CN102959082A - 用于治疗自身免疫性和变应性疾病的新组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗和预防自身免疫性和变应性疾病的改进方法和组合物。更具体地，本发明涉及新的免疫调控复合物，其是融合蛋白，包含霍乱毒素A1亚基(CTA1)的突变体亚基、能够结合特定细胞受体的肽、和与自身免疫性或变应性疾病有关的一种或多种表位。在所述突变体CTA1亚基中，对应于天然CTA1中氨基酸7精氨酸和氨基酸187半胱氨酸的氨基酸已经替换。

Description

用于治疗自身免疫性和变应性疾病的新组合物和方法
发明领域
本发明涉及免疫学和医学领域。本发明提供了用于治疗和预防自身免疫性和变应性疾病的改进方法和组合物。更具体地，本发明涉及新的免疫调控复合物，其是融合蛋白，包含细菌内毒素的突变体亚基、能够结合特定细胞受体的肽，以及与自身免疫性或变应性疾病有关的一种或多种自身抗原性或激发变态反应的表位。
发明背景
自身免疫性疾病和免疫应答的调控
自身免疫性疾病是由变成错误针对身体的健康细胞和/或组织的免疫细胞所引起的任何疾病。自身免疫性疾病影响美国人口的3%，和可能地类似百分比的工业化世界人口(Jacobson等，Clin Immunol Immunopathol 84:223-43,1997)。自身免疫性疾病以异常靶向自身蛋白质、自身多肽、自身肽和/或其它自身分子，导致体内器官、组织或细胞类型(例如胰、脑、甲状腺或胃肠道)的损伤和或功能障碍，从而引起疾病的临床表现的T和B淋巴细胞为特征(Marrack等，Nat Med 7:899-905,2001)。自身免疫性疾病包括影响特定组织的疾病以及能影响多种组织的疾病。对于一些疾病，这可能部分取决于自身免疫应答是针对限于特定组织的抗原，还是针对在体内广泛分布的抗原。组织特异性自身免疫的特征性特征是选择性靶向单一组织或个别细胞类型。然而，靶向遍在的自身蛋白质的某些自身免疫性疾病也可以影响特定组织。例如，在多肌炎中，自身免疫应答靶向遍在的蛋白质组氨酰-tRNA合成酶，而临床表现主要牵涉对肌肉的自身免疫性破坏。
免疫系统采用设计为针对多种外来病原体产生应答以保护哺乳动物，而同时防止针对自身抗原的应答的高度复杂的机制。在决定是否应答(抗原特异性)外，免疫系统还必须选择适合于处理每种病原体的效应器功能(效应器特异性)。对介导和调节这些效应器功能至关重要的一种细胞是CD4+T细胞。此外，T细胞介导其功能的主要机制似乎正是加工来自CD4+T细胞的特定细胞因子。因此，表征由CD4+T细胞生成的细胞因子的类型及如何控制其分泌对了解如何调节免疫应答是非常重要的。
20多年前首次发表了对自长期小鼠CD4+T细胞克隆的细胞因子生成的表征(Mosmann等，J Immunol 136:2348-2357,1986)。在这些研究中，显示了CD4+T细胞产生两种独特的细胞因子生成样式，其称作T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)。发现Th1细胞生成白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和淋巴毒素(LT)，而Th2克隆主要生成IL-4、IL-5、IL-6和IL-13(Cherwinski等，J Exp Med 169:1229-1244,1987)。稍晚，从Th2克隆中分离出别的细胞因子IL-9和IL-10(Van Snick等，J Exp Med 169:363-368,1989)(Fiorentino等，J ExpMed 170:2081-2095,1989)。最后，发现别的细胞因子，诸如IL-3、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由Th1和Th2细胞两者分泌的。最近，报告了从莱姆(Lyme)病患者的炎性关节分离的CD4+T细胞含有与Th1和Th2截然不同的生成IL-17的CD4+T细胞子集(Infante-Duarte等，J.Immunol 165:6107-6115,2000)。这些生成IL-17的CD4+T细胞称作Th17。IL-17(一种主要由活化的T细胞生成的促炎性细胞因子)增强T细胞引发，并且刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞生成多种促炎性介质，包括IL-1、IL-6、TNF-α、NOS-2、金属蛋白酶、和趋化因子，导致诱导炎症。IL-17表达在多种变应性和自身免疫性疾病，诸如RA、MS、炎性肠病(IBD)、和哮喘的患者中升高，提示了IL-17促成这类疾病的诱导和/或形成。
有充足证据显示，抑制性T细胞，现在称作调节性T细胞(Treg细胞)，抑制自身反应性T细胞作为外周免疫耐受的有效机制。迄今，稳固确立了Treg细胞依照其起源可以分成两种不同亚型，即天然的(或组成性)和诱导型(或适应性)群体(Mills,Nat Rev Immunol 4:841-855,2004)。另外，多种Treg细胞子集已经依照其表面标志物或细胞因子产物得到鉴定，诸如CD4+Treg细胞(包括天然CD4+CD25+Treg细胞、生成IL-10的Tr1细胞、和生成TGF-β的Th3细胞)、CD8+Treg细胞、CD8+反抑细胞、γδT细胞、NKT(NK1.1+CD4-CD8-)细胞、NK1.1-CD4-CD8细胞等。越来越多的证据已经显示，天然存在的CD4+CD25+Treg细胞在下调病原性自身免疫应答和维持免疫稳态中起着积极作用(Akbari等，Curr Opin Immunol 15:627-633,2003)。
自身免疫性疾病涵盖可以影响体内许多不同器官和组织的一大批疾病(参见，例如Paul,W.E.(1999),Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,New York)。
目前用于人自身免疫性疾病的疗法包括糖皮质激素类、细胞毒剂类、和最近开发的生物治疗剂类。一般地，人系统性自身免疫性疾病的管理是凭经验的且不满意的。通常，免疫抑制性药物，诸如糖皮质激素类在极其多种重度自身免疫性和炎性病症中广泛使用。在糖皮质激素类外，其它免疫抑制剂也被用于管理系统性自身免疫性疾病。环磷酰胺(cyclophosphamide)是一种引起T和B淋巴细胞两者的完全消减和细胞介导的免疫力损伤的烷化剂。环孢霉素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)和霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)是具有T淋巴细胞抑制的特异性特性的天然产物，并且它们已经被用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)及血管炎和肌炎(在有限的程度上)。这些药物与显著的肾毒性有关。以降低疾病进展为目的，甲氨蝶呤也用作RA中的“二线”药剂。其也在多肌炎和其它结缔组织疾病中使用。已经尝试过的其它办法包括意图阻断细胞因子作用或消减淋巴细胞的单克隆抗体(Fox,Am J Med 99:82-88,1995)。用于多发性硬化(MS)的治疗包括干扰素β和共聚物1，其将复发率降低20-30%，并且对疾病进展仅具有适度影响。也用包括甲泼尼龙(methylprednisolone)、其它类固醇、甲氨蝶呤、克拉屈滨(cladribine)和环磷酰胺在内的免疫抑制剂治疗MS。这些免疫抑制剂在治疗MS中具有最小的效力。引入抗体Tysabri(那他珠单抗(natalizumab))(一种α4-整联蛋白拮抗剂)作为MS的治疗已经由于接受该疗法的患者中进行性多灶性脑白质病(progressive multifocal leukoencephalopathy)(PML)的发生而蒙上阴影。目前用于RA的疗法利用非特异性抑制或调控免疫功能的药剂，诸如甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、来氟米特(leuflonamide)、泼尼松(prednisone)、以及最近开发的TNFα拮抗剂依那西普(etanercept)和英夫利昔单抗(infliximab)(Moreland等，J Rheumatol 28:1431-52,2001)。依那西普和英夫利昔单抗全面阻断TNFα，使患者由于败血症、慢性分枝杆菌性感染的恶化、和脱髓鞘事件的形成而更易死亡。
在器官特异性自身免疫的情况中，已经尝试了许多不同的治疗办法。已经系统性施用可溶性蛋白质抗原以抑制随后对所述抗原的免疫应答。这类疗法包括将髓磷脂碱性蛋白、其优势肽或髓磷脂蛋白质的混合物投递至患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的动物和患有多发性硬化的人(Brocke等，Nature379:343-6,1996;Critchfield等，Science 263:1 139-43,1994;Weiner等，AnnuRev Immunol 12:809-37,1994)、对患有胶原诱导的关节炎的动物和患有类风湿性关节炎的人施用II型胶原或胶原蛋白质的混合物(Gumanovskaya等，Immunology 91:466-73,1999;McKown等，Arthritis Rheum 42:1204-8,1999;Trentham等，Science 261:1727-30,1993)、将胰岛素投递至患有自身免疫性糖尿病的动物和人(Pozzilli和Gisella Cavallo,Diabetes Metab Res Rev 16:306-7,2000)、以及将S抗原投递至患有自身免疫性葡萄膜炎的动物和人(Nussenblatt等，Am J Ophthalmol 123:583-92,1997)。另一种方法是试图基于T细胞受体和与MHC分子结合的肽之间的特异性相互作用设计用于系统性施用肽抗原的理性治疗策略。一项在糖尿病动物模型中使用肽方法的研究导致针对该肽形成抗体生成(Hurtenbach等，J Exp Med 177:1499,1993)。另一种方法是实施T细胞受体(TCR)肽免疫(参见例如Vandenbark等，Nature341:541,1989)。再一种方法是通过摄取肽或蛋白质抗原诱导口服耐受性(参见例如Weiner,Immmunol Today 18:335,1997)。
粘膜耐受性指对用先前经由粘膜途径，通常是口服、鼻或鼻-呼吸系统，而且还有阴道和直肠施用的抗原攻击的系统性耐受性的现象(Weiner等，Annu Rev Immunol 12:809-837,1994)。粘膜耐受性于20世纪早期在豚鼠中延迟型和接触超敏感性模型中发现，但是耐受性机制直到现代免疫学时代仍然不清楚。使用细胞分离技术、用于生成细胞因子的测试和可以在体内追踪抗原特异性T细胞的转基因模型已经逐步阐明了粘膜耐受性的机制(Garside和Mowat.,Crit Rev Immunol 17:119-137,1997)。已经变得明显的是，根据施用途径和抗原剂量，经由粘膜途径施用抗原可以导致不同类型的耐受性。例如，高剂量的口服抗原诱导T细胞活化，接着是响应的T细胞的消除或无反应性(Chen等，Nature 376:177-180,1995)，这类似于高剂量可溶性抗原的胃肠外施用。这导致对所述抗原特异性的T细胞的消除及不响应随后的抗原攻击，即被动耐受性。相比之下，低剂量的口服抗原并不诱导消除或无反应性，但是在重复给予时，诱导一类独特的免疫响应，其特征在于出现分泌抗炎性细胞因子的调节-保护性T细胞(Treg细胞)，即主动耐受性(von Herrath,ResImmunol.148:541-554,1997)。这些Treg细胞通常属于CD4(辅助)T细胞类。向鼻咽粘膜上滴注完整的蛋白质抗原也诱导保护性Treg细胞。在此情况中，可以诱导CD4和CD8 T细胞两者。在口服或鼻内抗原施用后诱导的调节性Treg细胞生成抗炎性细胞因子诸如IL-4、IL-10和TGF-β。为了诱导粘膜耐受性，也可以以气雾剂形式给予抗原。经由口服、鼻内和气雾剂吸入这三种途径的施用在每种情况中导致不同的淋巴区室中的抗原摄取和呈递。因而，口服抗原呈递至主要在肠系膜淋巴结中和一定程度上在派伊尔(Peyer)氏淋巴集结中的T细胞，鼻内抗原呈递至颈深淋巴结中的T细胞，而吸入抗原呈递至纵隔淋巴结中的T细胞。每种情况中重复暴露于抗原能够诱导调节性T细胞，但是这些细胞的性质随抗原的途径和形式而不同。虽然由口服抗原诱导的调节性细胞是CD4 T细胞并且表达由αβ异二聚体组成的T细胞受体(TCR)，但是在鼻-呼吸系统抗原的情况中，调节性细胞也可以是表达γδ异二聚体TCR的CD8T细胞(即γδT细胞)。这些细胞中一些也可以具有作为αα同二聚体而不是常规的αβ-异二聚体TCR的CD8受体。携带CD8αα和γδTCR的大多数细胞驻留于皮肤或粘膜组织中。
在过去的数十年里，变应性疾病在西方国家的发生率和流行性两者有显著增加。变应性鼻炎是这些疾病中最常见的，影响人口的15-20%。变应性反应如下触发，即变应原介导的交联肥大细胞和嗜碱细胞表面上的特异性IgE，引起组胺和其它介质的释放，如此引起急性变应性反应，接着是以嗜曙红细胞、嗜中性粒细胞和生成IL-4、IL-5和IL-13的Th2细胞的流入为特征的晚期反应。
