JP2011116719A

JP2011116719A - Ｈｌａ−ｄｒ４エピトープの同定と、関節炎治療への応用

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Publication number: JP2011116719A
Application number: JP2009277392A
Authority: JP
Inventors: Hirofumi Shoda; 宏文庄田; Keishi Fujio; 圭志藤尾; Kazuhiko Yamamoto; 一彦山本
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-06-16
Also published as: WO2011071039A1

Abstract

【課題】本発明は、HLA-DR4またはHLA-DR1などのRA感受性MHCクラスII分子がCD4陽性T細胞に対して提示する、特定の抗原ポリペプチド（エピトープ）のアミノ酸配列構造を明らかにするとともに、その様なエピトープを使用した関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患の予防または治療のための新たな手段を開発することを課題とする。
【解決手段】本発明においては、アミノ酸配列：X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）からなる特定のアミノ酸配列モチーフを含み、全長12〜20アミノ酸残基からなるポリペプチドがHLA-DR4またはHLA-DR1により提示されるエピトープであることを明らかにすることにより、上述した課題を解決することができることを明らかにした。
【選択図】なし

Description

本発明は、HLA-DR4の未知のエピトープを同定すること、そして同定されたエピトープを使用して、関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を治療または予防することに関する。

関節リウマチ（Rheumatoid arthritis：RA）は、関節滑膜の炎症・増殖、骨・軟骨の破壊、ひいては関節の変形を特徴とする、炎症性の疾患である。この疾患原因は完全には解明されていないものの、遺伝による体質に何らかの環境因子の刺激が加わって、免疫に異常が生じて起こる自己免疫疾患のひとつと考えられている。

現在のRAの治療指針では、出来るだけ早期に疾患修飾性抗リウマチ薬（Disease modifying anti-rheumatic drugs：DMARDs）や生物学的製剤を用いることが推奨されており、同時に対症療法として非ステロイド系消炎鎮痛剤（NSAIDs）などを用いることが一般的に行われている。しかしながら、これらの治療方法では、患者の3割程度が治療薬を用いても十分な改善効果が得られないことが知られており、疾患の原因のみを抑制する抗原特異的な免疫抑制など疾患の原因そのものを治療することができる治療方法の開発が望まれている。

RAを起こした個体において、環状シトルリン化ペプチド（Cyclic Citrullinated Peptide:CCP）に対する抗体、抗CCP抗体が産生されることが知られている。この抗CCP抗体は、RAに極めて特異性が高い自己抗体であり、血中での抗CCP抗体の存在が陽性である場合、97％程度の確度で個体が関節リウマチであるとの診断をすることができることが知られている。この抗CCP抗体は、RA発症個体においてはもちろんのこと、RA発症前の個体中においても、既に出現しており、発症が近づくにつれて、抗CCP抗体の陽性率が高まっていくことも知られている（Nielen MM et al., Arthritis Rheum., 2004, 50, pp 380-386）。また、抗CCP抗体を実験的に投与した場合に、実験的関節炎が憎悪することも明らかになった（Kuhn KA et al., J. Clin. Invest., 2006, 116, 961-973）。抗CCP抗体は、この様な特徴を有していることから、RAの診断用マーカーの一つとして利用されている。しかしながら、早期のRA個体の検出のためには感度が不十分であるという問題点があることが知られている。

近年、RAの原因となる遺伝子的背景の解析が進み、CD4陽性T細胞に対して抗原提示を行い活性化を誘導する機能を持つMHCクラスII分子の一つであるHLA（ヒト白血球抗原 Human leukocyte antigen：HLA）-DRのセロタイプがHLA-DR4またはHLA-DR1である場合に、RAを発症しやすい傾向があることが示されている。このことから、RAの発症に際してCD4陽性T細胞の関与が疑われている。そして、HLA-DRのβ鎖の一つ、HLA-DRB1の特定の遺伝子型である、HLA-DRB1*0401（欧米)やHLA-DRB1*0405（アジア)、HLA-DRB1*0101（イスラエル）の保有率とRAの発症との間で正の相関性があることが示された。特定の抗原由来ポリペプチド（エピトープ)がHLA-DR4またはHLA-DR1などのRA感受性MHCクラスII分子により提示され、それをCD4陽性T細胞が認識した結果、免疫異常を生じRAを発症すると想定されているものの、これらのHLA-DR4またはHLA-DR1が、どのようなエピトープを認識し提示しているかは、全く知られていない。

一方、RAとの関連が知られているタンパク質として、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Binding protein of immunoglobulin heavy chein: BiP）の存在が知られている。このBiPは、78 kDaの熱ショックタンパク（Heat shock protein: HSP）70ファミリーに属する分子であり、RA患者の滑膜において過剰発現されているタンパク質である。このBiPに対する抗体は、対症個体と比較してRA患者個体において顕著に増加しており、具体的にはRA患者の60〜70％において抗BiP抗体が出現し、BiPに対するT細胞増殖反応も生じることが明らかにされた（Blass S et al., Arthritis Rheum., 2001, 44, pp 761-771）。しかしながら、BiPがどのような作用機序により関節リウマチに関連しているのかについては知られていない。

Nielen MM et al., Arthritis Rheum., 2004, 50, pp 380-386 Kuhn KA et al., J. Clin. Invest., 2006, 116, 961-973 Blass S et al., Arthritis Rheum., 2001, 44, pp 761-771

