PT1569696E - Composições para prevenção e tratamento de esclerose múltipla e diabetes de tipo 1 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES PARA PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE ESCLEROSE MÚLTIPLA E DIABETES DE TIPO 1"

REMISSÕES PARA PEDIDOS RELACIONADOS O presente pedido reivindica beneficio sob o artigo 35 USC 119 (e) para o Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/428643, apresentado a 21 de Novembro de 2002.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a composições para tratamento ou prevenção de doença, compreendendo sequências imunomoduladoras. O pedido refere-se, adicionalmente, aos meios e métodos para a identificação das sequências imunomoduladoras para prevenção ou tratamento de doença, de um modo mais particular, ao tratamento e prevenção de doença auto-imune ou doenças inflamatórias. O pedido também se refere ao tratamento ou prevenção de doença, compreendendo a administração das sequências imunomoduladoras isoladamente. O pedido também se refere ao tratamento ou prevenção de doença, compreendendo a administração das sequências imunomoduladoras, em combinação com um polinucleótido codificando autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s). O pedido refere-se, adicionalmente, ao 1 tratamento ou prevenção de doença, compreendendo a administração das sequências imunomoduladoras em combinação com automoléculas, tais como autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolipido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteina(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteina(s) modificado(s) pós-traducionalmente. 0 pedido também se refere ao tratamento ou prevenção de doença, compreendendo a administração das sequências imunomoduladoras em combinação com uma ou mais terapêuticas imunomoduladoras adicionais. A presente invenção também se refere a composições para tratamento de doenças num individuo associadas a uma ou mais autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) que estão presentes no individuo e envolvidas num estado não fisiológico. A presente invenção também se refere a composições para prevenção de doenças num individuo associadas a uma ou mais autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) que estão presentes num individuo e envolvidos num estado não fisiológico. 0 pedido também se refere à administração de uma terapia combinada, compreendendo uma sequência imunomoduladora e um polinucleótido codificando autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou péptido(s) presentes num estado não fisiológico e associados a uma doença. 0 pedido também se refere à modulação de uma resposta imunitária a automolécula(s) presente (s) num animal e envolvida(s) num estado não fisiológico e associada(s) a uma doença. 0 pedido refere-se, de um modo mais particular, aos métodos e composições para tratamento ou prevenção de doenças auto-imunes, associadas a uma ou mais automolécula(s) presente(s) no animal num estado não fisiológico, tais como em esclerose múltipla (MS), artrite reumatóide (RA), diabetes Mellitus dependente de insulina (IDDM), uveite auto-imune (AU), 2 cirrose biliar primária (PBC), miastenia grave (MG), síndrome de Sjogren, pênfigo vulgar (PV), esclerodermia, anemia perniciosa, lúpus eritematoso sistémico (SLE) e doença de Grave. 0 pedido refere-se, ainda, particularmente, a outras doenças associadas a uma ou mais automolécula(s) presente(s) no animal num estado não fisiológico, tais como osteoartrite, lesão da medula espinal, doença da úlcera péptica, gota, dores de cabeça de enxagueca, hiperlipidemia e doença arterial coronária. 2. Antecedentes

Doença Auto-Imune A doença auto-imune é qualquer doença causada por imunidade adaptativa que se torna erradamente dirigida para células e/ou tecidos saudáveis do corpo. A doença auto-imune afecta 3% da população dos E.U.A. e, provavelmente, uma percentagem semelhante da população do mundo industrializado (Jacobson et al., Clin Immunol Immunopathol, 84, 223-43, 1997). As doenças auto-imunes são caracterizadas por linfócitos T e B que aberrantemente visam automoléculas incluindo, mas não limitadas a, autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolipido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteina(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteina(s) modificado(s) pós-traducionalmente e seus derivados, causando, desse modo, lesão e/ou mau funcionamento de um órgão, tecido ou tipo de célula dentro do corpo (por exemplo, pâncreas, cérebro, tiróide ou aparelho gastrointestinal) que causam as manifestações clinicas da doença (Marrack et al., Nat Med, 7, 899-905, 2001). As doenças auto-imunes incluem doenças que afectam tecidos 3 específicos, assim como doenças que podem afectar múltiplos tecidos. Isto pode, em parte, para algumas doenças, depender de se as respostas auto-imunes são dirigidas a um antigénio de automolécula confinado a um particular tecido ou a um antigénio de automolécula que está largamente distribuído no corpo. 0 traço característico da auto-imunidade específica de tecido é a escolha selectiva de um único tecido ou tipo de célula individual. Não obstante, determinadas doenças auto-imunes que visam antigénios de automoléculas ubíquos também podem afectar tecidos específicos. Por exemplo, em polimiosite a resposta auto-imune visa a proteína ubíqua histidil-ARNt sintetase, todavia as manifestações clínicas envolveram, principalmente, destruição auto-imune de músculo. 0 sistema imunitário emprega um mecanismo altamente complexo, concebido para gerar respostas para proteger mamíferos contra uma variedade de patógenos estranhos, enquanto previne, ao mesmo tempo, respostas contra auto-antigénios. Adicionalmente a decidir se responde (especificidade de antigénio), o sistema imunitário também deve escolher funções efectoras apropriadas para lidar com cada patógeno (especificidade efectora). Uma célula crítica na mediação e regulação destas funções efectoras é a célula T CD4+. Além disso, é a elaboração de citocinas específicas a partir de células T CD4+ que parece ser um dos mecanismos principais pelos quais as células T medeiam as suas funções. Deste modo, caracterizando os tipos de citocinas produzidas por células T CD4+, assim como de que modo a sua secreção é controlada, é extremamente importante na compreensão de que modo a resposta imunitária é regulada. A caracterização da produção de citocina, a partir de clones de células T CD4+ de murganho de longo prazo, foi 4 primeiro publicada há mais de 10 anos (Mosmann et al., J. Immunol., 136:2348-2357, 1986). Nestes estudos, mostrou-se que as células T CD4+ produziam dois padrões distintos de produção de citocina, que foram designados T auxiliar 1 (Thl) e T auxiliar 2 (Th2). Verificou-se que as células Thl produziam selectivamente interleucina 2 (IL-2), interferão gama (iFN-gama) e linfotoxina (LT), enquanto os clones Th2 produziam selectivamente IL-4, IL-5, IL-6, e IL-13 (Cherwinski et al., J. Exp. Med., 169:1229-1244, 1987). Um pouco mais tarde, foram isoladas citocinas adicionais, IL-9 e IL-10, a partir de clones Th2 (Van Snick et al., J. Exp. Med., 169:363-368, 1989) (Fiorentino et al., J. Exp. Med., 170:2081-2095, 1989). Finalmente, verificou-se que eram segregadas citocinas adicionais, tais como IL-3, factor estimulador de colónias de macrófagos granulociticos (GM-CSF) e factor de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), tanto por células Thl como Th2. A doença auto-imune abrange um amplo espectro de doenças que podem afectar muitos órgãos e tecidos diferentes dentro do corpo, como delineado na tabela abaixo. (Ver, e. g., Paul, W.E. (1999) Fundamental Immunology, Quarta Edição, Lippincott-Raven, Nova Iorque.)

As terapias actuais para a doença auto-imune humana incluem glucocorticóides, agentes citotóxicos e terapêutica biológica recentemente desenvolvida. Em geral, a gestão da doença auto-imune sistémica humana é empírica e não satisfatória. Na maior parte, os fármacos imunossupressores amplos, tais como corticosteróides, são utilizados numa ampla variedade de distúrbios inflamatórios e auto-imunes graves. Adicionalmente aos corticosteróides, são utilizados outros agentes imunossupressores na gestão das doenças auto-imunes sistémicas. 5 A ciclofosfamida é um agente alquilante que causa profunda depleção tanto de linfócitos T como B e disfunção de imunidade de mediação celular. Ciclosporina, tacrolimus e micofenolato de mofetil são produtos naturais com propriedades especificas de supressão de linfócito T e foram utilizados para tratar SLE, RA e, numa medida limitada, em vasculite e miosite. Estes fármacos estão associados a toxicidade renal significativa. 0 metotrexato também é utilizado como um agente de "segunda linha" em RA, com o objectivo de reduzir a progressão de doença. Também é utilizado em polimiosite e outras doenças do tecido conjuntivo. Outras abordagens que têm sido tentadas incluem anticorpos monoclonais destinados a bloquear a acção de citocinas ou a reduzir linfócitos. (Fox, D.A. Am. J. Med., 99:82-88, 1995). Os tratamentos para MS incluem interferão Beta e copolimero 1, que reduzem a taxa de recidiva em 20-30% e apenas têm um modesto impacto dobre a progressão de doença. A MS também é tratada com agentes imunossupressores incluindo metilprednisolona, outros esteróides, metotrexato, cladribina e ciclofosfamida. Estes agentes imunossupressores têm eficácia mínima no tratamento de MS. A terapia actual para a RA utiliza agentes que suprimem ou modulam não especificamente a função imune, tais como metotrexato, sulfasalazina, hidroxicloroquina, leflunamida, prednisona, assim como os antagonistas de TNF alfa recentemente desenvolvidos etanercept e infliximab (Moreland et al., J Rheumatol, 28, 1431-52, 2001) . O etanercept e infliximab globalmente bloqueiam o TNF alfa, tornando os doentes mais susceptíveis a morte por sépsis, agravamento de infecções micobacterianas crónicas e desenvolvimento de eventos desmielinizantes.

No caso de auto-imunidade específica de órgão, foi tentado um certo número de abordagens terapêuticas diferentes. Foram 6 administrados sistemicamente antigénios de proteína solúvel, de modo a inibir a subsequente resposta imunitária a esses antigénios. Tais terapias incluem a distribuição de proteína básica de mielina, o seu péptido dominante ou uma mistura de proteínas de mielina, a animais com encefalomielite auto-imune experimental (EAE) e humanos com esclerose múltipla (Brocke et al., Nature, 379, 343-6, 1996); (Critchfield et al., Science, 263, 1139-43, 1994); Weiner et al., Annu Rev Immunol, 12, 809-37, (1994); administração de colagénio de tipo II ou uma mistura de proteínas de colagénio, a animais com artrite induzida por colagénio e humanos com artrite reumatóide (Gumanovskaya et al., Immunology, 97, 466-73, 1999); (McKown et al., Arthritis Rheum, 42, 1204-8, 1999), (Trentham et al.,

Science, 261, 1727-30, 1993); distribuição de insulina a animais e humanos com diabetes auto-imune (Pozzilli e Gisella Cavallo, Diabetes Metab Res Rev, 16, 306-7, 2000); e distribuição de antigénio S a animais e humanos com uveíte auto-imune (Nussenblatt et al., Am J Ophthalmol, 123, 583-92, 1997). Um problema associado a esta abordagem é a não responsividade de célula T induzida por injecção sistémica de antigénio. Outra abordagem é a tentativa para conceber estratégias terapêuticas racionais para a administração sistémica de um antigénio peptídico, baseado na interacção específica entre os receptores de células T e péptidos ligados a moléculas de histocompatibilidade principal (MHC). Um estudo utilizando a abordagem peptídica num modelo animal de diabetes resultou no desenvolvimento da produção de anticorpo para o péptido, (Hurtenbach U. et al., J Exp. Med, 177:1499, 1993). Outra abordagem é a administração de imunização de péptido TCR. Ver, por exemplo, (Vandenbark AA et al., Nature, 341:541, 1989). É ainda outra abordagem a indução de tolerância oral por ingestão 7 de antigénios peptídicos ou proteicos. Ver, por exemplo, (Weiner HL, Immmunol Today, 18:335, 1997).

As respostas imunitárias a patógenos ou tumores são actualmente alteradas através da distribuição de proteínas, polipéptidos ou péptidos, isoladamente ou em combinação com adjuvantes. Por exemplo, a vacina do vírus da hepatite B contém o antigénio de superfície recombinante do vírus da hepatite B, um antigénio não próprio, formulado em hidróxido de alumínio que serve como um adjuvante. Esta vacina induz uma resposta imunitária contra o antigénio de superfície do vírus da hepatite B, de modo a proteger contra a infecção. Uma abordagem alternativa envolve a distribuição de uma forma atenuada, de replicação deficiente e/ou não patogénica de um vírus ou bactéria, todos antigénios não próprios, de modo a deduzir uma resposta imunitária protectora de hospedeiro contra o patógeno. Por exemplo, a vacina polio oral é composta por um vírus atenuado vivo, um antigénio não próprio, que infecta células e se replica no indivíduo vacinado, de modo a induzir imunidade eficaz contra o poliovírus, um antigénio estranho ou não próprio, sem causar doença clínica. Alternativamente, a vacina polio inactivada contém um vírus inactivado ou "morto" que é incapaz de infectar ou se replicar e, se administrado subcutaneamente, induzir imunidade protectora contra o poliovírus.

Mecanismos de Iniciação e Propagação de Respostas Imunitárias

Doenças Inflamatórias Associadas A "Moléculas Não Próprias": A infecção com microrganismos incluindo micoplasma, vírus, bactérias, parasitas e micobactérias conduz a inflamação em órgãos alvo e, em alguns casos, inflamação sistémica. Exemplos salientes incluem artrite séptica bacteriana, artrite de Lyme, uveite infecciosa e choque séptico. Como parte do sistema imunitário inato, são activados mediadores inflamatórios, tais como componentes da cascata de coagulação, bradicininas e complemento, e contribuem para inflamação e morbidade. A resposta imunitária na doença infecciosa é dirigida contra moléculas não próprias presentes nos microrganismos, incluindo proteínas, lípidos, hidratos de carbono e ácidos nucleicos. ADN bacteriano contendo determinados motivos, referidos como motivos "CpG", definidos em maior detalhe abaixo, é capaz de iniciar respostas inflamatórias em modelos animais. Por exemplo, a injecção de ADN bacteriano ou motivos CpG, que são ambos moléculas não próprias, dentro de articulações sinoviais mimetiza muitos dos sinais e sintomas inflamatórios que caracterizam a artrite séptica.

Doenças Inflamatórias Associadas A "Automoléculas": Muitas das doenças humanas, na ausência de qualquer etiologia infecciosa conhecida, estão associadas a inflamação aguda ou crónica. Nestas doenças, o sistema imunitário está activo, fazendo com que os tecidos afectados estejam inflamados e anormalmente infiltrados por leucócitos e linfócitos, mas não parece existir infecção associada. Exemplos incluem osteoartrite, doença arterial coronária, Doença de Alzheimer, determinadas formas de dermatite, gastrite e pneumonite. Na ausência de uma resposta imunitária adaptativa, a resposta imunitária predominante é uma resposta imunitária inata.

Doenças Auto-imunes Associadas A "Automoléculas": Foram descritas dúzias de doenças auto-imunes, incluindo artrite 9 reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, esclerose múltipla, diabetes Mellitus, psoriase e muitas outras. Como as doenças inflamatórias associadas a automoléculas anteriores, o sistema imunitário está activo, fazendo com que os tecidos afectados sejam inflamados e anormalmente infiltrados por leucócitos e linfócitos e parece não existir infecção associada. Ao contrário das doenças inflamatórias associadas a automoléculas, uma caracteristica definidora de doenças auto-imunes é a presença de auto-anticorpos e/ou células T específicos para moléculas próprias expressas pelo hospedeiro. Os mecanismos pelos quais as automoléculas são selectivamente visadas pelos linfócitos T e B do hospedeiro são obscuros. Alquns investiqadores suqeriram que as doenças auto-imunes são desencadeadas ou exacerbadas por infecções com patógenos microbianos. A estimulação com sequências CpG microbianas está associada a susceptibilidade aumentada ao desenvolvimento de modelos animais de doenças auto-imunes, tais como EAE (Segai et al., J. Immunology, 158:5087, 1997,) e SLE (Gilkeson et al., J. Immunology, 142: 1482, 1989,); contudo, há pouca evidência que suporte a hipótese de que as sequências CpG ou produtos microbianos podem eles mesmos provocar uma doença auto-imune num animal de outro modo saudável, embora possam ser induzidas doenças inflamatórias. Por exemplo, várias experiências importantes utilizando sistemas gnotobióticos (í. e., animais criados num ambiente livre de germes) demonstraram que o desenvolvimento espontâneo de doenças auto-imunes ocorre sem exposição a micróbios de ocorrência natural ou CpGs microbianos. Exemplos incluem o desenvolvimento de pele auto-imune e doença genital num modelo de roedor transgénico livre de germes de espondilite anquilosante (Taurog, J Exp Med, 180:2359, 1994,); e desenvolvimento de lúpus em 2 modelos diferentes de SLE (Maldonadoi et al., J Immunol, 162: 6322, 1999; Unni et al., J Rheum, 2:35, 1975). Também foi 10 descrito um modelo indutível de SLE, no qual uma única injecção de qualquer estirpe de murganho com o óleo hidrocarbonatado, pristano, conduz ao desenvolvimento de SLE, caracterizado pela produção de auto-anticorpos caracteristicos e doença renal mediada por complexo imunitário. Considerados em conjunto, estes modelos experimentais sugerem que as doenças auto-imunes espontâneas e indutiveis podem desenvolver-se na ausência de exposição a ADN microbiano ou CpGs.

Sequências Imunoestimuladoras (ISS): O sistema imunitário inato é considerado como a primeira linha de defesa contra micróbios e patógenos. Um dos estimulantes mais potentes do sistema imunitário inato é ADN microbiano, que contém sequênias imunoestimuladoras (ISS). A activação de imunidade inata por sequências imunoestimuladoras especificas em ADN bacteriano requer uma sequência motivo nuclear hexamérica não metilada, consistindo em 5'-purina-purina-citosina-guanina-pirimidina-pirimidina-3' para estimulação em murganhos e 5'-purina-pirimidina-citosina-guanina-pirimidina-pirimidina-3' para estimulação em humanos (Krieg et ai., Annu Rev. Immunol., 20:709-760, 2002). ADN bacteriano e oligodesoxinucleótidos sintéticos (ODN) contendo este motivo dinucleotidico, referido como sequências "CpG", dentro de uma sequência motivo imunoestimuladora têm a capacidade para estimular a proliferação de células B e segregação de IL-6, IL-10 e imunoglobulina (Krieg et al., Nature, 374:546-549, 1995; Yi et al., J. Immunol., 157:5394-5402, 1996). ADN de ISS também activa directamente células dendriticas, macrófagos e monócitos a segregarem citocinas semelhantes a Thl, tais como TNF-α, IL6 e IL12 e regula positivamente a expressão de MHC e moléculas co-estimuladoras (Klinman et al., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 93:2879-2883, 1996; Martin-Orozco et al., Int. Immunol., 11 11:1111-1118, 1999; Sparwasser et al., Eur. J. Immunol., 28:2045-2054, 1998). Em murganhos, o receptor 9 semelhante a

Toll (TLR-9) foi identificado como o receptor chave no reconhecimento de motivos CpG.

Em ADN de vertebrado, a frequência de dinucleótidos CpG está suprimida em cerca de um quarto do valor previsto e o C no dinucleótido CpG está metilado, aproximadamente, 80% das vezes. Em contraste, ADN bacteriano, como ODN sintético, o C não está, de um modo preferido, metilado no dinucleótido CpG. Deste modo, o ADN bacteriano é estruturalmente distinto de ADN de vertebrado no seu teor aumentado em mais de 20 vezes de motivos CpG não metilados. Numerosos estudos estabeleceram o motivo CpG não metilado como o padrão molecular dentro de ADN bacteriano que activa células imunitárias (Krieg et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002) . O ADN de CpG é reconhecido como um potente adjuvante pela sua capacidade para induzir uma forte resposta de anticorpo e resposta de célula T semelhante a Thl a este tipo de antigénios não próprios, como lisozima de ovo de galinha poedeira e ovalbumina (Chu et al., J. Exp. Med., 186: 1623-1631, 1997; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 27: 2340-2344, 1997).

Actualmente, ADN de CpG e ODN de CpG estão a ser utilizados como vacinas terapêuticas em diversos modelos animais de doenças infecciosas, tumores, doenças alérgicas e doenças auto-imunes (Krieg et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002). O sucesso de CpG com uma vacina depende fortemente da sua eficácia de induzir uma forte resposta semelhante a Thl e, em alguns casos, redireccionar uma resposta Th2 para uma resposta Thl, tal como no modelo de asma alérgica (Kline et al., J. Immunol., 12 160:2555-2559, 1998; Broide et al., J. Immunol., 161 :7054-7062, 1998) .

Tem sido dada significativa atenção às aplicações terapêuticas de activação imunitária inata por ADN de CpG. A activação celular imunitária inata não específica de antigénio induzida por ADN de CpG é suficiente para proteger murganhos contra provocação bacteriana e mesmo para tratar infecções estabelecidas com patógenos intracelulares (Agrawal et al., Trends Mol. Med., 8: 114-121, 2002). O ADN de CpG também induz resistência imunitária inata a tumores e a repressão de tumores estabelecidos em murganhos (Dow et al., J. Immunol., 163:1552-1561, 1999; Carpenter et al., Câncer Res., 59: 5429-5432, 1999; Smith et al., J. Natl. Câncer Inst., 90: 1146-1154, 1998) . O potente efeito adjuvante Thl de ADN de CpG pode mesmo sobrepor-se a respostas imunitárias Th2 preexistentes; foi utilizado como um adjuvante para vacinas de alergia, onde induz respostas Thl a antigénios na presença de uma resposta Th2 preexistente, conduzindo a sintomas diminuídos após subsequente inalação de alergénio (Van Uden et al., J. Allergy Clin. Immunol., 104: 902-910, 1999).

Sequências Imunoinibitórias (IIS): Os inibidores de sequência oligodesoxinucleotídica imunoestimuladora (ISS-ODN) foram utilizados para inibir a actividade imunoestimuladora de ISS-ODN, por exemplo, para suprimir a actividade imunoestimuladora de qualquer ISS-ODN presente em vectores de expressão recombinantes, particularmente no contexto de terapia génica, como agentes anti-inflamatórios para redução de respostas imunitárias de hospedeiro a ISS-ODN em bactérias e vírus, como modulador auto-imune em combinação com conjugado de auto-antigénio ou auto-anticorpo para inibir a produção de IL-12 13 mediada por Thl estimulada por ISS-ODN, para utilização como um adjuvante para respostas imunitárias Th2 a antigénio extracelular e, em geral, para o desvio uma resposta imunitária de hospedeiro de uma resposta Thl para uma Th2. Ver a Patente US N° 6255292.

Yamada et al., J. Iimunol., 169; 5590-5594, 2002, utilizando diversos sistemas celulares de activação imunitária in vitro, avaliaram oligodesoxinucleótidos IIS na estimulação imunitária induzida por CpG. Yamada et al. verificaram que a supressão por oligodesoxinucleótidos IIS é dominante em relação a estimulação por oligodesoxinucleótidos e é específica para respostas imunitárias induzidas por CpG. Verificaram que as sequências oligonucleotídicas mais supressoras continham sequências ricas em poliG ou G-C mas não foi descoberto um motivo hexamérico específico. Krieg et al., PNAS, 95; 12631-12636, 1998, verificaram que oligonucleótidos sintéticos contendo motivos neutralizantes, definidos como dinucleótidos CpG, em aglomerados de repetições directas ou com um C no lado 5' ou um G no lado 3', poderiam bloquear a activação imunitária por motivos CpG imunoestimuladores. De novo, não foi descoberta uma sequência imunoinibitória hexamérica. Em Zeuner et al., Arthritis and Rheumatism, 46: 2219-2224, 2002, demonstrou-se que a IIS, descrita por Kreig et al. anteriormente, reduz a artrite induzida por CpG num modelo animal. No documento US 6225292, Raz et al. descrevem um motivo hexamérico específico, designado como 5'-purina-purina-[Y]-[Z]-pirimidina-pirimidina-3', onde Y é qualquer nucleótido excepto citosina e Z é qualquer nucleótido, em que quando Y não é guanosina ou inosina, Z é guanosina ou inosina, que bloqueia a actividade estimuladora de sequências CpG imunoestimuladoras. Em cada dos exemplos anteriores, 14 demonstrou-se que a IIS inibe especificamente a activação imunitária causada por sequências CpG estimuladoras.