特异性免疫疗法(SIT)被认为是变应性鼻炎的有效治疗。传统上，已经通过重复地皮下施用少量特异性变应原进行SIT。尽管此治疗形式可以是一种有效的治疗选项，但是担心此免疫疗法形式的安全性以及难以标准化变应原提取物用作疫苗。因此，在开发针对变应性疾病的备选的且新的治疗上有强烈兴趣。方法之一是使用粘膜疫苗(Widermann,Curr Drug Targets InflammAllergy 4,577-583,2005)。其它备选方法基于使用具有降低的变应原性或无变应原性的变应原衍生物作为疫苗(Vrtala等，Methods 32,313-320,2004)。这些包括通过蛋白质工程获得的变应原和代表变应原的免疫优势T细胞表位的合成肽。例如，Ole e1已经被鉴定为橄榄花粉的最相关的变应原(Wheeler等，Mol Immunol 27,631-636,1990)。
目前通过单独或与佐剂(免疫调控剂)组合投递多肽来改变免疫应答。例如，乙肝病毒疫苗含有在充当佐剂的氢氧化铝中配制的重组乙肝病毒表面抗原(一种非自身抗原)。此疫苗诱导针对乙肝病毒表面抗原的免疫应答以针对感染提供保护。一种备选方法牵涉投递病毒或细菌的减毒、复制缺陷型和/或非病原性形式(各为非自身抗原)，以引发针对病原体的宿主保护性免疫应答。例如，口服脊髓灰质炎疫苗由减毒的活病毒(一种非自身抗原)构成，所述减毒的活病毒感染细胞并在接种疫苗的个体中复制以诱导针对脊髓灰质炎病毒(一种外来的或非自身的抗原)的有效免疫，而不引起临床疾病。或者，灭活的脊髓灰质炎疫苗含有不能感染或复制的灭活的或“杀死的”病毒并且皮下施用以诱导针对脊髓灰质炎病毒的保护性免疫。
已经描述了用于治疗自身免疫性疾病的DNA疗法。这类DNA疗法包括编码T细胞受体的抗原结合区的DNA分子以改变驱动自身免疫应答的自身反应性T细胞的水平(Waisman等，Nat Med 2:899-905,1996；美国专利5,939,400)。将编码自身抗原的DNA分子附着于微粒，并通过基因枪投递至皮肤以预防MS和胶原诱导的关节炎。(WO 97/46253;Ramshaw等，ImmunolCell Biol 75:409-413,1997)。编码粘着分子、细胞因子(例如TNFα)、趋化因子(例如C-C趋化因子)、和其它免疫分子(例如Fas配体)的DNA分子已经在动物模型中用于治疗自身免疫性疾病(Youssef等，J Clin Invest 106:361-371,2000;Wildbaum等，J Clin Invest 106:671-679,2000;Wildbaum等，J Immunol165:5860-5866,2000)。
通过施用编码一种或多种自身抗原的核酸来治疗自身免疫性疾病的方法记载于WO 00/53019、WO 2003/045316和WO 2004/047734中。尽管这些方法已经获得成功，但是仍然需要进一步的改进。
细菌肠毒素在用于预防传染病的疫苗中用作免疫刺激性佐剂。霍乱毒素(CT)和紧密相关的大肠杆菌(E.coli)不耐热毒素(LT)可能是目前实验性使用的最有力的且研究得最好的粘膜佐剂(Rappuoli等，Immunol Today20:493-500)，但是在临床中利用时，其潜在的毒性和与贝耳(Bell)氏麻痹(面部神经麻痹)病例的关联已经导致其撤出市场(Gluck等，J Infect Dis 181:1129-1132,2000;Gluck等，Vaccine 20(增刊1):S42-44,2001;Mutsch等，NEngl J Med.350:896-903,2004)。已经证明了细菌肠毒素CT和LT在实验用动物中以及在人中是有效的免疫增强剂(Freytag等，Curr Top Microbiol Immunol236:215-236,1999)。在结构上，这些肠毒素是AB5复合物，并且由一个ADP-核糖基转移酶活性A1亚基和将A1与B亚基五聚体连接的A2亚基构成。全毒素经由B亚基(CTB)结合大多数哺乳动物细胞，所述B亚基与细胞膜中的GM1-神经节苷脂受体特异性相互作用。鉴于已经发现了全毒素增强粘膜免疫响应，已经使用CTB和抗原之间的缀合物来使免疫系统特异性耐受(Holmgren等，Am J Trop Med Hyg 50:42-54,1994)。小鼠中研究已经显示了，CT和LT在鼻内给予时可以在嗅神经和嗅球中积累，即一种依赖于CT或LT B亚基结合存在于所有有核哺乳动物细胞上的GM1-神经节苷脂受体的能力的机制(Fujihashi等，Vaccine 20:2431-2438,2002)。虽然毒性较小的CT和LT突变体已经工程化改造为具有实质性佐剂功能，但是这类分子仍然携带引起不利反应的重大风险(Giuliani等，J Exp Med 187:1123-1132,1998;Yamamoto等，J Exp Med 185:1203-1210,1997)，尤其在考虑CT和LT的佐剂性表现为A亚基的ADP-核糖基转移酶活性和结合靶细胞上神经节苷脂受体的能力的组合时(Soriani等，Microbiology 148:667-676,2002)。这些及其它观察结果排除了在人用疫苗中使用CT或LT全毒素。在另一方面，最近的观察结果已经证明了，有可能通过在编码A1亚基的基因中引入定点突变在无毒性或毒性很大降低的情况中保留这些分子的佐剂功能。已经证明为有效佐剂的突变体分子的例子是LTK63和LTR72(Giuliani等，J Exp Med 187:1123-1132,1998)，前一种无酶活性，而后一种有显著降低的ADP-核糖基化活性。尽管如此，GM1-神经节苷脂受体依赖性结合仍然是这些突变体中的一个问题，并且因此仍然可能引起神经细胞积累和神经毒性。
效力对毒性的此两难问题的更好的解决办法是CTA1-DD分子，其已经证明是一种高度有效的粘膜和系统性佐剂(
Figure BDA00002620859100071
等，J Immunol 158:3936-3946,1997;US 5,917,026)。此独特的佐剂基于与来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的免疫球蛋白结合元件的二聚体组合的CT酶促活性A1亚基。由此，该分子避免可以导致不想要的反应的对所有具核细胞的结合，并且完整利用全毒素中的CTA1酶。因此，迄今为止的所有研究都已经发现，CTA1-DD是无毒性的，而且保留卓越的免疫增强功能。在系统性给予时，CTA1-DD提供与完整的CT相当的佐剂效果，极大地提升针对与佐剂共施用的特定免疫原的细胞和体液免疫两者。它还发挥粘膜佐剂功能，并且应该是安全的，因为它缺乏作为CT全毒素毒性前提的B亚基。CTA1-DD不能结合神经节苷脂受体；而是，其靶向B细胞，将CTA1-DD佐剂限于可以与其相互作用的受限的细胞全集。然而，佐剂效果并不完全依赖于B细胞，如在B细胞缺陷型小鼠中使用CTA1-DD佐剂的鼻内免疫后特异性CD4 T细胞免疫的强烈诱导中显示的(Eliasson等，Vaccine 25:1243-52,2008,Akhiani等，ScandJ.Immunol 63:97-105,2006)。
CTA1-DD的佐剂效果在缺少ADP-核糖基化酶活性的突变体CTA1-E112K-DD和CTA1-R7K-DD中缺乏(Lycke,Immunol Lett 97:193-198,2005)。
WO 2009/078796进一步描述了包含突变体CTA1-R7K-DD的免疫调控复合物，且更具体地，包含与包含氨基酸260-273的共享的胶原II免疫优势肽(CII260-273)连接的CTA1-R7K-DD的免疫调控复合物。
已经显示了CTB和自牛胶原II衍生的肽的缀合物能够保护小鼠免于形成胶原诱导的自身免疫性耳疾病以及胶原诱导的关节炎(Kim等，Ann OtolRhinol Laryngol 110:646-654,2001;Tarkowski等，Arthritis Rheum 42:1628-34,1999)。然而，CTB由于其GM1-神经节苷脂结合特性和潜在的神经毒性效果而不可以适用于人，如上文讨论的。
本发明的免疫调控复合物与依照WO 2009/078796的包含突变体CTA1-R7K-DD的免疫调控复合物的不同之处至少在于已经将氨基酸187从半胱氨酸改变为丙氨酸，且可选地，在于已经在突变体CTA1亚基的N端中进一步插入赖氨酸残基。
令人惊讶地，本发明的发明人已经发现了，依照WO 2009/078796的包含突变体CTA1-R7K-DD的免疫调控复合物中，且具体地包含与共享的胶原II免疫优势肽连接的CTA1-R7K-DD的免疫调控复合物中用丙氨酸进一步替换氨基酸187半胱氨酸对关节炎提供显著改善的治疗效果，小鼠中关节炎的发生率和严重性显著更低。
不限于理论，与依照WO 2009/078796的CTA1-R/K-DD相比，依照本发明的CTA1-R7K/C187A-DD的治疗效果的令人惊讶的改善背后的机制似乎会可通过如下实情来解释，即用丙氨酸替换氨基酸187半胱氨酸消除经由二硫键的二聚体形成。
先验未知的是，获得治疗效果是否会至少在一定程度上或甚至在实质性程度上取决于所得融合蛋白的二聚化。因此，在本发明人的令人惊讶的发现前，不可预测尝试避免二聚化实际上是否会对免疫调控复合物的治疗活性有害，及进行此氨基酸替换是否会产生具有与CTA1-R7K-DD构建体至少一样好的治疗效果的融合蛋白。
此外，令人惊讶地，本发明人已经发现了，在融合蛋白的N端中插入赖氨酸残基显著增加融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-DD的表达和生成，而没有由错折叠、移位或蛋白水解性降解所致的蛋白质治疗效力方面的任何损失。因此，至今不知道在N端中插入赖氨酸残基是否会对融合蛋白的生物学利用度和治疗活性有害(例如由于对折叠的影响，等等)，及在N端中插入赖氨酸是否会产生具有与CTA1-R7K-DD构建体至少一样好的治疗效果的融合蛋白。
发明概述
本发明涉及改进的免疫调控复合物和包含它们的组合物，以及其用于生产医用产品和在用于防范、预防和/或治疗自身免疫性或变应性疾病的方法中的用途。依照本发明的改进的免疫调控复合物是融合蛋白，其包含霍乱毒素ADP-核糖基化A1亚基(CTA1)的突变体亚基、能够结合特定细胞受体的肽、以及一种或多种与疾病有关的表位。对受试者施用治疗或预防有效量的免疫调控复合物引发抑制针对与疾病有关的抗原的免疫应答，由此治疗或预防该疾病。
所述表位可以是自身免疫性表位(当要治疗的疾病是自身免疫性疾病时)和激发变态反应的表位(当要治疗的疾病是变应性疾病时)。
在一个实施方案中，本发明提供了免疫调控复合物，其是包含下列各项的融合蛋白：
(a)霍乱毒素ADP核糖基化A1亚基(CTA1)的突变体亚基，
(b)能够结合特定细胞受体的肽，和
(c)一种或多种与自身免疫性或变应性疾病有关的表位，
其中，在所述突变体CTA1亚基中，对应于天然CTA1中氨基酸7精氨酸和氨基酸187半胱氨酸的氨基酸已经被替换。
在一个优选的实施方案中，已经在所述突变体CTA1亚基的N端中进一步插入氨基酸赖氨酸。
在一个优选的实施方案中，所述融合蛋白包含CTA1-R7K/C187A突变体(SEQ ID NO:1)，其中天然CTA1序列中氨基酸7精氨酸已经用赖氨酸替换，且其中天然CTA1序列中氨基酸187半胱氨酸已经用丙氨酸替换。
在一个甚至更优选的实施方案中，所述融合蛋白包含K-CTA1-R7K/C187A突变体(SEQ ID NO:2)，其中天然CTA1序列中氨基酸7精氨酸已经用赖氨酸替换，其中天然CTA1序列中氨基酸187半胱氨酸已经用丙氨酸替换，且已经在N端中插入氨基酸赖氨酸。
用赖氨酸替换氨基酸7精氨酸消除ADP-核糖基化活性，用丙氨酸替换氨基酸187半胱氨酸防止二聚体的形成，而在N端中插入赖氨酸显著增加融合蛋白的表达和生成。
因此，与依照WO 2009/078796(在此通过提述完全并入)的CTA1-R7K相比，依照本发明的融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A提供了令人惊讶的且有利的效果。因此，令人惊讶地，已经发现了K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的治疗效果显著好于CTA1-R7K-COL-DD的治疗效果，如与实施例2和3的比较试验中小鼠对照组相比，在关节炎的严重性和发生率降低中可以看出的。
在一个实施方案中，所述融合蛋白包含特异性结合在能够抗原呈递的细胞，特别是表达MHC I类或MHC II类抗原的细胞上表达的受体的肽。抗原呈递细胞可以选自下组：淋巴细胞，诸如B淋巴细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、上皮细胞和内皮细胞。
所述肽是结合上述细胞的受体，优选地由所述抗原呈递细胞表达的Ig或Fc受体，且最优选地B淋巴细胞和树突细胞的受体的肽。
特异性肽的例子是能够结合诸如下列各项的受体的肽：
(i)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，其能够结合存在于单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、成纤维细胞和内皮细胞上的GM-CSF受体α/β异二聚体，
