SE1051122A1 - Nya kompositioner och förfaranden för behandling av autoimmuna och allergiska sjukdomar - Google Patents

Description

kroppsegna antigen. Förutom att avgöra huruvida ett svar skall genereras eller inte (antigenspecificitet) måste immunförsvaret också välja lämpliga effektorfunktioner för att hantera varje patogen (effektorspecificitet). En cell med avgörande betydelse för att förrnedla och reglera dessa effektorfunktioner år den CD4-positiva T-cellen (CD4+ T-celler). Det är vidare frisättningen av specifika cytokiner från CD4+ T celler som verkar vara den huvudsakliga mekanism genom vilken T- celler förmedlar sina funktioner. Att kartlägga de olika typer av cytokiner som produceras av CD4+ T- celler, såväl som hur deras sekretíon regleras, är följaktligen extremt viktigt för att förstå hur immunsvaret regleras.

Kartläggningen av cytokínproduktion från långlivade CD4+ T-cellskloner från möss publicerades första gången för mer än 20 år sedan (Mosmann et al. J Immunol 136: 2348- 2357, 1986). I dessa studier visades det att CD4+ T-celler uppvisade två distinkta mönster för cytokínproduktion, vilka betecknades T-hjälparcellstyp 1 (Thl) och T-hjälparcellstyp 2 (Th2). Thl-celler befanns producera interleukin-2 (lL-2), interferon-y (IFN-y) och lymfotoxin (LT), medan Th2-kloner huvudsakligen producerade IL-4, IL-5, IL-6 och IL-13 (Cherwinski et al. J Exp Med 169:1229-1244, 1987). Något senare isolerades ytterligare cytokiner, IL-9 and IL-10, från Th2-kloner (Van Snick et al. J Exp Med 1692363-368, 1989) (Fiorentino et al. J Exp Med 170:2081-2095, 1989). Man observerade slutligen att ytterligare cytokiner så som H,-3, granulocyt/makrofag-kolonistimulerande faktor (GM- CSF) och tumömekrosfaktor-ot (TNF-oc) utsöndrades av både Thl- och Th2-celler. Nyligen rapporterades att CD4+ T-celler som isolerats från de inflammerade ledema hos patienter med Lyme-sjukdom innehåller en delmängd av IL-17-producerande CD4+ T-celler som skiljer sig från Thl- och Th2- ce1ler(Infante-Duarte et al. J. Immunol 165:6107-61 15, 2000). Dessa IL-17-producerande CD4+ T- celler betecknas Thl 7. IL-17, en proinflammatorisk cytokin som huvudsakligen produceras av aktiverade T-celler, förstärker priming av T-celler och stimulerar fibroblaster, endotelceller, makrofager och epitelceller att producera ett flertal proinflammatoriska mediatorer, inkluderande IL-1, IL-6, TNF-u, NOS-2, metalloproteaser och kemokiner, vilket leder till induktion av inflammation. IL- 17-uttrycket är förhöjt i patienter med ett antal allergiska och autoimmuna sjukdomar, så som RA (reumatoid artrit), MS (multipel skleros), inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och astma, vilket indikerar att IL-l7 bidrar till induktionen och/eller utvecklingen av dylika sjukdomar.

Det finns rikligt med bevis som visar att suppressor-T-celler, numera benämnda regulatoriska T-celler (Treg-celler) hämmar autoreaktiva T-celler som en aktiv mekanism för perifer immuntolerans. Det är hitintills klart belagt att Treg-celler kan delas in i två olika subtyper, nämligen naturliga (eller konstitutiva) och inducerbara (eller adaptiva) populationer enligt deras ursprung (Mills, Nat Rev Immunol 4:841-855, 2004). En mängd av T-reg-cellsubgrupper har dessutom identifierats enligt deras ytmarkörer eller cytokínproduktion, så som CD4+ -Treg-celler (inkluderande naturliga CD4+CD25+ Treg-celler, lL-IO-producerande Trl-celler och TGF-ß- producerande Th3-celler), CD8+ Treg-celler, 2 Veto CD8+-celler, yö T-celler, NKT (NK1.1+CD4-CD8-) celler, NK1.1- CD4-CD8- celler, etc.

Ackumulerande bevis har visat att naturligt förekommande CD4+CD25+ Treg-celler spelar en aktiv roll fór att nedreglera patogena autoimmuna svar och för att bibehålla immunhomeostas (Akbari et al.

Curr Opin Immunol l5:627-633, 2003).

Autoimmuna sjukdomar omfattar ett brett spektrum av sjukdomar som kan påverka många olika organ och vävnader i kroppen (Se t.ex., Paul, W.E. (1999) Fundamental Immunology, Fourth Edition, Lippincott-Raven, New York.).

Nuvarande behandlingar av humana autoimmuna sjukdomar inkluderar glukokortikoider, cytotoxiska ämnen och nyligen utvecklade biologiska läkemedel. Behandling av humana systemiska autoimmuna sjukdomar är i allmänhet empirisk och otillfredsställande. Brett immunsupprimerande läkemedel så som kortikosteroider används till största delen fór ett stort antal svåra autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar. Förutom kortikosteroider används andra immunsupprimerande ämnen vid behandling av de systemiska autoimmune sjukdomarna. Cyklofosfamid är ett alkylerande ämne som orsakar en djupgående uttömning av både T- och B-lymfocyter och nedsättning av cellförrnedlad immunitet. Cyklosporin, takrolimus och and mykofenolatmofetil är naturliga produkter med specifika egenskaper som T-lymfocythämning och de har använts för att behandla systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA) och, till en begränsad utsträckning, vaskulit och myosit.

Dessa läkemedel är associerade med en signifikant njurtoxicitet. Metotrexat används också som ett ”andrahandspreparat” vid RA, med syftet att reducera sjukdomsprogressen. Det används också vid polymyosit och andra bindvävssjukdomar. Andra tillvägagångssätt som har provats inkluderar monoklonala antikroppar med avsikt att blockera verkan av cytokiner eller att uttömma lymfocyter (Fox, Am J Med 99:82-88, 1995). Behandlingar av multipel skleros (MS) innefattar interferon-ß och kopolymer-1, vilket reducerar återfallsgraden med 20-30% och bara har en modest effekt på sjukdomsprogression. MS behandlas också med immunsupprimerande ämnen, inkluderande metylprednisolon, andra steroider, metotrexat, kladribin och cyklofosfamid. Dessa immunsupprimerande ämnen har minimal effekt vid behandling av MS. lntroduktionen av antikroppen Tysabri (natalizumab), en alfa 4-integrin-antagonist, som behandling av MS har överskuggats av incidenser med progressiv multifokal leukoencefalopati (PML) hos patienter som mottagit behandlingen. Nuvarande behandling av RA använder ämnen som icke-specifikt hämmar eller modulerar immunfunktioner så som metotrexat, sulfasalazin, hydroxiklorokin, Leuflonamid, Prednison, så väl som nyligen utvecklade TNF-ot-antagonister etanercept och infliximab (Moreland et al. J Rheumatol 28: 1431-52, 2001). Etanercept och infliximab blockerar TNF-oc i hela kroppen, vilket gör patienter mer mottagliga for dödsfall genom sepsis, försämring av kroniska mykobakteriella infektioner och utveckling av demyeliniserande episoder.

I fallet med organspecifik autoimmunitet har ett antal olika terapeutiska tillvägagångssätt prövats.

Lösliga proteinantigener har administrerats systemiskt för att inhibera det efterföljande immunsvaret mot detta antigen. Dylika behandlingar inkluderar administration av basala myelinproteiner, dess dominanta peptid eller en blandning av myelinproteiner till djur med experimentell autoimmun encefalomyelit och människor med multipel skleros (Brocke et al. Nature 379: 343-6, 1996; Critchfield et al. Science 263: 1139-43, 1994; Weiner et al. Annu Rev Immunol 12: 809-37, 1994), administration av typ-II-kollagen eller en blandning av kollagenproteiner till djur med kollageninducerad artrit och människor med reumatoid artrit (Gumanovskaya et al. Immunology 91: 466-73, 1999; McKown et al. Arthritis Rheum 42: 1204-8, 1999; Trentham et al. Science 261: 1727- 30, 1993), tillförsel av insulin till djur och människor med autoimmun diabetes (Pozzilli and Gisella Cavallo, Diabetes Metab Res Rev 16: 306-7, 2000), och administration av S-antigen till djur och människor med autoimmun uveit (Nussenblatt et al. Am J Ophthalmol 123: 583-92, 1997).

Ett annat tillvägagångssätt är försöket att utforma rationella terapeutiska strategier för den systemiska administrationen av ett peptidantigen baserat på den specifika interaktionen mellan T- cell receptorer och peptider som är bundna till MHC-molekyler. En studie som använder ett peptidtillvägagångssätt i en djurmodell av diabetes, resulterade i utvecklingen av antikroppsproduktion mot peptiden (Hurtenbach et al. J Exp Med 177: 1499, 1993). Ett annat tillvägagångssätt är administrationen av T- cellsreceptorpeptidimmunisering. (Se, t.ex. Vandenbark et al. Nature 3412541, 1989). Ytterligare ett annat tillvägagångssätt är induktion av oral tolerans genom intag av peptid- eller proteinantigener. (Se t.ex. Weiner, Immunol Today l8:335, 1997).

Slemhinnetolerans refererar till fenomenet systemisk tolerans mot provokation med ett antigen som tidigare har administrerats via en slemhinna, vanligtvis oralt, nasalt, eller via näsan och andningsvägama, men även vaginalt och rektalt. (Weiner et al. Annu Rev Immunol l2z809-83 7, 1994). Slemhinnetolerans upptäcktes under 1900-talet i modeller av fördröjd hypcrsensitivitet och kontaktallergireaktioner hos marsvin, men mekanismema för tolerans förblev dåligt definierade fram till den modema immunologins tidsålder. Användningen av cellseparationstekniker, tester för syntes av cytokiner och transgena modeller, i vilka antigenspeciflka T-celler kan spåras in vivo, har gradvist klarlagt mekanismer för slemhinnetolerans (Garside and Mowat. Crit Rev Immunol 17:l 19-137, 1997). Det har blivit tydligt att antigenadministration via slemhinnor kan resultera i olika typer av tolerans beroende på administrationsväg och antigendosering. En hög dos av oralt antigen inducerar till exempel T-cellsaktivering följt av deletion av eller anergi hos T-celler som svarar på antigenet (Chen et al. Nature 376: 177-180, 1995) analogt med parenteral administration av höga doser av lösligt antigen. Detta resulterar i utsläckning av T-celler som är specifika för detta antigen och inte svarar på en efterföljande antigenprovokation, dvs. passiv tolerans. I motsats till detta inducerar en låg dos av oralt antigen inte någon deletion eller anergi men inducerar, när det administreras repetitivt, en distinkt 4 typ av immunsvar kännetecknat av förekomsten av regulatoriska, skyddande T-celler, Treg-celler, vilka utsöndrar antiinflammatoriska cytokiner, dvs. aktiv tolerans (von Herrath, Res Immunol. 148:541-554, 1997). Dessa Treg-celler hör vanligtvis till klassen CD4-positiva T-hjälparceller.

Tillförsel av intakt proteinantigen på näs-svalgslemhinnan inducerar också Treg-celler som är skyddande. In detta fall kan både CD4- och CD8-positiva T-celler induceras. Regulatoriska Treg- celler som inducerats efter oral eller intranasal antigenadministration producerar antiinflammatoriska cytokiner så som IL-4, IL-10 och TGF-ß. För att inducera slemhinnetolerans kan antigen också ges i form av en aerosol. Administration via dessa tre vägar, oral, intranasal eller aerosolinhalering, resulterar i antigenupptag och presentation i olika lymfoida kompartments i varje fall. Orala antigen presenteras följaktligen huvudsakligen för T-celler i mesenteriella lymfl<örtlar och till viss grad i Peyers plack, intranasala antigen i djupt liggande cervikala lymfl<örtlar och inhalerade antigen i mediastinala lymfl<örtlar. Upprepad exponering för antigen har i varje fall möjligheten att inducera regulatoriska T-celler, men egenskapema hos dessa celler skiljer sig åt, beroende på administrationsväg och typ av antigen. Medan regulatoriska celler som har inducerats av oralt antigen är CD4-positiva T-celler och uttrycker T-cellsreceptorer (TCR) bestående av aß-heterodimerer, kan de regulatoriska cellema i fallet med antigenadministration via näsan och andningsvägarna också vara CD8-positiva T-celler som uttrycker en yö-heterodimer-TCR (dvs. yö-T-celler). Vissa av dessa celler kan också ha en CD8-receptor som är en aa-homodimer istället för den konventionella aß- heterodimer-TCR. En majoritet av celler som bär CD8otoc och yö-TCR populerar hud eller slemhinnevävnader.

Under de senaste årtiondena har det skett en signifikant ökning av både incidensen och prevalensen av allergiska sjukdomar i västvärlden. Allergisk rinit, den vanligaste av dessa åkommor, påverkar 15-20 procent av populationen. Den allergiska reaktionen aktiveras av allergeninducerad tvärbindning av specifika IgE på ytan av mastceller och basofiler, vilket leder till frisättning av histamin och andra mediatorer som orsakar en akut allergisk reaktion följt av en sen-fasreaktion, vilken är kännetecknad av ett ínflöde av eosinofiler, neutrofiler och Th2-celler som syntetiserar IL-4, IL-5 och IL-13.

Specifik immunbehandling (SIT) är erkänt som en effektiv behandling av allergisk rinit. SIT har traditionellt utförts genom upprepad subkutan administration av små mängder av specifikt allergen.

