JP5346414B2 - 自己免疫疾患およびアレルギー性疾患を治療するための新規組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫学および医薬の分野に関する。本発明は、自己免疫疾患およびアレルギー性疾患を治療および防止するための改善された方法および組成物を提供する。より詳細には、本発明は、細菌内毒素の突然変異体サブユニット、特異的な細胞受容体に結合することができるペプチド、および自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に関連する１個以上の自己抗原性エピトープまたはアレルギーの原因になるエピトープを含む融合タンパク質である新しい免疫調節性複合体に関する。

自己免疫疾患および免疫応答の調節
自己免疫疾患は、体の健康な細胞および／または組織を誤って対象とする免疫細胞によって引き起こされるあらゆる疾患である。自己免疫疾患は、米国の人口の３％に影響を及ぼし、おそらく先進工業国の人口でも同様の百分率である（Jacobson et al., Clin Immunol Immunopathol 84：223-43, 1997）。自己免疫疾患は、自己タンパク質、自己ポリペプチド、自己ペプチド、および／または他の自己分子を異常に標的にし、体内の臓器、組織、または細胞型（例えば、膵臓、脳、甲状腺または胃腸管）の傷害および／または機能不良を引き起こし、疾患の臨床的な症状発現を引き起こすＴリンパ球およびＢリンパ球を特徴とする（Marrack et al., Nat Med 7：899-905, 2001）。自己免疫疾患は、特定の組織に影響を及ぼす疾患ならびに多数の組織に影響を及ぼす可能性がある疾患を含む。一部の疾患に関しては、これは、一部において、自己免疫応答が、特定の組織に限定される抗原、または体内に広範に分布している抗原のいずれを対象とするかに左右され得る。組織特異的自己免疫の特徴は、単一の組織または個々の細胞型を選択的に標的とすることである。しかし、遍在する自己タンパク質を標的とするある特定の自己免疫疾患は、特定の組織にも影響を及ぼし得る。例えば、多発性筋炎では、自己免疫応答は、遍在するタンパク質ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素を標的とするにもかかわらず、臨床的な症状発現は、主に筋肉の自己免疫破壊を伴う。

免疫系は、自己抗原に対する応答を防止しながら、哺乳動物を種々の外来病原体から保護するための応答を生成するために設計された高度に複雑な機構を用いる。応答するかどうかを決定すること（抗原特異性）に加えて、免疫系は、各病原体に対処する適切なエフェクター機能も選択しなければならない（エフェクター特異性）。これらのエフェクター機能を媒介および調節することにおいて重要な細胞はＣＤ４^＋Ｔ細胞である。さらに、Ｔ細胞がそれらの機能を媒介する主要な機構であると思われるのは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞からの特定のサイトカインの合成である。したがって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によって作られるサイトカインの種類、ならびに、それらの分泌がどのように制御されるかを特徴付けることが、免疫応答がどのように調節されるかを理解することにおいて非常に重要である。

長期マウスＣＤ４^＋Ｔ細胞クローンからのサイトカインの産生についての特性評価は、２０年超前に最初に発表された（Mosmann et al., J Immunol 136：2348−2357, 1986）。これらの試験では、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）およびＴヘルパー２（Ｔｈ２）と名付けられた、サイトカインの産生の２つの別個のパターンを生じることが示された。Ｔｈ１細胞はインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびリンホトキシン（ＬＴ）を産生し、一方、Ｔｈ２クローンはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１３を主に産生することが見出された（Cherwinski et al., J Exp Med 169:1229-1244, 1987）。いくぶん後に、追加的なサイトカイン、ＩＬ−９およびＩＬ−１０がＴｈ２クローンから単離された（Van Snick et al., J Exp Med 169:363-368, 1989）（Fiorentino et al., J Exp Med 170:2081-2095, 1989）。最終的に、追加的なサイトカイン、例えば、ＩＬ−３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などがＴｈ１細胞とＴｈ２細胞の両方から分泌されることが見出された。最近、ライム病の患者の炎症を起こしている関節から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｔｈ１およびＴｈ２とは別個のＩＬ−１７産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットを含有することが報告された（Infante-Duarte et al., J. Immunol 165:6107-6115, 2000）。これらのＩＬ−１７産生ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１７と称される。炎症促進サイトカインであるＩＬ−１７は、主に活性化Ｔ細胞によって産生され、Ｔ細胞の準備刺激を増強し、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、および上皮細胞を刺激して、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＮＯＳ−２、メタロプロテアーゼ、およびケモカインを含めた多数の炎症促進性メディエーターを産生させ、その結果、炎症が誘導される。種々のアレルギー性疾患および自己免疫疾患、例えば、ＲＡ、ＭＳ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、および喘息などの患者において、ＩＬ−１７の発現が増加し、これは、そのような疾患の誘導および／または発生にＩＬ−１７が寄与することを示唆している。

現在は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）と称されるサプレッサーＴ細胞が、末梢免疫寛容のための活性な機構として自己反応性Ｔ細胞を抑制することを示す十分な証拠がある。これまで、Ｔｒｅｇ細胞は、それらの起源に応じて、２つの異なるサブタイプ、すなわち、天然の（または構成的な）集団および誘導性の（または適応性の）集団に分けることができることが定着している（Mills, Nat Rev Immunol 4:841-855, 2004）。さらに、種々のＴｒｅｇ細胞サブセット、例えば、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞、ＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞、およびＴＧＦ−β産生Ｔｈ３細胞を含む）、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞、Ｖｅｔｏ ＣＤ８＋細胞、γσＴ細胞、ＮＫＴ（ＮＫ１．１＋ＣＤ４−ＣＤ８−）細胞、ＮＫ１．１−ＣＤ４−ＣＤ８−細胞などが、それらの表面マーカーまたは産生されるサイトカインに応じて同定されている。証拠の蓄積により、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞が、病原性自己免疫応答の下方制御および免疫恒常性の維持において能動的な役割を果たすことが示されている（Akbari et al., Curr Opin Immunol 15:627-633, 2003）。

自己免疫疾患は、体内の多くの異なる臓器および組織に影響を及ぼす可能性がある広範な疾患を包含する（例えば、Paul, W.E. (1999), Fundamental Immunology, Fourth Edition, Lippincott-Raven, New York.を参照されたい。）

ヒト自己免疫疾患に対する現在の療法は、グルココルチコイド、細胞傷害性薬剤、および最近開発された生物学的治療法を含む。一般に、ヒト全身性自己免疫疾患の管理は、経験的なものであり、不十分である。ほとんどの場合、多種多様な重篤な自己免疫障害および炎症性障害においてはコルチコステロイドなどの広範に免疫を抑制する薬物が使用されている。全身性自己免疫疾患の管理においてはコルチコステロイドに加えて他の免疫抑制剤が使用されている。シクロホスファミドは、Ｔリンパ球とＢリンパ球の両方のきわめて大きな枯渇および細胞性免疫の機能不全を引き起こすアルキル化剤である。シクロスポリン、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチルは、Ｔリンパ球抑制の特定の性質を持つ天然物であり、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、および限られた程度に、脈管炎および筋炎を治療するために使用されている。これらの薬物は、有意な腎毒性を伴う。ＲＡにおいて、疾患の進行を低下させる目的で「第２選択（ｓｅｃｏｎｄ ｌｉｎｅ）」薬剤としてメトトレキサートも使用される。メトトレキサートは、多発性筋炎および他の結合組織疾患においても使用される。試みられてきた他の手法としては、サイトカインの作用を遮断する、またはリンパ球を枯渇させるためのモノクローナル抗体が挙げられる（Fox, Am J Med 99:82-88, 1995）。多発性硬化症（ＭＳ）に対する治療としては、インターフェロンβおよび共重合体１が挙げられ、それは、再発率を２０〜３０％低下させ、疾患の進行に対して穏当な影響のみを有する。ＭＳの治療には、メチルプレドニゾロン、他のステロイド、メトトレキサート、クラドリビンおよびシクロホスファミドを含めた免疫抑制剤も用いられる。これらの免疫抑制剤は、ＭＳの治療において最小の効力を有する。アルファ４−インテグリンアンタゴニストである抗体タイサブリ（ナタリズマブ）をＭＳに対する治療として導入することは、この療法を受けている患者における進行性多巣性白質脳症（ｌｅｕｃｏｅｎｃａｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）（ＰＭＬ）の発生率によって影が薄れている。ＲＡに対する現在の療法では、免疫機能を非特異的に抑制または調節する薬剤、例えば、メトトレキサート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド（ｌｅｕｆｌｏｎａｍｉｄｅ）、プレドニゾン、ならびに最近開発されたＴＮＦαアンタゴニストであるエタネルセプトおよびインフリキシマブなどを利用する（Moreland et al., J Rheumatol 28：1431-52, 2001）。エタネルセプトおよびインフリキシマブは、ＴＮＦαを全体的に遮断し、それにより患者が敗血症によって死亡しやすくなり、慢性マイコバクテリア感染症が増悪しやすくなり、また、脱髄性事象が発生しやすくなる。

臓器特異的自己免疫の場合では、いくつもの異なる治療的手法が試みられている。可溶性タンパク質抗原が、その後のその抗原に対する免疫応答を阻害するために全身的に投与されている。そのような療法としては、ミエリン塩基性タンパク質、その優性ペプチド、またはミエリンタンパク質の混合物を実験的な自己免疫脳脊髄炎を有する動物および多発性硬化症のヒトに送達すること（Brocke et al., Nature 379：343-6, 1996; Critchfield et al., Science 263：1139-43, 1994; Weiner et al., Annu Rev Immunol 12：809-37, 1994）、ＩＩ型コラーゲンまたはコラーゲンタンパク質の混合物をコラーゲン誘導関節炎の動物および関節リウマチのヒトに投与すること（Gumanovskaya et al., Immunology 91：466-73, 1999; McKown et al., Arthritis Rheum 42：1204-8, 1999; Trentham et al., Science 261：1727-30, 1993）、インスリンを自己免疫性糖尿病の動物およびヒトに送達すること（Pozzilli and Gisella Cavallo, Diabetes Metab Res Rev 16：306-7, 2000）、およびＳ抗原を自己免疫性ぶどう膜炎の動物およびヒトに送達すること（Nussenblatt et al., Am J Ophthalmol 123：583-92, 1997）が挙げられる。別の手法は、Ｔ細胞受容体とＭＨＣ分子に結合したペプチドの間の特異的な相互作用に基づいて、ペプチド抗原を全身投与するための合理的な治療戦略を設計する試みである。糖尿病の動物モデルにおいてペプチド手法を使用する１つの試験では、ペプチドに対する抗体産生が発生した（Hurtenbach et al., J Exp Med 177:1499, 1993）。別の手法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ペプチド免疫化を施すことである（例えば、Vandenbark et al., Nature 341:541, 1989を参照されたい）。さらに別の手法は、ペプチド抗原またはタンパク質抗原の経口摂取によって経口免疫寛容を誘導することである（例えば、Weiner, Immmunol Today 18:335, 1997を参照されたい）。

粘膜免疫寛容とは、粘膜経路、通常は経口経路、経鼻経路または鼻−呼吸器経路、それだけでなく膣経路および直腸経路を介して以前投与された抗原による攻撃に対する全身性の免疫寛容の現象を指す（Weiner et al., Annu Rev Immunol 12:809-837, 1994）。粘膜免疫寛容は、２０世紀初期に、モルモットにおける遅延型過敏症反応および接触過敏症反応のモデルにおいて発見されたが、寛容の機構は現代の免疫学の時代まではっきりしないままであった。細胞分離技法、サイトカインを産生させるための試験および抗原特異的Ｔ細胞をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で追跡することができるトランスジェニックモデルを使用することにより、粘膜免疫寛容の機構が徐々に解明されている（Garside and Mowat., Crit Rev Immunol 17:119-137, 1997）。粘膜経路を介して抗原を投与した結果、投与経路および抗原の用量に応じて、別個の種類の寛容がもたらされ得ることが明らかになった。例えば、高用量の経口抗原により、高用量の可溶性抗原の非経口投与と類似したＴ細胞の活性化、その後の反応性Ｔ細胞の欠失またはアネルギーが誘導される（Chen et al., Nature 376:177-180, 1995）。これにより、その抗原に特異的なＴ細胞の消滅およびその後の抗原による攻撃に対する不応答性、すなわち、受動的な寛容がもたらされる。対照的に、低用量の経口抗原では、欠失またはアネルギーは誘導されないが、繰り返し与えると、抗炎症性サイトカインを分泌する調節性−保護性Ｔ細胞であるＴｒｅｇ細胞の出現を特徴とする別個の種類の免疫応答、すなわち、能動的な寛容が誘導される（von Herrath, Res Immunol. 148:541-554, 1997）。これらのＴｒｅｇ細胞は、通常、ＣＤ４（ヘルパー）Ｔ細胞のクラスに属する。インタクトなタンパク質抗原を鼻咽頭粘膜に滴下注入することによっても、保護性のＴｒｅｇ細胞が誘導される。この場合、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞の両方が誘導され得る。経口的な、または鼻腔内への抗原投与後に誘導される調節性Ｔｒｅｇ細胞は、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどを産生する。粘膜免疫寛容を誘導するために、抗原は、エアロゾルの形態で与えることもできる。これらの３つの経路、経口経路、鼻腔内経路およびエアロゾル吸入を介した投与により、抗原が取り込まれ、それぞれの場合において、異なるリンパ系区画において提示される。したがって、経口抗原は、主に腸間膜リンパ節において、およびいくらかの程度でパイエル板においてＴ細胞に対して提示され、鼻腔内抗原は深頸リンパ節においてＴ細胞に対して提示され、吸入された抗原は縦隔リンパ節においてＴ細胞に対して提示される。それぞれの場合において、抗原に繰り返して曝露させるにより、調節性Ｔ細胞を誘導することができるが、これらの細胞の本質は、経路および抗原の形態に応じて異なる。経口抗原によって誘導される調節性細胞は、ＣＤ４Ｔ細胞であり、αβヘテロ二量体からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するが、鼻−呼吸器の抗原の場合では、調節性細胞は、γσヘテロ二量体ＴＣＲを発現しているＣＤ８Ｔ細胞（すなわちγσＴ細胞）でもあり得る。ＣＤ８受容体も有し得るこれらの細胞のいくつかは、従来のαβヘテロ二量体ＴＣＲではなくααホモ二量体である。ＣＤ８ααＴＣＲおよびＣＤ８γσＴＣＲを保有する細胞の大多数は、皮膚組織または粘膜組織に存在する。