Terapia de Ácido Nucleico

Terapia Antí-sentído: Os oligonucleótidos anti-sentido foram originalmente concebidos como complementares a genes alvo específicos, de modo a diminuir a sua expressão (Krieg, Annu. Rev. Irmunol., 20: 709-760, 2002). De modo a prevenir a degradação destes oligonucleótidos, as estruturas eram, em geral, modificadas, tal como numa estrutura fosforotioato. Embora em muitos casos os oligonucleótidos anti-sentido suprimissem a expressão de genes alvo em células de cultura de tecidos, experiências in vivo eram menos bem-sucedidas a alterarem a expressão. Em vez disso, muitos investigadores verificaram, inesperadamente, que alguns destes oligonucleótidos estimulavam a resposta imunitária in vivo. Por exemplo, o oligonucleótido anti-sentido contra o gene rev do vírus da imunodeficiência humana (HIV) tinha um efeito imunoestimulador, como manifestado por proliferação aumentada de células B e esplenomegalia (Branda et al., Biochem. Pharmacol., 45: 2037-2043, 1993). Embora não fosse identificada nenhuma sequência motivo imunoestimuladora imediata a partir destes estudos iniciais, estas constatações conduziram à eventual pesquisa para motivos imunoestimuladores específicos.

Terapia Génica: Terapêutica polinucleotídica, incluindo ADN livre codificando péptidos e/ou polipéptidos, ADN formulado em agentes facilitando a precipitação e transfecção e vectores virais foi utilizada para "terapia génica". A terapia génica é a distribuição de um polinucleótido, de modo a proporcionar 15 expressão de uma proteína ou péptido, para substituir uma proteína ou péptido defeituoso ou ausente no hospedeiro e/ou para aumentar uma desejada função fisiológica. A terapia génica inclui métodos gue resultam na integração de ADN no genoma de um indivíduo para fins terapêuticos. Exemplos de terapia génica incluem a distribuição de ADN codificando factores de coagulação para hemofilia, adenina desaminase para imunodeficiência combinada grave, receptor de lipoproteína de baixa densidade para hipercolesterolemia familiar, glucocerebrosidase para doença de Gaucher, αΐ-antitripsina para deficiência de al-antitripsina, genes de alfaglobina ou Betaglobina para hemoglobinopatias e canais de cloretos para fibrose guística (Verma e Somia, Nature, 389, 239-42, 1997).

Imunização de ADN para tratar infecção: Na imunização de ADN, uma unidade de transcrição não replicante pode proporcionar o molde para a síntese de proteínas ou segmentos de proteínas que induzem ou proporcionam respostas imunitárias específicas no hospedeiro. A injecção de ADN livre promove a vacinação contra uma variedade de micróbios e tumores (Robinson e Torres, Semin Immunol, 9, 271-83, 1997) . Vacinas de ADN codificando proteínas específicas, presentes em vírus (vírus da hepatite B, vírus da imunodeficiência humana, rotavírus e vírus da influenza), bactérias (mycobacterium tuberculosis) e parasitas (Malária), todos antigénios não próprios, estão sendo desenvolvidas de modo a prevenir e tratar estas infecções (Le et al., Vaccine, 18, 1893-901, 2000); (Robinson e Pertmer, Adv Vírus Res, 55, 1-74, 2000) . ADN para tratar neoplasia: Vacinas de ADN codificando antigénio de classe I de histocompatibilidade principal, citocinas (IL-2, IL-12 e IFN-gama) e antigénios tumorais estão 16

sendo desenvolvidos, de modo a tratar a neoplasia (Wlazlo e Ertl, Arch Immunol Ther Exp, 49:1-11, 2001). Por exemplo, ADN virai codificando o idiótipo de imunoglobulina de célula B (região de ligação de antigénio) foi administrado para eliminar e proteger contra linfornas de células B (Timmerman et al., Blood, 97: 1370-1377, 2001).

Imunização de ADN para tratar doença auto-imune: Outros descreveram terapias de ADN codificando moléculas imunitárias para tratar doenças auto-imunes. Tais terapias de ADN incluem ADN codificando as regiões de ligação de antigénio do receptor de célula T, de modo a alterar níveis de células T auto-reactivas dirigindo a resposta auto-imune (Waisman et al., Nat Med, 2:899-905, 1996) (Patente US 5939400). ADN codificando auto-antigénios foi conjugado a partículas e distribuído por canhão de genes para a pele, de modo a prevenir esclerose múltipla e artrite induzida por colagénio. (Patente WO 97/46253) (Ramshaw et al., Immunol., e Cell Bio., 75:409-413, 1997) ADN codificando moléculas de adesão, citocinas (TNF alfa), guimiocinas (guimiocinas C-C) e outras moléculas imunitárias (ligando de Fas) foram utilizados para tratar modelos animais de doença auto-imune (Youssef et al., J Clin Invest, 106:361-371, 2000); (Wildbaum et al., J Clin Invest, 106:671-679,2000); (Wildbaum et al., J Immunol·, 165:5860-5866, 2000); (Wildbaum et al., J Immunol, 161:6368-7634, 1998); (Youssef et al., J Autoimmun, 13:21-9, 1999). É um objectivo da presente invenção proporcionar um método e composição para tratamento ou prevenção de uma doença, particularmente doença auto-imune ou doença inflamatória, compreendendo a administração de ácidos nucleicos imunomoduladores. É outro objectivo desta invenção proporcionar 17 os meios de identificação das sequências imunomoduladoras para tratamento de doença. É ainda outro objectivo desta invenção proporcionar o método e meios de tratamento de uma doença associada a autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) que estão presentes e envolvidos num processo não fisiológico num animal, compreendendo a administração de uma sequência imunomoduladora em combinação com um polinucleótido codificando autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s). É outro objectivo da presente invenção proporcionar uma composição para tratamento ou prevenção de uma doença associada a autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) que estão presentes não fisiologicamente num animal. A invenção refere-se, adicionalmente, ao tratamento ou prevenção de doença compreendendo a administração dos ácidos nucleicos imunomoduladores em combinação com automolécula(s). Estes e outros objectivos desta invenção serão evidentes a partir da memória descritiva como um todo.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método de preparação de um vector plasmidico, cujo método compreende a modificação de um vector que contém um motivo CpG de fórmula 5'-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3', de modo a efectuar uma substituição de citosina por não citosina dentro do dinucleótido CpG, em que o vector compreende, adicionalmente, um polinucleótido codificando uma proteina de mielina ou uma proteina de insulina. 18 A invenção proporciona, adicionalmente, um vector pVAXl™ modificado, compreendendo os seguintes nucleótidos na estrutura do vector: G nos nucleótidos 784, 1161, 1218 e 1966; A nos nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 e 1997; e T nos nucleótidos 1963 e 1987 e G nos nucleótidos 1831, 1876, 1942 e 1999.

Adicionalmente, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o referido vector modificado.

As composições da invenção podem ser utilizadas na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença auto-imune, seleccionada de esclerose múltipla e diabetes Mellitus dependente de insulina.

As composições da invenção podem ser utilizadas num método de tratamento de uma doença auto-imune, seleccionada de esclerose múltipla e diabetes Mellitus dependente de insulina. A presente invenção é baseada na verificação de que sequências imunomoduladoras, isoladamente ou em combinação, poderiam ser utilizadas para prevenir ou tratar doenças auto-imunes ou inflamatórias associadas a automoléculas. Até esta invenção, não era entendido que sequências imunomoduladoras contendo um dinucleótido GpG ou outro dinucleótido modulador, como aqui se descreve, em determinados motivos de sequências imunomoduladoras, pudessem ser utilizadas para prevenir ou tratar doenças inflamatórias ou auto-imunes que eram independentes de estimulação de ISS próxima ou concorrente (e. 19 g., ADN microbiano ou vectores recombinantes contendo CpGs). São exemplos dos motivos de sequências imunomoduladoras: 5'-Purina-Pirimidina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3'; e, 5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3'

Os objectivos da presente invenção são alcançados por uma composição inovadora para tratar ou prevenir uma doença, particularmente uma doença auto-imune ou inflamatória, compreendendo ácidos nucleicos imunomoduladores tendo uma ou mais sequências imunomoduladoras. Os ácidos nucleicos imunomoduladores podem ser administrados isoladamente ou em combinação com um polinucleótido codificando autoproteina(s), autopolipéptido(s), autopéptido(s). Os ácidos nucleicos imunomoduladores também podem ser administrados em combinação com outras automoléculas, de modo a tratar uma doença auto-imune ou inflamatória associada a uma ou mais automoléculas que estão presentes no indivíduo não fisiologicamente. A invenção refere-se, adicionalmente, a composições farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de uma doença auto-imune ou inflamatória, em que a composição farmacêutica compreende uma sequência imunomoduladora na forma de um polinucleótido, tal como um polinucleótido de ADN. A sequência imunomoduladora também pode ser incorporada dentro de um vector, por modificação de elementos de uma sequência nucleotídica de vector, de modo a incluir motivos de sequência imunomoduladora compreendendo, adicionalmente, um motivo dinucleotídico inibitório quando utilizado no contexto de doenças associadas a automoléculas 20 presentes no indivíduo não fisiologicamente, tal como em doença auto-imune ou inflamatória.

Outros objectivos da presente invenção são alcançados por uma composição inovadora, para utilização no tratamento ou prevenção de esclerose múltipla ou diabetes Mellitus dependente de insulina, que são doenças associadas a uma ou mais autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) presentes no animal não fisiologicamente, o referido tratamento compreendendo administrar ao animal uma sequência imunomoduladora. 0 pedido refere-se, adicionalmente, a um método inovador de tratamento ou prevenção de uma doença num animal associada a uma ou mais autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) que estão presentes no animal não fisiologicamente, compreendendo administrar ao animal uma sequência imunomoduladora em combinação com um polinucleótido codificando a(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s).

Num aspecto da invenção, é proporcionada uma composição para tratamento ou prevenção de esclerose múltipla, diabetes Mellitus dependente de insulina, o referido tratamento ou prevenção compreendendo administrar ao animal uma sequência imunomoduladora, quer isoladamente ou em combinação com um autovector, compreendendo um polinucleótido codificando autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) associado(s) à doença auto-imune. Noutro aspecto da invenção, a sequência imunomoduladora é para administrar em combinação com um polinucleótido, compreendendo ADN codificando a(s) autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) presentes no indivíduo num estado não fisiológico e associados a uma doença. 21

Noutro aspecto do presente pedido, é proporcionado um método para tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias, tais como osteoartrite, gota, pseudogota, doença de deposição de hidroxiapatite, asma, higroma, tendinite, conjuntivite, uretrite, cistite, balanite, dermatite, doença arterial coronária ou dor de cabeça de enxaqueca, compreendendo administrar ao animal uma sequência imunomoduladora, quer isoladamente ou em combinação.

Ainda noutro aspecto do pedido, é proporcionado um método para tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com transplantação de órgãos ou células, incluindo mas não limitadas a GVHD ou rejeição de transplante, compreendendo administrar ao animal uma sequência imunomoduladora, quer isoladamente ou em combinação com um autovector, compreendendo um polinucleótido codificando autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) associado(s) a GVHD ou rejeição de transplante. A administração da sequência imunomoduladora e do autovector, compreendendo um polinucleótido codificando a(s) autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) modula uma resposta imunitária à(s) autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) expresso (s) pelo autovector.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: IMS (IMS inibitória) suprime a proliferação de esplenócitos intactos mediada por ISS (CpG-ODN) e está dependente de TLR-9. (A) Esplenócitos intactos foram cultivados com CpG-ODN estimulador e concentrações crescentes de IMS inibitória, como indicado, durante 72 h. Os poços foram submetidos a um pulso com 1 pCi de [3H]TdR, durante as 16 h 22 finais de cultura, antes de a radioactividade incorporada ser medida. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados + /- SD. (B) Esplenócitos intactos de murganhos TLR-9 WT (barras a sombreado cruzado) e TLR-9 KO (barras a preto) foram isolados e cultivados com CpG-ODN estimulador, IMS inibitória ou LPS, durante 72 h. Os poços foram submetidos a um pulso com 1 pCi de [3H]TdR, durante as 16 h finais de cultura, antes de a radioactividade incorporada ser medida. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados + /- SD. (C) IMS inibe a fosforilação de ΙκΒ-α em Serina 32. Esplenócitos naive foram cultivados na presença do oligo indicado, a 5 pg/mL, durante 72 h. A fosforilação de ΙκΒ-α em Serina 32 foi determinada por análise de transferência Western de 20 pg de cada extracto de proteína. ΙκΒ-α é activado na presença de CpG estimulador (corredor 2) ou CpG estimulador e oligo de controlo (corredor 6), mas fica reduzido em activação com a adição da IMS ao oligo CpG estimulador (corredor 5).

Figura 2: IMS inibitória reduz expressão de classe II de MHC de superfície celular e molécula co-estimuladora. (A)

Esplenócitos naive foram cultivados na ausência ou presença quer de CpG-ODN estimulador (5 pg/mL) ou IMS inibitória (5 pg/mL). As células foram recolhidas após 72 h. ADNc foi sintetizado a partir de ARN purificado para análise de PCR quantitativo. A quantidade de ARN para classe II de MHC é indicada como unidades relativas em comparação com quantidade de β-actina presente em cada amostra. (B) Esplenócitos naive foram cultivados na presença da quantidade indicada de cada oligonucleótido (em pg/mL). A percentagem de células positivas para expressão de classe II de MHC foi analisada por FACS e, como mostrado, há uma inibição dependente de dose da expressão de classe II de MHC com concentrações crescentes do oligonucleótido inibidor. (C a F) 23

Efeito de IMS inibitória (oligo inibidor) sobre a expressão de marcadores de activação de APC. Esplenócitos naive foram cultivados com as concentrações indicadas de CpG-ODN estimulador, IMS inibitória ou ODN de controlo. As células foram recolhidas após 72 h. A análise de FACScan foi utilizada para avaliar a expressão de CD40 (C), CD80 (D), CD86 (E) e CDld (F) . Há uma redução dependente de dose na expressão de CD40, CD80 e CD86, mas um aumento dependente de dose na expressão de CDld com a IMS inibitória.

Figura 3: IMS inibitória suprime a produção de citocina

Thl. Esplenócitos naive foram cultivados com as concentrações indicadas de CpG-ODN estimulador, IMS inibitória ou ODN de controlo. Os sobrenadantes foram recolhidos após 72 h. A produção de IL6 (A) e ILl2p40 (B) foi medida por ELISA. Como indicado, há uma inibição dependente de dose da produção tanto de IL6 como lLl2p40 com concentrações crescentes da IMS. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados.

Figura 4: Terapia de prevenção com IMS Inibitória suprime ΕΆΕ mediada por PLPi39_i5i. Murganhos SJL/J foram imunizados subcutaneamente com 100 pg de péptido PLPi39_i5i em pbs, emulsionado em CFA. 50 pg da IMS ressuspensos em PBS foram administrados intraperitonealmente, catorze e sete dias antes da imunização peptidica. Os animais foram clinicamente pontuados diariamente. Grau 1, paralisia da cauda, grau 2, paraparesia de membro posterior, grau 3, paralisia de membro posterior, grau 4, paralisia completa (tetraplegia), grau 5, morte.

Figura 5: Terapia de prevenção com IMS Inibitória suprime EAE mediada por PLP139_151. Murganhos SJL/J foram imunizados subcutaneamente com 100 pg de péptido PLPi39_i5i em CFA, 24 consistindo em adjuvante incompleto de Freund e 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis inactivado por calor. 50 pg do ODN indicado, resuspenso em PBS, foram administrados intraperitonealmente no mesmo dia (dia 0) que a imunização peptidica. Os animais foram clinicamente pontuados diariamente. Grau 1, paralisia da cauda, grau 2, paraparesia de membro posterior, grau 3, paralisia de membro posterior, grau 4, paralisia completa (tetraplegia), grau 5, morte.

Figura 6: Efeitos de proliferação diferencial de IMS sobre células T específicas de antigénio purificadas. (A) IMS inibitória suprime células Thl. Esplenócitos intactos naive foram co-cultivados com péptido PLPi39_i5i e o ODN indicado, durante 24 h. Após irradiação dos esplenócitos carregados com péptido, foi adicionada uma linha celular Thl especifica de PLPi39_i5i, durante outras 72 h. A IMS não estimula a proliferação celular Thl e, de facto, diminui ligeiramente a proliferação induzida por CpG-ODN. (B) Em contraste, a IMS inibitória não inibe a proliferação de uma linha celular Th2 especifica de PLPi39_i5i. Note-se que o CpG-ODN reduz a proliferação desta linha celular Th2. Em cada uma destas três experiências, os poços foram submetidos a um pulso com 1 pCi de [3H]TdR, durante as 16 h finais de cultura, antes de a radioactividade incorporada ser medida. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados +/- SD.

Figura 7: Modificações no vector pBHTl reduzem a actividade proliferativa de esplenócitos. (A) Esplenócitos intactos foram cultivados com oligonucleótido CpG estimulador e oligonucleótido GpG imunomodulador, durante 24 h. Os poços foram submetidos a um pulso com 1 pCi de [3H] -timidina, durante as 4 h finais de cultura, antes de a radioactividade incorporada ser medida. O 25 índice de estimulação foi calculado com base no grau de proliferação acima da proliferação de esplenócitos incubados apenas com meio. (B) Esplenócitos intactos foram cultivados com o vector vazio pVAXl ou vector vazio pBHTl, às concentrações indicadas, durante 24 h. Os poços foram submetidos a um pulso com 1 pCi de [3H]-timidina, durante as 4 h finais de cultura, antes de a radioactividade incorporada ser medida. 0 índice de estimulação foi calculado com base no grau de proliferação acima da proliferação de esplenócitos incubados apenas com meio.

Figura 8: Activação reduzida de APCs com vector pBHTl.

Esplenócitos naive foram cultivados com CpG a 10 pg/mL ou oligonucleótido GpG (A), ou 100 pg/mL de pVAXl ou pBHTl, durante 48 horas. As células foram recolhidas, coradas ou expressão de CD16/32 e analisadas por FACScan. O gráfico não marcado representa células incubadas apenas com meio.

Figura 9: Produção reduzida de citocina com o vector pBHTl.

Esplenócitos naive foram cultivados com 10 pg/mL de oligo CpG estimulador, oligo GpG imunomodulador, 100 pg/mL de ADN de pVAXl ou 100 pg/mL de ADN de pBHTl. Os sobrenadantes foram recolhidos após os tempos indicados e a produção de IL6, IL10 e ifny foi medida por ELISA em sanduíche. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados.

Figura 10. O vector pBHTl codificando um auto-antigénio reduziu a gravidade de EAE. O adn codificando o auto-antigénio, PLP (proteína de proteolípido) de murganho, foi incorporado dentro do vector pBHTl e administrado intramuscularmente a murganhos SJL. Os murganhos foram primeiro induzidos para EAE com o péptido PLPi39_i5i em CFA (adjuvante completo de Freund) no dia 0 e, depois, vários dias após o começo da doença (no 26 dia 20), foram aleatorizados dentro de diversos grupos de tratamento. Cinquenta pg de PLP de murganho codificada dentro do vector pBHTl ou cinquenta pg de um controlo de vector pBHTl vazio foram, depois, administrados intramuscularmente em três frequências de dose diferentes: (A) uma vez por semana, (B) uma vez de duas em duas semanas e (C) uma vez de quatro em quatro semanas. Os murganhos foram pontuados diariamente para gravidade de doença EAE, numa escala de 1 a 5 e a pontuação média de doença de um grupo de tratamento é representada graficamente. Há uma redução na pontuação média de doença na totalidade dos grupos de tratamento, de um modo muito notável a uma frequência de duas em duas ou de quatro em quatro semanas.

Figura 11: Terapia polinucleotidica com IMS Inibitória suprime EAE mediada por PLPi39_i5i. No dia 0, murganhos SJL/J fêmea, de sete semanas de idade, foram imunizados subcutaneamente com 100 pg de PLPi39_i5i em PBS emulsionado em CFA, consistindo em IFA e 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis inactivado por calor. Os animais foram clinicamente pontuados diariamente, com inicio no dia 7. No dia 12, os murganhos foram injectados em ambos os quadriceps, com um total de 0,1 mL de Bupivacaína-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, murganhos seleccionados foram injectados intramuscularmente em ambos os quadriceps com polinucleótido de ADN codificando PLP, MAG, MOG e MBP murinos de comprimento completo, cada um num plasmídeo pTARGET separado (25 pg de cada), mais 50 pg de plasmideo pTARGET codificando IL-4 murina de comprimento completo, num volume total de 0,2 mL de TE. As injecções de ADN foram proporcionadas em intervalos semanais, durante seis semanas. Ao mesmo tempo que o tratamento de ADN inicial, 50 pg de IMS num volume de 200 pL de PBS foram administrados intraperitonealmente, isoladamente ou com tratamento de 27 polinucleótido de ADN. A IMS foi proporcionada de duas em duas semanas, durante seis semanas.

Figura 12: Perfil de citocina de grupos tratados com EAE.

Cinquenta e sete dias após indução da doença EAE, os murganhos foram sacrificados e os nódulos linfáticos inguinais e axilares de cada murganho foram extraídos e agregados, de acordo com os grupos respectivos. As células foram isoladas e estimuladas com 10 pg/mL em PLPi39_i5i em meios RPMI enriquecidos e FCS a 10%. Três dias mais tarde, os sobrenadantes celulares foram recolhidos e testados para perfil de citocina por ELISA em sanduíche, utilizando kits de ELISA padrão de (A) IFN-gama, (B) IL-4 e (C) IL-10 murinos da BD Pharmingen.

Figura 13: Análise de disseminação de epitopo de auto-anticorpo de mielina utilizando tecnologia de micromatriz de proteína. Catorze dias após o começo e a seguir a recuperação parcial de EAE paralítica aguda induzida com PLP139-151, murganhos SJL/J foram tratados semanalmente com veículo de PBS, IMS, MBP expressando pTARGET, PLP, MOG e MAG (DPT) e IL-4; DPT e IL-4 mais IMS; DPT e IL-4 mais CpG. A seguir ao tratamento de seis semanas, foi obtido soro de cada grupo de tratamento, incluindo soro de murganho normal (NMS), realizada a análise de micromatriz de proteína de mielina e SAM utilizado para identificar e criar uma análise hierárquica de aglomerado, de modo a ordenar as características antigénicas.

Figura 14: IMS Inibitória, isoladamente e em combinação com terapia polinucleotídica, suprime EAE mediada por PLP139-151. No

dia 0, murganhos SJL/J fêmea, de sete semanas de idade, foram imunizados subcutaneamente com 100 pg de PLPi39_i5i em PBS emulsionado em CFA, consistindo em IFA e 0,5 mg de Mycobacterium 28 tuberculosis inactivado por calor. Os animais foram clinicamente pontuados diariamente, com início no dia 7. No dia 14, os murganhos foram injectados em ambos os quadríceps, com um total de 0,1 mL de Bupivacaína-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, murganhos seleccionados foram injectados intramuscularmente em ambos os quadríceps com polinucleótido de ADN codificando PLP, MAG, MOG e MBP murinos de comprimento completo, cada num plasmídeo pTARGET separado (25 pg de cada), mais 50 pg de plasmídeo pTARGET codificando IL-4 murina de comprimento completo, num volume total de 0,2 mL de TE. As injecções de ADN foram proporcionadas em intervalos semanais, durante seis semanas. Ao mesmo tempo que o tratamento de ADN inicial, 50 pg de IMS num volume de 200 pL de PBS foram administrados intraperitonealmente, isoladamente (A) ou com tratamento de polinucleótido de ADN (B). A IMS foi proporcionada de duas em duas semanas, durante seis semanas.

