理解免疫反应是如何被调节的来说是极端重要的。
最早关于鼠长期CD4+T细胞系分泌细胞因子的特征的研究发表于10多年以前(Mosmann等，J.Immunol.，136：2348-2357，1986)。这些研究的结果表明CD4+T有两类，T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)，分别产生不同细胞因子。Th1细胞选择性地产生白细胞介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)和淋巴毒素(LT)，而Th2细胞选择性地产生IL-4、IL-5、IL-6、和IL-13(Cherwinski 等，J.Exp.Med.，169：1229-1244，1987)。后来从Th2克隆中相继分离出了IL-9和IL-10(Van Snick等，J.Exp.Med.，169：363-368，1989)(Fiorentino 等，J.Exp.Med.，170：2081-2095，1989)。最后发现Th1和Th2细胞都能分泌IL-3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
自身免疫性疾病包括下表中所列的影响肌体内多种不同器官和组织的许多疾病(见Paul，W.E.(1999)Fundamental Immunology，第四版，Lippincott-Raven，NewYork.)。
目前所用的治疗人自身免疫性疾病的药物包括糖皮质激素、细胞毒药物以及最近发展起来的生物治疗药物。总体来说，对人系统性自身免疫性疾病的治疗主要是经验性的，其效果也不能令人满意。在大多数情况下都是用广谱的免疫抑制药物如皮质类固醇来治疗各种严重的自身免疫性疾病和炎性疾病。除了皮质类固醇以外，其他免疫抑制药物也可用于治疗系统性自身免疫性疾病。环磷酰胺是一种烷化剂，可引起T淋巴细胞和B淋巴细胞的重度缺失和细胞介导的免疫反应的缺陷。环孢菌素、他克莫司和霉酚酸吗啉乙酯是具有特异性T淋巴细胞抑制活性的天然产物，已被用于治疗SLE、RA，在某些情况下也可用于治疗脉管炎和肌炎。这些药物具有很大的肾毒性。氨甲蝶呤也可作为“二线药物”治疗RA，用于抑制疾病的进展。也可用于治疗多肌炎和其他结缔组织病。其他曾经试验过的措施包括利用单克隆抗体阻断细胞因子的作用或耗竭淋巴细胞(Fox，D.A.Am.J.Med.，99：82-88，1995)。治疗MS的药物还包括干扰素γ和共聚物1，可使疾病的复发率降低20-30％，但是对疾病的进展只有中等程度的影响。其他用于治疗MS的免疫抑制药物包括甲基强的松龙、其他类固醇、氨甲蝶呤、克拉屈滨和环磷酰胺。这些免疫抑制药物在治疗MS时效果很弱。目前治疗RA所用的药物对免疫功能的抑制或调节是非特异性的，如氨甲蝶呤、水杨酸偶氮磺胺吡啶、羟氯喹、来氟米特、强的松，以及最近开发出的TNFα拮抗剂依那西普和英夫利昔单抗(Moreland等，J Rheumatol，28，1431-52，2001)。依那西普和英夫利昔单抗可全面阻断TNFα，使受试者对败血症引起的死亡、慢性分支杆菌感染的恶化以及脱髓鞘疾病的进展更加敏感。
对于器官特异性自身免疫来说，已经试验了许多不同的治疗方法。全身注射可溶性的蛋白抗原来抑制随后出现的对该抗原的免疫反应就是其中一种。这种方法包括给予实验性自身免疫性脑髓炎(EAE)动物和多发性硬化症病人髓鞘碱蛋白、其优势表位和髓鞘蛋白的混合物(Brocke 等，Nature，379，343-6，1996)；(Critchfield等，Science，263，1139-43，1994)；Weiner 等，Annu Rev Immunol，12，809-37，(1994)；给予胶原诱导的关节炎动物模型和类风湿关节炎病人II型胶原或胶原蛋白的混合物(Gumanovskaya 等，Immunology，97，466-73，1999)；(McKown 等，Arthritis Rheum，42，1204-8，1999)，(Trentham 等，Science，261，1727-30，1993)；给予自身免疫性糖尿病动物和人胰岛索(Pozzilli和Gisella Cavallo，Diabetes Metab Res Rev，16，306-7，2000)；以及给予自身免疫性色素层炎动物和人S抗原(Nussenblatt等，Am J Ophthalmol，123，583-92，1997)。利用这种方法治疗的一个问题是通过系统注射抗原会诱导T细胞出现无反应。另一种方法是试图设计出合理的治疗措施来系统注射肽抗原，其依据是T细胞受体与结合到主要相容性复合物(MHC)分子上的肽之间的特异性相互作用。一项利用肽方法在糖尿病动物模型上进行试验的结果表明动物体内产生出了该肽的抗体(Hurtenbach U.等，JExp.Med，177：1499，1993)。另一种方法是TCR肽免疫，见(Vandenbark AA 等，Nature，341：541，1989)。还有一种方法是口服肽或蛋白抗原来诱导耐受，见(Weiner HL，Immmunol Today，18：335，1997)。
通过单独或联合佐剂给予蛋白、多肽或肽可改变针对致病原或肿瘤的免疫反应。例如，含重组乙肝病毒表面抗原，一种非自身抗原的乙肝病毒疫苗与作为佐剂的氢氧化铝一起可制成制剂。这种疫苗可诱导出抗乙肝病毒表面抗原的免疫反应，从而避免被感染。另外一种方法是给予减毒的、复制缺陷型和/或非致病性病毒或细菌，其中都含有非自身抗原，可以激发宿主产生抗致病原的保护性免疫反应。例如，口服脊髓灰质炎疫苗就是由减毒活病毒-一种非自身抗原组成的疫苗，可感染细胞并在预防接种的个体体内诱导出有效的抗脊髓灰质炎病毒-一种外源的或非自身抗原的免疫反应，而不会导致出现临床症状。然而，含灭活的或“被杀死的”病毒的脊髓灰质炎灭活疫苗无法感染或复制，即使进行皮下注射也不能诱导出抗脊髓灰质炎的保护性免疫。
免疫反应激发和放大的机制
与“非自身分子”相关的炎性疾病：微生物包括支原体、病毒、细菌、寄生虫和分支杆菌感染可导致靶器官的炎症，在某些情况下甚至会引起全身性的炎症反应。比较典型的例子有细菌脓毒性关节炎、莱姆关节炎、感染性色素层炎和感染性休克。作为先天性免疫系统的一部分，炎症介质如凝血级联反应的组分、缓激肽和补体被活化，引起炎症反应，导致患病。感染性疾病所发生的免疫反应是针对微生物上的非自身分子的，包括蛋白、脂质、多糖和核酸。含某种被称为″CpG″基序的细菌DNA在动物模型中可激发炎症反应，这种基序在下文中有详细定义。例如，细菌DNA或CpG基序都是非自身分子，它们感染滑膜关节可诱导出多种类似于脓毒性关节炎的炎症信号和症状。
与“自身分子”相关的炎性疾病：许多人类疾病都与急性或慢性炎症有关，但是其感染源未知。在这些疾病中，免疫系统是活化的，导致受影响的组织出现炎症，白细胞和淋巴细胞异常浸润，但是又好像与感染无关。这类疾病包括骨关节炎、冠状动脉疾病、阿耳茨海默病、某些类型的皮肤炎、胃肠炎和肺炎。其中所发生的免疫反应主要是先天性免疫反应而不是适应性免疫反应。
与“自身分子”相关的自身免疫性疾病：许多自身免疫性疾病已被报道，其中包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、糖尿病、牛皮癣等。与上述和自身分子相关的炎性疾病一样，其中的免疫系统也是活化的，导致受影响的组织出现炎症，白细胞和淋巴细胞异常浸润，但是又好像与感染无关。但是也有某些方面与自身分子相关的炎性疾病不同，自身免疫性疾病存在宿主自身分子特异性的自身抗体和/或T细胞。其中宿主T和B淋巴细胞如何选择性地靶向到这些自身分子的机制还不清楚。某些研究者认为自身免疫性疾病是由于微生物致病原的感染而激发或恶化的。用微生物CpG序列刺激可增加动物模型对自身免疫性疾病如EAE(Segal等，J.Immunology，158：5087，1997，)和SLE(Gilkeson 等，J.immunology，142：1482，1989)的敏感性；但是，很少有证据能够支持CpG序列或微生物产物本身就可以在其他健康动物体内激发出自身免疫性疾病的假说，虽然这些序列或产物可以诱导出炎性疾病。例如，几个利用既知菌系统(即动物在无微生物的环境中饲养)进行的重要试验都证明动物即使不接触天然微生物或微生物CpG也会发生自身免疫性疾病。这样的例子有强直性脊柱炎无菌转基因啮齿类动物模型的自身免疫性皮肤和生殖器疾病的发生(Taurog，JExp Med，180：2359，1994)以及2个不同SLE模型的狼疮的发生(Maldonadoi 等，JImmunol，162：6322，1999；Unni 等，J Rheum，2：35，1975)。另外还报道了一种SLE可诱导模型，其中任何品系的小鼠单次注射烃油、异十八烷就可以诱导出SLE，其特征是产生特异性的自身抗体和免疫复合物介导的肾病。总之，这些试验说明自发的和可诱导的自身免疫性疾病不接触微生物DNA和CpG就可以发生。
免疫刺激序列(ISS)：先天性免疫系统被认为是抵抗微生物和致病原的第一道防线。一种最强的先天性免疫系统刺激因子是微生物DNA，其中包含免疫刺激序列(ISS)。细菌DNA的特异性免疫刺激序列活化先天性免疫需要一种由5’-嘌呤-嘌呤-胞嘧啶-鸟嘌呤-嘧啶-嘧啶-3’组成的非甲基化的核心六聚体基序来刺激小鼠，或者一种由5’-嘌呤-嘧啶-胞嘧啶-鸟嘌呤-嘧啶-嘧啶-3’组成的非甲基化的核心六聚体基序来刺激人(Krieg 等，Annu Rev.Immunol，20：709-760，2002)。在免疫刺激序列内含有这种被称为“CpG”序列的二核苷酸基序的细菌DNA和合成寡核苷酸(ODN)可刺激B细胞增殖和分泌IL-6、IL-10和免疫球蛋白(Krieg 等，Nature，374：546-549，1995；Yi 等，J.Immunol，157：5394-5402，1996)。ISS DNA还可以直接活化树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞，使其分泌Th1样细胞因子如TNF-α、IL6和IL12，上调MHC和共刺激分子的表达(Klinman等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，93：2879-2883，1996；Martin-Orozco 等，Jnt.Immunol，11：1111-1118，1999；Sparwasser 等，Eur.J.Immunol，28：2045-2054，1998)。在小鼠体内，Toll样受体-9(TLR9)被认为是可识别CpG基序的关键受体。
对于脊椎动物DNA来说，CpG二核苷酸出现的频率被抑制到预测值的约1/4，CpG二核苷酸内的C在约80％的时间内是被甲基化的。而细菌DNA和合成的ODN一样，CpG二核苷酸内的C基本是非甲基化的。因此细菌DNA和脊椎动物DNA在结构上是有所不同的，其未甲基化CpG基序的含量增加超过20倍。很多试验已经证明非甲基化的CpG基序可作为细菌DNA的一种分子模式活化免疫细胞(Krieg 等，Annu.Rev.Immunol，20：709-760，2002)。
CpG DNA被认为是一种高效佐剂，能够诱导抗自身抗原如鸡蛋溶菌酶和卵清蛋白的强抗体反应和Th1样T细胞反应(Chu 等，J.Exp.Med.，186：1623-1631，1997；Lipford 等，Eur.J.Immunol，21：23AQ-23AA，1997)。目前，CpG DNA和CpG ODN已作为治疗性疫苗被用于各种感染性疾病、肿瘤、变态反应性疾病和自身免疫性疾病动物模型中(Krieg 等，Annu.Rev.Immunol，20：709-760，2002)。CpG可成功地用作疫苗主要是因为它可以有效地诱导强的Th1样反应，在某些情况下还可以将Th2反应转变为Th1反应，如在变态反应性哮喘模型中(Kline 等，J.Immunol，160：2555-2559，1998；Broide 等，J.Immunol，161：7054-7062，1998)。
通过CpG DNA活化先天性免疫反应用于治疗的目的已经受到了广泛的关注。通过CpG DNA的诱导活化非抗原特异性的先天性免疫细胞足以保护小鼠免受细菌的感染，甚至可以治疗细胞内已有的致病原感染(Agrawal等，Trends Mol Med.，8：114-121，2002)。CpG DNA还可以诱导对肿瘤的先天性免疫耐受，抑制小鼠体内已有的肿瘤(Dow等，J.Immunol，163：1552-1561，1999；Carpenter 等，Cancer Res.，59：5429-5432，1999；Smith et al，J.Natl Cancer Inst.，90：1146-1154，1998)。CpG DNA的Th1佐剂效应甚至可以消除已经存在的Th2免疫反应；CpG DNA已被作为佐剂用于变态反应疫苗中，在已经存在Th2反应的情况下可诱导出针对抗原的Th1反应，使吸入变态反应原后出现的反应症状减轻(Van Uden 等，J.Allergy Clin.Immunol，104：902-910，1999)。
免疫抑制序列(IIS)：免疫刺激序列寡聚脱氧核苷酸(ISS-ODN)的抑制剂已被用于抑制重组表达载体内ISS-OND的免疫刺激活性，特别是在基因治疗中，这些抑制剂可作为抗炎症因子减轻针对细菌和病毒ISS-ODN的宿主免疫反应，作为自身免疫调节因子与自身抗原和自身抗体一起抑制ISS-OND刺激的Th1产生IL-12，作为佐剂用于刺激抗细胞外抗原的Th2免疫反应，通常可以将宿主的免疫反应从Th1转变成Th2。见美国专利No.6,255,292。
Yamada等，J.Immunol，169；5590-5594，2002利用各种体外免疫活化细胞系统评价了IIS寡聚脱氧核苷酸在CpG诱导的免疫刺激中的作用，他们发现IIS寡聚脱氧核苷酸所产生的抑制作用超过了寡聚脱氧核苷酸所产生的刺激作用，对于CpG诱导的免疫反应来说是特异性的；大多数抑制性的寡核苷酸序列都含有聚鸟苷酸或富含G-C序列，但是未发现特异性的六聚体基序。Krieg 等，PNAS，95；12631-12636，1998发现含有被称为him的中和基序的合成寡核苷酸可阻断免疫刺激性CpG基序诱导的免疫活化，这种中和基序存在同向重复簇的CpG二核苷酸、在5’端为C或在3’端为G。另外未发现六聚体免疫刺激序列。在文献Zeuner 等，Arthritis andRheumatism，46：2219-2224，2002中，上述Kreig等人描述的IIS被证明可在动物模型中抑制CpG诱导的关节炎。在US 6,225,292中，Raz等人描述了一种特异性的六聚体基序，被定义为5’-嘌呤-嘌呤-[Y]-[Z]-嘧啶-嘧啶-3’，其中Y是除胞嘧啶核苷酸之外的任意核苷酸，Z是任意核苷酸，其中当Y不是鸟嘌呤核苷或次黄嘌呤核苷、Z不是鸟嘌呤核苷或次黄嘌呤核苷时，可以阻断CpG免疫刺激序列的免疫刺激活性。在上述所有例子中，IIS都被证实可以特异性地抑制免疫刺激性CpG序列引起的免疫活化。
核酸治疗
反义核酸治疗：反义寡核苷酸最初是作为特异性靶基因的互补序列来降低该基因的表达(Krieg，Annu.Rev.Immunol，20：709-760，2002)。为了防止这些寡核苷酸的降解通常都要对寡核苷酸骨架进行修饰，如硫代磷酸酯化。虽然在许多情况下反义寡核苷酸确实可以抑制组织培养细胞内的靶基因表达，但是在体内试验中很少能成功地改变基因的表达。许多研究者意外地却发现许多这样的寡核苷酸可在体内刺激免疫反应。例如，抗人免疫缺陷病毒(HIV)rev基因的反义寡核苷酸具有免疫刺激效应，因为它可以刺激B细胞的增殖和脾肿大(Branda 等，Biochem.Pharmacol.，45：2037-2043，1993)。虽然在早期的研究中并没有马上鉴定出免疫刺激基序，但是这些发现导致了后来对特异性免疫刺激基序的深入研究。
基因治疗：多核苷酸治疗，其中包括编码肽和/或多肽的裸DNA、用沉淀和转染促进试剂制成的DNA制剂以及病毒载体都已被用于“基因治疗”。基因治疗就是通过转移多核苷酸来提供蛋白或肽的表达以替代宿主内缺失或缺陷的蛋白或肽，或者增强所需的生理功能。基因治疗包括用于治疗的目的使DNA整合到宿主基因组内的方法。基因治疗的例子包括转移编码凝血因子的DNA以治疗血友病、转移编码腺嘌呤脱氨酶的DNA以治疗重症联合免疫缺陷、转移编码低密度脂蛋白受体的DNA以治疗家族性高胆固醇血症、转移编码葡萄糖脑苷酯酶的DNA以治疗Gaucher病、转移编码α1胰蛋白酶的DNA以治疗α1胰蛋白酶缺乏症、转移α或β球蛋白基因以治疗血红蛋白病、以及转移编码氯离子载体的DNA以治疗囊性纤维化(Verma和Somia，Nature，389，239-42，1997)。
DNA免疫治疗感染：在DNA免疫中，一个非复制型的转录子单位为蛋白或蛋白片段的合成提供了一个模板，这种蛋白或蛋白片段可在宿主体内诱导或提供特异性的免疫反应。注射裸DNA可增强抗各种微生物和肿瘤的免疫(Robinson和Torres，SeminImmunol，9，271-83.，1997)。编码病毒(乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、轮状病毒和流感病毒)、细菌(结核分支杆菌)和寄生虫特异性蛋白的DNA疫苗已被开发出来用于预防和治疗这些致病原所引起的感染，其中所提到的蛋白都是非自身抗原(Le 等，Vaccine，18，1893-901，2000)；(Robinson和Pertmer，Adv Virus Res，55，1-74，2000)。
DNA治疗恶性肿瘤：编码主要组织相容性抗原I类分子、细胞因子(IL-2、IL-12和IFN-γ)和肿瘤抗原的DNA疫苗已被开发出来用于治疗恶性肿瘤(Wlazlo和Ertl，Arch Immunol Ther Exp，49：1-11，2001)。例如，编码B细胞免疫球蛋白独特型(抗原结合区)的病毒DNA被注射以后可根除B细胞淋巴瘤(Timmerman 等，Blood，97：1370-1377，2001)。
DNA免疫治疗自身免疫性疾病：其他研究者也报道了利用编码免疫分子的DNA来治疗自身免疫性疾病的研究。这种DNA治疗措施包括利用编码T细胞受体抗原结合区的DNA来改变导致自身免疫反应的自身反应性T细胞的水平(Waisman 等，NatMed，2：899-905，1996)(美国专利5,939,400)。将编码自身抗原的DNA连接到颗粒上，然后用基因枪转移到皮肤内可治疗多发性硬化症和胶原诱导的关节炎(专利WO97/46253)(Ramshaw 等，Immunol，和Cell Bio.，75：409-413，1997)。编码粘附分子、细胞因子(TNFα)、趋化因子(C-C趋化因子)和其他免疫分子(Fas配基)的DNA已被用于治疗自身免疫性疾病的动物模型(Youssef等，J Clin Invest，106：361-371，2000)；(Wildbaum 等，J Clin Invest，106：671-679，2000)；(Wildbaum 等，J Immunol，165：5860-5866，2000)；(Wildbaum 等，J Immunol，161：6368-7634，1998)；(Youssof等，J Autoimmun，13：21-9，1999).
