JP2017081977A - アレルギー性状態または過敏症状態を処置するための薬剤 - Google Patents

Abstract

【課題】アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用する医薬の製造における薬剤の使用を提供すること。
【解決手段】本発明の薬剤は、ガングリオシド関連活性を調節し得る。この薬剤は、抗原に結合されない。ガングリオシド関連活性の調節は、アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用する。ここで、この調節は、以下：（ｉ）抗原特異的ＩｇＥレベル；ならびに／または（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞反応性；ならびに／または（ｉｉｉ）ＩｇＧおよび／もしくはＩｇＡレベルにおける変化により特徴付けられる。
【選択図】なし

Description

本発明は、医薬に関する。

詳細には、本発明は、アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用するに有用な医薬に関する。

より詳細には、１つの局面において、本発明は免疫学的寛容の誘導剤に関する。

より詳細には、本発明は、哺乳動物、特にヒトのアレルギー性疾患および他の過敏症疾患の処置における使用のための特定の抗原と、必要に応じて同時投与されるような薬剤に関する。

適応性免疫応答が過度または不適切な形態で生じる場合に、用語アレルギー性または過敏症が適用される。アレルギー性反応または過敏症反応は、外来抗原（通常は、環境性の高分子）に対して不適切に作用する、通常は有益な免疫応答の結果であり、そして時折、炎症性応答および組織損傷を生じる。これら状況において、通常は無害の環境性刺激物（「アレルゲン」と呼ばれる）は、再曝露の際に、病理学的損傷を生成するように再活性化される免疫応答を誘発する。アレルギーまたは過敏症は、４つの反応型に分類される。最初の３つは抗体に媒介され、４つ目はＴ細胞およびマクロファージによって主に媒介される。

Ｉ型即時型過敏／アトピー性アレルギーにおいて、アレルゲンに対する主要な免疫応答はＩｇＥ抗体の産生を含む。このような障害はヒトにおいて断然広まっており、そして新しい治療的アプローチについての主要な標的として考えられる。これらの疾患は、排他的にＩｇＥに媒介されないが、ＩｇＥは肥満細胞および好塩基球のような組織内の細胞に結合し、そしてアレルゲンによる細胞表面上のＩｇＥの架橋が、多くの炎症性メディエータの放出を誘起する。そのような疾患の代表的な例としては、喘息、アレルギー性の咳、アレルギー性鼻炎および結膜炎、アトピー性湿疹および皮膚炎、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、じんま疹（ｈｉｖｅｓ）、虫刺されアレルギー、食事性および特定の薬物のアレルギーが挙げられる。多くの場合、個々のアレルゲンが公知である。例として、喘息における主要アレルゲンはヒョウヒダニ由来のＤｅｒＰ１であるが、ペットの鱗屑（ｐｅｔ ｄａｎｄｅｒ）抗原のような喘息の他の誘発物もまた存在する。

ＩＩ型または抗体依存性細胞傷害性過敏症は、異なる型の抗体（通常は、ＩｇＧおよびＩｇＭ）が、細胞上で自己抗原または外来抗原のいずれかと結合した場合に生じ、そして食作用、キラー細胞の活性化、または補体に媒介される細胞溶解へと導く。これらのアレルギーの型は比較的珍しいものであるが、薬物に対するいくつかのアレルギーを含み得る。

ＩＩＩ型過敏症は、免疫複合体が多量に形成される場合、または細網内皮系によって適切に一掃され得ない場合に発達する。免疫複合体は通常、これらの部位での抗体（通常は、ＩｇＭまたはＩｇＧ）とアレルゲンの複合体の沈着物から生じる。通常の環境下では、抗体はアレルゲンに結合し、そして種々の組織細胞によって一掃される。しかし、多くの因子が免疫複合体の存続に影響し得る。そして免疫複合体が血液中に長期間残存する場合、それらは腎臓、皮膚（ここでそれらは、発疹を生じる）および関節（ここでそれらは慢性関節リウマチ以外の型の関節炎を生じ得る）において収容ならびに炎症を樹立し得る。

ＩＶ型または遅延型過敏症（ＤＴＨ）は抗体に関与しないが、代わりにＴリンパ球の長期活性化に関する。これらのＴ細胞は、組織損傷を生じ、そして組織への他の細胞型の漸増および活性化を増強する可溶性因子を分泌し得る。侵入してきた細胞自体は、炎症および組織損傷の一因となる。ＤＴＨは、抗原（例えば、マイコバクテリア結核に関連する抗原）がマクロファージに捕捉され、そして一掃され得ない場合に、最も重大に著しい。次いで、Ｔ細胞は、ある範囲の炎症性応答を媒介するサイトカインを合成するよう刺激される。ＤＴＨ反応は、Ｉ型応答よりも一般的ではないが、移植拒絶およびアレルギー性接触皮膚炎（これは一般に、環境性の「接触性アレルゲン」（例えば、重金属）に対する接触過敏症（通常、皮膚発疹を含むアレルギー）として明らかにされてる）において見られる。

抗原（例えば、アレルゲンおよび自己抗原）の経口投与は、末梢性Ｔ細胞応答を予防するための方法として長い間認識され、そして自己抗原の場合、いくつかの実験的自己免疫疾患（実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含む）の発症を予防または遅延することも示されている。そのようなストラテジーで認められる主要な問題は、大用量ではなくても、多用量の自己抗原の摂取を通常必要とすること、および免疫においてネイティブの宿主とは対照的に一般的にあまり効率的ではないことである。後者の問題は、このストラテジーの治療的可能性を制限してきた。しかし現在、Ｓｕｎら（１９９４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：１０７９５−１０７９９）によって、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣｔｘＢ）、コレラ毒素の非毒性レセプター結合部分に結合された、微量の基本型微粒子および可溶性タンパク質抗原の経口投与は、末梢Ｔ細胞画分における寛容を容易に誘導し得、そしてネイティブのみならず全身的に感作された動物においてもまた効果的であることが示されている。さらに、ＣｔｘＢに結合された微量の自己抗原、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の経口投与は、ＬｅｗｉｓラットにおいてＥＡＥを予防し得る（Ｓｕｎら、１９９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３：７１９６−７２０１）。他の研究者らもまた、コレラ毒素のレセプター結合非毒性Ｂサブユニット部分（ＣｔｘＢ）に接合した単回用量の微量（マイクログラム）の抗原ですら摂食することは、ネイティブならびに実験動物において、全身性Ｔ細胞媒介炎症性反応を著しく抑制し得ることを示している（Ｂｅｒｇｅｒｏｔら １９９７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４：４６１０−４６１４）。

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性エンテロトキシン（Ｅｔｘ）、およびそれの密接に関連したホモログであるコレラ毒素（Ｃｔｘ）は、宿主細胞表面上の糖脂質レセプターに結合するタンパク質毒素の例である。各毒素は、６つの非共有結合的に連結されたペプチド鎖からなり、これは単一のＡサブユニット（２７ｋＤ）および５つの同一なＢサブユニット（１１．６ｋＤ）（これは、哺乳動物細胞の表面上に見出されるＧＭ１ガングリオシドレセプターに主に結合する）からなる（Ｎａｓｈａｒら、１９９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３：２２６−２３０）。Ａサブユニットは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を保有する毒性を担い、一方でＢサブユニット（ＥｔｘＢおよびＣｔｘＢ）は、ＧＭ１と呼ばれる偏在的な細胞表面糖脂質ガングリオシドを結合および架橋し、従って、Ａサブユニットの細胞内への侵入が促進する、非毒性オリゴマーである。

ＧＭ１ガングリオシドレセプターは、疎水性部分、セラミド、親水性部分（すなわち、オリゴ糖鎖）によって形成される、糖脂質（グリコスフィンゴリピドとも呼ばれる）を含有するシアル酸を含むガングリオシドファミリーのメンバーである。ガングリオシドは、他の糖残基に加えて、１つ以上のシアル残基を保有する任意のセラミドオリゴ糖として規定される（Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．１９９７、Ｓｍｉｔｈ ＡＤ、Ｄａｔｔａ ＳＰ、Ｈｏｗａｒｄ Ｓｍｉｔｈ Ｇ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＰＮ、Ｂｅｎｔｌｅｙ ＲおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ ＨＡ編）。最初は神経組織において記載されたが、いくつかの研究は、ガングリオシドが全ての脊椎組織において発現されるほぼ偏在的な分子であることを示している。細胞内において、ガングリオシドは通常は原形質膜に結合し、ここで種々の分子についてのレセプターとして作用し得、そして細胞と細胞の相互作用およびシグナル伝達に関与する。さらに、ガングリオシドは、いくつかの内分泌細胞（例えば、膵島および副腎髄質）の分泌性顆粒の膜のようなサイトゾル膜において発現される。