Figura 15: Terapia Polinucleotídica de ADN e IMS trata a diabetes em murganhos NOD. Murganhos NOD/Lt fêmea foram obtidos com 7 semanas de idade e alojados numa sala de acesso restrito. Os murganhos foram testados semanalmente para níveis de glucose no sangue (BGL) elevados, com início às 10 semanas de idade, utilizando o One Touch Ultra Blood Glucose Monitoring System. O tratamento foi iniciado quando a BGL estava entre 200 a 250 mg/dL. Os murganhos foram adicionados sequencialmente a cada grupo à medida que ficavam disponíveis, começando com a idade de 15 semanas. Os murganhos foram injectados em ambos os quadríceps, com um total de 0,2 mL de Bupivacaína-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os murganhos foram injectados intramuscularmente em ambos os quadríceps com: 1) polinucleótido de ADN codificando pré-proinsulina 1 e pré-proinsulina 2 murina de comprimento completo, cada num vector pVAXl separado, 29 a 50 pg/dose; ou, 2) polinucleótido de ADN codificando pré-proinsulina 1 e pré-proinsulina 2 murina de comprimento completo, cada num vector pVAXl separado, a 50 pg/dose mais plasmideo pVAXl codificando IL4 num volume total de 0,2 mL de PBS. As injecções foram proporcionadas em intervalos semanais, durante quatro semanas. Ao mesmo tempo que o tratamento de ADN inicial, 50 pg de IMS num volume de 200 pL de PBS foram administrados intraperitonealmente, isoladamente ou com tratamento de polinucleótido de ADN. A IMS foi proporcionada em intervalos semanais, durante quatro semanas. A percentagem de sobrevivência ao longo da progressão de diabetes observada foi examinada durante nove semanas, após o tratamento inicial (A) . A percentagem de diabéticos às 29 semanas de idade é definida como murganhos com uma BGL constante acima de 250 mg/dL (B).

Figura 16: Terapia Polinucleotidica de ADN e IMS trata a diabetes em murganhos NOD. Murganhos NOD/Lt fêmea foram obtidos com 7 semanas de idade e alojados numa sala de acesso restrito. Os murganhos foram testados semanalmente para niveis de glucose no sangue (BGL) elevados, com inicio às 10 semanas de idade, utilizando o One Touch Ultra Blood Glucose Monitoring System. O tratamento foi iniciado guando a BGL estava entre 200 a 250 mg/dL. Os murganhos foram adicionados sequencialmente a cada grupo à medida que ficavam disponíveis, começando com a idade de 15 semanas. Os murganhos foram injectados em ambos os quadriceps, com um total de 0,2 mL de Bupivacaina-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os murganhos foram injectados intramuscularmente em ambos os quadriceps com: 1) tratados com PBS, 2) plasmideo pVAXl vazio, a 200 pg/dose, 3) IMS, a 50 pg/dose proporcionados intramuscularmente, 4) a combinação de plasmideo pVAXl vazio mais IMS (intramuscularmente), 5) a combinação de polinucleótido de ADN codificando pré-proinsulina 30 1 e pré-proinsulina 2 murina de comprimento completo, cada num vector pVAXl separado, a 50 pg/dose, 6) a combinação de polinucleótido de ADN mais IMS (intramuscularmente), 7) a combinação de polinucleótido de ADN mais 50 pg/dose de um plasmideo pVAXl codificando IL-4, 8) a combinação de polinucleótido de ADN mais IL-4 mais IMS (intramuscularmente), 9) a combinação de polinucleótido de ADN mais IL-4 e uma injecção intraperitoneal de 50 pg/dose separada de IMS, num volume total de 0,2 mL de PBS. Todas as injecções foram proporcionadas em intervalos semanais, durante oito semanas. A percentagem de diabéticos é definida como murganhos com uma BGL constante acima de 250 mg/dL. A percentagem de sobrevivência ao longo da progressão de diabetes observada foi examinada durante oito semanas, após o tratamento inicial.

Figura 17: Terapia de ADN com IMS Inibitória suprime CIA induzida por colagénio de Tipo II. Grupos de 20 murganhos DBA/1 macho, de seis semanas de idade, foram pré-tratados IM com 50 pg das vacinas de ADN indicadas, 14 e 7 dias antes de indução de CIA, com CII emulsionado em Adjuvante Completo de Freund. Os murganhos receberam uma terceira dose de vacina de ADN tolerizante, 1 semana após indução de CIA. Os murganhos foram reforçados, 2 semanas mais tarde, com CII emulsionado em Adjuvante Incompleto de Freund. A artrite foi pontuada utilizando o sistema de pontuação visual, como descrito em Current Protocols in Immunology. (A) ADN codificando colagénio de tipo II intacto (CII), em combinação com ADN codificando IL-4, com e sem IMS, resultou em reduções significativas na gravidade média de artrite, em comparação com grupos de controlo tratados com vector de vacina de ADN (pTarget) + IL-4, com ou sem IMS. (B) A percentagem global de incidência de doença era comparável em todos os grupos. 31

Figura 18: Ensaio de proliferação de grupos tratados com CIA. Vinte e sete dias após reforço de imunização de CIA, os murganhos foram sacrificados e os nódulos linfáticos inguinais e axilares de cada murganho foram extraídos e agregados, de acordo com os grupos respectivos. As células foram isoladas e estimuladas com colagénio de tipo II desnaturado a 100 pg/mL, em meios RPMI enriquecidos e FCS a 10%, durante 72 horas. As células foram submetidas a um pulso com 1 pCi de [3H]TdR, durante as 16 h finais de cultura, antes de a radioactividade incorporada ser medida. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados +/- SD.

Figura 19: Perfil de citocina de grupos tratados com CIA.

Vinte e sete dias após reforço de imunização de CIA, os murganhos foram sacrificados e os nódulos linfáticos inguinais e axilares de cada murganho foram extraídos e agregados, de acordo com os grupos respectivos. As células foram isoladas e estimuladas com colagénio de tipo II desnaturado a 100 pg/mL, em meios RPMI enriquecidos e FCS a 10%, durante 72 horas. Os sobrenadantes foram recolhidos e testados para perfil de citocina por ELISA em sanduíche, utilizando kits de ELISA padrão de (A) IL-6, (B) IL-4, (C) iFN-gama e (D) TNF-alfa murinos da BD Pharmingen.

Figura 20: Terapia de ADN com IMS Inibitória suprime CIA induzida por colagénio de Tipo II. Grupos de 20 murganhos DBA/1 macho, de seis semanas de idade, foram pré-tratados IM com 50 pg das vacinas de ADN indicadas e IP com IMS, 14 e 7 dias antes de indução de CIA, com CII emulsionado em Adjuvante Completo de Freund. Os murganhos receberam uma terceira dose de vacina de ADN tolerizante e IMS, 1 semana após indução de CIA. Os murganhos foram reforçados, 2 semanas mais tarde, com CII 32 emulsionado em Adjuvante Incompleto de Freund. A artrite foi pontuada utilizando o sistema de pontuação visual, como descrito em Current Protocols in Immunology. (A) Murganhos tratados com IMS, resultou em reduções significativas na gravidade média de artrite, em comparação com o grupo de controlo não tratado e o grupo tratado com ADN codificando colagénio de tipo II intacto (CII), em combinação com IMS. (B) A percentagem global de incidência de doença foi diminuída no grupo tratado com IMS, comparativamente com os outros dois comparáveis em todos os grupos.

Figura 21: IMS inibitória suprime a proliferação de células B mediada por ISS (CpG-ODN). Células B primárias foram isoladas do baço por uma técnica padrão de enriquecimento de células B, utilizando um anticorpo IgG e IgM de cabra anti-murganho, específico de cadeia pesada e leve, com globulina gama de cabra como uma proteína veículoa e pureza >97% de células B220+ foi determinada por análise de FACScan. As células B foram cultivadas com 5 pg/mL de oligo indicado, durante 72 h. LPS foi co-cultivado a 100 ng/mL. Os poços foram submetidos a um pulso com 1 pCi de [3H]TdR, durante as 16 h finais de cultura, antes de a radioactividade incorporada ser medida. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados +/- SD.

Figura 22: IMS inibitória suprime a produção de citocina Thl de células B. Células B primárias naive foram cultivadas com as concentrações indicadas de CpG-ODN estimulador, IMS inibitória ou ODN de controlo. Os sobrenadantes foram recolhidos após 72 h. A produção de IL6 (A); IFN-gama (B), IL-10 (C) e lLl2p40 (D) foi medida por ELISA. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados. 33

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes da descrição da presente invenção em detalhe, deve ser compreendido que esta invenção não está limitada a formulações ou parâmetros de processo particulares, visto que os mesmos podem, certamente, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é apenas para efeitos de descrição de particulares formas de realização da invenção e não se pretende que seja limitativa.

Definições "Acido nucleico" e "polinucleótido", como aqui utilizados, são sinónimos e referem-se a um polimero de nucleótidos (e. g., desoxinucleótido, ribonucleótido ou um seu análogo). yy01igonucleótido", como aqui utilizado, refere-se a um subconjunto de ácido nucleico de cerca de 6 a cerca de 175 nucleótidos ou mais, em comprimento. Oligonucleótidos típicos têm até cerca de 100 nucleótidos em comprimento. Oligonucleótido refere-se tanto a oligorribonucleótidos como a oligodesoxirribonucleótidos, aqui a seguir referidos como ODN. Os ODN incluem oligonucleósidos e outros polímeros contendo bases orgânicas.

Os nucleótidos são moléculas compreendendo um açúcar (de um modo preferido, ribose ou desoxirribose) ligado a um grupo fosfato e uma base orgânica permutável, que pode ser quer uma purina substituída (guanina (G), adenina (A) ou inosina (I)) ou uma pirimidina substituída (timina (T), citosina (C) ou uracilo (U)) . 34

Sequências imunomoduladoras (IMS). "Sequência imunomoduladora" ou "IMS", como aqui utilizados, refere-se a uma sequência de nucleótidos de um ácido nucleico ou região de um ácido nucleico que é capaz de modular uma doença auto-imune ou inflamatória. Uma IMS pode ser, por exemplo, um oligonucleótido ou uma sequência de nucleótidos incorporada num vector. Um "ácido nucleico imunomodulador", como aqui utilizado, significa uma molécula de ácido nucleico que compreende uma ou mais IMS.

Os termos "identidade" ou "percentagem de identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptidicas, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleótidos que são iguais, quando comparadas e alinhadas para máxima correspondência, como medida utilizando quer um algoritmo de comparação de sequências, tal como, e. g., PILEUP ou BLAST ou um algoritmo semelhante (Ver, e. g., Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151-153,1989; Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410,1990). O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser conduzido, e. g., pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970, pela pesquisa para método de semelhança de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Scl. USA, 85:2444, 1988, por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por inspecção visual (ver, em geral, Ausubel et al., supra). A expressão "substancialmente idêntico", no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais 35 sequências ou subsequências que têm, pelo menos 60%, de um modo preferido, pelo menos 70%, de um modo mais preferido, pelo menos 80% e, de um modo muito preferido, pelo menos 90% ou, pelo menos, 95% de identidade de nucleótido ou resíduo de aminoácido, quando comparadas e alinhadas para máxima correspondência. De um modo preferido, a identidade substancial existe ao longo de uma região das sequências que tem, pelo menos, cerca de 50 resíduos em comprimento, de um modo mais preferido, ao longo de uma região de, pelo menos, cerca de 100 resíduos e, de um modo muito preferido, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de, pelo menos, cerca de 150 resíduos. Numa forma de realização preferida, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento de um determinado ácido nucleico ou polipéptido. Em determinadas formas de realização da invenção, um ácido nucleico ou polipéptido (e. g., autoproteína, autopolipéptido ou autopéptido ou um ácido nucleico codificando a autoproteína, autopolipéptido ou autopéptido) é substancialmente idêntico a um ácido nucleico ou polipéptido específico aqui divulgado. "Automoléculas", como aqui utilizado, inclui autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteína(s) e autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteína(s) modificado(s) pós-traducionalmente. "Autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s), ou seu(s) fragmento(s) ou derivado(s)" inclui proteína(s), polipéptido(s) ou péptido(s) codificado(s) dentro do genoma do animal; é produzido ou gerado no animal; pode ser modificado pós-traducionalmente em algum momento durante a vida do animal; ou está presente no animal não fisiologicamente. O termo "não fisiológico" ou "não fisiologicamente", quando 36 utilizado para descrever as autoproteínas, autopolipéptidos ou autopéptidos desta invenção, significa uma mudança ou desvio do papel ou processo normal no animal para essa autoproteina, autopolipéptido ou autopéptido. Quando fazendo referência à autoproteina, autopolipéptido ou autopéptido como "associado a uma doença" ou "envolvido numa doença" compreende-se que significa que a autoproteina, autopolipéptido ou autopéptido pode ser modificado na forma ou estrutura e, deste modo, não ser capaz de realizar o seu papel ou processo fisiológico; ou pode estar envolvido na patofisiologia do estado ou doença, quer através da indução da patofisiologia, mediação ou facilitação de um processo patofisiológico; e/ou sendo o alvo de um processo patofisiológico. Por exemplo, na doença auto-imune, o sistema imunitário aberrantemente ataca automoléculas, tais como autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolipido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteina(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteina(s) modificado(s) pós-traducionalmente causando dano e disfunção de células e tecidos nos quais a automolécula é expressa e/ou está presente. Alternativamente, a molécula pode, por si só, ser expressa a niveis não fisiológicos e/ou função não fisiologicamente. Por exemplo, em doenças neurodegenerativas, as autoproteínas são aberrantemente expressas e agregam-se em lesões no cérebro causando, desse modo, disfunção neural. Em outros casos, a automolécula agrava um estado ou processo não desejado. Por exemplo, na osteoartrite, autoproteínas, incluindo colagenases e metaloproteinases de matriz, aberrantemente degradam a cartilagem cobrindo a superfície articular das articulações. São exemplos de modificações pós-traducionais de autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) a glicosilação, adição de grupos lipídicos, desfosforilação por fosfatases, adição de 37 resíduos de dimetilarginina, citrulinação de filagrina e fibrina por peptidil arginina desaminase (PAD); fosforilação de alfa B-cristalina; citrulinação de MBP; e proteólise de auto-antigénio SLE por caspases e granzimas. Imunologicamente, autoproteína, autopolipéptido ou autopéptido seriam todos considerados auto-antigénios de hospedeiro e, em condições fisiológicas normais, são ignorados pelo sistema imunitário do hospedeiro através da eliminação, inactivação ou ausência de activação de células imunitárias que têm a capacidade de reconhecer auto-antigénios, através de um processo designado "tolerância imunitária". Autoproteína, autopolipéptido ou autopéptido não incluem proteínas, polipéptidos ou péptidos imunitários que são moléculas expressas fisiologicamente, especificamente e exclusivamente por células do sistema imunitário para efeitos de regulação da função imunitária. 0 sistema imunitário é o mecanismo de defesa que proporciona os meios para efectuar respostas rápidas, altamente específicas e protectoras contra a miríade de microrganismos potencialmente patogénicos habitando o mundo do animal. São exemplos de proteína(s), polipéptido(s) ou péptido(s) imunitários proteínas compreendendo o receptor de células T, imunoglobulinas, citocinas incluindo as interleucinas de tipo I e as citocinas de tipo li, incluindo os interferões e IL-10, TNF-α, linfotoxina e as quimiocinas, tais como a proteína 1 alfa e beta inflamatória de macrófago, proteína quimiotáctica de monócito e RANTES e outras moléculas directamente envolvidas na função imunitária, tal como ligando Fas. Existem determinadas proteínas, polipéptido(s) ou péptido(s) imunitários que estão incluídos na autoproteína, autopolipéptido ou autopéptido da invenção e são: glicoproteínas de membrana de classe I de MHC, glicoproteínas de classe II de MHC e osteopontina. Autoproteína, autopolipéptido ou autopéptido não inclui proteínas, polipéptidos e péptidos que estão ausentes do indivíduo, quer 38 inteiramente ou substancialmente, em virtude de uma deficiência genética ou adquirida causando um distúrbio metabólico ou funcional e são substituídos, quer por meio de administração da referida proteína, polipéptido ou péptido, ou por meio de administração de um polinucleótido codificando a referida proteína, polipéptido ou péptido (terapia génica). Exemplos de tais distúrbios incluem distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, fibrose quística, fenilcetonúria, galactosemia, doença urinária de xarope de ácer e homocistinúria. Autoproteína, autopolipéptido ou autopéptido não inclui proteínas, polipéptidos e péptidos expressos, especificamente e exclusivamente, por células que têm características que as distinguem dos seus homólogos normais, incluindo: (1) clonalidade, representando proliferação de uma única célula com uma alteração genética, de modo a formar um clone de células malignas, (2) autonomia, indicando que o crescimento não é adequadamente regulado e (3) anaplasia ou a ausência de diferenciação celular coordenada normal. Células tendo um ou mais dos três critérios anteriores são referidas quer como células neoplásicas, cancerosas ou malignas. "Plasmídeos" e "vectores" são designados por um p minúsculo, seguido de letras e/ou números. Os plasmídeos de partida estão comercialmente disponíveis, publicamente disponíveis numa base sem restrições ou podem ser construídos a partir de plasmídeos disponíveis de acordo com processos publicados. Adicionalmente, plasmídeos equivalentes àqueles descritos são conhecidos na técnica e serão evidentes para o especialista com conhecimentos gerais. Um "vector" ou "plasmídeo" refere-se a qualquer elemento genético que é capaz de replicação, compreendendo controlo e elementos regulatórios convenientes, quando presente numa célula hospedeira. Para os 39 objectivos desta invenção, exemplos de vectores ou plasmídeos incluem mas não estão limitados a plasmídeos, fago, transposões, cosmídeos, vírus e semelhantes. "Ácido nucleico livre", como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico que não é encapsulada (tal como, e. g., dentro de uma partícula virai, célula bacteriana ou lipossoma) e não complexada com uma molécula que se liga ao ácido nucleico (tal como, e. g., DEAE-dextrano) nem, de outro modo, conjugada ao ácido nucleico (e. g., partículas de ouro ou suportes baseados em polissacáridos). "Tratando", "tratamento" ou "terapia" de uma doença ou distúrbio deverão significar abrandar, parar ou reverter a progressão de doença estabelecida, como evidenciado por uma diminuição, cessação ou eliminação quer de sintomas clínicos ou de diagnóstico, por meio de administração do ácido nucleico imunomodulador desta invenção. "Doença estabelecida" significa que o sistema imunitário está activo, fazendo com que os tecidos afectados fiquem inflamados e anormalmente infiltrados por leucócitos e linfócitos. "Tratando", "tratamento" ou "terapia" de uma doença ou distúrbio também deverão significar abrandar, parar ou reverter a progressão da doença por meio de administração de um ácido nucleico imunomodulador, em combinação com uma automolécula. "Automoléculas", como aqui utilizado, refere-se a autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteína (s) e autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteína(s) modificado(s) pós-traducionalmente. "Tratando", "tratamento" ou "terapia" de uma doença ou distúrbio deverão, adicionalmente, significar abrandar, parar ou reverter a progressão da doença por meio de 40 administração de um ácido nucleico imunomodulador, em combinação com uma terapêutica imunomoduladora. "Em combinação com", quando fazendo referência a um regime terapêutico compreendendo um ácido nucleico imunomodulador e outro composto, por exemplo, ADN codificando uma autoproteina, autopéptido ou autopolipéptido, inclui dois ou mais compostos administrados separadamente mas em conjunto fisicamente, como co-administração num frasquinho de vidro, ligados entre si, como por exemplo por conjugação, codificados por ADN em um ou mais vectores ou administrados separadamente em sítios diferentes mas temporalmente tão próximos um do outro, de modo a serem considerados por um especialista na técnica como sendo administrados "em combinação". Como aqui utilizados, melhorando uma doença e tratando uma doença são equivalentes. "Prevenindo", "profilaxia" ou "prevenção" de uma doença ou distúrbio, como utilizados no contexto desta invenção, referem-se à administração de uma sequência imunomoduladora, quer isoladamente ou em combinação com outro composto, como aqui se descreve, para prevenir a ocorrência ou começo de uma doença ou distúrbio ou algum ou a totalidade dos sintomas de uma doença ou distúrbio ou para diminuir a probabilidade do começo de uma doença ou distúrbio. "Prevenindo", "profilaxia" ou "prevenção" de uma doença ou distúrbio, como utilizados no contexto desta invenção, referem-se à administração de uma sequência imunomoduladora, em combinação com automoléculas, para prevenir a ocorrência ou começo de uma doença ou distúrbio ou algum ou a totalidade dos sintomas de uma doença ou distúrbio ou para diminuir a probabilidade do começo de uma doença ou distúrbio. "Prevenindo", "profilaxia" ou "prevenção" de uma doença ou distúrbio, como utilizados no contexto desta invenção, referem-se à administração de uma sequência imunomoduladora, em 41 combinação com uma terapêutica imunomoduladora, para prevenir a ocorrência ou começo de uma doença ou distúrbio ou algum ou a totalidade dos sintomas de uma doença ou distúrbio ou para diminuir a probabilidade do começo de uma doença ou distúrbio. Como aqui utilizado, "terapêutica imunomoduladora", refere-se àquelas moléculas que, quando administradas a um indivíduo, têm uma função imunomoduladora ou regulatória. Tal terapêutica imunomoduladora inclui citocinas, quimiocinas, esteróides ou anticorpos para antiqénios ou auto-antiqénios. "Indivíduos", deverá significar qualquer animal, tal como, por exemplo, um humano, primata não humano, cavalo, vaca, cão, gato, murganho, rato, cobaio ou coelho.