本発明は、HLA-DR4またはHLA-DR1などのRA感受性MHCクラスII分子がCD4陽性T細胞に対して提示する、特定の抗原ポリペプチド（エピトープ）のアミノ酸配列構造を明らかにするとともに、その様なエピトープを使用した関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患の予防または治療のための新たな手段を開発することを課題とする。

本発明においては、アミノ酸配列：X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）からなる特定のアミノ酸配列モチーフを含み、全長12〜20アミノ酸残基からなるポリペプチドがHLA-DR4またはHLA-DR1により提示されるエピトープであることを明らかにすることにより、上述した課題を解決することができることを明らかにした。

すなわち、本発明は、以下の式からなるアミノ酸配列：
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）
を含み、全長12〜20アミノ酸残基からなるポリペプチドを提供することにより、上記の課題を解決することができることを示した。

本発明はまた、このようにして得られたSEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することにより、関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防または治療することができることを明らかにし、このポリペプチドを含む関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することができることを示した。

本発明はさらに、上述のポリペプチドまたは当該ポリペプチドを細胞内で発現するための核酸構築物を投与することにより、このポリペプチドに対する免疫寛容を生じさせることができることを明らかにし、上述のポリペプチドまたは当該ポリペプチドを細胞内で発現するための核酸構築物を含む関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防するためのワクチン組成物を提供することができることを示した。

このようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを経口投与して経粘膜感作することにより、関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防または治療する効果を発揮することができる。また、このようなポリペプチドを、関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防するためのワクチン組成物として使用することもできる。

図1は、HSP70ファミリーのヒトBiPおよびマイコバクテリウムmycHSP70から得られた20アミノ酸のポリペプチドに対するRA末梢血単核球の増殖応答を示す図である。図2は、有意なRA末梢血単核球増殖を引き起こしたBiP由来B22ポリペプチド、およびmycHSP70由来D21ポリペプチドが、試験管内においてHLA-DR4分子に対する陽性コントロールポリペプチドの結合を強く阻害することより、HLA-DR4に対してこれらのポリペプチドが顕著に高い結合能を有することを示す図である。図3は、B22ポリペプチド（図3A）およびD21ポリペプチド（図3B）のHLA-DR4に対する結合能に対して重要な役割を果たすアミノ酸を示す図である。図4は、B22ポリペプチド（図4A）およびD21ポリペプチド（図4B）の20アミノ酸のうち、HLA-DR4への結合に大きく関与するアミノ酸の領域を示す図である。図5は、HLA-DR4に対して結合するエピトープの配列の概要を示す図である。図6は、関節炎誘発のためのウシII型コラーゲン免疫の前にB22ポリペプチドまたはD21ポリペプチドを経口投与して経口免疫寛容誘導を行った場合の、関節炎発症への予防効果を示す図である。図7は、II型コラーゲン免疫の前にB22ポリペプチドまたはD21ポリペプチドを投与して経口免疫寛容誘導を行った場合の、CD4+ T細胞のII型コラーゲンおよびB22ポリペプチド刺激に対する増殖反応が顕著に低下することを示す図である。図8は、II型コラーゲン免疫の前にB22ポリペプチドまたはD21ポリペプチドを投与して経口免疫寛容を行った場合に、自己抗体が減少することを示す図である。図9は、II型コラーゲン免疫による関節炎発症の後に、B22ポリペプチドまたはD21ポリペプチドを投与した場合の、関節炎悪化への治療効果を示す図である。図10は、II型コラーゲン免疫による関節炎発症の後に、B22ポリペプチドまたはD21ポリペプチドを投与した場合に、所属リンパ節における制御性T細胞の増加を示した図である。図11は、DBA/1JマウスのCD4+CD25+T細胞、およびCD4+CD25-T細胞をB22ポリペプチドまたはD21ポリペプチドと培養した場合に、CD4+CD25+T細胞が反応して増殖していることを示す図である。

本発明の発明者らは、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（BiP）の部分ポリペプチドがHLA-DR4またはHLA-DR1などのRA感受性MHCクラスII分子と強く結合することにより抗原提示されることを明らかにし、この結果、HLA-DR4またはHLA-DR1などがCD4陽性T細胞に対して提示する特定の抗原ポリペプチド（エピトープ）のアミノ酸配列構造を明らかにするとともに、その様なエピトープを使用した関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患の予防または治療のための新たな手段を開発したことに基づいて、本発明を完成するに至った。

本発明の一態様において、以下の式からなるアミノ酸配列：
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）
を含み、全長12〜20アミノ酸残基からなるポリペプチドを提供する。