過去数十年にわたって、西洋諸国においてアレルギー性疾患の発生率および分布率の両方が有意に上昇してきた。アレルギー性鼻炎はこれらの疾患の最も一般的なものであり、この集団の１５〜２０％に影響を及ぼしている。アレルギー反応は、肥満細胞および好塩基球の表面上の特定のＩｇＥのアレルゲン媒介性架橋によって誘発され、ヒスタミンおよび他のメディエーターの放出が導かれ、したがって、急性アレルギー反応、その後に好酸球、好中球、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を産生するＴｈ２細胞の流入を特徴とする遅延相反応が引き起こされる。

特異的免疫療法（ＳＩＴ）はアレルギー性鼻炎の有効な治療であると認識されている。伝統的に、ＳＩＴは、少量の特定のアレルゲンの皮下投与を繰り返すことによって行われている。この治療形態は有効な治療的選択肢であり得るが、この形態の免疫療法の安全性ならびにワクチンとして使用するアレルゲン抽出物を標準化することの難しさに関する懸念がある。したがって、アレルギー性疾患に対する代替になる新規の治療の開発に強い関心が持たれている。手法の１つは、粘膜ワクチンの使用である（Widermann, Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4, 577-583, 2005）。他の代替法は、アレルゲン性が弱い、またはアレルゲン性がないアレルゲン誘導体をワクチンとして使用することに基づく（Vrtala et al., Methods 32, 313-320, 2004）。これらとしては、タンパク質工学によって得られるアレルゲンおよびアレルゲンの免疫優性Ｔ細胞エピトープを示す合成ペプチドが挙げられる。例えば、Ｏｌｅ ｅ１は、オリーブの花粉の最重要アレルゲンであると同定された（Wheeler et al., Mol Immunol 27,631-636, 1990）。

現在、免疫応答は、ポリペプチドを単独で、またはアジュバント（免疫調節性薬剤）と組み合わせて送達することによって変化させる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンは、アジュバントとしての機能を果たす水酸化アルミニウム中に処方された非自己抗原である組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原を含有する。このワクチンにより、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対する免疫応答が誘導されて感染症から保護される。代替の手法は、それぞれ非自己抗原である、ウイルスまたは細菌の弱毒化された形態、複製欠損性形態、および／または非病原性の形態を送達して、病原体に対する宿主の防御免疫応答を引き出すことを伴う。例えば、経口的なポリオワクチンは、非自己抗原である弱毒生ウイルスで構成され、ワクチン接種された個体において細胞に感染し、複製されて、臨床疾患を引き起こすことなく、外来抗原または非自己抗原であるポリオウイルスに対する有効な免疫を誘導する。あるいは、不活性化ポリオワクチンは、感染または複製ができない不活性化されたまたは「死滅した」ウイルスを含有し、ポリオウイルスに対する防御免疫を誘導するために皮下に投与される。

自己免疫疾患を治療するためのＤＮＡ療法が記載されている。そのようなＤＮＡ療法は、自己免疫応答を駆動する自己反応性Ｔ細胞のレベルを変化させるために、Ｔ細胞受容体の抗原結合領域をコードするＤＮＡ分子を含む（Waisman et al., Nat Med 2:899-905, 1996;米国特許第５，９３９，４００号）。ＭＳおよびコラーゲン誘導関節炎を防止するために、自己抗原をコードするＤＮＡ分子を粒子に付着させ、遺伝子銃によって皮膚に送達する（ＷＯ９７／４６２５３；Ramshaw et al., Immunol Cell Biol 75:409-413, 1997）。動物モデルにおいて自己免疫疾患を治療するために接着分子、サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）、ケモカイン（例えば、Ｃ−Ｃケモカイン）、および他の免疫分子（例えば、Ｆａｓ−リガンド）をコードするＤＮＡ分子が使用されている（Youssef et al., J Clin Invest 106:361-371, 2000; Wildbaum et al., J Clin Invest 106:671-679, 2000; Wildbaum et al., J Immunol 165:5860-5866, 2000）。

１個以上の自己抗原をコードする核酸を投与することによって自己免疫疾患を治療するための方法は、ＷＯ００／５３０１９、ＷＯ２００３／０４５３１６、およびＷＯ２００４／０４７７３４に記載されている。これらの方法は成功しているが、さらなる改善が依然として必要とされている。

感染症を防止するためのワクチン中の免疫賦活性アジュバントとして、細菌エンテロトキシンが使用される。コレラ毒素（ＣＴ）および密接に関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性の毒素（ＬＴ）は、今日実験的使用においておそらく最も有力であり、最もよく研究されている粘膜アジュバントであるが（Rappuoli et al., Immunol Today 20:493-500）、診療所において活用される場合、それらの潜在的な毒性およびベル麻痺（顔面神経の麻痺）の症例との関連性が、それらの市場からの撤退につながった（Gluck et al., J Infect Dis 181：1129-1132, 2000; Gluck et al., Vaccine 20 (Suppl.1)：S42-44, 2001; Mutsch et al., N Engl J Med. 350：896-903, 2004）。細菌エンテロトキシンであるＣＴおよびＬＴは、実験動物ならびにヒトにおける有効な免疫賦活薬（ｉｍｍｕｎｏｅｎｈａｎｃｅｒ）であることが証明されている（Freytag et al., Curr Top Microbiol Immunol 236：215-236, 1999）。構造的に、これらのエンテロトキシンは、ＡＢ_５複合体であり、１つのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性なＡ１サブユニットおよびＡ１をＢサブユニットの五量体に連結するＡ２サブユニットからなる。ホロ毒素は、大部分の哺乳動物の細胞にＢサブユニット（ＣＴＢ）を介して結合し、詳細には、細胞膜内のＧＭ１−ガングリオシド受容体と相互作用する。ホロ毒素は粘膜免疫応答を増強することが見出されているが、免疫系を特異的に寛容化するためにＣＴＢと抗原のコンジュゲートが使用されている（Holmgren et al., Am J Trop Med Hyg 50：42-54, 1994）。マウスにおける研究により、ＣＴおよびＬＴは、鼻腔内に与えられると、嗅覚神経および嗅球に蓄積され得、これはＣＴまたはＬＴのＢサブユニットの、全ての有核哺乳動物細胞上に存在するＧＭ１−ガングリオシド受容体に結合する能力に依存する機構であることが示された（Fujihashi et al., Vaccine 20：2431-2438, 2002）。相当なアジュバント機能を有する、毒性の低いＣＴおよびＬＴの突然変異体が遺伝子工学で作り出されているが、そのような分子は、特に、ＣＴおよびＬＴのアジュバント活性が、ＡサブユニットのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性と標的細胞上のガングリオシド受容体に結合する能力の組み合わせであると思われることを考えると（Soriani et al., Microbiology 148：667-676, 2002）、それでもなお有害反応を引き起こす有意な危険性を保有する（Giuliani et al., J Exp Med 187：1123-1132, 1998; Yamamoto et al., J Exp Med 185：1203-1210, 1997）。これらの観察およびその他の観察により、ヒト用ワクチンにおけるＣＴホロ毒素またはＬＴホロ毒素の使用が妨げられる。他方では、最近の観察により、Ａ１サブユニットをコードする遺伝子に部位特異的突然変異を導入することにより、毒性を伴わずに、または毒性を著しく低下させて、これらの分子のアジュバント機能を保持することが可能であることが実証された。有効なアジュバントであることが証明されている突然変異分子の例は、ＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２であり（Giuliani et al., J Exp Med 187：1123-1132, 1998）、前者は酵素活性を持たず、後者のＡＤＰリボシル化能力は有意に低下している。これにもかかわらず、ＧＭ１−ガングリオシド受容体依存性の結合は、これらの突然変異体において問題のままであり、したがって、依然として神経細胞の蓄積および神経毒性を引き起こす可能性がある。

この効力対毒性のジレンマに対するよりよい解決法は、高度に有効な粘膜アジュバントおよび全身性アジュバントであることが証明されているＣＴＡ１−ＤＤ分子である（Agren et al., J Immunol 158：3936-3946, 1997;米国特許５，９１７，０２６号）。この独特のアジュバントは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ由来の免疫グロブリン結合性エレメントの二量体と組み合わせた、酵素的に活性なＣＴのＡ１サブユニットに基づく。分子は、それによって、望ましくない反応をもたらし得る全有核細胞への結合を回避し、ホロ毒素内のＣＴＡ１酵素を完全に活用する。したがって、現在までの全ての試験により、ＣＴＡ１−ＤＤが非毒性であり、優れた免疫賦活機能を保持することが見出された。全身に与えられると、ＣＴＡ１−ＤＤは、インタクトなＣＴのアジュバント効果に匹敵するアジュバント効果をもたらし、アジュバントと同時投与された特定の免疫原に対する細胞性免疫と体液性免疫の両方を著しく増大させる。ＣＴＡ１−ＤＤは、粘膜アジュバントとしても機能し、ＣＴホロ毒素の毒性にまず必要であるＢサブユニットを欠くので、安全であるはずである。ＣＴＡ１−ＤＤは、ガングリオシド受容体に結合することができず、その代わりにＢ細胞を標的とし、これによりＣＴＡ１−ＤＤアジュバントが、相互作用することができる限られたレパートリー細胞に限定される。しかし、アジュバント効果は、Ｂ細胞欠損マウスにおいてＣＴＡ１−ＤＤアジュバントを使用して鼻腔内免疫化した後に特定のＣＤ４Ｔ細胞免疫が強力に誘導される（Eliasson et al., Vaccine 25：1243-52, 2008, Akhiani et al., Scand J. Immunol 63：97-105, 2006）ことに示されているように、Ｂ細胞に完全には依存しない。

ＣＴＡ１−ＤＤのアジュバント効果は、ＡＤＰリボシル化酵素活性を欠く突然変異体であるＣＴＡ１−Ｅ１１２Ｋ−ＤＤおよびＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤには存在しなかった（Lycke, Immunol Lett 97：193-198, 2005）。

ＷＯ２００９／０７８７９６には、さらに、突然変異体ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤを含む免疫調節性複合体、およびより詳細には、アミノ酸２６０〜２７３を含む共有免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０〜２７３）に連結したＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤを含む免疫調節性複合体が記載されている。

ＣＴＢとウシのＩＩ型コラーゲンに由来するペプチドのコンジュゲートは、マウスをコラーゲン誘導自己免疫性耳疾患ならびにコラーゲン誘導関節炎の発生から保護することができることが示されている（Kim et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 110：646-654, 2001; Tarkowski et al., Arthritis Rheum 42：1628-34, 1999）。しかし、ＣＴＢは、上記の通り、ＧＭ１ガングリオシド結合特性および潜在的な神経毒性効果があるので、ヒトへの使用には適さない場合がある。

本発明の免疫調節性複合体は、ＷＯ２００９／０７８７９６による、突然変異体ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤを含む免疫調節性複合体とは、少なくとも、アミノ酸１８７がシステインからアラニンに変化しているという点で、また、所望により、突然変異体ＣＴＡ１サブユニットのＮ末端にリジン残基がさらに挿入されているという点で異なる。

本発明の出願人らは、驚いたことに、ＷＯ２００９／０７８７９６による突然変異体ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤを含む免疫調節性複合体、具体的には、共有免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチドに連結したＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤを含む免疫調節性複合体のアミノ酸１８７のシステインをアラニンでさらに置き換えることにより、マウスにおいて、関節炎に対して有意に改善された治療効果がもたらされ、関節炎の発生率および重症度が有意に低くなることを見出した。

理論に束縛されるものではないが、ＷＯ２００９／０７８７９６によるＣＴＡ１−Ｒ／Ｋ−ＤＤと比較した、本発明によるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＤＤの治療効果の驚くべき改善の後ろにある機構は、アミノ酸１８７のシステインをアラニンで置き換えることにより、ジスルフィド結合を通じた二量体の形成が無効になるという事実によって説明できると思われる。

得られる治療効果が生じた融合タンパク質二量体化に少なくとも一部、または相当な程度にまで左右されるかどうかは先験的に未知であった。したがって、本出願人らの驚くべき発見の前には、二量体化を回避することを試みることが、実際に免疫調節性複合体の治療的活性に有害であるかどうか、およびこのアミノ酸の置き換えを行うことにより、少なくともＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤコンストラクトと同じくらい優良な治療効果を有する融合タンパク質がもたらされるかどうかは予測することができなかった。

さらに、本出願人らは、驚いたことに、融合タンパク質のＮ末端にリジン残基を挿入することにより、融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＤＤの発現および産生が、タンパク質の治療効果に関して、誤って折りたたまれること、移行またはタンパク質分解に起因するいかなる損失も伴わずに強烈に増加することを見出した。したがって、Ｎ末端にリジン残基を挿入することが、融合タンパク質の生物学的利用可能性および治療的活性に対して有害であるかどうか（例えば、折りたたみに対する影響など）、およびＮ末端にリジンを挿入することにより、少なくともＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤコンストラクトと同じくらい優良な治療効果を有する融合タンパク質がもたらされるかどうかは今まで未知であった。

本発明は、改善された免疫調節性複合体およびそれらを含む組成物、ならびに医薬品を製造するための、および自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を予防、防止および／または治療するための方法における、その使用に関する。本発明による改善された免疫調節性複合体は、コレラ毒素（ＣＴＡ１）のＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの突然変異体サブユニット、特異的な細胞受容体に結合することができるペプチド、および疾患に関連する１種または複数種のエピトープを含む融合タンパク質である。治療的または予防的に有効な量の免疫調節性複合体を対象に投与することにより、疾患に関連する抗原に対する免疫応答の抑制を引き出し、それによって、疾患を治療または防止する。