本发明的目的之一是提供治疗或预防疾病、特别是自身免疫性疾病或炎性疾病的方法和组合物，所述方法包括给予免疫调节核酸。本发明的另一个目的是提供鉴定治疗疾病的免疫调节序列的方法。本发明还有一个目的是提供治疗与存在于并参与动物体内非生理过程的自身蛋白、自身多肽或自身肽相关的疾病的方法和手段。本发明的另外一个目的是提供用于治疗或预防与存在于动物体内非生理过程的自身蛋白、自身多肽或自身肽相关的疾病的组合物。本发明还涉及疾病的治疗或预防，其中包括联合给予免疫调节核酸和自身分子。通过完整阅读本说明书可以清楚地理解本发明的这些目的以及其他目的。
发明概述
本发明的理论根据是单独或联合使用免疫调节序列可预防或治疗与自身分子相关的自身免疫性疾病或炎性疾病。正是由于本发明的出现含有CpG二核苷酸的免疫调节序列或在特定免疫调节基序中含有的如本文所述的其他调节性二核苷酸才被用于预防或治疗炎症性或自身免疫性疾病，这种预防和治疗方法不依赖于与其相似或并行的ISS刺激(如微生物DNA或含CpG的重组载体)。免疫调节基序的例子有：
5’-嘌呤-嘧啶-[Y]-[Z]-嘧啶-嘧啶-3’；和
5’-嘌呤-嘌呤-[Y]-[Z]-嘧啶-嘧啶-3’
本发明的目的可通过治疗或预防疾病、特别是自身免疫性或炎性疾病的新型方法和组合物来实现，包括给予含有一个或多个免疫调节序列的免疫调节核酸。免疫调节核酸可单独给药，也可以和编码自身蛋白、自身多肽、自身肽的多核苷酸一起给药。免疫调节核酸也可以和其他自身分子一起用于治疗与一种或多种处于非生理状态的个体体内的自身分子相关的自身免疫性或炎性疾病。本发明还涉及用于治疗或预防自身免疫性疾病或炎性疾病的药物组合物，其中药物组合物包含多核苷酸形式的免疫调节序列，如DNA多核苷酸。免疫调节序列还可以被插入到载体内，通过修饰载体核苷酸序列的元件使其包含免疫调节基序，当用于治疗与非生理状态个体体内的自身分子相关的疾病，如自身免疫性或炎性疾病时，还可以包含抑制性二核苷酸基序。
本发明的其他目的可通过治疗或预防与非生理状态动物体内的一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽相关的疾病的新型方法来实现，包括给予动物免疫调节序列的方法。本发明还涉及治疗或预防与非生理状态动物体内的一种或多种自身蛋白、自身多肽或自身肽相关的疾病的新型方法，其中包括给予动物免疫调节序列以及编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸。
在一个方面，本发明提供了治疗或预防自身免疫性疾病如多发性硬化症、类风湿关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性色素层炎、原发性胆汁性肝硬变、重症肌无力、Sjogren综合征、寻常性天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、强直性脊柱炎、自身免疫性皮肤病和Grave病的方法，该方法包括给予动物单独的免疫调节序列，或者联合含编码自身免疫性疾病相关的自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的自身载体一起给药。在本发明的另一方面，免疫调节序列可与含DNA的多核苷酸一起给药，其中的DNA编码处于非生理状态或其相关疾病的个体体内存在的自身蛋白、自身多肽或自身肽。
在另外一个方面，本发明提供了治疗或预防炎性疾病如骨关节炎、痛风、假性痛风、羟磷灰石沉积病、哮喘、滑囊炎、肌腱炎、结膜炎、尿道炎、阴茎头炎、皮肤炎、冠状动脉疾病或偏头疼的方法，该方法包括单独或联合给予动物免疫调节序列。
在另外一个方面，本发明提供了治疗或预防器官或细胞移植相关的疾病的方法，这些疾病包括而不限于GVHD或移植排斥，该方法包括单独或与自身载体一起给予动物免疫调节序列，其中的自身载体包括编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸，这些自身蛋白、自身多肽或自身肽与GVHD或移植排斥相关。给予免疫调节序列和含编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸的自身载体可调节针对自身载体表达的自身蛋白、自身多肽或自身肽的免疫反应。
附图简述
图1：IMS(抑制性IMS)抑制ISS(CpG-ODN)介导的全脾细胞增殖，并且是TLR-9依赖性的。(A)用刺激性CpG-ODN培养全脾细胞，在72小时内按照图例所示不断增加抑制性IMS的浓度。在培养的最后16小时用1μCi[3H]TdR脉冲，然后测定掺入的放射活性。每个数据点代表3个复孔的平均值+/-SD。(B)从TLR-9 WT(交叉影线柱)和TLR-9KO(黑柱)小鼠中分离全脾细胞，用刺激性CpG-ODN、抑制性IMS或LPS培养72小时。在培养的最后16小时用1μCi[3H]TdR脉冲，然后测定掺入的放射活性。每个数据点代表3个复孔的平均值+/-SD。(C)IMS抑制IκB-α在32位丝氨酸上的磷酸化。在存在5μg/ml所示的寡核苷酸的情况下培养空白的脾细胞72小时。用20μg蛋白提取物通过蛋白质印迹分析确定IκB-α在32位丝氨酸上的磷酸化水平。在存在刺激性CpG(2道)或刺激性CpG和对照寡核苷酸(6道)的情况下IκB-α被活化，将IMS加入到刺激性CpG寡肽中时(5道)IκB-α被活化的水平降低。
图2：抑制性IMS降低细胞表面MHC II类分子和共刺激分子的表达水平。(A)在添加或不添加CpG-ODN(5μg/ml)或抑制性IMS(5μg/ml)的情况下培养空白脾细胞，72小时后收获细胞。利用定量PCR从纯化的RNA开始合成cDNA。每个样品中MHC II类分子RNA的量表示为与β肌动蛋白RNA量相比较后得到的相对单位。(B)在添加图中所示量的每种寡核苷酸(μg/ml)的情况下培养空白脾细胞。通过FACS分析MHCII类分子表达阳性的细胞百分数，如图所示，抑制性寡核苷酸以剂量依赖的方式抑制MHC II类分子表达。(C至F)抑制性IMS(抑制性寡核苷酸)对APC活化标记分子表达水平的影响。空白脾细胞用所示浓度的刺激性CpG-ODN、抑制性IMS或对照ODN培养，72小时后收获细胞。利用FACS分析CD40(C)、CD80(D)、CD86(E)和CD1d(F)的表达水平。抑制性IMS可以剂量依赖的方式抑制CD40、CD80和CD86的表达，而以剂量依赖的方式增加CD1d的表达。
图3：抑制性IMS抑制Th1细胞因子的产生。空白脾细胞用所示浓度的刺激性CpG-ODN、抑制性IMS或对照ODN培养，72小时后收获上清。用ELISA方法测定IL6(A)和IL12p40(B)的表达水平。如图所示，抑制性IMS可以剂量依赖的方式抑制IL6和IL12p40的表达。一个数据点代表3个复孔的平均值。
图4：用抑制性IMS预防治疗来抑制PLP139-151介导的EAE。SJL/J小鼠皮下注射100μg PLP139-151肽进行免疫，肽用PBS溶解，以CFA乳化。在肽免疫前14天和7天腹腔注射50μg悬浮于PBS中的IMS。每天记录动物的临床分数。1级，尾巴麻痹；2级，后肢轻度瘫痪；3级，后肢麻痹；4级，完全麻痹(四肢麻痹)；5级，死亡。
图5：用抑制性IMS预防治疗来抑制PLP139-151介导的EAE。SJL/J小鼠皮下注射100μg含不完全弗氏佐剂和0.5mg热灭活结核分支杆菌的PLP139-151肽进行免疫。在肽免疫的同一天(第0天)腹腔注射如图所示的50μg悬浮于PBS中的ODN。每天记录动物的临床分数。1级，尾巴麻痹；2级，后肢轻度瘫痪；3级，后肢麻痹；4级，完全麻痹(四肢麻痹)；5级，死亡。
图6：IMS对纯化抗原特异性T细胞分化增殖的影响。(A)抑制性IMS抑制Th1细胞。空白全脾细胞用PLP139-151肽和如图所示的ODN共培养24小时，将载肽脾细胞照射以后加入PLP139-151特异性的Th1细胞系再培养72小时。IMS不能刺激Th1细胞的增殖，对CpG-ODN诱导的增殖只有轻微的抑制作用。(B)相反，抑制性IMS不能抑制PLP139-151特异性Th2细胞系的增殖。三组试验中都能观察到CpG-ODN对这种Th2细胞系增殖的抑制效应，在培养的最后16小时用1μCi[3H]TdR脉冲，然后测定掺入的放射活性。每个数据点代表3个复孔的平均值+/-SD。
图7：对pBHT1载体的修饰可降低脾细胞的增殖活性。(A)全脾细胞用刺激性CpG寡核苷酸和免疫调节性GpG寡核苷酸培养24小时。在培养的最后4小时用1μCi[3H]TdR脉冲，然后测定掺入的放射活性。刺激指数根据只用培养基孵育的脾细胞增殖水平之上的增殖程度来计算。(B)全脾细胞用图中所示浓度的pVAX1空载体或pBHT1空载体培养24小时。在培养的最后4小时用1μCi[3H]胸腺嘧啶核苷脉冲，然后测定掺入的放射活性。刺激指数根据只用培养基孵育的脾细胞增殖水平之上的增殖程度来计算。
图8：pBHT1载体降低APC的活化。空白脾细胞用10μg/ml CpG或GpG寡核苷酸(A)、或者100μg/ml pVAX1或pBHT1培养48小时。收获细胞，染色后通过FACS分析CD16/32的表达。未标记的图代表只与培养基共孵育的细胞。
图9：pBHT1载体抑制细胞因子的产生。空白脾细胞用10μg/ml刺激性CpG寡核苷酸、免疫调节性GpG寡核苷酸、100μg/ml pVAX1DNA或100μg/ml pBHT1DNA培养。在图中所示的时间点后收获上清，通过夹心ELISA测定IL6、IL10和IFNγ的表达水平。一个数据点代表三个复孔的平均值。
图10：编码自身抗原的pBHT1载体可减轻EAE的症状。将编码鼠PLP(蛋白脂类蛋白)的DNA插入到pBHT1载体内，肌肉注射给SJL小鼠。小鼠在第0天时先用溶于CFA(完全弗氏佐剂)的肽PLP139-151诱导EAE，然后在疾病起始后第7天(第20天)将小鼠随机分成不同的治疗组。50μg含鼠PLP的pBHT1载体或50μg pBHT1空载体对照以三种不同的给药方案肌肉注射到小鼠体内：(A)每周一次，(B)两周一次，以及(C)四周一次。每天记录小鼠的EAE分数，共分为5级，将治疗组的平均得分作图。所有治疗组的平均疾病得分都有下降，最显著的是两周一次或四周一次给药组。
图11：用抑制性IMS进行多核苷酸治疗抑制PLP139-151介导的EAE。在第0天时，7周龄的雌性SJL/J小鼠皮下注射100μg PLP139-151肽进行免疫，肽用PBS溶解，以CFA乳化，其中含有IFA和0.5mg热灭活的结核分支杆菌。从第7天开始每天记录动物的临床得分。在第12天时，在小鼠双侧四头肌内注射0.1ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后，在所选择小鼠的双侧四头肌内注射编码全长鼠PLP、MAG、MOG和MBP的DNA(分别插入到pTARGET质粒内，每种25μg)和50μg编码全长鼠IL-4的pTARGET质粒，质粒溶于TE内，总体积为0.2ml。DNA注射每周进行一次，共注射6周。在开始进行DNA处理时，小鼠腹腔单独注射200μl含50μg IMS的PBS，或者同时进行DNA多核苷酸注射。IMS每两周注射一次，共注射6周。
图12：EAE治疗组细胞因子表达情况。诱导出EAE后57天处死小鼠，取出每只小鼠的腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结，并将一组的淋巴混合在一起。分离出细胞用含10μg/ml PLP139-151、10％FCS的浓缩RPMI培养基培养。3天后收集细胞上清，用标准的鼠(A)IFN-γ、(B)IL-4和(C)IL-10ELISA试剂盒通过夹心ELISA检测细胞因子的表达情况。ELISA试剂盒购自BD Pharmingen。
图13：利用蛋白质芯片技术进行髓鞘自身抗体表位扩散试验。用PLP139-151诱导出急性麻痹性EAE并在部分恢复后14天，SJL/J小鼠分别用PBS空白对照，IMS，编码MBP、PLP、MOG、MAG(DPT)和IL-4的pTARGET；DPT和IL-4加上IMS；DPT和IL-4加上CpG.处理，每周一次。经过6周处理以后，采集每个治疗组小鼠的血清以及正常小鼠的血清(NMS)，进行髓鞘蛋白芯片试验，SAM用于鉴定和制备分级集束分析来确定抗原的特征。
图14：单独使用抑制性IMS和与多核苷酸治疗联合可抑制PLP139-151介导的EAE。在第0天时，7周龄的雌性SJL/J小鼠皮下注射100μg PLP139-151肽进行免疫，肽用PBS溶解，以CFA乳化，其中含有IFA和0.5mg热灭活的结核分支杆菌。从第7天开始每天记录动物的临床得分。在第14天时，在小鼠双侧四头肌内注射0.1ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后，在所选择小鼠的双侧四头肌内注射编码全长鼠PLP、MAG、MOG和MBP的DNA(分别插入到pTARGET质粒内，每种25μg)和50μg编码全长鼠IL-4的pTARGET质粒，质粒溶于TE内，总体积为0.2ml。DNA注射每周进行一次，共注射6周。在开始进行DNA处理时，小鼠腹腔单独注射200μl含50μgIMS的PBS(A)，或者同时进行DNA多核苷酸注射(B)。IMS每两周注射一次，共注射6周。
图15：DNA多核苷酸疗法和IMS治疗NOD糖尿病小鼠。取7周龄的NOD/Lt雌性小鼠，在禁止随意出入的房间内饲养。在10周龄时开始用One Touch Ultra BloodGlucose Monitoring System每周测定血糖水平(BGL)。当BGL达到200-250mg/dl时开始治疗。在15周龄时将小鼠分组。小鼠双侧四头肌内注射0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠双侧四头肌内注射：1)编码全长鼠前胰岛素原1和前胰岛素原2的DNA多核苷酸，DNA分别被插入到pVAX1载体内，注射剂量为50μg；或者2)编码全长鼠前胰岛素原1和前胰岛素原2的DNA多核苷酸，DNA分别被插入到pVAX1载体内，注射剂量为50μg，再加上编码IL-4的pVAX1质粒，质粒用PBS溶解，总体积为0.2ml。注射每周进行一次，连续4周。在开始进行DNA治疗的同时，小鼠腹腔单独注射200μl含50μg IMS的PBS，或者同时进行DNA多核苷酸治疗。IMS治疗每周一次，连续4周。开始治疗后9周内记录在糖尿病进展过程中的存活百分率(A)。29周龄时的糖尿病患病百分率定义为BGL持续超过250mg/dl的小鼠所占的百分率(B)。
图16：DNA多核苷酸疗法和IMS治疗NOD糖尿病小鼠。取7周龄的NOD/Lt雌性小鼠，在禁止随意出入的房间内饲养。在10周龄时开始用One Touch Ultra BloodGlucose Monitoring System每周测定血糖水平(BGL)。当BGL达到200-250mg/dl时开始治疗。在15周龄时将小鼠分组。小鼠双侧四头肌内注射0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠双侧四头肌内注射：1)PBS，2)200μg pVAX1空质粒，3)50μg IMS，4)pVAX1空质粒加IMS(肌肉注射)，5)编码全长鼠前胰岛素原1和前胰岛素原2的DNA多核苷酸，DNA分别被插入到pVAX1载体内，注射剂量为50μg，6)DNA多核苷酸加IMS(肌肉注射)，7)DNA多核苷酸加50μg编码IL-4的pVAX1质粒，8)DNA多核苷酸加IL-4加IMS(肌肉注射)，9)DNA多核苷酸加IL-4，腹腔再注射0.2ml含50μg IMS的PBS。所有的注射都是每周一次，连续8周。糖尿病患病百分率定义为BGL持续超过250mg/dl的小鼠所占的百分率。开始治疗后8周内记录在糖尿病进展过程中的存活百分率。
图17：DNA疗法和抑制性IMS抑制II型胶原诱导的CIA。将20只6周龄的DBA/1小鼠分组，在用完全弗氏佐剂乳化的CII诱导CIA前14天和7天用50μg如图所示的DNA疫苗进行IM预处理。诱导出CIA后用第三种剂量的DNA耐受疫苗处理小鼠1周。2周后小鼠用不完全弗氏佐剂乳化的CII诱发一次。利用Current Protocols inImmunology中描述的视觉评分系统记录关节炎的分数。(A)编码II型胶原(CII)的DNA加上编码IL-4的DNA，加或不加IMS，结果显示与DNA疫苗载体(pTarget)加上IL-4再加或不加IMS的对照组相比关节炎的平均严重程度明显下降。(B)疾病总体发病率各组基本一致。
图18：CIA治疗组的增殖试验。CIA免疫爆发后27天处死小鼠，取腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结，并将一组的淋巴混合在一起。分离出细胞用含100μg/ml变性II型胶原、10％FCS的浓缩RPMI培养基培养72小时。在培养的最后16小时用1μCi[3H]TdR脉冲，然后测定掺入的放射活性。每个数据点代表3个复孔的平均值+/-SD。
图19：CIA治疗组的细胞因子表达情况。CIA免疫爆发后27天处死小鼠，取腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结，并将一组的淋巴混合在一起。分离出细胞用含100μg/ml变性II型胶原、10％FCS的浓缩RPMI培养基培养72小时。收集上清，用BD Pharmingen的标准鼠(A)IL-6、(B)IL-4、(C)IFN-γ和(D)TNF-αELISA试剂盒通过夹心ELISA方法测定细胞因子的表达情况。
图20：DNA疗法和抑制性IMS抑制II型胶原诱导的CIA。将20只6周龄的DBA/1小鼠分组，在用完全弗氏佐剂乳化的CII诱导CIA前14天和7天用50μg如图所示的DNA疫苗和IP加IMS进行IM预处理。诱导出CIA后用第三种剂量的DNA耐受疫苗和IMS处理小鼠1周。2周后小鼠用不完全弗氏佐剂乳化的CII诱发一次。利用Current Protocols in Immunology中描述的视觉评分系统记录关节炎的分数。(A)IMS处理鼠与未处理对照组的小鼠和编码全长II型胶原(CII)的DNA加IMS处理组的小鼠相比其关节炎的严重程度明显减轻。(B)IMS处理组的总发病率与其他两组相比下降，其他两组类似。
图21：抑制性IMS抑制ISS(CpG-ODN)介导的B细胞增殖。利用羊抗鼠IgG和IgM、羊γ球蛋白的重链和轻链特异性抗体作为载体蛋白通过标准的B细胞淘洗技术从脾中分离初级B细胞，纯度大于＞97％的B220+细胞通过FACScan分析来确定。B细胞用5μg如图所示的寡核苷酸培养72小时。用100ng/ml的LPS共培养。在培养的最后16小时用1μCi[3H]TdR脉冲，然后测定掺入的放射活性。每个数据点代表3个复孔的平均值+/-SD。
图22：抑制性IMS抑制B细胞产生Th1细胞因子。空白初级B细胞用如图所示浓度的刺激性CpG-ODN、抑制性IMS或对照ODN培养。72小时后收获上清。通过ELISA方法测定产生的IL6(A)；IFN-γ(B)；IL-10(C)和IL12p40(D)。每个数据点代表3个复孔的平均值。
发明详述
在详细描述本发明前，需要说明的是本发明并不限于特定的制剂或方法参数，这些参数可以改变。还应当理解的是本文所用的方法只是为了描述本发明的特定实施方式，而不意味着对本发明的限制。
定义
“核酸”和“多核苷酸”用在这里时意义是相同的，是指核苷酸(如脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其类似物)的聚合物。
本文所用的术语“寡核苷酸”是指核酸的一个亚类，约含6到175个核苷酸或更长。典型的寡核苷酸的长度可达到约100个核苷酸。寡核苷酸既指寡核糖核苷酸，又指寡脱氧核糖核苷酸，本文称为ODN。ODN包括寡核苷酸和其他含有机碱基的聚合物。
核苷酸是含有连接到磷酸基团和可取代有机碱上的糖(优选核糖或脱氧核糖)的分子，可取代有机碱可以是取代嘌呤(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或次黄嘌呤(I))或取代嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))。
免疫调节序列(IMS)。本文所用的术语“免疫调节序列”或“IMS”是指能调节自身免疫性疾病或炎性疾病的核酸分子的核苷酸序列或核酸分子的一段区域。例如，IMS可以是插入到载体内的寡核苷酸或核苷酸序列。本文所用的术语“免疫调节核酸“是指含有一个和多个IMS的核酸分子。