(ii)T细胞上表达的CD4和CD8，其连同T细胞受体(TcR)一起，分别充当MHCII类和MHC I类分子的共同受体。MHC I类在大多数具核细胞上表达，而MHCII类分子在树突细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样和红系前体细胞和一些上皮细胞上表达，
(iii)CD 28和CTLA-4，即主要在T细胞上表达的两种同二聚体蛋白质，其结合B细胞上表达的CD80和CD86B7，
(iv)主要存在于成熟的B细胞表面上的CD40，其与T细胞上表达的CD40L(gp39或CD 154)相互作用，
(v)不同同种型的Ig重链恒定区，其与肥大细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、血小板、树突细胞、巨噬细胞、NK细胞和B细胞上存在的许多高或低亲和力Fc受体相互作用，
(vi)B细胞和小结树突细胞上表达的补体受体(CR)，即CR1、CR2和CR3，已经显示了其在产生正常的体液免疫应答中是重要的，而且它们有可能还参与自身免疫的形成，
(vii)C型凝集素受体(CLR)，如树突细胞上表达的Dectin-1，
(viii)DEC205，即一种在树突细胞子集上以高水平表达的用于抗原摄取和加工的胞吞受体，
(ix)CD11c，即一种主要在髓样细胞上发现的众多可溶性因子和蛋白质(LPS、血纤蛋白原、iC3b)的细胞表面受体，
(x)甘露糖受体，其存在于树突细胞、巨噬细胞和其它抗原呈递细胞上，
(xi)特异性HSP60受体，其存在于巨噬细胞上。
(xii)CD 103，即一种由树突细胞子集表达的整联蛋白α链，
(xii)33D1抗原，其存在于树突细胞上。
依照本发明的一个特别优选的实施方案，所述肽由单个或多个拷贝的蛋白A或其片段，诸如一个或多个其D亚基构成。依照本发明的另一个特别优选的实施方案，所述肽由特异性结合在能够抗原呈递的细胞上表达的受体的抗体片段，诸如单链抗体片段构成。
优选地，所述肽使得所得的融合蛋白拥有水溶性和将融合蛋白靶向至与结合天然毒素的受体不同的特异性细胞受体，从而介导至少所述亚基的胞内摄取的能力。
自身抗原性表位可以与自身免疫性疾病，诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、或舍格伦综合征(SS)有关。
在一些实施方案中，与IDDM有关的自身抗原性表位是自下组衍生的表位：前胰岛素原；胰岛素原，胰岛素和胰岛素B链；谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和-67；酪氨酸磷酸酶IA-2；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶相关蛋白(IGRP)和胰岛细胞抗原69kD。
在一些实施方案中，与MS有关的自身抗原性表位是自下组衍生的表位：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂关联少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)和髓磷脂关联糖蛋白(MAG)。
在一些实施方案中，与RA有关的自身抗原性表位是自下组衍生的表位：I、II、III、IV、V、IX和XI型胶原、GP-39、聚丝蛋白(filaggrin)和血纤蛋白。在一个优选的实施方案中，所述表位自II型胶原衍生，优选地，该表位是包含氨基酸260-273的共享的胶原II免疫优势肽(CII260-273)。
变应性表位可以与变应性哮喘、变应性鼻炎、变应性肺泡炎、特应性皮炎、或食物超敏感性有关。在一些实施方案中，所述变应性表位是自以下衍生的表位：植物花粉，诸如来自橄榄花粉的Ole e1变应原、来自日本雪松(cedar)花粉的Cry jI和Cry jII变应原、梯牧草(timothy grass)花粉nPhl p4、桦树花粉主要变应原Bet v1、或艾蒿(mugwort)花粉主要变应原Art v1；动物抗原，诸如猫变应原Fel d1、犬变应原Can f1或尘螨变应原Der f1、Der p1、Der m1、Biot4；真菌抗原，诸如链格孢属(Alternaria)抗原Alt a1、曲霉属(Asperigullus)抗原Asp f1、分枝孢子菌属(Cladosporium)抗原CIA h1和Cla h2、或青霉属(Penicillium)抗原Pen ch13；或食物变应原，诸如鸡蛋清变应原Gal d1、Gal d2和Gal d3，花生变应原Ara h2，大豆变应原Gly m1、Gly m5和Gly m6，鱼变应原Gad c1，或虾变应原Pen a1。
在一个优选的实施方案中，所述免疫调控复合物是融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD(SEQ ID NO:4)，其中COL是包含氨基酸260-273的共享的胶原II免疫优势肽(CII260-273)(SEQ ID NO:5)。在另一个实施方案中，所述免疫调控复合物是融合蛋白CTA1-R7K/C187A-COL-DD(SEQ ID NO:10)。在另一个优选的实施方案中，所述免疫调控复合物是融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Ro169-DD(SEQ ID NO:11)。在又一个优选的实施方案中，所述免疫调控复合物是融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Ro211-DD(SEQ ID NO:12)。在又一个优选的实施方案中，所述免疫调控复合物是融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Ro274-DD(SEQ ID NO:13)。在又一个优选的实施方案中，所述免疫调控复合物是融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Betvl-DD(SEQ ID NO:17)。在又一个优选的实施方案中，所述免疫调控复合物是融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Phlp5-DD(SEQ ID NO:18)。在又一个优选的实施方案中，所述免疫调控复合物是融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Phlp5-DD(SEQ ID NO:19)。
本发明提供了用于治疗、防范和/或预防自身免疫性疾病诸如多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、贝切特(Behcet)氏病、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、舍格伦氏综合征、寻常型天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)和格雷夫斯氏病的方法和组合物，包括对受试者施用包含一种或多种与所述疾病有关的自身抗原性表位的依照本发明的免疫调控复合物。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗、防范和/或预防自身免疫性疾病胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的改进方法，包括对受试者施用包含一种或多种与IDDM有关的自身抗原性表位的依照本发明的免疫调控复合物。在一些实施方案中，所述与IDDM有关的自身抗原性表位是自下组衍生的表位：前胰岛素原；胰岛素原，胰岛素和胰岛素B链；谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和-67；酪氨酸磷酸酶IA-2；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶相关蛋白(IGRP)和胰岛细胞抗原69kD。
在本发明的其它实施方案中，提供了用于治疗、防范和/或预防多发性硬化(MS)的改进方法，包括对受试者施用包含一种或多种与MS有关的自身抗原性表位的依照本发明的免疫调控复合物。在一些实施方案中，所述自身抗原性表位是自下组衍生的表位：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂关联少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)和髓磷脂关联糖蛋白(MAG)。
在其它实施方案中，提供了用于治疗、防范和/或预防类风湿性关节炎(RA)的改进方法，包括对受试者施用包含一种或多种与RA有关的自身抗原性表位的依照本发明的免疫调控复合物。在一些实施方案中，所述自身抗原性表位是自下组衍生的表位：I、II、III、IV、V、IX和XI型胶原、GP-39、聚丝蛋白和血纤蛋白。在一个优选的实施方案中，所述表位自II型胶原衍生，优选地，该表位是包含氨基酸260-273的共享的胶原II免疫优势肽(CII260-273)。
可以将包含不同自身抗原性表位的多种免疫调控复合物作为混合物施用，并且每种单独的免疫调控复合物可以包含多种自身抗原性表位。类似地，可以将包含不同变应性表位的多种免疫调控复合物作为混合物施用，并且每种单独的免疫调控复合物可以包含多种激发变态反应的表位。
在某些变型中，用于治疗、防范和/或预防自身免疫性或变应性疾病的方法和组合物进一步包括与其它物质诸如，例如包含免疫调控序列的多核苷酸、药理学药剂、佐剂、细胞因子、或编码细胞因子的载体组合施用依照本发明的免疫调控复合物。
本发明的又一个实施方案提供了包含依照本发明的免疫调控复合物的药物组合物。本发明的药物组合物可以用于防范、预防和/或治疗变应性或自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病可以选自下组：胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、舍格伦氏综合征、寻常型天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮、和格雷夫斯氏病。所述变应性疾病可以选自下组：变应性哮喘、变应性鼻炎、变应性肺泡炎、特应性皮炎、或食物超敏感性。
本发明的又一个实施方案提供了依照本发明的免疫调控复合物用于生产供防范、预防和/或治疗自身免疫性或变应性疾病用的医用产品的用途。所述自身免疫性疾病可以选自下组：胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、舍格伦氏综合征、寻常型天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮、和格雷夫斯氏病。所述变应性疾病可以选自下组：变应性哮喘、变应性鼻炎、变应性肺泡炎、特应性皮炎、或食物超敏感性。
在又一个实施方案中，本发明提供了编码依照本发明的免疫调控复合物的分离的核酸序列。因而，本发明提供了编码免疫调控复合物的分离的核酸序列，所述免疫调控复合物是包含霍乱毒素ADP核糖基化A1亚基(CTA1)的突变体亚基、能够结合特定细胞受体的肽、和一种或多种与自身免疫性或变应性疾病有关的表位的融合蛋白。
在一个实施方案中，依照本发明的核酸编码作为融合蛋白的免疫调控复合物，所述融合蛋白包含：
(a)霍乱毒素ADP核糖基化A1亚基(CTA1)的突变体亚基，
(b)能够结合特定细胞受体的肽，和
(c)一种或多种与自身免疫性或变应性疾病有关的表位，
其中，在所述突变体CTA1亚基中，对应于天然CTA1中氨基酸7精氨酸和氨基酸187半胱氨酸的氨基酸已经被替换。
在一个优选的实施方案中，已经在突变体CTA1亚基的N端中进一步插入氨基酸赖氨酸。
在一个优选的实施方案中，依照本发明的核酸编码包含CTA1-R7K/C187A突变体(SEQ ID NO:1)的融合蛋白，其中天然CTA1序列中的氨基酸7精氨酸已经用赖氨酸替换，且其中天然CTA1序列的氨基酸187半胱氨酸已经用丙氨酸替换。
在一个甚至更优选的实施方案中，依照本发明的核酸编码包含K-CTA1-R7K/C187A突变体(SEQ ID NO:2)的融合蛋白，其中天然CTA1序列中氨基酸7精氨酸已经用赖氨酸替换，其中天然CTA1序列中氨基酸187半胱氨酸已经用丙氨酸替换，且其中已经在N端中插入氨基酸赖氨酸。
在一个实施方案中，依照本发明的核酸编码包含肽的融合蛋白，所述肽特异性结合在能够抗原呈递的细胞，特别是表达MHC I类或MHC II类分子的细胞上表达的受体。抗原呈递细胞可以选自下组：淋巴细胞诸如B淋巴细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、上皮细胞和内皮细胞。
在一个实施方案中，依照本发明的核酸编码包含与自身免疫性疾病，诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、或舍格伦综合征(SS)有关的自身抗原性表位的融合蛋白。
在另一个实施方案中，依照本发明的核酸编码包含与变应性疾病，诸如变应性哮喘、变应性鼻炎、变应性肺泡炎、特应性皮炎、或食物超敏感性有关的变应性表位的融合蛋白。