Trots att denna form av behandling kan vara ett effektivt behandlingsval finns det en oro beträffande säkerheten hos denna form av immunbehandling, så väl som avseende svårigheten att standardisera allergenextraktet som används som vaccin. Det finns följaktligen ett starkt intresse att utveckla altemativa och nya behandlingar mot allergiska sjukdomar. Ett tillvägagångssätt är användningen av slemhinnevacciner (Widermann, Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4, 577-583, 2005). Andra altemativ är baserade på användningen av allergenderivat med reducerad eller ingen allergiframkallande förmåga som vacciner (Vrtala et al. Methods 32, 313-320, 2004). Dessa inkluderar 5 allergener som erhålls med användning av proteinteknik och syntetiska peptider som representerar immundominanta T-cellsepitoper av allergener. Ole el har till exempel identiflerats som det mest relevanta allergenet hos olivpollen (Wheeler et al. Mol Immunol 27,63 l-636, 1990). lmmunsvar modifieras nu genom att administrera polypeptider, ensamma eller i kombination med adjuvanser (immunomodulerande ämnen). Hepatit B-virusvaccinet innehåller till exempel rekombinant hepatit B-virusytantigen, ett icke kroppseget antigen, vilket har formulerats i aluminiumhydroxid, som fungerar som ett adjuvans. Detta vaccin inducerar ett immunsvar mot hepatit B-virusytantigen för att skydda mot infektion. Ett alternativt tillvägagångssätt involverar administration av en attenuerad, replikationshämmad och/eller icke-patogen form av virus eller bakterie, varje och en icke kroppsegna antigen, för att sätta igång ett skyddande immunsvar mot patogenen i värden. Det orala poliovaccinet är till exempel sammansatt av ett levande, attenuerat virus, ett icke kroppseget antigen, vilket infekterar celler och replikerar i den vaccinerade individen för att inducera effektiv immunitet mot poliovirus, ett främmande eller icke kroppseget antigen, utan att orsaka klinisk sjukdom. Det inaktiverade poliovaccinet kan altemativt innehålla inaktiverat eller ”avdödat” virus som inte kan infektera eller replikeras och som administreras subkutant för att inducera skyddande immunitet mot poliovirus.

DNA-terapier har beskrivits för behandling av autoimmuna sjukdomar. Dylika DNA-terapier inkluderar DNA som kodar för de antigenbindande regionerna hos T-cellsreceptom för att förändra nivåer av autoreaktiva T-celler som driver det autoimmuna svaret (Waisman et al. Nat Med 2:899-905, 1996; U.S. Patent 5,939,400). DNA som kodar för autoantigener anbringades på partiklar och administrerades med gaspístol (”gene gun”) till huden för att förhindra MS och kollageninducerad artrit. (WO 97/46253; Ramshaw et al. Immunol Cell Biol 752409-413, 1997). DNA-kodande adhesionsmolekyler, cytokiner (t.ex. TNFot), kemokiner (t.ex. C-C-kemokíner) och andra immunmolekyler (t.ex. Fas-ligand) har använts för behandling av autoimmuna sjukdomar i djurmodeller (Youssef et al. J Clin Invest l06:36l-37l, 2000; Wildbaum et al. J Clin Invest 1062671- 679, 2000; Wildbaum et al. J Immunol 16525860-5866, 2000).

Förfaranden för att behandla autoimmuna sjukdomar genom administrering av nukleinsyra som kodar för en eller flera autoantigener finns beskrivna i WO 00/53019, WO 2003/045316 och WO 2004/047734. Även om dessa förfaranden har varit framgångsrika krävs ännu ytterligare förbättringar.

Bakteriella enterotoxiner används som immunstimulerande adjuvanser i vacciner för preventionen av infektiösa sjukdomar. Koleratoxin (CT) och det nära besläktade värmeinstabila LT-toxinet från E.coli är kanske de mest kraftfulla och bäst studerade slemhinneadjuvansen som används experimentellt idag (Rappuoli et al. Immunol Today 202493-500) men när de har testats kliniskt har deras potentiella 6 toxicitet och koppling till fall med Bells pares (idiopatisk facialpares) lett till deras tillbakadragande från marknaden (Gluck et al. J Infect Dis 181: 1129-1132, 2000; Gluck et al. Vaccine 20 (Suppl.1): S42-44, 2001; Mutsch et al. N Engl J Med. 350: 896-903, 2004). De bakteriella enterotoxinema CT och LT har visat sig vara effektiva immunförstärkare i försöksdjur såväl som i människor. (Freytag et al. Curr Top Microbiol Immunol 236: 215-236, 1999). Dessa enterotoxiner är strukturellt ABS- komplex och utgörs av en ADP-ribosyltransferasaktiv A1-subenhet och en A2-subenhet som binder A1 -enheten till en pentamer av B-subenheter. Holotoxinema binder till de flesta däggdjursceller via B- subenheten (CTB) vilken interagerar specifikt med GM1-gangliosidreceptom i cellmembranet. Medan holotoxinema har visat sig förstärka slemhinneimmunsvar, har konj ugat mellan CTB och antigen använts för att speciflkt tolerisera immunsystemet. (Holmgren et al. Am J Trop Med Hyg 50: 42-54, 1994). Studier i möss har visat at CT och LT kan ackumuleras i luktnerven och luktloben när det ges intranasalt, en mekanism som är beroende på förmågan hos B-subenhetema av CT eller LT att binda till GMl-gangliosidreceptorer som finns närvarande på alla kämbärande däggdjursceller. (Fujihashi et al. Vaccine 20: 2431-2438, 2002). Trots att mindre toxiska mutanter av CT och LT har tagits fram, med väsentlig adjuvansfunktion, bär sådana molekyler fortfarande på en signifikant risk att orsaka biverkningar (Giuliani et al. J Exp Med 187: 1123-1132, 1998; Yamamoto et al. J Exp Med 185: 1203-1210, 1997) i synnerhet när man betänker att adjuvansförmågan hos CT och LT verkar vara en kombination av ADP-ribosyltransferasaktiviteten hos A-subenheten och förmågan att binda gangliosidreceptorer på målcellema (Soriani et al. Microbiology 148: 667-676, 2002). Dessa observationer och andra hindrar användandet av CT- eller LT-holotoxiner i vacciner för människor.

Aktuella observationer har å andra sidan demonstrerat att det är möjligt att kvarhålla adjuvansfunktioner hos dessa molekyler, med ingen eller kraftig reducerad toxicitet, genom införandet av punktspeciflka mutationer i genen som kodar för Al-subenheten. Exempel på muterade molekyler som har visat sig vara effektiva adjuvanser är LTK63 och LTR72, (Giuliani et al. J Exp Med 187: 1123-1132, 1998) där den första inte har någon enzymatisk aktivitet och den senare har signifikant reducerad ADP-ribosylerande förmåga. Trots detta förblir den GM]-gangliosidreceptorberoende bindningen ett problem i dessa mutanter och följaktligen kan de fortfarande orsaka nervcellsackumulering och neurotoxicitet.

En bättre lösning på detta dilemma av effektivitet mot toxicitet är CTA1-DD-molekylen som har visat sig vara ett mycket effektivt slemhinne- och systemiskt adjuvans (Ågren et al. J Immunol 158: 3936- 3946, 1997; US 5,9l7,026). Detta unika adjuvans är baserat på den enzymatisk aktiva Al-subenheten av CT, kombinerat med en dimer av ett immunglobulinbindande element från protein A från Staphylococcus aureus. Molekylen undviker därigenom bindning till alla kämbärande celler, vilket skulle kunna resultera i oönskade reaktioner och utnyttjar till fullo CTA1-enzymet i holotoxinet. Alla studier till dags datum har följaktligen funnit att CTAl-DD är icke-toxiskt och kvarhåller utmärkta immunförstärkande funktioner. När det ges systemiskt tillhandahåller CTAl-DD jämförbara 7 adjuvanseffekter med de hos intakt CT och förstärker kraftigt både cellulär och humoral immunitet mot specifika immunogener som samadministreras med adjuvanset. Det fungerar också som ett slemhinneadjuvans och borde vara säkert då det saknar B-subenhet som är en förutsättning för CT- holotoxintoxicitet. CTAl-DD kan inte binda till gangliosidreceptorer; istället aktiverar det B-celler, vilket begränsar CTAl -DD-adjuvanset till en begränsad repertoar av celler som det kan interagera med. Adjuvanseffekten är emellertid inte helt beroende av B-celler, vilket har visat sig som stark induktion av specifik CD4-positiv T-cellsimmunitet efter intranasal immunisering med användning av CTA1-DD-adjuvanset i B-cellsdeficienta möss (Eliasson et al Vaccine 25: 1243-52, 2008, Akhiani et al. Scand J. Immunol 63: 97-l05,2006).

Adjuvanseffekten hos CTA1-DD fanns inte hos mutantema CTAl-E1l2K-DD och CTA1-R7K-DD, vilka saknar den ADP-ribosylerande enzymatiska aktiviteten (Lycke, Immunol Lett 97: 193-198, 2005) WO 2009/078796 beskriver vidare immunmodulerande komplex, innefattande mutanten CTAl-R7K- DD och mer specifikt de immunmodulerande komplexen innefattande CTA1-R7K-DD kopplat till den delade immunodominanta kollagen-II-peptiden, innefattande aminosyror 260-273 (CII260-273).

Ett konjugat av CTB och en peptid som är härledd från bovint kollagen-II har visat sig ha förmåga att skydda möss från att utveckla kollageninducerad autoimmun öronsjukdom så väl som kollageninducerad artrit (Kim et al. Ann Otol Rhinol Laryngol 110: 646-654, 2001; Tarkowski et al.

Arthritis Rheum 42: 1628-34, 1999). CTB skulle emellertid inte vara lämpligt för användning med människor på grund av sin GM1-gangliosidbindande egenskaper och potentiellt neurotoxiska effekter enligt vad som diskuterats ovan.

SAMMANFATTNING AV UPPFINN INGEN Föreliggande uppfinning hänför sig till förbättrade förfaranden och kompositioner för profylaxen, prevention och/eller behandling av autoimmuna eller allergiska sjukdomar, innefattande administration av immunmodulerande komplex, där det autoimmuna komplexet utgörs av ett fusionsprotein innefattande en subenhet av en muterad A1-subenhet från koleratoxinet (CTA1), en peptid med förmågan att binda till en specifik cellulär receptor och en eller flera epitoper som är associerade med sjukdomen. Administration av en terapeutiskt eller profylaktiskt effektiv mängd av det immunmodulerande komplexet till en individ utlöser hämning av ett immunsvar som är riktat mot ett antigen som är associerat med sjukdomen, därigenom behandlas eller förhindras sjukdomen.

Epitopen kan vara en autoimmun epitop när sjukdomen som skall behandlas är en autoimmun sjukdom, epitopen kan vara en allergiframkallande epitop när sjukdomen som skall behandlas är en allergisk sjukdom.

I en utföringsforrn tillhandahåller uppfinningen ett immunmodulerande komplex, vilket utgörs av ett fusionsprotein som innefattar: (a) en muterad subenhet av den ADP-ribosylerande A1-subenheten av koleratoxinet (CTAl) (b) en peptid med förmåga att binda till en specifik cellulär receptor och (c) en eller flera epitoper som är associerade med en autoimmun eller allergisk sjukdom varvid aminosyroma i den muterade CTA]-subenheten, vilka motsvarar aminosyran 7, arginin och aminosyran 187, cystein, i det naturligt förekommande CTAl, har ersatts.

I en föredragen utföringsform har aminosyran lysin vidare infogats i N-terrninalen hos den muterade CTA1 -subenheten.

I en föredragen utföringsform innefattar fusionsproteinet CTA1-R7K/C 1 87A-mutant en (SEK. ID.

NR.: 1), där aminosyra 7, arginin, i den ursprungliga CTA1-sekvensen har ersatts med ett lysin och där aminosyra 187, cystein, i den ursprungliga CTAl-sekvensen har ersatt med ett alanin.

I en ännu mera föredragen utföringsforni innefattar fusionsproteinet K-CTA1-R7K/Cl87A -mutanten (SEK. 1D. NR.:2), där aminosyra 7, arginin, i den ursprungliga CTAl-sekvensen har ersatts med ett lysin, där aminosyran 187, cystein, i den ursprungliga CTAl-sekvensen har ersatts med ett alanin, och där aminosyran lysin har infogats i N-terminalen.

Ersättning av aminosyra 7, arginin, med ett lysin slår ut den ADP-ribosylerande aktiviteten, ersättning av aminosyra 187 cystein med ett alanin, förhindrar bildandet av dimerer och infogandet av ett lysin i den N-terminala delen ökar dramatiskt uttrycket och produktionen av ett fusionsprotein.

I en utföringsfonn innefattar fusionsproteinet en peptid vilken specifikt binder till en receptor som är uttryckt på en cell med förmågan att presentera antigen, speciellt celler som uttrycker MHC klass I- eller MHC klass II-antigen. Den antigenpresenterande cellen kan väljas från gruppen som utgörs av lymfocyter, såsom B-lymfocyter, T-celler, monocyter, makrofager, dendritiska celler, Langerhansceller, epitelceller och endotelceller.

Peptiden är en peptid som binder till receptorer på de ovanstående cellerna, företrädesvis en Ig- eller Fc-receptor som uttrycks av nämnda antigenpresenterande cell och mest föredraget till receptorer på B-lymfocyter och dendritiska celler.