Doenças Auto-imunes

As composições e métodos aqui descritos são úteis para o tratamento ou prevenção de doenças auto-imunes. Vários exemplos de doenças auto-imunes associadas a automoléculas, incluindo autolípidos, autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido (s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteína(s) e autoproteína(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicoproteína(s) modificado(s) pós-traducionalmente ou derivados de automoléculas presentes no animal não fisiologicamente são expostos na tabela abaixo e são descritos abaixo. 42

Tabela 1. Doença Auto- Tecido Autoproteína(s) Associada(s) A imune Visado Uma Doença Auto-imune Esclerose sistema nervoso proteína básica de mielina, múltipla central proteína de proteolípido, glicoproteína associada a mielina, fosfodiesterase nucleotídica cíclica, glicoproteína associada a ielina, proteína básica oligodendrocítica associada a mielina; alfa B-cristalina; glicoproteína oligodendrocítica de mielina Síndrome de sist. nerv. proteína I de mielina periférica Guillian Barre periférico e outras Diabetes Células beta em tirosina fosfatase IA2, ΙΑ-2β; Mellitus ilhéus do ácido glutâmico descarboxilase Dependente de pâncreas (formas de 65 e 67 kDa), Insulina carboxipeptidase H, insulina, proinsulina, proteínas de chogue térmico, glima 38, antigénio de célula de ilhéu de 69 KDa, p52, veículo de glucose de célula de ilhéu GLUT-2 43

Tabela 1. Doença Auto-imune Tecido Visado Autoproteína(s) Associada(s) A Uma Doença Auto-imune Artrite Reumatóide articulações sinoviais Imunoglobulina, fibrina, filagrina, colagénios de tipo I, II, III IV, V, IX e XI, GP-39, hnRNP Uveíte Auto-imune iris, aparelho uveal Antigénio S, proteína de ligação de interfoto-receptor retinóide (IRBP), rodopsina, recoverina Cirrose Biliar Primária árvore biliar do figado complexos de piruvato desidrogenase (2-oxoácido desidrogenase) Hepatite Auto-imune Fígado Antigénios de hepatócito, citocromo P450 Pênfigo vulgar Pele Desmogleína 1, 3 e outras Miastenia Grave junções nervo-músculo receptor de acetilcolina Gastrite auto-imune estômago/células H+/K+ ATPase, factor intrínseco parietais Anemia Perniciosa Estômago factor intrínseco 44

Tabela 1. Doença Auto-imune Tecido Visado Autoproteína(s) Associada(s) A Uma Doença Auto-imune Polimiosite Músculo histidil ARNt sintetase, outras sintetases, outros antigénios nucleares Tiroidite Auto-imune Tiróide Tiroglobulina, tiróide peroxidase Doença de Graves Tiróide Receptor da hormona estimuladora da tiróide Psoriase Pele Desconhecida Vitiligo Pele Tirosinase, proteína 2 relacionada com tirosinase Lúpus Eritem. Sistémico Sistémico antigénios nucleares: ADN, histonas, ribonucleoproteínas Doença Celiaca Intestino delgado Transglutaminase

Esclerose Múltipla: A esclerose múltipla (MS) é o distúrbio desmielinizante mais comum do sistema nervoso central (SNC) e afecta 350000 Americanos e um milhão de pessoas mundialmente. O começo dos sintomas ocorre tipicamente entre 20 e 40 anos de 45 idade e manifesta-se como um ataque agudo ou subagudo de insuficiência visual unilateral, fraqueza muscular, parestesias, ataxia, vertigem, incontinência urinária, disartria ou perturbação mental (por ordem de frequência decrescente). Tais sintomas resultam de lesões focais de desmielinização que causam, tanto anomalias de condução negativa, em virtude de condução axonal abrandada, como anomalias de condução positiva, em virtude de geração de impulso ectópico (e. g., sintoma de Lhermitte). O diagnóstico de MS é baseado numa história incluindo, pelo menos, dois ataques distintos de disfunção neurológica que sejam separados no tempo, produzam sinais clínicos objectivos de disfunção neurológica e envolvam áreas separadas da matéria branca do SNC. Estudos laboratoriais proporcionando evidência objectiva adicional suportando o diagnóstico de MS incluem imagiologia de ressonância magnética (MRI) de lesões da matéria branca do SNC, fluido espinal cerebral (CSF), bandas oligoclonais de IgG e respostas evocadas anormais. Embora a maioria dos doentes experiencie um curso de doença remitente recorrente gradualmente progressivo, o curso clínico de MS varia grandemente entre indivíduos e pode variar entre, estar limitado a vários ataques moderados ao longo de uma vida e doença progressiva crónica fulminante. Um aumento quantitativo em células T auto-reactivas de mielina com a capacidade de segregar IFN-gama está associado à patogénese de MS e EAE.

Artrite Reumatóide: A artrite reumatóide (RA) é uma sinovite inflamatória auto-imune crónica, afectando 0,8% da população mundial. É caracterizada por sinovite inflamatória crónica gue causa destruição de articulação erosiva. A RA é mediada por células T, células B e macrófagos. 46 A evidência de que as células τ desempenham um papel critico na RA inclui a (1) predominância de células T CD4+ infiltrando a membrana sinovial, (2) melhoramento clinico associado a supressão de função de célula T com fármacos, tal como ciclosporina e (3) a associação de RA com determinado alelos HLA-DR. Os alelos HLA-DR associados a RA contêm uma sequência semelhante de aminoácidos, nas posições 67-74 na terceira região hipervariável da cadeia beta, que estão envolvidos na ligação peptidica e apresentação a células T. A RA é mediada por células T auto-reactivas que reconhecem uma automolécula, tal como autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolípido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteina(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteina(s) modificado(s) pós-traducionalmente ou uma autobiomolécula não identificada presente em articulações sinoviais ou em qualquer outra parte no hospedeiro. Autoproteina (s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) desta invenção, também referidos como auto-antigénios, são visados em RA e compreendem epitopos de colagénio de tipo II; hnRNP; A2/RA33; Sa; filagrina; queratina; citrulina; proteínas de cartilagem incluindo gp39; colagénios de tipo I, iii, iv, v, ix, xi; HSP-65/60; igM (factor reumatóide); ARN polimerase; hnRNP-ΒΙ; hnRNP-D; cardiolipina; aldolase A; filagrina modificada por citrulina e fibrina. Auto-anticorpos que reconhecem péptidos de filagrina contendo um resíduo de arginina modificado (desiminado, de modo a formar citrulina) foram identificados no soro de uma proporção elevada de doentes de RA. Em alguns doentes, as respostas auto-reactivas de células T e B são ambas dirigidas contra o mesmo péptido de colagénio de tipo II (CII) imunodominante 257-270. 47

Diabetes Mellitus Dependente de Insulina: A diabetes Mellitus humana de tipo I ou dependente de insulina (IDDM) é caracterizada por destruição auto-imune das células Beta nos ilhéus pancreáticos de Langerhans. A depleção de células Beta resulta numa incapacidade de regular niveis de glucose no sangue. A diabetes declarada ocorre quando o nivel de glucose no sangue sobe acima de um nivel especifico, habitualmente cerca de 250 mg/dL. Em humanos, um longo periodo pré-sintomático precede o começo da diabetes. Durante este periodo, existe uma perda gradual de função de célula beta pancreática. O desenvolvimento da doença é implicado pela presença de auto-anticorpos contra insulina, ácido glutâmico descarboxilase e a tirosina fosfatase IA2 (IA2), cada um, um exemplo de uma autoproteina, autopolipéptido ou autopéptido de acordo com esta invenção.

Os marcadores que podem ser avaliados durante o estádio pré-sintomático são a presença de insulite no pâncreas, o nível e frequência de anticorpos de células de ilhéus, anticorpos de superfície celular de ilhéus, expressão aberrante de moléculas de Classe II de MHC em células beta pancreáticas, concentração de glucose no sangue e a concentração plasmática de insulina. Um aumento no número de linfócitos T no pâncreas, anticorpos de células de ilhéus e glucose no sangue é indicativo da doença, como o é uma diminuição na concentração de insulina. O Murganho Diabético Não Obeso (NOD) é um modelo animal com muitas características clínicas, imunológicas e histopatológicas em comum com a IDDM humana. Os murganhos NOD desenvolvem espontaneamente inflamação dos ilhéus e destruição das células Beta, o que conduz a hiperglicemia e diabetes declarada. Para que a diabetes se desenvolva são requeridas tanto as células T CD4+ como CD8+, embora os papéis de cada permaneçam obscuros. 48

Demonstrou-se, tanto com insulina como GAD que, quando administradas como proteínas sob condições tolerizantes, a doença pode ser prevenida e as respostas aos outros auto-antiqénios requladas neqativamente.

Facto importante, os murganhos NOD desenvolvem diabetes auto-imune em salas de murganhos livres de patógenos e em ambientes livres de germes. A IDDM humana é actualmente tratada através da monitorização dos níveis de glucose no sangue, de modo a guiar a injecção, ou distribuição baseada em bomba, de insulina recombinante. Regimes de dieta e exercício contribuem para se alcançar o controlo adequado de glucose no sangue.

Uveíte Auto-imune: A uveíte auto-imune é uma doença auto-imune do olho que se estima que afecte 400000 pessoas, com uma incidência de 43000 novos casos por ano nos E.U.A. A uveíte auto-imune é actualmente tratada com esteróides, agentes imunossupressores, tais como metotrexato e ciclosporina, imunoglobulina intravenosa e antagonistas de TNF-alfa. A uveíte auto-imune experimental (EAU) é uma doença auto-imune mediada por células T que ataca a retina neural, úvea e tecidos relacionados no olho. A EAU partilha muitas características clínicas e imunológicas com a uveíte auto-imune humana e é induzida por administração periférica de péptido uveitogénico emulsionado em Adjuvante Completo de Freund (CFA).

As autoproteínas visadas pela resposta auto-imune na uveíte auto-imune humana podem incluir antigénio S, proteína de ligação retinóide interfoto-receptora (IRBP), rodopsina e recoverina. 49

Cirrose Biliar Primária: A Cirrose Biliar Primária (PBC) é uma doença auto-imune, especifica de órgão, que predominantemente afecta mulheres entre 40-60 anos de idade. A prevalência referida entre este grupo aproxima-se de 1 por 1000. A PBC é caracterizada por destruição progressiva de células epiteliais biliares intra-hepáticas (IBEC) revestindo os duetos biliares intra-hepáticos pequenos (Nishio et al., Semin Liver Dis, 22: 291, 2002). Isto conduz a obstrução e interferência com a secreção biliar, causando cirrose eventual. Foi referida a associação com outras doenças auto-imunes, caracterizadas por dano de revestimento de epitélio/sistema secretório, incluindo Sindrome de Sjogren, Sindrome de CREST, Doença Auto-imune da Tiróide e Artrite Reumatóide.

Um modelo murino de colangite auto-imune experimental (EAC) utiliza sensibilização intraperitoneal (i.p.) com PDC de mamífero em murganhos SJL/J fêmea, induzindo colangite destrutiva não supurativa (NSDC) e produção de AMA (Jones, J Clin Pathol, 53: 813-21, 2000). Demonstrou-se que o modelo de murganho MRL/lpr de SLE também desenvolve uma enfermidade semelhante a PBC, caracterizada pelo desenvolvimento de auto-anticorpos dirigidos contra o complexo de alfa cetoglutarato desidrogenase.

Outras Doenças Auto-imunes E AutoProteína (s), Autopolipéptido (s) Ou Autopétido (s) Associados: Os auto-antigénios para a miastenia grave podem incluir epitopos no receptor de acetilcolina. Os auto-antigénios visados em pênfigo vulgar podem incluir desmogleína 3. Os antigénios da sindrome de Sjogren podem incluir SSA (Ro); SSB (La); e fodrina. O auto-antigénio dominante para pênfigo vulgar pode incluir desmogleína 3. Os painéis para miosite podem incluir ARNt 50 sintetases (e. g., treonil, histidil, alanil, isoleucil e glicil); Ku; Scl; SS-A; proteínas ribonucleares Ul-sn; Mi-1; Mi-1; Jo-1; Ku; e SRP. Os painéis para esclerodermia podem incluir Scl-70; centrómero; proteínas ribonucleares Ul-sn; e fibrilarina. Os painéis para anemia perniciosa podem incluir factor intrínseco; e subunidade beta de glicoproteína de ATPase H/K gástrica. Antigénios epitópicos para lúpus eritematoso sistémico (SLE) podem incluir ADN; fosfolípidos; antigénios nucleares; ribonucleoproteína Ul; R06O (SS-A); Ro52 (SS-A); La (SS-B); calreticulina; Grp78; Scl-70; histona; proteína Sm; factores de excisão de serina-arginina e cromatina, etc. Para a doença de Grave os epitopos podem incluir o simporte Na+/I-; receptor de tirotropina; Tg; e TPO.

Outras doenças Vários exemplos de outras doenças associadas a autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) presentes no animal não fisiologicamente são expostos na tabela e descritos abaixo.

Doenças Inflamatórias

Osteoartrite e Doenças Degenerativas das Articulações: A osteoartrite (OA) afecta 30% de pessoas acima dos 60 anos de idade e é a doença das articulações mais comum dos humanos. A osteoartrite representa a degenerescência e falência das articulações sinoviais e envolve a desagregação da cartilagem articular. 51 A cartilagem é composta principalmente por proteoglicanos, que proporcionam rigidez e capacidade para suportar carga e colagénios, que proporcionam tensão e resistência contra a força bruta. Os condrócitos giram e remodelam sobre cartilagem normal através da produção e segregação de colagenases latentes, estromelisina latente, gelatinase latente, activador do plasminogénio tecidular e outras enzimas associadas, cada qual isoladamente ou em combinação, são autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolipido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteína(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteina(s) modificado(s) pós-traducionalmente desta invenção. Vários inibidores, incluindo inibidor tecidular de metaloproteinase (TIMP) e inibidor de activador do plasminogénio (PAI-1), também são produzidos por condrócitos e limitam a actividade degradativa de metaloproteinases neutras, activador do plasminogénio tecidular e outras enzimas. Estas enzimas degradativas e inibidores, isoladamente ou em combinação, são as autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou péptido(s) desta invenção. Estas enzimas degradativas e inibidores coordenam a remodelação e manutenção de cartilagem normal. Na OA, a desregulação deste processo resulta na deterioração e degradação de cartilagem. Muitos doentes com OA também têm algum grau de inflamação, incluindo calor e inchaço das articulações. Na OA precoce, há alterações anormais na disposição e tamanho de fibras de colagénio. Metaloproteinases, catepsinas, plasmina e outras automoléculas, isoladamente ou em combinação, são autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolipido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteina(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteina(s) modificado(s) pós-traducionalmente desta invenção, causam perda significativa de 52 matriz de cartilagem. A produção de condrócitos inicialmente aumentada de proteoglicanos e cartilagem resulta na cartilagem articular sendo mais espessa do gue o normal. A cartilagem articular, depois, adelgaça e amolece como resultado da acção de enzimas degradativas, incluindo colagenases, estromelisina, gelatinase, activador do plasminogénio tecidular e outras enzimas relacionadas, isoladamente ou em combinação, são automoléculas, tais como autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolipido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteína(s) e autoproteina (s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteina(s) modificado(s) pós-traducionalmente desta invenção. Moléculas inflamatórias, tais como IL-1, catepsinas e plasmina podem promover a degenerescência e desagregação de cartilagem, isoladamente ou em combinação, e são autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolipido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteina(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteina(s) modificado(s) pós-traducionalmente desta invenção. A cartilagem mais mole e adelgaçada é muito mais susceptivel a dano por stress mecânico. Estes factores conduzem à desagregação da superfície da cartilagem e à formação de fendas verticais (fibrilação). Formam-se erosões na superfície da cartilagem e estendem-se ao osso na fase terminal da doença. Os condrócitos inicialmente replicam-se e formam aglomerados e, na fase terminal, a cartilagem é hipocelular. A remodelação e hipertrofia do osso são características significativas da OA.

As terapias actuais para a OA incluem repouso, terapia física para fortalecer músculos suportando a articulação, cintas e outros dispositivos de suporte para estabilizar a articulação, 53 agentes anti-inflamatórios não-esteróides, acetaminofeno e outros analgésicos. Na fase terminal OA de osso-com-osso de articulações criticas para actividades de vida diária, tais como os joelhos ou ancas, é realizada a substituição cirúrgica da articulação.

Lesão de Medula Espinal: Estima-se que existam, aproximadamente, 11000 novos casos de lesão de medula espinal todos os anos nos E.U.A. e que a prevalência global seja um total de 183000 a 230000 casos nos E.U.A. presentemente (Stover et al., Arch Phys Med Rehabil, 80, 1365-71, 1999). A recuperação da lesão de medula espinal é muito fraca e resulta em incapacidade neurológica irreversível devastadora. O tratamento actual da lesão de medula espinal aguda consiste na estabilização mecânica do local de lesão, por exemplo, por intervenção cirúrgica e a administração de esteróides parentéricos. Estas intervenções pouco fizeram para reduzir a incidência de paralisia permanente após lesão de medula espinal. O tratamento de lesão de medula espinal crónica está centrado na manutenção de qualidade de vida, tal como a gestão de dor, espasticidade e função de bexiga. Nenhum tratamento actualmente disponível aborda a recuperação da função neurológica. Na fase aguda imediatamente após lesão, a inflamação é proeminente e o inchaço associado a lesão de medula é uma causa importante de morbidade. Esta inflamação é controlada, em parte, com doses elevadas de corticosteróides sistémicos.

Doença de Enxerto Versus Hospedeiro: Uma das maiores limitações da transplantação de tecido e órgão em humanos é a rejeição do transplante de tecido pelo sistema imunitário do receptor. Está bem estabelecido que quanto maior a correspondência dos alelos de classe I e II de MHC (HLA-A, HLA-B 54 e HLA-DR) entre dador e receptor, melhor a sobrevivência do enxerto. A doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD) causa morbidade e mortalidade significativas em doentes recebendo transplantes contendo células hematopoiéticas alógenas. Isto deve-se, em parte, a inflamação na pele e em outros órgãos alvo. As células hematopoiéticas estão presentes em transplantes de medula óssea, transplantes de células estaminais e outros transplantes. Aproximadamente 50% dos doentes recebendo um transplante de um irmão com correspondência de HLA desenvolvem GVHD moderada a grave e a incidência é muito superior em enxertos sem correspondência de HLA. Como resultado, um terço dos doentes que desenvolve GVHD moderada a grave irá morrer. Os linfócitos T e outras células imunitárias no enxerto de dador atacam as células receptoras que expressam variações de polipéptidos nas suas sequências de aminoácidos, particularmente variações em proteínas codificadas no complexo génico do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) no cromossoma 6 em humanos. As proteínas mais influentes para GVHD em transplantes envolvendo células hematopoiéticas alógenas são as altamente polimórficas proteínas de classe I (extensa variação de aminoácidos entre pessoas) (HLA-A, HLA-B e HLA-C) e as proteínas de classe II (DRBl, DQBl e DPBl) (Appelbaum, Nature 411:385-389, 2001). Mesmo quando os alelos de classe I de MHC são serologicamente 'correspondentes' entre dador e receptor, a sequenciação de ADN revela que há disparidades a nível de alelo em 30% de casos, proporcionando uma base para GVHD dirigida por classe I, mesmo em pares dador-receptor correspondentes (Appelbaum, Nature, 411, 385-389, 2001) . Frequentemente, a GVHD causa dano à pele, intestino, fígado, pulmão e pâncreas. A GVHD é tratada com glucocorticóides, ciclosporina, metotrexato, fludarabina e OKT3. 55

Rejeição de Transplante de Tecido: A rejeição imunitária de transplantes de tecidos, incluindo pulmão, coração, fígado, rim, pâncreas e outros órgãos e tecidos é mediada por respostas imunitárias no receptor do transplante dirigido contra o órgão transplantado. Os órgãos transplantados alógenos contêm proteínas com variações nas suas seguências de aminoácidos, quando comparados com as sequências de aminoácidos do receptor de transplante. Em virtude de as sequências de aminoácidos do órgão transplantado diferirem daquelas do receptor de transplante, as mesmas frequentemente deduzem uma resposta imunitária no receptor contra o órgão transplantado. A resposta imunitária abrange respostas tanto do sistema imunitário inato como adquirido e é caracterizada por inflamação no órgão alvo. A rejeição de órgãos transplantados é uma importante complicação e limitação do transplante de tecidos e pode causar falência do órgão transplantado no receptor. A inflamação crónica que resulta da rejeição frequentemente conduz a disfunção no órgão transplantado. Os receptores de transplante são actualmente tratados com uma variedade de agentes imunossupressores, de modo a prevenir e suprimir a rejeição. Estes agentes incluem glucocorticóides, ciclosporina A, Cellcept, FK-506 e 0KT3. Ácidos_Nucleicos_Imunomodulador e s_e_Composições

Relacionadas

Num aspecto, os ácidos nucleicos imunomoduladores da invenção compreendem o seguinte hexâmero nuclear: 5'-purina-pirimidina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3'.

Também são divulgados ácidos nucleicos imunomoduladores compreendendo o seguinte hexâmero nuclear: 56 5'-purina-purina-[X]—[Y]-pirimidina-pirimidina-3'. em que X e Y são quaisquer nucleótidos de ocorrência natural ou sintéticos, excepto que X e Y não podem ser citosina-guanina. 0 hexâmero nuclear de IMS, aqui referido como um motivo de sequência imunomoduladora compreendendo um motivo dinucleotidico, pode ser flanqueado 5' e/ou 3' por qualquer composição ou número de nucleótidos ou nucleósidos. De um modo preferido, ácidos nucleicos imunomoduladores compreendendo motivos de sequências imunomoduladoras são oligonucleótidos variando entre 6 e 100 pares de bases em tamanho e, de um modo muito preferido, 16-50 pares de bases em tamanho. Os ácidos nucleicos imunomoduladores também podem ser distribuídos como parte de pedaços maiores de ADN, variando entre 100 e 100000 pares de bases. As IMS podem ser incorporadas ou já ocorrem, em plasmídeos de ADN, vectores virais e ADN genómico. Os ácidos nucleicos imunomoduladores também podem variar de 6 (sem sequências flanqueantes) a 10000 pares de bases, ou superior, em tamanho. As sequências presentes que flanqueiam o núcleo hexamérico podem ser construídas, de modo a substancialmente corresponderem a sequências flanqueantes presentes em quaisquer sequências imunoinibitórias conhecidas. Por exemplo, a IMS tendo a sequência TGACTGTG-Purina-Pirmidina-X-Y-Pirimidina-Pirimidina-AGAGATGA, compreende as sequências flanqueantes tgactgtg e AGAGATGA. Outra sequência flanqueante preferida incorpora uma série de pirimidinas (C, T e U), quer como uma pirimidina individual repetida duas ou mais vezes, ou uma mistura de pirimidinas diferentes, dois ou mais em comprimento. Foram utilizadas diferentes sequências flanqueantes na testagem de sequências moduladoras inibitórias. Exemplos adicionais de sequências flanqueantes para ácidos nucleicos 57 inibitórios estão contidos nas seguintes referências: Patentes U.S. N° 6225292 e 6339068; Zeuner et ai., Arthrítís and Rheumatism, 46: 2219-24, 2002. IMS particulares da invenção compreendem as seguintes sequências hexaméricas: IMS 5'-purina-pirimidina-[x]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' contendo núcleos dinucleotidicos GG: GTGGTT; ATGGTT, GCGGTT, ACGGTT, GTGGCT, ATGGCT, GCGGCT, ACGGCT, GTGGTC, ATGGTC, GCGGTC, ACGGTC e assim por diante.

Também são divulgadas IMS 5'-purina-pirimidina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' contendo núcleos dinucleotidicos GC: GTGCTT, ATGCTT, GCGCTT, ACGCTT, GTGCCT, ATGCCT, GCGCCT, ACGCCT, GTGCTC, ATGCTC, GCGCTC, ACGCTC e assim por diante; 3. Guanina e inosina substituem adenina e/ou uridina substitui citosina ou timina e aquelas substituições podem ser efectuadas como exposto, com base nas directrizes anteriores.

Demonstrou-se que uma sequência inibitória imunitária ou IIS anteriormente divulgada inibe a actividade de sequências imunoestimuladoras (ISS) contendo um dinucleótido nuclear, CpG. Patente U.S. 6225292. Demonstrou-se, pela primeira vez por esta invenção, que esta IIS, na ausência de uma ISS, previne e trata doença auto-imune, quer isoladamente ou em combinação com terapia polinucleotidica de ADN. Esta IIS continha a região de hexâmero nuclear tendo a sequência AAGGTT. Essa sequência é aqui referida como uma sequência imunomoduladora ou IMS. Outras IISs 58 relacionadas com um motivo semelhante incluídas dentro das IMS desta invenção são: 1. IMS 5'-purina-purina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' contendo núcleos dinucleotídicos GG: GGGGTT, AGGGTT, GAGGTT, AAGGTT, GGGGCT, AGGGCT, GAGGCT, AAGGCT, GGGGTC, AGGGTC, GAGGTC, AAGGTC e assim por diante/ 2. IMS 5'-purina-purina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3' contendo núcleos dinucleotídicos GC: GGGCTT, AGGCTT, GAGCTT, AAGCTT, GGGCCT, AGGCCT, GAGCCT, AAGCCT, GGGCTC, AGGCTC, GAGCTC, AAGCTC e assim por diante; 3. Substituições de guanina e inosina por adenina e/ou substituições de uridina por citosina ou timina podem ser efectuadas como exposto, com base nas directrizes anteriores.