术语“一致性”或“百分一致性”用于两个和多个核酸或多肽序列时是指两个或多个序列或亚序列在被排列到一起比较其最大一致性时是一样的，或者有一定百分比的氨基酸残基或核苷酸是一样的，例如用序列比较算法如PILEUP、BLAST或其他类似算法(见Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153，1989；Altschul 等，J.Mol Biol，215：403-410，1990)进行比较时。在比较序列时较好的排列方法是Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482，1981所描述的局部同源性算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443，1970所描述的同源性排列算法、Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444，1988所描述的相似性搜索法、以及根据这些算法编写的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package内的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WT)，或者通过人眼的检查来比较(见Ausubel 等，同上)。
术语“基本一致的”用于两个核酸或多肽时是指两个或多个序列或亚序列在被排列到一起比较其最大一致性时至少有60％的核苷酸或氨基酸残基是一致的，优选至少有70％、更优选至少有80％、最优选至少有90％或95％的核苷酸或氨基酸残基是一致的。如果在序列的一个区域内存在序列的基本一致性，那么这个区域的长度优选至少约50个残基、更优选的是至少约100个残基、最优选的是至少约150个残基。在一个优选实施方式中，序列在给定核酸或多肽的全长序列上是基本一致的。在本发明的某些实施方式中，核酸或多肽(如自身蛋白、自身多肽或自身肽，或者编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的核酸)与本文所描述的特定核酸或多肽是基本一致的。
本文所用的术语“自身分子”包括自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白。“自身蛋白、自身多肽、自身肽或其片段或衍生物”包括动物基因组所编码的蛋白、多肽或肽；动物产生的蛋白、多肽或肽；在动物生命过程的某个阶段经过翻译后修饰的蛋白、多肽或肽；或处于非生理状态中的动物体内存在的蛋白、多肽或肽。术语“非生理状态”用于描述本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽时是指这些自身蛋白、自身多肽或自身肽在动物体内偏离或脱离了其正常的功能或过程。当指自身蛋白、自身多肽或自身肽“与疾病相关”或“参与疾病”时是指自身蛋白、自身多肽或自身肽可在形式上或结构上加以修饰以使其不能再发挥其生理功能或参与生理过程；或者是指自身蛋白、自身多肽或自身肽通过诱导病理生理状态、介导或促进病理生理过程、和/或称为病理生理过程的靶位来参与到疾病的病理生理过程中。例如，对于自身免疫性疾病来说，免疫系统异常攻击自身分子，如自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白，引起表达和/或存在自身分子的细胞和组织损伤或功能障碍。另外，分子本身也可以非生理水平和/或以非生理功能表达。例如，在神经变性疾病中，自身蛋白异常表达，聚集在脑的病变部位，从而引起神经功能障碍。在其他情况下，自身分子可使病理状态或过程恶化。例如在骨关节炎中，自身蛋白包括胶原酶和基质金属蛋白酶异常地降解覆盖在关节面上的关节软骨。自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白的翻译后修饰包括糖基化、添加脂质基团、被磷酸酶去磷酸化、添加二甲基精氨酸残基、聚丝蛋白(fillagrin)和纤维蛋白被肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)瓜氨酸化；αB-晶体蛋白磷酸化；MBP瓜氨酸化；级联酶和粒酶蛋白水解SLE自身抗原。在免疫学上，自身蛋白、自身多肽或自身肽都被认为是宿主的自身抗原，在正常的生理条件下，宿主免疫系统通过消除、灭活或失活能识别自身抗原的免疫细胞，经过一个被称为“免疫耐受”的过程来忽略自身抗原。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括免疫系统的细胞为了调节免疫功能而生理性、特异性以及专一性表达的免疫蛋白、免疫多肽或免疫肽。免疫系统是一种防卫机制，在动物世界栖息的难以计数的致病性微生物入侵时提供快速的、高度特异性的保护反应。免疫蛋白、免疫多肽或免疫肽包括T细胞受体、免疫球蛋白、细胞因子如I型白细胞介素和II型细胞因子，其中包括干扰素和IL-10、TNF-α、淋巴毒素，趋化因子如巨噬细胞炎症蛋白-1α和β、单核细胞趋化蛋白和RANTES，以及其他直接参与免疫功能的分子如Fas配基。某些免疫蛋白、免疫多肽或免疫肽也包括在本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽之中，其中包括MHC I类膜糖蛋白、MHC II类糖蛋白和骨桥接素。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括受试者完全缺乏或实质缺乏的蛋白、多肽和肽，这些蛋白、多肽和肽的缺乏是由于先天性或获得性缺陷所引起的代谢或功能障碍而导致的，并且可以通过给予所述的蛋白、多肽或肽，或者通过给予编码所述的蛋白、多肽或肽的核酸(基因治疗)来替代。这种障碍的例子包括杜兴肌营养不良、贝克肌营养不良、囊性纤维化、苯丙酮酸尿症、半乳糖血症、枫糖尿病和高胱氨酸尿症。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括具有能将其自身与其正常伙伴区别开来的特征的细胞所特异性和专一性表达的蛋白、多肽和肽，这些特征包括：(1)克隆性，即具有异常突变的单个细胞可以增殖形成一个恶性细胞的克隆，(2)自主性，即其生长不能被适当调节，以及(3)间变性或缺乏正常细胞协调分化的能力。具有上述三个标准中的一个或多个的细胞被称为肿瘤细胞、癌细胞或恶性细胞。
“质粒”和“载体”的命名规则是小写字母p加上字母和/或数字。起始质粒可以购买或从无限制的公共资源中获得，或者按照公开的方法从已有的质粒开始构建。另外，与已描述的质粒等价的质粒是本领域所熟知的，其构建方法也是本领域技术人员所熟知的。“载体”或“质粒”是指通过添加适当的调控元件能够在宿主细胞内复制的任何基因元件。为了实现本发明，本发明所用的载体或质粒包括而不限于质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒等。
“裸核酸”用于本文中是指不被包裹(如包裹在病毒颗粒、细菌或脂质体内)并且不与结合核酸的分子(如二乙氨乙基右旋糖酐)形成复合物，也不与其他的核酸相连接(如金属颗粒或多糖支持物)的核酸分子。
疾病或病症的“治疗”是指减缓、终止或反转已发生疾病的进展，其表现为通过给予本发明的免疫调节核酸使临床症状或诊断症状减轻、终止或消除。“已发生疾病”是指免疫系统被活化，导致受影响组织发生炎症，白细胞和淋巴细胞异常浸润。疾病或病症的“治疗”还指通过联合给予免疫调节核酸和自身分子减缓、终止或反转已发生疾病的进展。本文所用的术语“自身分子”是指自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白。疾病或病症的“治疗”还指通过联合给予免疫调节核酸和免疫调节药物减缓、终止或反转已发生疾病的进展。当“联合给予”用于包含免疫调节核酸和其他化合物如编码自身蛋白、自身肽或自身多肽的DNA的治疗方案时，是指两种或多种化合物分开给药，但是这些化合物被装入一个容器内一起给药，通过连接物连接在一起，被一个或多个载体内的DNA编码，或者在不同的部位分别注射但是不同注射的间隔时间很短以至于本领域的技术人员认为是联合给药。在本文中，改善疾病和治疗疾病的意义是一样的。
本发明中所用的术语疾病的“预防”是指免疫调节序列单独或者和本文所描述的化合物一起给药以防止疾病或病症、疾病或病症的某些或全部症状的发生或起始，或者降低疾病或病症起始的可能性。本发明中所用的术语疾病的“预防”还指免疫调节序列和自身分子一起给药以防止疾病或病症、疾病或病症的某些或全部症状的发生或起始，或者降低疾病或病症起始的可能性。本发明中所用的术语疾病的“预防”还指免疫调节序列和免疫调节药物一起给药以防止疾病或病症、疾病或病症的某些或全部症状的发生或起始，或者降低疾病或病症起始的可能性。“免疫调节药物”用于本文中是指当给予受试者时能够产生免疫调节功能的分子。这种免疫调节药物包括细胞因子、趋化因子、类固醇激素、抗原或自身抗原的抗体。
“受试者”可指任何动物，如人、非人灵长类动物、马、牛、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。
自身免疫性疾病
本所描述的组合物和方法可用于治疗或预防自身免疫性疾病。与自身分子包括处于非生理状态的动物体内存在的自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白、或自身分子的衍生物相关的自身免疫性疾病的几个例子列于下表中，并将在下文中描述。
Figure C20038010773000231
Figure C20038010773000241
多发性硬化症：多发性硬化症(MS)是最常见的中枢神经系统(CNS)脱髓鞘疾病，在美国有350,000人患病，全球患病人数有一百万。开始出现症状的年龄一般在20到40之间，症状为急性或亚急性双侧视觉损伤、肌无力、感觉异常、共济失调、眩晕、尿失禁、发音困难或智力障碍(发作频率逐渐增加)。这些症状是由于局部脱髓鞘导致轴突传导缓慢引起负传导异常，同时异位脉冲产生引起正传导异常(如Lhermitte症状)而造成的。MS的诊断需要根据病史如至少两次间隔一段时间的神经功能障碍的明显发作，神经功能障碍产生客观的临床症状和CNS白质内有不同区域受影响这些因素来确定。实验室研究也提供了一些其他的客观证据支持对MS的诊断，其中包括CNS白质损伤区域的磁共振成像(MRI)、脑脊髓液(CSF)内的IgG寡克隆条带以及异常唤起反应。虽然大多数受试者会经历逐渐恶化的复发-缓解过程，但是不同个体之间MS的临床过程差异很大，有的受试者在一生中可能只出现几次温和的发作，而有些受试者的症状可能不断恶化并且会不时发作。能分泌IFNγ的髓鞘自身反应性T细胞数量的增加被认为与MS和EAE的发病机制有关。
类风湿关节炎：类风湿关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性炎性滑膜炎，在全球整个人群中的患病率为0.8％。其特征是慢性炎性滑膜炎导致侵蚀性的关节损伤。RA是由T细胞、B细胞和巨噬细胞介导的。
证明T细胞在RA中扮演关键角色的证据包括(1)滑膜内浸润有大量的CD4+T细胞，(2)利用药物如环孢菌素抑制T细胞的功能可改善临床症状，以及(3)RA与某些HLA-DR等位基因相关。与RA相关的HLA-DR等位基因β链的第三高变区67-74位置上有一个类似的氨基酸序列，参与肽的结合和向T细胞的呈递。RA是由能识别自身分子如存在于宿主关节滑膜或其他部位的自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白、或未分类的自身生物分子的自身反应性T细胞介导的。本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽还指RA内作为靶位自身抗原，其中含有II型胶原；hnRNP；A2/RA33；Sa；中间丝相关蛋白；角蛋白；瓜氨酸；软骨蛋白包括gp39；I、III、IV、V、IX、XI型胶原；HSP-65/60；IgM(类风湿因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心肌磷脂；醛缩酶A；瓜氨酸修饰的中间丝相关蛋白和纤维蛋白来源的表位。在大部分RA受试者的血清中都检测到了能识别精氨酸残基被修饰的中间丝相关蛋白(脱亚胺基形成瓜氨酸)的自身抗体。在某些受试者体内含有直接抗同种免疫优势II型胶原(CII)肽257-270的自身反应性T细胞和B细胞反应。
胰岛素依赖型糖尿病：人I型或胰岛素依赖型糖尿病(IDMM)的特征是胰岛β细胞因为自身免疫反应而被毁坏。B细胞的耗竭导致无法调节血糖水平。当血液中的葡萄糖浓度超过某个特定水平，通常是约250mg/dl时就会出现明显的糖尿病症状。在这个期间胰岛β细胞的功能不断丢失。出现抗胰岛素、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗体就预示着疾病在恶化，这些蛋白都是本发明所包括的自身蛋白、自身多肽或自身肽的例子。
在出现症状前用于评价疾病的指标有胰腺胰岛素炎的出现、胰岛细胞抗体的水平、胰岛细胞表面抗体、胰岛β细胞上MHC II类分子的异常表达、血糖浓度以及胰岛素在血浆内的浓度。胰腺内T淋巴细胞数量增多、胰岛细胞抗体和血糖水平上升、以及胰岛素浓度下降是糖尿病的象征。
非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠动物模型具有多种与人IDDM相似的临床、免疫性和组织病理学特征。NOD小鼠可自发地出现胰岛的炎症和β细胞的毁坏，导致高血糖和明显的糖尿病症状。CD4+和CD8+T细胞都是糖尿病进展所需要的，虽然其作用机制还不清楚。试验证明在诱导耐受的情况下给予胰岛素和GAD可预防疾病，对其他自身抗原的表达下调产生反应。
人IDDM的治疗目前所采取的方法是通过监测血糖水平来指导重组胰岛素的注射或通过胰岛素泵注射重组胰岛素。饮食控制和运动也有助于控制血糖水平。
自身免疫性色素层炎：自身免疫性色素层炎是眼的自身免疫性疾病，据估计受试者人数可达400,000，在美国每年新发病例就有43,000例。目前对自身免疫性色素层炎的治疗是用类固醇激素、免疫抑制剂如氨甲蝶呤和环孢菌素、静脉注射免疫球蛋白和TNFα拮抗剂。
实验性自身免疫性色素层炎(EAU)是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，其靶位为眼内的视网膜、色素层及其相关组织。EAU的许多临床症状和免疫学特征与人的自身免疫性色素层炎相似，可通过外周注射完全弗氏佐剂(CFA)乳化的色素层炎生成肽(uveitogenic peptide)来诱发。
人自身免疫性色素层炎所发生的自身免疫反应的自身蛋白靶位包括S抗原、感光细胞间维生素A类结合蛋白(IRBP)、视紫红质和恢复蛋白。
原发性胆汁性肝硬变：原发性胆汁性肝硬变(PBC)是一种器官特异性的自身免疫性疾病，主要影响40-60岁的女性。流行病学调查发现这类人群中的发病率约为1/1000。PBC的特征是小的肝内胆管上的肝内胆道上皮细胞(IBEC)进行性的毁坏(Nishio 等，Semin Liver Dis，22：291，2002)，导致胆汁的分泌被阻塞和干扰，最终引起肝硬化。与具有上皮组织/分泌系统损伤特征的自身免疫性疾病相关的其他疾病已有报道，其中包括Sjogren综合征、CREST综合征、自身免疫性甲状腺疾病和类风湿关节炎。
雌性SJL/J小鼠腹腔注射(i.p.)哺乳动物PDC、诱导非化脓性的毁坏性胆管炎(NSDC)和产生AMA可制备出实验性自身免疫性胆管炎(EAC)小鼠模型(Jones，JCHnPathol，53：813-21，2000)。MRL/lpr小鼠SLE模型也可以发展成PBC样的疾病，其特征是产生出抗α酮戊二酸脱氢酶复合体的自身抗体。
其他自身免疫性疾病及其相关的自身蛋白、自身多肽或自身肽：导致重症肌无力的自身抗原包括乙酰胆碱受体内的表位。参与寻常性天疱疮的自身靶抗原包括桥粒核心糖蛋白-3。Sjogren综合征抗原包括SSA(Ro)；SSB(La)和fodrin。参与寻常性天疱疮的主要自身抗原包括桥粒核心糖蛋白-3。参与肌炎的自身抗原包括tRNA合成酶(如苏氨酰、组氨酰、丙氨酰、异亮氨酰和甘氨酰tRNA合成酶)；Ku；Scl；SS-A；Ul-sn-核糖核蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku；以及SRP。参与硬皮病的自身抗原包括Scl-70；着丝粒蛋白；Ul-sn-核糖核蛋白和纤维蛋白。参与恶性贫血的自身抗原包括内因子和胃H/K ATP酶的β亚单位。系统性红斑狼疮的抗原表位包括DNA；磷脂；核抗原；U1核糖核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；钙网蛋白；Grp78；Scl-70；组蛋白；Sm蛋白；丝氨酸-精氨酸剪切因子核染色质等。Grave病的表位包括Na+/I-同向转运载体；促甲状腺激素受体；Tg和TPO。
其他疾病
与处于非生理状态的动物体内的自身蛋白、自身多肽或自身肽相关的其他疾病的例子列在了表中，并且在下文有进一步的描述。
炎性疾病
骨关节炎和退行性关节病：60岁以上的人群中有30％的人受骨关节炎(OA)的影响，是最常见的人类关节疾病。骨关节炎代表了关节滑膜的退化和功能障碍，包括关节软骨的断裂。
软骨主要由蛋白多糖和胶原组成，蛋白多糖提供硬度和抵抗载荷的能力，胶原提供对突然施压的张力和抵抗力。软骨细胞通过产生和分泌潜在的胶原酶、潜在的基质降解因子、潜在的白明胶酶、组织纤维蛋白溶酶原激活质和其他相关的酶来更新和重塑正常的软骨，这些酶单独或联合在一起都是本发明所述的自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白。软骨细胞还产生几种抑制因子，包括金属蛋白酶(TEVIP)和纤溶酶原激活剂抑制因子(PAI-1)来抑制天然金属蛋白酶、组织纤维蛋白溶酶原激活质和其他酶的降解活性。这些降解酶和抑制因子单独或联合在一起都是本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽。这些酶和抑制因子协同作用来重塑和维持正常的软骨。在OA中，这一过程的调节异常会导致软骨退化和降解。大多数OA受试者都有不同程度的炎症，包括关节发热和肿胀。早期OA出现胶原纤维排列和大小的异常改变。金属蛋白酶、组织蛋白酶、纤维蛋白溶酶和其他自身分子单独或联合在一起都是本发明的自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白，引起软骨基质明显的丢失。开始时软骨细胞产生的蛋白多糖增多，软骨增厚，导致关节软骨异常增厚。然后由于降解酶如胶原酶、基质降解因子、白明胶酶、组织纤维蛋白溶酶原激活质和其他相关酶的作用关节软骨变薄软化，这些酶单独或联合在一起都是自身分子，如本发明的自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白。炎症分子如IL-1、组织蛋白酶和纤维蛋白溶酶可单独或与本发明的自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白一起促进软骨的降解和断裂。变软变薄的软骨对机械压力造成的损伤更敏感。这些因素导致关节表面断裂和垂直裂口的形成(纤维颤动)。疾病后期软骨表面形成侵蚀并且深入到骨。软骨细胞开始时通过增殖形成簇，在疾病后期软骨内的细胞显著减少。骨重塑和骨肥大是OA的典型特征。
目前治疗OA的方法包括休息，物理治疗加强支持关节的肌肉，支架和其他装置稳定关节，非甾体类抗炎药物，对乙酰氨基酚和其他止痛药物。在晚期OA，对一些日常活动来说至关重要的骨与骨之间的关节可进行关节置换。
脊索损伤：据估计目前在美国每年大约有11,000例新发脊索损伤病例(Stover等，Arch Phys MedRehabil，80，1365-71，1999)。脊索损伤完全恢复的很少，通常会造成不可逆的破坏性神经残疾。目前治疗急性脊索损伤的方法包括损伤部位的机械固定，如通过手术，以及系统给予类固醇药物。这些方法很少能够减轻脊索损伤后出现的永久性瘫痪。慢性脊索损伤的治疗主要集中在维持受试者的生活质量，如止痛、缓解痉挛状态和恢复膀胱功能。目前还无法解决神经功能恢复的问题。在损伤后的急性期，炎症反应很明显，脊髓损伤造成的肿胀是发病的主要原因。这种炎症可通过服用大剂量的皮质激素来控制。