在一些实施方案中，与IDDM有关的自身抗原性表位是自下组衍生的表位：前胰岛素原；胰岛素原，胰岛素、和胰岛素B链；谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和-67；酪氨酸磷酸酶IA-2；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶相关蛋白(IGRP)和胰岛细胞抗原69kD。在一些实施方案中，与MS有关的自身抗原性表位是自下组衍生的表位：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂关联少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、和髓磷脂关联糖蛋白(MAG)。在一些实施方案中，与RA有关的自身抗原性表位是自下组衍生的表位：I、II、III、IV、V、IX和XI型胶原、GP-39、聚丝蛋白和血纤蛋白。在一些实施方案中，与SS有关的自身抗原性表位是自下组衍生的表位：热休克蛋白HSP60、胞衬蛋白(fodrin)、Ro(或SSA)和La(或SSB)核糖核蛋白。
本发明的核酸可以是DNA或RNA。
依照本发明的核酸可以是编码融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的核酸序列，诸如核酸序列SEQ ID NO:3；编码融合蛋白CTA1-R7K/C187A-COL-DD的核酸序列，诸如核酸序列SEQ ID NO:9；编码融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Ro169-DD的核酸序列；编码融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Ro211-DD的核酸序列；编码融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Ro274-DD的核酸序列；编码融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Betvl-DD的核酸序列；编码融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Phl p1-DD的核酸序列；和编码融合蛋白K-CTA1-R7K/C187A-Phl p5-DD的核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含依照本发明的核酸的药物组合物。所述药物组合物可以用于防范、预防和/或治疗变应性或自身免疫性疾病。本发明进一步提供了用于防范、预防和/或治疗受试者中自身免疫性或变应性疾病的方法，所述方法包括：对所述受试者施用有效量的依照本发明的核酸。
在又一个实施方案中，本发明提供了包含依照本发明的核酸的重组质粒、载体和表达系统。优选地，重组表达系统适合于细菌表达。本发明进一步提供了含有依照本发明的质粒、载体或表达系统的经转化的细胞。优选地，经转化的细胞是经转化的细菌细胞。
定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非另外规定，如在本文中使用的，下列术语和短语具有归于其的含义。
霍乱毒素ADP核糖基化A1亚基(CTA1)的氨基酸序列可以见例如GenBank登录号AAM22586.1、ADG44926.1、AAM74170.1、CAE11218.1、或AAA27514.1。术语“霍乱毒素ADP核糖基化A1亚基(CTA1)的亚基”指至少包含与霍乱毒素的成熟的ADP核糖基化A1亚基(CTA1)序列的氨基酸7赖氨酸至氨基酸187半胱氨酸的序列对应的序列的多肽，诸如至少包含与霍乱毒素的成熟的ADP核糖基化A1亚基(CTA1)序列的氨基酸1天冬酰胺至氨基酸187半胱氨酸的序列对应的序列，或至少包含与霍乱毒素的成熟的ADP核糖基化A1亚基(CTA1)序列的氨基酸1天冬酰胺至氨基酸194丝氨酸的序列对应的序列的多肽。
术语“多核苷酸”和“核酸”指由经由磷酸二酯键连接的多个核苷酸单元(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或相关结构变体)构成的聚合体。多核苷酸或核酸可以实质上具有任意长度，典型地，从约六(6)个核苷酸至约109个核苷酸或更长。多核苷酸和核酸包括RNA、DNA、合成形式、和混合聚合体(有义链和反义链两者，双链或单链)，并且也可以是经化学或生物化学修饰的，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如熟练技术人员会容易领会的。
如本文中使用的，“抗原”指可以通过B细胞或T细胞，或这两者，受到免疫系统识别的任何分子。
如本文中使用的，“自身抗原”指引发病原性免疫应答的内源分子，通常为多糖或蛋白质或其片段。自身抗原包括糖基化的蛋白质和肽以及携带其它形式翻译后修饰的蛋白质和肽，包括瓜氨酸化的(citrullinated)肽。当将自身抗原或其表位称为“与自身免疫性疾病有关”时，理解为意指自身抗原或表位通过诱导病理生理学(即与疾病的病因学有关)、介导或促进病理生理学过程；和/或作为病理生理学过程的靶物而牵涉疾病的病理生理学。例如，在自身免疫性疾病中，免疫系统异常靶向自身抗原，引起表达和/或存在自身抗原的细胞和组织的损伤和功能障碍。在正常的生理学条件下，宿主免疫系统经由一种称作“免疫耐受”的过程经由具有识别自身抗原的能力的免疫细胞的消除、灭活、或活化缺乏而忽视自身抗原。
如本文中使用的，“变应原”指引发病原性免疫应答的外源分子，通常为多糖或蛋白质或其片段。变应原包括糖基化的蛋白质和肽以及携带其它形式翻译后修饰的蛋白质和肽。变应原可以自例如花粉、真菌、昆虫毒液、皮屑、霉、食品衍生。许多食物变应原得到纯化并充分表征，诸如花生Ara h1、Ara h2、Ara h3和Ara h6；鸡蛋清Gal d1、Gal d2和Gal d3；大豆Gly m1；鱼Gad c1；和虾Pen a1。猫(Fel d1)和犬(Can f1)主要变应原，以及尘螨变应原Der f1和Der p1得到充分表征。天然梯牧草花粉nPhl p4以及许多相关重组变应原rPhl 1p、rPhl 2p、rPhl 5p、rPhl 6p、rPhl 7p、rPhl 11p、rPhl 12p，桦树花粉主要变应原Bet v1，车前草(plantain)花粉主要变应原Pla I 1，橄榄花粉主要变应原Ole e1，豕草(ragweed)花粉主要变应原Amb a1，艾属(Artemisia)花粉主要变应原Art v1和Art v3是定义完善的。
如本文中使用的，术语“表位”理解为意指多糖或多肽中具有受到动物免疫系统的B细胞或T细胞识别的特定形状或结构的部分。表位可以包括多糖和多肽两者的部分，例如糖基化的肽。
“自身抗原表位”指自身抗原中引发病原性免疫应答的表位。
“激发变态反应的表位”指变应原中引发病原性免疫应答的表位。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合体。该术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
“自身蛋白”、“自身多肽”或“自身肽”在本文中可互换使用，并且指任何如下的蛋白质、多肽、或肽、或其片段或衍生物：其在动物的基因组内编码；在动物中产生或生成；可以在动物一生期间的某一时间翻译后修饰；和，在非生理学情况下存在于动物中。术语“非生理学”或“非生理学情况下”在用于描述本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽时，意指所述自身蛋白、自身多肽、或自身肽在动物中的正常作用或过程的偏离或偏差。当将自身蛋白、自身多肽、或自身肽称为“与疾病有关”或“牵涉疾病”时，理解为意指自身蛋白、自身多肽、或自身肽在形式或结构中可以经过修饰，并且因此不能实施其生理学作用或过程，或者可以通过诱导病理生理学；介导或促进病理生理学过程；和/或通过作为病理生理学过程的靶物而牵涉该状况或疾病的病理生理学。例如，在自身免疫性疾病中，免疫系统异常攻击自身蛋白，引起表达和/或存在自身蛋白的细胞和组织的损伤和功能障碍。或者，自身蛋白、自身多肽或自身肽可以自身以非生理学水平表达和/或在非生理学情况下发挥功能。例如，在神经变性性疾病中，自身蛋白异常表达，并且在脑损伤中聚集，由此引起神经功能障碍。在其它情况中，自身蛋白使不期望的状况或过程恶化。例如，在骨关节炎中，包括胶原酶和基质金属蛋白酶在内的自身蛋白异常降解覆盖关节的关节表面的软骨。自身蛋白、自身多肽或自身肽的翻译后修饰的例子是糖基化、脂质基团的添加、可逆的磷酸化、二甲基精氨酸残基的添加、瓜氨酸化、和蛋白酶解，且更具体地，通过肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)对聚丝蛋白和血纤蛋白的瓜氨酸化、αβ-晶体蛋白磷酸化、MBP的瓜氨酸化、和通过胱天蛋白酶(caspase)和粒酶对SLE自身抗原的蛋白酶解。在免疫学上，会认为自身蛋白、自身多肽或自身肽都是宿主自身抗原，并且在正常的生理学条件下，经由一种称作“免疫耐受”的过程经由具有识别自身抗原的能力的免疫细胞的消除、灭活、或活化缺乏而被宿主免疫系统忽视。自身蛋白、自身多肽、或自身肽不包括免疫蛋白质、多肽、或肽，其是为了调节免疫功能由免疫系统的细胞在生理学上专门表达的分子。免疫系统是提供针对存在于动物世界的无数潜在病原性微生物产生快速的、高特异性的且保护性的应答的手段的防御机制。免疫蛋白质、多肽、或肽的例子是如下的蛋白质，包括T细胞受体、免疫球蛋白、细胞因子，包括I型白介素、和II型细胞因子，包括干扰素和IL-10、TNF、淋巴毒素和趋化因子，诸如巨噬细胞炎性蛋白-1α和β、单核细胞-趋化蛋白和RANTES，以及其它直接牵涉免疫功能的分子，诸如Fas配体。存在纳入本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽中的某些免疫蛋白质、多肽或肽，并且它们是：I类MHC膜糖蛋白、II类MHC糖蛋白和骨桥蛋白。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括如下的蛋白质、多肽和肽，其由于引起代谢或功能紊乱的遗传性或获得性缺陷而使受试者完全或实质性缺乏，并且通过施用所述蛋白质、多肽或肽，或者通过施用编码所述蛋白质、多肽或肽的多核苷酸(基因疗法)替换。这类病症的例子包括迪谢内肌营养不良(Duchenne’muscular dystrophy)、贝克肌营养不良(Becker’s muscular dystrophy)、囊性纤维化病(cystic fibrosis)、苯丙酮酸尿症(phenylketonuria)、半乳糖血症(galactosemia)、槭糖尿病(maple syrup urinedisease)、和同型胱氨酸尿症(homocystinuria)。
如本文中使用的，“免疫应答的调控”、“调控”或“改变免疫应答”指由于施用免疫调控复合物或编码免疫调控复合物的多核苷酸发生的，针对自身免疫或激发变态反应的表位，包括例如核酸、脂质、磷脂、碳水化合物、自身多肽、蛋白复合物或核糖核蛋白复合物的现有或潜在的免疫应答的任何改变。这类调控包括牵涉或能够牵涉免疫应答的任何免疫细胞的存在、能力或功能的任何改变。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、NK T细胞、专门的抗原呈递细胞、非专门的抗原呈递细胞、炎性细胞、或任何能够牵涉或影响免疫应答的其它细胞。“调控”包括对现有的免疫应答、形成中的免疫应答、潜在的免疫应答、或者诱导、调节、影响或响应免疫应答的能力赋予的任何变化。调控包括作为免疫应答的一部分的免疫细胞中基因、蛋白质和/或其它分子的表达和/或功能的任何变化。
“免疫应答的调控”包括，例如下列各项：消除、删除、或隔离免疫细胞；诱导或生成可以调控其它细胞的功能能力的免疫细胞，诸如自身反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞、或炎性细胞；在免疫细胞中诱导无应答状态(即无反应性)；增加、降低或改变免疫细胞的活性或功能或如此做的能力，包括但不限于，改变由这些细胞表达的蛋白质的模式。例子包括某些类别的分子诸如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子、或其它细胞表面受体的生成和/或分泌的改变；或这些调控事件的任意组合。