エピトープは、治療される疾患が自己免疫疾患である場合は自己免疫エピトープであってよく、治療される疾患がアレルギー性疾患である場合はアレルギーの原因になるエピトープであってよい。

一実施形態では、本発明は、
（ａ）コレラ毒素（ＣＴＡ１）のＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの突然変異体サブユニット、
（ｂ）特異的な細胞受容体に結合することができるペプチド、および
（ｃ）自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に関連する１個以上のエピトープ
を含む融合タンパク質である免疫調節性複合体であって、
突然変異体ＣＴＡ１サブユニットにおいて、ネイティブなＣＴＡ１におけるアミノ酸７のアルギニン、およびアミノ酸１８７のシステインに対応するアミノ酸が置き換えられている、免疫調節性複合体を提供する。

好ましい一実施形態では、突然変異体ＣＴＡ１サブユニットのＮ末端にアミノ酸リジンがさらに挿入されている。

好ましい一実施形態では、融合タンパク質は、ネイティブなＣＴＡ１配列におけるアミノ酸７のアルギニンがリジンと置き換えられており、ネイティブなＣＴＡ１配列におけるアミノ酸１８７のシステインがアラニンと置き換えられている、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ突然変異体（配列番号１）を含む。

さらに好ましい一実施形態では、融合タンパク質は、ネイティブなＣＴＡ１配列におけるアミノ酸７のアルギニンがリジンと置き換えられており、ネイティブなＣＴＡ１配列におけるアミノ酸１８７のシステインがアラニンと置き換えられており、Ｎ末端にアミノ酸リジンが挿入されている、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ突然変異体（配列番号２）を含む。

アミノ酸７のアルギニンのリジンへの置き換えは、ＡＤＰリボシル化活性を無効にし、アミノ酸１８７のシステインのアラニンへの置き換えは、二量体の形成を防止し、Ｎ末端へのリジンの挿入は、融合タンパク質の発現および産生を劇的に増加する。

したがって、本発明による融合タンパク質、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａは、本明細書においてその全体が参照により組み込まれるＷＯ２００９／０７８７９６によるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋと比較して、驚くべき有利な効果をもたらす。したがって、実施例２および３の比較試験において、マウスの対照群と比較して関節炎の重症度および発生率が減少することにおいて見ることができるように、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの治療効果は、驚いたことに、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの治療効果よりも有意に優れていることが見出されている。

一実施形態では、融合タンパク質は、抗原を提示することができる細胞、特にＭＨＣクラスＩ抗原またはＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現している細胞上で発現される受容体に特異的に結合するペプチドを含む。抗原提示細胞は、Ｂリンパ球、Ｔ細胞などのリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞および内皮細胞からなる群から選択することができる。

ペプチドは、上記の細胞の受容体、好ましくは前記抗原提示細胞によって発現されるＩｇ受容体またはＦｃ受容体、最も好ましくは、Ｂリンパ球および樹状細胞の受容体に結合するペプチドである。

特定のペプチドの例は、受容体に結合することができるペプチド、例えば、以下のものなどである：
（ｉ）単球、好中球、好酸球、線維芽細胞および内皮細胞上に存在するＧＭ−ＣＳＦ受容体α／βヘテロ二量体に結合することができる顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ ＳＦ）、
（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）と一緒に、それぞれＭＨＣクラスＩＩ分子およびＭＨＣクラスＩ分子のコレセプターとしての機能を果たす、Ｔ細胞上で発現されるＣＤ４およびＣＤ８。ＭＨＣクラスＩは、大部分の有核細胞上で発現され、一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、樹状細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、骨髄前駆体細胞、赤血球前駆体細胞および一部の上皮細胞上で発現される、
（ｉｉｉ）Ｂ細胞上で発現されるＣＤ８０およびＣＤ８６Ｂ７に結合する、主にＴ細胞上で発現される２つのホモ二量体タンパク質であるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４、
（ｉｖ）Ｔ細胞上で発現されるＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９またはＣＤ１５４）と相互作用する、主に成熟Ｂ細胞の表面に存在するＣＤ４０、
（ｖ）肥満細胞、好塩基球、好酸球、血小板、樹状細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞およびＢ細胞上に存在するいくつもの高親和性または低親和性のＦｃ受容体と相互作用する、Ｉｇ重鎖定常領域の異なるアイソタイプ、
（ｖｉ）正常な体液性免疫応答の生成において重要であり、また、自己免疫の発生にも関与する可能性があることが示されている、Ｂ細胞および濾胞樹状細胞上で発現される補体受容体（ＣＲ）、ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３、
（ｖｉｉ）樹状細胞上で発現されるデクチン−１のようなＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、
（ｖｉｉｉ）樹状細胞のサブセット上で高レベルで発現される、抗原の取り込みおよびプロセシングのためのエンドサイトーシス受容体であるＤＥＣ２０５、
（ｉｘ）主に骨髄細胞において見出される多数の可溶性因子およびタンパク質（ＬＰＳ、フィブリノーゲン、ｉＣ３ｂ）の細胞表面受容体であるＣＤ１１ｃ、
（ｘ）樹状細胞、マクロファージおよび他の抗原提示細胞上に存在するマンノース受容体、
（ｘｉ）マクロファージ上に存在する特異的なＨＳＰ６０受容体、
（ｘｉｉ）樹状細胞のサブセットによって発現されるインテグリンアルファ鎖であるＣＤ１０３、
（ｘｉｉ）樹状細胞上に存在する３３Ｄ１抗原。

本発明の特に好ましい実施形態によると、前記ペプチドは、単一のコピーまたは多数のコピーのプロテインＡまたはその断片、例えば、その１つまたは複数のＤサブユニットなどによって構成される。本発明の別の特に好ましい実施形態によると、前記ペプチドは、抗体断片、例えば、抗原を提示することができる細胞上で発現される受容体に特異的に結合する単鎖抗体断片などによって構成される。

ペプチドは、生じた融合タンパク質が、水溶性およびネイティブな毒素に結合している受容体とは異なる特異的な細胞受容体に融合タンパク質をターゲティングする能力を保有し、それによって、少なくとも前記サブユニットの細胞内取り込みを媒介するものであることが好ましい。

自己抗原エピトープは、自己免疫疾患、例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、またはシェーグレン症候群（ＳＳ）などと関連し得る。

いくつかの実施形態では、ＩＤＤＭに関連する自己抗原エピトープは、プレプロインスリン；プロインスリン、インスリン、およびインスリンＢ鎖；グルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）−６５およびグルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）−６７；チロシンホスファターゼＩＡ−２；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）および膵島細胞抗原６９ｋＤからなる群に由来するエピトープである。

いくつかの実施形態では、ＭＳに関連する自己抗原エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、およびミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）からなる群に由来するエピトープである。

いくつかの実施形態では、ＲＡに関連する自己抗原エピトープは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲン、ＧＰ−３９、フィラグリン、ならびにフィブリンからなる群に由来するエピトープである。好ましい一実施形態では、エピトープはＩＩ型コラーゲンに由来し、エピトープは、アミノ酸２６０〜２７３を含む共有免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０〜２７３）であることが好ましい。

アレルギー性エピトープは、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性肺胞炎、アトピー性皮膚炎、または食物過敏症と関連し得る。いくつかの実施形態では、アレルギー性エピトープは、植物の花粉に由来するエピトープ、例えば、オリーブの花粉由来のＯｌｅ ｅ１アレルゲン、スギの花粉由来のＣｒｙ ｊＩアレルゲンおよびＣｒｙ ｊＩＩアレルゲン、オオアワガエリの花粉のｎＰｈｌ ｐ４、カバノキの花粉の主要アレルゲンであるＢｅｔ ｖ１、またはヨモギの花粉の主要アレルゲンであるＡｒｔ ｖ１など；動物抗原に由来するエピトープ、例えば、ネコのアレルゲンであるＦｅｌ ｄ１、イヌのアレルゲンであるＣａｎ ｆ１、またはチリダニ（ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ）のアレルゲンであるＤｅｒ ｆ１、Ｄｅｒ ｐ１、Ｄｅｒ ｍ１、Ｂｌｏ ｔ４など；真菌の抗原に由来するエピトープ、例えば、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）抗原であるＡｌｔ ａ１、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｉｇｕｌｌｕｓ）抗原であるＡｓｐ ｆ１、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）抗原であるＣｌＡ ｈ１およびＣｌａ ｈ２、またはペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）抗原であるＰｅｎ ｃｈ１３など；または食物アレルゲンに由来するエピトープ、例えば、ニワトリ卵白のアレルゲンであるＧａｌ ｄ１、Ｇａｌ ｄ２、およびＧａｌ ｄ３、ピーナッツのアレルゲンであるＡｒａ ｈ２、ダイズのアレルゲンであるＧｌｙ ｍ１、Ｇｌｙ ｍ５およびＧｌｙ ｍ６、魚のアレルゲンであるＧａｄ ｃ１、またはエビのアレルゲンであるＰｅｎ ａ１などである。

好ましい一実施形態では、免疫調節性複合体は、融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ（配列番号４）であり、ここでＣＯＬはアミノ酸２６０〜２７３を含む共有免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０〜２７３）（配列番号５）である。別の実施形態では、免疫調節性複合体は、融合タンパク質ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ（配列番号１０）である。別の好ましい実施形態では、免疫調節性複合体は、融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ１６９−ＤＤ（配列番号１１）である。さらに別の好ましい実施形態では、免疫調節性複合体は、融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ２１１−ＤＤ（配列番号１２）である。さらに別の好ましい実施形態では、免疫調節性複合体は、融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ２７４−ＤＤ（配列番号１３）である。さらに別の好ましい実施形態では、免疫調節性複合体は、融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｂｅｔｖ１−ＤＤ（配列番号１７）である。さらに別の好ましい実施形態では、免疫調節性複合体は、融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｐｈｌｐ５−ＤＤ（配列番号１８）である。さらに別の好ましい実施形態では、免疫調節性複合体は融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｐｈｌｐ５−ＤＤ（配列番号１９）である。

本発明は、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびグレーブス病などを治療、予防および／または防止するための方法および組成物であって、対象に、疾患に関連する１個以上の自己抗原エピトープを含む本発明による免疫調節性複合体を投与することを含む方法および組成物を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、自己免疫疾患であるインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を治療、予防および／または防止するための改善された方法であって、対象に、ＩＤＤＭに関連する１種または複数種の自己抗原エピトープを含む本発明による免疫調節性複合体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＩＤＤＭに関連する自己抗原エピトープは、プレプロインスリン；プロインスリン、インスリン、およびインスリンＢ鎖；グルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）−６５およびグルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）−６７；チロシンホスファターゼＩＡ−２；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）および膵島細胞抗原６９ｋＤからなる群に由来するエピトープである。

本発明の他の実施形態では、多発性硬化症（ＭＳ）を治療、予防および／または防止するための改善された方法であって、対象に、ＭＳに関連する１個以上の自己抗原エピトープを含む本発明による免疫調節性複合体を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、自己抗原エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、およびミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）からなる群に由来するエピトープである。

他の実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）を治療、予防および／または防止するための改善された方法であって、対象に、ＲＡに関連する１個以上の自己抗原エピトープを含む本発明による免疫調節性複合体を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、自己抗原エピトープは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲン、ＧＰ−３９、フィラグリン、およびフィブリンからなる群に由来するエピトープである。好ましい一実施形態では、エピトープはＩＩ型コラーゲンに由来し、エピトープは、アミノ酸２６０〜２７３を含む共有免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０〜２７３）であることが好ましい。

異なる自己抗原エピトープを含む多数の免疫調節性複合体をカクテルとして投与することができ、個々の免疫調節性複合体は、多数の自己抗原エピトープを含んでよい。同様に、異なるアレルギー性エピトープを含む多数の免疫調節性複合体をカクテルとして投与することができ、個々の免疫調節性複合体は、多数のアレルギーの原因になるエピトープを含んでよい。

特定の変形では、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を治療、予防および／または防止するための方法および組成物は、本発明による免疫調節性複合体を、他の物質、例えば、免疫調節性配列、薬理作用物質、アジュバント、サイトカイン、またはサイトカインをコードするベクターを含むポリヌクレオチドなどと組み合わせて投与することをさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態は、本発明による免疫調節性複合体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、アレルギー性疾患または自己免疫疾患を予防、防止および／または治療するために使用することができる。自己免疫疾患は、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス、およびグレーブス病からなる群から選択することができる。アレルギー性疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性肺胞炎、アトピー性皮膚炎、または食物過敏症からなる群から選択することができる。

本発明のさらに別の実施形態は、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を予防、防止および／または治療するための医薬品を製造するための、本発明による免疫調節性複合体の使用を提供する。自己免疫疾患は、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス、およびグレーブス病からなる群から選択することができる。アレルギー性疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性肺胞炎、アトピー性皮膚炎、または食物過敏症からなる群から選択することができる。

さらに別の実施形態では、本発明は、本発明による免疫調節性複合体をコードする単離された核酸配列を提供する。したがって、本発明は、コレラ毒素（ＣＴＡ１）のＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの突然変異体サブユニット、特異的な細胞受容体に結合することができるペプチド、および自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に関連する１個以上のエピトープを含む融合タンパク質である免疫調節性複合体をコードする単離された核酸配列を提供する。

一実施形態では、本発明による核酸は、
（ａ）コレラ毒素（ＣＴＡ１）のＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの突然変異体サブユニット、
（ｂ）特異的な細胞受容体に結合することができるペプチド、および
（ｃ）自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に関連する１種または複数種のエピトープ
を含む融合タンパク質であって、突然変異体ＣＴＡ１サブユニットにおいて、ネイティブなＣＴＡ１におけるアミノ酸７のアルギニン、およびアミノ酸１８７のシステインに対応するアミノ酸が置き換えられている融合タンパク質である免疫調節性複合体をコードする。