移植物抗宿主病：人类组织和器官移植的最大限制之一就是组织移植物被受体的免疫系统排斥。试验证实供体与受体之间MHC I类和II类分子(HLA-A、HLA-B和HLA-DR)等位基因之间匹配的程度越高，移植物存活的可能性就越大。移植物抗宿主病(GVHD)在接受含同种异体造血干细胞的移植物的受试者中可引起较高的发病率和死亡率，这部分是由于皮肤和其他靶器官的炎症反应。造血干细胞存在于骨髓移植物、干细胞移植物和其他移植物中。在接受HLA匹配的同胞的移植物的受试者中大约有50％会发生中度到重度的GVHD，而接受HLA不相匹配的移植物的受试者中GVHD的发病率更高。发生中度到重度GVHD的受试者中大约有1/3会死亡。供体移植物中的T淋巴细胞和其他免疫细胞攻击表达其氨基酸序列发生变化的多肽的受体细胞，特别是人6号染色体上的主要组织相容性复合物(MHC)基因复合体编码的蛋白发生变化的细胞。对同种异体造血干细胞移植发生GVHD影响最大的蛋白是高度多态性(同种蛋白在不同人之间其氨基酸序列变化很大)的I类蛋白(HLA-A、-B和-C)和II类蛋白(DRB1、DQB1和DPB1)(Appelbaum，Nature 411：385-389，2001)。即使供体和受体的MHC I类等位基因在血清学上相“匹配”，但是通过DNA测序发现也有30％的病例在等位基因水平是不相匹配的，这就是造成相匹配的供体-受体对也发生I类分子介导的GVHD的原因(Appelbaum，Nature，411，385-389，2001)。GVHD通常造成皮肤、小肠、肝脏、肺和胰腺的损伤。可用皮质激素、环孢菌素、氨甲蝶呤和OKT3治疗GVHD。
组织移植排斥：组织移植物，包括肺、心、肝、肾、胰腺以及其他器官和组织的免疫排斥是由移植物受体抗被移植器官的免疫反应所介导的。同种异体移植器官含有的蛋白质其氨基酸序列与移植受体的同种蛋白质的氨基酸序列有所不同。由于供体器官的蛋白质与受体的蛋白质氨基酸序列有所不同，因此会在受体体内激发抗被移植器官的免疫反应。免疫反应包括先天性免疫反应和获得性免疫反应，并且伴随靶器官的炎症反应。被移植器官被排斥是组织移植的主要并发症和限制因素，可导致被移植器官在受体体内坏死。由于排斥反应而引起的慢性炎症通常会导致被移植器官的功能障碍。目前治疗移植排斥的方法是利用各种免疫抑制剂预防和抑制排斥反应的发生。这些药物包括皮质激素、环孢菌素A、Cellcept、FK-506和OKT3。
免疫调节核酸及其相关组合物
在一个方面，本发明的免疫调节核酸含有下列核心六聚体：
5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’
或
5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’
其中X和Y是天然产生的或合成的任意核苷酸，但是X和Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。
IMS的核心六聚体在本文中是指含二核苷酸基序的免疫调节序列，其5’和/或3’可以是任意组合物或任意数量的核苷酸或核苷。免疫调节核酸所包含的免疫调节基序优选6到100个碱基对的寡核苷酸，最优选的是16-50个碱基对的寡核苷酸。免疫调节序列还可以作为含100到100,000个碱基对的大片段DNA的一部分。IMS可被插入到DNA质粒、病毒载体和基因组DNA中，或者是其中的一部分。免疫调节核酸的长度范围为6到10,000个碱基对或者更长。六聚体核心两侧的序列可以加以构建以使其与已知的免疫调节序列两侧的序列相匹配。例如，具有序列TGACTGTG-嘌呤-嘧啶-X-Y-嘧啶-嘧啶-AGAGATGA的IMS含有侧翼序列TGACTGTG和AGAGATGA。其他优选的侧翼序列掺有一系列嘧啶核苷酸(C、T和U)，或者是单个嘧啶核苷酸重复2次或多次，或者是2个或多个不同嘧啶核苷酸混合物。抑制性调节序列可用不同侧翼序列来检测。抑制性核酸侧翼序列的其他例子见如下的参考文献：美国专利Nos.6,225,292和6,339,068；Zeuner 等，Arthritis and Rheumatism，46：2219-24，2002。
本发明的特定IMS含有如下六聚体序列：
1.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含有GG二核苷酸核心：GTGGTT、ATGGTT、GCGGTT、ACGGTT、GTGGCT、ATGGCT、GCGGCT、ACGGCT、GTGGTC、ATGGTC、GCGGTC、ACGGTC等；
2.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含有GC二核苷酸核心：GTGCTT、ATGCTT、GCGCTT、ACGCTT、GTGCCT、ATGCCT、GCGCCT、ACGCCT、GTGCTC、ATGCTC、GCGCTC、ACGCTC等；
3.鸟嘌呤核苷酸和肌苷替代腺嘌呤核苷酸和/或鸟嘧啶核苷酸替代胞嘧啶核苷酸或胸腺嘧啶核苷酸，这些替代可按照上述的指导原则来进行。
上面所描述的免疫抑制序列或IIS能够抑制含核心二核苷酸CpG的免疫刺激序列(ISS)的活性，美国专利6,225,292。本发明首次发现在无ISS的情况下这种IIS可单独或与DNA多核苷酸一起预防和治疗自身免疫性疾病。这种IIS含有带序列AAGGTT的核心六聚体区。那种序列在本文中是指免疫调节序列或IMS。具有与本发明的IMS相似的基序的其他相关IIS有：
1.5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含GG二核苷酸核心：GGGGTT、AGGGTT、GAGGTT、AAGGTT、GGGGCT、AGGGCT、GAGGCT、AAGGCT、GGGGTC、AGGGTC、GAGGTC、AAGGTC等；
2.5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMS，含GC二核苷酸核心：GGGCTT、AGGCTT、GAGCTT、AAGCTT、GGGCCT、AGGCCT、GAGCCT、AAGCCT、GGGCTC、AGGCTC、GAGCTC、AAGCTC等；
3.鸟嘌呤核苷酸和肌苷替代腺嘌呤核苷酸和/或鸟嘧啶核苷酸替代胞嘧啶核苷酸或胸腺嘧啶核苷酸，这些替代可按照上述的指导原则来进行。
在本发明的某些实施方式中，IMS的核心六聚体区的5’端或3’端，或者是两端有聚鸟苷酸区。“聚鸟苷酸区”或“聚鸟苷酸基序”用于本文中是指至少由两个连续鸟嘌呤碱基组成的核酸区，通常是2到30或2到20个连续鸟嘌呤碱基。在某些实施方式中，聚鸟苷酸区含有2到10个、4到10个、或4到8个连续鸟嘌呤碱基，在某些优选实施方式中，侧翼聚鸟苷酸区与核心六聚体相连接。在其他的实施方式中，聚鸟苷酸区通过一个非聚鸟苷酸区(非聚鸟苷酸连接子)与核心六聚体相连；一般来说，非聚鸟苷酸连接子的长度不超过6个核苷酸，更常见的是不超过4个，最常见的是不超过2个核苷酸。
免疫调节核酸可从已有的核酸资源中获得，如基因组DNA、病毒DNA和cDNA。在某些优选实施方式中，免疫调节核酸是通过寡核苷酸合成技术合成的寡核苷酸。IMS可以是单链或双链DNA、RNA和/或寡核苷酸的一部分。
免疫调节核酸优选含有一个或多个IMS区的核酸，其中的IMS含有未甲基化的GpG寡核苷酸。在其他的实施方式中，IMS区的一个或多个腺嘌呤或胞嘧啶残基是甲基化的，对于真核细胞来说，胞嘧啶残基和腺嘌呤残基通常都是被甲基化的。
免疫调节核酸可以是经过稳定化处理和/或未经过稳定化处理的寡核苷酸。经过稳定化处理的寡核苷酸意味着寡核苷酸对体内的外切核酸酶、内切核酸酶和其他降解途径的降解是耐受的。优选的经稳定化处理的寡核苷酸含有被修饰的磷酸骨架，最优选的寡核苷酸含有硫代磷酸酯化的磷酸骨架，其中至少有一个磷酸氧被硫取代。骨架上的磷酸基团被修饰，包括甲基磷酸化，硫代磷酸酯化、氨基磷酸酯化和二硫代磷酸酯化内核苷酸连接可为BVIS提供抗微生物特性。免疫调节核酸优选经过稳定化处理的寡核苷酸，最好通过硫代磷酸酯化对寡核苷酸进行稳定化处理。
其他稳定化处理寡核苷酸的方法包括：烷基磷酸三酯化和磷酸二酯化，其中带正电荷的氧是烷基化的；芳基磷酸化和烷基磷酸化，这是非离子型的DNA类似物，其中带正电荷的磷酸氧被芳基或烷基取代；或/和在一个或两个末端带有六乙二醇或四乙二醇或其他二醇的寡核苷酸。其他steric结构可用于将糖基连接到IMS区的核苷碱基上。
两侧为修饰二核苷酸的IMS区的核苷酸碱基可以是已知的天然碱基，也可以是合成的非天然碱基。可以利用常规技术将寡核苷酸插入到IMS-ON的内部和/或两端作为连接点，即作为连接或粘附其他分子如化合物，其中包括自身分子的方式，或作为添加其他免疫调节因子的连接点。EVIS-ON的碱基、糖基、磷酸基和末端还可以通过本领域技术人员熟知的方法加以修饰以构建出具有除调节活性之外的其他特性的EVIS-ON。例如，可将糖基连接到任何steric构型的EVIS-ON的核苷酸碱基上。
修饰寡核苷酸的磷酸基团的方法是本领域所熟知的，因此不需要进行详细的解释。其中一种适用的技术是对靶寡核苷酸产物进行中间磷酸三酯化，然后在碘水溶液或其他试剂如无水胺中氧化成天然的磷酸二酯。所得到的寡核苷酸氨基磷酸酯用硫处理生成硫代磷酸酯。可用与此相似的技术(硫处理步骤出外)将甲基磷酸酯制备成甲基氨基磷酸酯。要了解磷酸基团修饰技术的细节，本领域的技术人员可以参考美国专利Nos.4,425,732；4,458,066；5,218,103和5,453,496，以及Tetrahedron，Lett，21：414925(1995)，7：5575(1986)，25：1437(1984)和Journal Am.ChemSoc，93：6657(1987)，这些文献披露的内容都已纳入本文用于说明本领域有关免疫调节核酸的组合物和制备方法的技术水平。
一种特别有用的磷酸基团修饰方法是将EVIS-ON寡核苷酸转化成硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的形式。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯形式的寡核苷酸比其未修饰的形式更耐受体内的降解，因此本发明的EVIS-ON更适合宿主。
EVIS-ON可用本领域熟知的技术和核酸合成设备来合成。这方面的参考文献有Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology，第2章和第4章(WileyInterscience，1989)；Maniatis 等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Lab.，New York，1982)；美国专利No.4,458,066和No.4,650,675。这些文献都已被纳入本文中用于说明本领域制备合成的寡核苷酸的水平。
另外，EVIS-ON还可以通过突变游离的微生物ISS-ODN来获得，其中的突变是用竞争性的二核苷酸来替代天然的CpG基序和侧翼核苷酸。通过核酸杂交技术进行筛选有可能从任何生物中分离出任何多核苷酸序列，只要有合适的探针或抗体。如果需要研究一种蛋白，则可以通过化学合成方法合成编码该蛋白的部分核酸序列相应的寡核苷酸探针。但是这需要事先知道该蛋白氨基酸序列的一段短的寡肽组成。编码蛋白质的DNA序列也可以根据遗传密码规则推测出来，但是需要考虑密码子的简并性。
例如，可以筛选怀疑含有携带ISS的多核苷酸的cDNA文库，筛选过程如下：将cDNA来源的各种mRNA注射到卵母细胞内，培养足够的时间使cDNA基因产物得以表达，然后检测目的cDNA表达产物是否存在，例如用目的多核苷酸编码的肽的抗体，或者用探针检测目的多核苷酸编码的肽的重复基序和组织表达模式特征。另外，还可以间接筛选cDNA文库来分析目的肽的表达，其中的肽至少含有一个表位，筛选所用的是该表位的特异性抗体。这种抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，用于检测表达产物来判断目的cDNA是否存在。
一旦获得了含ISS的多核苷酸就可以利用常规技术通过酶消化方法将其剪切到所需要的长度。然后突变ISS-ODN寡核苷酸产物内的CpG基序，取代成“抑制性”的二核苷酸，这种抑制性的二核苷酸是用本发明的方法鉴定的。在已知序列的DNA的特定位点上进行替代突变的方法是本领域熟知的，如通过PCR进行M13引物突变。由于IMS是非编码序列，因此在进行替代突变时不需要考虑如何维持开放阅读框架的问题。但是，当用于体内时，ISS-ODN寡核酸中间体或IMS突变产物应该是相当纯的(即无天然污染物和LPS，利用本领域现有的技术通过本领域技术人员的选择可以做到这一点)。
本发明的免疫调节序列可以包含独立的DVIS，DVIS也可以顺式或反式的方式和其他核酸区一起插入到重组自身载体(质粒，粘粒、病毒或逆转录病毒)内，这些重组表达载体可以编码任何自身蛋白、自身多肽或自身肽。在某些实施方式中，EVIS不需要插入到载体内就可以直接注射。而在另外一些实施方式中，EVIS被插入到载体如表达载体内，这可以利用本领域技术人员所熟知的常规技术来完成(见Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，同上)。
例如，构建重组表达载体可以利用标准的连接技术。为了确定所构建的载体内的序列是正确的，可以将连接混合物转化宿主细胞，通过适当的抗生素耐药性来筛选成功的转化子。从转化子中提取载体，利用限制性内切酶消化和/或测序来分析所提取的载体，如Messing 等，Nucleic Acids Res.，9：309，1981描述的方法，Maxam等，Methods in Enzymology，65：499，1980描述的方法，或本领域技术人员熟知的其他适宜方法。利用常规的凝胶电泳技术根据裂解片段的大小来分开裂解的片段。见Maniatis 等，Molecular Cloning，133-134页，1982的描述。
宿主细胞可用本发明的表达载体转化，然后用常规的营养培养基培养，其中的培养基可加以适当调整以诱导启动子、筛选转化子或扩增基因。培养条件如温度、pH等都是宿主细胞以前筛选表达时所用的，也是本领域技术人员所熟知的。
如果用重组载体作为本发明的EVIS-ON的载体，质粒和粘粒是特别优选的，因为它们没有致病性。但是，质粒和粘粒在体内的降解速度比病毒快，因此不适于传递适当剂量的EVIS-ON来预防或治疗炎性疾病或自身免疫性疾病。
在一个相关的方面，本发明提供了一种核酸载体，其中结构式5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’中的一个或多个CpG二核苷酸被非CpG二核苷酸替代，这样载体的IIS相关的免疫刺激活性下降。这种载体可用于使用免疫调节核酸的方法和/或使用编码一个或多个自身蛋白、自身多肽或自身肽的自身载体的方法。例如，CpG二核苷酸中的胞嘧啶可用鸟嘌呤替代，得到一个含结构式5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’中的GpG基序的IMS区。胞嘧啶还可用其他任何非胞嘧啶核苷酸来替代。替代可用位点特异性突变技术来实现。一般来说，被替代的CpG基序是那些定位在载体重要调控区(如启动子区)外的CpG。另外，如果将位于表达载体的编码区内的CpG进行非胞嘧啶替代，则一般是为了产生静默突变，或者生成编码氨基酸保守替代相应的密码子。
例如，在某些实施方式中，提供了经改造的pVAX1载体，其中通式5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’的一个或多个CpG二核苷酸通过用非胞嘧啶核苷酸替代CpG二核苷酸中的胞嘧啶而被突变。PVAX1载体是本领域熟知的，可从Invitrogen(Carlsbad，CA)购买到。在一个典型的实施方式中，经改造的pVAX1载体在CpG基序内有如下的胞嘧啶到非胞嘧啶的替代：
在784、1161、1218和1966位核苷酸上胞嘧啶取代成鸟嘌呤；
在1264、1337、1829、1874、1940和1997位核苷酸上胞嘧啶取代成腺嘌呤；以及
在1963和1987位核苷酸上胞嘧啶取代成胸腺嘧啶；
另外在1831、1876、1942和1999位核苷酸上也有胞嘧啶到鸟嘌呤的替代。(上述核苷酸位数是根据Invitrogen提供的pVAX1载体的计数系统来确定的)(见下面的实施例3)。
EVIS的功能特性
有几个机制可解释EVIS的免疫调节特性，其中包括不依赖于ISS(CpG)介导的免疫刺激的机制。
“免疫反应的调节、调节或改变免疫反应”用于本文中是指已有的或潜在的抗自身分子免疫反应的任何变化，其中的自身分子包括而不限于作为给予免疫调节序列后的结果而产生的核酸、脂质、磷脂、多糖、自身蛋白、自身多肽、自身肽、蛋白复合体、核糖核蛋白复合体或其衍生物。这种调节包括参与或能参与免疫反应的任何免疫细胞存在与否、其活性或能力的改变。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、NK T细胞、专职抗原呈递细胞、非专职抗原呈递细胞、炎症细胞以及能参与或影响免疫反应的其他任何细胞。调节还包括能对已发生的免疫反应、正在发生的免疫反应、潜在的免疫反应产生影响的任何改变，或者诱导、调节、影响或回应免疫反应的能力。调节还包括作为免疫反应一部分的免疫细胞内的基因、蛋白和/或其他分子表达和/或功能的改变。
免疫反应的调节包括而不限于：清除、缺失或隔离免疫细胞；诱导或产生能调节其他细胞如自身反应性淋巴细胞、APC或炎症细胞的功能活性的免疫细胞；诱导免疫细胞进入未反应状态，术语称为无反应性；提高、降低或改变免疫细胞的功能或活性，或者提高、降低或改变其发挥活性或功能的能力，其中包括而不限于改变这些细胞所表达蛋白的表达模式。其中包括改变某类分子的产生和/或分泌，如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子或其他细胞表面受体；或者上述调节事件的任意组合。
免疫反应的特征是辅助T细胞和免疫反应产生细胞因子如IL-2和IFN-γ，并且与产生某些同型抗体的(一般来说在鼠体内为IgG1，在人体内为IgG2和IgG4)B细胞有关。Th1型免疫反应主要发生在自身免疫性疾病中，并且与自身免疫介导的组织损伤有关。而Th2型免疫反应的特征是辅助T细胞和免疫反应产生细胞因子如IL-4和IL-10，并且与产生某些同型抗体的(一般来说在鼠体内为IgG1，在人体内为IgG2和IgG4)B细胞有关。Th2型免疫反应在啮齿类动物和人的自身免疫中可产生抗自身免疫介导的组织损伤的保护作用。
免疫调节核酸可通过清除、隔离或反转介导或能够介导非期望免疫反应的免疫细胞；诱导、产生或转变成介导或能够介导保护性免疫反应的免疫细胞；改变免疫细胞的生理或功能特性(如抑制Th1型反应和/或诱导Th2型反应)；或者上述效应的结合来调节免疫反应。免疫反应调节的检测方法包括而不限于检测是否存在免疫细胞群(利用流式细胞术、免疫组化、组织学、电镜、聚合酶链式反应)；检测免疫细胞的功能活性，包括受到刺激信号的刺激后能够增殖或分裂，或者耐受刺激信号的刺激(如用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、PMA、载肽或蛋白抗原的抗原呈递细胞刺激后根据3H胸腺嘧啶核苷掺入的情况进行T细胞增殖试验和肽扫描分析；B细胞增殖试验)；测定杀伤或溶解其他细胞的能力(如细胞毒T细胞试验)；测定细胞表达的细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和其他产物(流式细胞术、酶联免疫吸附试验、蛋白质印迹分析、蛋白质芯片技术、免疫沉淀试验)；测定免疫细胞活化后的生物化学标记物或免疫细胞内的信号传导通路分子(蛋白质印迹杂交试验和免疫沉淀试验分析酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化、多肽的裂解和蛋白复合体的形成与解离、蛋白芯片分析、利用DNA芯片或消减杂交技术分析DNA的转录模式)；测定细胞由于调亡、坏死或其他机制造成的死亡(膜联蛋白V染色、TUNEL分析、凝胶电泳测定DNA梯型、组织学检测、荧光发生级联分析、级联反应底物的蛋白质印迹分析)；检测免疫细胞表达的基因、蛋白质和其他分子(RNA印迹杂交、聚合酶链式反应、DNA芯片、蛋白质芯片、二维电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附试验、流式细胞术)；以及观察临床结果如自身免疫性疾病、神经变性性疾病和其他疾病症状的改善(临床评分、是否需要其他治疗措施、功能状态、影像学检查)。