例如，施用免疫调控复合物或编码免疫调控复合物的多核苷酸可以如下调控免疫应答，即消除、隔离或灭活介导或能够介导不期望的免疫应答的免疫细胞；诱导、生成、或开启介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些效果的组合。测量免疫应答调控的例子包括但不限于，检查免疫细胞群的存在或缺乏(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微术、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应信号而增殖或分裂的能力或对响应信号而增殖或分裂的抗性(诸如使用T细胞增殖测定法和肽扫描分析，其基于在用抗-CD3抗体、抗-T细胞受体抗体、抗-CD28抗体、钙离子载体、PMA、加载有肽或蛋白质抗原的抗原呈递细胞刺激后的3H-胸苷掺入；B细胞增殖测定法)；测量杀死或溶解其它细胞的能力(诸如细胞毒性T细胞测定法)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和其它细胞产物(例如通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定法、Western印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径活化的生物化学标志物(例如，对酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽裂解、和蛋白质复合物的形成和解离的Western印迹和免疫沉淀分析；蛋白质阵列分析；使用DNA阵列或扣除杂交的DNA转录序型分析)；测量由凋亡、坏死、或其它机制引起的细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色、TUNEL测定法、测量DNA分梯(laddering)的凝胶电泳、组织学；荧光胱天蛋白酶测定法，对胱天蛋白酶底物的Western印迹分析)；测量由免疫细胞生成的基因、蛋白质和其它分子(例如，Northern印迹分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白质微阵列、二维凝胶电泳、Western印迹分析、酶联免疫吸附测定法、流式细胞术)；以及测量临床症状或结果，诸如牵涉自身蛋白或自身多肽的自身免疫性、神经变性性、和其它疾病的改善(临床得分、对使用其它疗法的需要、功能性状态、成像研究)，例如，其通过测量复发率或疾病严重性(使用普通技术人员已知的临床得分)(在多发性硬化的情况中)，测量血糖(在I型糖尿病的情况中)，或者关节炎症(在类风湿性关节炎的情况中)进行。
“受试者”应当意指任何动物，诸如，例如人、非人灵长类、马、牛、犬、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或家兔。
疾病或病症的“治疗”或“疗法”应当意指通过单独地或与如本文中描述的另一种化合物组合施用免疫调控复合物或编码免疫调控复合物的多核苷酸来减缓、停止或逆转疾病的进展，如根据降低、停止或消除临床或诊断症状证明的。“治疗”或“疗法”还意味着在急性或慢性疾病或病症中症状严重性降低或如例如在复发性或间歇性自身免疫性疾病病程的情况中复发率降低或在自身免疫性疾病炎性方面的情况中炎症降低。在优选的实施方案中，治疗疾病意味着逆转或停止或减轻疾病的进展，理想地达到消除疾病自身的程度。如本文中使用的，改善疾病和治疗疾病是等同的。
如在本发明的上下文中使用的，“预防”或“防范”疾病或病症指单独地或与如本文中描述的另一种化合物组合施用免疫调控复合物或编码免疫调控复合物的多核苷酸，来预防疾病或病症的发生或发作或疾病或病症的一些或所有症状或降低疾病或病症发作的可能性。
免疫调控复合物的“治疗或预防有效量”指免疫调控复合物的量足以治疗或预防疾病，如例如通过改善或消除疾病的症状和/或原因实现。例如，治疗有效量落入较宽的范围内并且经由临床试验确定，并且对于特定的患者，基于熟练临床医生已知的因素，包括例如疾病的严重性、患者的重量、年龄和其它因素确定。
附图简述
图1.编码免疫调控复合物K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的DNA构建体
pCTA1-DD质粒含有在trp启动子控制下的在HindIII-BamHI处克隆的霍乱毒素A1基因(aa 1-194)和来自葡萄球菌蛋白A基因的2个D片段。将胶原肽插入CTA1和DD片段之间以给出pCTA1-COL-DD。通过体外诱变构建R7K和C187A突变，给出pK-CTA1-R7K/C187A-COL-DD。Ptrc=Ptrc启动子。COL2A1=胶原肽，D=来自金黄色葡萄球菌蛋白A的Ig结合元件。
图2.CTA1-R7K-COL-DD和K-CTA1-R7K/C 187A-COL-DD在小鼠CIA模 型中的治疗效果的比较
A.关节炎指数。B.关节炎频率。
-■-CTA1-R7K-COL-DD，-◆-K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD，-□-PBS对照。
图3.CTA1-R7K-COL-DD和K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD在小鼠CAIA 模型中的治疗效果的比较
关节炎指数。-■-CTA1-R7K-COL-DD，-◆-K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD，-□-PBS对照。
图4.使用分析用大小排阻层析(SEC)研究的CTA1-R7K-COL-DD和 K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的二聚体形成
A.CTA1-R7K-COL-DD，B.K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD
图5.通过SDS-PAGE比较CTA1-R7K-COL-DD和K-CTA1-R7K/C 187A-COL-DD的纯度
第1道：分子量标准品；第2道：K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD(1.3μg)；
第3道：CTA1-R7K-COL-DD(1.1μg)。
发明详述
本发明涉及改进的免疫调控复合物和包含它们的组合物，以及其用于生产医用产品和在用于防范、预防和/或治疗受试者中疾病的方法中的用途，所述疾病与受试者中存在的且牵涉非生理学状态的一种或多种自身蛋白、自身多肽、或自身肽有关。依照本发明的改进的免疫调控复合物是融合蛋白，其包含霍乱毒素突变体A1亚基(CTA1)的亚基、能够结合特定细胞受体的肽、和一种或多种与疾病有关的表位。更具体地，本发明的某些实施方案涉及用于防范、预防和/或治疗受试者中与以非生理学状态存在的一种或多种自身多肽有关的自身免疫性疾病诸如多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、舍格伦氏综合征、寻常型天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮和格雷夫斯氏病的方法和组合物。本发明提供了用于防范、预防和/或治疗自身免疫性疾病的改进方法，包括对受试者施用包含一种或多种与疾病有关的自身抗原性表位的免疫调控复合物。对受试者施用治疗或预防有效量的包含一种或多种自身抗原性表位的免疫调控复合物，引发抑制针对与自身免疫性疾病有关的自身抗原的免疫应答，由此治疗或预防疾病。
自身免疫性疾病
表1中列出了自身免疫性疾病关联自身抗原的数个例子，并且在下文中更为详细地描述了具体的例子。
表1：例示性自身免疫性疾病和关联的自身抗原
Figure BDA00002620859100231
Figure BDA00002620859100241
类风湿性关节炎。类风湿性关节炎(RA)是一种影响0.8%的世界人口的慢性自身免疫性炎性滑膜炎。它以引起侵蚀性关节损伤的慢性炎性滑膜炎为特征。RA是由T细胞、B细胞和巨噬细胞介导的。
T细胞在RA中发挥至关重要的作用的证据包括(1)浸润滑膜的CD4+ T细胞的优势，(2)用药物诸如环孢霉素得到的与抑制T细胞功能有关的临床改善，和(3)RA与某些HLA-DR等位基因的关联。与RA有关的HLA-DR等位基因在β链的第三高变区中的第67位-第74位含有相似的氨基酸序列，其牵涉肽结合和对T细胞的呈递。RA是由识别存在于滑膜关节中的自身蛋白或经修饰的自身蛋白的自身反应性T细胞介导的。在RA中靶向的自身抗原包含，例如，来自II型胶原；hnRNP；A2/RA33；Sa；聚丝蛋白；角蛋白；瓜氨酸；包括gp39在内的软骨蛋白；I5 III、IV、V、IX、XI型胶原；HSP-65/60；IgM(类风湿因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心磷脂(cardiolipin)；醛缩酶A；经瓜氨酸修饰的聚丝蛋白和血纤蛋白的表位。已经在高比例的RA患者的血清中鉴定出识别含有经修饰精氨酸残基(脱亚氨以形成瓜氨酸)的聚丝蛋白肽的自身抗体。自身反应性T和B细胞应答在一些患者中都针对同一II型胶原(CII)免疫优势肽257-270。
多发性硬化。多发性硬化(MS)是最常见的脱髓鞘CNS病症，并且影响着350,000名美国人和世界范围内的100万人。典型地，症状的发作在年龄为20岁至40岁发生，并且表现为单侧视力损伤、肌无力、感觉异常(paresthesia)、共济失调(ataxia)、眩晕(vertigo)、尿失禁(urinary incontinence)、构音困难(dysarthria)或精神障碍(按照频率递减排序)的急性或亚急性发作。这类症状源自病灶性脱髓鞘损害，其引起由减缓的轴突传导所致的负传导异常，和由异位脉冲生成所致的正传导异常(例如莱尔米(Lhermitte)氏症状)两者。MS的诊断学基于历史，包括神经病学功能障碍的至少两次独特发作，其在时间上是分开的，产生神经病学功能障碍的客观临床证据，并且牵涉CNS白质的不同区域。提供支持MS诊断学的其它客观证据的实验室研究包括CNS白质损伤的磁共振成象(MRI)、IgG的脑脊髓液(CSF)寡克隆显带、和异常诱发的应答。虽然大多数患者经历逐渐进展的复发性间歇性病程，但是MS的临床过程在个体间变化很大，并且范围可以为限于一生里数次轻度发作至爆发性慢性进行性疾病。具有分泌IFN-γ的能力的髓磷脂自身反应性T细胞的定量增加与MS和EAE的发病机制有关。
自身免疫性脱髓鞘疾病，诸如多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中自身免疫应答的自身抗原靶物可以包含来自下列各项的表位：蛋白脂质蛋白(PLP)；髓磷脂碱性蛋白(MBP)；髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)；环核苷酸磷酸二酯酶(CNP酶)；髓磷脂关联糖蛋白(MAG)和髓磷脂关联少突胶质细胞碱性蛋白(MBOP)；α-B-晶体蛋白(一种热休克蛋白)；病毒和细菌模拟肽，例如流感、疱疹病毒、乙肝病毒，等等；OSP(少突胶质细胞特异性蛋白)；经瓜氨酸修饰的MBP(MBP的C8同等型，其中已经将6个精氨酸脱亚氨为瓜氨酸)，等等。膜内在蛋白PLP是髓磷脂的优势自身抗原。PLP抗原性的决定子已经在数种小鼠品系中得到鉴定，并且包括残基139-151、103-116、215-232、43-64和178-191。已经报告了至少26种MBP表位(Meinl等，J ClinInvest 92,2633-43,1993)。值得注意的是残基1-11、59-76和87-99。已经在数种小鼠品系中鉴定出的MOG免疫优势表位包括残基1-22、35-55、64-96。
在人MS患者中，下列髓磷脂蛋白和表位被鉴定为T和B细胞自身免疫应答的靶物。自MS脑斑洗脱的抗体识别髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽83-97(Wucherpfennig等，J Clin Invest 100:1114-1122,1997)。另一项研究发现MS患者约50%具有针对髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的外周血淋巴细胞(PBL)T细胞反应性(6-10%对照)、20%针对MBP有反应(8-12%对照)、8%针对PLP有反应(0%对照)、0%针对MAG有反应(0%对照)。在此研究中，10位MOG反应性患者中的7位具有聚焦于3种肽表位(包括MOG 1-22、MOG 34-56、MOG 64-96)之一的T细胞增殖应答(Kerlero de Rosbo等，Eur J Immunol 27:3059-69,1997)。T和B细胞(脑损伤洗脱的抗体)应答聚焦于MBP 87-99(Oksenberg等，Nature 362:68-70,1993)。在MBP 87-99中，氨基酸基序HFFK是T和B细胞应答两者的优势靶物(Wucherpfennig等，J Clin Invest 100:1114-22,1997)。另一项研究观察到针对髓磷脂关联少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)(包括残基MOBP 21-39和MOBP 37-60)的淋巴细胞反应性(Holz等，JImmunol 164:1 103-9,2000)。使用MOG和MBP肽的免疫金缀合物对MS和对照脑染色，MBP和MOG肽两者都受到MS斑结合的抗体识别(Genain和Hauser,Methods 10:420-34,1996)。