好ましい一実施形態では、突然変異体ＣＴＡ１サブユニットのＮ末端にアミノ酸リジンがさらに挿入されている。

好ましい一実施形態では、本発明による核酸は、ネイティブなＣＴＡ１配列におけるアミノ酸７のアルギニンがリジンと置き換えられており、ネイティブなＣＴＡ１配列におけるアミノ酸１８７のシステインがアラニンと置き換えられているＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ突然変異体（配列番号１）を含む融合タンパク質をコードする。

さらに好ましい一実施形態では、本発明による核酸は、ネイティブなＣＴＡ１配列におけるアミノ酸７のアルギニンがリジンと置き換えられており、ネイティブなＣＴＡ１配列におけるアミノ酸１８７のシステインがアラニンと置き換えられており、Ｎ末端にアミノ酸リジンが挿入されているＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ突然変異体（配列番号２）を含む融合タンパク質をコードする。

一実施形態では、本発明による核酸は、抗原を提示することができる細胞、特に、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している細胞上で発現される受容体に特異的に結合するペプチドを含む融合タンパク質をコードする。抗原提示細胞は、Ｂリンパ球、Ｔ細胞などのリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞および内皮細胞からなる群から選択することができる。

一実施形態では、本発明による核酸は、自己免疫疾患、例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、またはシェーグレン症候群（ＳＳ）などに関連する自己抗原エピトープを含む融合タンパク質をコードする。

別の実施形態では、本発明による核酸は、アレルギー性疾患、例えば、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性肺胞炎、アトピー性皮膚炎、または食物過敏症などに関連するアレルギー性エピトープを含む融合タンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、ＩＤＤＭに関連する自己抗原エピトープは、プレプロインスリン；プロインスリン、インスリン、およびインスリンＢ鎖；グルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）−６５およびグルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）−６７；チロシンホスファターゼＩＡ−２；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）および膵島細胞抗原６９ｋＤからなる群に由来するエピトープである。いくつかの実施形態では、ＭＳに関連する自己抗原エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、およびミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）からなる群に由来するエピトープである。いくつかの実施形態では、ＲＡに関連する自己抗原エピトープは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲン、ＧＰ−３９、フィラグリン、ならびにフィブリンからなる群に由来するエピトープである。いくつかの実施形態では、ＳＳに関連する自己抗原エピトープは、熱ショックタンパク質ＨＳＰ６０、フォドリン、Ｒｏ（またはＳＳＡ）リポタンパク質およびＬａ（またはＳＳＢ）リボ核タンパク質からなる群に由来するエピトープである。

本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。

本発明による核酸は、融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤをコードする核酸配列、例えば、配列番号３の核酸配列など；融合タンパク質ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤをコードする核酸配列、例えば、配列番号９の核酸配列など；融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ１６９−ＤＤをコードする核酸配列；融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ２１１−ＤＤをコードする核酸配列；融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ２７４−ＤＤをコードする核酸配列；融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｂｅｔｖ１−ＤＤをコードする核酸配列；融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｐｈｌ ｐ１−ＤＤをコードする核酸配列；および融合タンパク質Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｐｈｌ ｐ５−ＤＤをコードする核酸配列であってよい。

別の実施形態では、本発明は、本発明による核酸を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、アレルギー性疾患または自己免疫疾患を予防、防止および／または治療するために使用することができる。本発明は、さらに、対象における自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を予防、防止および／または治療するための方法であて、対象に本発明による核酸を有効量で投与することを含む方法を提供する。

さらに別の実施形態では、本発明は、本発明による核酸を含む組換え型のプラスミド、ベクターおよび発現系を提供する。組換え発現系は、細菌性の発現に適していることが好ましい。本発明は、さらに、本発明によるプラスミド、ベクターまたは発現系を含有する形質転換された細胞を提供する。形質転換された細胞は、形質転換された細菌の細胞であることが好ましい。

定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および句は、別段の指定のない限りそれらに帰する意味を有する。

コレラ毒素（ＣＴＡ１）のＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットのアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＭ２２５８６．１、ＡＤＧ４４９２６．１、ＡＡＭ７４１７０．１、ＣＡＥ１１２１８．１、またはＡＡＡ２７５１４．１において見出すことができる。「コレラ毒素（ＣＴＡ１）のＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットのサブユニット」という用語は、少なくとも、コレラ毒素（ＣＴＡ１）の成熟ＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの配列のアミノ酸７のリジンからアミノ酸１８７のシステインまでの配列に対応する配列を含むポリペプチド、例えば、少なくとも、コレラ毒素（ＣＴＡ１）の成熟ＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの配列のアミノ酸１のアスパラギン（ａｓｐａｒｇｉｎｅ）からアミノ酸１８７のシステインまでの配列に対応する配列、または少なくとも、コレラ毒素（ＣＴＡ１）の成熟ＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの配列のアミノ酸１のアスパラギンからアミノ酸１９４のセリンまでの配列に対応する配列を含むポリペプチドなどを指す。

「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リン酸ジエステル結合を介して連結した多数のヌクレオチド単位（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｍｉｃｌｅｏｔｉｄｅ）または関連する構造変異体）で構成されるポリマーを指す。ポリヌクレオチドまたは核酸は、実質的にいかなる長さのものであってもよく、一般には、約６ヌクレオチド〜約１０^９ヌクレオチド、またはそれ以上である。ポリヌクレオチドおよび核酸とは、当業者に容易に理解される通り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方の、二本鎖または一本鎖であり、化学的または生化学的に修飾されていてもよい、または、非天然ヌクレオチド塩基または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有してよい、ＲＮＡ、ＤＮＡ、合成の形態、および混合ポリマーを含む。

「抗原」とは、本明細書で使用される場合、Ｂ細胞またはＴ細胞、またはその両方による免疫系によって認識され得る任意の分子を指す。

「自己抗原」とは、本明細書で使用される場合、内在性分子、一般には、病原性免疫応答を引き出す多糖またはタンパク質またはその断片を指す。自己抗原としては、グリコシル化されたタンパク質およびペプチドならびにシトルリン化されたペプチドを含めた他の形態の翻訳後修飾を保有するタンパク質およびペプチドが挙げられる。自己抗原またはそのエピトープについて、「自己免疫疾患に関連する」と言及される場合、自己抗原またはエピトープが、病態生理（すなわち、疾患の病因に関連する）を誘導すること、病態生理プロセスを媒介するまたは容易にすること；および／または病態生理プロセスの標的となること、のいずれかによって、疾患の病態生理に関与することを意味することが理解される。例えば、自己免疫疾患では、免疫系が自己抗原を異常に標的とし、自己抗原が発現および／または存在している細胞および組織の損傷および機能障害を引き起こす。正常な生理的状態では、自己抗原は、「免疫寛容」と称されるプロセスにより、自己抗原を認識する能力を有する免疫細胞の排除、不活性化、または活性化の欠如によって宿主免疫系から無視される。

「アレルゲン」とは、本明細書で使用される場合、外因性の分子、一般には、病原性免疫応答を引き出す多糖またはタンパク質またはその断片を指す。アレルゲンとしては、グリコシル化されたタンパク質およびペプチドならびに他の形態の翻訳後修飾を保有するタンパク質およびペプチドが挙げられる。アレルゲンは、例えば、花粉、真菌、昆虫毒液、鱗屑、カビ、食糧由来であってよい。多数の食物アレルゲン、例えば、ピーナッツのＡｒａ ｈ１、Ａｒａ ｈ２、Ａｒａ ｈ３およびＡｒａ ｈ６；ニワトリ卵白のＧａｌ ｄ１、Ｇａｌ ｄ２、およびＧａｌ ｄ３；ダイズのＧｌｙ ｍ１；魚のＧａｄ ｃ１；およびエビのＰｅｎ ａ１などが精製され、よく特徴付けられている。ネコの主要アレルゲン（Ｆｅｌ ｄ１）およびイヌの主要アレルゲン（Ｃａｎ ｆ１）、ならびにチリダニのアレルゲンであるＤｅｒ ｆ１およびＤｅｒ ｐ１がよく特徴付けられている。ネイティブなオオアワガエリの花粉のｎＰｈｌ ｐ４ならびにいくつもの関連する組換えアレルゲンであるｒＰｈｌ１ｐ、ｒＰｈｌ２ｐ、ｒＰｈｌ５ｐ、ｒＰｈｌ６ｐ、ｒＰｈｌ７ｐ、ｒＰｈｌ１１ｐ、ｒＰｈｌ１２ｐ、カバノキの花粉の主要アレルゲンであるＢｅｔ ｖ１、オオバコの花粉の主要アレルゲンであるＰｌａ Ｉ １、オリーブの花粉の主要アレルゲンであるＯｌｅ ｅ１、ブタクサ（ｒａｇｇｗｅｅｄ）の花粉の主要アレルゲンであるＡｍｂ ａ１、ヨモギ属（ａｒｔｅｍｅｓｉａ）の花粉の主要アレルゲンであるＡｒｔ ｖ１およびＡｒｔ ｖ３が明確に定義されている。

本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、動物の免疫系のＢ細胞またはＴ細胞のいずれかによって認識される特定の形状または構造を有する多糖またはポリペプチドの部分を意味すると理解される。エピトープは、多糖とポリペプチド、例えばグリコシル化されたペプチドの両方の部分を含んでよい。

「自己抗原エピトープ」とは、病原性免疫応答を引き出す自己抗原のエピトープを指す。

「アレルギーの原因になるエピトープ」とは、病原性免疫応答を引き出すアレルゲンのエピトープを指す。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーにあてはまる。

「自己タンパク質」、「自己ポリペプチド」、または「自己ペプチド」は、本明細書では互換的に使用され、動物のゲノム内にコードされる任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、またはその断片または誘導体；動物において産生または生成される任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、またはその断片または誘導体；動物の生涯の間のある時に翻訳後修飾され得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、またはその断片または誘導体；および、動物に非生理的に存在する任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、またはその断片または誘導体を指す。「非生理的」または「非生理的に」という用語は、本発明の自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドを説明するために使用される場合、その自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドの動物における正常な役割またはプロセスからの逸脱または偏差を意味する。自己タンパク質、自己ポリペプチドまたは自己ペプチドについて、「疾患に関連する」または「疾患に関与する」と言及される場合、自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドは、その形態または構造が修飾され、したがって、その生理的な役割またはプロセスを実施することができない可能性がある、または、病態生理を誘導することによって；病態生理プロセスを媒介する、または容易にすることによって；および／または病態生理プロセスの標的になることによってのいずれかにより、状態または疾患の病態生理に関与し得ることを意味することが理解される。例えば、自己免疫疾患では、免疫系は自己タンパク質を異常に攻撃し、自己タンパク質が発現および／または存在している細胞および組織の損傷および機能障害を引き起こす。あるいは、自己タンパク質、自己ポリペプチドまたは自己ペプチドは、それ自体が非生理的レベルで発現され、かつ／または非生理的に機能することがある。例えば、神経変性疾患では、自己タンパク質が異常に発現され、脳内の病変に凝集し、それによって、神経の機能障害を引き起こす。他の場合では、自己タンパク質は、望ましくない状態またはプロセスを悪化させる。例えば、変形性関節症では、コラゲナーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼを含めた自己タンパク質は、関節の関節面を覆う軟骨を異常に分解する。自己タンパク質、自己ポリペプチドまたは自己ペプチドの翻訳後修飾の例は、グリコシル化、脂質基の付加、可逆的なリン酸化、ジメチルアルギニン残基の付加、シトルリン化、およびタンパク質分解、より詳細には、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるフィラグリンおよびフィブリンのシトルリン化、アルファベータ−クリスタリンリン酸化、ＭＢＰのシトルリン化、およびカスパーゼおよびグランザイムによるＳＬＥ自己抗原タンパク質分解である。免疫学的に、自己タンパク質、自己ポリペプチドまたは自己ペプチドは、全て、宿主の自己抗原とみなされ、正常な生理的状態では、「免疫寛容」と称されるプロセスにより、自己抗原を認識する能力を有する免疫細胞の排除、不活性化、または活性化の欠如によって宿主免疫系から無視される。自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドは、免疫機能を調節するために免疫系の細胞によって生理的に排他的に発現される分子である免疫タンパク質、免疫ポリペプチド、または免疫ペプチドを含まない。免疫系は、動物界に生息する無数の潜在的に病原性の微生物に対する急速であり、高度に特異的であり、かつ防御的な応答を行う手段をもたらす防御機構である。免疫タンパク質、免疫ポリペプチドまたは免疫ペプチドの例は、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、Ｉ型インターロイキン、およびインターフェロンおよびＩＬ−１０、ＴＮＦ、リンホトキシンを含めたＩＩ型サイトカインを含めたサイトカイン、ならびにケモカイン、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ、マクロファージ炎症性タンパク質−１ベータ、単球走化性タンパク質およびＲＡＮＴＥＳなど、ならびに免疫機能に直接関与する他の分子、例えば、Ｆａｓ−リガンドなどを含むタンパク質である。本発明の自己タンパク質、自己ポリペプチドまたは自己ペプチド中には特定の免疫タンパク質、免疫ポリペプチドまたは免疫ペプチドが含まれ、それらは：クラスＩ ＭＨＣ膜糖タンパク質、クラスＩＩ ＭＨＣ糖タンパク質およびオステオポンチンである。自己タンパク質、自己ポリペプチドまたは自己ペプチドは、代謝的または機能的な障害を引き起こす遺伝的欠損または後天的欠損に起因して、対象に完全にまたは実質的に存在しないタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含まず、該タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを投与することによって、または該タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって置き換えられる（遺伝子療法）。そのような障害の例としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症、およびホモシスチン尿症が挙げられる。