另外一些研究者进行了一些试验来评价IIS的作用机制。试验结果表明中和性或抑制性IIS(GpG)基序可阻断ISS(CpG)的免疫刺激作用(Krieg 等，PNAS，95：12631，1998；美国专利6,225,292和6,339,068)。这些试验中的IIS被用于接触、抑制、竞争或克服ISS的效应(来源于细菌、病毒、寄生虫和外源DNA，如DNA疫苗或基因治疗所用的DNA)。ISS和IIS可进入同一细胞内，说明在同一细胞内IIS通过相同机制与ISS直接竞争来抑制ISS(Yamada 等，J.Immunology，2002，169：5590)。
给药方法
免疫调节分子可制备成含药学上可接受的载体的组合物。可与本发明的免疫调节核酸一起使用的优选药学上可接受的载体包括水性溶液或非水性溶液、悬液和乳化液。非水性溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、蔬菜油如橄榄油、以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇水溶液、乳化液或悬液，其中包括盐水和缓冲介质。胃肠外途径给药的载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠溶液、乳酸盐林格溶液或脂肪油。静脉注射用载体包括液体和营养补充剂、电介质补充剂(如以林格葡萄糖为基础制成的补充剂)等。还可以添加防腐剂和其他添加剂，如抗生素、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。免疫调节核酸还可以用本领域熟知的方法冻干以便于随后按照本发明的方法重新恢复和使用。免疫调节序列还可以混合到药物组合物中，组合物中含有多拷贝的单一IMS、不同DVIS的混合物、等摩尔浓度的不同DVIS的混合物、不同摩尔浓度的EVIS混合物、或单一的和/或不同的EVIS，其中EVIS插入到重组表达载体内，如质粒、线性多核苷酸、病毒和病毒载体、细菌和其他活的、灭活的或合成的含寡核苷酸的组合物。
本发明的免疫调节序列可制备成药用盐的形式。免疫调节核苷酸可用无毒的无机或有机碱制备。有机碱盐包括钠盐、钾盐、锌盐、钙盐、铝盐、镁盐等。有机无毒碱包括伯、仲、叔胺的盐。这种免疫调节核酸可制成冻干的形式以便于在使用前重新恢复，如用无菌水或盐溶液溶解。另外，免疫调节序列可用水性载体或油性载体制备成溶液、悬液或乳化液以便于转移。免疫调节序列可冻干，然后在使用前用无菌水溶解。
正如本领域技术人员所熟知的，现在有很多方法可用于将核酸转移到受体内。在某些实施方式中，免疫调节核酸以裸核酸的形式给药。例如，在某些实施方式中，使用前裸核酸与病毒颗粒(如腺病毒颗粒，见Curiel 等，Am.J.Respir.CellMol.Biol，6：247-52，1992，同上)混合成含病毒颗粒的制剂，其中的病毒颗粒并不包裹核酸但是可以促进核酸的转移。另外，在其他的实施方式中，免疫调节核酸用分子包裹或者与分子结合形成复合物，如阳离子物质(如DEAE右旋糖酐或阳离子脂质)。例如，脂质体就是一种制备和转移寡核苷酸和/或自身多核苷酸的有效载体。在其他特殊实施方式中，免疫调节核酸被插入到病毒载体、病毒颗粒或细菌内以便于药理转运。病毒载体可以是具有完整感染性的，也可以是减毒的(经突变后诱导疾病的能力下降)或复制缺陷型的。在其他的实施方式中，核酸与固相支持物相连接，如金颗粒、多糖支持物，或者可注射、吸入或颗粒打靶(弹道转移)转移的其他颗粒或微球。
转移核酸制剂的方法是本领域熟知的。见美国专利Nos.5,399,346、5,580,859、5,589,466。现在已经开发出了多种病毒系统用于将核酸转移到哺乳动物细胞内。例如逆转录病毒系统(美国专利No.5,219,740)；(Miller 等，Biotechniques，7：980-990，1989)；(Miller，AD.，Human Gene Therapy，1：5-14，1990)；(Scarpa等，Virology，180：849-852，1991)；(Burns 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8033-8037，1993)和(Boris-Lawrie和Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.，3：102-109，1993)。文献中还描述了多种腺病毒载体，见(Haj-Ahmad 等，J.Virol，57：267-27’4，1986)；(Bett 等，J.Virol，67：5911-5921，1993)；(Mittereder 等，Human Gene Therapy，5：717-729，1994)；(Seth 等，J.Virol，68：933-940，1994)；(Ban 等，Gene Therapy，1：51-58，1994)；(Berkner，K.L.，BioTechniques，6：616-629，1988)和(Rich 等，Human Gene Therapy，4：461-476，1993)。腺相关病毒(AAV)载体系统也被开发出来用于转移核酸。AAV载体利用本领域所熟知的方法很容易构建。见美国专利Nos.5,173,414和5,139,941；国际专利WO 92/01070(公开日为1992年1月23日)和WO 93/03769(公开日为1993年4月4日)；(Lebkowski 等，Molec.Cell.Biol，.8：3988-3996，1988)；(Vincent等，Vaccines，90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)1990)；(Carter，B.J.，Current Opinion inBiotechnology，3：533-539，1992)；(Muzyczka，N.，Current Topics in MicrobiotAnd Immunol.，158：97-129，1992)；(Kotin，R.M.，Human Gene Therapy，5：793-801，1994)；Shelling 等，Gene Therapy，1：165-169，1994)和(Zhouetf 等，J.Exp.Med.，179：1867-1875，1994)。
本发明的IMS不用载体也可以转移。例如，在转移前可将分子包裹在脂质体内。脂质包裹通常是用能稳定结合或纳入并保留核酸的脂质体。使用脂质体作为载体转移核酸的方法见如下文献的描述：(Hug 等，Biochim.Biophys.Acta.，1097：1-17，1991)；(Straubinger 等，Methods of Enzymology，Vol.101，pp.512-527，1983)。例如，可用于本发明的脂质体包括而不限于DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、胆固醇和CUDMEDA(N-(5-cholestrum-3-ol 3 urethanyl)-N’，N’-二甲基乙二胺)。例如，DNA可混合在含下列阳离子脂质体的溶液中使用：LipofectinTM(LTI/BRL)、TransfastTM(Promega Corp)、Tfx50TM(Promega Corp)、Tfx 10TM(Promega Corp)或Tfx20TM(Promega Corp)。
根据本发明的说明给予“治疗有效量”的免疫调节核酸足以治疗或预防疾病，比如疾病症状和/或病因的减轻或消失。例如，治疗有效量落在一个很宽的范围内，可以通过临床试验加以确定，对于特定病人来说，要根据普通临床医生所熟知的因素如疾病的严重程度、受试者的体重、年龄和其他因素来确定治疗有效量。免疫调节核酸的治疗有效量范围约在0.001mg到1g之间。免疫调节核酸的优选治疗剂量约为5mg到1000mg之间。更优选的范围约为50到200mg。免疫调节核酸治疗可以每天一次、隔天一次、每周两次、每周一次、两周一次或每月一次连续进行。如果免疫调节核酸治疗和编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸治疗一起进行，那么治疗方案可以先执行不同的时间，如6-12个月，然后再以维持剂量3-12个月治疗一次。根据疾病的严重程度、受试者的年龄、使用的编码自身蛋白、自身多肽、自身肽的寡核苷酸和/或多核苷酸以及普通医师所考虑的其他因素，还可以采用其他治疗方案。
在一个实施方式中，免疫调节核酸通过肌肉注射转移。在另一个实施方式中，免疫调节核酸通过鼻内吸入、口服、皮下注射、真皮内注射、静脉注射、皮肤加压、眼内、关节内、阴道内、直肠内、粘膜给药或者粘附到金颗粒上给药，或者透过真皮给药(见WO 97/46253)。另外，核酸还可以通过局部涂抹转移到皮肤细胞内，混合或不混合脂质体或阳离子脂质(美国专利No.6,087,341)。另外一种给药方法是将核酸制成可吸入的制剂。在联合治疗的情况下，免疫调节核酸和编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的多核苷酸可在同一部位或不同部位、同时或不同时给药。
在给予免疫调节核酸前，给药部位可用bupivicane、心脏毒素或其他药物预处理以提高随后进行的多核苷酸的转移效率。这种预处理一般在转移多核苷酸前12到96小时进行，优选在转移免疫调节核酸前24到48小时进行。另外，在进行IMS治疗前也可以不进行预处理。
免疫调节核酸和/或含有编码自身蛋白、自身多肽、自身肽的多核苷酸的自身载体可以和其他物质，如药物、佐剂、细胞因子、自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白、DNA药物一起给药，或者和编码细胞因子的载体一起给药。
在其他的实施方式中，免疫调节核酸可以和其他的疗法一起使用。这种疗法包括和自身分子一起使用的免疫调节核酸，自身分子包括而不限于编码自身分子的DNA，例如在多核苷酸治疗的情况下(见公开号为20030148983的美国专利申请)，或者和自身脂质、自身蛋白、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身多糖、自身糖蛋白以及经过翻译后修饰的自身蛋白、自身肽、自身多肽或自身糖蛋白，或用于治疗自身免疫性疾病的其他治疗性化合物一起使用的免疫调节核酸。
通过参考下面对说明性实施方式的描述可以对本发明有进一步的了解。
实施例1：
确定前期研究的结果：IMS可抑制ISS诱导的淋巴细胞活化和预防实验性自身免疫性脑髓炎的发生
利用一系列的试验来确证以前的研究结果，即IMS可抑制含ISS(CpG)的序列的刺激作用。这些试验如下所述：
已知刺激性CpG-ODN可活化脾来源的免疫细胞，其中包括树突状细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞(见Krieg 等，Nature，374：546-549，1995；Yi 等，J.Immunol，157：5394-5402，1996；Klinman 等，Proc Nat.Acad.Sci.USA，93：2879-2883，1996；Martin-Orozco 等，Int.Immunol.，11：1111-1118，1999；Sparwasser 等，Eur.J.Immunol，28-2045-2054，1998)。通过测定空白脾细胞的总体增殖情况来评价IMS的效应。我们构建了含单一5’-AACGTT-3’(CpG-ODN)或IMS 5’-AAGGTT-3’序列和硫代硫酸酯骨架以保护DNA免受核酸酶降解的22-mer寡核苷酸序列。为了确定添加IMS是否可以抵消刺激性CpG-ODN的效应，分离的空白全脾细胞单独用5μg/ml刺激性CpG-ODN培养，并用5μg/ml刺激性CpG-ODN和浓度逐渐增加的IMS培养。48小时后，加入1μg/ml IMS的全脾细胞增殖能力下降2倍，而加入5μg/ml和10μg/ml IMS的全脾细胞增殖能力下降3倍(图1A)。
TLR-9已被证明可识别细菌DNA CpG基序(Hemmi 等，Nature，408：740-745，2000)。为了确定这种简单的C-G颠换是否可以改变其识别作用，从TLR-9野生型(WT)和TRL-9敲除型(KO)小鼠中分离出空白全脾细胞，用CpG-ODN、IMS和二者联合培养。作为独立的对照，加入脂多糖(LPS)以证明TLR-9KO脾细胞依然能够对非特异性的丝裂原刺激作出反应而发生增殖。加入刺激性CpG-ODN可诱导出很强的增殖反应，但是加入IMS后这种增殖反应被明显抑制(图1B)。与单独的LPS刺激相比，用LPS和刺激性CpG-ODN联合刺激可增强脾细胞的增殖能力。但是，即使加入LPS，IMS的调节效应依然是显著的。
由于TLR-9 KO脾细胞缺失TLR-9受体，因此与TLR-9野生型脾细胞相比，CpG-ODN对其的增殖刺激效应消失。同样，TLR-9 KO脾细胞对IMS的刺激也没有反应。如果将LPS加入到TLR-9 KO脾细胞培养基中，与TLR-9野生型脾细胞相比，IMS单独或与刺激性CpG-ODN联合都不能影响脾细胞的增殖反应。这说明IMS可能是通过TLR-9信号传导途径来抑制刺激性CpG-ODN的效应。
TLR-9识别刺激性CpG-ODN后诱导细胞信号传导途径激活，最后导致NF-КB活化(Krieg，Ann.Rev.Immunol.，20：709-760，2002)。为了说明IMS对刺激性CpG-ODN的作用机制，研究了NF-κB对IκB-α在32位丝氨酸位点上发生磷酸化的影响。用如图所示的寡核苷酸活化脾细胞，其提取物进行蛋白质印迹分析以确定通过刺激性CpG-ODN的作用可使IκB-α在32位丝氨酸上发生磷酸化(图1C，2道)。相应的，IMS不能诱导IκB-α在32位丝氨酸上发生磷酸化(图1C，3道)。令人感兴趣的是，刺激性CpG-ODN和IMS联合可导致IκB-α在32位丝氨酸上磷酸化水平的显著下降(图1C，5道)。这些结果说明IMS发挥作用的作用机制是与刺激性CpG-ODN竞争TLR-9信号传导途径成分的识别与结合。
以前的研究表明CpG-ODN可增加MHC II类分子的表达水平(Martin-Orozco 等，Int.Immunol，11：1111-1118，1999)。为了定量测定MHC II类分子mRNA的相对浓度，用定量PCR(QPCR)扩增全脾细胞培养物纯化出的RNA。信号强度根据β肌动蛋白mRNA的量进行标准化处理。与CpG-ODN孵育的脾细胞其MHC II类分子mRNA表达水平升高，而与IMS孵育的脾细胞没有出现这种变化(图2A)。通过荧光活化细胞扫描(FACScan)分析发现IMS可下调细胞表面MHC II类分子的表达。IMS可以剂量依赖的方式抑制刺激性CpG-ODN对细胞表面MHC II类分子表达的活化(图2B)。
为了确定IMS是否可以抑制抗原呈递细胞(APC)的活化，还检测了APC的各种表面活化标记分子。空白脾细胞与如图所示浓度的抑制性、刺激性或无关对照寡核苷酸共孵育72小时，FACScan分析表明IMS可以剂量依赖的方式抑制刺激性CpG-ODN诱导的细胞表面CD40(图2C)、CD80(图2D)和CD86(图2E)的表达。与此相反的是，IMS可以剂量依赖的方式增加糖脂呈递分子CD1d的表达(图2F)。
为了全面了解免疫调节寡核苷酸对免疫细胞产生细胞因子的影响，从动物体内取出空白脾细胞，与如图所示浓度的IMS、刺激性CpG-ODN或无关对照寡核苷酸共孵育72小时，结果表明单独的IMS不能诱导IL-6(图3A)和IL12p40(图3B)的产生，但是与刺激性CpG-ODN联合时却可以剂量依赖的方式抑制细胞因子的产生。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种Th1介导的多发性硬化症动物疾病模型。诱导EAE动物中枢神经系统的炎症可导致白质炎症性浸润和脱髓鞘化而造成上行性麻痹。诱导EAE需要用髓鞘抗原或髓鞘肽加完全弗氏佐剂免疫动物，弗氏佐剂中含有热灭活的分支杆菌。
然后我们又研究了体内注射IMS来预防EAE的方法。用含在CFA中的PLP1139-151肽皮下注射免疫SJL/J小鼠，诱导EAE。同时腹腔注射单次剂量的如图所示的寡核苷酸，其中寡核苷酸悬浮于磷酸盐缓冲液中。结果表明与PBS和刺激性CpG-ODN相比，小鼠单次注射抑制性IMS就可以使疾病的严重程度全面减轻(图4)。
实施例2：
在无ISS(CpG)的情况下，IMS可调节保护性Th2细胞、抑制自身免疫性Th1细胞、以及防止实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生。
因为试验已经证明IMS可抑制空白的非定向髓鞘特异性T细胞，因此我们进一步研究了在存在或不存在CpG-ODN的情况下IMS对定向的Th1或Th2细胞是否有不同效应。刺激性CpG-ODN促进PLP139-151特异性Th1细胞系的增殖，而IMS抑制它的增殖(图5A)。IMS和刺激性CpG-ODN联合与单独的CpG-ODN相比其促进PLP139-151特异性Th1细胞系增殖的活性下降。
利用PLP139-151特异性Th2细胞系进行了同样的试验。刺激性CpG-ODN可抑制PLP139-151特异性Th2细胞系的增殖(图5B)。令人惊奇的是，IMS可促进Th2细胞系的增殖。因此，CpG-ODN可作为PLP139-151特异性Th2细胞系的抑制因子，而单独的IMS，即在没有ISS的情况下，可调节PLP139-151特异性的Th2细胞。总之，这些未预料到的结果表明了本发明的IMS可抑制自身免疫性Th1细胞，增强Th2细胞的保护功能，并且不依赖于ISS-ODN(CpG)。
在用含在CFA中的PLP139-151诱导EAE前14天和7天给予SJL小鼠IMS。这种处理可在无任何ISS的情况下将IMS导入到免疫系统中达2周。与未处理组相比，用IMS处理小鼠可延迟发病时间，全面降低疾病的严重程度(图6)。
实施例3：
利用GpG修饰的质粒载体进行多核苷酸治疗
基于IMS寡核苷酸的试验结果证明GpG序列有助于减轻疾病的严重程度、使自身反应性T细胞群向Th2亚型转变，因此我们构建了一个在载体骨架内插入有GpG序列的经改造的载体。我们以pVAX1载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)为基础开始构建，这是一个在我们的EAE试验中被广泛应用的质粒载体，符合用于人体的所有要求。然后我们检测了CpG基序与已知的具有免疫刺激作用的人CpG基序，即Pu-Py-C-G-Py-Py一致的载体。我们发现pVAX1的一条链上有16个这样的CpG基序。我们利用位点特异性突变技术修饰了这些位点中的12个，见表1。其余CpG位点由于位于载体的重要调控区内，因此未作修饰。在可能的位点上将CpG基序中的C突变成G以匹配IMS寡核苷酸中GpG寡核苷酸序列的相应基序。12个被修饰位点中有4个是这样的修饰。其他的8个位点不是修饰成GpG，而是通过同样的方式将CpG中的C转变成A或T。以这种方式可将潜在的具有Th1免疫刺激性的CpG基序去掉。构建出的载体被命名为pBHT1。
表2
pBHT1载体内序列发生突变的位点以及核苷酸改变的类型
  位点*  784   1161   1218   1264   1337   1829   1874   1940   1963   1966   1987   1997
  非编码区  是   是   是   否   否   否   否   否   否   否   否   否
  编码区  否   否   否   Kan   Kan   Kan   Kan   Kan   Kan   Kan   Kan   Kan
  C到G  是   是   是   否   否   否   否   否   否   是   否   否
  C到A  否   否   否   是   是   否   否   否   否   否   否   否
  C到T  否   否   否   否   否   否   否   否   否   否   否   否
  CGC到AGG  否   否   否   否   否   是   是   是   否   否   否   否
*编号系统是基于Invitrogen的pVAX1序列的原始编号系统
通过体外试验来分析pBHT1载体与未修饰的pVAX1载体相比其免疫刺激活性是否明显降低。试验用的是SJL/J小鼠来源的新鲜全脾细胞作为免疫细胞。使用全脾细胞是因为已知刺激性CpG寡核苷酸能够活化脾来源的免疫细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。体外分析试验包括增殖试验、FACS分析和ELISA分析细胞因子的产生。以CpG寡核苷酸作为免疫活化的对照，以GpG IMS寡核苷酸作为免疫抑制的对照。