Exempel på specifika peptider är peptider som har fönnågan att binda till receptorer så som: (i) granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-C SF) med förmågan att binda till GM-CSF receptor-on/ß-heterodimerer som finns närvarande på monocyter, neutrofiler, eosinofiler, fibroblaster och endotelceller. (ii) CD4 och CD8 uttryckt på T-celler, vilka tillsammans med T-cellsreceptom (TcR) fungerar som samreceptorer för MHC klass II- respektive MHC klass I-molekyler. MHC klass I uttrycks på de flesta kämbärande celler, medan MHC klass II-molekyler uttrycks på dendritiska celler, B-celler, monocyter, makrofager, myeloida och erytroida prekursorceller och vissa epitelceller, (iii) CD28 och CTLA-4, två homodimerproteiner som huvudsakligen uttrycks på T-celler, vilka binder till CD80 och CD86B7 som uttrycks på B-celler., (iv) CD4O finns närvarande huvudsakligen på ytan av mogna B-celler, vilka interagerar med CD40L (gp39 eller CD 154) som uttrycks på T-celler, (v) olika ísotyper av de konstanta Ig-tungedjeregionema, vilka interagerar med ett antal av högaffina eller lågaffina Fc-receptorer som finns närvarande på mastceller, basofiler, eosinofiler, trombocyter, dendritiska celler, makrofager, NK-celler och B-celler, (vi) komplementreceptorer (CR), CRl, CR2 och CRS, vilka uttrycks på B-celler och follikulära dendritiska celler, har visat sig vara viktiga vid genereringen av normala humorala immunsvar och de deltar troligtvis också i utvecklingen av autoimmunitet, (vii) lektinreceptorer, C-typ (CLR) så som Dectin-1 som uttrycks på dendritiska celler, (viii) DEC205, en endocytisk receptor för antigenupptag och modifiering, vilken uttrycks i höga nivåer på en delgrupp av dendritiska celler, (ix) CD1 lc, en cellytereceptor för ett antal lösliga faktorer och proteiner (LPS, fibrinogen, iC3b) vilken primärt återfinns på myeloida celler, (x) mannosreceptom som finns närvarande på dendritiska celler, makrofager och andra antigenpresenterande celler, 10 (xi) den specifika HSP60-receptom som finns närvarande på makrofager. (xii) CD103, en integrin-alfakedja, som uttrycks av en delgrupp av dendrítiska celler. (xii) 33Dl-antigenet, vilket finns närvarande på dendrítiska celler.

Enligt en särskilt föredragen utföringsforrn av uppfinningen utgörs nämnda peptid av protein A eller ett fragment därav, i en eller flera kopior, så som en eller flera D-subenheter därav. Enligt en annan särskilt föredragen utföringsform av uppfinningen utgörs nämnda peptid av ett antikroppsfragment, så som ett enkelt kedja antikroppsfragment, vilken specifikt binder till en receptor som är uttryckt på en cell med förmåga till antigenpresentation.

Peptiden är företrädesvis sådan att det resulterande fusíonsproteinet är vattenlösligt och har förmågan att rikta fusíonsproteinet mot en specifik cellreceptor som är skild från receptorer som binder till det ursprungliga toxinet, därigenom förmedlas intracellulärt upptag av åtminstone nämnda subenhet.

De autoantigena epitopema kan associeras med en autoimmun sjukdom, så som insulinberoende diabetes mellitus (IDDM), multipel skleros (MS), systemisk lupus erythematosus (SLE) eller reumatoid artrit (RA), Sjögrens syndrom (SS).

I vissa utföringsformer är de autoantigena epitopema som är associerade med HDDM en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av: preproinsulin; proinsulin, insulin, och insulin-B-kedja; glutaminsyradekarboxylas-65 och -67 (GAD), tyrosinfosfatas-IA-2; öcellsspecifikt glukos-6- fosfatasrelaterat protein (IGRP) och öcellsantigen (69 kD).

I vissa utföringsforrner är autoantigenepitopen som är associerad med MS en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av myelinbasalt protein (MBP), proteolipidprotein (PLP), myelinassocierat oligodendrocytbasalt protein (MOBP), myelin-oligodendrocyt-glykoprotein (MOG) och myelinassocierat glykoprotein (MAG).

I vissa utföringsformer är den autoantigena epitopen associerad med RA en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av typ I-, II-, III-, IV-, V-, IX-, och XI-kollagen, GP-39, filaggrin och fibrin. I en föredragen utföringsforrn är epitopen härledd från typ II-kollagen, epitopen är företrädesvis den delade immundominanta kollagen II-peptiden, innefattande aminosyroma 260-273 (CII260-273).

De allergiska epitopema kan associeras med allergisk astma, allergisk rinit, allergisk alveolit, atopisk derrnatit eller födoämnesöverkänslighet. I vissa utföringsforrner är de allergiska epitopema en epitop ll som är härledd från ett växtpollen, så som Ole el-allergen från olivpollen, Cry jI- och Cry jII- allergener från pollen från japansk ceder, timotej gräspollen nPhl p4 eller det dominanta björkpollenallergenet Bet vl , det dominanta malörtspollenantigenet Art vl, ett djurallergen så som kattallergenet Fel dl eller hundallergenet Can fl, dammkvalsterallergenema Der fl, Der pl, Der ml, Blo t4, ett svampantigen så som Alternaría-antigenet Alt al, Asperígullus-antigenet Asp fl , Cladosporíum-antigenema ClA hl och Cla h2, Penícillum-antigenet Pen chl3; eller ett födoämnesallergen såsom kycklingäggviteallergenema Gal dl, Gal d2 och Gal d3, jordnötsallergenet Ara h2, sojabönsallergenet Gly ml, Gly m5 och Gly m6, fiskallergenet Gad cl eller räkallergenet Pen al.

I en föredragen utföringsfonn är det immunmodulerande komplexet fusionsproteinet K-CTAl-R7K/Cl87A-COL-DD (SEK. ID. NR.:4), där COL är den delade immundominanta kollagen II-peptiden, vilken innefattar aminosyroma 260-273 (CII260-273) (SEK. ID. NR.:5).

Föreliggande uppfinning tillhandahåller förfaranden och kompositioner för behandling, profylax och/eller prevention av en autoimmun sjukdom, såsom multipel skleros, reumatoid artrit, insulinberoende diabetes mellitus, autoimmun uveit, Behçets sjukdom, primär biliär cirros, myasthenia gravis, Sjögrens syndrom, pemfigus vulgaris, sklerodermi, pemiciös anemi, systemisk lupus erythematosus (SLE) och Graves sjukdom, innefattande att administrera ett immunmodulerande komplex i enlighet med uppfinningen till en individ, vilket innefattar ett eller flera autoantigena epitoper som är associerade med sjukdomen.

I vissa utföringsforrner tillhandahåller den föreliggande uppfinningen förbättrade förfaranden för behandlingen, profylax och/eller prevention av den autoimmuna sjukdomen insulinberoende diabetes mellitus (IDDM), vilket innefattar att administrera ett immunmodulerande komplex innefattande en eller flera autoantigena epitoper som är associerade med IDDM enligt uppfinningen till en individ. I vissa utföringsformer är de autoantigena epitopema som är associerade med IDMM en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av: preproinsulín; proinsulin, insulin, och insulin B-kedja; glutaminsyradekarboxylas-65 och -67 (GAD); tyrosinfosfatas IA-2; öcellsspecifikt glukos-6- fosfatasrelaterat protein (IGRP) och öcellsantigen (69 kD).

I andra utföringsformer av den föreliggande uppfinningen tillhandahålls förbättrade förfaranden för behandling, profylax och/eller prevention av multipel skleros (MS) innefattande att administrera ett immunmodulerande komplex enligt uppfinningen innefattande ett eller flera autoantigena epitoper som är associerade med MS till en individ. I vissa utföringsformer är den autoantigena epitopen en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av myelinbasalt protein (MBP), proteolipidprotein 12 (PLP), myelinassocierat oligodendrocytbasalt protein (MOBP), myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) och myelinassocierat glykoprotein (MAG).

I andra utföríngsformer tillhandahålls förbättrade förfaranden för behandling, profylax och/eller prevention av reumatoid artrit (RA), vilka innefattar att administrera ett immunmodulerande komplex enligt föreliggande uppfinning innefattande en eller flera autoantigena epitoper som är associerade med RA till en individ. I vissa utföringsformer är den autoantigena epitopen en epitop som är härledd från guppen som utgörs av typ I-, II-, III-, IV-, V-, IX-, och XI-kollagen, GP-39, filaggrin och fibrin. I en föredragen utföringsform är epitopen härledd från kollagen typ II, epitopen är företrädesvis den delade immundominanta kollagen II-peptiden innefattande aminosyror 260-273 (CII260-273).

Enligt en särskilt föredragen utföringsforrn av uppfinningen utgörs nämnda peptid av protein A eller ett fragment därav, i en eller flera kopior, så som en eller flera D-subenheter därav. Enligt en annan särskilt föredragen utföringsform av uppfinningen utgörs nämnda peptid av ett antikroppsfragment, så som ett enkelt kedja antikroppsfragment, vilket binder specifikt till en receptor som är uttryckt på en cell med förmågan att presentera antigen.

Multipla immunomodulerande komplex innefattande olika autoantigena epitoper kan administreras som en cocktail och varje individuellt immunmodulerande komplex kan också innefatta multipla autoantigena epitoper. På liknande sätt kan multipla immunmodulerande komplex som innefattar olika allergiska epitoper administreras som en cocktail och varje individuellt immunmodulerande komplex kan innefattar multipla allergiframkallande epitoper.

I vissa variationer kan förfarandena och kompositionema för behandling, profylax och/eller prevention av en autoimmun eller allergisk sjukdom vidare innefattar administrationen av det immunmodulerande komplexet enligt föreliggande uppfinning i kombination med andra substanser, till exempel polynukleotider innefattande en immumodulerande sekvens, farmakologiska ämnen, adjuvanser, cytokiner eller vektorer som kodar för cytokiner.

Ytterligare en annan utföringsform av föreliggande uppfinning tillhandahåller en farmaceutisk komposition innefattande ett immumodulerande komplex enligt uppfinningen. Den farrnaceutiska kompositionen enligt uppfinningen kan användas för profylax, prevention och/eller behandling av en allergisk eller autoimmun sjukdom. Den autoimmuna sjukdomen kan väljas från gruppen som utgörs av insulinberoende diabetes mellitus, multipel skleros, reumatoid artrit, autoimmun uveit, primär biliär cirros, myasthenia gravis, Sjögrens syndrom, pemfigus vulgaris, sklerodermi, pemiciös anemi, systemisk lupus erythematosus och Graves sjukdom. Den allergiska sjukdomen kan väljas från 13 gruppen som utgörs av allergisk astma, allergisk rinit, allergisk alveolit, atopisk derrnatit eller födoämnesöverkänslighet.

Ytterligare an annan utföringsform av den föreliggande uppfinningen tillhandahåller användning av ett immunmodulerande komplex enligt uppfinningen för produktionen av en medicinsk produkt för profylax, prevention och/eller behandling av en autoimmun eller allergisk sjukdom. Den autoimmuna sjukdomen kan väljas från gruppen som utgörs av insulinberoende diabetes mellitus, multipel skleros, reumatoid artrit, autoimmun uveit, primär biliär cirros, myasthenia gravis, Sjögrens syndrom, pemfigus vulgaris, skleroderrni, pemiciös anemi, systemisk lupus erythematosus och Graves sjukdom.

Den allergiska sjukdomen kan väljas från gruppen som utgörs av allergisk astma, allergisk rinit, allergisk alveolit, atopisk derinatit eller födoämnesöverkänslighet.

I ytterligare en annan utföringsforrn tillhandahåller den föreliggande uppfinningen isolerade nukleinsyramolekyler som kodar för ett immunmodulerande komplex enligt uppfinningen. Den föreliggande uppfinningen tillhandahåller följaktligen isolerade nukleinsyramolekyler som kodar för ett immunkomplex som är ett fusionsprotein innefattande en muterad subenhet av den ADP- ribosylerande Al-subenheten från koleratoxinet (CTAl), en peptid med förmågan att binda till en specifik cellulär receptor och en eller flera epitoper som är associerade med en autoimmun eller allergisk sjukdom.

I en utföringsforrn kodar nukleinsyran enligt uppfinningen för ett immunmodulerande komplex vilket utgörs av ett fiisionsprotein innefattande: (a) en muterad subenhet av den ADP-ribosylerande Al-subenheten från koleratoxinet (CTAl) (b) en peptid med förmågan att binda till en specifik cellulär receptor, och (c) en eller flera epitoper som är associerade med en autoimmun eller allergisk sjukdom varvid aminosyrorna som motsvarar aminosyra 7, arginín, och aminosyra 187, cystein, i det ursprungliga CTAl har ersatts i den muterade CTAl-subenheten.

I en föredragen utföringsform har aminosyran lysin vidare infogats i N-tenninalen hos den muterade CTAl-subenheten.

I en fördragen utföringsforrn kodar nukleinsyran enligt uppfinningen for ett fusionsprotein innefattande CTAl-R7K/Cl87A-mutanten (SEK. ID. NR.: l), där aminosyra 7, arginín, i den ursprungliga CTAl-sekvensen har ersatts med ett lysin och där aminosyra 187, cystein, i den ursprungliga sekvensen har ersatt med ett alanin. 14 I en ännu mer föredragen utföringsform kodar nukleinsyra enligt föreliggande uppfinning för ett fusionsprotein innefattande K-CTA1-R7K/Cl 87A mutanten (SEK. ID: NR.:2), där aminosyra 7, arginin, i den ursprungliga CTA1-sekvensen har ersatts med ett lysin och där aminosyra 187, cystein, i den ursprungliga CTAl-sekvensen har ersatt med ett alanin, och där aminosyran lysin har infogats i N- tenninalen.

I en utföringsforrn kodar nukleinsyran enligt uppfinningen för ett fusionsprotein vilket innefattar en peptid som specifikt binder till en receptor som uttrycks på en cell med förmågan att presentera antigen, i synnerhet celler som uttrycker MHC klass I- eller MHC klass II-molekyler. De antigenpresenterande cellerna kan väljas från gruppen som utgörs av lymfocyter, så som B-lymfocyter, T-celler, monocyter, makrofager, dendritiska celler, Langerhansceller, epitelceller och endotelceller.