Em determinadas formas de realização da presente invenção, a região de hexâmero nuclear da IMS é flanqueada quer na extremidade 5' ou 3', ou tanto na extremidade 5' como 3', por uma região poliG. Uma "região poliG" ou "motivo poliG', como aqui utilizado, significa uma região de ácido nucleico consistindo em, pelo menos, duas (2) bases de guanina contíguas, tipicamente de 2 a 30 ou de 2 a 20 guaninas contíguas. Em algumas formas de realização, a região poliG tem de 2 a 10, de 4 a 10 ou de 4 a 8 bases de guanina contíguas. Em determinadas formas de realização preferidas, a região poliG flanqueante é adjacente ao hexâmero nuclear. Ainda noutras formas de realização, a região poliG é ligada ao hexâmero nuclear por uma região não poliG (ligante não poliG); tipicamente, a região ligante não poliG não tem mais de 6, mais tipicamente, não mais 59 de 4 nucleótidos e, muito tipicamente, não mais de 2 nucleótidos.

Os ácidos nucleicos imunomoduladores podem ser obtidos de fontes de ácidos nucleicos existentes, incluindo ADN genómico, ADN plasmidico, ADN virai e ADNc. Em determinadas formas de realização preferidas, os ácidos nucleicos imunomoduladores são oligonucleótidos sintéticos produzidos por síntese oligonucleotídica. A IMS pode ser parte de ADN de cadeia simples ou de cadeia dupla, ARN e/ou oligonucleósidos.

Os ácidos nucleicos imunomoduladores são, de um modo preferido, ácidos nucleicos tendo uma ou mais regiões de IMS que contêm oligonucleótidos GpG não metilados. Em formas de realização alternativas, um ou mais resíduos de adenina ou citosina da região de IMS são metilados. Em células eucarióticas, tipicamente, resíduos de citosina e adenina podem ser metilados.

Os ácidos nucleicos imunomoduladores podem ser oligonucleótidos estabilizados e/ou não estabilizados. Oligonucleótidos estabilizados significa oligonucleótidos que são relativamente resistentes a degradação in vivo por exonucleases, endonucleases e outras vias de degradação. Oligonucleótidos estabilizados preferidos têm estruturas de fosfato modificadas e oligonucleótidos muito preferidos têm estruturas de fosfato modificadas de fosforotioato nas quais, pelo menos, um dos oxigénios do fosfato é substituído por enxofre. Modificações do grupo fosfato de estrutura, incluindo ligações internucleotídicas de metilfosfonato, fosforotioato, fosforoamidato e fosforoditionato podem proporcionar propriedades antimicrobianas em IMS. Os ácidos nucleicos 60 imunomoduladores são, de um modo preferido, oligonucleótidos estabilizados, de um modo preferido utilizando oligonucleótidos estabilizados de fosforotioato.

Oligonucleótidos estabilizados alternativos incluem: alquilofosfotriésteres e fosfodiésteres, nos quais o oxigénio carregado está alquilado; arilfosfonatos e alquilfosfonatos, que sejam análogos de ADN não iónicos nos quais o oxigénio de fosfonato carregado é substituído por um grupo arilo ou alquilo; ou/e oligonucleótidos contendo hexaetilenoglicol ou tetraetilenoglicol, ou outro diol, em uma ou ambas as extremidades. Configurações esféricas alternativas podem ser utilizadas para conjugar fracções de açúcar a bases nucleosídicas em regiões de IMS.

As bases nucleotídicas da região de IMS que flanqueiam os dinucleótidos de modulação podem ser as bases de ocorrência natural conhecidas ou bases não naturais sintéticas. Os oligonucleósidos podem ser incorporados dentro da região interna e/ou extremidades da IMS-ON utilizando técnicas convencionais, para utilização como pontos de conjugação, isto é, como um meio de conjugação ou ligação de outras moléculas, para outros compostos, incluindo automoléculas ou como pontos de conjugação para terapêutica imunomoduladora adicional. A(s) base(s), fracção de açúcar, grupos fosfato e extremidades da IMS-ON também podem ser modificados de qualquer maneira conhecida de alguém com conhecimentos gerais na técnica, de modo a construir uma IMS-ON tendo propriedades desejadas, adicionalmente à actividade moduladora da IMS-ON. Por exemplo, fracções de açúcar podem ser ligadas a bases nucleotídicas de IMS-ON em qualquer configuração estérica. 61

As técnicas para realização destas modificações de grupo fosfato em oligonucleótidos são conhecidas na técnica e não requerem explicação detalhada. Para revisão de uma tal técnica útil, o triéster fosfato intermediário para o produto oligonucleotidico alvo é preparado e oxidado para o triéster fosfato de ocorrência natural com iodo aquoso ou com outros agentes, tal como aminas anidras. Os fosforamidatos oligonucleotidicos resultantes podem ser tratados com enxofre, de modo a produzir fosforotioatos. A mesma técnica geral (exceptuando a etapa de tratamento com enxofre) pode ser aplicada para produzir metilfosfoamiditos a partir de metilfosfonatos. Para mais detalhes dizendo respeito a técnicas de modificação de grupo fosfato, alguém com conhecimentos gerais na técnica pode querer consultar as Pat. U.S. N° 4425732; 4458066; 5218103 e 5453496, assim como Tetrahedron, Lett. em 21: 4149 25 (1995), 7: 5575 (1986), 25: 1437 (1984) e Journal Am. ChemSoc., 93: 6657 (1987), cujas divulgações são aqui incorporadas para efeitos de ilustração do nível de conhecimento na técnica, dizendo respeito à composição e preparação de ácidos nucleicos imunomoduladores.

Uma modificação de grupo fosfato particularmente útil é a conversão nas formas de fosforotioato ou fosforoditioato dos oligonucleótidos de IMS-ON. Os fosforotioatos e fosforoditioatos são mais resistentes à degradação in vivo do que os seus homólogos oligonucleotidicos não modificados, tornando a IMS-ON da invenção mais disponível para o hospedeiro. A IMS-ON pode ser sintetizada utilizando técnicas e equipamento de síntese de ácido nucleico que são bem conhecidos na técnica. Para referência a este respeito, ver, e. g., Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Cap. 2 62 e 4 (wiley interscience, 1989); Maniatis, et al., Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Nova Iorque, 1982); Pat. U.S. N° 4458066 e Pat. U.S. N° 4650675. Estas referências são aqui incorporadas por referência, para efeitos de demonstração do nivel de conhecimento na técnica dizendo respeito à produção de oligonucleótidos sintéticos.

Alternativamente, a IMS-ON pode ser obtida por mutação de ISS-ODN microbiana isolada, de modo a substituir um dinucleótido competidor pelo motivo CpG de ocorrência natural e pelos nucleótidos flanqueantes. Processos de rastreio que se baseiam em hibridação de ácidos nucleicos tornam possível isolar qualquer sequência polinucleotídica a partir de qualquer organismo, desde que a sonda ou anticorpo apropriado esteja disponível. Sondas oligonucleotídicas, que correspondem a uma parte da sequência codificando a proteína em questão, podem ser sintetizadas quimicamente. Isto requer que devam ser conhecidos curtos segmentos oligopeptídicos de sequência de aminoácidos. A sequência de ADN codificando a proteína também pode ser deduzida do código genético, contudo, a degenerescência do código deve ser tida em conta.

Por exemplo, uma biblioteca de ADNc que se julgue conter um polinucleótido contendo ISS pode ser rastreada injectando diversos ARNm derivados de ADNc dentro de ovócitos, permitindo que decorra tempo suficiente para expressão dos produtos génicos de ADNc e testagem para a presença do produto de expressão de ADNc desejado, por exemplo, através da utilização de anticorpo específico para um péptido codificado pelo polinucleótido de interesse ou através da utilização de sondas para os motivos repetidos e um padrão de expressão tecidular, característico de um péptido codificado pelo polinucleótido de interesse. 63

Alternativamente, uma biblioteca de adnc pode ser rastreada indirectamente para expressão de péptidos de interesse tendo, pelo menos, um epitopo utilizando anticorpos específicos para os péptidos. Tais anticorpos podem ser derivados, quer policlonalmente ou monoclonalmente e utilizados para detectar produto de expressão indicativo da presença de ADNc de interesse.

Assim que o polinucleótido contendo ISS tenha sido obtido, pode ser encurtado para o comprimento desejado através de, por exemplo, digestão enzimática utilizando técnicas convencionais. 0 motivo CpG no produto oligonucleotídico na ISS-ODN é, depois, mutado para substituir um dinucleótido de "inibição" - identificado utilizando os métodos desta invenção - pelo motivo CpG. Técnicas para preparação de mutações de substituição em sítios particulares em ADN tendo uma sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo mutagénese de iniciador de M13 através de PCR. Em virtude de a IMS ser não codificante, não existe interesse envolvendo a manutenção de uma fase de leitura aberta na preparação da mutação de substituição. Contudo, para utilização in vivo, o material de partida polinucleotídico, intermediário oligonucleotídico de ISS-ODN ou produto de mutação de IMS deve ser tornado substancialmente puro (í. e., tão livre de contaminantes e LPS de ocorrência natural quanto possível, utilizando técnicas disponíveis conhecidas e seleccionadas por alguém com conhecimentos gerais na técnica).

Os ácidos nucleicos imunomoduladores da presente invenção podem conter IMS isoladamente ou incorporada em cis ou em trans com outras regiões de ácidos nucleicos, tal como, por exemplo, dentro de um autovector recombinante (plasmídeo, cosmídeo, vírus 64 ou retrovírus) que, por sua vez, pode codificar para quaisquer autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s), distribuiveis por um vector de expressão recombinante. Em determinadas formas de realização, as IMS são administradas sem incorporação dentro de um vector. Alternativamente, em outras formas de realização, as IMS são incorporadas dentro de um vector, tal como, por exemplo, um vector de expressão, que pode ser alcançado, por exemplo, utilizando técnicas convencionais como conhecidas de alquém como conhecimentos qerais na técnica (ver, e. g., Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, supra).

Por exemplo, a construção de vectores de expressão recombinantes emprega técnicas de ligação padrão. Para análise, de modo a confirmar sequências correctas em vectores construídos, as misturas de ligação podem ser utilizadas para transformar uma célula hospedeira e os transformantes bem-sucedidos seleccionados por resistência a antibiótico, se apropriado. Os vectores dos transformantes são preparados, analisados por restrição e/ou sequenciados, por exemplo, pelo método de Messing, et al., Nucleic Acids Res., 9:309, 1981, o método de Maxam, et al., Methods in Enzymology, 65:499, 1980 ou outros métodos adequados que serão conhecidos dos especialistas na técnica. A separação por tamanho de fragmentos clivados é realizada utilizando electroforese em gel convencional como descrito, for exemplo, por Maniatis, et al., Molecular Cloning, p. 133-134, 1982.

As células hospedeiras podem ser transformadas com os vectores de expressão desta invenção e cultivadas em meios nutrientes convencionais, modificados conforme apropriado, para a indução de promotores, selecção de transformantes ou 65 amplificação de genes. As condições de cultura, tal como temperatura, pH e semelhantes, são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão evidentes do especialista com conhecimentos gerais na técnica.

Se um vector recombinante for utilizado como um veiculo para a IMS-ON da invenção, plasmideos e cosmídeos são particularmente preferidos pela sua ausência de patogenicidade. Contudo, os plasmideos e cosmídeos estão sujeitos a degradação in vivo mais rapidamente do que os vírus e, por conseguinte, podem não distribuir uma dosagem adequada de IMS-ON para prevenir ou tratar uma doença inflamatória ou auto-imune.

Num aspecto relacionado, é proporcionado um vector de ácido nucleico, no qual um dinucleótido não CpG é substituído por um ou mais dinucleótidos CpG de fórmula 5 '-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' ou 5'-purina-purina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' produzindo, desse modo, um vector no qual a actividade imunoestimuladora associada a IIS é reduzida. Tais vectores são úteis, por exemplo, em métodos para administrar ácidos nucleicos imunomoduladores e/ou para administrar um autovector codificando um ou mais autoproteína(s), autopolipéptidos(s) ou autopéptido(s). Por exemplo, a citosina do dinucleótido CpG pode ser substituída com guanina produzindo, desse modo, uma região de IMS tendo um motivo GpG de fórmula 5'-purina-pirimidina-G-G-pirimidina-pirimidina-3' ou 5'-purina-purina-G-G-pirimidina-pirimidina-3'. A citosina também pode ser substituída com qualquer outro nucleótido não citosina. A substituição pode ser alcançada, por exemplo, utilizando mutagénese dirigida pontual. Tipicamente, os motivos CpG substituídos são aqueles CpG que não se situam em regiões de 66 controlo importantes do vector (e. g., regiões promotoras).

Adicionalmente, se o CpG se situar dentro de uma região codificante de um vector de expressão, a substituição de não citosina é tipicamente seleccionada para produzir uma mutação silenciosa ou um codão correspondendo a uma substituição conservativa do aminoácido codificado.

Por exemplo, em determinadas formas de realização, é proporcionado um vector pVAXl modificado, no qual um ou mais dinucleótidos CpG de fórmula 5'-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3' são mutados, através da substituição da citosina do dinucleótido CpG com um nucleótido não citosina. 0 vector pVAXl é conhecido na técnica e está comercialmente disponível a partir da Invitrogen (Carlsbad, CA) . Numa forma de realização exemplificativa, o vector pVAXl modificado tem as seguintes substituições de citosina por não citosina dentro de um motivo CpG: citosina por guanina nos nucleótidos 784, 1161, 1218 e 1966 ; citosina por adenina nos nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 e 1997; e citosina por timina nos nucleótidos 1963 e 1987; com mutações adicionais de citosina por guanina nos nucleótidos 1831, 1876, 1942 e 1999. (As designações de número de nucleótido, como anteriormente expostas, são de acordo com o sistema de numeração para pVAXl proporcionado pela Invitrogen). (Ver o Exemplo 3, infra). 67

Propriedades Funcionais de IMS

Existem diversos mecanismos para explicar as propriedades imunomoduladoras de IMS e estes incluem mecanismos independentes de estimulação imunitária mediada por (CpG) de ISS. "Modulação, modulando ou alterando uma resposta imunitária", como aqui utilizado, refere-se a qualquer alteração de resposta(s) imunitária(s) existente(s) ou potencial (potenciais) contra automoléculas, incluindo mas não limitadas a ácidos nucleicos, lipidos, fosfolipidos, hidratos de carbono, autoproteina(s), autopolipéptido(s), autopéptido(s), complexos de proteína, complexos de ribonucleoproteina ou seu(s) derivado(s) que ocorrem como resultado de administração de um ácido nucleico imunomodulador. Tal modulação inclui qualquer alteração na presença, capacidade ou função de qualquer célula imunitária, envolvida ou capaz de estar envolvida, numa resposta imunitária. Células imunitárias incluem células B, células T, células NK, células T NK, células de apresentação de antigénios profissionais, células de apresentação de antigénios não profissionais, células inflamatórias ou qualquer outra célula capaz de estar envolvida ou influenciando uma resposta imunitária. A modulação inclui qualquer alteração conferida a uma resposta imunitária existente, uma resposta imunitária em desenvolvimento, uma resposta imunitária potencial ou a capacidade para induzir, regular, influenciar ou responder a uma resposta imunitária. Modulação inclui qualquer alteração na expressão e/ou função de genes, proteínas e/ou outras moléculas em células imunitárias como parte de uma resposta imunitária.

Modulação de uma resposta imunitária inclui, mas não está limitada a: eliminação, deleção ou sequestração de células 68 imunitárias; indução ou geração de células imunitárias que podem modular a capacidade funcional de outras células, tais como linfócitos auto-reactivos, APCs ou células inflamatórias; indução de um estado não responsivo em células imunitárias, designado anergia; aumento, diminuição ou alteração da actividade ou função de células imunitárias ou da capacidade nesse sentido, incluindo mas não limitado a alteração do padrão de proteínas expressas por estas células. Exemplos incluem produção e/ou secreção alterada de determinadas classes de moléculas, tais como citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, factores de transcrição, cinases, moléculas co-estimuladoras ou outros receptores de superfície celular; ou qualquer combinação destes eventos moduladores.

As respostas imunitárias são caracterizadas por células T auxiliares e respostas imunitárias que produzem citocinas, incluindo IL-12 e IFN gama e estão associadas com células B que produzem anticorpos de determinados isótipos (em geral, IgG2a em murganhos; em geral, IgGl e IgG3 em humanos). As respostas imunitárias de tipo Thl predominam em doenças auto-imunes e estão associadas a lesão tecidular mediada por auto-imunidade. Em contraste, as respostas imunitárias Th2 são caracterizadas por células T auxiliares e respostas imunitárias que produzem citocinas, incluindo IL-4 e IL-10 e estão associadas com células B que produzem anticorpos de determinados isótipos (em geral, IgGl em murganhos; em geral, igG2 e igG4 em humanos). As respostas imunitárias de tipo Th2 estão associadas a protecção contra lesão tecidular mediada por auto-imunidade em auto-imunidade de roedor e humana. 69

Os ácidos nucleicos imunomoduladores poderiam modular respostas imunitárias através da eliminação, sequestração ou desligamento de células imunitárias mediando ou capazes de mediar uma resposta imunitária não desejada; indução, geração ou ligação de células imunitárias que medeiam ou são capazes de mediar uma resposta imunitária protectora; alteração das propriedades fisicas ou funcionais de células imunitárias (tal como a supressão de uma resposta de tipo Thl e/ou indução de uma resposta de tipo Th2); ou uma combinação destes efeitos. Exemplos de medições da modulação de uma resposta imunitária incluem mas não estão limitados a examinação da presença ou ausência de populações de células imunitárias (utilizando citometria de fluxo, imuno-histoquímica, histologia, microscopia electrónica, a reacção de polimerização em cadeia); medição da capacidade funcional de células imunitárias, incluindo a capacidade ou resistência para proliferarem ou se dividirem em resposta a um sinal (tal como utilizando ensaios de proliferação de células T e análise pepscan baseada na incorporação de 3H-timidina após estimulação com anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-receptor de células T, anticorpo anti-CD28, ionóforos de cálcio, PMA, células de apresentação de antigénios carregadas com um antigénio peptidico ou proteico; ensaios de proliferação de células B) ; medição da capacidade para provocar a morte ou lisar outras células (tal como ensaios citotóxicos de células T) ; medições das citocinas, quimiocinas, moléculas de superfície celular, anticorpos e outros produtos das células (por citometria de fluxo, ensaios de imunoabsorção enzimática, análise de transferência Western, análise de micromatriz de proteína, análise de imunoprecipitação); medição de marcadores bioquímicos de activação de células imunitárias ou vias de sinalização dentro de células imunitárias (análise de transferência Western e imunoprecipitação de fosforilação de 70 tirosina, serina ou treonina, clivagem polipeptídica e formação ou dissociação de complexos de proteínas; análise de matriz de proteína; caracterização transcricional de ADN utilizando matrizes de ADN ou hibridação subtractiva); medições de morte celular por apoptose, necrose ou outros mecanismos (coloração de anexina V, ensaios TUNEL, electroforese em gel para medir escalas de ADN, histologia; ensaios fluorogénicos de caspase, análise de transferência Western de substratos de caspase); medição dos genes, proteínas e outras moléculas produzidos por células imunitárias (análise de transferência Northern, reacção de polimerização em cadeia, micromatrizes de ADN, micromatrizes de proteínas, electroforese em gel de 2 dimensões, análise de transferência Western, ensaios de imunoabsorção enzimática, citometria de fluxo); e medição de resultados clínicos, tais como melhoramento de resultados de doença auto-imune, neurodegenerativa e outros (valores clínicos, requisitos para utilização de terapias adicionais, estado funcional, estudos de imagiologia).

Outros investigadores efectuaram experiências para avaliar os mecanismos de acção de IISs. Esses investigadores demonstraram que motivos IISs neutralizantes ou supressores (GpGs), bloqueiam a estimulação imunitária de ISS (CpG) (Krieg et ai., PNAS, 95:12631, 1998; Patentes U.S. 6225292 e 6339068). As IISs naquelas experiências foram utilizadas para contrariar, inibir, competir ou superar os efeitos de ISS (de fontes tais como bactérias, vírus, parasitas e ADN proporcionados exogenamente, tal como na vacinação de ADN ou terapia génica) . Demonstrou-se que as ISS e IISs entram na mesma célula, sugerindo que um mecanismo pelo qual as IISs inibem ISS é através de competição directa dentro da mesma célula (Yamada et ai., J. Immunology, 2002, 169:5590). 71 Métodos de Administração

Os ácidos nucleicos imunomoduladores são preparados como uma composição compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveis preferidos para utilização com o ácido nucleico imunomodulador da invenção podem incluir soluções estéreis, aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. São exemplos de solventes não aquosos o propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tal como azeite e ésteres orgânicos injectáveis, tal como oleato de etilo. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem recarregadores de fluidos e nutrientes, recarregadores de electrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes. Uma composição de ácidos nucleicos imunomoduladores também pode ser liofilizada, utilizando meios bem conhecidos na técnica, para subsequente reconstituição e utilização de acordo com a invenção. Os ácidos nucleicos imunomoduladores podem ser misturados dentro de uma composição farmacêutica que contém múltiplas cópias de uma IMS individual, uma combinação de diferentes IMS, uma combinação de IMS onde cada uma está presente à mesma concentração molar relativa, combinações de IMS onde cada uma está presente a concentrações molares relativas diferentes ou IMS individuais e/ou diferentes incorporadas dentro de plasmídeos vectores de expressão recombinantes, polinucleótidos lineares, vírus e vectores virais, bactérias e 72 outras composições vivas, inactivadas ou sintéticas contendo oligonucleótidos.

Os ácidos nucleicos imunomoduladores desta invenção podem ser formulados com sais para utilização como medicamentos. Os ácidos nucleicos imunomoduladores podem ser preparados com bases inorgânicas ou orgânicas não tóxicas. Sais de bases inorgânicas incluem sódio, potássio, zinco, cálcio, alumínio, magnésio, etc. Bases orgânicas não tóxicas incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias e semelhantes. Tais ácidos nucleicos imunomoduladores podem ser formulados na forma liofilizada para reconstituição, antes de distribuição, tal como água estéril ou uma solução salina. Alternativamente, os ácidos nucleicos imunomoduladores podem ser formulados em soluções, suspensões ou emulsões envolvendo veiculos à base de água ou óleo para distribuição. Os ácidos nucleicos imunomoduladores podem ser liofilizados e, depois, reconstituídos com água estéril, antes de administração.