ガングリオシドは、そのオリゴ糖の頭部基において、ガングリオシドの極性頭部に、ｐＨ７．０で正味の負電荷を提供するシアル酸の１つ以上の残基を含む。ヒトガングリオシドにおいて通常見出されるシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸である。２０を超える異なる型のガングリオシドが同定されている。これらはヘキソースおよびシアル残基の数ならびに相対的位置において異なっており、この差異がそれらの分類の基本を形成している。公知のガングリオシドのほとんど全ては、セラミドとのグリコシド結合においてグルコース残基を有し、Ｄ−ガラクトースおよびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの残基もまた存在する。

Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍにより考案された、ガングリオシドのガングリオシド命名法において（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、第２版、１９７５ Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ 第２９４〜２９５頁）、下付きの文字は、シアル基の数を示す。Ｍはモノシアロであり、Ｄはジシアロであり、Ｔはトリシアロである。

ガングリオシドファミリーの最も研究されたメンバーのうちの１つが、モノシアロシルガングリオシドのＧＭ１であり、これはコレラ毒素についての天然のレセプターであることが示されている。可溶性ガングリオシドＧＭ１は、高親和性で毒素に結合し、そしてそれを不活性化する（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ １９７６ Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ７１：１９１−２０４）。

ＧＭ１についての化学式は、以下のように表され得る：
Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４（ＮｅｕＡｃα３）Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ
ここで、ＧｌｕはＤ−グルコース、ＧａｌはＤ−ガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン；ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｃｅｒはセラミドである。

ＧＭ１についての化学式は、以下のようにもまた表され得る；
ガラクトシル−Ｎ−アセチルガラクトサミニル｛シアロシル｝ラクトシルセラミド、または
ガラクトシル−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−（シアリル）−ガラクトシルグルコシル（ｇｌｕｓｏｓｙｌ）セラミド。

ラクトースに結合したＥｘｔのＸ線結晶構造（Ｓｉｘｍａら、１９９２ Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５５：５６１−５６４）およびＧＭ１の五糖に結合したＣｔｘＢのＸ線結晶構造（Ｍｅｒｒｉｔｔら、１９９４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ３：１６６−１７５）は、ＣｔｘＢおよびＥｔｘＢが、以下のように表され得るＧＭ１の末端ガラクトースならびにシアル酸部分に結合すること；
Ｇａｌβ−１−３−３ＧａｌＮＡｃ
そして、そのような結合はＢサブユニットコンフォメーションにおいていかなる著しい変換も誘導しないことを明らかにした。

さらにコレラ毒素は、第２の内部シアル酸（例えば、ＧＤ１ｂ中）との置換に対する寛容性と共に、末端ガラクトースおよび内部シアル酸残基（例えば、ＧＭ１中）についての絶対的要求を示すことが示された。

Ｅｔｘは、Ｃｔｘのようにまた、おそらく末端糖配列：
Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（ＮｅｕＡｃα２−３）Ｇａｌ
に結合する。ここで、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンであり、そしてＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸である。

ＧＭ１への結合に加えて、ＥｔｘＢは他のガングリオシド（ＧＭ２およびアシアロ−ＧＭ１を含む非ガラクトース、ならびにガラクトタンパク質を含む）に弱く結合する（Ｎａｓｈａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９７ ９１：５７２−５７８）。他の研究者らは、ＥｘｔＢがＧＭ１に結合し得、そしてＧＭ１の末端ガラクトースの置換ではなく内部シアル酸残基（それぞれ、アシアロ−ＧＭ１およびＧＤ１ｂにおけるような）の除去または伸長を許容されることを示した（ＵｍｅｓａｋｉおよびＳｅｔｏｙａｍａ １９９２ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７５：３８６−３８８）。

Ａサブユニット単独での貧弱な免疫原性とは対照的に、ＥｘｔＢおよびＣｔｘＢの両方は例外的に強力な免疫原であり、そしてそれらのそれぞれのホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、ＥｘｔおよびＣｔｘは、関連のない抗原との組み合わせにおいて経口的に与えられる場合に、例外的に強力なアジュバントになり得ることが公知である（Ｒｕｅｄｌら
１９９６ Ｖａｃｃｉｎｅ １４：７９２−７９８；Ｎａｓｈａｒら、１９９３ Ｖａｃｃｉｎｅ １１：２３５；ＮａｓｈａｒおよびＨｉｒｓｔ １９９５ Ｖａｃｃｉｎｅ
１３：８０３；ＥｌｓｏｎおよびＥａｌｄｉｎｇ １９８４ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３；２８９２；ＬｙｃｋｅおよびＨｏｌｍｇｒｅｎ １９８６ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
５９：３０１）。それらの著しい免疫原性のため、ＥｘｔＢおよびＣｔｘＢの両方は、他のエピトープおよび抗原のキャリアとして使用され（Ｎａｓｈａｒら、１９９３ 同書）、そしてコレラおよびＥ．ｃｏｌｉ性の下痢に対するワクチンの成分として使用されている（Ｊｅｔｂｏｒｎら、１９９２ Ｖａｃｃｉｎｅ １０：１３０）。

ＣｔｘおよびＥｔｘのＢサブユニットが哺乳動物細胞上に存在するレセプターと相互作用する能力は、それらの細胞の機能に調節的効果を発揮することが示されている。免疫系の細胞が以下のこのような相互作用に示差的に影響されることは、公知である。特に、ＷＯ ９５／０２００４５は、ＥｔｘＢが哺乳動物細胞の表面に見い出されるＧＭ１ガングリシドレセプターに結合すること、ならびにこの結合がＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的減損およびＢ細胞の付随する活性化を含む、リンパ球集団への示差的効果を誘導することを開示する。ＧＭ１結合活性が欠損している変異体ＥｔｘＢタンパク質を使用する場合、これらの効果は存在しない。これらの観察は、自己免疫疾患の予防および処置、移植拒絶反応、ならびに対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）において、ＧＭ１と結合し得る薬剤の使用を導いた。これらの研究は、ＧＭ１に結合する薬剤、またはＧＭ１に結合する擬態物が免疫学的寛容の誘導を促進することを示唆する。

研究者らは、免疫学的非応答の状態（「免疫学的または経口的寛容」としてもまた知られる）は、食物性タンパク質抗原の経口投与によって誘導され得ることを示した（Ｓｕｎら １９９４ 同書；Ｓｕｎら １９９６ 同書；Ｂｅｒｇｅｒｏｔら １９９７ 同書）。抗原の吸入はまた、特異的な免疫学的非応答または「鼻寛容」の状態を誘導し得る。従って、粘膜経路より経口的または鼻的に抗原が投与される場合、全身的免疫学的寛容が誘導され得る。ＷＯ ９５／０１３０１は、特定の寛容原に結合される粘膜結合剤を含む免疫学的寛容誘導剤を開示する。ＷＯ ９５／１０３０１はまた、アレルゲンと結合した粘膜結合剤を使用するアレルギーの処置の言及を含む。Ｔａｍｕｒａら（１９７７ Ｖａｃｃｉｎｅ １５：２２５−２２９）のような他の研究者は、ＷＯ ９５／１０３０１のプロトコルを直接取り入れ、そしてＩ型アレルギーのマウスモデルにおいてアレルギー予防のその効力を試験した。彼らは、効力の強力な予測物質であるＩｇＥレベルの有意な低下を報告した。そして、彼らは、卵白アルブミンに結合したＥｔｘＢの投与の後（結果は含まれず）、ＩｇＥレベルが一旦確立されるとＥｔｘＢが有効でなくなることを示すデータを引用する。それはまた、経口的投与されるＣｔｘおよびＥｔｘは、胃腸管においてのみならず、遠方の粘膜エフェクター部位（例えば、気道）においてもまた、いくつかの体液性および細胞性免疫応答に作用し得ることを示す。これらのデータは、遠くの粘膜組織において局所免疫応答を改良するために、一般的粘膜免疫系の概念に従って、これらの粘膜アジュバントが経口免疫ストラテジーにおける潜在的使用を有することを示唆する（Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ Ｊ １９７４ Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ．：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＩＩ、第４巻：ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ、Ｉ．Ｌ． Ｂｒｅｎｔ，Ｊ．Ｈｏｌｂｏｒｒｏｗ編、 Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、 Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ、１９７〜２０７頁；Ｒｕｅｄｌら １９９６ 同書；Ｕｍｅｓａｋｉ １９９２ 同書；ＣｚｅｒｋｉｎｓｋｙおよびＨｏｌｍｇｒｅｎ（１９９４ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０：３７−４４））。