I en utföringsform kodar nukleinsyran enligt föreliggande uppfinning för ett fusionsprotein vilket innefattar en autoantigen epitop som är associerad med en autoimmune sjukdom, såsom insulinberoende diabetes mellitus (IDDM), multipel skleros (MS), systemisk lupus erythematosus (SLE) eller reumatoid artrit (RA) eller Sjögrens syndrom (SS).

I en annan utföringsfonn kodar nukleinsyra enligt föreliggande uppfinning för ett fusionsprotein som innefattar en allergisk epitop som är associerad med en allergisk sjukdom, såsom allergisk astma, allergisk rinit, allergisk alveolit, atopísk dermatit eller födoämnesöverkänslighet.

I vissa utföringsformer är de autoantigena epitopema som är associerade med IDDM en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av: preproinsulin; proinsulin, insulin, och insulin B-kedja; glutaminsyradekarboxylas-65 och -67 (GAD); tyrosinfosfatas IA-2; öcellsspecifrkt glukos-6- fosfatasrelaterat protein (IGRP) och öcellsantigen 69 kD. I vissa utföringsformer är de autoantigena epitopema som är associerade med MS en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av: myelinbasalt protein (MBP), proteolipidprotein (PLP), myelinassocierat oligodendrocytbasalt protein (MOBP), myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) och myelinassocierat glykoprotein (MAG). I vissa utföringsforrner är de autoantigena epitopema som är associerade med RA en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av typ I-, II-, III-, IV-, V-, IX-, och XI-kollagen, GP-39, filaggrin, och fibrin. I vissa utföringsforrner är de autoantigena epitopema som är associerade med SS en epitop som är härledd från gruppen som utgörs av: HSP60-stressprotein, fodrin, Ro-ribonukleoprotein (eller SSA-ribonukleoprotein) och La-ribonukleoprotein (eller SSB-ribonukleoprotein).

Nukleinsyroma enligt föreliggande uppfinning kan vara DNA eller RNA. 15 Nukleinsyran enligt föreliggande uppfinning kan vara en nukleinsyrasekvens som kodar för fusionsproteinet K-CTA1-R7K/Cl87A-COL-DD, så som nukleinsyrasekvensen SEK. ID. NR.: 3.

I en annan utföringsforin tillhandahåller uppfinningen en fannaceutisk komposition innefattande en nukleinsyra enligt uppfinningen. Den farrnaceutiska kompositionen kan användas för profylax, prevention och/eller behandling av en allergisk eller autoimmun sjukdom. Uppfinningen tillhandahåller vidare förfaranden för profylax, prevention och/eller behandling av en autoimmun eller allergisk sjukdom hos en individ, där förfarandet innefattar att administrera en effektiv mängd av en nukleinsyra enligt uppfinningen till en individ.

I ytterligare en utföringsforrn av den föreliggande uppfinningen tillhandahålls plasmider, vektorer och uttryckssystem innefattande en nukleinsyra enligt uppfinning. Det rekombinanta uttiyckssystemet år företrädesvis anpassat för bakteriellt uttryck. Uppfinningen tillhandahåller vidare transfonnerade celler som innehåller en plasmid, vektor eller uttryckssystem enligt uppfinningen. De transforinerade cellema är företrädesvis transfonnerade bakterieceller.

DEFINITIONER Om det inte definieras annorstädes har alla tekniska och vetenskapliga termer som används häri samma betydelse som vanligtvis underförstås av fackmän inom teknikområdet som uppfinningen hör till. Som det används häri, har de följande temierna och fraserna de betydelser som tillskrivs dem om inget annat specificeras annorstädes.

Aminosyrasekvensen för den ADP-ribosylerande Al-subenheten av koleratoxinet (CTAl) kan återfinnas t.ex. i GenBank med accesionsnummer AAM22586.1, ADG44926. 1, AAM74170.1, CAE11218.1, eller AAA27514.1. Termen “en subenhet av den ADP-ribosylerande Al-subenheten av koleratoxinet (CTAl)” hänför sig till en polypeptid som innefattar åtminstone en sekvens som motsvarar sekvensen från aminosyra 7, lysin, till aminosyra 187, cystein, från sekvensen hos den mogna ADP-ribosylerande Al-subenheten hos koleratoxinet (CTAl), så som en polypeptid som innefattar åtminstone en sekvens som motsvarar sekvensen från aminosyra 1, asparagin, till aminosyra 187, cystein, från sekvensen hos den mogna ADP-ribosylerande Al-subenheten hos koleratoxinet (CTAl), eller åtminstone en sekvens som motsvarar sekvensen från aminosyra l, asparagin, till aminosyra 194, serin, från sekvensen hos den mogna ADP-ribosylerande Al-subenheten hos koleratoxinet (CTAl).

Termema "polynukleotid” och “nukleinsyra” hänför sig till en polymer som är uppbyggd av en mängd nukleotidenheter (ribonukleotid eller deoxiribonukleotid eller relaterade strukturella varianter) som är 16 sammanfogade via fosfodiesterbindningar. En polynukleotid eller nukleinsyra kan vara av väsentligen vilken längd som helst, vanligtvis från mellan ungefär sex (6) nukleotider till 109 nukleotider eller längre. Polynukleotider och nukleinsyror inkluderar RNA, DNA, syntetiska former och blandade polymerer, både sens och antísens-trådar, dubbel- eller enkeltrådiga, och kan också vara kemiskt eller biokemiskt modifierade eller kan innehålla icke-naturligt förekommande eller derivatiserade nukleotidbaser, vilket är uppenbart för en fackman inom teknikområdet.

”Antigen” som det används häri, avser vilken molekyl som helst som kan kännas igen av immunsystemet, det vill säga av B-celler eller T-celler eller båda.

”Autoantigen” som det används häri, avser en endogen molekyl, vanligtvis en polysackarid eller ett protein eller ett fragment därav som utlöser ett sjukligt immunsvar. Autoantigen innefattar glykosylerade proteiner och peptider såväl som proteiner eller peptider som bär andra former av posttranslationella modifieringar, inkluderande citrullinerad peptider. Vid hänvisning till autoantigenet eller epitopen av detsamma som “associerat med en autoimmun sjukdom” är det underförstått att avse att autoantigenet eller epitopen är involverad i patofysiologin hos sjukdomen antingen genom att inducera patofysiologin (dvs. associerad med sjukdomens etiologi), bidra till eller underlätta en patofysiologisk process; och/eller genom att vara mål för en patofysiologisk process. Vid exempelvis en autoimmun sjukdom riktar sig immunförsvaret felaktigt mot autoantigen, vilket orsakar skada och felaktig funktion hos celler och vävnader i vilka autoantigenet uttrycks och/eller finns närvarande.

Under normala fysiologiska betingelse ignoreras autoantigen av det egna immunsystemet genom eliminering, inaktivering eller brist på aktivering av immunceller som har kapaciteten att känna igen autoantigenet genom en process som kallas “immuntolerans”.

“Allergen” som det används häri, syftar på en exogen molekyl, vanligtvis en polysackarid eller ett protein eller ett fragment därav vilket utlöser ett sjukligt immunsvar. Allergener inkluderar glykosylerade proteiner och peptider, såväl som proteiner och peptider som bär andra former av posttranslationella modifieringar. Allergenet kan vara härlett från t.ex. pollen, svampar, insektsgift, mjäll, mögel och födoämnen. Ett flertal födoämnesallergener har renats och är väl karaktäriserade, så som Ara hl, Ara h2, Ara h3 och Ara h6 från jordnöt; Gal dl, Gal d2, och Gal d3 från kycklingäggvita; Gly ml från sojaböna; Gad cl från fisk; och Pen al från räka. De dominant kattallergenet (Fel dl) och hundallergenet (Can fl), såväl som dammkvalsterallergenen Der fl och Der pl, är väl karaktäriserade.

Det ursprungliga timtotejgräspollenet nPhl p4, såväl som ett antal relaterade rekombinanta allergener, rPhl lp, rPhl 2p, rPhl 5p, rPhl 6p, rPhl 7p, rPhl llp, rPhl l2p, det dominerande björkpollenallergenet Bet vl, det dominerande platanpollenallergent Pla I l, det dominerande olivpollenallergenet Ole el, det dominerande malörtsambrosiaallergenet Amb al, det dominerande malörtsallergenen Art vl och Art V3, är väl karaktäriserade. 17 Som det används häri är termen ”epitop” avsedd att betyda en del av en polysackarid eller polypeptid som har en speciell fonn eller struktur som känns igen av antingen B-celler eller T-celler i ett djurs immunsystem. En epitop kan inkludera delar av både en polysackarid och en polypeptid, t.ex. en glykosylerad peptid.

”Autoantigen epitop” hänför sig till en epitop hos ett autoantigen vilken utlöser ett sjukligt immunsvar.

“Allergiframkallande epitop” hänför sig till en epitop av ett allergen som utlöser ett sjukligt immunsvar.

Termerna “polypeptid”, “peptid”, och “protein” används utbytbart med varandra och avser häri en polymer av aminosyrarester. Termen avser aminosyrapolymerer i vilka en eller flera av aminosyrarestema är en artificiell kemisk replica av en motsvarande naturligt förekommande aminosyra, såväl som naturligt förekommande aminosyrapolymerer och icke-naturlig förekommande aminosyrapolymerer.

”Kroppseget protein”, ”kroppsegen polypeptid” eller “kroppsegen peptid ” används utbytbart häri och avser något protein, polypeptid eller peptid eller ett fragment eller derivat därav som: kodas för i djurets genom; produceras eller genereras i djuret ; kan modifieras posttranslationellt vid någon tidpunkt i djurets liv; och finns närvarande i djuret icke-fysiologiskt. Termen ”icke-fysiologiskt” eller ”icke-fysiologisk” avser, när det används för att beskriva kroppsegna proteiner, kroppsegna polypeptider eller kroppsegna peptider enligt föreliggande uppfinning, en skillnad eller avvikelse från den normala rollen eller processen i djuret för detta kroppsegna protein, kroppsegen polypeptid eller polypeptid peptid. Vid hänvisning till det kroppsegna proteinet, den kroppsegna polypeptiden eller den kroppsegna peptiden som “associerad med en sjukdom” eller “involverad i en sjukdom” är det underförstått att avse att det kroppsegna proteinet, den kroppsegna polypeptiden eller den kroppsegna peptiden kan vara modifierat i sin form eller struktur och följaktligen oförmöget att utföra sin fysiologiska roll eller process eller kan vara involverat i patofysiologin för tillståndet eller sjukdomen antingen genom att inducera patofysiologin; orsaka eller underlätta den patofysiologiska processen; och/eller vara målet för en patofysiologisk process. I autoimmuna sjukdomar attackerar immunförsvaret till exempel på ett avvikande sätt kroppsegna proteiner, vilket orsakar skada och dysfunktion hos celler och vävnader i vilka det kroppsegna proteinet är uttryckt och/eller finns närvarande. Det kroppsegna proteinet, den kroppsegna polypeptiden eller kroppsegna peptiden kan alternativt i sig självt vara uttryckt i icke-fysiologiska nivåer och/eller ha en icke-fysiologisk funktion.

I neurodegenerativa sjukdomar är till exempel kroppsegna proteiner uttryckta på ett avvikande sätt och aggregerar i lesioner i hj äman, vilket därigenom orsakar neural dysfunktion. I andra fall förvärrar det 18 kroppsegna proteinet ett oönskat tillstånd eller process. Vid artros bryter till exempel kroppsegna proteiner, inkluderande kollagenaser och matrixmetalloproteinaser, ner brosk som täcker ledytoma i leder på ett avvikande sätt. Exempel på posttranslationella modifieringar av kroppsegna proteiner eller kroppsegna polypeptider eller kroppsegna peptider är glykosylering, addition av lipidgrupper, reversibel fosforylering, addition av dimetylargininrester, citrullination och proteolys och mer specifikt citrullination av fillagrin och fibrin med peptidylarginindeiminas (PAD), alfa beta-kristallin fosforylering, citrullination av MBP och SLE-autoantigenproteolys av kaspaser och granzymer.

Immunlogiskt skulle kroppsegna proteiner, polypeptider och peptider alla anses vara värdspecifika självantigen och under normal fysiologiska betingelser ignoreras dessa av det egna immunförsvaret genom elimineringen, inaktiveringen eller bristen på aktivering av immunceller som har kapaciteten att känna igen självantigen genom en process som kallas ”immuntolerans”. Ett kroppseget protein, polypeptid eller peptid inkluderar inte immunproteiner, polypeptider eller peptider som är molekyler som uttrycks fysiologiskt enbart av celler i immunförsvaret i syfte att reglera immunfunktion.

Immunsystemet är den försvarsmekanisk som tillhandahåller medel för att skapa ett snabbt, mycket specifikt och skyddande svar mot den oräkneliga mängd av potentiellt patogena mikroorganismer som finns i djurens värld. Exempel på immunproteiner, polypeptider eller peptider är proteiner innefattande T-cellsreceptom, immunglobuliner, cytokiner, inkluderande typ I-interleukiner och typ II-cytokiner, inkluderande interferonema och IL-10, TNF, lymfotoxin och kemokinema såsom makrofaginflammatoriskt protein-l-alfa och beta, monocytkemotaktiskt protein och RANTES och andra molekyler som är direkt involverade i immunfunktion, så som Fas-ligand. Det finns vissa immunproteiner, polypeptider eller peptider som innefattas i det kroppsegna proteinet, polypeptiden eller peptiden enligt föreliggande uppfinning och det är: MHC klass I-membranglykoproteiner, MHC klass II-glykoproteiner och osteopontin. Kroppsegna proteiner, polypeptider eller peptider inkluderar inte proteiner, polypeptider eller peptider som saknas in individen, antingen helt eller väsentligen, på grund av en genetisk eller förvärvad brist, vilket ger en metabol eller funktionell sjukdom och ersätts antingen med administration av nämnda protein, polypeptid eller peptid eller genom administration av en polynukleotid som kodar för nämnda protein, polypeptid eller peptid (genterapi). Exempel på sådana sjukdomar inkluderar Duchennes muskeldystrofi, Beckers muskeldystrofi, cystisk fibros, fenylketonuri, galaktosemi, lönnsirapsjuka och homocystinuri.