Como conhecido dos especialistas na técnica, existe uma ampla variedade de métodos para distribuir ácidos nucleicos a indivíduos. Em algumas formas de realização, os ácidos nucleicos imunomoduladores são administrados como um ácido nucleico livre. Por exemplo, em determinadas formas de realização, partículas virais (e. g., partículas de adenovírus, ver, e. g., Curiel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 6: 247-52, 1992, supra) são misturadas com o ácido nucleico livre, antes de administração, de modo a produzir uma formulação que contém partículas virais não encapsulando o ácido nucleico mas que, não obstante, facilitam a sua distribuição. Alternativamente, em outras formas de realização, o ácido nucleico imunomodulador é encapsulado ou é complexado com molécula que se liga ao ácido nucleico, tal 73 como, por exemplo, substâncias catiónicas (e. g., DEAE-dextrano ou lípidos catiónicos). Por exemplo, os lipossomas representam meios eficazes para formular e distribuir oligonucleótido e/ou autopolinucleótido. Em outras formas de realização especificas, o ácido nucleico imunomodulador é incorporado dentro de um vector virai, partícula virai ou bactéria para distribuição farmacológica. Os vectores virais podem ser competentes para infecção, atenuados (com mutações que reduzem a capacidade de induzir doença) ou deficientes em replicação. Em outras formas de realização, o ácido nucleico é conjugado a suportes sólidos, incluindo partículas de ouro, suportes à base de polissacáridos ou outras partículas ou esférulas que podem ser injectadas, inaladas ou distribuídas por bombardeamento de partículas (distribuição balística).

Os métodos para distribuição de preparações de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica. Ver, e. g., Patentes U.S. N° 5399346, 5580859, 5589466. Foi desenvolvido um certo número de sistemas de base virai para transferência para dentro de células de mamífero. Por exemplo, foram descritos sistemas retrovirais (Patente U.S. N° 5219740; (Miller et al., Biotechniques, 7:980-990, 1989); (Miller, A.D., Human Gene Therapy, 1:5-14, 1990); (Scarpa et al., Virology, 180:849-852, 1991); (Bums et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:8033-8037, 1993); e (Boris-Lawrie e Temin, Cur. Opin. Genet. Develop., 3:102-109, 1993). Também foi descrito um certo número de vectores de adenovírus, ver, e. g., (Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57:267-274, 1986); (Bett et al., J. Virol., 67: 5911-5921, 1993); (Mittereder et al., Human Gene Therapy, 5: 717-729, 1994); (Seth et al., J. Virol., 68:933-940, 1994); (Barr et al., Gene Therapy, 1:51-58, 1994); (Berkner, K.L., BioTechniques, 6:616-629, 1988); e (Rich et al., Human Gene Therapy, 4:461-476, 1993). Também foram desenvolvidos 74 sistemas de vectores de vírus adeno-associado (aav) para distribuição de ácido nucleico. Vectores AAV podem ser facilmente construídos utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Ver, e. g., as Patentes U.S. N° 5173414 e 5139941; Publicações Internacionais N° WO 92/01070 (publicada a 23 de Janeiro de 1992) e WO 93/03769 (publicada a 4 de Março de 1993); (Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol., 8:3988-3996, 1988); (Vincent et al., Vaccines, 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) 1990); (Cárter, B.J., Current Opinion in Biotechnology, 3:533-539, 1992); (Muzyczka, N., Current Topics in Microbiol.

And Immunol., 158:97-129, 1992); (Kotin, R.M., Human Gene

Therapy, 5:793-801, 1994); Shelling et al., Gene Therapy, 1:165-169, 1994); e Zhou et al., J. Exp. Med., 179:1867-1875, 1994).

As IMS desta invenção também podem ser distribuídas sem um vector. Por exemplo, antes de distribuição ao indivíduo, a molécula pode ser empacotada em lipossomas. A encapsulação em lípido é, em geral, alcançada utilizando lipossomas que são capazes de ligar ou aprisionar e reter de modo estável ácido nucleico. Para uma revisão da utilização dos lipossomas como veículos para distribuição de ácidos nucleicos, ver, (Hug et al., Biochim. Biophys. Acta., 1097: 1-17, 1991); Straubinger et al., in Methods of Enzymology, Vol. 101, p. 512-527, 1983). Por exemplo, os lípidos que podem ser utilizados de acordo com a invenção incluem mas não estão limitados a DOPE (Dioleoil fosfatidiletanolamina), colesterol e CUDMEDA (N-(5-colestrum-3-ol 3 uretanil)-Ν',N-dimetiletilenodiamina). Como um exemplo, o ADN pode ser administrado numa solução contendo uma das seguintes formulações lipossomais catiónicas: Lipofectin™ (LTI/BRL), Transfast™ (Promega Corp), Tfx50™ (Promega Corp), Tfx.10™ (Promega Corp) ou Tfx20™ (Promega Corp). 75 "Quantidades terapeuticamente eficazes" dos ácidos nucleicos imunomoduladores são administradas de acordo com o ensinamento desta invenção e serão suficientes para tratar ou prevenir a doença como, por exemplo, através do melhoramento ou eliminação de sintomas e/ou da causa da doença. Por exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes estão abrangidas por gama(s) ampla(s) e são determinadas através de ensaios clinicos e, para um particular doente, são determinadas com base em factores conhecidos do clinico com conhecimentos gerais, incluindo a gravidade da doença, peso do doente, idade e outros factores. Quantidades terapeuticamente eficazes de ácidos nucleicos imunomoduladores são na gama de cerca de 0,001 microgramas a cerca de 1 grama. Uma quantidade terapêutica preferida de ácido nucleico imunomodulador é na gama de cerca de 5 microgramas a cerca de 1000 microgramas de cada. Uma quantidade terapêutica muito preferida de um ácido nucleico imunomodulador é na gama de cerca de 50 a cerca de 200 microgramas. A terapia de ácido nucleico imunomodulador é distribuída diariamente, de dois em dois dias, duas vezes por semana, semanalmente, de duas em duas semanas ou mensalmente, numa base continuada. Se distribuído em conjunto com terapias polinucleotidicas codificando autoproteínas, autopolipéptidos ou autopéptidos, então, o regime terapêutico pode ser administrado durante vários períodos, tal como 6-12 meses e, depois, a cada 3-12 meses como uma dose de manutenção. Podem ser desenvolvidos regimes de tratamento alternativos, dependendo da gravidade da doença, da idade do doente, do oligonucleótido e/ou polinucleótido codificando autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) sendo administrados e outros factores, tais como seriam considerados pelo médico assistente comum. 76

Numa forma de realização, os ácidos nucleicos imunomoduladores são distribuídos por injecção intramuscular. Noutra forma de realização, os ácidos nucleicos imunomoduladores são distribuídos intranasalmente, oralmente, subcutaneamente, intradermicamente, intravenosamente, impressos através da pele, intra-ocularmente, intra-articularmente, intravaginalmente, intra-rectalmente, mucosalmente ou conjugados a partículas de ouro distribuídas para ou através da derme (ver, e. g., documento WO 97/46253). Alternativamente, o ácido nucleico pode ser distribuído dentro de células de pele por aplicação tópica, com ou sem lipossomas ou lípidos carregados (ver, e. g., Patente U.S. N° 6087341). Ainda outra alternativa é distribuir o ácido nucleico como um agente inalado. No caso de terapia de combinação, compreendendo a administração de ácidos nucleicos imunomoduladores e polinucleótidos codificando autoproteína(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s), o ácido nucleico imunomodulador e o polinucleótido podem ser administrados no mesmo local ou em locais diferentes, assim como ao mesmo tempo ou em tempos diferentes.

Antes de distribuição de ácidos nucleicos imunomoduladores, o local de distribuição pode ser pré-condicionado por tratamento com bupivacaína, cardiotoxina ou outro agente que possa melhorar a distribuição de terapia polinucleotídica subsequente. Tais regimes de pré-condicionamento são, em geral, distribuídos 12 a 96 horas antes de distribuição de polinucleótido terapêutico, mais frequentemente 24 a 48 horas antes de distribuição dos ácidos nucleicos imunomoduladores terapêuticos. Alternativamente, não é proporcionado tratamento de pré-condicionamento antes de terapia de IMS. 77

Os ácidos nucleicos imunomoduladores e/ou autovector compreendendo um polinucleótido codificando a(s) autoproteina(s), autopolipéptido(s) ou autopéptido(s) podem ser administrados em combinação com outras substâncias, tais como agentes farmacológicos, adjuvantes, citocinas, autolipidos, autoproteina (s), autopéptido(s), autopolipéptido (s), autoglicolipido (s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteína(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicoproteína(s) modificado(s) pós-traducionalmente, terapias baseadas em ADN ou em conjunto com distribuição de vectores codificando citocinas.

Noutra forma de realização, os ácidos nucleicos imunomoduladores são administrados em combinação com outras terapias. Tais terapias poderiam incluir, por exemplo, ácidos nucleicos imunomoduladores administrados em combinação com automoléculas incluindo mas não limitadas a ADN codificando automoléculas, por exemplo no caso de terapia polinucleotidica (ver a Publicação de Pedido de Patente US 20030148983) ou com autolipidos, autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s), autoglicolipido(s), auto-hidrato(s) de carbono, autoglicoproteína(s) e autoproteina(s), autopéptido(s), autopolipéptido(s) ou autoglicoproteína(s) modificado(s) pós-traducionalmente ou qualquer outro composto terapêutico utilizado para tratar doença auto-imune.

Uma compreensão adicional da presente invenção será obtida por referência à seguinte descrição que expõe formas de realização ilustrativas. 78 EXEMPLO 1:

Confirmação De Estudos Anteriores Mostrando que a IMS Inibe a Activação Linfocítica Induzida por ISS e Previne a Indução de Encefalomielite Auto-imune Experimental

Foi efectuada uma série de experiências confirmando diversos estudos anteriores, indicando que uma IMS pode inibir a estimulação por sequências contendo ISS (CpG). Essas experiências são como se segue.

Sabe-se que o CpG-ODN estimulador activa células imunitárias derivadas de baços, incluindo células dendríticas, macrófagos, células T e células B (ver, Krieg et al., Nature, 374:546-549, 1995; Yi et al., J. Irmunol., 157:5394-5402, 1996; Klinman et al., Proc Nat. Acad. Sei. USA, 93:2879-2883, 1996; Martin-Orozco et al., Int. Immunol., 11:1111-1118, 1999; Sparwasser et al., Eur. J. Immunol., 28-2045-2054, 1998). Os efeitos de IMS foram avaliados através da medição da proliferação global de esplenócitos naive. Foi construída uma sequência oligonucleotídica de 22-mer contendo uma única sequência 5'-AACGTT-3' (CpG-ODN) ou uma sequência 5'-aaggtt-3' de IMS com uma estrutura de fosforotioato, de modo a proteger o ADN de degradação por nuclease. De modo a determinar se a adição da IMS iria contrariar os efeitos de CpG-ODN estimulador, esplenócitos intactos naive isolados foram cultivados com CpG-ODN estimulador isoladamente, a 5 pg/mL e com concentrações crescentes de IMS. Após 48 hrs, a proliferação de esplenócitos intactos diminuiu 2 vezes após a adição de IMS a 1 pg/mL e diminuiu 3 vezes com a adição de 5 pg/mL e 10 pg/mL de IMS (Figura IA). 79

Demonstrou-se que o TLR-9 reconhece motivos CpG de ADN bacteriano (Hemmi et al., Nature, 408:740-745, 2000). De modo a determinar se uma simples troca de par de bases C por G poderia alterar este reconhecimento, esplenócitos intactos naive isolados de murganhos TLR-9 de tipo selvagem (WT) e TRL-9 nocaute (KO) foram separadamente cultivados com CpG-ODN, IMS e combinações de ambos. Como um controlo separado, foi adicionado lipopolissacárido (LPS), de modo a mostrar que os esplenócitos TLR-9 KO ainda eram capazes de proliferar a um estímulo mitogénico não específico. A adição de CpG-ODN estimulador resultou numa forte resposta proliferativa que foi significativamente suprimida pela adição de IMS (Figura 1B) . A combinação de LPS com CpG-ODN estimulador aumentou a proliferação de esplenócitos, em comparação com a estimulação de LPS isoladamente. Contudo, os efeitos moduladores da IMS ainda eram evidentes, mesmo com a adição de LPS. A ausência do receptor TLR-9 dos esplenócitos TLR-9 KO ab-rogou os efeitos proliferativos de CpG-ODN, em comparação com esplenócitos TLR-9 WT. De modo semelhante, os esplenócitos TLR-9 KO não responderam à IMS. Após a adição de LPS aos esplenócitos tlr-9 KO, a IMS, isoladamente e em combinação com CpG-ODN estimulador, não influenciou a resposta proliferativa, quando comparada com esplenócitos TLR-9 WT. Isto implica que a IMS pode estar a impedir o CpG-ODN estimulador de prosseguir através da via de sinalização de TLR-9. O reconhecimento de CpG-ODN Estimulador por TLR-9 desencadeia a indução de vias de sinalização celular, culminando na activação de NF-κΒ (Krieg, Ann. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002). De modo a elucidar o mecanismo de IMS em CpG-ODN estimulador, foi investigado o papel da actividade de NF-κΒ 80 através da fosforilação de ΐκΒ-α em Serina 32. A análise de transferência Western de extractos de esplenócitos activados com o oligo indicado confirma a fosforilação de ΙκΒ-α em Serina 32 por CpG-ODN estimulador (Figura 1C, corredor 2) . Consequentemente, a IMS não induziu fosforilação de ΙκΒ-α em Serina 32 (Figura 1C, corredor 3) . Interessantemente, a combinação de CpG-ODN estimulador e IMS resultou numa redução marcada na fosforilação de ΙκΒ-α em Serina 32 (Figura 1C, corredor 5) . Este resultado indica que um mecanismo pelo qual a IMS funciona é competir com CpG-ODN estimulador para reconhecimento e ligação por elementos da via de sinalização de TLR-9.

Demonstrou-se que os CpG-ODNs aumentam a expressão de classe II de MHC (Martin-Orozco et al., Int. Immunol., 11: 1111-1118, 1999) . De modo a quantificar a concentração relativa de mensagem para a molécula de classe II de MHC, foi realizada análise de PCR quantitativo (QPCR) em ADNc, a partir de amostras de ARN purificadas de culturas de esplenócitos intactos. Os sinais foram normalizados em relação à quantidade de mensagem para β-actina. 0 ARNm de classe II de MHC estava aumentado em esplenócitos estimuladores incubados com o CpG-ODN, mas não em esplenócitos incubados com IMS (Figura 2A) . A regulação negativa de expressão de superfície celular de classe II de MHC por IMS foi confirmada por análise de triagem celular de activação fluorescente (FACScan). A IMS suprimiu a activação de expressão de superfície celular de classe II de MHC pelo CpG-ODN estimulador, num modo dependente de dose (Figura 2B).

De modo a determinar se a IMS reduziu a activação de células de apresentação de antigénios (APC), também foi analisada a expressão de superfície celular de diversos 81 marcadores de activação de APC. Esplenócitos naive foram incubados, durante 72 horas, com as concentrações indicadas de oligonucleótido inibitório, estimulador ou controlo irrelevante. A análise de FACScan indica que a IMS suprimiu a expressão de superfície celular induzida por CpG-ODN estimulador de CD40 (Figura 2C), CD80 (Figura 2D) e CD86 (Figura 2E) num modo dependente de dose. Em contraste, a expressão da molécula de apresentação de glicolípido, CDId (Figura 2F), era aumentada pela IMS num modo dependente de dose.

De modo a realizar um perfil do efeito sobre a produção de citocina de células imunitárias pelo oligonucleótido imunomodulador, esplenócitos naive foram removidos de animais e incubados, durante 72 horas, com as concentrações indicadas de IMS, CpG-ODN estimulador ou oligonucleótido de controlo irrelevante. A IMS isoladamente não induziu a produção de IL6 (Figura 3A) e ILl2p40 (Figura 3B) mas, quando combinada com CpG-ODN estimulador, suprimiu a produção de citocina num modo dependente de dose. A encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é um modelo de doença animal mediada por Thl da esclerose múltipla. A inflamação do sistema nervoso central induzida na doença EAE resulta numa paralisia ascendente, como resultado de infiltração inflamatória de matéria branca e desmielinização. A indução activa de EAE requer imunização do animal com antigénio ou péptido de mielina, em adjuvante completo de Freund, que contém micobactérias mortas pelo calor.

Foi, depois, investigada a administração in vivo de IMS como um método de prevenção da indução de EAE. Murganhos SJL/J foram imunizados subcutaneamente para indução de doença com o 82 péptido plp i39-i5i em CFA. Concorrentemente, o oligonucleótido indicado resuspenso em solução salina tamponada com fosfatos foi administrado intraperitonealmente como uma única injecção. Os murganhos tratados só com uma única injecção de IMS inibitória exibiram uma gravidade de doença globalmente diminuída, em comparação com murganhos tratados com PBS e tratados com CpG-ODN estimulador (Figura 4). EXEMPLO 2: IMS Modula Células Th2 Protectoras, Suprime Células Thl Auto-reactivas e Previne a Indução de Encefalomielite Auto-imune Experimental na Ausência de ISS (CpG)

Tendo-se demonstrado que a IMS suprimiu células T específicas de mielina não comprometidas naive, testou-se se a mesma poderia ter efeitos diferenciais sobre células Thl ou Th2 comprometidas, na ausência e presença de CpG-ODN. 0 CpG-ODN estimulador aumentou a proliferação de uma linha celular Thl específica de PLPi39_i5i, ao passo que a IMS suprimiu a sua proliferação (Figura 5A) . A combinação de IMS e CpG-ODN estimulador diminuiu o aumento da proliferação celular Thl específica de PLPi39_i5i causada por CpG-ODN isoladamente.

Foram realizadas investigações semelhantes com uma linha celular Th2 específica de PLPi39_i5i. 0 CpG-ODN estimulador suprimiu a proliferação da linha celular Th2 específica de PLPi39_i5i (Figura 5B) . Surpreendentemente, a IMS melhorou a proliferação da linha celular Th2. Deste modo, o CpG-ODN actua como um inibidor das células Th2 específicas de PLPi39_i5i, ao passo que a IMS isoladamente, í. e., na ausência de 83

Considerados ISS, modula as células Th2 específicas de plPi39_i5i. em conjunto, estes resultados inesperados e surpreendentes estabelecem que a IMS desta invenção inibe células Thl auto-imunes e aumenta a função protectora de células Th2, independentemente de ISS-ODN (CpG). A IMS foi administrada a murganhos SJL, 14 e 7 dias antes da indução de EAE com PLPi39_i5i em CFA. Este protocolo introduz a IMS ao sistema imunitário, durante duas semanas, na ausência de quaisquer iSSs adicionadas. Os murganhos tratados com IMS tiveram um atraso no começo da doença e uma gravidade de doença globalmente diminuída, em comparação com murganhos não tratados (Figura 6). EXEMPLO 3:

Terapia Polinucleotídica com uma Estrutura de Vector Plasmídico Modificada com GpG

Com base nos resultados com o oligonucleótido IMS, demonstrando o benefício das sequências GpG na redução da gravidade de doença e na produção de um desvio de Th2 na população de células T auto-reactivas, foi criado um vector modificado incorporando sequências GpG dentro da estrutura do vector. Principiou-se com o vector pVAXl (Invitrogen, Carlsbad, CA) que é o vector plasmídico predominantemente utilizado nas presentes experiências de EAE e que foi concebido para cumprir a totalidade dos requisitos para utilização em humanos. Foi, depois, examinado o vector para motivos CpG que correspondem ao consenso do motivo CpG humano conhecido, para estimulação imunitária, que é Pu-Py-C-G-Py-Py. Foi determinado que, numa 84 cadeia de pVAXl, existem 16 desses elementos CpG. Utilizando mutagénese dirigida pontual, modificaram-se 12 daqueles sítios, como sumariado na Tabela 1. Os restantes sítios CpG ocorriam dentro de importantes regiões de controlo do vector e, por conseguinte, não foram modificados. Onde possível, o C no motivo CpG foi alterado para um G, de modo a corresponder ao motivo de sequência das sequências oligo GpG utilizadas no oligonucleótido IMS. Isto foi realizado em quatro dos 12 sítios modificados. Os outros oito sítios foram modificados, não para um GpG mas de tal modo que o C dentro do motivo CpG fosse alterado quer para um A ou um T. Desta forma, o motivo CpG imunoestimulador potencialmente dirigindo Thl foi removido. 0 vector deste modo construído foi denominado pBHTl. TABELA 2 Sítios de mutagénese confirmados por sequência e tipos de alterações nucleotídicas em pBHTl Sítios* 784 1161 1218 1264 1337 1829 1874 1940 1963 1966 1987 1997 Não codificantes sim sim sim não não não não não não não não não Codificantes não não não Kan Kan Kan Kan Kan Kan Kan Kan Kan C para G sim sim sim não não não não não não sim não não C para A não não não sim sim não não não não não não não C para T não não não não não não não não sim não sim não CGC para AGG não não não não não sim sim sim não não não sim * 0 sistema de numeração é baseado no sistema de numeração original da sequência de pVAXl da Invitrogen 85 0 vector pBHTl foi testado por ensaios in vitro, de modo a determinar se existe, de facto, um grau reduzido de imunoestimulação em comparação com o pVAXl não modificado. Os ensaios foram realizados utilizando esplenócitos de fresco intactos de murganhos SJL/J como uma fonte de células imunitárias. Foram utilizados esplenócitos intactos, em virtude de se saber que oligonucleótidos CpG-ODN estimulador activam células imunitárias derivadas de baços, incluindo células dendriticas, macrófagos, células T e células B. Os ensaios realizados incluíram ensaio de proliferação, análise de FACS e ELISA para produção de citocina. Os oligonucleótidos CpG foram utilizados como um controlo para activação imunitária e os oligonucleótidos GpG IMS foram utilizados como controlo para inibição imunitária.

Nos ensaios de controlo, a proliferação foi realizada através da incubação de esplenócitos isolados com 10 pg/mL quer de oligo CpG ou oligo GpG IMS, durante 24 horas. Adicionalmente, foram incubados esplenócitos, durante 24 horas, com três concentrações diferentes de vector vazio pVAXl ou vector vazio pBHTl, como na Figura 7. Como mostrado pelos índices de estimulação, o vector pVAXl teve um grau superior de proliferação, em comparação com o vector pBHTl em cada uma das concentrações de vector. Embora a magnitude de estimulação seja menor (provavelmente em virtude de a quantidade molar de sequências estimuladoras ser superior numa determinada concentração de oligo do que em plasmídeo), a tendência resultante em estimulação correlacionou-se com aquela observada com os dois oligos. Isto é, existe menos estimulação com o oligo GpG IMS e também existe menos estimulação com o vector pBHTl. 86

De modo a determinar se o oligonucleótido GpG IMS reduziu a activação de células de apresentação de antigénios (APC), foi analisada a expressão de superfície celular de CD16/32 como um marcador para activação de APCs. Esplenócitos naive foram incubados, durante 48 horas, com 10 pg/mL quer de oligo CpG ou oligos GpG IMS. As células foram recolhidas e medidas por análise de FACScan para expressão de CD16/32. Enquanto os oligos CpG causam a activação de CD16/32, o oligo GpG IMS imunomodulador suprimiu a expressão de superfície celular de CD16/32 quase para o nível do dos meios isoladamente (Figura 8A) . Foi, depois, determinado se o vector pBHTl modificado se comportava num modo semelhante, em termos de activação de CD16/32. Esplenócitos foram incubados, durante 48 horas, com 100 pg/mL quer de vector vazio pVAXl ou vector vazio pBHTl. De novo, existiu uma redução na activação de CD16/32 com o vector pBHTl, indicada por uma redução na activação de APC (Figura 8B) .