在对照试验中，分离出的脾细胞与10μg/ml的CpG寡核苷酸或GpG IMS寡核苷酸共孵育24小时测定增殖效应。另外，脾细胞与三种不同浓度的图7所示的pVAX1空载体或pBHT1空载体共孵育24小时。如刺激指数所显示，与pBHT1载体相比，各浓度的pVAX1载体都有很高的增殖刺激效应。虽然刺激的幅度较小(可能因为给定浓度的寡核苷酸中刺激序列的克分子量比质粒中的高)，但是所得到的趋势是刺激作用与两种寡核苷酸所观察到结果是相关的。即，GpG IMS的刺激作用很弱，pBHT1载体的刺激作用也很弱。
为了确定GpG IMS寡核苷酸是否能够抑制抗原呈递细胞(APC)的活化，检测了APC活化标记分子CD16/32在细胞表面表达的情况。空白脾细胞与10μg/ml的CpG寡核苷酸或GpG IMS寡核苷酸共孵育48小时。收获细胞，通过FACScan分析CD16/32分子的表达。CpG寡核苷酸可诱导CD16/32的表达升高，而免疫调节性GpG IMS寡核苷酸可将细胞表面CD16/32分子的表达水平抑制到对照的一半(图8A)。然后我们再确定经修饰的pBHT1载体是否能以同样的方式影响CD16/32的表达。同样我们观察到pBHT1载体可抑制CD16/32分子的表达，说明APC的活化被抑制(图8B)。
已知CpG寡核苷酸可通过促进多种细胞因子分泌的方式来活化免疫细胞。我们进行了如上所述的试验，其中脾细胞与CpG寡核苷酸或GpG IMS寡核苷酸共孵育如图所示的时间后，通过夹心ELISA法测定各种细胞因子的分泌情况。另外，脾细胞与pVAX1空载体或pBHT1空载体共孵育以确定经修饰的pBHT1载体对细胞因子的分泌是否有同样的影响。如图9所示，CpG寡核苷酸可诱导空白脾细胞分泌IL6、IL10和IFN-γ。但是GpG IMS寡核苷酸却不能诱导这些细胞因子的分泌。pVAX1可诱导细胞因子的分泌，而pBHT1载体没有这种效应。pBHT1在抑制IL6、IL10和IFN-γ的分泌中有一种相似的趋势。虽然pBHT1与GpG IMS相比对细胞因子的产生有一种较弱的促进作用，GpG IMS组中几乎检测不到细胞因子的分泌，但是其诱导的程度大大低于pVAX1，这可能是因为其中的CpG序列不能被修饰，依然保留在载体骨架内。事实上，我们也不想要一个完全没有免疫诱导效应的载体，因为这样的载体无法用于制备DNA疫苗以有效的方式刺激免疫系统的反应。
利用EAE模型进行体内试验来评价对多核苷酸DNA治疗的耐受情况，其中DNA用的是pBHT1载体内的自身抗原。将编码自身抗原—小鼠PLP(蛋白脂类蛋白)的DNA插入到pBHT1载体内，通过肌肉注射到SJL小鼠体内(见图10)。本文所用的模型是治疗模型而不是预防模型，其中小鼠先用含在CFA(完全弗氏佐剂)中的PLP139-151肽诱导出EAE，然后在疾病发作(第20天)后数天内随机分成几个治疗组。将50μg编码鼠PLP的pBHT1载体或50μg pBHT1空载体对照以三种不同的给药方案肌肉注射给小鼠。如图10所示，所有治疗组小鼠的EAE平均疾病得分都有下降，其中最明显的是两周一次组和四周一次组。以前有研究用非pBHT1载体进行自身抗原多核苷酸治疗，结果显示这类EAE治疗模型的复发率降低。但是，这些前期研究并没有证实治疗模型中EAE严重程度的这个指标(即平均临床得分)降低，而本发明利用pBHT1载体进行自身抗原多核苷酸治疗证明了这一点。
我们的结论是：目前pBHT1载体是一种较好的用于治疗Th1介导的自身免疫性疾病如MS的载体。因此，人源自身抗原基因也可以被克隆到pBHT1载体内用于人类疾病的多核苷酸治疗。
实施例4：
利用IMS和编码多种自身蛋白的DNA联合治疗多发性硬化症动物模型
DNA多核苷酸治疗包括利用编码髓鞘的4种主要成分MBP、MAG、MOG和PLP的全长cDNA在疾病开始发作后治疗EAE动物模型中的复发疾病。另外，在髓鞘DNA多核苷酸治疗时加上编码IL-4的DNA可以通过降低复发率使治疗的效果进一步提高。但是，尽管复发率降低，疾病的整体严重程度与对照组相比依然没有变化。
雌性SJL/J小鼠皮下注射100μg用PBS溶解、CFA乳化的PLP139-15肽进行免疫，其中CFA由IFA和0.5mg热灭活的结核分支杆菌组成。免疫后12天，即疾病开始发作时，在小鼠双侧四头肌内注射0.1ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后，在所选择小鼠的双侧四头肌内注射DNA混合物，该混合物含有编码全长鼠PLP、MAG、MOG和MBP的质粒(分别插入到pTARGET质粒(Promega Corp.Wisconsin)内，每种25μg)和50μg编码全长鼠IL-4的pTARGET质粒，质粒溶于TE内，总体积为0.2ml。DNA注射每周进行一次，共注射6周。在开始进行DNA免疫时，小鼠腹腔单独注射200μl含50μg IMS的PBS，或者同时进行DNA多核苷酸注射。IMS每两周注射一次，共注射6周。
与未处理的小鼠相比，DNA多核苷酸加编码IL-4的质粒处理的小鼠、单独IMS处理的小鼠在整个疾病过程中其平均疾病得分总体都有下降(图11)。当小鼠用DNA混合物加IL-4联合IMS治疗时，总体平均疾病得分下降的更加明显(图11)。
EAE疾病被诱导发生后57天处死小鼠，诱导出EAE后57天处死小鼠，取出每只小鼠的腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结，并将一组的淋巴混合在一起。分离出细胞用含10μg/ml PLP139-151、10％FCS的浓缩RPMI培养基培养。3天后收集细胞上清，通过夹心ELISA检测IFN-γ、IL-4和IL-10的表达情况。未处理组小鼠、单独IMS处理组小鼠以及DNA多核苷酸+IL-4处理组小鼠分泌的细胞因子是偏Th1型的，表现为IFN-γ的表达水平升高(图12)。DNA多核苷酸+IL-4联合IMS处理组小鼠分泌的细胞因子是偏Th2型的，表现为IL-4和IL-10的表达水平升高。
分离体内试验的动物的脑和脊髓进行组织学分析。小鼠灌注10％的缓冲福尔马林，然后取出脑和脊髓再用10％的缓冲福尔马林固定。石蜡包埋的样品用苏木精-伊红和罗克沙尔固蓝染料染色，Bielschowsky浸透。如表2所示，与对照组相比，IMS治疗组小鼠脑脊膜和实质内的炎症病灶总数和发生脱髓鞘的病灶数明显减少。DNA多核苷酸+IL-4治疗组的炎症病灶总数和脱髓鞘病灶数都减少。DNA多核苷酸+IL-4+IMS治疗组的炎症病灶总数和脱髓鞘病灶数进一步下降。
表3
Figure C20038010773000451
小鼠经如图11所示的处理后57天采集血清样本，利用一种新型蛋白质芯片技术分析该样本，这种技术能够大规模地鉴定疾病样本与对照样本之间髓鞘自身抗体反应特异性的模式。进行芯片试验时利用SAM鉴定和制备分级集束分析以确定抗原的特征。在图13中，DNA多核苷酸+IL-4+CpG处理组与对照组、单独IMS处理组和DNA多核苷酸+IL-4处理组相比髓鞘自身抗体的表位扩散显著升高。DNA多核苷酸+IL-4+IMS处理还可以进一步升高髓鞘自身抗体的表位扩散。
重复这个体内试验可得到相似的结果。在图14A中，在急性EAE高峰期小鼠两周一次注射50μg/ml IMS或CpG。经过57天后，IMS处理组小鼠与PBS处理组小鼠和CpG处理组小鼠相比总体平均疾病得分显著下降。在图14B中，在急性EAE高峰期小鼠每周注射一次DNA多核苷酸+IL-4、DNA多核苷酸+IL-4+CpG或DNA多核苷酸+IL-4+IMS。经过57天后，DNA多核苷酸+IL-4+CpG处理组小鼠的总体平均疾病得分与PBS处理组小鼠相似。DNA多核苷酸+IL-4处理组小鼠与PBS处理组小鼠相比总体平均疾病得分显著下降。DNA多核苷酸+IL-4+IMS处理组小鼠的总体平均疾病得分进一步下降。
实施例5：
利用IMS和编码自身蛋白胰岛素的DNA联合治疗胰岛素依赖型糖尿病
非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠可自发地产生自身免疫性糖尿病，具有多种与人胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)相似的临床、免疫学和组织病理学特征。该疾病的特征是Langerhans胰岛的炎症和β细胞的破坏，导致高血糖症和明显的糖尿病症状。CD4+和CD8+T细胞是糖尿病形成所必需的。已经鉴定了对几种自身抗原如胰岛素、IA-2和谷氨酸脱羧酶的反应性。
IMS和自身蛋白胰岛素编码DNA联合治疗开始发挥作用的时间是在侵入性胰岛炎发生过程中，但是是在IDDM完全发作之前。取7周龄的NOD/Lt雌性小鼠，在禁止随意出入的房间内饲养。在10周龄时开始用One Touch Ultra Blood GlucoseMonitoring System每周测定血糖水平(BGL)。当BGL达到200-250mg/dl时开始治疗。在15周龄时将小鼠分组。小鼠双侧四头肌内注射0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠双侧四头肌内注射50μg pVAX1载体或DNA混合物，其中的DNA混合物含有三种pVAX1载体，每种50μg，分别编码全长鼠前胰岛素原1、前胰岛素原2和IL-4，载体用PBS溶解，总体积为0.2ml。注射每周进行一次，连续4周。在开始进行DNA治疗的同时，小鼠腹腔单独注射200μl含50μg IMS的PBS，或者同时进行DNA多核苷酸治疗。IMS治疗每周一次，连续4周。
糖尿病患病百分率定义为BGL持续超过250mg/dl的小鼠所占的百分率。经过四次注射后，记录每组的小鼠存活率(图15A)。到第9周时，对照组的存活率为10％，单独IMS治疗组的存活率为20％，单纯质粒组的存活率为54％，DNA多核苷酸+IL-4组的存活率为45％，而DNA多核苷酸+IL4+IMS组的存活率为73％。当比较不同治疗组小鼠的存活时间时发现，到第29周时，单独IMS治疗组小鼠的糖尿病发病率为80.0％(图15B)，pVAX1(Invitrogen，CA)空质粒治疗组小鼠的糖尿病发病率为45.4％(p＝0.635)。自身抗原编码DNA+细胞因子IL-4+免疫调节序列治疗组小鼠的发病率只有27.3％(p＝0.0075)，而未治疗组小鼠的发病率到29周时为90％(图15B)。在这个试验中，DNA质粒通过肌肉注射，而IMS通过腹腔注射，清楚地表明DNA质粒(ISS)和IMS的靶细胞群是不同的。另外，本试验的NOD小鼠不用ISS处理。总之，这些令人惊奇的意外结果证明IMS可有效治疗自然发生的自身免疫性疾病。
这个试验添加治疗组后重复了一次，治疗过程调整为每周一次，连续8周。治疗组分别是1)PBS，2)200μg pVAX1空质粒，3)50μg IMS肌肉注射，4)pVAX1空质粒加IMS(肌肉注射)，5)DNA多核苷酸混合物，6)DNA多核苷酸加IMS(肌肉注射)，7)DNA多核苷酸加IL-4，8)DNA多核苷酸加IL-4加IMS(肌肉注射)，9)DNA多核苷酸加IL-4，腹腔再注射IMS。如图16所示，各组的存活百分率分别为1)PBS(0％)，2)pVAX1空质粒(36％)，3)IMS肌肉注射(14％)，4)pVAX1空质粒加IMS(47％)，5)DNA多核苷酸混合物(36％)，6)DNA多核苷酸加IMS(25％)，7)DNA多核苷酸加IL-4(31％)，8)DNA多核苷酸加IL-4加IMS(38％)，9)DNA多核苷酸加IL-4，腹腔再注射IMS(54％)。
实施例6：
IMS和编码全长自身蛋白II型胶原和IL4的DNA联合治疗胶原诱导的关节炎
胶原诱导的鼠关节炎(CIA)是一种类风湿关节炎(RA)模型。通过给遗传易感性的小鼠品系注射完全弗氏佐剂(CFA)乳化的全长II型胶原(CII)可诱导出RA。CII是动关节软骨的主要组成蛋白，也是RA内的主要炎症靶位(Myers 等，Life Sciences，61：1861-1878，1997)。所诱导出的重度多关节关节炎的特征是滑膜炎及软骨和骨的慢性侵蚀，在组织学上与RA相似(Courtenay 等，Nature，283(5748)：666-668，1980)。与RA一样，啮齿类动物对CIA的敏感性与特异性主要组织相容性复合物I I类分子的表达有关(Wooley 等，J.Exp.Med.，154：688-700，1981；Griffiths，Int.Rev.Immunol，4：1-15，1988)。
本试验检测了IMS联合全长自身蛋白II型胶原(CII)和IL-4编码DNA的治疗效应。20只6周龄的雄性DBA/1小鼠分组后双侧四头肌注射0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠的双侧四头肌内注射如图所示的DNA疫苗，每种50μg，在开始注射DNA进行免疫的同时腹腔注射200μl含50μg IMS的PBS。治疗组分别为：1)单纯PBS，2)pTarget质粒+编码IL-4的pTarget，3)pTarget质粒+编码IL-4的pTarget+IMS，4)编码全长CII的pTarget+编码IL-4的pTarget；5)编码全长CII的pTarget+编码IL-4的pTarget+IMS。在用完全弗氏佐剂乳化的CII诱导CIA前14天和7天开始治疗。诱导出CIA后用第三种剂量的剂量的剂量的DNA耐受疫苗和IMS处理小鼠1周。2周后小鼠用不完全弗氏佐剂乳化的CII诱发一次。利用Current Protocols in Immunology中描述的视觉评分系统记录关节炎的分数。
编码全长II型胶原(CII)的DNA加编码IL-4的DNA，加或不加IMS的处理组小鼠与DNA疫苗载体(pTarget)加IL-4，加或不加IMS的对照组小鼠相比其关节炎的严重程度明显减轻(图17A)。各组的总发病率基本一致(图17B)。变性的全长CII能够诱导T细胞增殖说明各组都存在CII反应性T细胞(图18)。细胞因子分析结果表明用DNA质粒加或不加IMS治疗可显著抑制IL-6和TNF-α的产生，但是却可以增加IL-4的分泌(图19)。
第二组体内试验检测了IMS单独或联合全长自身蛋白II型胶原(CII)编码DNA的效应。20只6周龄的雄性DBA/1小鼠分组后双侧四头肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠的双侧四头肌内注射如图所示的DNA疫苗，每种50μg，在开始注射DNA进行免疫的同时腹腔注射200μl含50μg IMS的PBS。治疗组分别为：1)单纯PBS，2)单纯IMS，和3)编码全长CII的pTarget+IMS。在用完全弗氏佐剂乳化的CII诱导CIA前14天和7天开始治疗。诱导出CIA后用第三种剂量的剂量的DNA耐受疫苗和/或IMS处理小鼠1周。利用Current Protocols inImmunology中描述的视觉评分系统记录关节炎的分数。与对照组和全长CII+IMS处理组相比，单纯IMS处理组小鼠的关节炎平均严重程度(图20A)和发病率显著下降(图20B)。
实施例7：
IMS阻断CpG对初级B细胞的刺激效应
在存在特异性抗原的情况下，CpG DNA可作为共刺激因子诱导初级B细胞成熟，表现为促进免疫球蛋白的产生和B细胞的增殖(Krieg 等，Nature，374：546，1995；Yi 等，J.Immunol.，157：5394，1996)。利用羊抗鼠IgG和IgM、羊γ球蛋白的重链和轻链特异性抗体作为载体蛋白通过标准的B细胞淘洗技术从SJL/J小鼠脾中分离初级B细胞，纯度大于＞97％的B220+细胞通过FACScan分析来确定。初级B细胞用5μg如图所示的寡核苷酸培养72小时。用100ng/ml的LPS共培养。在培养的最后16小时用1μCi[3H]TdR脉冲，然后测定掺入的放射活性。每个数据点代表3个复孔的平均值+/-SD。如图21所示，富集的B细胞增殖试验表明CpG可导致B细胞的剧烈增殖，而IMS却可以抑制CpG-ODN对成熟B细胞的这种效应。B细胞与LPS和CpG-ODN共培养对B细胞的增殖有叠加效应，这种效应可被IMS而不是对照寡核苷酸抑制。细胞因子分析结果表明CpG-ODN可促进IL-6(图22A)、IFN-γ(图22B)、IL-10(图22C)和IL-12(p40)(图22D)的产生，而这种效应可被IMS有效抑制。
实施例8：
单独利用IMS以及联合编码细胞内大分子自身蛋白的DNA来治疗系统性红斑狼疮
有几种自发的或诱导的狼疮样疾病鼠模型具有多种与人狼疮相似的特征，其中包括自发的新西兰杂合子模型(NZB/NZW F1杂合子)、自发的MRL-lpr/lpr模型和异十八烷诱导的Balb/c模型。抗细胞内大分子如核小体、DNA和小核糖核蛋白的自身抗体的产生在组织损伤和肾小球肾炎的发病机制中扮演重要角色。
用Balb/c雌性小鼠检验单独IMS和IMS联合自身蛋白小核糖核蛋白U1A或U1C编码DNA的治疗效果。将10只6周龄的雌性Balb/c小鼠分组，双侧四头肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠的双侧四头肌内注射如图所示的DNA疫苗：1)pTarget质粒(100μg/次)；2)编码U1A的pTarget+pTarget空质粒(每种50μg/次)；3)编码U1C的pTarget+pTarget空质粒(每种50μg/次)；以及4)U1A和U1C的混合物(每种50μg/次)。在开始进行DNA免疫的同时，小鼠单独腹腔注射200μl含50μg IMS或CpG的PBS，或者同时进行DNA免疫。注射每周一次，连续2周。腹腔单次注射0.5ml的异十八烷就可以诱导出SLE。诱导出SLE后给小鼠注射第三种剂量的DNA耐受疫苗和/或寡核苷酸一周。每月重复一次相同的治疗方案，共持续9个月。通过每月检测尿蛋白的水平来评价SLE的进展情况。在试验结束时，通过苏木精和伊红染色、过碘酸-席夫碱染色、三色(trichrome)染色和网硬蛋白银染进行组织学检查以评价肾组织损伤情况。肾损伤通过检查肾小球系膜细胞增多的严重程度、肾小球系膜基质增生情况、小叶增生情况以及IgG和C3染色的范围来评分。
用MRL-MpJFAS Ipr雌性小鼠检验单独IMS和IMS联合编码自身蛋白小核糖核蛋白U1A、U1C和U170、核小体组蛋白H2B和H3的DNA的治疗效果。将10只6周龄的雌性MRL-MpJFAS Ipr小鼠分组，双侧四头肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠的双侧四头肌内注射如图所示的DNA疫苗(pBHT1，编码U1A的pBHT1，编码U1C的pBHT1，编码H2B的pBHT1和编码H3的pBHT1)，每种50μg/次，连续三周。载体pBHT1见实施例3的描述。在开始进行DNA免疫的同时，小鼠单独腹腔注射200μl含50μg IMS或CpG的PBS，或者同时进行DNA免疫。给小鼠每月注射DNA耐受疫苗和/或寡核苷酸，连续两个月以上。通过每月检测尿蛋白的水平来评价SLE的进展情况。在试验结束时，通过苏木精和伊红染色、过碘酸-席夫碱染色、三色染色和网硬蛋白银染进行组织学检查以评价肾组织损伤情况。肾损伤通过检查肾小球系膜细胞增多的严重程度、肾小球系膜基质增生情况、小叶增生情况以及IgG和C3染色的范围来评分。
用(NZB×NZW)F1杂合子雌性小鼠检验单独IMS和IMS联合编码自身蛋白核小体组蛋白H2B和H3的DNA的治疗效果。将10只5个月龄的雌性(NZB×NZW)F1杂合子小鼠分组，双侧四头肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠的双侧四头肌内注射如图所示的DNA疫苗(pBHT1，编码H2B的pBHT1、编码H3的pBHT1以及H2B和H3的混合物)，每种50μg/次，连续三周。在开始进行DNA免疫的同时，小鼠单独腹腔注射200μl含50μg IMS或CpG的PBS，或者同时进行DNA免疫。通过每月检测尿蛋白的水平来评价SLE的进展情况。在试验结束时，通过苏木精和伊红染色、过碘酸-席夫碱染色、三色染色和网硬蛋白银染进行组织学检查以评价肾组织损伤情况。肾损伤通过检查肾小球系膜细胞增多的严重程度、肾小球系膜基质增生情况、小叶增生情况以及IgG和C3染色的范围来评分。
实施例9：
单独利用IMS以及联合编码自身蛋白丙酮酸脱氢酶复合体和IL-4的DNA来治疗原发性胆汁性肝硬变