免疫学的寛容の誘導は、以下に要約され得る多くの異なる機構を含み得る：
（ｉ）それによって、抗原反応細胞が、それらに自殺（アポトーシス）を引き起こすことを通じて除去されるプロセス；
（ｉｉ）アレルギーの誘導または抗原反応細胞の長期不活性化；
（ｉｉｉ）病的な応答の発生とは異なる抗原反応細胞の免疫偏向；
（ｉｖ）抗原反応細胞の抑制、または特異的因子もしくは調節細胞によるそれらの調節。

アレルギーの処置において、任意のこれらの機構の誘導が有用であり得ることは可能である。しかし、一旦詳細なアレルゲンが公知になると、抗原反応細胞の欠損および／またはアレルギーの誘導が有用なストラテジーである一方、これらの機構の発動は、通常、処置様式で与えられたアレルゲンに対して応答するそれらの細胞のみを沈黙させる。一方、免疫偏向または抑制ストラテジーの実行は、条件に関与するが処置の一部ではなかった抗原に対する応答の潜在的な調節の利益を有する。この現象は、「傍観者抑制（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」として知られ、非抗原特異的サプレッサー分子の可能な分泌を通じて、または抗原特異的細胞と特異的免疫化抗原との間の相互作用の結果としての、その組織中の抑制性細胞相互作用を通じてのいずれかで、標的組識中の他の抗原（例えば、アレルゲン）に対する寛容の「広がり」を許容する。このように、その障害に関与する少なくとも１つの抗原が公知である限り、この条件は、同様に関係している他の抗原が存在する場合さえも、処置され得る。従って、良好な治療の目的は、特異的免疫偏向または抑制の誘導である。

Ｎａｓｈａｒおよび共同研究者（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９６ ９３：２２３−２２６；Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９６ ８：７３１−７３６；Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７ ９１：５７２−５７８）は、ＥｔｘＢおよび他の相同物の投与が
Ｔｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮγおよびインターロイキン２（ＩＬ−２））の生成から離れて、そしてＴｈ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）の分泌に向かう免疫応答を調節し得る。ＩＦＮγは、古典的なＴｈ１サイトカインであり、ＩＬ−４は、古典的なＴｈ２サイトカインである。この「免疫偏向」は、ＷＯ ９７／０２０４５の開示に基づき、そして自己免疫疾患の処置において有効性を示す。ＷＯ ９７／０２０４５の実験結果は、ＧＭ１結合剤がアレルギー性状態および／または過敏感性状態の処置における使用を見出さないことを示唆する。なぜなら、このような状態は、一般にＩＬ−４によって促進され、およびＩＦＮγによって下方調節されるように受容されている産物であるＩｇＥを含むからである。

本発明はここで、特異的免疫偏向または抑制の誘導を通じてアレルギー性状態および／または過敏感性状態の新しい処置方法を提供することを探究する。

本発明の第１の局面に従って、アレルギー性状態および／または過敏症状態に影響を与える医薬の製造における薬剤の使用を提供する；ここで、この薬剤は、ガングリオシド関連活性を調節し得る；そして、この薬剤は、抗原と結合しない；そして、このガングリオシド関連活性の調節は、アレルギー性状態および／または過敏症状態に影響を与える。

本発明の第２の局面に従って、アレルギー性状態および／または過敏症状態に影響を与える医薬の製造における薬剤の使用を提供する；ここで、この薬剤は、ＧＭ１関連活性を調節し得る；そして、この薬剤は、抗原と結合しない；そして、このＧＭ１関連活性の調節は、アレルギー性状態および／または過敏症状態に影響を与える。

本発明の第３の局面に従って、ＩｇＥ媒介応答をブロックし得る、本発明に従う薬剤を提供する。

好ましくは、この薬剤は、ＩｇＥ媒介応答をインビボでブロックし得る。

本発明の第４の局面に従って、アレルギー性状態および／または過敏症状態に影響し得る本発明に従う薬剤を同定するためのアッセイ方法を提供する；ここで、このアッセイ方法は、以下：（ａ）薬剤をガングリオシドと接触させる工程；（ｂ）この薬剤がガングリオシド関連活性を調節するかどうかを決定する工程；その結果、ガングリオシド関連活性の調節は、この薬剤がアレルギー性状態および／または過敏症状態に影響し得ることを示す；そして、この薬剤は、抗原と結合しない。

本発明の第５の局面に従って、本発明に従うアッセイ方法を提供する。ここで、このアッセイは、アレルギー性状態および／もしくは過敏症状態の予防ならびに／または処置において有用な薬剤についてスクリーニングするためのアッセイである。

本発明の第６の局面に従って、以下の工程：（ａ）本発明に従ってこのアッセイを実施する工程；（ｂ）ガングリオシド関連活性を調節し得る１つ以上の薬剤を同定する工程；および（ｃ）これらの１つ以上の薬剤の量を調製する工程を包含するプロセスを提供する。

本発明の第７の局面に従って、以下の工程：（ａ）本発明に従ってこのアッセイを実施する工程；（ｂ）ガングリオシド関連活性を調節し得る１つ以上の薬剤を同定する工程；および（ｃ）これらの１つ以上の同定された薬剤を含む薬学的組成物を調製する工程を包含するプロセスを提供する。

本発明の第８の局面に従って、以下の工程：（ａ）本発明に従ってこのアッセイを実施する工程；（ｂ）ガングリオシド関連活性を調節し得る１つ以上の薬剤を同定する工程；および（ｃ）ガングリオシド関連活性を調節し得る１つ以上の同定された薬剤を改変する工程；および（ｄ）これらの１つ以上の改変された薬剤を含有する薬学的組成物を調製する工程を包含するプロセスを提供する。

本発明の第９の局面に従って、本発明のプロセスにより同定される薬剤を提供する。

好ましくは、この同定された薬剤は、ガングリオシド関連活性の調節を通じてアレルギー性状態および／または過敏症状態に影響を与えることが予め公知ではない。

本発明の第１０の局面に従って、アレルギー性状態および／または過敏症状態に１つ以上の薬剤を用いて影響を与える方法を提供する；ここで、この薬剤は、インビトロアッセイ方法においてガングリシド関連活性を調節し得る；そして、このインビトロアッセイ方法は、本発明中に規定されるアッセイ方法である。

好ましくは、インビボでのアレルギー性状態および／または過敏症状態に１つ以上の薬剤を用いて影響を与える方法を提供する；ここで、この薬剤は、インビトロアッセイ方法においてガングリシド関連活性を調節し得る；そして、このインビトロアッセイ方法は、本発明中で規定されるアッセイ方法である。

本発明の第１１の局面に従って、医薬品としての使用のために本発明に記載の薬剤を提供する。

本発明の第１２の局面に従って、アレルギー性状態および／または過敏症状態に影響を与える医薬の製造において本発明に従う薬剤の使用を提供する。

本発明の第１３の局面に従って、本発明に従う薬剤を含むか、またはこれから調製される薬学的組成物を提供する。

好ましくは、この薬剤は、ＧＭ１結合剤である。

好ましくは、ガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤は、Ｃｔｘ、Ｅｔｘ、ＣｔｘＢおよびＥｔｘＢからなる群より選択される。

好ましくは、ガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤は、アレルギー性状態および／または過敏症状態を有する被験体においてＩｇＥ媒介応答をブロックし得る。

好ましくは、この被験体はヒト−例えば、ヒト患者である。

好ましくは、この薬剤は、ＥｔｘＢである。

特定の好ましい実施態様において、この薬剤は、野生型ＥｔｘＢである。

あるいは、好ましくは、この薬剤は、ガングリオシド関連活性を調節し得るＥｔｘＢの変異体、またはそれと等価な他のタンパク質のいずれかである。

好ましくは、この薬剤（単数または複数）は、非毒性である。

好ましくは、この薬剤は、ＣｔｘＢおよびガングリオシド関連活性を調節し得るその変異体である。

好ましくは、このガングリオシドは、ＧＭ１ガングリオシドレセプターである。

好ましくは、ガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤は、ＧＭ１ガングリオシドレセプターと架橋され得る。