“Moduleríng av”, “modulering” eller “att förändra ett immunsvar” avser som det används häri någon förändring av ett existerande eller potentiellt immunsvar mot en autoimmun eller allergiframkallande epitop, inkluderande t.ex. nukleinsyror, lipider, fosfolipider, kolhydrater, kroppsegna polypeptider, proteinkomplex eller ribonukleoproteinkomplex, vilka sker som ett resultat av administration av ett immunmodulerande komplex eller polynukleotid som kodar för ett immunmodulerande komplex.

Dylik modulering inkluderar någon förändring i närvaron, kapaciteten eller funktionen hos någon immuncell som är involverad i eller har förmågan att deltaga i ett immunsvar. Immunceller inkluderar 19 B-celler, T-celler, NK-celler, NK T-celler, professionella antigenpresenterande celler, icke- professionella antingenpresenterande celler, inflammatoriska celler eller någon annan cell som är involverad i eller påverkar ett immunsvar. “Modulatering” inkluderar alla förändringar som överförs på ett existerande immunsvar, ett mognande immunsvar, ett potentiellt immunsvar eller kapaciteten att inducera, reglera, påverka eller svara mot ett immunsvar. Modulering inkluderar alla förändringar i uttrycket och/eller funktionen av gener, proteiner och/eller andra molekyler i immunceller som är en del av ett immunsvar.

“Modulering av ett immunsvar” inkluderar till exempel det följande; eliminering, deletion eller sekvestrering av immunceller; induktion eller generering av immunceller som kan modulera den fiinktionella kapaciteten hos andra celler, så som autoreaktiva lymfocyter, antigenpresenterande celler eller inflammatoriska celler; induktion av ett icke-reaktivt tillstånd hos en immuncell (dvs. anergi); ökning, minskning eller förändring av aktiviteten eller funktionen hos immunceller eller kapaciteten att göra detta, inkluderande men inte begränsat till att förändra mönstret för proteiner som uttrycks i dessa celler. Exempel inkluderar en förändrad produktion och/eller utsöndring av vissa klasser av molekyler, så som cytokiner, kemokiner, tillväxtfaktorer, transkriptionsfaktorer, kinaser, samstimulerande molekyler eller andra cellytreceptorer; eller någon annan kombination av dessa modulerande händelser.

Administration av ett immunmodulerande komplex eller en polynukleotid som kodar för ett immunmodulerande komplex kan till exempel modulera ett immunsvar genom att eliminera, sekvestrera eller inaktivera immunceller som förmedlar eller har förrnågan att förmedla ett oönskat immunsvar; att inducera, generera eller aktivera immunceller som förmedlar eller har förmågan att förmedla ett skyddande immunsvar; att förändra de fysikaliska eller funktionella egenskapema hos immunceller; eller en kombination av dessa effekter. Exempel på mätningar av moduleringen av ett immunsvar inkluderar men är inte begränsade till undersökning av närvaron eller frånvaron av immuncellspopulationer (med användning av flödescytometri, immunohistokemi, histologi, elektronmikroskopi, polymeraskedjereaktion (PCR)); mätning av den funktionella kapaciteten hos immunceller inkluderar förmågan till eller resistens mot proliferation eller att dela sig som svar på en signal (såsom att använda T-cellsproliferationsanalys baserat på SH-tymidininkorporering efter stimulering med anti-CD3 -antikropp, anti-T eellsreceptorantikropp, anti-CD28-antikropp, kalciumjonoferer, PMA, antigenpresenterande celler som är laddade med en peptid eller ett proteinantigen; B-cellsproliferationsanalys); mätning av förmågan att döda eller lysera andra celler (så som cytotoxiska T-cellsanalyser ); mätningar av cytokiner, kemokiner, cellytemolekyler, antikroppar och andra produkter från cellema (t. ex. genom flödescytometri, enzymkopplad immunadsorberande analys, Westem blöt-analys, proteinmikroarray-analys, immunprecipitationsanalys); mätning av biokemiska markörer för aktivering av immunceller eller signaleringsvägar inom immunceller (t. ex. 20 Westem blot och immunprecipitationsanalys av tyrosin-, serin- eller treoninfosforylering, polypeptidklyvning och bildandet eller dissocíeringen av proteinkomplex; proteinarray-analys; DNA- transkriptionell profilering med hjälp av DNA-arrays eller subtraktiv hybridisering); mätningar av celldöd genom apoptos, nekros eller andra mekanismer (t. ex. annexin V-färgning, TUNEL-analyser, gelelektrofores för att mäta förekomsten av DNA-stegar, histologi; fluorogena kaspasanalyser, Westem blot-analys av kaspassubstrat); mätningar av generna, proteinema och andra molekyler som produceras av immuncellema ( t. ex. Northem blotting-analys, polymeraskedj ereaktion, DNA- mikroarrays, protein-mikroarrays, 2- dimensionell gelelektrofores, Westem blotting-analys, enzymkopplad immunadsorberande analys, flödescytometri); och mätningar av kliniska symptom eller utfall så som förbättringar av autoimmuna, neurodegenerativa och andra sjukdomar som involverar kroppsegna proteiner och kroppsegna polypeptider (kliniska poäng, krav för användning vid ytterligare terapier, funktionell status, avbildningsstudier) till exempel genom att mäta recidivfrekvens och sjukdomssvårighetsgrad (med användning av kliniska poäng enligt vad som är känt för fackmän inom teknikområdet) i fallet med multipel skleros, att mäta blodglukosnivåer i fallet med typ l- diabetes eller ledinflammation in fallet med reumatoid artrit.

”Individer” är avsett att betyda något djur, såsom till exempel en människa, en icke-human primat, häst, ko, hund, katt, mus, råtta, marsvin eller kanin.

”Att behandla”, “behandling”, eller “terapi” av en sjukdom eller stöming är avsett att betyda avsaktande, stoppande eller reversion av sjukdomens progress, vilket visas genom minskning, upphörande eller eliminering av antingen kliniska eller diagnostiska symptom, genom administration av ett immunmodulerande komplex eller en polynukleotid som kodar för ett immunmodulerande komplex, antingen ensamt eller i kombination med en annan förening enligt beskrivning häri. ”Att behandla”, “behandling”, eller “terapi” betyder också en minskning i svårighetsgraden hos symptom hos en akut eller kronisk sjukdom eller stöming eller en minskning i recidivintensiteten som till exempel i fallet med en recidiverande eller remitterande autoimmun sjukdoms förlopp eller en minskning av inflammation i fallet med en inflammatorisk aspekt hos en autoimmun sjukdom. I den föredragna utföringsforrnen avser, att behandla en sjukdom, att vända eller stoppa eller begränsa sjukdomsprogressionen, idealt till den punkt där sjukdomen elimineras helt. Som det används häri är att förbättra en sjukdom och att behandla en sjukdom ekvivalenta begrepp.

“Att förhindra”, “profylax av”, eller “prevention” av en sjukdom eller en stöming hänför sig som det används i kontexten i den föreliggande uppfinningen till administrationen av ett immunmodulerande komplex eller en polynukleotid som kodar för ett immunmodulerande komplex, antingen ensamt eller i kombination med en annan förening enligt beskrivning häri, för att förhindra uppkomsten eller 21 starten av en sjukdom eller stöming eller vissa eller alla av de symptomen hos en sjukdom eller stöming eller att minska sannolikheten för att en sjukdom eller stöming uppkommer.

En “terapeutiskt eller profylaktiskt effektiv mängd” av ett immunmodulerande komplex hänför sig till någon mängd av det immunmodulerande komplexet som är tillräcklig för att behandla eller förhindra sjukdomen som till exempel genom att förbättra eller eliminera symptomen och/eller orsaken till sjukdomen. Terapeutiskt effektiva mängder faller till exempel inom breda intervall och bestäms genom kliniska prövningar och bestäms för specifika patienter baserat på faktorer som är kända för en fackman inom teknikområdet, exempelvis svårighetsgraden hos sjukdomen, patientens vikt, ålder och andra faktorer.

BESKRIVNING AV RITNINGARNA Figur l. DNA-konstruktion som kodar för det immunmodulerande komplexet K-CTAl-R7K/C187A- COL-DD pCTAl-DD-plasmiden innehåller koleratoxin Al-genen (aminosyra 1-194) klonad vid HindIII- BamHI och två D-fragment från stafylokockprotein A-genen som står under kontroll av trp- promotom. Kollagenpeptid infogades mellan CTAl- och DD-fragmentet för att ge pCTAl-COL-DD.

R7K- och C187A-mutationer skapades med användning av in vitro-mutagenes, vilket resulterade i pK- CTAI-R7K/Cl 87A-COL-DD. Ptrc = Ptrc-promotor. COL2Al = kollagenpeptid, D = Ig-bindande element hos protein A från S. aureus.

Figur 2. Jämförelse av de terapeutiska effektema hos CTAl-R7K-COL-DD och K-CTAl-R7K/Cl 87A-COL-DD i mus-CIA-modellen.

A. Artritindex. B. Artritfrekvens.

- I- CTAl-R7K-COL-DD, - Ö - K-CTAl-R7K/Cl87A-COL-DD, - Ü - PBS, kontroll.

Figur 3. Jämförelse av de terapeutiska effektema hos CTAl-R7K-COL-DD och K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD i mus-CAIA-modellen.

Artritindex. - I- CTAl-R7K-COL-DD, - O - K-CTAl-R7IUCl87A-COL-DD, - Ü - PBS, kontroll.

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning hänför sig till förfaranden och kompositioner för profylax, prevention och/eller behandling av en sjukdom hos en individ, vilken är associerad med ett eller flera kroppsegna proteiner, polypeptider, eller peptider som finns närvarande i individen och är involverade i ett icke- fysiologiskt tillstånd. Uppfinningen är mer specifikt relaterad till förfaranden och kompositioner för 22 profylax, prevention och/eller behandling av autoimmuna sjukdomar som är associerade med en eller flera kroppsegna polypeptider som finns närvarande i en individ i ett icke-fysiologískt tillstånd så som i multipel skleros, reumatoid artrit, insulinberoende diabetes mellitus, autoimmun uveit, primär biliär cirros, myasthenia gravis, Sjögrens syndrom, pemfigus vulgaris, skleroderini, pemiciös anemi, systemisk lupus erythematosus och Graves sjukdom. Föreliggande uppfinning tillhandahåller förbättrade förfaranden för profylax, prevention och/eller behandling av en autoimmun sjukdom, innefattande att administrera ett immunmodulerande komplex innefattande ett eller flera autoantigena epitoper som är associerade med sjukdomen till en individ. Administration av en terapeutiskt eller profylaktiskt effektiv mängd av det immunmodulerande komplexet innefattande en eller flera autoantigena epitoper till en individ utlöser hämning av ett immunsvar mot autoantígenet som är associerat med en autoimmun sjukdom, vilket därigenom behandlar eller förhindrar sjukdomen.

Autoímmuna Sjukdomar Flera exempel på autoimmuna sjukdomar som är associerade med autoantigen presenteras i tabell 1 och specifika exempel finns beskrivna mer i detalj häri nedan.

Tabell 1. Exempel på autoimmune sjukdomar och associerade autoantigen Autoimmun sjukdom Påverkad vävnad Autoantigen(er) som är associerade med den autoimmuna sjukdomen Reumatoid artrit synovialleder Immunglobulin, fibrin, filaggrin, kollagen av typ- I, -II, -III, -IV, -V, -IX, och XI, GP-39, hnRNP Multipel skleros centrala nervsystemet Myelinbasalt protein, proteolipidprotein, myelinassocierat glykoprotein, cykliskt nukleotidfosfodiesteras, myelinassocierat glykoprotein, myelinassocierat oligodendrocytiskt basalt protein, myelinoligodendrocytglykoprotein, alfa-B- kristallin lnSlllinbefOelldë beroende ß-celler i Tyrosinfosfatas-IA2, -IA-Zß; díflbeïflS mellifllS cellöar i glutaminsyradekarboxylas (65 och 67 kDa- bukspottskörteln former), karboxypeptidas-H, insulin, proinsulin, pre- proinsulin, stressproteiner (heat shock proteins), glima-38, öcellsantingen (69 KDa), p52, öcellsglukostransportör, GLUT-2 23 Sjögrens syndrom exokrina körtlar HSP60-stressprotein, fodrin, ribonukleoproteiner: Ro6O (SSA), Ro52 (SSA), och La (SSB), poly(ADP-ribos)polymeras, lipokalin, alfa-amylas Guillain-Barrés perifera nervsystemet perifert myelinprotein-I och andra syndrom Autoimmun Uveit öga, uvea S-antigen, interfotoreceptorretinoidbindande protein (IRBP), rodopsin, recoverin Primär biliär cirros gallvägama i lever pyruvatdehydrogenaskomplex (2-oxosyra- dehydrogenas) Autoimmun hepatit lever Hepatocytantigener, cytokrom-P450 Pemfigus vulgaris hud Desmoglein-1, -3, och andra Myasthenia Gravis nerv-muskelkopplingar acetylkolinreceptor Autoimmun gastrit mage/parietalcell HVKïATPas, inre faktor Pemiciös anemi mage inre faktor Polymyosit muskel Histidyl-tRNA-syntetas, andra syntetaser, andra nukleära antigener Autoimmun tyroidit sköldkörtel tyroglobulin, tyroidperoxidas Graves sjukdom sköldkörtel sköldkörtelstimulerande horrnonreceptor Psoriasis hud okänt Vitiligo hud tyrosinas, tyrosinas-relaterat protein-Z systemisk lupus systemisk nukleära antigener: DNA, hístoner, erythematosus ribonukleoproteiner glutenintolerans tunntarrn transglutaminas Reumatoid Artrit. Reumatoid artrit (RA) är en kronisk autoimmun inflammatorisk synovit som påverkar 0,8 % av väldens population. Den är kännetecknad av kronisk inflammatorisk synovit som orsakar eroderande lednedbrytning. RA förmedlas av T-celler, B-celler och makrofager.