この式中、X1〜X12は、それぞれアミノ酸を規定しており、それぞれは以下の通り定義される：
X1はMet（M）またはArg（R）から選択され、
X2はLys（K）であり、
X3はPro（P）であり
X4は、Phe（F）、Val（V）、Trp（W）、Tyr（Y）、Ile（I）、Leu（L）、またはMet（M）から選択され；
X5は、Gln（Q）、Arg（R）、Val（V）、Ile（I）、Lys（K）、またはLeu（L）から選択され；
X6は、Lys（K）、Ser（S）、Ile（I）、Met（M）、Leu（L）、Phe（F）、またはTyr（Y）から選択されるが、ただしAsp（D）またはGlu（E）ではなく；
X7は、Val（V）、Asp（D）、Met（M）、Ser（S）、Glu（E）、His（H）、Ile（I）、またはThr（T）から選択され；
X8は、Leu（L）、Ile（I）、Thr（T）、Pro（P）、Ser（S）、Val（V）、Phe（F）、Lys（K）、またはMet（M）から選択され；
X9は、Glu（E）、Ala（A）、Thr（T）、Ser（S）、Asn（N）、Val（V）、またはPro（P）から選択され；
X10は、Asp（D）、Met（M）、Val（V）、Leu（L）、またはAla（A）から選択され；
X11は、Ser（S）、Thr（T）、Gln（Q）、Tyr（Y）、Lys（K）、Asn（N）、Leu（L）、またはTrp（W）から選択され；そして
X12は、Asp（D）、Gly（G）、Ser（S）、Gln（Q）、Val（V）、His（H）、またはAla（A）から選択される。

ここで、X4は、Phe（F）またはVal（V）であることが好ましい；X7はVal（V）であることが好ましい；そしてX10はAsp（D）であることが好ましい。X4、X7およびX10の3つのアミノ酸部位に好ましいアミノ酸が存在する場合、X1 X2 X3-Phe-X5 X6-Val-X8 X9-Asp-X11 X12またはX1 X2 X3-Val-X5 X6-Val-X8 X9-Asp-X11 X12という、アミノ酸配列構造モチーフを有することとなる。

SEQ ID NO: 1により規定されるポリペプチドには、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（BiP、GenBank AFF13605（AF188611.1）、SEQ ID NO: 2および3）の部分ペプチド、MKPVQKVLEDSD（SEQ ID NO: 21）またはBiPのマイコバクテリウム（Mycobacterium tuberculosis）相同ポリペプチドであるmycHSP70（DNAKとも呼ばれる、GenBank CAD93221のアミノ酸配列、GenBank BX248335.1のヌクレオチド配列の77864〜79741番ヌクレオチドに相当、SEQ ID NO: 4および5）の部分ペプチド、RKPFQSVIADTG（SEQ ID NO: 23）を含む、全長12〜20アミノ酸残基からなるポリペプチドが含まれる（ここで、下線を引いたアミノ酸が、それぞれX4、X7およびX10に相当する）。これらの具体的なアミノ酸配列を有するポリペプチドは、実際にHLA-DR4またはHLA-DR1と結合することができた。そこで、これらの具体的なアミノ酸配列に基づいて、HLA-DR4と結合することができるポリペプチドのアミノ酸配列を、公知のエピトープ配列予測アルゴリズム（Hammer J, et al. J Exp med 1994; 180: 2353-8）を利用して予測したところ、SEQ ID NO: 1のX1〜X12として利用可能なアミノ酸候補が上記に定義したアミノ酸が使用された場合にも、これらの具体的なアミノ酸配列で規定されるポリペプチドと同様の活性を有することが示された。

このようにして定義されるポリペプチドは、HLA-DR4またはHLA-DR1などのRA感受性MHCクラスII分子と結合することができ、その結合の結果として、CD4陽性T細胞に対して結合されたポリペプチドを抗原提示することができる。すなわち、この定義されるポリペプチドは、HLA-DR4またはHLA-DR1などのRA感受性MHCクラスII分子のエピトープとして機能することができる。HLA-DR4またはHLA-DR1が関連することが知られている疾患には、関節リウマチ（RA）の他、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（1型糖尿病）、または多発性硬化症などが知られている。これらの疾患は、いずれもHLA-DR4またはHLA-DR1がエピトープにより刺激されることにより、結果的にCD4+ T細胞の活性化を通じて、生じると考えられている。

本発明は一態様において、本願明細書において定義されるX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用して、生体内においてこのポリペプチドに対する自己免疫反応を生じさせることなく、免疫寛容を生じさせることができる。このポリペプチドに対する免疫寛容を生じさせる方法としては、当該技術分野において一般的に使用されている方法のいずれを使用してもよく、例えば、抗原となるポリペプチドを経口摂取することによりその抗原への免疫寛容を成立させる方法、または、抑制性の機能を有する樹状細胞に提示された形での経静脈投与を利用することができる。

このような特徴を利用して、本発明は一態様において、本願明細書において定義されるX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは当該ポリペプチドを細胞内で発現するための核酸構築物を含む、関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。前述したように、HLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患には、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（1型糖尿病）、または多発性硬化症などが存在しており、ここで提供される医薬組成物を使用することにより、HLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患としては、関節リウマチ、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（1型糖尿病）、または多発性硬化症などの疾患を治療することができる。

本発明は別の一態様において、本願明細書において定義されるX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは当該ポリペプチドを細胞内で発現するための核酸構築物を含む、関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防するためのワクチン組成物を提供する。このワクチン組成物により、上述したとおり、関節リウマチの他に、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（1型糖尿病）、または多発性硬化症などの疾患もまた、予防することができる。生体内においてこのポリペプチドに対する抗体を形成することにより、RAなどのHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患の患者の体内でのBiPとHLA-DR4またはHLA-DR1とのあいだでの結合を阻害し、結果としてBiPのHLA-DR4またはHLA-DR1への結合により生じるRAなどのHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患の発症のカスケードを遮断することができる。