好ましくは、ＥｔｘＢは、その五量体形態の効力によってＧＭ１ガングリオシドレセプターを架橋し得るような薬剤である。

好ましくは、この医薬は、Ｉ型アレルギーおよび／または接触過敏症のようなＩＶ型過敏症状態の処置または予防のために使用される。

好ましくは、この医薬は、必要に応じて抗原と同時投与される１つ以上の抗原を含む。

好ましくは、この薬剤は、哺乳動物に抗原を同時投与するかまたは同時投与せずに投与され得る。

好ましくは、この哺乳動物とは、ヒト−例えば、ヒト患者である。
したがって、本発明は、以下をも提供する。
（１） アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用する医薬の製造における薬剤の使用であって、ここで；
該薬剤は、ガングリオシド関連活性を調節し得；
該薬剤は、抗原に結合せず；
該ガングリオシド関連活性の調節が、アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用し；そして
該調節は、以下：
（ｉ）抗原特異的ＩｇＥレベル；ならびに／または
（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞反応性；ならびに／または
（ｉｉｉ）ＩｇＧおよび／もしくはＩｇＡレベル
における変化により特徴付けられる、使用。
（２） アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用する医薬の製造における薬剤の使用であって、ここで；
該薬剤は、ＧＭ１関連活性を調節し得；
該薬剤は、抗原に結合せず；そして
該ＧＭ１関連活性の調節は、アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用する、使用。
（３） 前記薬剤が、ＩｇＥ媒介応答をブロックし得る、項目１または項目２に記載の薬剤の使用。
（４） アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用し得る請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤を同定するためのアッセイ方法であって；
ここで該アッセイ方法は、以下の工程：
（ａ）薬剤をガングリオシドレセプターと接触させる工程；
（ｂ）（ｉ）抗原特異的ＩｇＥレベル；ならびに／または
（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞反応性；ならびに／または
（ｉｉｉ）ＩｇＧおよび／もしくはＩｇＡレベル、
における変化を測定することによって、該薬剤がガングリオシド関連活性を調節するか否かを決定する工程であって、その結果、該ガングリオシド関連活性の調節が、該薬剤がアレルギー性状態および／または過敏症状態に作用し得ることの指標となる工程、を包含し；そしてここで該薬剤は抗原に結合されない、方法。
（５） 項目４に記載のアッセイ方法であって、前記アッセイが、アレルギー性状態および／または過敏症状態の予防および／または処置において有用な薬剤についてスクリーニングする、方法。
（６） 以下の工程：
（ａ）項目４または項目５に記載のアッセイを実施する工程；
（ｂ）ガングリオシド関連活性を調節し得る１つ以上の薬剤を同定する工程；および
（ｃ）ある量の該１つ以上の薬剤を調製する工程、
を包含する、方法。
（７） 以下の工程：
（ａ）項目４または項目５に記載のアッセイを実施する工程；
（ｂ）ガングリオシド関連活性を調節し得る１つ以上の薬剤を同定する工程；および
（ｃ）該１つ以上の同定された薬剤を含有する薬学的組成物を調製する工程、
を包含する、方法。
（８） 以下の工程：
（ａ）項目４または項目５に記載のアッセイを実施する工程；
（ｂ）ガングリオシド関連活性を調節し得る１つ以上の薬剤を同定する工程；
（ｃ）ガングリオシド関連活性を調節する１つ以上の同定された薬剤を改変する工程；および
（ｄ）該１つ以上の改変された薬剤を含有する薬学的組成物を調製する工程、
を包含する、方法。
（９） 項目６または項目７または項目８の方法によって同定される、薬剤。
（１０） 前記薬剤がＧＭ１結合剤である、項目９に記載の薬剤。
（１１） 前記薬剤がＥｔｘＢであり、ここで該薬剤はガングリオシド関連活性の調節を通してアレルギー性状態および／または過敏症状態に作用し得る、項目１０に記載の薬剤。
（１２） 前記薬剤が、以下：（ｉ）抗原特異的ＩｇＥレベル；ならびに／または（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞反応性；ならびに／または（ｉｉｉ）ＩｇＧおよび／もしくはＩｇＡレベル；における変化によって特徴付けられるガングリオシド関連活性の調節を通して、アレルギー性状態および／また過敏症状態に作用することが以前に公知ではなかった、項目９に記載の薬剤。
（１３） 前記ガングリオシドがＧＭ１ガングリオシドである、請求項１、４、６、７または８のいずれか１項に規定されるガングリオシド。
（１４） アレルギー性状態または過敏症状態に１つ以上の薬剤で作用する方法であって；
ここで該薬剤はインビトロアッセイ方法においてガングリオシド関連活性を調節し得；そして
ここで該インビトロアッセイ方法は、項目４または項目５に規定されるアッセイ方法である、
方法。
（１５） アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用する医薬の製造における、項目４〜１２または項目１４のいずれか１項に規定される薬剤の使用。
（１６） アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用し得る薬学的組成物としての使用のための、項目９もしくは項目１０もしくは請求項１１もしくは項目１２に記載の薬剤、または項目６もしくは項目７もしくは８に記載の方法によって調製される薬剤。
（１７） 項目９もしくは項目１０もしくは項目１１もしくは項目１２のいずれか１項に記載の薬剤、または項目６もしくは項目７もしくは項目８に記載の方法によって調製される薬剤、を含有するかあるいは該薬剤から調製される薬学的組成物であって、該組成物はアレルギー性状態および／または過敏症状態に作用し得る、薬学的組成物。
（１８） アレルギー性状態および／または過敏症状態の処置のための、項目７または項目８または項目１６または項目１７に規定される薬学的組成物の調製における、薬剤の使用。
（１９） 添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載されるガングリオシド関連活性の調節を通して、アレルギー性状態および／または過敏症状態に作用し得る、薬剤。

本発明に従って、本発明者らは、驚くべきことに、ガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤の使用が、単独で投与される場合または適切な抗原と同時投与される場合に、アレルギー性状態および／または過敏症状態に対する有効な治療として使用され得ることを見出した。以前の研究者らは、機構を見出す試み（Ｓｕｎら １９９６ 同書）、またはガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤（例えば、ＥｔｘＢおよびＣｔｘＢ）が、抗原に対する免疫応答においてＴｈ１からＴｈ２へのスイッチを引き起こすことの議論（ＷＯ９７／０２０４５）のいずれもしていなかった。アレルギー性状態がＴｈ２応答によって促進されることが当該分野において公知であるため、次いで以前の知見は、このような薬剤がアレルギーの処置において効果がないか、またはより悪化さえさせ得ることのいずれかであることを示唆する。

本発明者らは、驚くべきことに、ＥｔｘＢおよびＣｔｘＢがＴｈ２関連応答のいくつかの局面を促進する一方、いくつかの場合において、それらがアレルギーを引き起こす主な因子である、ＩｇＥの生成を刺激し得ないことを見出した。従って、アレルギー性状態および／または過敏症状態は、ガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤（例えば、これは抗原とは結合しない）を用いて処置され得る。

有意には、構成成分の結合は、必要性が見られない。さらに、本発明者らの研究結果は、アレルギー性状態および／または過敏症状態に対する防御機構には、抗原特異的ＩｇＥ分泌の抑制および／または非炎症性抗原特異的抗体イソタイプ（特にＩｇＧおよびＩｇＡ）の上方調節産生が挙げられ得るがそれらに限定されない。

従って、アレルギー性状態および／または過敏症状態は、必要に応じて抗原と同時投与されるガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤を用いて処置され得るので、本発明は有利である。

本発明に関して使用される場合、用語「ガングリオシド」は、当該分野におけるその通常の定義（上記で定義されるような）ならびにその活性フラグメントを含む。

このガングリオシドは、合成的に作製され得るか、または天然の供給源から単離され得る。あるいは、市販の供給源から得られ得る。

用語「ガングリオシド関連活性」は、任意の１つ以上の調節ガングリオシドレセプターまたは免疫調節ガングリオシドレセプターを含み、これらはガングリオシドレセプター結合の前、結合の間または結合の後のいずれかのシグナリング事象を調節する。

用語「Ｃｔｘ」は、コレラ毒素をいい、そしてＣｔｘＢは、コレラ毒素のＢサブユニットをいう。他の文脈において、これらは時々ＣＴまたはＣｔまたはＣＴＢまたはＣｔＢとしてそれぞれ同一とされ得る。