胰岛素依赖性糖尿病。人I型或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)以对朗格汉斯胰岛中β细胞的自身免疫性破坏为特征。β细胞的消减导致不能调节血液中的葡萄糖水平。当血液中的葡萄糖水平上升到高于特定水平(通常约250mg/dl)时发生明显糖尿病。在人中，糖尿病发作前有较长的症状前时段。在此时段期间，胰腺β细胞功能逐渐丧失。根据针对胰岛素、谷氨酸脱羧酶、和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗体的存在暗示疾病的形成。
可以在症状前阶段期间评估的标志物是胰腺中胰岛炎的存在、胰岛细胞抗体的水平和频率、胰岛细胞表面抗体、胰β细胞上MHC II类分子的异常表达、血液中的葡萄糖浓度、和胰岛素的血浆浓度。胰腺中的T淋巴细胞数目、胰岛细胞抗体和血糖的增加指示疾病，胰岛素浓度降低亦然。
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是与人IDDM具有共同的许多临床、免疫学、和组织病理学特征的动物模型。NOD小鼠自发形成胰岛炎症和对β细胞的破坏，这导致高血糖症和明显糖尿病。CD4+和CD8+ T细胞两者都是糖尿病形成需要的，尽管每种的作用还不清楚。已经显示了在耐受化条件下对NOD小鼠以蛋白质施用胰岛素或GAD5，预防疾病并下调对其它自身抗原的应答。
在血清中具有各种特异性的自身抗体的组合的存在对于人I型糖尿病而言是高度灵敏的且特异性的。例如，针对GAD和/或IA-2的自身抗体的存在对于自对照血清鉴定I型糖尿病是约98%灵敏的且99%特异性的。在I型糖尿病患者的非糖尿病一级亲属中，对3种自身抗原(包括GAD、胰岛素和IA-2)中2种特异性的自身抗体的存在传达对于5年内形成IDM型，阳性预测值>90%。
在人胰岛素依赖性糖尿病中靶向的自身抗原可以包括，例如酪氨酸磷酸酶IA-2；IA-2β；谷氨酸脱羧酶(GAD)65kDa和67kDa形式两者；羧肽酶H；胰岛素；胰岛素原；热休克蛋白(HSP)；glima 38；胰岛细胞抗原69KDa(ICA69)；p52；两种神经节苷脂抗原(GT3和GM2-1)；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶相关蛋白(IGRP)；和胰岛细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT 2)。
目前通过监测血糖水平以指导重组胰岛素的注射或基于泵的投递来治疗人IDDM。饮食和锻炼方案有助于实现足够的血糖控制。
自身免疫性葡萄膜炎。自身免疫性葡萄膜炎是一种自身免疫性眼疾病，估计其影响400,000人，在美国每年有43,000例新发病例。目前用类固醇，免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤和环孢霉素、静脉内免疫球蛋白、和TNFα拮抗剂治疗自身免疫性葡萄膜炎。
实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，其靶向眼中的神经视网膜、葡萄膜、和相关组织。EAU与人自身免疫性葡萄膜炎共享许多临床和免疫学特征，并且通过外周施用完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的葡萄膜炎发生(uveitogenic)肽诱导。
人自身免疫性葡萄膜炎中的自身免疫应答靶向的自身抗原可以包括S-抗原、光受体间类视黄醇结合蛋白(B BP)、视紫质、和恢复蛋白(recoverin)。
原发性胆汁性肝硬化。原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种主要影响年龄为40-60岁的女性的器官特异性自身免疫性疾病。在此组间报告的流行性接近千分之一。PBC以对作为小肝内胆管衬里的肝内胆管上皮细胞(IBEC)的进行性破坏为特征。这导致阻塞和干扰胆汁分泌，从而引起最终硬化。已经报告了与以上皮衬里/分泌系统损伤为特征的其它自身免疫性疾病的关联，包括舍格伦氏综合征、CREST综合征、自身免疫性甲状腺疾病和类风湿性关节炎。关于驱动抗原(driving antigen)的注意力已经聚焦于线粒体超过50年，导致抗线粒体抗体(AMA)的发现(Gershwin等，Immunol Rev 174:210-225,2000;Mackay等，Immunol Rev 174:226-237,2000)。AMA很快成为用于PBC实验室诊断的基石，其在临床症状出现很久以前就存在于90-95%患者的血清中。线粒体中自身抗原性反应性称为M1和M2。M2反应性针对48-74kDa组分家族。M2代表2-酮酸脱氢酶复合物(2-OADC)酶的多种自身抗原性亚基，而且是本发明的自身蛋白、自身多肽或自身肽的另一个例子。鉴定丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)抗原在PBC发病机理中作用的研究支持如下的观念，即PDC在该疾病的诱导中发挥中心作用(Gershwin等，Immunol Rev 174:210-225,2000;Mackay等，Immunol Rev 174:226-237,2000)。在95%的PBC病例中最频繁的反应性是属于PDC-E2的E2 74kDa亚基。存在着相关的，但截然不同的复合物，包括：2-酮戊二酸脱氢酶复合物(OGDC)和支链(BC)2-OADC。三种组成性酶(E1、2、3)促成催化功能，其在将NAD+还原成NADH的情况中将2-酮酸底物转化为酰基辅酶A(CoA)。哺乳动物PDC含有别的组分，称作蛋白X或E-3结合蛋白：(E3BP)。在PBC患者中，主要的抗原应答针对PDC-E2和E3BP。E2多肽含有两个串联重复的硫辛酰(lipoyl)域，而E3BP具有单个硫辛酰域。硫辛酰域存在于PBC的许多自身抗原靶物中，并且在本文中称为“PBC硫辛酰域”。用糖皮质激素类和免疫抑制剂类，包括甲氨蝶呤和环孢菌素A治疗PBC。
舍格伦氏综合征。舍格伦氏综合征(SS)是一种主要影响唾液腺和泪腺，导致干眼(干燥性角结膜炎(keratoconjunctivitis sicca))和口干燥(口干燥症(xerostomia))的慢性自身免疫性疾病。可能牵涉的其它器官包括支气管树、肾、肝、血管、周围神经和胰。特别感兴趣的是SS的双重呈现：在第四和第五个十年的女性中单独作为原发性病症(原发性SS)，或者在其它自身免疫性疾病的背景中(继发性SS)；可以存在腺性(干燥症状)和系统性(腺外)临床表现。SS的特征是存在类风湿因子、抗核和沉淀性自身抗体。细胞质/核的核糖核蛋白颗粒(Ro/SSA和La/SSB)在SS的自身免疫应答中发挥突出的作用。根据免疫荧光牵涉阳性核模式的其它抗原包括下列各项：Ku、NOR-90(核仁组织区)、p-80 coilin、HMG-17(高迁移率组)、Ki/SL。此外，还认识到器官特异性自身抗体，包括抗甲状腺球蛋白、抗红血球和抗唾液腺上皮抗体。(综述见Clio等，Int Arch Allergy Immunol 123:46-57,200)。一种120-kD器官特异性自身抗原已经被鉴定为细胞骨架蛋白α-胞衬蛋白(Haneji等，Science276:604-607,1997)。HSP60是提出牵涉SS的另一种自身抗原。已经显示了用HSP60或HSP60衍生肽(氨基酸残基437-460)免疫降低SS动物模型中SS相关组织病理学特征(Dalaleu等，Arthritis Rheum 58:2318-2328,2008)。已经在分子水平广泛限定主要的靶抗原Ro/SSA、La/SSB和及其关联抗体。Ro/SSA是一种含有小胞质RNA的核糖核蛋白。Ro/SSA抗原的蛋白质组分60-kD蛋白(60-kD Ro/SSA，Ro60)结合数种小胞质RNA分子之一。52-kD肽是Ro/SSA抗原的另一种组分(52-kD Ro/SSA；Ro52)。La/SSB抗原由组成为408个氨基酸的多肽构成。60-kD Ro/SSA和La/SSB蛋白两者都是含有称为RNA识别基序的80个氨基酸的序列的RNA结合蛋白(RNP)家族的成员。使用数种策略对60-kD Ro/SSA、52-kD Ro/SSA和La/SSB分子的B细胞表位定位已经在数项研究中揭示了特异性表位。60-kD Ro/SSA自身抗原的B细胞表位似乎位于该分子的中心区和羧基端部位。已经鉴定出两种疾病特异性表位：TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP(169-190)(SEQ ID NO:6)和ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV(211-232)(SEQ ID NO:7)区(Routsias等，EurJ Clin Invest 26:514-521,1996)。52-kD Ro/SSA蛋白的抗原决定簇主要为线性的，并且存在于该分子的中心区。已经报告了4种肽(氨基酸2-11、107-126、277-292和365-382)受到抗-Ro/SSA血清识别(Ricchiuti等，Clin Exp Immunol95:397-407,1994)。已经报告了4种与纯化的IgG的高度反应性肽，跨越La/SSB蛋白145-164、289-308、301-320和349-368区(Tzioufas等，Clin Exp Immunol108:191-198,1997)。
其它自身免疫性疾病和关联自身抗原。重症肌无力的自身抗原可以包括乙酰胆碱受体内的表位。寻常型天疱疮中靶向的自身抗原可以包括桥粒芯糖蛋白-3。肌炎的组可以包括tRNA合成酶(例如苏氨酰、组氨酰、丙氨酰、异亮氨酰和甘氨酰)；Ku；ScI；SSA；U1 Sn核糖核蛋白；Mi-I；Mi-I；Jo-I；Ku；和SRP。硬皮病的组可以包括Scl-70；着丝粒；U1核糖核蛋白；和血纤蛋白。恶性贫血的组可以包括内因子；和胃H/K ATP酶的糖蛋白β亚基。系统性红斑狼疮(SLE)的表位抗原可以包括DNA；磷脂；核糖核抗原；Ro；La；U1核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；钙网蛋白；Grp78；Scl-70；组蛋白；Sm蛋白；和染色质等。对于格雷夫斯氏病，表位可以包括Na+/I-同向转运蛋白(symporter)；促甲状腺素受体；Tg；和TPO。
移植物抗宿主病。人的组织和器官移植的最大限制之一是接受体的免疫系统对组织移植物的排斥。完善建立的是，供体和接受体间MHC I类和II类(HLA-A、HLA-B和HLA-DR)等位基因的匹配越大，移植物存活得越好。移植物抗宿主病(GVHD)在接受含有异基因造血细胞的移植物的患者中引起显著的发病率和死亡率。造血细胞存在于骨髓移植物、干细胞移植物、和其它移植物中。接受来自HLA匹配同胞的移植物的患者约50%会形成中度到重度GVHD，并且发生率在非HLA匹配移植物中高得多。因此，形成中度到重度GVHD的患者的三分之一会死亡。供体移植物中T淋巴细胞和其它免疫细胞攻击如下的接受体细胞，其表达其氨基酸序列中的多肽变异，特别是在人第6号染色体上主要组织相容性复合体(MHC)基因复合物中编码的蛋白质的变异。牵涉异基因造血细胞的移植物中最有影响的GVHD蛋白是高度多态性(各人间广泛的氨基酸变异)I类蛋白(HLA-A、-B和-C)和II类蛋白(DRB1、DQB1和DPB1)(Appelbaum,Nature 411,385-389,2001)。即使在MHC I类等位基因在供体和接受体之间是血清学“匹配”时，DNA测序揭示在30%的病例中有等位基因水平错配，这为I类指导的GVHD提供基础(甚至在匹配的供体-接受体对中)(Appelbaum,Nature 41 1,385-389,2001)。GVHD中的次要组织相容性自身抗原经常引起对皮肤、肠、肝、肺和胰的损伤。用糖皮质激素类、环孢霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨(fludarabine)和OKT3治疗GVHD。
组织移植物排斥。对组织移植物(包括肺、心脏、肝、肾、胰、及其它器官和组织)的免疫排斥由移植接受体中针对该移植器官的免疫应答介导。异基因移植器官含有在其氨基酸序列中具有与移植接受体的氨基酸序列相比的变异的蛋白质。由于移植器官的氨基酸序列不同于移植接受体的那些氨基酸序列，它们经常引发接受体中针对移植器官的免疫应答。移植器官的排斥是组织移植的主要并发症和限制，并且可以引起移植器官在接受体中的衰竭。源自排斥的慢性炎症经常导致移植器官中的功能障碍。目前用多种免疫抑制剂治疗移植接受体以预防和抑制排斥。这些药剂包括糖皮质激素类、环孢霉素A、骁悉(Cellcept)、FK-506和OKT3。
用于治疗的组合物和方法
本发明提供了改进的免疫调控复合物和包含它们的组合物，以及其用于生产医用产品和在用于治疗、防范和/或预防自身免疫性或变应性疾病的方法中的用途。依照本发明的改进的免疫调控复合物是融合蛋白，其包含霍乱毒素ADP-核糖基化A1亚基(CTA1)的突变体亚基、能够结合特定受体的肽、和一种或多种与自身免疫性或变应性疾病有关的表位。本发明的改进方法包括施用包含一种或多种与疾病有关的表位的免疫调控复合物。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗、防范和/或预防自身免疫性疾病胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的改进方法，包括对受试者施用包含一种或多种与IDDM有关的自身抗原性表位的免疫调控复合物。