ここで、生体外で調製されたX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与する場合、例えば関節リウマチの場合、その罹患部位（例えば、各関節）に当該ポリペプチドを送達することができるいずれの方法ならびに投与経路を使用することができ、例えばリポソーム等の脂質中に目的とするポリペプチドを封入、あるいはアンテナペディア配列と融合するなどの修飾を付加した細胞浸透性合成ポリペプチドにし、これを静脈内または筋肉内から投与することができる。

また、X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を細胞内に導入し、細胞内で目的とするポリペプチドを産生することができる。この場合、X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを細胞内で発現するための構築物は、遺伝子治療を目的としたものであればウィルスや発現ベクターなどどのような構築物であってもよく、例えば、遺伝子治療に使用するために好ましいレンチウィルス（Invitrogen）などを使用することができる。例えばベクターの場合にはリポソームなどの脂質膜中に目的とするベクターを封入して、あるいはウィルスの場合にはそのまま、静脈内または筋肉内から投与することができる。

本発明においては、X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列に基づいて、当該アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を調製することができる。例えば、X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列としてMKPVQKVLEDSD（SEQ ID NO: 21）を使用する場合、この配列を有するポリペプチドをコードする核酸には、atgaagcccg tccagaaagt gttggaagat tctgat（SEQ ID NO: 20）のヌクレオチド配列またはそれと縮重の関係にあるヌクレオチド配列が含まれる。また、X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列としてRKPFQSVIADTG（SEQ ID NO: 23）を使用する場合、この配列を有するポリペプチドをコードする核酸には、cgcaagccgt tccagtcggt gatcgctgac accggc（SEQ ID NO: 22）のヌクレオチド配列またはそれと縮重の関係にあるヌクレオチド配列が含まれる。本発明においては、それ以外のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸もまた、使用することができる。

これらの核酸は、いずれもX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることを特徴としており、当該核酸を組換え発現ベクター中に組み込んでまたは組換えウィルス中に組み込んで、in vitroまたはin vivoにて細胞にトランスフェクションすることにより、X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現することができる。したがって、本発明においては、これらの核酸を発現可能に含有する組換え発現ベクターまたはこれらの核酸を発現可能に含有する組換えウィルスもまた、提供することができる。このような組換え発現ベクターまたは組換えウィルスは、当該技術分野における周知の方法を用いて作製することができ、そしてこれらをin vitroでの本発明のポリペプチド産生のため、または関節リウマチを初めとしたHLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患の遺伝子治療において使用することができる。

本発明の組換え発現ベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、pREP9ベクター（Invitrogen）、pCDNA3.0ベクター（Invitrogen）、pCDNA3.1ベクター（Invitrogen）などがあるが、これらのものには限定されない。本発明の組換え発現ウィルスを作製するために使用することができるウィルスとしては、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス（Invitrogen）、レンチウイルスなどがあるが、これらのものには限定されない。

実施例1：HLA-DR4エピトープの探索
本実施例は、HLA-DR4のエピトープを探索することを目的として実験を行った。
まず、HLA-DR4陽性の関節リウマチ患者15名から、静脈血を採血し、Ficoll-Paqueにより密度遠心することにより末梢血単核細胞を分離し、RPMI1640（Gibco）＋10％ヒト血清を使用して1×10⁵ cells/0.1 mL/wellの濃度の細胞懸濁液を調製し、これを96 well細胞培養プレート（Corning）に100μlずつ播種した。37℃、5％CO₂、加湿条件の培養条件下で、抗原培養ポリペプチド10μMと共に96時間培養したのち、³[H]-チミジンを添加し、18時間後に取り込みを測定した。

添加したポリペプチドはヒトBiPについてはGenBank AF188611.1（SEQ ID NO: 2）に基づいて、そしてマイコバクテリウムHSP70であるmycHSP70（DNAK）についてはGenBank BX248335.1のヌクレオチド配列の77864〜79741番ヌクレオチド（SEQ ID NO: 4）に基づいて、それぞれのアミノ酸配列（BiPについてはSEQ ID NO: 3（GenBank AFF13605）、mycHSP70についてはSEQ ID NO: 5（GenBank CAD93221））を5アミノ酸ずつの重なりを持って、そのC末端からN末端まで20アミノ酸刻みで分割したものを使用し、それぞれにヒトBiPは1〜42番、mycHSP70は1〜43番の番号を付けた。

抗原ポリペプチドなしのサンプルのチミジン取り込み量を1とし、抗原ポリペプチド添加サンプルでのチミジン取り込み量の相対値を、刺激インデックス（S.I.）として測定した（すなわち、刺激インデックス（S.I.）＝エピトープ-刺激PBMCチミジン取り込み／刺激なしのPBMCのチミジン取り込み）。BiPおよびmycHSP70のそれぞれに由来する各ポリペプチドついてのデータを、図1に示す。その結果、ヒトBiP由来のポリペプチドの中で最も強いチミジン取り込みを誘導したポリペプチドをB22ポリペプチド（RSTMKPVQKVLEDSDLKKSD、SEQ ID NO: 6）、マイコバクテリウムHSP70（mycHSP70）由来のポリペプチドの中で最も強いチミジン取り込みを誘導したポリペプチドをD21ポリペプチド（DRTRKPFQSVIADTGISVSE、SEQ ID NO: 13）と、それぞれ命名した。