用語「Ｅｔｘ」は本明細書中において、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシンを意味し、そしてＥｔｘＢは、ＥｔｘのＢサブユニットである。他の文脈において、これらは時々ＬＴまたはＬｔ、およびＬＴＢまたはＬｔＢとしてそれぞれ同一とされ得る。

用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する物質を含む。

用語「粘膜アジュバント」は、この薬剤が非関連の抗原に対して粘膜免疫応答を容易にし得るように非関連の抗原とともに粘膜を介して送達される薬剤を含む。このように、この薬剤は、いわゆる粘膜アジュバントとして作用する。

用語「粘膜表面」は、経口、舌下、鼻腔内、腟内、直腸、唾液、腸管および結膜表面を含むがそれらに限定されない。

用語「粘膜」および／または「粘膜組織」は、腸、肺、口、生殖管、鼻および眼を含むがそれらに限定されない。

「ワクチンキャリア」は、関連する抗原のキャリアを含む（Ｓｚｏｓｔａｋら １９９６ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４４：１６１−１７０）。

用語「粘膜免疫原」は、局所的抗体産生および／もしくは全身的抗体産生、ならびに／または細胞媒介免疫反応、ならびに／または遅延型過敏症反応を誘起する能力を有する粘膜経路により投与可能な薬剤を含む。

「ハプテン」は、エピトープとして作用し得るがそれ自体によって抗体応答を誘発し得ない、低分子を意味する。

用語「免疫学的寛容または経口的寛容」は、特異的に寛容された抗原（単数または複数）に対する宿主の免疫学的反応性の減少を意味する。免疫学的寛容または経口的寛容は、特定の抗原に対する免疫応答の完全な抑制を意味しなくてもよいが、これは「免疫偏向」または「分裂寛容」としてもまた知られている形態または寛容である。

用語「免疫偏向」または「分裂寛容」は、いくらかのＩｇＧ応答の保持を伴うが、しかし遅延した過敏症および／またはＩｇＥ応答の下方調節を伴う局所的ＩｇＡ応答の保存のようなものを記載するために使用され得る。

用語「寛容」とは、特異的免疫学的非応答性の状態を意味する。

「寛容原」は、寛容化された抗原を意味する。

用語「自己免疫」は、身体が自己抗原に対する免疫応答を生じるプロセスを述べるために使用される。

用語「ガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤」は、ガングリオシドとの相互作用を通じて、免疫調節物質として作用する任意の薬剤を記載するために用いられ得る。

用語「ＧＭ１結合剤」とは、ＧＭ１ガングリオシドレセプターとの相互作用を通じて、免疫調節物質として作用する任意の薬剤を含む。

用語「免疫調節物質」とは、抗原の抗原性を変更することによってか、または非特異的様式で特定の反応性、もしくは宿主の非特異的エフェクター関連機構を変更することによって抗原に対する免疫応答の程度を変更する任意の薬剤を含む。

用語「投与される」とは、ウィルス性または非ウィルス性の技法による送達を含む。ウィルス性の送達機構は、アデノウィルスベルター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウィルスベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、およびバキュロウィルスベクターを含むが、これらに限定されない。非ウィルス性の送達機構は、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、カチオン性顔面用両親媒性（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｆａｃｉａｌ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）（ＣＦＡ）、およびこれらの組み合わせを含む。このような送達機構に関する経路は、粘膜、経鼻、経口、非経口、胃腸、局所、または舌下の経路を含むが、これらに限定されない。

用語「同時投与される」とは、各々の薬剤および抗原の投与部位および投与時間が、免疫系の必要な調節が達成されるようであることを意味する。従って、この薬剤および抗原は、同じ瞬間に間に合ってかつ同じ場所に投与され得るが、この薬剤を抗原とは異なる時間にかつ異なる部位へ投与することに利点が存在し得る。この薬剤および抗原は、さらに、同じ送達ビヒクル（例えば、Ｍａｃｒｏｓｏｌ^TM、ＷＯ９５／１３７９５およびＷＯ９６／１４８７１を参照のこと）中で、但し、この薬剤およびこの抗原を結合させないで送達され得る。

用語「投与される」とは、（例えば、鼻用スプレーまたは吸入用エアロゾルとして、あるいは摂取可能な溶液としての）粘膜経路による；送達が注射可能な形態による場合、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、または皮下経路のような、非経口経路による送達を含むが、これらに限定されない。

用語「全身性免疫処置」とは、皮膚または血液のような非粘膜組織中への抗原の導入を意味する。

用語「自己抗原」とは、宿主組織に由来する成分を意味する。

用語「標的相互作用成分」は、ガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤、ガングリオシド、および／または抗原を含むが、これに限定されない。

用語「結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ）」（これは用語「結合される（ｌｉｎｋｅｄ）」と同じ意味を持つ）とは、抗原と薬剤との結合（これは、（イオン結合または共有結合によるのような）直接的な結合、あるいは適切なスペーサー基の供給による間接的な結合を含むが、これに限定されない）を意味する。

用語「結合していない（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ）」（これは用語「結合していない（ｕｎｌｉｎｋｅｄ）」と同じ意味を持つ）とは、薬剤が、抗原と結合していないことを意味する。

しかし、本発明に従って、この薬剤および／または抗原は、別の存在物と結合し得る。

用語「作用する」とは、処置、予防、抑制、緩和、回復、もしくは予め存在する状態の他の変化および／または将来の状態に潜在的に作用すること、ならびにそれらのいずれかの組み合わせのような調節を含む。

「抗原」とは、免疫応答性動物へ導入した場合、薬剤と結合し得る特異抗体の生成を刺激する薬剤を意味する。この抗原は、純粋な物質、物質の混合物、あるいは（細胞または細胞フラグメントを含む）可溶性または粒状の材料であり得る。この意味で、この用語は、任意の適切な抗原決定基、自己抗原（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）、自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）、寛容原、アレルゲン、ハプテン、および免疫原、またはそれらの部分、ならびにそれらいずれかの組み合わせを含み、そしてこれらの用語は本明細書中を通して交換可能に用いられる。

「アレルゲン」は、Ｉ型過敏性反応を含むアレルギー性反応を刺激する、任意の抗原を含む。

一般的なアレルゲン供給原の例は、以下の表に概説される。

用語「アレルギー性状態」とは、喘息、アレルギー性の咳、アレルギー性鼻炎および結膜炎、アトピー性湿疹および皮膚炎、じんま疹（ｕｔｉｃａｒｉａ）、じんま疹（ｈｉｖｅｓ）、虫刺されアレルギー、食事性アレルギー（ピーナッツ、魚、牛乳、小麦など）ならびに薬物アレルギーを含むが、これに限定されない。

用語「過敏症状態」とは、植物の有毒ツタにより誘発される接触過敏症のような状態を含むが、これに限定されない。

用語「薬剤」とは、ガングリオシド関連活性を調節し得る存在物を含む。この薬剤は、１つ以上の無機化学薬品または有機化学薬品、ならびにそれらの組み合わせであり得る。例として、それらが、必要とされる免疫調節活性を維持する限りは、この薬剤はポリペプチド、ならびにそれらの改変体／相同体／誘導体／フラグメントであり得る。この薬剤はまた、それらの模倣物および等価物および変異体を含む。アレルギー性状態または過敏症状態の処置のための他の薬剤は、標的相互作用成分に対する抗体を含む。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメントおよび特別に設計されたヒト化モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。

ガングリオシド関連活性を調節し得る薬剤は、当該分野で公知の方法によって、上記に概説されたように設計および生成され得る。例として、本発明の薬剤が、ＥｔｘＢサブユニットまたはＣｔｘＢサブユニットのようなタンパク質である場合、この薬剤は、このタンパク質が形成される特定のポリペプチド鎖をコードする遺伝子が、適切なベクター中へ挿入され、次いで適切な宿主へのトランスフェクトに用いられる方法によって、本発明の全ての局面において用いるために生成され得る。例えば、ＥｔｘＢを組み立てるこのポリペプチド鎖をコードする遺伝子が、例えば、プラスミドｐＭＭ６８中へ挿入され得、次いでこれはＶｉｂｒｉｏ ｓｐ．６０のような宿主細胞のトランスフェクトに用いられ得る。このタンパク質は、それ自体が公知の様式において精製され、そして単離される。次いで、活性な変異体のＥｔｘＢタンパク質を発現する変異遺伝子は、野生型遺伝子から公知の方法によって生成され得る。