为了治疗或预防IDDM施用的免疫调控复合物可以包含自一种或多种自身蛋白，例如前胰岛素原、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和-67；酪氨酸磷酸酶IA-2；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶相关蛋白(IGRP)；和/或胰岛细胞抗原69kD衍生的自身免疫性表位。或者，为了治疗或预防IDDM施用的免疫调控复合物可以包含自相同或不同自身蛋白、自身多肽或自身肽衍生的多种自身免疫性表位。在优选的实施方案中，为了治疗或预防IDDM施用的免疫调控复合物可以包含自自身多肽前胰岛素原或胰岛素原衍生的自身免疫性表位。
在本发明的其它实施方案中，提供了用于治疗、防范和/或预防多发性硬化(MS)的改进方法，包括对受试者施用包含一种或多种与MS有关的自身抗原性表位的免疫调控复合物。为了治疗MS施用的免疫调控复合物可以包括自一种或多种自身多肽，包括但不限于：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂关联少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、和/或髓磷脂关联糖蛋白(MAG)衍生的自身抗原表位。或者，免疫调控复合物包含自与疾病有关的相同或不同自身蛋白、自身多肽、或自身肽衍生的多种自身抗原性表位。
在本发明的其它实施方案中，提供了用于治疗、防范和/或预防类风湿性关节炎(RA)的改进方法，包括对受试者施用包含一种或多种与RA有关的自身抗原性表位的依照本发明的免疫调控复合物。在一些实施方案中，自身抗原性表位是自下组衍生的表位：I、II、III、IV、V、IX、和XI型胶原、GP-39，聚丝蛋白、和血纤蛋白。在一个优选的实施方案中，表位自II型胶原衍生，优选地，表位是包含氨基酸260-273的共享的胶原II免疫优势肽(CII260-273)，SEQ ID NO:5。
或者，可以施用包含自不同自身多肽衍生的自身抗原性表位的多种免疫调控复合物。
因此，如实施例中证明的(特别在类风湿性关节炎模型，实施例2中的CIA和实施例3中的CAIA中，并在EAE模型中指示的)，依照本发明的免疫调控复合物的治疗效果，并不特定限于类风湿性关节炎(RA)，而是与治疗、防范和预防一般的自身免疫性和变应性疾病有关的有利治疗效果，这取决于来自与特定变应性或自身免疫性疾病有关的自身抗原的表位的选择。因此，本发明的实施例意图例示并支持如下的一般性发明理念，即使用包含与免疫优势表位有关的免疫调控性CTA1-R7K/C187A的依照本发明的免疫调控复合物来治疗一般的自身免疫性和变应性疾病。
共享的免疫优势表位可以选自已知与自身免疫性或变应性疾病有关的任何合适的自身抗原。表位可以例如选自与表1中的疾病有关的任何自身抗原。然而，具有高含量半胱氨酸的表位可以抵消与CTA1-R7K相比依照本发明的免疫调控复合物的CTA1-R7/C187A中用丙氨酸替换氨基酸187半胱氨酸提供的有利效果。因此，优选的是，以如下的方式选择依照本发明的表位，使得避免高含量的半胱氨酸。
在又一个实施方案中，本发明提供了编码依照本发明的免疫调控复合物的核酸序列，包括DNA和RNA序列，以及包含这类核酸序列的质粒、载体和表达系统。
依照本发明的免疫调控复合物可以通过重组DNA技术生成。
用于构建质粒、载体和表达系统和细胞转染的技术是本领域公知的，并且熟练技术人员会熟悉描述特定条件和规程的标准资源材料。
本发明的质粒、载体和表达系统的构建采用本领域中公知的连接和限制技术(通常参见，例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,WileyInterscience,1989；Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A LaboratoryManual第3版2001)。将分离的质粒、DNA序列、或合成的寡核苷酸以期望的形式切割，剪裁，并再连接。可以使用例如用于DNA序列分析的标准技术确认DNA构建体的序列(参见，例如Sanger等(1977),Proc.Natl.Acad.Sci.,74,5463-5467)。
又一种用于分离特定核酸分子的方便方法是通过聚合酶链式反应(PCR)(Mullis等，Methods Enzymol 155:335-350,1987)或逆转录PCR(RT-PCR)进行。可以通过RT-PCR从RNA分离特定的核酸序列。通过本领域中技术人员已知的技术将RNA自例如细胞、组织或完整的生物体分离。然后，使用聚dT或随机六聚体引物、脱氧核苷酸和合适的酶逆转录酶生成互补DNA(cDNA)。然后，可以通过PCR自生成的cDNA扩增期望的多核苷酸。或者，可以自适当的cDNA文库直接扩增感兴趣的多核苷酸。合成与感兴趣的多核苷酸序列5’和3’端两者杂交的引物，并将其用于PCR。引物还可以含有5’端的特定限制酶位点，用于容易消化扩增序列并将其连接入经类似限制性消化的质粒载体中。
免疫调控复合物的投递
免疫调控复合物的治疗和预防有效量的范围为约1μg至约10mg。免疫调控复合物的一个优选的治疗或预防有效量的范围为约5μg至约1mg。免疫调控复合物的一个最优选的治疗量的范围为约10μg至100μg。在某些实施方案中，将免疫调控复合物每月施用一次达6-12个月，然后每3-12个月施用一次作为维持剂量。可以开发备选的治疗方案，并且根据疾病的严重性、患者的年龄、施用的免疫调控复合物、和如普通治疗医生会考虑的这类其它因素，范围可以为每日、至每周、至每隔一个月、至每年、至一次施用。
在一个实施方案中，鼻内投递免疫调控复合物。在其它变型中，口服、舌下、皮下、经皮、皮内、静脉内、粘膜或肌肉内投递免疫调控复合物。
配制物
免疫调控复合物可以与其它物质，诸如例如药理学药剂、佐剂、细胞因子、或免疫刺激复合物(ISCOMS)组合施用。
表2：序列
  CTA1-R7K/C187A   氨基酸序列   SEQ ID NO:1
  K-CTA1-R7K/C187A   氨基酸序列   SEQ ID NO:2
  K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD   DNA序列   SEQ ID NO:3
  K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD   氨基酸序列   SEQ ID NO:4
  COL，II型胶原氨基酸260-273   氨基酸序列   SEQ ID NO:5
  60-kD Ro/SSA氨基酸169-190   氨基酸序列   SEQ ID NO:6
  60-kD Ro/SSA氨基酸211-232   氨基酸序列   SEQ ID NO:7
  60-kD Ro/SSA氨基酸274-290   氨基酸序列   SEQ ID NO:8
  CTA1-R7K/C187A-COL-DD   DNA序列   SEQ ID NO:9
  CTA1-R7K/C187A-COL-DD   氨基酸序列   SEQ ID NO:10
  K-CTA1-R7K/C187A-Ro169-DD   氨基酸序列   SEQ ID NO:11
  K-CTA1-R7K/C187A-Ro211-DD   氨基酸序列   SEQ ID NO:12
  K-CTA1-R7K/C187A-Ro274-DD   氨基酸序列   SEQ ID NO:13
  Bet v1氨基酸140-151   氨基酸序列   SEQ ID NO:14
  Phlp1氨基酸150-164   氨基酸序列   SEQ ID NO:15
  Phlp5氨基酸216-233   氨基酸序列   SEQ ID NO:16
  K-CTA1-R7K/C187A-Betv1-DD   氨基酸序列   SEQ ID NO:17
  K-CTA1-R7K/C187A-Phl pl-DD   氨基酸序列   SEQ ID NO:18
  K-CTA1-R7K/C187A-Phl p5-DD   氨基酸序列   SEQ ID NO:19
实施例
以下实施例是用于实施本发明的具体实施方案。实施例仅为了例示性目的而提供，而并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：免疫调控复合物K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD
基本上如
Figure BDA00002620859100341
(J Immunol 1999,162:2432-2440)所描述的，实施CTA1-DD突变体的构建、融合蛋白的表达和纯化。
pCTA1-DD质粒含有在trp启动子控制下的在HindIII-BamHI处克隆的霍乱毒素A1基因(aa 1-194)和编码来自葡萄球菌蛋白A基因的2个D片段的DNA。将编码一种胶原肽，即共享的胶原II免疫优势肽(CII260-273)的DNA插入编码CTA1和DD模块的DNA之间，给出pCTA1-COL-DD质粒。通过体外诱变构建R7K和C187A突变，给出质粒pK-CTA1-R7K/C187A-COL-DD(图1)。实施例2:在小鼠CIA模型中比较CTA1-R7K-COL-DD和K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的治疗效果
使用RA的胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型来比较用CTA1-R7K-COL-DD和K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD耐受原的鼻内处理。CIA模型与RA共享许多临床、组织学、和免疫学特征，并且因此是测试针对RA的潜在治疗剂的使用最多的模型。对DBA1小鼠(Taconic，Denmark)给予用完全弗氏佐剂(CFA)中100μg鸡/牛II型胶原(Sigma/MDBioSciences)的初步免疫，接着在第21天给予用不完全弗氏佐剂(IFA)的加强剂。在加强免疫时左右和/或之后用3-8剂PBS、CTA1-R7K-COL-DD或K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD鼻内处理小鼠。然后，使用关节炎评分系统在关节炎的发生率和严重性方面追踪小鼠。
使用每肢0-3分的临床评分系统：0=无炎症，0.5=趾或指肿胀，1=轻度肿胀或发红，2=肿胀和发红，以及3=显著肿胀、发红和/或关节强直。通过将来自每只动物的所有四肢的得分加起来构建关节炎指数。
K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的治疗效果显著好于CTA1-R7K-COL-DD的治疗效果，如与对照组(PBS)相比在CIA的严重性(图2A)和发生率(图2B)的降低中看到的。
对照PBS组中的关节炎指数在胶原免疫后3周显著增加，并且在第6周达到峰值。在CTA1-R7K-COL-DD组中，可以看到关节炎指数的略微降低。相反，在K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD组中，关节炎指数显著更低，而且许多动物根本没有症状。
实施例3：在小鼠CAIA模型中比较CTA1-R7K-COL-DD和K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的治疗效果
第0天通过以2mg/小鼠的剂量水平静脉内注射针对胶原II的单克隆抗体混合物(ArthritoMab混合物：D1、F10、A2和D8；MD Biosciences,Zürich,Switzerland)在Balb/c小鼠(Taconic，Denmark)中诱导胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)。在第3天，腹膜内注射脂多糖(LPS)(ArthritoMab试剂盒，MDBiosciences)以提高疾病的发生率和严重性(50μg/小鼠)。
在第-2天、第0天、第+3天用20μL PBS中5μgK-CTA1-R7K/C187A-COL-DD或CTA1-R7K-COL-DD鼻内处理小鼠。使用与用于CIA(参见实施例2)相同的关节炎评分系统在关节炎的发生率和严重性方面追踪小鼠。
在第4天，所有小鼠开始显示疾病体征(数据未显示)。在PBS对照组和用CTA1-R7K-COL-DD处理的组中，关节炎指数在抗体免疫后7天显著增加。然而，在用K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD处理的组中，关节炎指数的增加贯穿整个实验过程显著更低。
实施例4：用于治疗舍格伦氏病(SS)的免疫调控复合物