原发性胆汁性肝硬变(PBC)是一种自身免疫性慢性胆汁郁积性肝疾病，是由CD4+T细胞介导的。实验性自身免疫性胆管炎(EAC)是一种能导致PBC样损伤的动物疾病模型，其中SJL小鼠的肝内小胆管上皮细胞通过自身抗原-丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)致敏而产生损伤。
用SJL/J雌性小鼠检验单独IMS和IMS联合编码自身蛋白-PDC的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2)和E3结合蛋白成分的DNA的治疗效果。将15只8周龄的雌性SJL/J小鼠分组，双侧四头肌注射(IM)0.2ml用PBS溶解的0.25％盐酸布比卡因。两天后在小鼠的双侧四头肌内注射如图所示的DNA疫苗(pTarget质粒，编码PDC-E2的pTarget以及PDC-E2和IL-4的混合物)，每种50μg/次，连续三周。在开始进行DNA免疫的同时，小鼠单独腹腔注射200μl含50μg IMS或CpG的PBS，或者同时进行DNA免疫。PDC-E2肽GDLLAEIETDKATI(500μg，溶于10μl PBS中)用CFA(含10mg/ml的结核分支杆菌株H37RA)乳化，小鼠单次腹腔注射200μl诱导EAC。致敏后30周评价EAC的情况。肝组织切片，用H&E染色后进行形态学检查，观察炎症坏死情况和胆管损伤情况。
实施例10：
筛选预计可调节自身免疫性疾病的其他IMS寡核苷酸
据估计其他IMS寡核苷酸也可能具有相似的或更高的活性来改变自身免疫性疾病的进程。根据较早前所描述的IMS寡核苷酸(即5’-TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3’)的活性数据可以推测出其他的IMS寡核苷酸序列。根据如下通式来预测其他IMS寡核苷酸是否具有相似的或更高的活性：5’-TGACTGTGTGRRα βYYAGAGATGA-3’，其中R代表嘌呤(A或G)，Y代表嘧啶(C或T)，α和β是GpG或非GpG二核苷酸。据估计这些寡核苷酸在啮齿类动物试验中具有最大的活性，这与以前所报道的在啮齿类系统中的活性最高的结果是一致的。这些IMS寡核苷酸全部都列在表4中。在这个表中“I”代表肌苷。
同样，根据如下通式也可以预测其他IMS寡核苷酸是否具有相似的或更高的活性5’-TGACTGTGTGRYα βYYAGAGATGA-3’，其中R代表嘌呤(A或G)，Y代表嘧啶(C或T)，α和β是GpG或非GpG二核苷酸。据估计这些寡核苷酸在啮齿类动物试验中具有最大的活性，这与以前所报道的在啮齿类系统中的活性最高的结果是一致的。这些IMS寡核苷酸全部都列在表5中。在这个表中“I”代表肌苷。
所有的寡核苷酸合成时都在每个核苷酸上进行硫代磷酸化以提高寡核苷酸的稳定性。通过体外试验分别筛选这些寡核苷酸以检测其对免疫细胞活化的影响。这些筛选方法包括细胞增殖试验、细胞因子分泌试验、以及通过FACS来分析细胞表面标记分子的表达情况。表现出免疫抑制活性的候选IMS寡核苷酸再进行体内试验来分析其免疫调节功能。这些体内试验包括给动物以及自身免疫性疾病模型(如EAE、NOD、SLE和CIA)注射IMS寡核苷酸，然后分析免疫细胞的上述活化参数。
在表4和表5中描述了核心六聚体(即RRα βYY和RYα βYY)5’端和3”端的侧翼序列。这个核心六聚体两侧的其他侧翼序列可以通过用任意长度的任意核苷酸序列来替代上述侧翼序列而获得。比如：5’-NNNNNNNNNRyα βYYNNNNNNNNN-3’和5’-NNNNNNNNNN RRα βYYNNNNNNNNNN-3’，其中N代表任意核苷酸。
特殊的例子包括而不限于如下寡核苷酸：
5’-GGGGGGGGGGAAGGTTGGGGGGGGGG-3’，
5’-GGGGGGGGGGATGGTTGGGGGGGGGG-3’，
5’-GGGGGGGGGGACGGTTGGGGGGGGGG-3’，
5’-GGGGGGGGGGAAGCTTGGGGGGGGGG-3’，
5’-GGGGGGGGGGATGCTTGGGGGGGGGG-3’，
5’-GGGGGGGGGGACGCTTGGGGGGGGGG-3’，
5’-CCCCCCCCCCAAGGTTCCCCCCCCCC-3’，
5’-CCCCCCCCCCATGGTTCCCCCCCCCC-3’，
5’-CCCCCCCCCCACGGTTCCCCCCCCCC-3’，
5’-CCCCCCCCCCAAGCTTCCCCCCCCCC-3’，
5’-CCCCCCCCCCATGCTTCCCCCCCCCC-3’，
5’-CCCCCCCCCCACGCTTCCCCCCCCCC-3’.
表4
5′      R  R  α β Y  Y         3′
TGACTGTG A  A  G  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  G  C  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  G  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  G  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  G  C  T  T  AGAGATGA
5′      R  R  α β Y    Y         3′
TGACTGTG A  G  G  C  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  G  C  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  G  C  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  G  C  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  G  C  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  G  C  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  G  C  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  G  C  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  G  C  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  G  C  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  G  C  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  G  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  G  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  G  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  G  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  G  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  G  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  G  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  G  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  G  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  G  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  G  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  G  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  G  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  G  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  G  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  G  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  A  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  A  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  A  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  A  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  A  G  T    T  AGAGATGA
5′      R  R  α β Y    Y         3′
TGACTGTG A  G  A  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  A  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  A  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  A  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  A  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  A  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  A  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  A  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  A  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  A  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  A  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  I  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  I  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  I  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  I  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  I  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  I  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  I  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  I  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  I  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  I  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  I  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  I  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  I  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  I  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  I  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  I  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  I  C  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  I  C  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  I  C  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  I  C  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  I  C  T    T  AGAGATGA
5′      R  R  α β Y    Y         3′
TGACTGTG A  G  I  C  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  I  C  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  I  C  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  I  C  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  I  C  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  I  C  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  I  C  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  I  C  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  I  C  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  I  C  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  I  C  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  T  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  T  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  T  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  T  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  T  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  T  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  T  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  T  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  T  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  T  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  T  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  T  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  T  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  T  G  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  T  G  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  T  G  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  T  A  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  T  A  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  T  A  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  T  A  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  T  A  T    T  AGAGATGA
5′      R  R  α β Y    Y         3′
TGACTGTG A  G  T  A  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  T  A  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  G  T  A  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  T  A  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  T  A  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  T  A  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  A  T  A  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  T  A  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  T  A  T    C  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  T  A  C    T  AGAGATGA
TGACTGTG G  G  T  A  C    C  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  C  G  T    T  AGAGATGA
TGACTGTG A  A  C  C  T    T  AGAGATGA
表5：
5′       R  Y  α β Y  Y         3′