「の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ）」、「調節すること（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」、または「免疫応答を変化させること」とは、本明細書で使用される場合、例えば、免疫調節性複合体または免疫調節性複合体をコードするポリヌクレオチドを投与した結果として生じる核酸、脂質、リン脂質、炭水化物、自己ポリペプチド、タンパク質複合体、またはリボ核タンパク質複合体を含めた自己免疫またはアレルギーの原因になるエピトープに対する既存の免疫応答または潜在的な免疫応答のあらゆる変更を指す。そのような調節は、免疫応答に関与する、または免疫応答に関与することができるあらゆる免疫細胞の存在、能力、または機能のあらゆる変更を含む。免疫細胞としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、非プロフェッショナル抗原提示細胞、炎症細胞、または免疫応答に関与する、またはそれに影響を及ぼすことができるあらゆる他の細胞が挙げられる。「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、既存の免疫応答、発生中の免疫応答、潜在的な免疫応答に与えられる任意の変化、または免疫応答を誘導する、調節する、影響を及ぼす、または応答する能力を含む。調節は、免疫応答の一部として免疫細胞における遺伝子、タンパク質および／または他の分子の発現および／または機能のあらゆる変更を含む。

「免疫応答の調節」とは、例えば、以下を含む：免疫細胞を排除すること、欠失させること、または隔離すること；他の細胞、例えば、自己反応性リンパ球、抗原提示細胞、または炎症細胞などの機能的な能力を調節することができる免疫細胞を誘導または生成すること；免疫細胞の不応答性の状態（すなわち、アネルギー）を誘導すること；これらに限定されないが、免疫細胞によって発現されるタンパク質のパターンを変更することを含めた、免疫細胞の活性もしくは機能、またはそのための能力を増大、低下、または変化させること。例としては、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、転写因子、キナーゼ、共刺激分子、または他の細胞表面受容体などの特定のクラスの分子の産生および／または分泌を変更すること；またはこれらの調節性の事象の任意の組み合わせが挙げられる。

例えば、免疫調節性複合体または免疫調節性複合体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、望ましくない免疫応答を媒介する、または媒介することができる免疫細胞を排除、隔離、または不活性化すること；防御免疫応答を媒介するまたは媒介することができる免疫細胞を誘導すること、生成すること、または作動させること；免疫細胞の物理的性質または機能的性質を変化させること；またはこれらの効果の組み合わせによって、免疫応答を調節することができる。免疫応答の調節の測定の例としては、これらに限定されないが、免疫細胞集団の存在または非存在の検査（フローサイトメトリー、免疫組織学的検査、組織学的検査、電子顕微鏡、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する）；シグナルに反応して増殖または分離する能力または抵抗性を含めた免疫細胞の機能的な能力の測定（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗Ｔ細胞受容体抗体、抗ＣＤ２８抗体、カルシウムイオノフォア、ＰＭＡ、ペプチド抗原またはタンパク質抗原を担持する抗原提示細胞を用いて刺激した後の^３Ｈ−チミジンの組み入れに基づくＴ細胞増殖アッセイおよびペップスキャン分析（ｐｅｐｓｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）；Ｂ細胞増殖アッセイを使用するなど）；他の細胞を死滅させるまたは溶解する能力の測定（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイなど）；サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体および細胞の他の産物の測定（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着検定法、ウエスタンブロット分析、タンパク質 マイクロアレイ解析、免疫沈降分析による）；免疫細胞内の、免疫細胞またはシグナル伝達経路の活性化の生化学的マーカーの測定（例えば、チロシン、セリンまたはトレオニンのリン酸化、ポリペプチドの切断、およびタンパク質複合体の形成または解離のウエスタンブロットおよび免疫沈降分析；タンパク質アレイ解析；ＤＮＡアレイまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用したＤＮＡの転写のプロファイリング）；アポトーシス、壊死、または他の機構による細胞死の測定（例えば、アネキシンＶ染色、ＴＵＮＥＬアッセイ、ＤＮＡラダリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）を測定するためのゲル電気泳動、組織学的検査；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウエスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生される遺伝子、タンパク質、および他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、２次元ゲル電気泳動、ウエスタンブロット分析、酵素連結免疫吸着検定法、フローサイトメトリー）；ならびに臨床的な症状または転帰、例えば、自己免疫疾患、神経変性疾患、および自己タンパク質または自己ポリペプチドに関与する他の疾患の改善（臨床スコア、追加的な療法を用いるための要件、機能の状態、画像化試験）の測定、例えば、多発性硬化症の場合では再発率または疾患の重症度を測定すること（当業者に公知の臨床スコアを使用する）、１型糖尿病の場合では血中ブドウ糖を測定すること、または関節リウマチの場合では関節の炎症を測定することによる測定、などの測定が挙げられる。

「対象」とは、あらゆる動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモットまたはウサギなどを意味するべきである。

疾患または障害を「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、その「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、免疫調節性複合体または免疫調節性複合体をコードするポリヌクレオチドを単独で、または本明細書に記載の別の化合物と組み合わせて投与することにより、臨床症状または診断症状のいずれかが減少する、休止するまたは排除されることによって証明される通り、疾患の進行が遅くなること、阻止されることまたは反転することを意味するべきである。「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、急性または慢性の疾患または障害の症状の重症度が低下すること、または、例えば、再発寛解型（ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｏｒ ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ）自己免疫疾患の過程の場合では再発率が低下すること、または自己免疫疾患の炎症性の態様の場合では炎症が減少することも意味する。好ましい実施形態では、疾患を治療することとは、疾患の進行を、理想的には疾患それ自体が排除されるポイントまで反転させることまたは阻止することまたは緩和することを意味する。本明細書で使用される場合、疾患を改善させることと、疾患を治療することは等しい。

疾患または障害を「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、その「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」、または「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明に関して使用される場合、免疫調節性複合体または免疫調節性複合体をコードするポリヌクレオチドを単独で、または本明細書に記載の別の化合物と組み合わせて投与して、疾患もしくは障害の出現もしくは発症または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全部を妨げる、または、疾患もしくは障害が発症する可能性を減らすことを指す。

免疫調節性複合体の「治療的または予防的に有効な量」とは、例えば、疾患の症状および／または原因を改善または排除することによって疾患を治療または防止するために十分な免疫調節性複合体の量を指す。例えば、治療有効量は、広範な範囲内に入り、臨床試験によって決定され、特定の患者について、例えば、疾患の重症度、患者の体重、年齢、および他の因子を含めた熟練臨床医に公知の因子に基づいて決定される。

免疫調節性複合体Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤをコードするＤＮＡコンストラクト。 ｐＣＴＡ１−ＤＤプラスミドは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングされたコレラ毒素Ａ１遺伝子（アミノ酸１〜１９４）およびｔｒｐプロモーターの制御下にあるブドウ球菌のプロテインＡ遺伝子由来の２つのＤ断片を含有する。コラーゲンペプチドを、ＣＴＡ１とＤＤ断片の間に挿入して、ｐＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤを生じさせた。Ｒ７Ｋ突然変異およびＣ１８７Ａ突然変異をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）突然変異誘発によって構築し、ｐＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤを生じさせた。Ｐｔｒｃ＝Ｐｔｒｃプロモーターである。ＣＯＬ２Ａ１＝コラーゲンペプチドであり、Ｄ＝黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ由来のＩｇ結合性エレメントである。 マウスＣＩＡモデルにおけるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤとＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの治療効果の比較。 Ａ．関節炎指数（Ａｒｔｈｒｉｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ）である。Ｂ．関節炎（Ａｒｔｈｔｒｉｔｉｓ）の頻度である。 −■−はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤであり、−◆−はＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤであり、−□−はＰＢＳ対照である。 マウスＣＡＩＡモデルにおけるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤとＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの治療効果の比較。 関節炎指数である。−■−はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤであり、−◆−はＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤであり、−□−はＰＢＳ対照である。 分析的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して試験したＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤおよびＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの二量体形成。 ＡはＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤであり、ＢはＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤである。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤとＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの純度の比較。 レーン１は、分子量の標準であり；レーン２はＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ（１.３μｇ）であり；レーン３はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ（１.１μｇ）である。

本発明は、改善された免疫調節性複合体およびそれらを含有する組成物、ならびに医薬品を製造するための、および対象における、対象に存在する１個以上の自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドに関連し、非生理的状態を伴う疾患を予防、防止および／または治療するための方法におけるその使用に関する。本発明による改善された免疫調節性複合体は、コレラ毒素（ＣＴＡ１）の突然変異体Ａ１サブユニット、特異的な細胞受容体に結合することができるペプチド、および疾患に関連する１個以上のエピトープを含む融合タンパク質である。本発明のある特定の実施形態は、より詳細には、多発性硬化症、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデスおよびグレーブス病などの非生理的状態にある対象に存在する１個以上の自己ポリペプチドに関連する自己免疫疾患を予防、防止および／または治療するための方法および組成物に関する。本発明は、対象に、疾患に関連する１個以上の自己抗原エピトープを含む免疫調節性複合体を投与することを含む、自己免疫疾患を予防、防止および／または治療するための改善された方法を提供する。１個以上の自己抗原エピトープを含む免疫調節性複合体を、治療的または防止的に有効な量で対象に投与することにより、自己免疫疾患に関連する自己抗原に対する免疫応答の抑制が引き出され、それによって、疾患が治療または防止される。

自己免疫疾患
自己免疫疾患に関連する自己抗原のいくつかの例が表１に記載されており、詳細な例が、本明細書において、下でさらに詳細に記載されている。

関節リウマチ。関節リウマチ（ＲＡ）は、世界人口の０.８％に影響を及ぼしている慢性の自己免疫性炎症性滑膜炎である。関節リウマチは、びらん性の関節破壊を引き起こす慢性の炎症性の滑膜炎を特徴とする。ＲＡは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージによって媒介される。

Ｔ細胞が、ＲＡにおいて決定的な役割を果たすという証拠としては、（１）滑膜に浸潤しているＣＤ４^＋Ｔ細胞の優性、（２）シクロスポリンなどの薬物を用いたＴ細胞機能の抑制に伴う臨床的な改善、および（３）ＲＡと特定のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子との関連性が挙げられる。ＲＡに関連するＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は、ペプチド結合およびＴ細胞に対する提示に関与するβ鎖の第３の超可変領域内の６７〜７４位のアミノ酸と同様の配列を含有する。ＲＡは、滑液関節内に存在する自己タンパク質または修飾された自己タンパク質を認識する自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。ＲＡにおいて標的とされる自己抗原は、例えば、ＩＩ型コラーゲン；ｈｎＲＮＰ；Ａ２／ＲＡ３３；Ｓａ；フィラグリン；ケラチン；シトルリン；ｇｐ３９を含めた軟骨タンパク質；Ｉ５型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン；ＨＳＰ−６５／６０；ＩｇＭ（リウマチ因子）；ＲＮＡポリメラーゼ；ｈｎＲＮＰ−Ｂｌ；ｈｎＲＮＰ−Ｄ；カルジオリピン；アルドラーゼＡ；シトルリン修飾されたフィラグリンおよびフィブリン由来のエピトープを含む。修飾されたアルギニン残基（脱イミン化（ｄｅ−ｉｍｉｎａｔｅ）してシトルリンを形成する）を含有する、フィラグリンペプチドを認識する自己抗体が高い割合のＲＡ患者の血清中で同定されている。一部の患者では、自己反応性のＴ細胞応答およびＢ細胞応答はどちらも同じ免疫優性ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）ペプチド２５７〜２７０を対象とする。

多発性硬化症。多発性硬化症（ＭＳ）は、最も一般的なＣＮＳの脱髄性疾患であり、米国人３５０，０００人および世界的に１００万人に影響を及ぼしている。症状の発症は、一般には、２０歳から４０歳の間に生じ、片側性の視力障害、筋肉の衰弱、感覚異常症、運動失調、眩暈、尿失禁、構音障害、または精神障害（頻度が減少する順）の急性または亜急性の発作として顕在化する。そのような症状は、軸索伝導が遅くなることによる負の伝導異常と、異所性インパルスの生成による正の伝導異常（例えば、レルミット症状）の両方を引き起こす脱髄の限局性の病変に起因する。ＭＳの診断は、少なくとも２つの、時間的に離れ、神経性の機能障害の客観的な臨床的な証拠を生じ、ＣＮＳ白質の別々の領域に関与する神経性の機能障害の別個の発作歴に基づく。ＭＳの診断を支持する追加的な客観的な証拠をもたらす研究室試験としては、ＣＮＳ白質病変の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＩｇＧの脳脊髄液（ＣＳＦ）オリゴクローナルバンド形成、および応答を異常に惹起することが挙げられる。大部分の患者は徐々に進行性再発寛解型疾患の過程をたどるが、ＭＳの臨床的な過程は、個体間で著しく変動し、生涯にわたるいくつかの穏やかな発作から劇症性の慢性の進行性疾患までにわたり得る。ＩＦＮ−ガンマを分泌する能力を有するミエリン自己反応性Ｔ細胞の定量的増加は、ＭＳおよびＥＡＥの発病に関連する。

自己免疫性脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症および実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）などにおける自己免疫応答の自己抗原標的は、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）；環式ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）；ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＢＯＰ）；アルファ−Ｂ−クリスタリン（熱ショックタンパク質）；ウイルス性模倣ペプチドおよび細菌性模倣ペプチド、例えば、インフルエンザ、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなど；ＯＳＰ（オリゴデンドロサイト特異的タンパク質）；シトルリン修飾されたＭＢＰ（６つのアルギニンが脱イミン化されてシトルリンになっているＭＢＰのＣ８アイソフォーム）など由来のエピトープを含み得る。不可欠な膜タンパク質ＰＬＰは、ミエリンの優性自己抗原である。ＰＬＰ抗原性の決定因子はいくつかのマウス系統において同定されており、残基１３９〜１５１、１０３〜１１６、２１５〜２３２、４３〜６４および１７８〜１９１を含む。少なくとも２６種のＭＢＰエピトープが報告されている（Meinl et al., J Clin Invest 92, 2633-43, 1993）。残基１〜１１、５９〜７６および８７〜９９に注目すべきである。いくつかのマウス系統において同定された免疫優性ＭＯＧエピトープは残基１〜２２、３５〜５５、６４〜９６を含む。