Bevis på att T-celler spelar en avgörande roll i RA inkluderar (l) dominansen av CD4-positiva T- celler som infiltrerar leden, (2) klinisk förbättring associerad med hämning av T-cellsfunktion med läkemedel så som cyklosporin (3) associering mellan RA och vissa HLA-DR-alleler. HLA-DR-alleler som är associerade med RA innehåller en liknande sekvens av aminosyror vid positionema 67-74 i den tredje hypervariabla regionen i ß-kedjan som är involverad i peptidbindning och presentation för T-celler. RA förmedlas av autoreaktiva T-celler som känner igen ett kroppseget protein eller ett modifierat kroppseget protein, vilket finns närvarande i synovialleder. Autoantigener som är mål i RA innefattar till exempel epitoper från typ II-kollagen; hnRNP; A2/RA33; Sa; filaggrin; keratin; eitmllin; broskproteiner, inkluderande gp39; kollagen av typ-I5 III, -IV, -V, -IX, -XI; HSP-65/60; IgM 24 (reumatoid faktor); RNA-polymeras; hnRNP-Bl; hnRNP-D; kardiolipin; aldolase-A; citrullin- modifierat filaggrin och flbrin. Autoantikroppar som känner igen filaggrinpeptider och som innehåller en modifierad argininrest (deiminerad till att bilda citrullin) har identifierats i serum hos en hög andel RA-patienter. Autoreaktiva T- och B-cellssvar är båda riktade mot samma immundominanta typ-II- kollagenpeptid (CII-peptid) 257-270 hos vissa patienter.

Multipel skleros. Multipel skleros (MS) är den vanligaste demyeliniserande sjukdomen i centrala nervsystemet och drabbar 350 000 amerikaner och miljon människor över hela världen. Symptomstart sker vanligen mellan 20 till 40 års ålder och manifesteras som en akut eller subakut attack av ensidig synfórsämring, muskelsvaghet, parestesi, ataxí, yrsel, urininkontinens, dysartri eller mental stöming (i sjunkande frekvensordning). Dylika symptom härrör från fokala lesioner av demyelinisering vilket orsakar både negativa överföringsabnormaliteter på grund av långsammare axonal överföring och positiva övertöringsabnormaliteter på grund av ektopisk impulsgenerering (t.ex. Lherinittes symptom).

Diagnos av MS är baserat på en historia inkluderande åtminstone två distinkta attacker av neurologisk dysfunktion som är separerade i tiden, patienten uppvisar objektiva kliniska bevis för neurologisk dysfunktion och involverar olika delar av den vita substansen i CNS. Laboratoriestudier ger ytterligare objektiva bevis som stödjer diagnosen av MS, vilket inkluderar avbildning med magnetisk resonanstomografi (MRI) av lesioner i den vita massan i CNS, cerebrospinalvätska, oligoklonal bandning av IgG och onormala retningssvar. Trots att de flesta patienter upplever ett gradvist progressivt remitterande sjukdomsförlopp, varierar det kliniska förloppet hos MS mycket mellan individer och kan sträcka sig från att vara begränsat till flera milda attacker under en livstid till fulminant kronisk progressiv sjukdom. En kvantitativ ökning av antalet myelin-autoreaktiva T-celler med förmågan att utsöndra IFN-gamma är associerat med patogenesen hos MS och EAE.

De autoantigena målen för det autoimmuna svaret i autoimmuna demyeliniserande sjukdomar, så som multipel skleros och experimentell autoimmun encefalit (EAE), kan innefatta epitoper från proteolipidprotein (PLP); myelinbasalt protein (MBP); myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG); cykliskt nukleotidfosfodiesteras (CNPas); myelinassocierat glykoprotein (MAG)5 och myelinassocierat oligodendrocytiskt basalt protein (MBOP); alfa-B-kristallin (ett stressprotein); virala och bakteriella härinande peptider, t.ex., influensa, herpesvirus, hepatit B-virus, etc.; OSP (oligodendrocytspecifikt protein); citrullin-modifierat MBP (CS-isoformen av MBP i vilken 6 argininer har blivit deiminerade till citrullin), etc. Det integrala membranproteinet PLP är ett dominant autoantigen hos myelin. Detenninanter for PLP-antigenicitet har identifierats i flera musstammar och innefattar restema 139451, 103-116, 215-232, 43-64 och 178-191. Åtminstone 26 MBP-epitoper har rapporterats (Meinl et al, J Clin Invest 92, 2633-43, 1993). Restema 1-11, 59-76 och 87-99 är värt att notera. Immundominanta MOG-epitoper som har identifierats hos flera musstammar inkluderar restema 1-22, 35-55 och 64-96. 25 Hos humana MS-patienter identifierades de följande myelinproteinema och epitopema som mål för de autoimmuna T- och B-cellssvaren. Antikroppar som eluerats från MS-plack i hjäma kände igen myelinbasalt proteinpeptid (MBP-peptid) 83-97 (Wucherpfennig et al. J Clin Invest 100:1 1 14-1122, 1997). En annan studie fann att ungefär 50 % av MS-patientema hade T-cellsreaktivitet bland perífera blodlymofcyter mot myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) (6-10% hos kontrollen), 20 % var reaktiva mot MBP (8-12% hos kontrollen), 8 % var reaktiva mot PLP (0 % hos kontrollen), 0 % var reaktiva mot MAG (0 % hos kontrollen). 1 denna studie hade 7 av 10 MOG-reaktiva patienter ett proliferativt T-cellssvar som var fokuserat på en av de 3 peptidepitoperna, inkluderande MOG 1-22, MOG 34-56, MOG 64-96 (Kerlero de Rosbo et al. Eur J Immunol 27: 3059-69, 1997). T- och B- cellssvar (antikropp eluerade från hjämlesion) var fokuserat på MBP 87-99 (Oksenberg et al. Nature 362: 68-70, 1993). Hos MBP 87-99, är aminosyrasekvensen HFFK ett dominant mål för både T-cells- och B-cellssvaret (Wucherpfennig et al. J Clin Invest 100: 1114-22, 1997). En annan studie observerade lymfocytreaktivitet mot myelinassocierat basalt protein (MOBP), inkluderande resterna MOBP 21-39 och MOBP 37-60 (Holz et al. J Immunol 164: 1103-9, 2000). Med användning av immunogold-konjugat av MOG och MBP-peptider för att färga MS- och kontrollhjämor kändes både MBP- och MOG-peptider igen av antikroppar bundna till MS-plack (Genain and Hauser, Methods 10: 420-34, 1996).

Insulinberoende diabetes mellitus. Human typ I- eller insulinberoende diabetes mellitus (IDDM) kännetecknas av autoimmun förstörelse av ß-cellema i de pankreatiska Langerhansöcellema.

Uttömningen av ß-celler resulterar i oförmåga att reglera nivåerna av glukos i blodet. Uppenbar diabetes föreligger när nivåerna av glukos i blodet stiger över en specifik nivå, vanligtvis ungefär 250 mg/dl. Hos människor föregås starten av diabetessjukdomen av en lång presymptomatiskt period.

Under denna period sker en gradvis förlust av pankreatisk betacellsfunktion. Utvecklingen av sjukdomen impliceras av närvaron av autoantikroppar mot insulin, glutaminsyradekarboxylas och tyrosinfosfataset IA2 (IA2).

Markörer som kan utvärderas under den presymptomatiska perioden är närvaron av insulit i bukspottskörteln, nivån och frekvensen av antikroppar mot öceller, antikroppar mot öcellers yta, avvikande uttryck av MHC klass II-molekyler på pankreatiska betaceller, glukoskoncentration i blodet och plasmakoncentrationen av insulin. En ökning av antalet T-lymfocyter i bukspottskörteln, antikroppar mot öceller och blodglukos är indikativt för sjukdomen, vilket också en minskning av insulinkoncentrationen är.

De icke-överviktiga NOD-mössen (NOD=Non-Obese Diabetic) är en djurmodell med många kliniska immunologiska och histopatologiska särdrag gemensamma med human IDDM. NOD-möss utvecklar 26 inflammation i öarna och förstörelse av beta-cellema spontant, vilket leder till hyperglykemi och öppen diabetes. Både CD4-positiva och CD8-positiva T-celler krävs för att diabetes skall utvecklas, trots att rollerna hos var och en förblir oklar. Det har visats att administration av insulin eller GAD5 till NOD-möss, i fonn av proteiner, under toleriserande betingelser, förhindrar sjukdom och nedreglerar svar mot andra autoantigener.

Närvaron av kombinationer av autoantikroppar med olika specificiteter i serum uppvisar mycket hög sensitivitet och specificitet för human diabetes mellitus av typ 1. Närvaron av autoantikroppar mot GAD och/eller IA-2 uppvisar till exempel ungefär 98 % sensitivitet och 99 % specificitet för att identifiera diabetes mellitus av typ I från kontrollserum. Närvaron av autoantikroppar som är specifika för två av de tre autoantigenema inkluderande GAD, insulin och IA-2, hos friska första gradens släktingar till typ-1 diabetes patienter ger ett positivt prediktivt värde på >90% för utveckling av typ- IDM inom 5 år.

Autoantigener som är mål vid human insulinberoende diabetes mellitus kan till exempel inkludera tyrosinfosfatas IA-2; IA-2[beta]; glutaminsyradekarboxylas (GAD), både 65 kDa och 67 kDa- formema; karboxipeptidas H; insulin; proinsulin; stressproteiner (HSP); glima 38; öcellsantigen (69 kDa) (ICA69); p52; två gangliosidantigener (GT3 och GM2-l); öspecifikt glukos-ó-fosfatasrelaterat protein (IGRP); och öcells-glukostransportör (GLUT 2).

Human IDDM behandlas för närvarande genom övervakning av blodglukosnivåer för att styra injektion eller pumpbaserad administration av rekombinant insulin. Diet och träningsbehandlingar bidrar till att uppnå adekvat blodglukoskontroll.

Autoimmun uveit. Autoimmun uveít är en autoimmun sjukdom i ögat som uppskattas påverka 400 000 personer, med en incidens på 43 000 nya fall årligen i USA. Autoimmun uveít behandlas för närvarande med steroider, immunsupprimerande ämnen så som metotrexat och cyklosporin, intravenöst immunglobulin och TNF-oc-antagonister.

Experimentell autoimmun uveít (EAU) är en T-cellsförrnedlad autoimmun sjukdom som riktar sig mot neural retina, uvea och relaterade vävnader i ögat. EAU delar många kliniska och immunologiska särdrag med human autoimmun uveít och induceras av perifer administration av uveitogen peptid som är emulgerad i Freunds kompletta adjuvans (CFA).

Autoantigener som är mål för humana autoimmuna svar kan inkludera S-antigen, interfotoreceptorretinoidbindande protein (IRBP), rodopsin och recoverin. 27 Primär biliär cirros. Primär biliär cirros (PBC) är en organspecifik, autoimmun sjukdom som huvudsakligen drabbar kvinnor i åldem 40-60 år. Prevalensen som rapporteras i denna grupp närmar sig 1 per 1000. PBC kännetecknas av en progressiv förstörelse av intrahepatiska biliära epitelceller (IBEC) som täcker insidan av de små íntrahepatiska gallvägama. Detta leder til obstruktion och stömingar i gallutsöndringen, vilket slutligen leder till cirros. Association med andra autoimmuna sjukdomar som kännetecknas av skador på epitelet som bekläder/ utsöndringssystemet har rapporterats, innefattande Sjögrens syndrom, CREST-syndrom, autoimmun sköldkörtelsjukdom och reumatoid artrit. Uppmärksamhet avseende de drivande antigenen har fokuserat på mitokondriema under 50 år, vilket har lett till upptäckten av antimitokondrieantikroppen (AMA) (Gershwin et al.

Immunol Rev 1741210-225, 2000; Mackay et al. Immunol Rev 174:226-237, 2000). AMA blev snart en hörnsten för laboratoriediagnos av PBC och finns närvarande i serum hos 90-95 % av patienterna långt innan kliniska symptom uppträder. Autoantigena reaktíviteter i mitokondrien betecknades M1 och M2. M2-reaktivitet är riktad mot en familj av komponenter på 48-74 kDa. M2 representerar multipla autoantigena subenheter av enzymer från 2-oxosyradehydrogenaskomplexet (2- OADC) och är ett annat exempel på det kroppsegna protein, polypeptiden eller peptiden enligt föreliggande uppfinning. Studier som har identifierat vilken roll pyruvatdehydrogenaskomplexantigener (PDC- antigener) spelar vid etiopatogenesen hos PBC stödjer konceptet att PDV spelar en central roll för induktionen av sjukdomen (Gershwin et al. Immunol Rev l74:2l0-225, 2000; Mackay et al. Immunol Rev 1742226-23 7, 2000). Den vanligaste reaktiviteten i 95 % av PBC-fallen är E2 74 kDa-subenheten, vilken tillhör PDC-E2. Det finns relaterade, men skilda komplex vilka inkluderar: 2- oxoglutaratdehydrogenaskomplex (OGDC) och (BC) 2- OADC med grenad kedja. Tre ingående enzymer (El, 2,3) bidrar till den katalytiska funktionen, vilken är att omvandla Z-oxosyrasubstratet till acylkoenzym A (CoA), med reduktion av NADJ' till NADH. Däggdjurs-PDC innehåller ytterligare en komponent, vilken är benämnd protein-X eller E-3 -bindande protein: (E3BP). Hos PBC-patienter är det huvudsakliga antigensvaret riktat mot PDC-E2 och EBBP. E2-polypeptiden innehåller två tandem- upprepade lipoyldomäner, medan E3BP har en enkel lipoyldomän. Lipoyldomänen återfinns i ett antal autoantigena mål hos PBC och refereras till häri som ”PBC-lipoyldomänen”. PBC behandlas med glukokortikoider och immunsupprimerande ämnen, inkluderande metotrexat och cyklosporin A.