Os oligonucleótidos CpG são conhecidos por causarem a activação de células imunitárias, de maneira a que a secreção de múltiplas citocinas seja aumentada. Foram realizados ensaios, como anteriormente, nos quais os esplenócitos foram incubados com oligo CpG ou oligo GpG IMS, durante o tempo indicado e a secreção de diversas citocinas foi medida por ELISA em sanduíche. Adicionalmente, os esplenócitos foram incubados com vector vazio pVAXl e pBHTl, de modo a determinar se as modificações em pBHTl tinham um efeito semelhante sobre a produção de citocina. Como mostrado na Figura 9, o oligo CpG causa a indução de secreção de IL6, IL10 e IFN-γ a partir de esplenócitos naive. Contudo, o oligo GpG IMS não induz a produção de qualquer destas citocinas. Quando a produção de citocina induzida por vector pVAXl é comparada com aquela pelo 87 vector pBHTl, existe uma tendência semelhante em produção reduzida de IL6, IL10 e IFN-γ com pBHTl. Embora permaneça uma pequena indução aumentada de produção de citocina por pBHTl, em contraste com GpG IMS, no qual não havia quase nenhuma indução de citocina, o grau de indução é muito menor do que aquele com pVAXl. É provável que este baixo grau de indução se deva às sequências CpG que não eram capazes de ser modificadas e permanecem na estrutura do vector. De facto, provavelmente não se quereria um vector completamente inócuo que não causasse indução imunitária, visto que um um tal vector pode não ter eficácia a fazer com que o sistema imunitário reaja numa maneira favorável à vacina de ADN.

Foram realizadas experiências in vivo avaliando a eficácia da abordagem da terapia de tolerização de ADN polinucleotídico, utilizando um auto-antigénio dentro do vector pBHTl no modelo de EAE. 0 ADN codificando o auto-antigénio, PLP (proteína de proteolípido) de murganho, foi incorporado dentro do vector pBHTl e administrado intramuscularmente a murganhos SJL (ver a Figura 10) . O modelo aqui utilizado é um modelo de tratamento, em vez de um modelo de prevenção, na medida em que os murganhos foram primeiro induzidos para EAE com o péptido PLPi39_i5i em CFA (adjuvante completo de Freund) e, depois, vários dias após o começo da doença (no dia 20), foram aleatorizados dentro de diversos grupos de tratamento. Cinquenta pg de PLP de murganho codificada dentro do vector pBHTl ou cinquenta pg de um controlo de vector pBHTl vazio foram, depois, administrados intramuscularmente em três frequências de dose diferentes. Como mostrado na Figura 10, há uma redução na pontuação média da doença EAE na totalidade dos grupos de tratamento, de um modo muito notável a uma frequência de duas em duas ou de quatro em quatro semanas. Estudos anteriores, utilizando terapia 88 polinucleotídica de auto-antigénio com um vector não pBHTl, demonstraram uma redução nas taxas de recidiva neste tipo de modelo de tratamento de EAE. Contudo, aqueles estudos anteriores não demonstraram uma redução deste parâmetro de gravidade de EAE (i. e., pontuação média de doença) num modelo de tratamento, como é aqui demonstrado com a terapia polinucleotídica de auto-antigénio no vector pBHTl. A conclusão dos requerentes é que o actual vector pBHTl está, agora, mais optimizado para utilização no tratamento de doenças auto-imunes mediadas por Thl, tal como MS. Por conseguinte, os genes de auto-antigénios humanos são clonados no vector pBHTl para utilização como terapia polinucleotídica na doença humana. EXEMPLO 4:

Tratamento de um Modelo Animal de Esclerose Múltipla Utilizando IMS Em combinação Com ADN Codificando Múltiplas Autoproteínas

Uma terapia polinucleotídica de ADN, composta por ADNc de comprimento completo codificando os quatro principais componentes de mielina, MBP, MAG, MOG e PLP tratou doença recorrente no modelo animal EAE quando proporcionada após o início do surgimento da doença. Além disso, com a adição de ADN codificando IL-4 à terapia polinucleotídica de ADN de mielina, a eficácia do tratamento é adicionalmente melhorada por uma diminuição na taxa de recidiva. Contudo, não obstante a redução em recidivas, a gravidade de doença global é ainda comparável ao grupo de controlo. 89

Murganhos SJL/J fêmea foram imunizados subcutaneamente com 100 pg de PLPi39_i5i em PBS emulsionado em CFA, consistindo em IFA e 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis inactivado por calor. Doze dias após a imunização, no momento do começo da doença, os murganhos foram injectados em ambos os quadríceps, com um total de 0,1 mL de Bupivacaína-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, murganhos seleccionados foram injectados intramuscularmente, em ambos os quadríceps, com uma mistura cocktail de ADN, contendo 25 pg cada de quatro plasmídeos pTARGET separados (Promega Corp. Wisconsin) codificando PLP, MAG, MOG e MBP murinos de comprimento completo, mais 50 pg de plasmideo pTARGET codificando IL-4 murina de comprimento completo, num volume total de 0,2 mL. As injecções de ADN foram proporcionadas em intervalos semanais, ao longo de seis semanas. Ao mesmo tempo que a vacinação de ADN inicial, 50 pg de IMS num volume de 200 pL de PBS foram administrados intraperitonealmente, isoladamente ou com vacinação de ADN. A IMS foi proporcionada de duas em duas semanas, ao longo de seis semanas.

Em comparação com murganhos não tratados e murganhos tratados com terapia polinucleotídica de ADN, mais um plasmideo codificando IL-4, os murganhos tratados com IMS isoladamente tiveram uma gravidade de doença média globalmente diminuída durante todo o decurso da doença (Figura 11) . A redução da gravidade de doença média global foi significativamente mais drástica quando os murganhos foram tratados com cocktail de ADN, mais IL-4 em combinação com IMS (Figura 11).

Cinquenta e sete dias após indução da doença EAE, os murganhos foram sacrificados e os nódulos linfáticos inguinais e axilares dos murganhos foram extraídos e agregados, de acordo 90 com os grupos respectivos. As células foram isoladas e estimuladas com 10 pg/mL em PLPi39_i5i em meios RPMI enriquecidos e FCS a 10%. Três dias após reestimulação, os sobrenadantes foram recolhidos e rastreados para produção de IFN-γ, IL-4 e IL-10 por ELISA em sanduíche. Os perfis de citocina para murganhos não tratados e murganhos tratados com IMS isoladamente ou com terapia polinucleotídica de ADN mais IL-4, tiveram todos um pendor para Thl de produção de IFN-γ aumentada (Figura 12) . O grupo tratado com terapia polinucleotídica de ADN, mais IL-4 em combinação com IMS, teve um pendor para Th2, com produção aumentada de IL-4 e IL-10.

Os cérebros e medulas espinais desta experiência in vivo foram isolados para análise histológica através de perfusão dos murganhos com formalina tamponada a 10%, depois da qual o cérebro e medula espinal irão ser removidos e adicionalmente fixados em formalina tamponada a 10%. As amostras embebidas em parafina foram coradas com os corantes hematoxilina-eosina e azul rápido de Luxol e impregnação de Bielschowsky. Como sumariado na Tabela 2, o número total de focos inflamatórios nas meninges e parênquima e o número de focos de desmielinização foram significativamente diminuídos no grupo tratado com IMS, em comparação com o grupo de controlo. O número total de focos inflamatórios nas meninges e parênquima e o número de focos de desmielinização em murganhos tratados com terapia polinucleotídica de ADN e IL-4 mais CpG foram significativamente melhorados, em comparação com o grupo de controlo. Houve uma diminuição tanto no número total de focos inflamatórios como no número de focos de desmielinização no grupo tratado com terapia polinucleotídica de ADN e IL4. O número de focos inflamatórios e o número de focos de desmielinização foram adicionalmente 91 diminuídos no the grupo tratado com polinucleótido de ADN e IL4 mais IMS. TABELA 3 Número de Focos Inflamatórios Meninqes Parênquima Total # De Focos de desmielinização CONTROLO 76 66 142 50 138 128 266 18 106 89 195 39 IMS 62 48 110 22 77 54 131 22 Terapia 109 58 167 47 Polinucleotídica de 110 106 216 41 ADN + IL4 69 61 130 40 Terapia 66 17 83 7 Polinucleotídica de 69 33 102 18 ADN de IL4 + IMS 90 89 179 42 Terapia 160 213 373 nd Polinucleotídica de 196 122 318 36 ADN de IL4 + CpG 126 129 255 55

Amostras séricas, recolhidas no dia cinquenta e sete, de murganhos tratados na Figura 11, foram analisadas por uma inovadora tecnologia de micromatriz de proteína que possibilita a caracterização em grande escala da especificidade de respostas de auto-anticorpo de mielina entre amostras de doença e de controlo. A análise de matriz foi realizada e o SAM foi utilizado para identificar e criar uma análise hierárquica de 92 aglomerados, de modo a ordenar as características antigénicas. Na Figura 13, houve um aumento significativo em disseminação de epitopo de auto-anticorpo de mielina por tratamento com terapia polinucleotidica de ADN e IL-4 mais CpG, em comparação com murganhos de controlo e murganhos tratados com IMS isoladamente e terapia polinucleotidica de ADN e IL-4. 0 tratamento com terapia polinucleotidica de ADN e IL-4 mais IMS aumentou, adicionalmente, a disseminação de epitopo de auto-anticorpo.

Esta experiência in vivo foi repetida com resultados semelhantes. Na Figura 14A, no pico de EAE aguda, os murganhos foram tratados com 50 pg/dose, quer de IMS ou CpG, de duas em duas semanas. Ao longo de cinquenta e sete dias, houve uma diminuição significativa na gravidade de doença média global em murganhos tratados com IMS, em comparação com os murganhos tratados com PBS e murganhos tratados com CpG. Na Figura 14B, no pico de EAE aguda, os murganhos foram tratados com injecções semanais de terapia polinucleotidica de ADN e IL-4, terapia polinucleotidica de ADN e IL-4 mais CpG ou terapia polinucleotidica de ADN e IL-4 mais IMS. Ao longo de cinquenta e sete dias, a gravidade de doença média global de murganhos tratados com terapia polinucleotidica de ADN e IL-4 mais CpG era comparável a murganhos tratados com PBS. Houve uma diminuição significativa na gravidade de doença média global em murganhos tratados com terapia polinucleotidica de ADN e IL-4, em comparação a murganhos tratados com PBS. A gravidade de doença média global foi, adicionalmente, reduzida em murganhos tratados com terapia polinucleotidica de ADN e IL-4 mais IMS. 93 EXEMPLO 5:

Tratamento De Diabetes Mellitus Dependente De Insulina Utilizando IMS Em Combinação Com ADN Codificando A Autoproteina Insulina

Os murganhos diabéticos não obesos (NOD) desenvolvem diabetes auto-imune espontânea e partilham muitas caracteristicas clinicas, imunológicas e histopatológicas com a diabetes Mellitus dependente de insulina (IDDM) humana. A doença é caracterizada por inflamação dos ilhéus pancreáticos de Langerhans e destruição das células β, conduzindo a hiperglicemia e diabetes declarada. São regueridas células T, tanto CD4+ como CD8+, para o desenvolvimento da doença. Foi identificada a reactividade a diversos auto-antigénios, incluindo insulina, IA-2 e ácido glutâmico descarboxilase. A eficácia de tratamento de IMS em combinação com ADN codificando a autoproteina insulina foi iniciada durante a insulite invasiva, mas antes do começo completo de IDDM. Murganhos NOD/Lt fêmea foram obtidos com 7 semanas de idade e alojados numa sala de acesso restrito. Os murganhos foram testados semanalmente para níveis de glucose no sangue (BGL) elevados, com início às 10 semanas de idade, utilizando o One Touch Ultra Blood Glucose Monitoring System. O tratamento foi iniciado quando a BGL estava entre 200 a 250 mg/dL. Os murganhos foram adicionados sequencialmente, a cada grupo, à medida que ficavam disponíveis, começando com a idade de 15 semanas. Os murganhos foram injectados em ambos os quadríceps, com um total de 0,2 mL de Bupivacaína-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os murganhos foram injectados intramuscularmente em ambos os quadríceps com vector pVAXl, a 50 pg/dose, ou uma mistura de 94 cocktail de ADN contendo 50 pg cada de três plasmídeos pVAXl separados codificando Pré-proinsulina 1, Pré-proinsulina 2 e IL4 murinos de comprimento completo, num volume total de 0,2 mL de PBS. As injecções foram proporcionadas em intervalos semanais, durante quatro semanas. Ao mesmo tempo que a vacinação de ADN inicial, 50 pg de IMS num volume de 200 pL de PBS foram administrados intraperitonealmente, isoladamente ou com vacinação de ADN. A IMS foi proporcionada em intervalos semanais, durante quatro semanas. A percentagem de diabéticos é definida como murganhos com uma BGL constante acima de 250 mg/dL. Após quatro injecções de tratamento, a taxa de sobrevivência de cada grupo foi observada (Figura 15A) . Na semana 9, a taxa de sobrevivência do grupo de controlo foi 10%, o grupo de IMS isoladamente foi 20%, o grupo de plasmideo isoladamente foi 54%, a combinação de polinucleótido de ADN mais IL-4 foi 45% e a combinação de polinucleótido de ADN mais IL4 e IMS foi 73%. Quando se compara a idade dos murganhos em relação aos respectivos protocolos de tratamento, murganhos recebendo IMS isoladamente tiveram uma incidência de diabetes de 80,0% na semana 29 (Figura 15B).

Murganhos recebendo plasmideo pVAXl vazio (Invitrogen, CA) tiveram uma incidência de diabetes de 45,4% (p = 0,635).

Murganhos tratados com uma combinação de polinucleótido de ADN codificando auto-antigénios e a citocina IL-4, em conjunto com sequências imunomoduladoras, desenvolveram incidência de diabetes de apenas 27,3% (p = 0,0075), em comparação com incidência de diabetes de 90% no grupo não tratado na semana 29 (Figura 15B). Nesta experiência, os plasmídeos de ADN foram injectados IM, enquanto as IMS foram injectadas IP, sugerindo fortemente que os plasmídeos de ADN (iSSs) e as IMS estavam a visar populações celulares diferentes. Além do mais, neste 95 estudo, os murganhos NOD não foram expostos a ISS. Considerado em conjunto, este resultado surpreendente e inesperado demonstra que as IMS tratam eficazmente uma doença auto-imune de ocorrência natural.

Este estudo foi repetido, de modo a incluir grupos de tratamento adicionais e o período de tratamento foi modificado para intervalos semanais, durante 8 semanas. Os grupos de tratamento eram 1) tratado com PBS, 2) plasmídeo pVAXl vazio, a 200 pg/dose, 3) IMS, a 50 pg/dose, proporcionada intramuscularmente, 4) a combinação de plasmídeo pVAXl vazio mais IMS (intramuscularmente), 5) a combinação de polinucleótido de ADN, 6) a combinação de polinucleótido de ADN mais IMS (intramuscularmente), 7) a combinação de polinucleótido de ADN mais IL-4, 8) a combinação de polinucleótido de ADN mais IL-4 mais IMS (intramuscularmente), 9) a combinação de polinucleótido de ADN mais IL-4 e uma injecção intraperitoneal separada de IMS. Como indicado na Figura 16, percentagem de sobrevivência de cada grupo foi 1) tratado com PBS (0%), 2) plasmídeo pVAXl vazio (36%), 3) IMS proporcionada intramuscularmente (14%), 4) a combinação de plasmídeo pVAXl vazio mais IMS (47%), 5) a combinação de polinucleótido de ADN (36%), 6) a combinação de polinucleótido de ADN mais IMS (25%), 7) a combinação de polinucleótido de ADN mais IL-4 (31%), 8) a combinação de polinucleótido de ADN mais IL-4 mais IMS (38%), 9) a combinação de polinucleótido de ADN mais il-4 e uma injecção intraperitoneal separada de IMS (54%). 96 EXEMPLO 6:

Tratamento De Artrite Induzida por Colagénio Utilizando IMS Em Combinação Com ADN Codificando O Colagénio De tipo II intacto De Autoproteína e IL4 A artrite induzida por colagénio (CIA) murina é um modelo animal de artrite Reumatóide (RA). A CIA é induzida injectando estirpes geneticamente susceptiveis de murganhos com colagénio de tipo II intacto (Cll), emulsionado em Adjuvante Completo de Freund (CFA). CII, a principal proteína constituinte de cartilagem em articulações diartrodiais, é o local de inflamação predominante em RA (Myers et al., Life Sciences, 61: 1861-1878, 1997) . A artrite poliarticular grave resultante é caracterizada por sinovite e a erosão crónica de cartilagem e osso gue histologicamente se assemelha a ARN (Courtenay et al., Nature, 283(5748): 666-668,1980). Como a RA, a susceptibilidade a CIA em roedores está ligada à expressão de moléculas específicas de classe II do complexo de histocompatibilidade principal (Wooley et al., J. Exp. Med., 154:688-700, 1981; Griffiths, Int. Rev. Immunol., 4:1-15, 1988).

Foi examinada a eficácia de tratamento de IMS em combinação com ADN codificando o colagénio de tipo II intacto de autoproteína (CII) e IL-4. Grupos de 20 murganhos DBA/1 de seis semanas de idade foram injectados intramuscularmente (IM) em ambos os quadríceps, com um total de 0,2 mL de Bupivacaína-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os murganhos foram injectados intramuscularmente em ambos os quadríceps, com 50 pg/dose, de cada uma das vacinas de ADN indicadas e, ao mesmo tempo que a vacinação de ADN inicial, 50 pg de IMS, num volume de 200 pL de PBS, foram administrados intraperitonealmente. Os 97 grupos de tratamento eram: 1) apenas PBS, 2) plasmídeo pTarget e IL-4 em pTarget, 3) plasmídeo pTarget e IL-4 em pTarget mais IMS, 4) CII intacto em pTarget e IL-4 em pTarget; 5) CII intacto em pTarget e IL-4 em pTarget mais IMS. 0 tratamento foi proporcionado 14 e 7 dias antes de indução de CIA, com CII emulsionado em Adjuvante Completo de Freund. Os murganhos receberam uma terceira dose de vacina de ADN tolerizante e/ou dose de IMS, 1 semana após indução de CIA. Os murganhos foram reforçados, 2 semanas mais tarde, com CII emulsionado em

Adjuvante Incompleto de Freund. A artrite foi pontuada utilizando o sistema de pontuação visual, como descrito em

Current Protocols in Immunology.

Os murganhos tratados com ADN codificando colagénio de tipo II intacto (CII) mais ADN codificando IL-4, com e sem IMS, resultaram em reduções significativas na gravidade média de artrite, em comparação com grupos de controlo tratados com vector de vacina de ADN (pTarget) + IL-4, com ou sem IMS. (Figura 17A) A percentagem global de incidência de doença era comparável em todos os grupos (Figura 17B). A proliferação de células T para CII intacto desnaturado indicou a presença de células τ reactivas para CII em todos os grupos de tratamento (Figura 18). A análise de citocina indicou que o tratamento com plasmídeos de ADN, com e sem IMS, teve eficácia significativa na supressão de IL-6 e produção de TNF-alfa aumentando, simultaneamente, a produção de IL-4 (Figura 19).

Numa segunda experiência in vivo, foi examinada a eficácia de tratamento de IMS, isoladamente e em combinação com ADN codificando o colagénio de tipo II intacto de autoproteína (CII) . Grupos de 20 murganhos DBA/1 de seis semanas de idade foram injectados intramuscularmente (IM) em ambos os quadríceps, 98 com um total de 0,2 mL de Bupivacaína-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os murganhos foram injectados intramuscularmente em ambos os quadríceps, com 50 pg/dose, de cada uma das vacinas de ADN indicadas e, ao mesmo tempo que a vacinação de ADN inicial, 50 pg de IMS, num volume de 200 pL de PBS, foram administrados intraperitonealmente. Os grupos de tratamento eram: 1) Apenas PBS, 2) apenas IMS e 3) CII intacto em pTarget mais IMS. O tratamento foi proporcionado 14 e 7 dias antes de indução de CIA, com CII emulsionado em Adjuvante Completo de Freund. Os murganhos receberam uma terceira dose de vacina de ADN tolerizante e/ou dose de IMS, 1 semana após indução de CIA. A artrite foi pontuada utilizando o sistema de pontuação visual, como descrito em Current Protocols in Immunology. O tratamento de IMS isoladamente resultou em reduções significativas na gravidade média de artrite, comparativamente com grupo de controlo e o grupo tratado com CII intacto com IMS (Figura 20A), assim como incidência de doença reduzida (Figura 20B). EXEMPLO 7: IMS Bloqueia os Efeitos Estimuladores de CpG em células B Primárias

Demonstrou-se que em células B maduras primárias, ADN de CpG funciona como um factor co-estimulador na presença de um antigénio especifico através da amplificação da produção de imunoglobulina e proliferação de células B (Krieg et al., Nature, 374:546, 1995; Yi et al., J. Immunol., 157:5394, 1996). Células B primárias foram isoladas dos baços de SJL/J por uma técnica padrão de enriquecimento de células B, utilizando um 99 anticorpo igG e igM de cabra anti-murganho, específico de cadeia pesada e leve, com globulina gama de cabra como uma proteína veículoa e pureza > 97% de células B220+ foi determinada por análise de FACScan. As células B primárias foram cultivadas com 5 pg/mL de oligo indicado, durante 72 h. LPS foi co-cultivado a 100 ng/mL. Os poços foram submetidos a um pulso com 1 pCi de [3H]TdR, durante as 16 h finais de cultura, antes de a radioactividade incorporada ser medida. Cada ponto de dados representa a média de poços triplicados +/-SD. Como representado na Figura 21, um ensaio de proliferação de células B enriquecido confirmou que os CpG podem causar proliferação robusta, ao passo que IMS foi capaz de suprimir os efeitos de CpG-ODN em células B maduras. A co-cultura de células B com LPS e CpG-ODN pareceu ter um efeito proliferativo aditivo que foi suprimido pela adição de IMS, mas não o oligo de controlo. A análise de citocina indicou que a produção aumentada de IL-6 (Figura 22A), IFN-gama (Figura 22B), IL-10 (Figura 22C) e IL-12 (p40) (Figura 22D) por CpG-ODN foi eficazmente reduzida pela adição de IMS. EXEMPLO 8:

Tratamento De Lúpus Eritematoso Sistémico Utilizando IMS Isoladamente e Em Combinação Com ADN Codificando Autoproteínas para Macromoléculas Intracelulares