ヒトＭＳ患者では、以下のミエリンのタンパク質およびエピトープが自己免疫性のＴ細胞応答およびＢ細胞応答の標的として同定された。ＭＳ脳プラークから溶出させた抗体は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド８３〜９７を認識した（Wucherpfennig et al., J Clin Invest 100:1114-1122, 1997）。別の試験では、ＭＳ患者のおよそ５０％がミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対して末梢血リンパ球（ＰＢＬ）Ｔ細胞応答性（対照は６〜１０％）を有し、２０％がＭＢＰに対して応答性であり（対照は８〜１２％）、８％がＰＬＰに対して応答性であり（対照は０％）、０％がＭＡＧに対して応答性（対照は０％）であることが見出された。この試験では、ＭＯＧ応答性の患者１０人のうち７人が、ＭＯＧ１〜２２、ＭＯＧ３４〜５６、ＭＯＧ６４〜９６を含めた３種のペプチドエピトープのうちの１種に焦点が合ったＴ細胞増殖応答を有した（Kerlero de Rosbo et al., Eur J Immunol 27:3059-69, 1997）。Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答（脳の病変から溶出したＡｂ）は、ＭＢＰ８７〜９９に焦点が合っている（Oksenberg et al., Nature 362:68-70, 1993）。ＭＢＰ８７〜９９では、アミノ酸モチーフＨＦＦＫは、Ｔ細胞応答とＢ細胞応答の両方の優性の標的である（Wucherpfennig et al., J Clin Invest 100:1114-22, 1997）。別の試験では、残基ＭＯＢＰ２１〜３９およびＭＯＢＰ３７〜６０を含めたミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）に対するリンパ球応答性が観察された（Holz et al., J Immunol 164:1103-9, 2000）。ＭＯＧペプチドおよびＭＢＰペプチドの免疫金コンジュゲートを使用してＭＳおよび対照の脳を染色すると、ＭＢＰペプチドとＭＯＧペプチドはどちらも、ＭＳプラークに結合したＡｂによって認識された（Genain and Hauser, Methods 10:420-34, 1996）。

インスリン依存性糖尿病。ヒト１型またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、膵臓のランゲルハンス島内のβ細胞の自己免疫破壊を特徴とする。β細胞が枯渇することにより、血液中のグルコースのレベルを調節することができなくなる。顕性糖尿病は、血液中のグルコースのレベルが特定のレベル、通常は約２５０ｍｇ／ｄｌを超えて上昇した場合に生じる。ヒトでは、糖尿病の発症には長い前駆症状性の期間が先行する。この間中、膵ベータ細胞の機能が段階的に損失する。疾患の発生は、インスリン、グルタミン酸脱炭素酵素、およびチロシンホスファターゼＩＡ２（ＩＡ２）に対する自己抗体の存在と関係する。

前駆症状段階の間に評価することができるマーカーは、膵臓における膵島炎の存在、膵島細胞抗体のレベルおよび発生頻度、膵島細胞表面の抗体、膵ベータ細胞におけるクラスＩＩ ＭＨＣ分子の異所性発現、血液中のグルコース濃度、およびインスリンの血漿中濃度である。膵臓中のＴリンパ球、膵島細胞抗体および血中ブドウ糖の数の増加により、インスリン濃度の減少と同様に、疾患が示される。

非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、ヒトＩＤＤＭと共通の多くの臨床的特徴、免疫学的特徴、および病理組織学的特徴を有する動物モデルである。ＮＯＤマウスでは、膵島の炎症およびベータ細胞の破壊が自然発生し、それが高血糖症および顕性糖尿病につながる。糖尿病の発生にはＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方が必要であるが、それぞれの役割は、不明なままである。ＮＯＤマウスに寛容化状態でタンパク質としてインスリンまたはＧＡＤ５を投与することにより、疾患が防止され、他の自己抗原に対する応答が下方制御されることが示されている。

血清中に、種々の特異性を有する自己抗体の組み合わせが存在することは高感度であり、ヒト１型糖尿病に特異的である。例えば、ＧＡＤおよび／またはＩＡ−２に対する自己抗体の存在は、１型糖尿病を対照の血清から見分けることに関する感度がおよそ９８％であり、特異度が９９％である。糖尿病にかかっていない、１型糖尿病患者の第一度近親者では、ＧＡＤ、インスリンおよびＩＡ−２を含めた３種の自己抗原のうちの２種に特異的な自己抗体が存在することにより、５年以内のＩ型ＤＭの発生について９０％を超える陽性的中率が伝えられる。

ヒトインスリン依存性糖尿病において標的とされる自己抗原としては、例えば、チロシンホスファターゼＩＡ−２；ＩＡ−２［ベータ］；６５ｋＤａの形態と６７ｋＤａの形態の両方のグルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）；カルボキシペプチダーゼＨ；インスリン；プロインスリン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）；ｇｌｉｍａ３８；膵島細胞抗原６９ｋＤａ（ＩＣＡ６９）；ｐ５２；２つのガングリオシド抗原（ＧＴ３およびＧＭ２−１）；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）；および膵島細胞グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２）を挙げることができる。

ヒトＩＤＤＭは、現在、血中ブドウ糖レベルをモニターして、組換えインスリンの注射、またはポンプベースの送達を導くことによって治療されている。食事療法および運動療法が適切な血中ブドウ糖の制御の実現に寄与する。

自己免疫性ぶどう膜炎。自己免疫性ぶどう膜炎は、４００，０００人に影響を及ぼしていると推定される眼の自己免疫疾患であり、発生率は米国において１年当たり新規の症例が４３，０００件である。自己免疫性ぶどう膜炎は、現在、ステロイド、免疫抑制剤、例えば、メトトレキサートおよびシクロスポリン、静脈注射用免疫グロブリン、およびＴＮＦαアンタゴニストなどを用いて治療される。

実験的な自己免疫性ぶどう膜炎（ＥＡＵ）は、神経網膜、ぶどう膜、および眼内の関連する組織を標的とするＴ細胞媒介性自己免疫疾患である。ＥＡＵは、ヒト自己免疫性ぶどう膜炎と多くの臨床的特徴および免疫学的特徴を共有し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化されたぶどう膜炎発生ペプチド（ｕｖｅｉｔｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を末梢投与することにより誘導される。

ヒト自己免疫性ぶどう膜炎において自己免疫応答の標的となる自己抗原としては、Ｓ抗原、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、ロドプシン、およびリカバリンを挙げることができる。

原発性胆汁性（Ｂｉｌｌｉａｒｙ）肝硬変。原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）は、主に４０〜６０歳の女性に影響を及ぼす臓器特異的自己免疫疾患である。この群の間で報告された有病率は、１，０００当たり１に近づく。ＰＢＣは、小さな肝内胆管を裏打ちしている肝内胆管上皮細胞（ＩＢＥＣ）の進行性の破壊を特徴とする。これは閉塞症および胆汁分泌への干渉につながり、最終的に硬変症を引き起こす。シェーグレン症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、自己免疫性甲状腺疾患および関節リウマチを含めた、上皮内層／分泌システムの損傷を特徴とする他の自己免疫疾患との関連性が報告されている。抗原（１つまたは複数）を駆動することに関する注目は５０年にわたってミトコンドリアに集中しており、抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）が発見された（Gershwin et al., Immunol Rev 174:210-225, 2000; Mackay et al., Immunol Rev 174:226-237, 2000）。ＡＭＡはすぐに、臨床的な症状が現れるよりずっと前に９０〜９５％の患者の血清中に存在するＰＢＣの検査室診断の礎石になった。ミトコンドリアにおける自己抗原性応答性は、Ｍ１およびＭ２と名付けられた。Ｍ２応答性は、４８〜７４ｋＤａの構成成分のファミリーを対象とする。Ｍ２は、２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体（２−ＯＡＤＣ）の酵素の多数の自己抗原性サブユニットを表し、本発明の自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドの別の例である。ＰＢＣの疾病原因におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）抗原の役割を同定する試験により、ＰＤＣが疾患の誘導において中心的な役割を果たすという概念が支持される（Gershwin et al., Immunol Rev 174:210-225, 2000; Mackay et al., Immunol Rev 174:226-237, 2000）。ＰＢＣの症例の９５％における最も頻度の高い応答性は、ＰＤＣ−Ｅ２に属するＥ２ ７４ｋＤサブユニットである。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＧＤＣ）および分岐鎖（ＢＣ）２−ＯＡＤＣを含めた、関連するが別個である複合体が存在する。３種の構成酵素（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３）は、２−オキソ酸基質をアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）に変換するための触媒機能に寄与し、ＮＡＤ^＋からＮＡＤＨの変換は低下する。哺乳動物のＰＤＣは、タンパク質ＸまたはＥ−３結合性タンパク質：（Ｅ３ＢＰ）と称される追加的な構成成分を含有する。ＰＢＣ患者では、主要な抗原性応答は、ＰＤＣ−Ｅ２およびＥ３ＢＰを対象とする。Ｅ２ポリペプチドは２つのタンデムに繰り返されたリポイルドメインを含有し、一方、Ｅ３ＢＰは単一のリポイルドメインを有する。リポイルドメインは、ＰＢＣのいくつもの自己抗原標的において見出され、本明細書では「ＰＢＣリポイルドメイン」と言及される。ＰＢＣは、グルココルチコイドならびにメトトレキサートおよびシクロスポリンＡを含めた免疫抑制剤を用いて治療される。

シェーグレン症候群。シェーグレン症候群（ＳＳ）は、主に唾液腺および涙腺に影響を及ぼし、ドライアイ（乾性角結膜炎）および口渇（口内乾燥）をまねく慢性の自己免疫疾患である。関与し得る他の臓器としては、気管支樹、腎臓、肝臓、血管、末梢神経および膵臓が挙げられる。ＳＳの二重の表出が特に興味深い：４０代および５０代の女性における原発性の障害として単独で（原発性ＳＳ）、または他の自己免疫疾患に関連して（続発性ＳＳ）；腺性の（乾燥症状（ｓｉｃｃａ ｓｙｍｐｔｏｍ））臨床的な症状発現および全身性の（腺外の）臨床的な症状発現が存在し得る。ＳＳの特性は、リウマチ因子、抗核自己抗体および沈降自己抗体が存在することである。細胞質内／核内リボ核タンパク質粒子（Ｒｏ／ＳＳＡおよびＬａ／ＳＳＢ）は、ＳＳの自己免疫応答において顕著な役割を有する。免疫蛍光法による正の核パターンに関与する他の抗原としては、以下が挙げられる：Ｋｕ、ＮＯＲ−９０（核小体形成部位）、ｐ−８０コイリン、ＨＭＧ−１７（高移動性群）、Ｋｉ／ＳＬ。さらに、抗サイログロブリン抗体、抗赤血球抗体および抗唾液腺上皮抗体を含めた臓器特異的自己抗体も認識されている（Clio et al., Int Arch Allergy Immunol 123:46-57, 200に概説されている）。１２０ｋＤの臓器特異的自己抗原は、細胞骨格タンパク質α−フォドリンと同定された（Haneji et al., Science 276:604-607, 1997）。ＨＳＰ６０は、ＳＳに関与することが示唆された別の自己抗原である。ＨＳＰ６０またはＨＳＰ６０由来のペプチド（アミノ酸残基４３７〜４６０）を用いた免疫化により、ＳＳの動物モデルにおけるＳＳに関連する組織病理学的特徴が軽減されることが示されている（Dalaleu et al., Arthritis Rheum 58:2318-2328, 2008）。主要な標的抗原であるＲｏ／ＳＳＡ、Ｌａ／ＳＳＢおよびそれらの同族の抗体は、分子レベルで広範囲にわたって定義されている。Ｒｏ／ＳＳＡは、小さな細胞質内ＲＮＡを含有するリボ核タンパク質である。Ｒｏ／ＳＳＡ抗原のタンパク質成分は、６０ｋＤのタンパク質（６０ｋＤのＲｏ／ＳＳＡ、Ｒｏ６０）であり、いくつかの小さな細胞質内ＲＮＡ分子のうちの１つに結合している。５２ｋＤのペプチドは、Ｒｏ／ＳＳＡ抗原の別の構成成分である（５２ｋＤのＲｏ／ＳＳＡ；Ｒｏ５２）。Ｌａ／ＳＳＢ抗原は、４０８アミノ酸からなるポリペプチドで構成される。６０ｋＤのＲｏ／ＳＳＡタンパク質とＬａ／ＳＳＢタンパク質は、どちらも、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＮＰ）として公知の８０アミノ酸の配列を含有するＲＮＡ結合性タンパク質ファミリーのメンバーである。いくつかの戦略を用いて６０ｋＤのＲｏ／ＳＳＡ、５２ｋＤのＲｏ／ＳＳＡおよびＬａ／ＳＳＢ分子のＢ細胞エピトープをマッピングすることにより、いくつかの試験において特異的なエピトープが明らかになった。６０ｋＤのＲｏ／ＳＳＡ自己抗原のＢ細胞エピトープは、分子の中心的な領域およびカルボキシ末端部分に位置すると思われる。２つの疾患特異的エピトープ：ＴＫＹＫＱＲＮＧＷＳＨＫＤＬＬＲＳＨＬＫＰ（１６９〜１９０）領域（配列番号６）およびＥＬＹＫＥＫＡＬＳＶＥＴＥＫＬＬＫＹＬＥＡＶ（２１１〜２３２）領域（配列番号７）が同定されている（Routsias et al., Eur J Clin Invest 26:514-521, 1996）。５２ｋＤのＲｏ／ＳＳＡタンパク質の抗原性決定因子は、主に線形であり、分子の中心部分において見出される。４つのペプチド（アミノ酸２〜１１、１０７〜１２６、２７７〜２９２および３６５〜３８２）は、抗Ｒｏ／ＳＳＡ血清によって認識されることが報告されている（Ricchiuti et al., Clin Exp Immunol 95:397-407, 1994）。Ｌａ／ＳＳＢタンパク質の１４５〜１６４領域、２８９〜３０８領域、３０１〜３２０領域および３４９〜３６８領域にわたる、ＩｇＧを用いて精製された４つの高度に応答性のペプチドが報告されている（Tzioufas et al., Clin Exp Immunol 108:191-198, 1997）。