Sjögrens Syndrom. Sjögrens syndrom (SS) är en kronisk autoimmune sjukdom som huvudsakligen påverkar spottkörtlar och tårkörtlar, vilket leder till torra ögon (keratoconjunctivitis sicca) och muntorrhet (xerostomi). Andra organ som kan vara involverade inkluderar bronkträdet, njurar, lever, blodkärl, perifera nerver och bukspottskörteln. Den dubbla naturen hos SS är av särskilt intresse: antingen ensamt som en primär sjukdom hos kvinnor i 40- 50-års ålder (primär SS) eller i samband med andra autoimmuna sjukdomar (sekundär SS); glandulär (sicca-symptom) och systemisk (extraglandulär) där kliniska manifestationer kan finnas närvarande. Kännetecknande för SS är närvaron av reumatoida faktorer, antinukleära och precipiterande autoantikroppar. De 28 cytoplasmatiska/nukleära ribonukleoproteinpartiklarna (Ro/SSA och La/SSB) har en framträdande roll i det autoimmuna svaret hos SS. Andra antigener som är involverade i det positiva nukleära mönstret vid immunfluorescens inkluderar de följande: Ku, NOR-90 (nukleär organiserande region), p-80 coilin, HMG-l7 (high-mobility group), Ki/ SL. Vidare känns organspecifika autoantikroppar också igen, detta inkluderar antityroglobulin-, antierytrocyt- och anti-spottkörtelepitelantikroppar. (Översikt av Clio et al. Int Arch Allergy Immunol 123:46-57, 200). Ett 120-kD, organ-specifikt autoantigen, har identifierats som cytoskelettproteinet oc-fodrin (Haneji et al. Science 2762604-607, 1997). HSP60 är ett annat autoantigen som föreslagits vara involverat i SS. Immunisering med HSP60 eller en HSP60- härledd peptid (aminosyrarester 437-460) har visat sig reducera SS-relaterade histopatologiska egenskaper i en djurmodell av SS (Dalaleu et al. Aithritis Rheum 5822318-2328, 2008). De dominanta målantigenema Ro/SSA, La/SSB och deras motsvarande antikroppar har definierats i detalj på molekylär nivå. Ro/SSA är ett ribonukleoprotein innehållande små, cytoplasmatiska RNA-molekyler.

Proteinkomponenten i Ro/SSA-antigenet, ett protein på 60 kD (60-kD Ro/SSA, Ro60) är bundet till en av flera små cytoplasmatiska RNA-molekyler. En peptid på 52 kD är en annan komponent av Ro/SSA-antigener (52-kD Ro/SSA; Ro52). La/SSB-antigen är sammansatt av en polypeptid som består av 408 aminosyror. Både 60-kD Ro/SSA och La/SSB-proteiner är medlemmar av en familj med RNA-bindande proteiner som innehåller en sekvens på 80 aminosyror som är känd som RNA- igenkänningsmotivet (RNP). B-cellsepitopkartläggning av 60-kD Ro/SSA, 52-kD Ro/SSA och La/SSB-molekyler med användning av flera strategier har avslöjat specifika epitoper i flera studier. B- cellsepitoper hos 60-kD Ro/SSA-autoantigen verkar vara lokaliserade till den centrala regionen och den karboxiterminala delen hos molekylen. Två sjukdomsspecifika epitoper: TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) (SEK. ID. NR.:6) och regionen ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232) (SEK. 1D. NR.:7) har identifierats (Routsias et al. Eur J Clin Invest 26:514-521, 1996). De antigena determinantema hos 52-kD Ro/SSA-proteinet är huvudsakligen linjära och återfinns i den centrala delen av molekylen. Fyra peptider (aminosyror 2-11, 107-126, 277-292 och 365-382) har rapporterats kunna kännas igen av anti-Ro/SSA-sera (Ricchiuti et al. Clin Exp Immunol 95:397-407, 1994). Fyra starkt reaktiva peptider, med renat IgG, vilka spänner över regionema 145-164, 289-308, 301-320 och 349-368 hos La/SSB-proteinet, har rapporterats (Tzioufas et al. Clin Exp Immunol 108: 191-198, 1997).

Andra autoimmuna sjukdomar och associerade autoantigener. Autoantigener relaterade till myasthenia gravis kan inkludera epitoper inom acetylkolinreceptom. Autoantigener som är mål i pemfigus vulgaris skulle kunna inkludera desmoglein-3. Det dominanta autoantigenet för pemfigus vulgaris skulle kunna inkludera desmoglein-3. Paneler relaterade till myosit skulle kunna inkludera tRNA- syntetaser (t.ex. treonyl, histidyl, alanyl, isoleucyl och grycyl); Ku; ScI; SSA; Ul Sn ribonukleärt protein; Mi-I; Mi-I; Jo-I; Ku; och SRP. Paneler relaterade till skleroderini skulle kunna inkludera Scl- 70; centromer; Ul-ribonukleära proteiner; och fibrillarin. Paneler relaterade till pemiciös anemi skulle 29 kunna inkludera inre faktor; och glycoprotein-beta-subenhet av gastriskt H/K ATPas. Epitopantigener relaterade till systemisk lupus erythematosus (SLE) skulle kunna inkludera DNA; fosfolipider; nukleära antigener; Ro; La; Ul- ribonukleoprotein; Ro60 (SS-A); Ro52 (SS-A); La (SS-B); kalreticulin; Grp78; Scl-70; histon; Sm-protein; och kromatin, etc. För Graves sjukdom skulle epitoper kunna inkludera Na+/I-symporter; tyrotropinreceptor; Tg; och TPO.

Transnlantat-mot-värdsiukdom. En av de största begränsningarna vid vävnads- och organtransplantationer hos människor är avstötning av vävnadstransplantatet av mottagarens immunsystem. Det är välkänt att ju bättre matchningen mellan MHC klass I- och II-alleler (HLA- A, HLA-B och HLA-DR) mellan donator och mottagare är, desto bättre överlevnad för transplantatet.

Transplantat-mot-värdsjukdom (GVHD) orsakar en signifikant morbiditet och mortalitet hos patienter som erhåller transplantat som innehåller allogena hematopoetíska celler. Hematopoetiska celler finns närvarande i benmärgstransplantat, stamcellstransplantat och andra transplantat. Ungefär 50 % av patientema som mottar ett transplantat från ett HLA-matchat syskon kommer att utveckla måttlig till svår transplantat-mot-värdsjukdom och incidensen är mycket högre för icke-HLA-matchade transplantat. En tredjedel av patientema som utvecklar måttlig till svår transplantat-mot-värdsjukdom kommer att dö på grund av detta. T-lymfocyter och andra immunceller hos donatortransplantatet kommer att attackera mottagarens celler som uttrycker polypeptidvariationer i sina aminosyrasekvenser, i synnerhet variationer hos proteiner som kodar för av histokompabilitetskomplexgenema på kromosom 6 hos människor. De mest inflytelserika proteinema för transplantat-mot-värdsjukdom hos transplantat som berör allogena hematopoetíska celler är de mycket polymorfa (stor aminosyravariation mellan människor) klass I-proteinemas (HLA-A, -B och - C) och klass II-proteinerna (DRBl, DQBl och DPBl) (Appelbaum, Nature 411, 385-389, 2001). Även när MHC klass I-allelema är serologiskt “matchade” mellan donator och mottagare avslöjar DNA- sekvensering att det finns allel-skillnader i 30 % av fallen vilket ger en grund för klass l-driven transplantat-mot-värdsjukdom även hos matchade par av donator och mottagare (Appelbaum, Nature 411, 385-389, 2001). De mindre histokompatibilitetsantigenema självantingenema transplantat-mot- värdsjukdom orsakar ofta skador på huden, tarmar, lever, lungor och bukspottskörteln. Transplantat- mot-värdsjukdom behandlas med glukokortikoider, cyklosporin, metotrexat, fludarabin och OKT3.

Vävnadstransplantatavstötning. Immunologisk avstötning av vävnadstransplantat, inkluderande lunga, hjärta, lever, bukspottskörtel och andra organ och vävnader, förmedelas av immunsvar hos den transplanterade mottagaren, vilka är riktade mot det transplanterade organet. Allogent transplanterade organ innehåller proteiner med variationer i sina aminosyrasekvenser jämfört med aminosyrasekvensema hos transplantatmottagaren. Eftersom aminosyrasekvensen hos det transplanterade organet skiljer sig från den hos den transplanterade mottagaren utlöser de oña ett immunsvar hos mottagaren mot det transplanterade organet. Avstötning av transplanterade organ är en 30 allvarlig komplikation och begränsning av vävnadstransplantation och kan orsaka svikt hos det transplanterade organet hos mottagaren. Den kroniska inflammationen som blir ett resultat av avstötningen leder ofta till dysfunktion hos det transplanterade organet. Transplantatmottagare får för närvarande behandlingar med en mängd immunsupprimerande ämnen för att förhindra och hämma avstötning. Dessa ämnen inkluderar glukokortikoider, cyklosporin A, Cellcept, FK-506 och OKT3.

Komposítioner och förfaranden för behandling Föreliggande uppfinning tillhandahåller förbättrade förfaranden och kompositioner för behandling, profylax och/eller prevention av autoimmuna eller allergiska sjukdomar, vilket innefattar ett immunmodulerande komplex innefattande en eller flera epitoper som är associerade med sjukdomen.

Det immunmodulerande komplexet enligt den föreliggande uppfinning innefattar en eller flera epitoper som är associerade med den autoimmuna eller allergiska sjukdomen. Det förbättrade förfarandet enligt föreliggande uppfinning inkluderar administrationen av ett immunmodulerande komplex innefattande en eller flera epitoper som är associerade med sjukdomen.

I vissa utföringsforrner tillhandahåller den föreliggande uppfinningen förbättrade förfaranden för behandlingen och/eller preventionen av den autoimmuna sjukdomen diabetes mellitus (IDDM), vilket innefattar att administrera ett immunmodulerande komplex innefattande ett eller flera autoantigener associerade med diabetes mellitus (lDDM) till en individ.

Det immunmodulerande komplexet som administreras för att behandla eller förhindra diabetes mellitus(1DDM) skulle kunna inkludera autoimmuna epitoper som är härledda från en eller flera kroppsegna proteiner, till exempel preproinsulín, proinsulin, glutaminsyradekarboxylas-65 och -67 (GAD-65 och GAD-67); tyrosinfosfatas-IA-Z; öcellsspecifikt glukos-6-fosfatasrelaterat protein (IGRP); och/eller öcellsantigen 69 kD. Det immunmodulerande komplexet som administreras för att behandla eller förebygga IDDM skulle altemativt kunna inkludera flera autoimmuna epitoper som är härledda från samma eller olika kroppsegna proteiner, polypeptider eller peptider. I en föredragen utföringsforrn skulle det immunmodulerande komplexet som administreras för att behandla eller förebygga IDMM kunna inkludera autoimmuna epitoper som är härledda från den kroppsegna polypeptiden preproinsulin eller proinsulin.

I andra utföringsforrner av den föreliggande uppfinningen tillhandahålls förbättrade förfaranden för behandlingen, profylaxen och/eller preventionen av multipel skleros (MS), innefattande att administrera ett immunmodulerande komplex innefattande en eller flera autoantigena epitoper associerade med MS till en individ. Det immunmodulerande komplexet som administreras för att behandla MS skulle kunna inkludera en autoantigen epitop som är härledd från ett eller flera 31 kroppsegna proteiner, inkluderande men inte begränsat till: myelinbasalt protein (MBP), myelinoligodendrocytiskt glykoprotein (MOG), proteolipidprotein (PLP)5 myelinassocierat oligodendrocytiskt basalt protein (MOBP), myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG), och/eller myelinassocierat glykoprotein (MAG). Ett immunmodulerande komplex skulle altemativt kunna innefatta multipla autoantigena epitoper som är härledda från samma eller olika kroppsegna proteiner, polypeptider eller peptider som är associerade med sjukdomen.

I andra utföringsformer av den föreliggande uppfinningen tillhandahålls förbättrade förfaranden för behandling, profylax och/eller prevention av reumatoid artrit (RA), innefattande att administrera ett immunmodulerande komplex enligt uppfinningen innefattande en eller flera autoantigena epitoper associerade med RA till en individ. I vissa utföringsformer är den autoantigena epitopen en epitop som är härledd från kollagen av typ I, II, III, IV, V, IX, och XI, GP-39, filaggrin och fibrin. I en föredragen utföringsforin är epitopen härledd från kollagen av typ II, epitopen är företrädesvis den delade immundominanta epitopen kollagen II-peptid, vilken innefattar aminosyror 260-273 (CII260-273 ), SEK. ID. NR.:5.

Altemativt kan multipla immunmodulerande komplex innefattande autoantigena epitoper som är härledda från olika kroppsegna polypeptider administreras.