次に、上記の方法により得られたB22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドが、HLA-DR4分子に対してどの程度の強度で結合することができるかについて、ペプチド結合アッセイを行った。試験管内で合成したHLA-DR4分子を、HLA-DR4分子と強く結合することが知られるビオチン化インフルエンザヘムアグルチニン（HA）由来ペプチド306-318（アミノ酸配列PKYVKQNTLKLAT、SEQ ID NO: 24）30 nMと、HA由来ペプチド306-318（陽性対照）、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1000 nMの濃度のB22ポリペプチドまたはD21ポリペプチド（試験群）、ならびにB22ポリペプチドとは5アミノ酸ずれた配列を有するB21ポリペプチド（NMDLFRSTMKPVQKVLEDSD、SEQ ID NO: 25、陰性対照）、とともに、PBS＋0.05％オクチル-グルコシド中で37℃で18時間反応させ、予め10μg/mLの濃度の抗HLA-DR抗体（LB3.1, ATCCより譲渡）にてコートした96穴プレート（Nunc）に結合させた後に、ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼ試薬（GE Healthcare）に反応させ、フェノールフタレインーリン酸（MBL）を用いて、競合後においてもなおHLA-DR4分子に対して結合しているビオチン化HA由来ペプチド306-318（SEQ ID NO: 24）から発光される蛍光発色の強度をルミノメーター（BioRad）を用いて測定した。

データは、陽性コントロールの蛍光強度を50％減少させる競合ポリペプチド濃度を、50％阻害濃度（IC50）として示した。結果を図2に示す。図2において示されるように、B22ポリペプチドは、HLA-DR4分子とのあいだで強力な結合を示し陽性対照として使用されたHAと比較してもほぼ同等の強度でHLA-DR4分子と結合することが示された。また、D21ポリペプチドは、B22ポリペプチドよりは弱いものの、B22ポリペプチドに準ずる強度でHLA-DR4分子と結合することが示された。これに対して、B22ポリペプチドと重複する領域のポリペプチド、B21ポリペプチドは、HLA-DR4分子との結合に関して、非常に弱い結合性しか有さないことが明らかになった。このことから、BiPタンパク質由来のB22ポリペプチド（RSTMKPVQKVLEDSDLKKSD、SEQ ID NO: 6）およびmycHSP70タンパク質由来のD21ポリペプチド（DRTRKPFQSVIADTGISVSE、SEQ ID NO: 13）は、HLA-DR4分子のエピトープとして機能することが示された。

実施例2：HLA-DR4エピトープの配列解析
本実施例は、HLA-DR4のエピトープとして特定されたB22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドのうち、機能的に重要なアミノ酸または領域を探索することを目的として実験を行った。

B22ポリペプチド（図3A）とD21ポリペプチド（図3B）のうち、ポリペプチドの中心部分のアミノ酸（それぞれの図において、下線で示した）を1アミノ酸ずつアラニンに置換したポリペプチドを作製し、それぞれのアラニン置換を加えたポリペプチドを6 nMまたは30 nMで培養液中に添加すること以外は実施例1（図2）と同様の方法で、各ポリペプチドのHLA-DR4分子への結合力を、ビオチン化HA由来ペプチド306-318（SEQ ID NO: 24）からの蛍光発色の強度として試験管内で測定した。得られたデータを図3に示す。この図において、データは蛍光強度で示してあり、すなわち蛍光強度が高いほうがインフルエンザHA由来ペプチド306-318とHLA-DR4分子との結合を妨害できない、すなわちHLA-DR4分子との結合力が弱い、と考えられる。図3AはB22ポリペプチドのアラニン置換を行った結果を示し、図3BはD21ポリペプチドのアラニン置換を行った結果を示す。

これらの結果から、B22ポリペプチドの場合には図3Aの矢印で示した2箇所のバリン（V）およびアスパラギン酸（D）がHLA-DR4分子との結合のために重要な役割を果たしており、D21ポリペプチドの場合には図3Bの矢印で示したフェニルアラニン（F）、バリン（V）およびアスパラギン酸（D）がHLA-DR4分子との結合のために重要な役割を果たしていることが明らかになった。B22ポリペプチド上の重要なアミノ酸の位置とD21ポリペプチド上の重要なアミノ酸の位置は、配列アラインメントを行った場合に対応した位置であることが明らかになった（図5）。

次に、図1および図2のスクリーニング段階で20アミノ酸であったポリペプチドのアミノ酸数を15アミノ酸まで短くした場合に、エピトープポリペプチドのHLA-DR4分子への結合力がどのように変化するかを、図2と同様の方法で測定した。