他の自己免疫疾患および関連する自己抗原。重症筋無力症に関する自己抗原としては、アセチルコリン受容体内のエピトープを挙げることができる。尋常性天疱瘡において標的にされる自己抗原としては、デスモグレイン−３を挙げることができる。筋炎についてのパネルは、ｔＲＮＡ合成酵素（例えば、トレオニル、ヒスチジル、アラニル、イソロイシル、およびグリシル（ｇｒｙｃｙｌ））；Ｋｕ；ＳｃＩ；ＳＳＡ；Ｕ１Ｓｎリボ核タンパク質；Ｍｉ−Ｉ；Ｍｉ−Ｉ；Ｊｏ−Ｉ；Ｋｕ；およびＳＲＰを含んでよい。強皮症についてのパネルは、Ｓｃｌ−７０；セントロメア；Ｕ１リボ核タンパク質；およびフィブリラリンを含んでよい。悪性貧血についてのパネルは、内因子；および胃のＨ／Ｋ ＡＴＰアーゼの糖タンパク質ベータサブユニットを含んでよい。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に対するエピトープ抗原としては、ＤＮＡ；リン脂質；核抗原；Ｒｏ；Ｌａ；Ｕ１リボ核タンパク質；Ｒｏ６０（ＳＳ−Ａ）；Ｒｏ５２（ＳＳ−Ａ）；Ｌａ（ＳＳ−Ｂ）；カルレティキュリン；Ｇｒｐ７８；Ｓｃｌ−７０；ヒストン；Ｓｍタンパク質；およびクロマチンなどを挙げることができる。グレーブス病に関しては、エピトープとして、Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体；サイロトロピン受容体；Ｔｇ；およびＴＰＯを挙げることができる。

移植片対宿主病。ヒトにおける組織および臓器の移植に関する最大の限定の１つは、レシピエントの免疫系によって組織移植体が拒絶されることである。ドナーとレシピエントの間でＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−ＤＲ）の対立遺伝子の一致が大きいほど、移植片がよく生存することがよく確立されている。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）により、同種異系の造血細胞を含有する、移植体を受け取った患者において著しい罹患率および死亡率が引き起こされる。造血細胞は骨髄移植体、幹細胞移植体、および他の移植体に存在する。ＨＬＡが一致する同胞から移植体を受け取った患者のおよそ５０％で中程度〜重篤なＧＶＨＤが発生し、ＨＬＡが一致しない移植片では発生率ははるかに高い。中程度〜重篤なＧＶＨＤが発生する患者の３分の１が結果として死亡する。ドナー移植片中のＴリンパ球および他の免疫細胞は、レシピエントの、アミノ酸配列においてポリペプチドの変動、特にヒトにおける第６染色体上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子複合体においてコードされるタンパク質の変動を示す細胞を攻撃する。同種異系の造血細胞を伴う移植片中の、ＧＶＨＤに対する最も影響力の大きいタンパク質は、高度に多型的な（人の間で広範囲にわたるアミノ酸の変動）クラスＩタンパク質（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ）およびクラスＩＩタンパク質（ＤＲＢｌ、ＤＱＢｌ、およびＤＰＢｌ）である（Appelbaum, Nature 411, 385-389, 2001）。ドナーとレシピエントの間でＭＨＣクラスＩ対立遺伝子が血清学的に「一致する」場合でさえ、ＤＮＡ配列決定により、症例の３０％において対立遺伝子レベルのミスマッチが存在することが示され、一致するドナー−レシピエント対においてさえもクラスＩ指向型ＧＶＨＤの基礎がもたらされる（Appelbaum, Nature 411, 385-389, 2001）。ＧＶＨＤにおける副次的な組織適合性自己抗原により、しばしば、皮膚、腸、肝臓、肺、および膵臓に対する損傷が引き起こされる。ＧＶＨＤは、グルココルチコイド、シクロスポリン、メトトレキサート、フルダラビン、およびＯＫＴ３で治療される。

組織移植体の拒絶。肺、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、ならびに他の臓器および組織を含めた組織移植体の免疫拒絶は、移植レシピエントにおける、移植された臓器を対象とする免疫応答によって媒介される。同種異系の移植された臓器は、それらのアミノ酸配列が移植レシピエントのアミノ酸配列と比較して変異したタンパク質を含有する。移植された臓器のアミノ酸配列は移植レシピエントのものと異なるので、レシピエントにおいて移植された臓器に対する免疫応答がしばしば引き出される。移植された臓器の拒絶は、組織移植の主要な合併症および限定であり、レシピエントにおける移植された臓器の不全を引き起こし得る。拒絶から生じる慢性の炎症により、移植された臓器における機能障害がしばしば導かれる。移植レシピエントは、現在、拒絶を防止し、抑制するために種々の免疫抑制剤を用いて治療されている。これらの薬剤としては、グルココルチコイド、シクロスポリンＡ、セルセプト、ＦＫ−５０６、およびＯＫＴ３が挙げられる。

治療するための組成物および方法
本発明は、改善された免疫調節性複合体およびそれらを含む組成物、ならびに医薬品を製造するための、および自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を治療、予防および／または防止するための方法における、その使用を提供する。本発明による改善された免疫調節性複合体は、コレラ毒素（ＣＴＡ１）のＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの突然変異体サブユニット、特異的な受容体に結合することができるペプチド、および自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に関連する１種または複数種のエピトープを含む融合タンパク質である。本発明の改善された方法は、疾患に関連する１種または複数種のエピトープを含む免疫調節性複合体を投与することを含む。

ある特定の実施形態では、本発明は、自己免疫疾患であるインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を治療、予防および／または防止するための改善された方法であって、対象に、ＩＤＤＭに関連する１種または複数種の自己抗原エピトープを含む免疫調節性複合体を投与すること含む方法を提供する。

ＩＤＤＭを治療または防止するために投与される免疫調節性複合体は、自己タンパク質、例えば、プレプロインスリン、プロインスリン、グルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）−６５およびグルタミン酸脱炭素酵素（ＧＡＤ）−６７；チロシンホスファターゼＩＡ−２；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）；および／または膵島細胞抗原６９ｋＤの１つまたは複数に由来する自己免疫エピトープを含んでよい。あるいは、ＩＤＤＭを治療または防止するために投与される免疫調節性複合体は、同じまたは異なる自己タンパク質（１種または複数種）、自己ポリペプチド（１種または複数種）、または自己ペプチド（１種または複数種）に由来する多数の自己免疫エピトープを含んでよい。好ましい実施形態において、ＩＤＤＭを治療または防止するために投与される免疫調節性複合体は、自己ポリペプチドであるプレプロインスリンまたはプロインスリンに由来する自己免疫エピトープを含んでよい。

本発明の他の実施形態では、多発性硬化症（ＭＳ）を治療、予防および／または防止するための改善された方法であって、対象に、ＭＳに関連する１種または複数種の自己抗原エピトープを含む免疫調節性複合体を投与することを含む方法が提供される。ＭＳを治療するために投与される免疫調節性複合体は、これらに限定されないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、および／またはミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）を含めた１種または複数種の自己ポリペプチドに由来する自己抗原エピトープを含んでよい。あるいは、免疫調節性複合体は疾患に関連する同じまたは異なる自己タンパク質（１種または複数種）、自己ポリペプチド（１種または複数種）、または自己ペプチド（１種または複数種）に由来する多数の自己抗原エピトープを含む。

本発明の他の実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）を治療、予防および／または防止するための改善された方法であって、対象に、ＲＡに関連する１種または複数種の自己抗原エピトープを含む本発明による免疫調節性複合体を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、自己抗原エピトープは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲン、ＧＰ−３９、フィラグリン、ならびにフィブリンからなる群に由来するエピトープである。好ましい一実施形態では、エピトープはＩＩ型コラーゲンに由来し、エピトープは、アミノ酸２６０〜２７３を含む共有免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０〜２７３）、配列番号５であることが好ましい。

あるいは、異なる自己ポリペプチドに由来する自己抗原エピトープを含む多数の免疫調節性複合体を投与することができる。

したがって、実施例において実証されている（具体的には、関節リウマチモデルである実施例２におけるＣＩＡおよび実施例３におけるＣＡＩＡ、ならびにＥＡＥモデルにおいて示されている）通り、本発明による免疫調節性複合体の治療効果は、関節リウマチ（ＲＡ）に特異的に限定されず、一般に、特定のアレルギー性疾患または自己免疫疾患に関連する自己抗原由来のエピトープの選択に応じて、自己免疫疾患およびアレルギー性疾患の治療、予防および防止に伴う有利な治療効果である。したがって、本発明の実施例は、一般に自己免疫疾患およびアレルギー性疾患を治療するための免疫優性エピトープに関連して、免疫調節性ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａを含む本発明による免疫調節性複合体を使用することに関する一般的な本発明の概念を例示し、支持することを意図している。

共有免疫優性エピトープは、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に関連することが公知の任意の適切な自己抗原から選択することができる。エピトープは、例えば、表１中の疾患に関連する自己抗原の任意のものから選択することができる。

しかし、システインの含有量が高いエピトープは、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋと比較して、本発明による免疫調節性複合体のＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａにおいてアミノ酸１８７のシステインをアラニンで置き換えることによってもたらされる有利な効果を打ち消す可能性がある。したがって、本発明によるエピトープは、システインの高含有量を回避するように選択することが好ましい。

さらに別の実施形態では、本発明は、本発明による免疫調節性複合体をコードする、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を含めた核酸配列、ならびにそのような核酸配列を含むプラスミド、ベクターおよび発現系を提供する。

本発明による免疫調節性複合体は、組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。

プラスミド、ベクターおよび発現系を構築し、細胞をトランスフェクトするための技法は当技術分野で周知であり、当業者は、特定の状態および手順について記載されている標準のリソース材料に詳しい。

本発明のプラスミド、ベクターおよび発現系の構築には、当技術分野で周知の標準のライゲーションおよび制限技法を使用する（一般に、例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 1989; Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed. 2001を参照されたい）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、切断し、あつらえ、再ライゲーションして所望の形態にする。ＤＮＡコンストラクトの配列は、例えば、ＤＮＡ配列を解析するための標準の方法を用いて確認することができる（例えば、Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467を参照されたい）。

特定の核酸分子を単離するためのさらに別の都合のよい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Mullis et al., Methods Enzymol 155:335-350, 1987）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によるものである。ＲＴ−ＰＣＲにより、特定の核酸配列をＲＮＡから単離することができる。ＲＮＡを、例えば、細胞、組織、または生物体全体から、当業者に公知の技法によって単離する。次いで、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ポリｄＴまたは無作為の六量体プライマー、デオキシヌクレオチド、および適切な逆転写酵素を使用して生成する。次いで、所望のポリヌクレオチドを、生成したｃＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅することができる。あるいは、対象のポリヌクレオチドは、適切なｃＤＮＡライブラリーから直接増幅することができる。対象のポリヌクレオチド配列の５’末端と３’末端の両方にハイブリダイズするプライマーを合成し、ＰＣＲに使用する。プライマーは、容易に消化し、増幅された配列を同様に制限消化したプラスミドベクターとライゲーションするために、５’末端に特定の制限酵素部位も含有してよい。

免疫調節性複合体の送達
免疫調節性複合体の治療的かつ予防的な有効量は、約１μｇ〜約１０ｍｇの範囲内である。免疫調節性複合体の好ましい治療的または予防的な有効量は、約５μｇ〜約１ｍｇの範囲内である。最も好ましい免疫調節性複合体の治療量は、約１０μｇ〜１００μｇの範囲内である。ある特定の実施形態では、免疫調節性複合体は、月に１回、６〜１２ヶ月にわたって投与し、その後、３〜１２ヶ月ごとに維持用量として投与する。代替の治療レジメンを展開することができ、それは、疾患の重症度、患者の年齢、投与される免疫調節性複合体、および普段治療にあたっている医師によって考えられる他の因子に応じて、毎日から、週に１回まで、１ヶ月おきまで、年に１回まで、一回投与までの範囲であってよい。

一実施形態では、免疫調節性複合体は鼻腔内に送達される。他の変形では、免疫調節性複合体は経口的に、舌下に、皮下に、経皮的に、皮内に、静脈内に、粘膜に、または筋肉内に送達される。

製剤
免疫調節性複合体は、他の物質、例えば、薬理作用物質、アジュバント、サイトカイン、または免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などと組み合わせて投与することができる。

以下の実施例は、本発明を実行するための特定の実施形態である。実施例は、単に例示的な目的で提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。

免疫調節性複合体Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ
ＣＴＡ１−ＤＤ突然変異体の構築、融合タンパク質の発現および精製を、基本的にAgren（J Immunol 1999, 162:2432-2440）に記載されている通り実施した。

ｐＣＴＡ１−ＤＤプラスミドは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングされたコレラ毒素Ａ１遺伝子（アミノ酸１〜１９４）、およびｔｒｐプロモーターの制御下にある、ブドウ球菌のプロテインＡ遺伝子由来の２つのＤ断片をコードするＤＮＡを含有する。コラーゲンペプチドである共有免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０〜２７３）をコードするＤＮＡを、ＣＴＡ１をコードするＤＮＡとＤＤ部分の間に挿入し、ｐＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤプラスミドを生じさせた。Ｒ７Ｋ突然変異およびＣ１８７Ａ突然変異をインビトロ突然変異誘発によって構築し、プラスミドｐＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤを生じさせた（図１）。

マウスＣＩＡモデルにおけるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤとＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの治療効果の比較。
ＲＡのマウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルを使用して、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤおよびＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ寛容原を用いた鼻腔内治療を比較した。ＣＩＡモデルは、いくつもの臨床的特徴、組織学的特徴および免疫学的特徴をＲＡと共有し、したがって、ＲＡに対する潜在的な治療剤を検査するために最も使用されるモデルである。ＤＢＡ１マウス（タコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中ニワトリ／ウシＩＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ／ＭＤＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｇを用いて一次免疫化し、その後、２１日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて追加免疫した。マウスを、追加免疫した頃および／またはその後にＰＢＳ、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤまたはＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤを鼻腔内に３〜８回投与して処置した。次いで、マウスを、関節炎の発生率および重症度に関して関節炎についてのスコアリングシステムを使用して追跡した。