I ytterligare en utföringsform tillhandahåller den föreliggande uppfinningen nukleinsyrasekvenser, inkluderande DNA- och RNA-sekvenser, vilka kodar för de immunmodulerande komplexen enligt uppfinningen, såväl som plasmider, vektorer och uttryckssystem innefattande dylika nukleinsyrasekvenser.

De immunomodulerande komplexen enligt uppfinningen kan produceras med rekombinant DNA- teknologi.

Tekniker för konstruktion av plasmider, vektorer och uttryckssystem och transfektion av celler är välkända inom teknikområdet och en fackman inom teknikområdet känner väl till de standardreferensmaterial som beskriver specifika betingelser och förfaranden.

Konstruktion av plasmidema, vektorema och uttryckssystemen enligt uppfinningen använder standardtekniker för ligering och restriktionsklyvning som är välkända inom teknikområdet (för en allmän beskrivning se t.ex. Ausubel, et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 1989; Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed. 2001).

Isolerade plasmider, DNA-sekvenser eller syntetiserade oligonukleotider klyvs, skräddarsys och återligeras till den önskade fomien. Sekvenser hos DNA-konstruktioner kan säkerställas genom 32 användning av t.ex. standardfiårfaranden for DNA-sekvenseringsanalys (se t.ex. Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467).

Ytterligare ett annat lämpligt förfarande för att isolera specifika molekyler är med hjälp av polymeraskedjereaktion (PCR) (Mullis et al. Methods Enzymol 1551335-350, 1987) eller omvänd transkriptions-PCR (RT-PCR). Specifika nukleinsyrasekvenser kan isoleras från RNA med RT-PCR.

RNA isoleras till exempel från celler, vävnader eller hela organismer med tekniker som är kända för fackmän inom teknikområdet. Komplementärt DNA (cDNA) generera sedan med användning av poly- dT- eller slumpmässiga hexamerprimrar, deoxinukleotíder och ett lämpligt omvänt transkriptasenzym.

Den önskade polynukleotiden kan sedan amplifieras från det genererade cDNA:t med PCR.

Polynukleotiden av intresse kan altemativt amplifieras direkt från ett lämpligt cDNA-bibliotek.

Primrar som hybridiserar med både 5'- och 3'-ändama hos polynukleotidsekvensen av intresse syntetiseras och används for PCR-reaktionen. Primama kan också innehålla specifika restriktionsenzymsekvenser vid 5'-änden for enkel klyvning och lingering av amplifierade sekvenser in i liknande restriktionsklyvda plasmidvektorer.

T illförsel av immunomodulerande komplex Terapeutiskt och profylaktiskt effektiva mängder av ett immunmodulerande komplex ligger i intervallet ungefär 1 pg till ungefär 10 mg. En föredragen terapeutiskt eller profylaktiskt effektiv mängd ligger i intervallet mellan ungefär 5 pg till ungefär 1 mg. En mest fóredragen terapeutisk mängd av immunmodulerande komplex ligger i intervallet mellan 10 pg till 100 pg. I vissa utforingsforrner administreras det immunmodulerande komplexet månadsvis under 6-12 månader och sedan var tredje till tolfte månad som en underhållsdos. Altemativa behandlingsregimer kan utvecklas och kan sträcka sig från dagligen, till veckovis, till varannan månad, till årligen, till en engångsadministration, beroende på svårighetsgraden hos sjukdomen, patientens ålder, det immunmodulerande komplexet som administreras och dylika andra faktorer som skulle övervägas av den behandlande läkaren.

I en utfóringsform administreras det immunmodulerande komplexet intranasalt. I andra variationer tillförs det immunmodulerande komplexet oralt, sublingualt, subkutant, transkutant, intradermalt, via mukosan eller intramuskulärt.

Form uleríng Det immunmodulerande komplexet kan administreras i kombination med andra substanser, så som till exempel farrnakologiska ämnen, adjuvanser, cytokiner eller immunstimulerande komplex (ISCOMS). 33 EXEMPEL De följande exemplen är specifika utföríngsfonner för att utföra den föreliggande uppfinningen. Dessa exempel tillhandahålls endast i ett illustrerande syfte och är inte avsedda att begränsa omfånget hos den föreliggande uppfinningen på något sätt.

Exempel 1. Immunomodulerande komplex K-CT A 1-R 7K/C18 7A-COL-DD Konstruktion av CTAl-DD-mutanter, uttryck och rening av fusionproteiner utfördes väsentligen enligt beskrivning av Ågren (J Immunol 1999, 162: 2432-2440). pCTAl -DD-plasmiden innehåller koleratoxin-Al-genen (aminosyra 1-194) klonad vid HindIII- BamHI och DNA som kodar för två D-fragments från stafylokockprotein A-genen under kontroll av trp-promotom. DNA som kodar för en kollagenpeptid, den delade immundominanta kollagen-II- peptiden (CII260-273) infogades mellan DNA som kodar för CTA1 och DD-gruppema, vilket resulterar i pCTAl-COL-DD-plasmiden. R7K- och C187A-mutationema konstruerades med in vitro- mutagenes, vilket resulterade i plasmiden pK-CTA1-R7lUC187A-COL-DD (Figur 1).

Exempel 2. Jämförelse av de terapeutiska effektema hos CTA1-R7K-COL-DD och K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD i mus-CIA-modellen.

Mus-CIA-modellen för RA användes för att jämföra intranasala behandlingar med CTA1-R7K-COL- DD och K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD-tolerogen. CIA-modellen delar ett antal kliniska, histologiska och immunologiska särdrag med RA och det är därför den mest använda modellen för att testa potentiella terapeutisk ämnen mot RA. DBA1-möss fick en primär immunisering med kollagen av typ II från kyckling i Freunds kompletta adjuvans (FCA) följt av en boosterdos med F reunds inkompletta 5-adjuvans (IFA) dag 21. Mössen behandlades intranasalt med PBS, CTA1-R7K-COL- DD eller K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD innan och/eller efter booster-immuniseringen. Mössen följdes sedan avseende incidensen av och svårighetsgraden hos artrit med användning av ett poängsystem för artrit.

Den terapeutiska effekten hos K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD var signifikant bättre än den terapeutiska effekten hos CTA1-R7K-COL-DD, vilket ses som en minskning i svårighetsgraden (Figur 2A) och incidensen (Figur 2B) hos CIA jämfört med kontrollgrupp (PBS). 34 Artritindex för PBS-kontrollgruppen ökade dramatiskt tre veckor efter kollagenimmuniseringama och nådde en topp vid 6 veckor. I CTA1-R7K-COL-DD-gruppen kunde en svag ökning av artritindex observeras. I motsats till detta fick K-CTA1-R7K/Cl87A-COL-DD-gruppen signifikant lägre artritindex och många djur hade inga symptom alls.

Exempel 3 Jämförelse av de terapeutiska effektema hos CTA1-R7K-COL-DD och K-CTAl-R7K/C1 87A-COL-DD i CAIA-musmodellen.

Kollagenantikroppsinducerad artrit (CAIA) inducerades i Balb/c-möss (Taconic, Danmark) dag O genom en intravenös injektion av en blandning av monoklonala antikroppar mot kollagen II (ArthritoMab cocktail: Dl, F10, A2 och D8; MD Biosciences, Zürich, Schweiz) vid en doseringsnivå på 2 mg/mus. Dag 3 injicerades lipopolysackarid (LPS) (ArthritoMab kit, MD Biosciences) intraperitonealt för att förstärka incidensen och svårighetsgraden hos sjukdomen (50 ug/mus).

Mössen behandlades intranasalt dag -2, 0, +3 med 5 pg K-CTAl-R7K/C187A-COL-DD eller CTA1- R7K-COL-DD i 20 ul PBS.

Dag 4 började alla möss visa tecken på sjukdom (inga data visas). I PBS-kontrollgruppen och i gruppen som behandlades med CTA1-R7K-COL-DD steg artritindexet dramatiskt 7 dagar efter immunisering. I gruppen som behandlades med K-CTA1-R7K/C187A-COL-DD var ökningen av artritindex emellertid signifikant lägre genom hela experimentets förlopp. 35

Claims (1)

1. KRAV Immunomodulerande komplex, vilket är ett fusionsprotein innefattande: (a) en muterad subenhet av den ADP-ribosylerande Al-subenheten från koleratoxinet (CTA1) (b) en peptíd med förmågan att binda till en specifik cellulär receptor och (c) en eller flera epitoper som är associerade med en autoimmun sjukdom eller allergisk sjukdom, varvid aminosyroma som motsvarar aminosyra 7 arginin och aminosyra 187 cystein i det naturligt förekommande CTAl har ersatts i den muterade CTAl-subenheten. Immunmodulerande komplex enligt krav l, varvid den muterade CTAl-subenheten är CTAl - R7K/C187A-mutanten, SEK. ID. NR.: l. Immunmodulerande komplex enligt krav l, varvid aminosyran lysin vidare har infogats vid N- terminalen hos den muterade CTAl-subenheten. Immunmodulerande komplex enligt krav 3, varvid den muterade CTAl-subenheten är K- CTA1-R7IUCl87-mutanten, SEK. ID. NR.:2 Immunmodulerande komplex enligt något av krav l till 4, varvid en eller flera av epitopema är autoimmuna epitoper som är associerade med en autoimmun sjukdom. Immunmodulerande komplex enligt krav 5, varvid den autoimmuna sjukdomen är vald från insulinberoende diabetes mellitus, multipel skleros, reumatoid artrit, autoimmune uveit, primär biliär cirros, myasthenia gravis, Sjögrens syndrom, pemfigus vulgaris, skleroderrni, pemiciös anemi, systemisk lupus erythematosus och Graves sjukdom. Immunmodulerande komplex enligt något av krav 1 till 4, varvid en eller flera av epitopema är allergiframkallande epitoper som är associerade med en allergisk sjukdom. Immunmodulerande komplex enligt krav 7, varvid den allergiska sjukdomen är vald från allergisk astma, allergisk rinit, atopisk dermatit och fódoämnesöverkänslighet. Immunmodulerande komplex enligt något av krav 1 till 8, varvid peptiden är en peptíd som specifikt binder till en receptor som uttrycks på en cell med förmågan till antigenpresentation. 36 10. ll. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Immunmodulerande komplex enligt krav 9, varvid fusionsproteinet innefattar en peptid vilken specifikt binder till en receptor som uttrycks på en cell som uttrycker MHC klass I- eller MHC klass II-molekyler. Immunmodulerande komplex enligt krav 10, varvid fusionsproteinet innefattar en peptid vilken specifikt binder till en receptor som uttrycks på en cell som är vald från gruppen som utgörs av lymfocyter, så som B-lymfocyter, T-celler, monocyter, makrofager, dendrítiska celler, Langerhansceller, epitelceller och endotelceller. Immunmodulerande komplex enligt krav ll, varvid nämnda peptid utgörs av protein A eller ett fragment därav i en eller multipla kopior, så som en eller flera D-subenheter därav. Immunmodulerande komplex K-CTA1-R7IUCl87A-COL-DD SEK. ID. NR.:4. Isolerad nukleinsyra vilken kodar för ett immunmodulerande komplex enligt något av krav 1 till 13. Uttryckssystem innefattande en nukleinsyra enligt krav 14. Transfekterad cell innefattande ett uttryckssystem enligt krav 15. Farmaceutísk komposition innefattande ett immunmodulerande komplex enligt något av krav 1 till 13. Farmaceutísk komposition enligt krav 17 for användning vid profylaxen, preventionen och/eller behandlingen av en autoimmun eller allergisk sjukdom. F armaceutisk komposition enligt krav 18, för användning vid profylaxen, preventionen och/eller behandlingen av en autoimmun sjukdom vald från insulinberoende diabetes mellitus, multipel skleros, reumatoid artrit, autoimmun uveit, primär biliär cirros, myasthenia gravis, Sjögrens syndrom, pemfigus vulgaris, sklerodermi, pemiciös anemi, systemisk lupus erythematosus och Graves sjukdom. Farmaceutísk komposition enligt krav 18, för användning vid profylaxen, preventionen och/eller behandlingen av en allergisk sjukdom vald från allergisk astma, allergisk rinit, atopisk dermatit och födoämnesöverkänslighet. 37 21. 22. 23. 24. 25. 26. Användning av ett immunmodulerande komplex enligt något av krav 1 till 13 för framställningen av en medicinsk produkt för profylaxen, preventionen och/eller behandling av en autoimmun eller allergisk sjukdom. Användning enligt krav 21, varvid den autoimmuna sjukdomen är vald från insulinberoende diabetes mellitus, multipel skleros, reumatoid artrit, autoimmun uveit, primär biliär cirros, myasthenia gravis, Sjögrens syndrom, pemflgus vulgaris, skleroderrni, pemiciös anemi, systemisk lupus erythematosus och Graves sjukdom. Användning enligt krav 21, varvid den allergiska sjukdomen är vald från allergisk astma, allergisk rinit, atopisk dermatit och fódoämnesöverkänslighet. Förfarande for profylax, prevention och/eller behandling av en autoimmun eller allergisk sjukdom hos en individ där förfarandet innefattar: att administrera en effektiv mängd av ett immunmodulerande komplex enligt något av krav 1 till 13 till en individ. Förfarande enligt krav 24, varvid den autoimmuna sjukdomen är vald från insulinberoende diabetes mellitus, multipel skleros, reumatoid artrit, autoimmun uveit, primär biliär cirros, myasthenia gravis, Sjögrens syndrom, pemfigus vulgaris, sklerodermi, pemiciös anemi, systemisk lupus erythematosus och Graves sjukdom. F örfarande enligt krav 24, varvid den allergiska sjukdomen är vald från allergisk astma, allergisk rinit, atopisk dermatit och fódoämnesöverkänslighet. 38