具体的には、B22ポリペプチド（SEQ ID NO: 6）の両端から合計5アミノ酸を除去した以下のポリペプチド：
B22Aポリペプチド：RSTMKPVQKVLEDSD（SEQ ID NO: 7）
B22Bポリペプチド：STMKPVQKVLEDSDL（SEQ ID NO: 8）
B22Cポリペプチド：TMKPVQKVLEDSDLK（SEQ ID NO: 9）
B22Dポリペプチド：MKPVQKVLEDSDLKK（SEQ ID NO: 10）
B22Eポリペプチド：KPVQKVLEDSDLKKS（SEQ ID NO: 11）
B22Fポリペプチド：PVQKVLEDSDLKKSD（SEQ ID NO: 12）
ならびに、D21ポリペプチド（SEQ ID NO: 13）の両端から合計5アミノ酸を除去した以下のポリペプチド：
D21Aポリペプチド：DRTRKPFQSVIADTG（SEQ ID NO: 14）
D21Bポリペプチド：RTRKPFQSVIADTGI（SEQ ID NO: 15）
D21Cポリペプチド：TRKPFQSVIADTGIS（SEQ ID NO: 16）
D21Dポリペプチド：RKPFQSVIADTGISV（SEQ ID NO: 17）
D21Eポリペプチド：KPFQSVIADTGISVS（SEQ ID NO: 18）
D21Fポリペプチド：PFQSVIADTGISVSE（SEQ ID NO: 19）
をそれぞれ作製した。

これらのポリペプチドをそれぞれ30 nMずつ培養液中に添加すること以外は実施例1（図2）と同様の方法で、各ポリペプチドのHLA-DR4分子への結合力を、ビオチン化HA由来ペプチド306-318（SEQ ID NO: 24）からの蛍光発色の強度として試験管内で測定した。得られたデータを図4に示す。この図において、データは蛍光強度で示す。図4AはB22ポリペプチドの短縮版ポリペプチド（B22Aポリペプチド〜B22Fポリペプチド）を用いて実験を行った結果を示し、図4BはD21ポリペプチドの短縮版ポリペプチド（D21Aポリペプチド〜D21Fポリペプチド）を用いて実験を行った結果を示す。

これらの結果から、B22ポリペプチドの場合にはB22EポリペプチドおよびB22Fポリペプチドで、そしてD21ポリペプチドの場合にはD21EポリペプチドおよびD21Fポリペプチドで、それぞれ蛍光強度が高くなる（すなわち、HLA-DR4分子との結合力が弱まった）ことが明らかになった。

従って、B22ポリペプチド上の重要なペプチド領域（MKPVQKVLEDSD、SEQ ID NO: 21）とD21ポリペプチド上の重要なペプチド領域（RKPFQSVIADTG、SEQ ID NO: 23）は、配列アラインメントを行った場合に対応した位置であることが明らかになった（図5）。

図5においては、前述の図1〜4の結果をまとめ、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチド配列の詳細を示したものである。
実施例3：HLA-DR4エピトープの免疫寛容誘導能
本実施例は、HLA-DR4のエピトープとして特定されたB22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドが、関節リウマチ誘発モデルにおいて、in vivoにおいて予防的な効果を発揮することができるか否かを調べることを目的として実験を行った。

DBA/1Jマウス（メス6週齢、日本SLC、各群8匹）に対して、PBS中B22ポリペプチドまたはD21ポリペプチド100μg（0.1 mL）を5日間連続（D1〜D5）で経口投与（内服）した後、7日目（D7）にウシII型コラーゲン100μg/50μLを等量の完全フロインドアジュバンドとともに皮下注射することによる関節炎誘発処理を行った。対照群に対しては、ポリペプチド溶液の代わりに同容量（0.1 mL）のPBSを投与した。その後、ポリペプチドの投与開始から24〜32日（D24〜D32）にかけて、これらのマウスについて関節炎スコアおよび関節炎の発生を調査し、平均関節炎スコアならびに平均関節炎発生率（％）を算出した。投与計画の概略ならびにこれらの実験の結果を図6に示す。この結果、陰性対照であるPBS投与群と比較して、実験群であるB22ポリペプチド投与群ならびにD21ポリペプチド投与群における平均関節炎スコアおよび平均関節炎発生率（％）がともに顕著に低下したことが示された。

次に、実験開始後35日目（D35）に、マウスを犠死させ、マウス脾臓から、マウスCD4+単離キット（ミルテニーバイオテク）によりCD4陽性T細胞を分離した。このCD4+ T細胞を、5×10⁵ cells/mLの濃度に調製したのち、1300 radの放射線処理をした抗原提示細胞（脾臓細胞）2.5×10⁶ cells/mLと、示してある抗原（培養時添加抗原）とともにRPMI1640（Gibco）＋10％ウシ胎児血清中で37℃、5％CO₂の条件下にて96時間培養後、³[H]-チミジンを添加し、18時間後に取り込みを測定した。ポリペプチド濃度は10μM、ウシII型コラーゲンは10μg/mLの濃度で添加した。この実験の結果を図7に示す。

図7において、チミジン取り込み（C.P.M.）のグラフ（左）及び、抗原無しのサンプルと比較したチミジン取り込みの相対量（Stimulatory index: S.I.）のグラフ（右）を示した。B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチド内服群のCD4+ T細胞は、PBS内服群と比較し、II型コラーゲンへの増殖反応が有意に抑制されていた。この結果はB22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドの内服により、関節炎を引き起こす免疫異常状態のうち、CD4陽性T細胞によるものを抑制することができたことを意味する。B22ポリペプチドまたはD21ポリペプチド添加条件下で細胞を培養した場合には、いずれの条件でもCD4+ T細胞の増殖活性は有意には観察されず、コラーゲン免疫下の状態においてはB22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドに対するT細胞の増殖反応は生じていないと考えられた。