標的相互作用成分がタンパク質である場合、この成分に対する抗体の生成のために、当該分野で周知の手順が用いられ得る。

抗体の生成のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、などを含む種々の宿主が、標的相互作用成分またはそれらの任意の誘導体もしくは相同体、あるいは免疫原の特性を保持するオリゴペプチドを注射することによって免疫され得る。宿主種に依存して、免疫応答を増大させるために種々のアジュバントが用いられ得る。このようなアジュバントは、フロイント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、およびジニトロフェノールのような界面活性を含むが、これらに限定されない。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒｖｕｍは、潜在的に有用なヒトアジュバントである。

標的相互作用成分が、タンパク質である場合、この成分に対するモノクローナル抗体が、培養中の連続する細胞株による抗体分子の生成を提供する任意の技法を用いて調製され得る。これらは、当初はＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）によって記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ，７７−９６頁）を含むが、これらに限定されない。さらに、「キメラ抗体」の生成のために開発された技法である、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るための、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングが、用いられ得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）。あるいは、単鎖抗体の生成に関して記載された技法（米国特許第４，９４６，７７９号）が、標的相互作用成分に特異的な単鎖抗体を生成するために適応され得る。

抗体はまた、リンパ球集団における生成をインビボで誘導することによってか、あるいはＯｒｌａｎｄｉら（１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６：３８３３−３８３７）、およびＷｉｎｔｅｒ ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９９１；Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９）により開示されたように、高特異的結合試薬で組換え免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることによって生成され得る。

標的相互作用成分に対する特異的結合部位を含む抗体フラグメントもまた、作製され得る。例えば、このようなフラグメントは、この抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）₂フラグメント、およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメントを含むが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望された特異性のモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするために構築され得る（Ｈｕｓｅ ＷＤら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１）。

本発明の標的相互作用成分、またはそれらの誘導体もしくは相同体、および／あるいは本発明の標的相互作用成分、またはそれらの誘導体もしくは相同体を発現する細胞株は、標的相互作用の調節因子として作用する、抗体、ペプチド、あるいは有機分子または無機分子のような他の薬剤に関するスクリーニングに用いられ得、それによって標的相互作用を調節し得る治療薬剤を同定する。例えば、標的相互作用を調節し得る抗体が同定され得る。

あるいは、組換え的に発現された標的相互作用成分、またはそれらの誘導体もしくは相同体、あるいは標的相互作用成分、またはそれらの誘導体もしくは相同体を発現する細胞株を用いる、コンビナトリアルケミストリーによって作製されるペプチドライブラリーまたは有機物ライブラリーのスクリーニングは、標的相互作用を調節することによって機能する治療薬剤の同定に有用であり得る。合成化合物、天然産物、および潜在的に生物学的に活性な材料の他の供給源は、当業者にとって慣用的であると考えられる多くの方法でスクリーニングされ得る。

標的相互作用成分ポリペプチド、その免疫原フラグメントまたはそれらのオリゴペプチドは、種々の薬物スクリーニング技法のいずれかにおいて治療用の化合物のスクリーニングに用いられ得る。このような試験に用いられるポリペプチドは、溶液中で遊離し得るか、固体支持体に付着され得るか、細胞表面に保有され得るか、または細胞内に位置し得る。活性の破壊または標的相互作用成分と試験される薬剤との間の結合複合体の形成が、測定され得る。

あるいは、ファージディスプレイは、標的相互作用成分に作用する候補薬剤の同定に用いられ得る。

ファージディスプレイは、組換えバクテリオファージを利用する分子スクリーニングのプロトコルである。この技法は、バクテリオファージを、標的相互作用成分（またはそれらの誘導体もしくは相同体）と反応し得る適切なリガンド（この場合、候補薬剤）をコードする遺伝子、あるいはこのリガンドをコードするヌクレオチド配列（またはそれらの誘導体もしくは相同体）で形質転換することを含む。形質転換されたバクテリオファージ（これは好ましくは、固体支持体に係留される）は、適切なリガンド（例えば、候補薬剤）を発現し、そしてそれらのファージの外被上にそれを提示する。この候補薬剤を認識する標的分子を有する存在物（例えば、細胞）が、単離されそして増幅される。次いで、首尾良い候補薬剤は、特徴付けされる。ファージディスプレイは、標準的なアフィニティリガンドスクリーニング技法を超える利点を有する。このファージの表面は、候補の天然に存在するコンホメーションに、より厳密に似た、三次元の配置で、候補薬剤を提示する。これは、スクリーニングの目的のために、より特異的かつより高い親和性の結合を可能にする。

従って、本発明は、複数の薬剤を提供する工程；標的相互作用成分、またはそれらの誘導体もしくは相同体を複数の薬剤それぞれと、適切な条件下で、結合を可能にするのに十分な時間で合わせる工程；および複数の薬剤それぞれに対する、標的相互作用成分、またはそれらの誘導体もしくは相同体の結合を検出し、それによって標的相互作用成分に特異的に結合する薬剤を同定する工程を含む、標的相互作用成分、またはそれらの誘導体もしくは相同体との特異的結合親和性に関して複数の薬剤をスクリーニングするのための方法を提供する。このようなアッセイにおいて、この複数の薬剤は、当業者に公知のコンビナトリアルケミストリーの技法によって生成され得る。

スクリーニングのための別の技法は、標的相互作用成分のポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する薬剤の高処理量スクリーニングを提供し、そしてＷＯ ８４／０３５６４において詳細に記載された方法に基づく。要約すれば、大量の異なる小さなペプチド試験化合物が、プラスチックピン、または何か他の表面のような固体基材上で合成される。このペプチド試験薬剤は、標的相互作用成分フラグメントと反応され、そして洗浄される。次いで、結合した標的相互作用成分は、（例えば、当該分野で周知の適切に適合させた方法によって）検出される。精製された標的相互作用成分はまた、前述の薬物スクリーニング技法に使用するためにプレート上に直接的に被覆され得る。あるいは、非中和抗体は、このペプチドを捕捉し、そしてそれを固体支持体上に固定化するために用いられ得る。

本発明は、ガングリオシド関連活性を調節し得る治療上有効な量の薬剤、および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを投与する工程を包含する、処置の必要がある、被験体を処置するための薬学的組成物もまた提供する。

この薬学的組成物は、ヒトまたは動物への用法のためであり得、そして代表的には、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤、またはアジュバントのいずれか１つ以上を含む。薬学的キャリア、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図した投与経路および標準的な薬学的実践に関して選択され得る。この薬学的組成物は、キャリア、賦形剤または希釈剤として（または、それに加えて）任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含み得る。

薬学的組成物は、適切な抗原と共に処方され得る。

あるいは、それぞれの治療剤および抗原に対して別々の組成物を含むキットが提供され得る。

本発明のいくつかの実施態様において、この薬学的組成物は、１つ以上の以下を含む：本発明のアッセイによってスクリーニングされた薬剤；ここでこの薬剤は、ガングリオシド関連活性を調節し得る。

本発明はまた、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤またはアジュバント（それらの組み合わせを含む）と混和した、有効な量の抗原を含む薬学的組成物に関係する。

本発明はまた、有効量の本発明の薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する、処置の必要がある、この被験体を処置する方法を提供する。

本発明は、標的相互作用成分の全てまたは部分を単独で、または少なくとも１つの他の薬剤（例えば、安定化化合物）と組み合わせで含み得、そして生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、これらに限定されない任意の滅菌した生体適合性の薬学的キャリア中で投与され得る薬学的組成物に関係する。

異なる送達系に依存して、異なる組成物の要求／処方物の要求があり得る。

本発明の薬学的組成物は、例えば、鼻用スプレー、または吸入用エアロゾル、または摂取可能な溶液として粘膜経路によって、あるいは組成物が、（例えば、静脈内経路、筋肉内経路、または皮下経路による）送達のための注射可能な形態に処方されて、非経口的に送達されるように処方され得る。あるいは、処方物は、両方の経路によって送達されるように設計され得る。

薬剤が、胃腸粘膜を通して粘膜的に送達される場合、胃腸管を通過している間安定であることが好ましい；例えば、好ましくは、タンパク質分解性分解に耐性であり、酸性ｐＨに安定であり、そして胆汁の界面活性効果に対して耐性であることが好ましい。

代表的には、医者は、被験体に最も適切な実際の投与量を決定し、そして投与量は、特定の被験体の年齢、体重および応答によって変化する。薬剤および抗原決定基の単一の用量は、十分で有り得るが、複数の用量は、本発明の範囲内に考慮される。