将编码自60kDa Ro衍生的表位Ro169(具有氨基酸序列TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP(SEQ ID NO:6))，和Ro211(具有氨基酸序列ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV(SEQ ID NO:7))，以及Ro274(具有氨基酸序列QEMPLTALLRNLGKMT(SEQ ID NO:8))的DNA序列克隆入K-CTA1-R7K/C187A载体中，产生包含DNA构建体的载体，所述DNA构建体分别编码免疫调控复合物K-CTA1-R7K/C187A-Ro169-DD(SEQ ID NO:11)、K-CTA1-R7K/C187A-Ro211-DD(SEQ ID NO:12)、和K-CTA1-R7K/C187A-Ro274-DD(SEQ ID NO:13)。
将表达载体转染入大肠杆菌中，并使用标准技术纯化表达的免疫调控复合物。
实施例5：免疫调控复合物用于治疗舍格伦氏病(SS)的治疗效果
最近，创建了一种与人疾病的许多特征显示惊人相似性的新颖的鼠模型(Scofield R.H.等，J Immunol,2005,175(12),8409-12)，其中用与小鼠序列具有100%同源性的一种人Ro RNP短肽(Ro274-290，称作Ro274)在一定的时间段里对BALB/c小鼠免疫。确定用此肽免疫的小鼠形成针对Ro52、Ro60和La的高滴度IgG自身抗体、CD19+B和CD4+/8+淋巴细胞的唾液腺浸润、和降低的唾液流。因此，此模型适用于研究免疫调控复合物用于治疗舍格伦氏病(SS)的治疗效果。
简言之，用一种与60-kDa Ro蛋白的氨基酸274-290对应的肽，QEMPLTALLRNLGKMT(SEQ ID NO:8)免疫动物。对于初始免疫使用以1:1在CFA中乳化的在PBS中的100μg单体肽进行免疫，后续免疫在第14天、第35天、第63天和第51天在IFA中进行。通过如下测量唾液生成追踪疾病：简言之，在规程前将动物禁食16-18小时。对每只动物给予以0.01ml/g体重i.p.注射2.5% 2,2,2-三溴乙醇作为麻醉。然后，用在同一注射器中0.020mg异丙肾上腺素(isoproterenol)/100g体重和0.05mg毛果芸香碱(pilocarpine)/100g体重的i.p.注射刺激唾液分泌。然后，在10分钟时段里使用毛细管从口腔获得总体唾液。在疾病时用鼻内施用的三剂要测试的免疫调控复合物处理小鼠。通过比较处理和未处理小鼠中唾液生成的水平评估治疗效果。
实施例6：用于治疗变应性疾病的免疫调控复合物
Bet v1已经鉴定为桦树主要变应原之一，而Phl p1和Phl p5已经鉴定为两种禾本科(grass)花粉主要变应原。Bet v1的免疫优势肽表位已经鉴定为具有肽序列MGETLLRAVESY(SEQ ID NO:14)。Phl p1的免疫优势肽表位已经鉴定为具有肽序列AGELELQFRRVKCKY(SEQ ID NO:15)，而Phl p5的免疫优势肽表位已经鉴定为具有肽序列TVATAPEVKYTVFETALK(SEQ ID NO:16)。将编码这些肽表位的DNA克隆入CTA1-R7K/C187A载体中，产生包含DNA构建体的载体，所述DNA构建体分别编码免疫调控复合物K-CTA1-R7K/C187A-Betvl-DD(SEQ ID NO:17)、K-CTA1-R7K/C187A-Phlp1-DD(SEQ ID NO:18)和K-CTA1-R7K/C187A-Phl p5-DD(SEQ ID NO:19)。将表达载体转染入大肠杆菌中，并使用标准技术纯化表达的免疫调控复合物。
实施例7：免疫调控复合物用于治疗变应性疾病的治疗效果
一种用于研究免疫调控复合物用于治疗变应性疾病的治疗效果的合适模型是例如由Hufnagl等(Clin Exp Allergy,2008,38,1192-1202)建立的对桦树和禾本科花粉主要变应原Bet v1、Phl p1和Phl p5的变应性多致敏作用的小鼠模型。
简言之，通过以14天时间间隔用吸附于氢氧化铝(Al(OH)3)的重组Bet v1、Phl p1和Phl p5(各5mg)或一种或多种这些变应原的混合物的三次腹膜内(i.p.)免疫(第22天、第36天和第50天)实施致敏作用。作为处理，将要测试的一种或多种免疫调控复合物(各5mg)在致敏作用前以7天时间间隔(第0天、第7天和第14天)在30mL 0.9% NaCl中鼻内(i.n.)施用三次。在最后一次i.p.免疫后一周，连续两天用1% w/v桦树花粉和/或梯牧草(phleum)提取物实施气雾剂攻击。在气雾剂攻击后2天(第60天)，将小鼠杀死，并收集支气管肺泡灌洗物(BAL)。通过BAL流体中炎性细胞(巨噬细胞、淋巴细胞、嗜曙红细胞)的数目和IL-5水平测定气道炎症。看到处理效果为与对照小鼠相比，用免疫调控复合物处理的小鼠中BAL中嗜曙红细胞和IL-5显著降低。
实施例8：CTA1-R7K-COL-DD和K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的二聚体形成
使用分析用大小排阻层析(SEC)研究CTA1-R7K-COL-DD和K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD的二聚体形成。使用装备有Superdex 200 HR10/30柱(GE Healthcare)的系统(GE Healthcare)进行研究。作为移动相，于室温以流速0.4ml/min使用10mM磷酸钠盐缓冲液pH 7.4，0.4M NaCl。样品是CTA1-R7K-COL-DD(批次091118，2.4mg/mL)和K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD(批次091118，5.6mg/mL)。分析前，将样品自-80°C融化，并在缓冲液中稀释至1.5mg/mL。将50μL注射到柱上。通过在还原性条件下的SDS-PAGE，接着是在NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上的考马斯染色分析制备物的纯度。
结果
如从SEC分析看到的，显著量的二聚体已经形成，并且可以在CTA1-R7K-COL-DD样品中鉴定(图4A)。可以看到以12.61ml处的峰洗脱的二聚体，和以14.29ml处的峰洗脱的单体。相比之下，二聚体在K-CTA1-R7K7C187A-COL-DD样品中没能检出(图4B)，其以在14.16ml洗脱的单体的单峰指示。如可以从图5看到的，两种制备物是同样纯的，并且在还原性条件下仅由一种组分构成，即单体免疫调控复合物。
实施例9:生产率水平的比较
在表3中列出了在重组大肠杆菌菌株培养后来自1g细菌团粒的纯化物质的产量，所述重组大肠杆菌菌株携带编码依照本发明的不同免疫调控复合物的质粒。
表3。生产率水平的比较
  复合物   产量
  CTA1-R7K-DD   0.94mg
  K-CTA1-R7K/C187A-DD   4.03mg
  CTA1-R7K-COL-DD   0.88mg
  K-CTA1-R9K/C187A-COL-DD   4.47mg
如可以从表3看出的，生产率对于包含K插入和C187A突变的复合物而言显著更高。
Figure IDA00002620860200011
Figure IDA00002620860200031
Figure IDA00002620860200041
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Figure IDA00002620860200161

Claims (26)

1.一种免疫调控复合物，其是包含下列各项的融合蛋白：
(a)霍乱毒素ADP核糖基化A1亚基(CTA1)的突变体亚基，
(b)能够结合特定细胞受体的肽，和
(c)一种或多种与自身免疫性或变应性疾病有关的表位，
其中，在所述突变体CTA1亚基中，对应于天然CTA1中氨基酸7精氨酸和氨基酸187半胱氨酸的氨基酸已经替换。
2.依照权利要求1的免疫调控复合物，其中所述突变体CTA1亚基是CTA1-R7K/C187A突变体SEQ ID NO:1。
3.依照权利要求1或2的免疫调控复合物，其中已经在所述突变体CTA1亚基的N端中进一步插入氨基酸赖氨酸。
4.依照权利要求3的免疫调控复合物，其中所述突变体CTA1亚基是K-CTA1-R7K/C187A突变体SEQ ID NO:2。
5.依照权利要求1至4中任一项的免疫调控复合物，其中所述一种或多种表位是与自身免疫性疾病有关的自身免疫性表位。
6.依照权利要求5的免疫调控复合物，其中所述自身免疫性疾病选自下组：胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、舍格伦氏综合征（
Figure FDA00002620859000011
syndrome）、寻常型天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮和格雷夫斯病（Grave's disease）。
7.依照权利要求1至4中任一项的免疫调控复合物，其中所述一种或多种表位是与变应性疾病有关的激发变态反应的表位。
8.依照权利要求7的免疫调控复合物，其中所述变应性疾病选自下组：变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和食物超敏感性。
9.依照权利要求1至8中任一项的免疫调控复合物，其中所述肽是特异性结合在能够抗原呈递的细胞上表达的受体的肽。
10.依照权利要求9的免疫调控复合物，其中所述融合蛋白包含特异性结合在表达MHC I类或MHC II类分子的细胞上表达的受体的肽。
11.依照权利要求10的免疫调控复合物，其中所述融合蛋白包含特异性结合在选自下组的细胞上表达的受体的肽：淋巴细胞，诸如B淋巴细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞（Langerhans cells）、上皮细胞和内皮细胞。
12.依照权利要求11的免疫调控复合物，其中所述肽由单个或多个拷贝的蛋白A或其片段，诸如一个或多个其D亚基构成。
13.免疫调控复合物K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD (SEQ ID NO:4)、CTA1-R7K/C187A-COL-DD(SEQ ID NO:10)、K-CTA1-R7K/C187A-Ro169-DD(SEQ ID NO:11)、K-CTA1-R7K/C187A-Ro211-DD(SEQ ID NO:12)、K-CTA1-R7K/C187A-Ro274-DD(SEQ ID NO:13)、K-CTA1-R7K/C187A-Betvl-DD(SEQ ED NO:17)、K-CTA1-R7K/C187A-Phlp1-DD(SEQ ID NO:18)和K-CTA1-R7K/C187A-Phl p5-DD(SEQ ID NO:19)。
14.一种分离的核酸，其编码依照权利要求1至13中任一项的免疫调控复合物。
15.一种表达系统，其包含依照权利要求14的核酸。
16.一种经转染的细胞，其包含依照权利要求15的表达系统。
17.一种药物组合物，其包含依照权利要求1至13中任一项的免疫调控复合物。
18.依照权利要求17的药物组合物，其在防范、预防和/或治疗自身免疫性或变应性疾病中使用。
19.依照权利要求18的药物组合物，其中所述自身免疫性疾病选自下组：胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、舍格伦氏综合征、寻常型天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮和格雷夫斯氏病。
20.依照权利要求18的药物组合物，其中所述变应性疾病选自下组：变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和食物超敏感性。
21.依照权利要求1至13中任一项的免疫调控复合物用于生产供防范、预防和/或治疗自身免疫性或变应性疾病的医药产品的用途。
22.依照权利要求21的用途，其中所述自身免疫性疾病选自下组：胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、舍格伦氏综合征、寻常型天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮和格雷夫斯氏病。
23.依照权利要求21的用途，其中所述变应性疾病选自下组：变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和食物超敏感性。
24.一种用于防范、预防和/或治疗受试者中自身免疫性或变应性疾病的方法，所述方法包括：对所述受试者施用有效量的依照权利要求1至13中任一项的免疫调控复合物。
25.依照权利要求24的方法，其中所述自身免疫性疾病选自下组：胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、舍格伦氏综合征、寻常型天疱疮、硬皮病、恶性贫血、系统性红斑狼疮和格雷夫斯氏病。
26.依照权利要求24的方法，其中所述变应性疾病选自下组：变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和食物超敏感性。
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