TGACTGTG  A  T  G  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  G  C  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  G  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  G  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  G  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  G  C  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  G  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  G  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  G  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  G  C  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  G  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  G  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  G  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  G  C  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  G  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  G  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  G  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  G  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  G  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  G  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  G  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  G  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  G  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  G  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  G  G  T  T  AGAGATGA
5′       R  Y  α β Y  Y         3′
TGACTGTG  G  T  G  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  G  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  G  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  G  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  G  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  G  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  G  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  A  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  A  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  A  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  A  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  A  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  A  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  A  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  A  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  A  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  A  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  A  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  A  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  A  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  A  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  A  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  A  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  I  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  I  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  I  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  I  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  I  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  I  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  I  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  I  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  I  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  I  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  I  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  I  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  I  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  I  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  I  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  I  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  I  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  I  C  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  I  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  I  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  I  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  I  C  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  I  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  I  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  I  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  I  C  T  C  AGAGATGA
5′       R  Y  α β Y  Y         3′
TGACTGTG  G  T  I  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  I  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  I  C  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  I  C  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  I  C  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  I  C  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  T  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  T  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  T  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  T  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  T  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  T  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  T  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  T  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  T  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  T  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  T  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  T  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  T  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  T  G  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  T  G  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  T  G  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  T  A  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  T  A  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  T  A  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  T  A  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  T  A  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  T  A  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  T  A  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  T  A  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  T  A  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  T  A  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  T  A  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  T  T  A  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  T  A  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  T  A  T  C  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  T  A  C  T  AGAGATGA
TGACTGTG  G  C  T  A  C  C  AGAGATGA
TGACTGTG  A  T  C  G  T  T  AGAGATGA
TGACTGTG  A  C  C  G  T  T  AGAGATGA
上述实施例是用于实现本发明的特殊实施方式。提供实施例的目的只是为了说明本发明，而不意味着以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员很容易理解本发明的其他变化，并且这些变化也包括在权利要求中。本文所引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献都已纳入本文作为参考。

Claims (29)

1.一种制造核酸载体的方法，包括对含有CpG基序的载体进行改造从而在CpG二核苷酸内制造胞嘧啶到非胞嘧啶的取代，所述CpG基序的通式为5’-嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶-3’，所述载体还含有编码与自身免疫性疾病相关的自身蛋白的聚核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述胞嘧啶到非胞嘧啶的取代是胞嘧啶取代成鸟嘌呤。
3.如权利要求1所述的方法，其中，制造了多个胞嘧啶到非胞嘧啶的取代。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述载体是质粒或粘粒载体。
5.如权利要求1所述的方法，所述载体是pVAXl载体。
6.如权利要求5所述的方法，所述pVAXl载体经改造后包含如下胞嘧啶到非胞嘧啶取代：
784、1161、1218和1966位核苷酸上胞嘧啶取代成鸟嘌呤；
1264、1337、1829、1874、1940和1997位核苷酸上胞嘧啶取代成腺嘌呤；
1963和1987位核苷酸上胞嘧啶取代成胸腺嘧啶；以及
1831、1876、1942和1999位核苷酸上胞嘧啶取代成鸟嘌呤。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。
8.如权利要求7所述的方法，所述自身蛋白选自髓鞘碱蛋白，蛋白脂类蛋白，髓鞘相关糖蛋白，环状核苷酸磷酸二酯酶，髓鞘相关少突胶质神经细胞碱性蛋白；α-B-晶体蛋白和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，所述自身蛋白是髓鞘碱蛋白。
10.如权利要求1-6中任一项所述的方法，所述自身免疫性疾病是胰岛素依赖型的糖尿病。
11.如权利要求10所述的方法，所述自身蛋白选自酪氨酸磷酸酶IA2、IA-2β；65kDa形式和67kDa形式的谷氨酸脱羧酶，羧肽酶H，胰岛素，胰岛素原，前胰岛素原，热休克蛋白，glima 38，胰岛细胞抗原69Kda，p52和胰岛细胞葡萄糖载体GLUT-2。
12.如权利要求11所述的方法，所述自身蛋白是胰岛素原。
13.一种载体，由权利要求1-9中任一项所述的方法制成。
14.一种经改造的pVAXl载体，其载体骨架中含有以下核苷酸：
784、1161、1218和1966位核苷酸为鸟嘌呤；
1264、1337、1829、1874、1940和1997位核苷酸为腺嘌呤；
1963和1987位核苷酸为胸腺嘧啶；以及
1831、1876、1942和1999位核苷酸为鸟嘌呤。
15.如权利要求14所述的载体，还含有编码髓鞘蛋白的聚核苷酸。
16.如权利要求15所述的载体，所述髓鞘蛋白是髓鞘碱蛋白。
17.如权利要求14所述的载体，还包含编码胰岛素蛋白的聚核苷酸。
18.如权利要求17所述的载体，所述胰岛素蛋白是胰岛素原。
19.一种药物组合物，含有权利要求14-18中任一项所述的载体和药学上可接受的运载体。
20.以下药物组合物用于制造治疗自身免疫性疾病的药物的用途，该组合物包含：(a)含免疫调节核酸的质粒载体和(b)药学上可接受的载体，所述免疫调节核酸含有通式为5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’的六聚体区域和编码自身蛋白、自身多肽或自身肽的聚核苷酸区域，其中，X和Y是任何天然产生的或合成的核苷酸，但是X-Y不能是胞嘧啶-鸟嘌呤。
21.如权利要求20所述的用途，所述质粒载体是经改造的pVAXl载体。
22.如权利要求20所述的用途，所述经改造的pVAXl载体的载体骨架中含有以下核苷酸：
784、1161、1218和1966位核苷酸为鸟嘌呤；
1264、1337、1829、1874、1940和1997位核苷酸为腺嘌呤；
1963和1987位核苷酸为胸腺嘧啶；以及
1831、1876、1942和1999位核苷酸为鸟嘌呤。
23.如权利要求20所述的用途，所述疾病是多发性硬化症、类风湿关节炎或胰岛素依赖型的糖尿病。
24.如权利要求20所述的用途，所述自身蛋白是髓鞘蛋白。
25.如权利要求24所述的用途，所述髓鞘蛋白是髓鞘碱蛋白。
26.如权利要求20所述的用途，所述自身蛋白是胰岛素蛋白。
27.如权利要求26所述的用途，所述胰岛素蛋白是胰岛素原。
28.如权利要求20-27中任一项所述的用途，其中，所述免疫调节核酸还包含一个连接到六聚体区域5’端或3’端的聚鸟苷酸区域。
29.如权利要求20-27中任一项所述的用途，其中，所述免疫调节核酸还包含一个连接到六聚体区域5’端的第一聚鸟苷酸区域和一个连接到六聚体区域3’端的第二聚鸟苷酸区域。
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