適切な場合、薬学的組成物が、吸入によって投与され得、坐薬もしくは膣坐薬の形態で、代表的にはローション、溶液、クリーム、軟膏、または粉剤の形態で、皮膚パッチを用いて投与され得るか、デンプンもしくは乳糖のような賦形剤を含む錠剤の形態で、あるいは単体もしくは賦形剤との混合物でのいずれかでカプセルまたはオーブルス（ｏｖｕｌｅｓ）で、または矯味矯臭剤もしくは着色剤を含むエリキシル、溶液または懸濁液の形態で経口的に投与され得るか、あるいは、それらは、例えば，空洞内に、静脈内に、筋肉内にまたは腹腔内に非経口的に注射され得る。非経口的投与については，この組成物は、滅菌水溶液の形態で最もよく使用され得、これは、他の物質（例えば、溶液を血液と等張にするように、十分な塩または単糖類）を含み得る。頬肉または舌下投与については、この組成物は、錠剤またはトローチの形態で、投与され得、これらの錠剤またはトローチは、従来の手法で処方され得る。

異なった組成物／処方系に依存した異なる送達要求があり得る。

レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、あるいは種々の細菌プラスミド由来の発現ベクターが、標的化された組織および／または細胞集団への薬剤の送達に用いられ得る。当業者に周知の方法が、薬剤を含む組換えベクターの構築に用いられ得る。あるいは、薬剤は、リポソーム中で標的細胞に送達され得る。

例示のために、生物分解性のポリマー微粒子を用いた粘膜表面での抗原の制御された放出が、抗原の標的化および初回免疫に必要な用量の数の減少を助け得る（ＧｕｐｔａおよびＳｉｂｅｒ １９９５ Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２６３−１２７６）。

生物分解性微粒子へのワクチンのカプセル化が、優れた粘膜性免疫原を提供する。組換えノーウォークウイルス様（ｒＮＶ）粒子はまた、粘膜性抗原送達に用いられ得る（Ｂａｌｌら １９９６ Ａｒｃｈ Ｖｉｏｌ 増補 １２：２４３−２４９）。

ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）は、ＢおよびＴ細胞エピトープを含む複数の免疫原のワクチン送達系として利用されてきた（Ｒｏｙ １９９６ Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：６２−７１）。

経口送達の１つの好ましい方法を、ＷＯ ９５／１３７９５、ＷＯ ９６／１７５９３およびＷＯ ９６／１７５９４に記載されるような形成に用いる。これらの処方物は、タンパク質のような高分子が、経口送達のために「油（ｏｉｌｓ）」に可溶化することを可能にする。従って、そのような処方物は、腸の粘膜表面への高分子の送達を可能にする。

さらなるアプローチにおいて、再び、治療的薬剤が、タンパク質である場合、ＷＯ ９３／１７１１７に記載されるような細菌送達系の手法により、そのようなタンパク質の送達が可能である。この系は、例えば経口的にまたは実際は経鼻的であるような、他の粘膜経路によってタンパク質を送達するために細菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを利用する。

要約すると、本発明は、アレルギー性状態および／または過敏症状態に影響を与える医薬の製造における薬剤の使用を提供する；ここで、薬剤は、抗原と結合せずに、ガングリオシド関連活性を調節させ得る。

別の広範な局面において、本発明は、抗原と結合しないガングリオシド関連活性を調節させ得る薬剤を含む免疫学的耐性を誘導する薬剤を提供する。

本発明の別の局面は、ここで以下の番号づけされたパラグラフにより示され、以下が挙げられる：
１． ＧＭ１結合活性を有する薬剤、またはＧＭ１媒介細胞内シグナル伝達事象に対する影響を有するが、ＧＭ１結合活性を有さない薬剤の、アレルギー性状態または他の過敏症状態を処置するための医薬の調製における使用。但し、この薬剤が、アレルゲンおよび／または抗原と結合しない。

２． 上記薬剤が、Ｃｔｘ、Ｅｔｘ、ＣｔｘＢまたはＥｔｘＢのようなＧＭ１結合薬剤、あるいはそれらの変異体形態または誘導体である、パラグラフ１に規定される使用。

３． 上記医薬が、ぜん息、アレルギー性の咳、アレルギー性鼻炎、結膜炎、アトピー性湿疹、皮膚炎、じんま疹（ｕｔｉｃａｒｉａ）、じんま疹（ｈｉｖｅｓ）、虫刺されアレルギー、食事性アレルギー（ピーナッツ、魚、ミルク、コムギなど）、薬物アレルギー、または接触アレルギー（ｃｏｎｔａｃｔ）および他の過敏症の予防または処置のためである、パラグラフ１およびパラグラフ２に規定される使用。

４． ＧＭ１結合活性を有する薬剤、またはＧＭ１媒介細胞内シグナル伝達事象に対する影響を有するが、ＧＭ１結合活性を有さない薬剤の（但し、この薬剤は、アレルゲンおよび／または抗原と結合しない）、有効量を被験体に投与する工程を包含する、アレルギーまたは他の過敏症状態の処置または予防の方法。

５． 上記薬剤が、Ｃｔｘ、Ｅｔｘ、ＣｔｘＢまたはＥｔｘＢのようなＧＭ１結合薬剤、あるいはそれらの変異体形態または誘導体である、パラグラフ４に規定される方法。

６． 上記方法が、ぜん息、アレルギー性の咳、アレルギー性鼻炎、結膜炎、アトピー性湿疹、皮膚炎、じんま疹（ｕｔｉｃａｒｉａ）、じんま疹（ｈｉｖｅｓ）、虫刺されアレルギー、食事性アレルギー（ピーナッツ、魚、ミルク、コムギなど）、薬物アレルギー、または接触過敏症の予防または処置のためである、パラグラフ４またはパラグラフ５に規定される方法。

７． ヒトアレルギー性および／または過敏症疾患の処置のための薬学的組成物であって、
（ｉ） ＧＭ１結合活性を有する薬剤；または
（ｉｉ） ＧＭ１結合活性を有さないが、ＧＭ１媒介細胞内シグナル伝達事象に対する影響を有する薬剤；
を含む薬学的組成物。但し、この薬剤は、アレルゲン／抗原；および薬学的に受容可能なキャリアまたはそれらの希釈液と結合しない。

８． アレルギー性状態または他の過敏症状態を処置する医薬の調製における、ＧＭ１結合活性を有する薬剤、またはＧＭ１結合活性を有さないが、ＧＭ１媒介細胞内シグナル伝達事象に対する影響を有する薬剤を含む生成物（但し、この薬剤は、アレルゲンおよび／または抗原と結合せず、そして少なくとも１つの抗原／アレルゲンは、同時の、別々のまたは経時的な使用のために組み合わせて調製される）。

本発明は、ここで、例示のためにのみ記載される。

（実施例）
（ガングリオシド関連活性を変化させ得る薬剤のスクリーニング）
ガングリオシド関連活性を変化させ得る薬剤を、種々の方法のうちいずれか１つにより試験する。

そのような方法の例は、以下の方法を含むがそれらに限定されない：
１．ＧＭ１のようなガングリオシドレセプターへの結合を、マイクロタイタープレートをコートする、精製されたＧＭ１を用いることにより決定する。さらなる非特異的なタンパク質のプレートへの結合のブロックに続いて、研究中の薬剤を、プレートに添加し、そして洗浄に先だって相互作用を可能にし、そして上記薬剤に特異的な抗体を用いて検出する。酵素または放射性標識との直接的または間接的のいずれかでの抗体の結合体は、続く比色定量（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）または放射活性に基づいた方法（それぞれＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ）のいずれかを用いた結合の定量化を可能にする。

２．ＧＭ１のようなガングリオシドの五糖部分は、標準的なアフィニティークロマトグラフィーを行なうことを可能にするために適切なカラムマトリックスに結合する。希釈液からカラムに添加した公知の化合物の除去は、結合活性の証拠として用いられる。あるいは、化合物の混合物を、カラムに添加する場合、溶出および続く分析は、ガングリオシド関連活性を変化させ得る薬剤の性質を決定し得る。

タンパク質分析は、ペプチド配列およびトリプシンの消化地図作製に続く利用可能なデータベースとの比較を含む。溶出されたタンパク質が、この方法では同定できない場合、例えば、レーザー脱離質量分析による質量決定のような標準的な生物化学的分析を、化合物をさらに特徴づけるために用いる。ＧＭ１−アフィニティーカラムから溶出された非タンパク質を、ＨＰＬＣおよび単一な同種のピークの質量分光測定により分析する。