次に、実験開始後35日目のマウス血清中の抗ウシII型コラーゲン抗体価および抗CCP抗体価をELISA法で測定した。マウスの尾静脈より20μLの血液を採取し、そこから血清を調製した。血清中の抗ウシII型コラーゲン抗体価は、96穴プレート（Nunc）にウシII型コラーゲン（Chondrex）を10μg/mLの濃度で吸着させた後に、100倍血清を添加し、結合したIgG抗体を抗マウス-IgG抗体-HRP（Zymed）を2次抗体として結合させ、TMB溶液（KPL）で発色させ、ルミノメーター（BioRad）により450 nMの吸光度にて測定した。血清中の抗CCP抗体価は、MESACUP CCPテスト（MBL）を用いて、10倍血清を反応させた後に、ルミノメーター(BioRad)により570 nMの吸光度にて測定した。これらの結果を図8に示す。この結果、B22ポリペプチドおよびD21ポリぺプチドを予め内服させた後に免疫した場合には、免疫抗原に対する抗体の出現を抑制できるとともに、関節炎の病態とも関与している抗CCP抗体の出現も抑制できたため、これらのB22ポリペプチドおよびD21ポリぺプチドの内服によりB細胞性の免疫異常を幅広く抑制できることが明らかとなった。

実施例4：HLA-DR4エピトープの関節炎治療効果
本実施例は、HLA-DR4のエピトープとして特定されたB22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドが、実際に誘発された関節リウマチモデルにおいて、in vivoにおいて治療的な効果を発揮することができるか否かを調べることを目的として実験を行った。

DBA/1Jマウス（メス6週齢、日本SLC、各群7匹）に対して、ウシII型コラーゲン100μg(50μL)を完全フロインドアジュバンド50μLとともに皮下注射した（D1）。関節炎発症日よりB22ポリペプチドまたはD21ポリペプチド100μgをPBS 100μLに溶解させたものを5日間連続で経口投与（内服）した。対照群に対しては、ポリペプチド溶液の代わりに同容量100μLのPBSを投与した。

その後、関節炎を発症したマウスの経過を各群について観察し、関節炎発症後の平均関節炎スコアをグラフに示した。投与計画の概略ならびにこれらの実験の結果を図9に示す。この結果、陰性対照であるPBS投与群と比較して、実験群であるB22ポリペプチド投与群ならびにD21ポリペプチド投与群における平均関節炎スコアが顕著に低下したことが示された。

次に、B22ポリペプチド投与群ならびにD21ポリペプチド投与群において平均関節炎スコアが顕著に低下した理由が、体内でのどのような生理学的機序によるものであるかを確認することを目的として、それぞれの実験群においてどのような免疫系細胞が刺激されているかを調べた。

具体的には、同実験において、関節炎発症後（ポリペプチド投与開始後）14日目に、マウスを犠死させ、足関節の所属リンパ節である鼠径リンパ節を採取した。抗マウスCD4抗体、抗マウスCD25抗体および抗マウスFoxp3抗体（eBioscience）を用いて、抗マウスFoxp3-PE染色キット（eBioscience）により、リンパ節の細胞を染色のうえ、FACS Vantage（Becton Dickinson）を用いて、まずCD4+細胞にgatingしたのち、抗CD25抗体および抗Foxp3抗体を用いて、CD4+細胞について、CD25陽性および／またはFoxp3陽性について測定した（図10a）。このようなFACSの結果、CD4+ T細胞の総数に対するCD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞の存在比率を明らかにした（図10b）。これらの結果より、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドの内服投与により、リンパ臓器においては、ヘルパーT細胞よりもむしろ制御性T細胞の増殖が誘導され、その結果としてin vivoにおいて関節炎が抑制されていることが示された。

実験例5：制御性T細胞のエピトープとしてのB22ポリペプチド、D21ポリペプチド
本実施例は、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドの内服投与により、どのようなT細胞集団が刺激を受けているのかをより詳細に明らかにすることを目的として、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドによる刺激に対する各種T細胞サブセットの増殖活性を調べた。

DBA/1Jマウスの脾臓細胞を抗マウスCD4抗体、抗マウスCD25抗体（eBioscience）を用いて染色し、FACS Vantage （Becton Dickinson）によってCD4+CD25+T細胞（図11a）とCD4+CD25-T細胞（図11b）を分離した。これらの細胞をカルボキシフルオレスセインスクシンイミジルエステル（Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester；CFSE）（同仁化学製品）10μg/mLで37℃30分反応させて染色した後、各細胞群2×10⁴ cells/0.2 mLの濃度に調製したのち、1300 radの放射線処理をした抗原提示細胞（脾臓細胞）1×10⁵ cells/mLと、B22ポリペプチド、D21ポリペプチド、またはHAポリペプチド（培養時添加抗原）とともにRPMI1640（Gibco）＋10％ウシ胎児血清中＋マウスIL-2 100 U/mL（R6D systems）で37℃、5％CO₂の条件下にて96時間培養後、再度FACS VantageによってCFSEの輝度を観察した。対照群では、培養時添加抗原を何も添加しなかった。結果を図11に示す。