肢のそれぞれについて０〜３ポイントの臨床的なスコアリングシステムを使用した：０＝炎症なし、０，５＝つま先または指の腫脹、１＝穏やかな腫脹または発赤、２＝腫脹および発赤、および３＝顕著な腫脹、発赤および／または関節強直。関節炎指数を、各動物について４つの肢全てからのスコアを足すことによって構築した。

Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの治療効果は、対照群（ＰＢＳ）と比較してＣＩＡの重症度（図２Ａ）および発生率（図２Ｂ）が低下したことに見られるように、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの治療効果よりも有意に優れていた。

対照ＰＢＳ群における関節炎指数は、コラーゲンでの免疫化の３週間後に劇的に増加し、６週間の時点でピークに達した。ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ群では、関節炎指数のわずかな減少が見られた。対照的に、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ群では、関節炎指数は有意に低く、多くの動物が全く症状を有さなかった。

マウスＣＡＩＡモデルにおけるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤとＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの治療効果の比較
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）において、０日目に、ＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体のカクテル（ＡｒｔｈｒｉｔｏＭａｂカクテル：Ｄ１、Ｆ１０、Ａ２およびＤ８；ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｚｕｅｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をマウス当たり２ｍｇの用量レベルで静脈内注射することによってコラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）を誘導した。３日目に、リポ多糖（ＬＰＳ）（ＡｒｔｈｒｉｔｏＭａｂ ｋｉｔ、ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内に（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎａｌｌｙ）注射して、疾患の発生率および重症度を増強した（マウス当たり５０μｇ）。

マウスを、−２日目、０日目、＋３日目に、２０μｌのＰＢＳ中５μｇのＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤまたはＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを用いて鼻腔内処置した。マウスを、関節炎の発生率および重症度に関して、ＣＩＡについてと同じ関節炎についてのスコアリングシステム（実施例２を参照されたい）を用いて追跡した。

４日目に、全てのマウスが疾患徴候を示し始めた（データは示していない）。ＰＢＳ対照群およびＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤで処置した群では、関節炎指数は抗体免疫化の７日後に劇的に増加した。しかし、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤを用いて処置した群では、関節炎指数の増加は実験の過程全体を通して有意に低かった。

シェーグレン病（ＳＳ）を治療するための免疫調節性複合体。
６０ｋＤａのＲｏ、アミノ酸配列ＴＫＹＫＱＲＮＧＷＳＨＫＤＬＬＲＳＨＬＫＰ（配列番号６）を有するＲｏ１６９、およびアミノ配列ＥＬＹＫＥＫＡＬＳＶＥＴＥＫＬＬＫＹＬＥＡＶ（配列番号７）を有するＲｏ２１１、およびアミノ酸配列ＱＥＭＰＬＴＡＬＬＲＮＬＧＫＭＴ（配列番号８）を有するＲｏ２７４に由来するエピトープをコードするＤＮＡ配列を、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａベクターにクローニングし、免疫調節性複合体であるＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ１６９−ＤＤ（配列番号１１）、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ２１１−ＤＤ（配列番号１２）、およびＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ２７４−ＤＤ（配列番号１３）をそれぞれコードするＤＮＡコンストラクトを含むベクターをもたらした。

発現ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にトランスフェクトし、発現された免疫調節性複合体を、標準の技法を使用して精製する。

シェーグレン病（ＳＳ）を治療するための免疫調節性複合体の治療効果
最近、ＢＡＬＢ／ｃマウスをある期間にわたってマウス配列に対して１００％の相同性を有するヒトＲｏ ＲＮＰの短いペプチドを用いて免疫化した（Ｒｏ２７４〜２９０、Ｒｏ２７４と称される）、ヒト疾患の多くの特徴と著しい類似性を示す新規のマウスモデルが創出された（Scofield R.H. et al., J Immunol, 2005, 175(12), 8409-12）。このペプチドを用いて免疫化したマウスではＲｏ５２、Ｒｏ６０およびＬａに対する高力価のＩｇＧ自己抗体、ＣＤ１９^＋ＢおよびＣＤ４^＋／８^＋リンパ球の唾液腺への浸潤、および唾液の流れの減少が発生することが決定された。したがって、このモデルは、シェーグレン病（ＳＳ）を治療するための免疫調節性複合体の治療効果を試験するために適している。

簡単に述べると、動物を、６０ｋＤａのＲｏタンパク質のアミノ酸２７４〜２９０に対応するペプチド、ＱＥＭＰＬＴＡＬＬＲＮＬＧＫＭＴ（配列番号８）を用いて免疫化する。免疫化は、最初の免疫化についてはＣＦＡ中に１：１に乳化したＰＢＳ中単量体ペプチド１００μｇを用いて行い、その後の免疫化をＩＦＡ中、１４日目、３５日目、６３日目、および５１日目に行う。疾患を、唾液の産生を以下の通り測定することによって追跡する：簡単に述べると、動物を手順の前に１６〜１８時間絶食させる。体重１ｇ当たり０.０１ｍｌの２．５％２，２，２−トリブロモエタノールを、麻酔として各動物にｉ．ｐ．注射する。次いで、唾液の分泌を、同じシリンジ中の体重１００ｇ当たり０.０２０ｍｇのイソプロテレノールおよび体重１００ｇ当たりの０.０５ｍｇのピロカルピンをｉ．ｐ．注射して刺激した。次いで、毛細管を使用して、１０分間にわたって口腔から総唾液を得る。マウスを、疾患時に、試験される免疫調節性複合体を３回鼻腔内投与して処置する。処置マウスおよび無処置マウスにおける唾液の産生のレベルを比較することによって治療効果を評価する。

アレルギー性疾患を治療するための免疫調節性複合体
Ｂｅｔ ｖ１は、カバノキの主要アレルゲンの１つと同定され、Ｐｈｌ ｐ１およびＰｈｌ ｐ５はイネ科植物の花粉の２つの主要アレルゲンとして同定されている。Ｂｅｔ ｖ１の免疫優性ペプチドエピトープは、ペプチド配列ＭＧＥＴＬＬＲＡＶＥＳＹ（配列番号１４）を有すると同定された。Ｐｈｌ ｐ１の免疫優性ペプチドエピトープは、ペプチド配列ＡＧＥＬＥＬＱＦＲＲＶＫＣＫＹ（配列番号１５）を有すると同定され、Ｐｈｌ ｐ５の免疫優性ペプチドエピトープは、ペプチド配列ＴＶＡＴＡＰＥＶＫＹＴＶＦＥＴＡＬＫ（配列番号１６）を有すると同定された。これらのペプチドエピトープをコードするＤＮＡをＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａベクターにクローニングし、免疫調節性複合体であるＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｂｅｔｖ１−ＤＤ（配列番号１７）、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｐｈｌ ｐ１−ＤＤ（配列番号１８）、およびＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｐｈｌ ｐ５−ＤＤ（配列番号１９）をそれぞれコードするＤＮＡコンストラクトを含むベクターをもたらす。発現ベクターを大腸菌にトランスフェクトし、発現された免疫調節性複合体を、標準の技法を使用して精製する。

アレルギー性疾患を治療するための免疫調節性複合体の治療効果。
アレルギー性疾患を治療するための免疫調節性複合体の治療効果を試験するための適切なモデルは、例えば、Ｈｕｆｎａｇｌら（Clin Exp Allergy, 2008, 38, 1192-1202）によって確立された、カバノキおよびイネ科植物の花粉の主要アレルゲンであるＢｅｔ ｖ１、Ｐｈｌ ｐ１およびＰｈｌ ｐ５に対するアレルギー性の多感作（ｐｏｌｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）マウスモデルである。

簡単に述べると、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_３）に吸着させた組換え型のＢｅｔ ｖ１、Ｐｈｌ ｐ１およびＰｈｌ ｐ５（それぞれ５ｍｇ）またはこれらのアレルゲンの１つまたは複数の混合物を１４日間隔で３回腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫化すること（２２日目、３６日目および５０日目）によって感作を実施する。処置として、試験される免疫調節性複合体の１つまたは複数（それぞれ５ｍｇ）を、感作する前に、７日間隔で３回（０日目、７日目および１４日目）、３０ｍＬの０.９％ＮａＣｌ中で鼻腔内に（ｉ．ｎ．）投与する。最後のｉ．ｐ．免疫化の１週間後に、１％ｗ／ｖのカバノキの花粉および／またはアワガエリ属の抽出物を用いたエアロゾル攻撃を２日連続して実施する。エアロゾル攻撃の２日後（６０日目）に、マウスを屠殺し、気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）を採取する。気道炎症を、ＢＡＬ液中の炎症細胞（マクロファージ、リンパ球、好酸球）の数およびＩＬ−５レベルによって決定する。治療の効果は、免疫調節性複合体で処置したマウスにおける、対照マウスと比較したＢＡＬ中の好酸球およびＩＬ−５の有意な低下として見られる。

ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤおよびＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの二量体形成。
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤおよびＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤの二量体形成を、分析的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して試験した。この試験のためにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＥＫＴＡＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。移動相として、１０ｍＭのＮａ−リン酸緩衝液、ｐＨ ７.４、０.４ＭのＮａＣｌを、室温で０.４ｍｌ／分の流速で使用した。試料は、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ（バッチ０９１１１８、２.４ｍｇ／ｍＬ）およびＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ（バッチ０９１１１８、５.６ｍｇ／ｍＬ）であった。試料を−８０℃から解凍し、分析前に緩衝液中に１.５ｍｇ／ｍＬに希釈した。５０μＬをカラムに注入した。調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次に還元条件下、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でのクーマシー染色によって分析した。

結果
ＳＥＣ分析から見られるように、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ試料において著しい量の二量体が形成され、同定することができた（図４Ａ）。二量体は１２.６１ｍｌにおけるピークとして、および単量体が１４.２９ｍｌにおけるピークとして溶出するのが見られた。比較すると、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ試料（図４Ｂ）においては二量体を検出することはできず、１４.１６ｍｌにおいて溶出する単量体の単一のピークが示された。図５から見られるように、２つの調製物は同等に純粋であり、還元性条件下ではただ１つの構成成分、すなわち単量体の免疫調節複合体（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）で構成される。

生産性のレベルの比較
本発明による種々の免疫調節性複合体をコードするプラスミドを保有する組換え型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を培養した後に細菌ペレット１ｇから精製された材料の収量が表３に列挙されている。

表３から見ることができるように、生産性は、Ｋの挿入およびＣ１８７Ａ突然変異を含む複合体に関して有意に高い。

Claims (20)

1. （ａ）コレラ毒素（ＣＴＡ１）のＡＤＰリボシル化Ａ１サブユニットの突然変異体サブユニット、
   （ｂ）特異的な細胞受容体に結合することができるペプチド、および
   （ｃ）対応する自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に関連する１個以上のエピトープ
   を含む融合タンパク質である免疫調節性複合体であって、突然変異体ＣＴＡ１サブユニットが、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ突然変異体、配列番号１であり、ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している細胞上で発現される受容体に特異的に結合するものである、免疫調節性複合体。
2. 突然変異体ＣＴＡ１サブユニットのＮ末端にアミノ酸リジンがさらに挿入されている、請求項１に記載の免疫調節性複合体。
3. 突然変異体ＣＴＡ１サブユニットが、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ突然変異体、配列番号２である、請求項２に記載の免疫調節性複合体。
4. １個以上のエピトープが、自己免疫疾患に関連する自己免疫エピトープである、請求項１から３のいずれかに記載の免疫調節性複合体。
5. 自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス、およびグレーブス病からなる群から選択される、請求項４に記載の免疫調節性複合体。
6. １個以上のエピトープが、アレルギー性疾患に関連する、アレルギーの原因になるエピトープである、請求項１から５のいずれかに記載の免疫調節性複合体。
7. アレルギー性疾患が、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎および食物過敏症からなる群から選択される、請求項６に記載の免疫調節性複合体。
8. 融合タンパク質が、Ｂリンパ球、Ｔ細胞などのリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞および内皮細胞からなる群から選択される細胞上で発現される受容体に特異的に結合するペプチドを含む、請求項１から７のいずれかに記載の免疫調節性複合体。
9. 前記ペプチドが、単一のコピーまたは多数のコピーのプロテインＡまたはその断片、例えば、その１つまたは複数のＤサブユニットなどによって構成される、請求項８に記載の免疫調節性複合体。
10. 免疫調節性複合体であるＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ（配列番号４）、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−ＣＯＬ−ＤＤ（配列番号１０）、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ１６９−ＤＤ（配列番号１１）、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ２１１−ＤＤ（配列番号１２）、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｒｏ２７４−ＤＤ（配列番号１３）、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｂｅｔｖ１−ＤＤ（配列番号１７）、Ｋ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｐｈｌ ｐ１−ＤＤ（配列番号１８）、およびＫ−ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ／Ｃ１８７Ａ−Ｐｈｌ ｐ５−ＤＤ（配列番号１９）。
11. 請求項１から１０のいずれかに記載の免疫調節性複合体をコードする単離された核酸。
12. 請求項１１に記載の核酸を含む発現系。
13. 請求項１２に記載の発現系を含むトランスフェクトされた細胞。
14. 請求項１から１０のいずれかに記載の免疫調節性複合体を含む医薬組成物。
15. 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の予防、防止および／または治療において使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス、およびグレーブス病からなる群から選択される、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の予防、防止および／または治療において使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
17. アレルギー性疾患が、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎および食物過敏症からなる群から選択される、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の予防、防止および／または治療において使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
18. 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を予防、防止および／または治療するための医薬品を製造するための、請求項１から１０のいずれかに記載の免疫調節性複合体の使用。
19. 自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス、およびグレーブス病からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
20. アレルギー性疾患が、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎および食物過敏症からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。

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