３．ＧＭ１のようなガングリオシドへの結合能力および相互作用の正確なアフィニティーを、以前に報告された（Ｋｕｚｉｅｍｋｏら、（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３５：６３７５−６３８４）ようにプラスモン表面共鳴（ｐｌａｓｍｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いて決定し得る。

（同定された薬剤の評価）
ガングリオシド関連活性の調節が、アレルギー性状態および／または過敏症状態に影響するように、ガングリオシド関連活性を調節させ得る薬剤の同定を、以下のように決定する：
実験動物を、当該分野で周知の方法により抗原特異的ＩｇＥの産生のために刺激する。例示のために、マウスに、ミョウバン沈殿させた可溶性タンパク質抗原（例えば、オボアルブミン、あるいはブタクサまたはヒョウヒダニ抗原のようなヒトアレルギー性疾患に関与する公知のアレルゲン）を、皮下または腹腔内のいずれかでチャレンジする。

無処置の動物において、この手順は、慣用的に、適切なマイクロタイタープレートを被覆するために抗原を用いて、標準的なＥＬＩＳＡにより血清中に容易に検出される抗原特異的ＩｇＥの産物を導く。免疫化されたマウスからの血清を、非特異的タンパク質の結合をブロックした後プレートに添加し、そしてＩｇＥの存在を、広範に利用可能なマウスＩｇＥに特異的な、標識された抗体を用いて決定する。

アレルギーを予防または処置する薬剤の能力について薬剤をスクリーニングするために、ガングリオシド関連活性を変化させ得る薬剤を、用量の範囲内でそして種々の経路により、チャレンジ抗原の存在下または非存在下のいずれかでマウスへ投与する。経口的な経路は、投与の好ましい方法であるが、送達は、他の粘膜表面によってまたは非経口的になされ得る。そのような投与の頻度ならびに反復した投薬のタイミングもまた、研究する。そのような研究のストラテジーは、ＩｇＥを誘導する抗原チャレンジ（予防）に先だって、またはＩｇＥを誘導する抗原チャレンジ（処置）の後のいずれかで利用される。抗原のチャレンジは、（ｉ）予防または処置のプロトコールの一部として用いる抗原；（ｉｉ）無関係な抗原、または（ｉｉｉ）それぞれ、応答の特異性およびバイスタンダー抑制の誘導を試験するための、チャレンジおよび無関係な抗原の混合物のいずれかであり得る。

種々の方法により有効性が決定され、そして多くの異なる結果が示される。

１． 抗原特異的ＩｇＥレベル。特定のＥＬＩＳＡ（記載したように）による血清ＩｇＥの測定は、予防または治療のプロトコールが、抗原特異的ＩｇＥの血清レベルを減少させ得るか否かを決定するために用いられる。ＩｇＥ応答を決定するために用いられる当該分野で公知の他の方法が、ＥＬＩＳＡの代替としてか、もしくは相補的なデータを提供するためのいずれかで用いられる。そのような方法は、いわゆる「Ｕｓｓｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ ｔｅｓｔ」または「受身皮膚アナフィラキシー」アッセイを含む。特異的ＩｇＥの減少は、これらのアッセイのいずれかによって決定されるように、潜在的臨床有効性の強力なマーカーである。

２．抗原特異的Ｔ−細胞反応性。チャレンジ抗原に対する処置された動物の二次的なリンパ組織由来のＴ−細胞の応答が、確立された方法論を用いて研究された。細胞懸濁液を調製し、そしてチャレンジ抗原の存在または不在下において培養する。培養を開始してから適切な時間で、サンプルを細胞増殖およびサイトカイン産生について評価する。

サイトカインを、特定の捕捉ＥＬＩＳＡ、細胞内染色に続く細胞数測定分析、ＲＴ−ＰＣＲ、または他の確立された手順により測定する。抗原の不在に対して、抗原の存在下での細胞増殖およびサイトカイン産生の比較が、各場合において、チャレンジ抗原に対する特異的な応答の部分の測定を提供する。予防的または治療的プロトコールの有効性の証拠が、Ｔｈ２関連サイトカイン産生の減少（特に、ＩＬ−４）またはアレルギー性応答の下方調節に関与するサイトカイン発現の増加（例えば、ＩＬ−１０またはＴＧＦβ）により実証される。

３．ＩｇＧおよびＩｇＡのレベル。抗原特異的ＩｇＥのレベルを下げないプロトコールはさらに、他の非アレルギーに関連した抗体アイソトープの産生も増強し得る事象に潜在的に効果を有すると考えられ得る。従って、ＩｇＧおよびＩｇＡの存在について予防または処置プロトコールの一部として研究されている、薬剤を処置しなかったかまたは与えたかのいずれかの動物由来の血清および粘膜分泌物の研究がまた、実行される。ＩｇＧおよびそれらの特異的なサブクラス、そしてＩｇＡに特異的な検出抗体を利用する標準的な抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（記載したように）が、この目的のために用いられる。分泌物または血清のＩｇＧまたはＩｇＡ抗体を増強された生成物は、有効性を示す。なぜなら、そのような抗体は、アレルゲンの、肥満細胞、好塩基球および好酸球（ｃｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）に結合した架橋ＩｇＥを阻止するか、または粘膜上皮を越えた抗原の取り込みを制限することが期待され、それゆえ、それに続くアレルギー性の炎症応答を阻止する。

（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））
ＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のＧＭ１への結合は、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡにより調べられる（Ａｍｉｎ，Ｔ．およびＨｉｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．（１９９４）Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ．５、１９８−２０４）。

血清および腸分泌物を、サンプルを、５μｇ／ｍｌのＰＢＳ中のＥｔｘＢまたはＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のいずれかで被覆したマイクロプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ Ｉ、Ｄｙｎａｔｅｃｋ、ＵＳＡ）に添加するＥＬＩＳＡにより、抗ＢサブユニットＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の存在について調査する。腸分泌物の上清中の抗−ＢサブユニットＩｇＡ抗体は、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌウサギ抗マウスＩｇＡ（α鎖特異的；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ、ＵＳＡ）で各プレートの２列のウェルを被覆し、続いて１μｇ／ｍｌのマウス骨髄腫ＩｇＡ（ＭＯＰＣ ３１５、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加にすることにより作製される標準曲線から推定する。総ＩｇＡを測定するために、ウェルを、ウサギ抗マウスＩｇＡで被覆し、続いて腸分泌物上清を添加する。全てのサンプルを、連続的に希釈した。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．、ＵＳＡ）またはヤギ抗マウスＩｇＡ（α鎖特異的；Ｓｉｇｍａ）ペルオキシダーゼ結合物を希釈し、そして全てのウェルに添加する。抗−ＢサブユニットＩｇＧ力価（Ａ_450nm＞０．２で得られる）を決定する。腸分泌物中のＥｔｘＢおよびＥｔｘＢ（Ｇ３３Ｄ）のそれぞれに対するＩｇＡ抗−Ｂサブユニットの応答を、「ＩｇＡ特異的活性」として算出する（ＩｇＡ抗−Ｂサブユニット（μｇ／ｍｌ）／総ＩｇＡ（μｇ／ｍｌ）を意味する）。

ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γのサイトカインレベルを測定するために公知のＥＬＩＳＡ法を用いる。手短に言えば、マイクロタイタープレートを、マウスＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γに対するラット抗体で被覆する。プレートを、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロックする。培養培地からの上清をウェルに添加し、そして希釈する。各サイトカインについて各プレートの一列は、標準的な量の組換えサイトカインを含む。次いで、プレートを、０．５μｇ／ｍｌのビオチン標識された抗サイトカインモノクローナル抗体とインキュベートし、続いてアビジンペルオキシダーゼおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）（ＴＭＢ）基質を添加し、そしてＡ_450nmで測定する。

上述の明細書中に述べられた全ての出版物は、本明細書中に参考として援用される。本発明に記載した方法およびシステムの種々の変更および変化は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は，特定の好ましい実施態様に関連して記載されるが、本願発明は、このような特定の実施態様に過度に制限されるべきでないことが理解されるべきである。実際に，分子生物学または関連の分野の当業者に明らかである、記載された本発明を実施するための態様の種々の変更が、上記の請求の範囲内であることが意図される。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。