CFSEはいったん細胞中に取り込まれた後、細胞分裂の進行とともに一細胞あたりのCFSE含有量が減少することを特徴としており、従って、増殖性の細胞においては、一細胞あたりのCFSEは、細胞が分裂を生じるごとに輝度が低下し、FACSのグラフが左側にシフトするという特徴を有する。従って、対照群と比較して、培養時の抗原の添加によりグラフが左側にシフトする場合に、抗原の添加の作用により細胞が増殖していることを示す。

図11a）ではCD4+CD25+T細胞のうちFOXP3陽性のものが、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチド刺激によりFACSのグラフが左側にシフトし、CD4+CD25+FOXP3+ T細胞はB22ポリペプチドおよびD21ポリペプチド刺激に応答して増殖していることが示された（図11aの↓部分）。一方、図11b）では、CD4+CD25-T細胞は、FOXP3陽性または陰性に関わらず、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチド刺激により有意に増殖しないことが示された。

これらの結果から、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドはともに、CD4+CD25+制御性T細胞により認識されるエピトープであることがわかった。これとともに、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドはともに、CD4+CD25+制御性T細胞を選択的に増殖させる作用があることがわかった。さらに、B22ポリペプチドおよびD21ポリペプチドは、CD4+CD25+制御性T細胞の増殖を誘導することを通じて、HLA-DR4またはHLA-DR1に関連のある疾患を治療しうることがわかった。

SEQ ID NO: 1：HLA-DR4分子に対するエピトープポリペプチドの部分ペプチド
SEQ ID NO: 2：ヒト由来BiPのヌクレオチド配列
SEQ ID NO: 3：ヒト由来BiPのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 2のヌクレオチド配列のうち、1〜1917をCDSとしたもの）
SEQ ID NO: 4：マイコバクテリウム（Mycobacterium bovis）由来mycHSP70のヌクレオチド配列
SEQ ID NO: 5：マイコバクテリウム（Mycobacterium bovis）由来mycHSP70のアミノ酸配列（上記ヌクレオチド配列のうち、1〜1878をCDSとしたもの）
SEQ ID NO: 6：B22ポリペプチド
SEQ ID NO: 7：B22Aポリペプチド
SEQ ID NO: 8：B22Bポリペプチド
SEQ ID NO: 9：B22Cポリペプチド
SEQ ID NO: 10：B22Dポリペプチド
SEQ ID NO: 11：B22Eポリペプチド
SEQ ID NO: 12：B22Fポリペプチド
SEQ ID NO: 13：D21ポリペプチド
SEQ ID NO: 14：D21Aポリペプチド
SEQ ID NO: 15：D21Bポリペプチド
SEQ ID NO: 16：D21Cポリペプチド
SEQ ID NO: 17：D21Dポリペプチド
SEQ ID NO: 18：D21Eポリペプチド
SEQ ID NO: 19：D21Fポリペプチド
SEQ ID NO: 20：ヒトBiP由来B22ポリペプチドの部分ペプチドをコードするヌクレオチド配列
SEQ ID NO: 21：ヒトBiP由来B22ポリペプチドの部分ペプチド
SEQ ID NO: 22：マイコバクテリウム（Mycobacterium bovis）mycHSP70由来D21ポリペプチドの部分ペプチドをコードするヌクレオチド配列
SEQ ID NO: 23：マイコバクテリウム（Mycobacterium bovis）mycHSP70由来D21ポリペプチドの部分ペプチド
SEQ ID NO: 24：インフルエンザヘムアグルチニン（HA）由来ペプチド
SEQ ID NO: 25：B21ポリペプチド

Claims

以下の式からなるアミノ酸配列：
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12（SEQ ID NO: 1）
式中、X1はMまたはRから選択され、
X2はKであり、
X3はPであり
X4は、F、V、W、Y、I、L、またはMから選択され、
X5は、Q、R、V、I、K、またはLから選択され、
X6は、K、S、I、M、L、F、またはYから選択されるが、ただしDまたはEではなく、
X7は、V、D、M、S、E、H、I、またはTから選択され、
X8は、L、I、T、P、S、V、F、K、またはMから選択され、
X9は、E、A、T、S、N、V、またはPから選択され、
X10は、D、M、V、L、またはAから選択され、
X11は、S、T、Q、Y、K、N、L、またはWから選択され、
X12は、D、G、S、Q、V、H、またはAから選択される
を含み、全長12〜20アミノ酸残基からなるポリペプチド。
X4がFまたはVである、請求項1に記載のポリペプチド。
X7がVである、請求項1または2に記載のポリペプチド。
X10がDである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列が、MKPVQKVLEDSD（SEQ ID NO: 21）またはRKPFQSVIADTG（SEQ ID NO: 23）である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドを細胞内で発現するための核酸構築物を含む、HLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防または治療するための医薬組成物。
HLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患が、関節リウマチ、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（1型糖尿病）、または多発性硬化症から選択される、請求項6に記載の医薬組成物。
請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドを細胞内で発現するための核酸構築物を含む、HLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患を予防するためのワクチン組成物。
HLA-DR4またはHLA-DR1と関連した疾患が、関節リウマチ、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（1型糖尿病）、または多発性硬化症から選択される、請求項8に記載のワクチン組成物。