Existem diversos modelos murinos de doença semelhante a lúpus espontânea e induzida que partilham muitas características com lúpus humano. Estes incluem o modelo híbrido espontâneo da Nova Zelândia (híbrido Fl NZB/NZW), o modelo espontâneo MRL-lpr/lpr e o modelo Balb/c induzido prístino. A produção de auto-anticorpos dirigidos contra macromoléculas intracelulares, tais 100 como nucleossomas, ADN e ribonucleoproteínas nucleares pequenas desempenha um importante papel no mecanismo de patogénese de lesão tecidular e glomerulonefrite. A eficácia do tratamento de IMS, isoladamente e em combinação com ADN codificando as ribonucleoproteínas nucleares pequenas de autoproteínas UlA ou U1C, foi testada em murganhos Balb/c fêmea. Grupos de 10 murganhos Balb/c fêmea de seis semanas de idade foram injectados intramuscularmente (IM) em ambos os quadríceps, com um total de 0,2 mL de Bupivacaína-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os murganhos foram injectados intramuscularmente em ambos os quadríceps com as vacinas de ADN indicadas; 1) plasmídeo pTarget (100 pg/dose); 2) UlA em pTarget mais pTarget vazio (cada a 50 pg/dose); 3) U1C em pTarget mais pTarget vazio (cada a 50 pg/dose); e 4) a combinação de UlA e U1C (cada a 50 pg/dose) . Ao mesmo tempo que a vacinação de ADN inicial, 50 pg de IMS ou CpG num volume de 200 pL de PBS foram administrados intraperitonealmente, isoladamente ou com vacinação de ADN. As injecções foram administradas semanalmente, durante duas semanas. A indução de SLE foi por injecção única intraperitoneal de 0,5 mL de Pristano. Depois, os murganhos receberam uma terceira dose de vacina de ADN tolerizante e/ou dose oligo, 1 semana após indução de SLE. As injecções mensais do mesmo regime de tratamento são para continuar, durante um total de 9 meses. A progressão de SLE é avaliada por monitorização mensal de níveis de proteína na urina. Na conclusão da experiência, o dano de tecido renal é avaliado por coloração histológica com hematoxilina e eosina, Schiff ácido periódico, tricromo e corantes de reticulina à base de prata. As lesões renais são pontuadas para gravidade de hipercelularidade mesangial, aumento de matriz mesangial, acentuação lobular e extensão de coloração de IgG e C3. 101 A eficácia de tratamento de IMS, isoladamente e em combinação com ADN codificando as ribonucleoproteínas nucleares pequenas de autoproteinas UlA, U1C e U170 e as histonas nucleossomais H2B e H3, é testada em murganhos fêmea MRL-MpJFAS lpr. Grupos de 10 murganhos MRL-MpJFAS Ipr fêmea de seis semanas de idade são injectados intramuscularmente (IM) em ambos os quadriceps, com um total de 0,2 mL de Bupivacaina-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os murganhos são injectados intramuscularmente em ambos os quadriceps com 50 pg/dose de cada uma das vacinas de ADN indicadas (pBHTl, UlA em pBHTl, U1C em pBHTl, H2B em pBHTl e H3 em pBHTl), durante 3 semanas consecutivas. O vector pBHTl é descrito no Exemplo 3. Ao mesmo tempo que a vacinação de ADN inicial, 50 pg/dose de IMS ou CpG num volume de 200 pL de PBS são administrados intraperitonealmente, isoladamente ou com vacinação de ADN. Os murganhos recebem mais duas injecções mensalmente de dose de vacina de ADN tolerizante e/ou dose de oligo. A progressão de SLE é avaliada por monitorização mensal de niveis de proteína na urina. Na conclusão da experiência, o dano de tecido renal é avaliado por coloração histológica com hematoxilina e eosina, Schiff ácido periódico, tricromo e corantes de reticulina à base de prata. As lesões renais são pontuadas para gravidade de hipercelularidade mesangial, aumento de matriz mesangial, acentuação lobular e extensão de coloração de IgG e C3. A eficácia de tratamento de IMS, isoladamente e em combinação com ADN codificando as histonas nucleossomais de autoproteinas H2B ou H3, é testada em murganhos fêmea híbridos Fl (NZB x NZW) . Grupos de 10 murganhos híbridos Fl (NZB x NZW) fêmea de cinco meses de idade são injectados intramuscularmente (IM), em ambos os quadriceps, com um total de 0,2 mL de Bupivacaina-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os 102 murganhos são injectados intramuscularmente em ambos os

quadriceps com 50 pg/dose de cada uma das vacinas de ADN indicadas (plasmideo pBHTl, H2B em pBHTl , H3 em pBHTl e a combinação de H2B e H3), durante 3 semanas consecutivas. Ao mesmo tempo que a vacinação de ADN inicial, 50 pg/dose de IMS ou CpG num volume de 200 pL de PBS são administrados intraperitonealmente, isoladamente ou com vacinação de ADN. A progressão de SLE é avaliada por monitorização mensal de niveis de proteina na urina. Na conclusão da experiência, o dano de tecido renal é avaliado por coloração histológica com hematoxilina e eosina, Schiff ácido periódico, tricromo e corantes de reticulina à base de prata. As lesões renais são pontuadas para gravidade de hipercelularidade mesangial, aumento de matriz mesangial, acentuação lobular e extensão de coloração de IgG e C3. EXEMPLO 9:

Tratamento De Cirrose Biliar Primária Utilizando IMS Isoladamente e em combinação com ADN codificando O Complexo De Piruvato Desidrogenase De Autoproteína e IL-4 A cirrose biliar primária (PBC) é uma doença hepática colestática crónica auto-imune que é mediada por células T CD4+. A colangite auto-imune experimental (EAC) é o modelo de doença animal que produz lesões semelhantes a PBC nas células epiteliais biliares, revestindo os duetos biliares intra-hepáticos pequenos, em murganhos SJL sensibilizados com o auto-antigénio, complexo de piruvato desidrogenase (PDC). 103 A eficácia de tratamento de IMS, isoladamente e em combinação com ADN codificando as autoproteinas di-hidrolipoamida acetil-transferase (E2) e componentes da proteina de ligação E3 do PDC, foi testada em murganhos fêmea SJL/J. Grupos de 15 murganhos SJL/J fêmea de oito semanas de idade foram injectados intramuscularmente (IM) em ambos os quadriceps, com um total de 0,2 mL de Bupivacaina-HCL a 0,25% em PBS. Dois dias mais tarde, os murganhos foram injectados intramuscularmente em ambos os guadriceps com 50 pg/dose de cada uma das vacinas de ADN indicadas (plasmideo pTarget, PDC-E2 em pTarget e a combinação de PDC-E2 e IL4), com três doses semanalmente. Ao mesmo tempo gue a vacinação de ADN inicial, 50 pg de IMS ou CpG num volume de 200 pL de PBS foram administrados intraperitonealmente, isoladamente ou com vacinação de ADN. Os murganhos foram induzidos com péptido PDC-E2 GDLLAEIETDKATI (500 pg em 100 pL de PBS) emulsionado 1:1 (v/v) com CFA (contendo 10 mg/mL da estirpe H37RA de Mycobacterium tuberculosis) com uma única injecção intraperitoneal de 200 pL. A EAC é avaliada 30 semanas após sensibilização. Secções de fígado coradas com H&E são utilizadas para avaliação morfológica de necroinflamação e lesão de dueto biliar. EXEMPLO 10:

Rastreio de Oligonucleótidos IMS Adicionais Que se Prevê que Modulem a Doença Auto-imune

Prevê-se que os oligonucleótidos IMS adicionais terão eficácia semelhante ou melhorada na alteração do curso de doença auto-imune. A sequência destes oligonucleótidos IMS adicionais é 104 baseada nos dados de eficácia obtidos com o oligonucleótido IMS descrito anteriormente (í. e., 5'TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3'). Prevê-se que os oligonucleótidos IMS adicionais que têm eficácia semelhante ou melhorada sigam o padrão seguinte: 5'-TGACTGTGTGRRc^YYAGAGATGA-3', onde R representa purinas (A ou G), Y representa pirimidinas (C ou T) e α e β são dinucleótidos GpG ou não GpG. Prevê-se que estes oligonucleótidos tenham a eficácia mais robusta em ensaios de roedor, visto que o consenso segue aquilo que foi referido como sendo o mais activo em sistemas de roedor. Uma lista completa destes oligonucleótidos IMS é listada na Tabela 4. Na tabela, "I" representa inosina.

De modo semelhante, prevê-se que oligonucleótidos IMS adicionais, que têm eficácia semelhante ou melhorada, sigam o padrão seguinte: 5'-TGACTGTGTGRYc^YYAGAGATGA-3' onde R representa purinas (A ou G), Y representa pirimidinas (C ou T) e α e β são dinucleótidos GpG ou não GpG. Prevê-se que estes oligonucleótidos tenham a eficácia mais robusta em ensaios humanos, visto que o consenso segue aquilo que foi referido como sendo o mais activo em sistemas humanos. Uma lista completa destes oligonucleótidos IMS é listada na Tabela 5. Na tabela, "I" representa inosina.

Todos os oligonucleótidos são sintetizados com uma estrutura de fosfotioato em cada um dos nucleótidos, de modo a aumentar a estabilidade do oligonucleótido. Estes oligonucleótidos são rastreados individualmente por ensaios in vitro para efeitos sobre a activação celular imunitária. Estes rastreios incluem ensaios de proliferação celular, perfis de secreção de citocina e análise de expressão de marcador de superfície celular por FACS. Os oligonucleótidos IMS candidatos que mostrem actividade imunitária inibitória são, depois, 105 ensaiados utilizando ensaios in vivo para imunomodulação. Estes ensaios in vivo incluem a análise de células imunitárias pelos parâmetros de activação anteriores, após administração do oligonucleótido IMS ao animal, assim como modelos de doença auto-imune (e. g., EAE, NOD, SLE e CIA).

Tanto na Tabela 4 como Tabela 5 são representados exemplos de sequências flanqueantes tanto 5' como 3' em torno do hexâmero nuclear (í. e., RRaPYY ou RYc^YY). As sequências flanqueantes adicionais circundando este hexâmero nuclear são criadas através da substituição das sequências flanqueantes com qualquer sequência nucleotidica de qualquer comprimento. Isto está representado nas seguintes sequências: 5'-NNNNNNNNNNRYαβYYNNNNNNNNNN-3' e 5'-NNNNNNNNNNRRaPYYNNNNNNNNNN-3', onde N representa qualquer nucleótido. Exemplos específicos incluem mas não estão limitados aos seguintes oligonucleótidos: 5'-GGGGGGGGGGAAGGTTGGGGGGGGGG-3 ', 5'-GGGGGGGGGGATGGTTGGGGGGGGGG-3 ', 5'-GGGGGGGGGGACGGTTGGGGGGGGGG-3', 5'-GGGGGGGGGGAAGCTTGGGGGGGGGG-3 ', 5'-GGGGGGGGGGATGCTTGGGGGGGGGG-3', 5'-GGGGGGGGGGACGCTTGGGGGGGGGG-3 ', 5'-CCCCCCCCCCAAGGTTCCCCCCCCCC-3 ', 5'-CCCCCCCCCCATGGTTCCCCCCCCCC-3 ', 5'-CCCCCCCCCCACGGTTCCCCCCCCCC-3 ', 5'-CCCCCCCCCCAAGCTTCCCCCCCCCC-3 ', 5'-CCCCCCCCCCATGCTTCCCCCCCCCC-3 ', 5'-CCCCCCCCCCACGCTTCCCCCCCCCC-3 ' . 106 TABELA 4

5' R R α β Y Y TGACTGTG A A G C T T AGAGATGA TGACTGTG A A G C T c AGAGATGA TGACTGTG A A G c C T AGAGATGA TGACTGTG A A G c C c AGAGATGA TGACTGTG A G G c T T AGAGATGA TGACTGTG A G G c T c AGAGATGA TGACTGTG A G G c C T AGAGATGA TGACTGTG A G G c C c AGAGATGA TGACTGTG G A G c T T AGAGATGA TGACTGTG G A G c T c AGAGATGA TGACTGTG G A G c C T AGAGATGA TGACTGTG G A G c C c AGAGATGA TGACTGTG G G G c T T AGAGATGA TGACTGTG G G G c T c AGAGATGA TGACTGTG G G G c c T AGAGATGA TGACTGTG G G G c c c AGAGATGA TGACTGTG A A G G T T AGAGATGA TGACTGTG A A G G T c AGAGATGA TGACTGTG A A G G c T AGAGATGA TGACTGTG A A G G c c AGAGATGA TGACTGTG A G G G T T AGAGATGA TGACTGTG A G G G T c AGAGATGA TGACTGTG A G G G c T AGAGATGA TGACTGTG A G G G c c AGAGATGA TGACTGTG G A G G T T AGAGATGA 107 (continuação)

5' R R α β Y Y TGACTGTG G A G G T c AGAGATGA TGACTGTG G A G G C T AGAGATGA TGACTGTG G A G G C c AGAGATGA TGACTGTG G G G G T T AGAGATGA TGACTGTG G G G G T c AGAGATGA TGACTGTG G G G G C T AGAGATGA TGACTGTG G G G G C c AGAGATGA TGACTGTG A A A G T T AGAGATGA TGACTGTG A A A G T c AGAGATGA TGACTGTG A A A G C T AGAGATGA TGACTGTG A A A G C c AGAGATGA TGACTGTG A G A G T T AGAGATGA TGACTGTG A G A G T c AGAGATGA TGACTGTG A G A G c T AGAGATGA TGACTGTG A G A G c c AGAGATGA TGACTGTG G A A G T T AGAGATGA TGACTGTG G A A G T c AGAGATGA TGACTGTG G A A G c T AGAGATGA TGACTGTG G A A G c c AGAGATGA TGACTGTG G G A G T T AGAGATGA TGACTGTG G G A G T c AGAGATGA TGACTGTG G G A G c T AGAGATGA TGACTGTG G G A G c c AGAGATGA TGACTGTG A A I G T T AGAGATGA TGACTGTG A A I G T c AGAGATGA 108 (continuação)

5' R R α β Y Y TGACTGTG A A I G C T AGAGATGA TGACTGTG A A I G C c AGAGATGA TGACTGTG A G I G T T AGAGATGA TGACTGTG A G I G T c AGAGATGA TGACTGTG A G I G C T AGAGATGA TGACTGTG A G I G C c AGAGATGA TGACTGTG G A I G T T AGAGATGA TGACTGTG G A I G T c AGAGATGA TGACTGTG G A I G c T AGAGATGA TGACTGTG G A I G c c AGAGATGA TGACTGTG G G I G T T AGAGATGA TGACTGTG G G I G T c AGAGATGA TGACTGTG G G I G c T AGAGATGA TGACTGTG G G I G c c AGAGATGA TGACTGTG A A I C T T AGAGATGA TGACTGTG A A I C T c AGAGATGA TGACTGTG A A I C c T AGAGATGA TGACTGTG A A I C c c AGAGATGA TGACTGTG A G I C T T AGAGATGA TGACTGTG A G I C T c AGAGATGA TGACTGTG A G I C c T AGAGATGA TGACTGTG A G I C c c AGAGATGA TGACTGTG G A I C T T AGAGATGA TGACTGTG G A I C T c AGAGATGA TGACTGTG G A I C c T AGAGATGA 109 (continuação)

5' R R α β Y Y TGACTGTG G A I c C c AGAGATGA TGACTGTG G G I c T T AGAGATGA TGACTGTG G G I c T c AGAGATGA TGACTGTG G G I c C T AGAGATGA TGACTGTG G G I c C c AGAGATGA TGACTGTG A A T G T T AGAGATGA TGACTGTG A A T G T c AGAGATGA TGACTGTG A A T G C T AGAGATGA TGACTGTG A A T G C c AGAGATGA TGACTGTG A G T G T T AGAGATGA TGACTGTG A G T G T c AGAGATGA TGACTGTG A G T G C T AGAGATGA TGACTGTG A G T G C c AGAGATGA TGACTGTG G A T G T T AGAGATGA TGACTGTG G A T G T c AGAGATGA TGACTGTG G A T G C T AGAGATGA TGACTGTG G A T G c c AGAGATGA TGACTGTG G G T G T T AGAGATGA TGACTGTG G G T G T c AGAGATGA TGACTGTG G G T G c T AGAGATGA TGACTGTG G G T G c c AGAGATGA TGACTGTG A A T A T T AGAGATGA TGACTGTG A A T A T c AGAGATGA TGACTGTG A A T A c T AGAGATGA TGACTGTG A A T A c c AGAGATGA 110 (continuação)

5' R R α β Y Y TGACTGTG A G T A T T AGAGATGA TGACTGTG A G T A T c AGAGATGA TGACTGTG A G T A C T AGAGATGA TGACTGTG A G T A C c AGAGATGA TGACTGTG G A T A T T AGAGATGA TGACTGTG G A T A T c AGAGATGA TGACTGTG G A T A C T AGAGATGA TGACTGTG G A T A C c AGAGATGA TGACTGTG G G T A T T AGAGATGA TGACTGTG G G T A T c AGAGATGA TGACTGTG G G T A C T AGAGATGA TGACTGTG G G T A c c AGAGATGA TGACTGTG A A C G T T AGAGATGA TGACTGTG A A c C T T AGAGATGA TABELA 5

5' R Y α β Y Y 3' TGACTGTG A T G C T T AGAGATGA TGACTGTG A T G C T c AGAGATGA TGACTGTG A T G c c T AGAGATGA TGACTGTG A T G c c c AGAGATGA TGACTGTG A C G c T T AGAGATGA TGACTGTG A C G c T c AGAGATGA TGACTGTG A C G c c T AGAGATGA 111 (continuação)

5' R Y α β Y Y TGACTGTG A C G C C c AGAGATGA TGACTGTG G T G C T T AGAGATGA TGACTGTG G T G c T c AGAGATGA TGACTGTG G T G c C T AGAGATGA TGACTGTG G T G c C c AGAGATGA TGACTGTG G C G c T T AGAGATGA TGACTGTG G C G c T c AGAGATGA TGACTGTG G C G c C T AGAGATGA TGACTGTG G C G c C c AGAGATGA TGACTGTG A T G G T T AGAGATGA TGACTGTG A T G G T c AGAGATGA TGACTGTG A T G G C T AGAGATGA TGACTGTG A T G G C c AGAGATGA TGACTGTG A C G G T T AGAGATGA TGACTGTG A C G G T c AGAGATGA TGACTGTG A C G G C T AGAGATGA TGACTGTG A C G G C c AGAGATGA TGACTGTG G T G G T T AGAGATGA TGACTGTG G T G G T c AGAGATGA TGACTGTG G T G G c T AGAGATGA TGACTGTG G T G G c c AGAGATGA TGACTGTG G C G G T T AGAGATGA TGACTGTG G C G G T c AGAGATGA TGACTGTG G c G G c T AGAGATGA TGACTGTG G c G G c c AGAGATGA 112 (continuação)

5' R Y α β Y Y TGACTGTG A T A G T T AGAGATGA TGACTGTG A T A G T c AGAGATGA TGACTGTG A T A G C T AGAGATGA TGACTGTG A T A G C c AGAGATGA TGACTGTG A C A G T T AGAGATGA TGACTGTG A C A G T c AGAGATGA TGACTGTG A C A G C T AGAGATGA TGACTGTG A C A G C c AGAGATGA TGACTGTG G T A G T T AGAGATGA TGACTGTG G T A G T c AGAGATGA TGACTGTG G T A G C T AGAGATGA TGACTGTG G T A G C c AGAGATGA TGACTGTG G C A G T T AGAGATGA TGACTGTG G C A G T c AGAGATGA TGACTGTG G C A G c T AGAGATGA TGACTGTG G C A G c c AGAGATGA TGACTGTG A T I G T T AGAGATGA TGACTGTG A T I G T c AGAGATGA TGACTGTG A T I G c T AGAGATGA TGACTGTG A T I G c c AGAGATGA TGACTGTG A c I G T T AGAGATGA TGACTGTG A c I G T c AGAGATGA TGACTGTG A c I G c T AGAGATGA TGACTGTG A c I G c c AGAGATGA TGACTGTG G T I G T T AGAGATGA 113 (continuação)

5' R Y α β Y Y TGACTGTG G T I G T c AGAGATGA TGACTGTG G T I G C T AGAGATGA TGACTGTG G T I G C c AGAGATGA TGACTGTG G C I G T T AGAGATGA TGACTGTG G C I G T c AGAGATGA TGACTGTG G C I G c T AGAGATGA TGACTGTG G C I G c c AGAGATGA TGACTGTG A T I C T T AGAGATGA TGACTGTG A T I C T c AGAGATGA TGACTGTG A T I C c T AGAGATGA TGACTGTG A T I C c c AGAGATGA TGACTGTG A C I C T T AGAGATGA TGACTGTG A C I C T c AGAGATGA TGACTGTG A c I C c T AGAGATGA TGACTGTG A c I C c c AGAGATGA TGACTGTG G T I C T T AGAGATGA TGACTGTG G T I C T c AGAGATGA TGACTGTG G T I C c T AGAGATGA TGACTGTG G T I C c c AGAGATGA TGACTGTG G c I C T T AGAGATGA TGACTGTG G c I C T c AGAGATGA TGACTGTG G c I c c T AGAGATGA TGACTGTG G c I c c c AGAGATGA TGACTGTG A T T G T T AGAGATGA TGACTGTG A T T G T c AGAGATGA 114 (continuação)

5' R Y α β Y Y TGACTGTG A T T G C T AGAGATGA TGACTGTG A T T G C c AGAGATGA TGACTGTG A C T G T T AGAGATGA TGACTGTG A C T G T c AGAGATGA TGACTGTG A C T G C T AGAGATGA TGACTGTG A C T G C c AGAGATGA TGACTGTG G T T G T T AGAGATGA TGACTGTG G T T G T c AGAGATGA TGACTGTG G T T G C T AGAGATGA TGACTGTG G T T G C c AGAGATGA TGACTGTG G C T G T T AGAGATGA TGACTGTG G C T G T c AGAGATGA TGACTGTG G C T G C T AGAGATGA TGACTGTG G C T G C c AGAGATGA TGACTGTG A T T A T T AGAGATGA TGACTGTG A T T A T c AGAGATGA TGACTGTG A T T A c T AGAGATGA TGACTGTG A T T A c c AGAGATGA TGACTGTG A c T A T T AGAGATGA TGACTGTG A c T A T c AGAGATGA TGACTGTG A c T A c T AGAGATGA TGACTGTG A c T A c c AGAGATGA TGACTGTG G T T A T T AGAGATGA TGACTGTG G T T A T c AGAGATGA TGACTGTG G T T A c T AGAGATGA 115 (continuação)

5' R Y α β Y Y TGACTGTG G T T A C C AGAGATGA TGACTGTG G C T A T T AGAGATGA TGACTGTG G C T A T C AGAGATGA TGACTGTG G C T A C T AGAGATGA TGACTGTG G C T A C C AGAGATGA TGACTGTG A T C G T T AGAGATGA TGACTGTG A C c G T T AGAGATGA

Os exemplos anteriores são formas de realização especificas para efectuar a presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não se pretende que limitem, em nenhuma instância, o âmbito da presente invenção. Outras variantes das invenções serão facilmente perceptiveis para alguém com conhecimentos gerais na técnica e abrangidas pelas reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Bayhill Therapeutics, Inc.

Conselho de Administração da Leland Stanford Júnior University <120> Métodos e Composições de Ácidos Nucleicos Imunomoduladores Para Prevenção e Tratamento de Doenças 116 <13Ο> AHB/FP6303689 atggtt 6 < 14 0 > ΕΡ 03789883.0 < 141 > 2003-11-21 < 15 0 > PCT/US2003/037157 < 151 > 2003-11-21 < 15 0 > US 60/428,643 < 151 > 2002-11-21 < 16 0 > 296 < 17 0 > Patentln versão 3.3 < 210 > 1 < 211 > 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 1 gtggtt < 210 > 2 <211 > 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 2 117

< 210 > 3 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 3 gcggtt 6

< 210 > 4 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 4 acggtt 6

< 210 > 5 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 5 gtggct 6

<210> 6 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 118 < 4 Ο Ο > 6 atggct 6

< 210 > 7 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 7 gcggct 6

< 210 > 8 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 8 acggct 6

< 210 > 9 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 9 gtggtc 6

<210> 10 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 119 < 4 Ο Ο > 10 atggtc 6

< 210 > 11 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 11 gcggtc 6

< 210 > 12 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 12 acggtc 6

< 210 > 13 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 13 gtgctt 6

<210> 14 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 120 < 4 Ο Ο > 14 atgctt 6

< 210 > 15 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 15 gcgctt 6

< 210 > 16 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 16 acgctt 6

< 210 > 17 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 17 gtgcct 6

<210> 18 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 121 < 4 Ο Ο > 18 atgcct 6

< 210 > 19 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 19 gcgcct 6

<210> 20 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 20 acgcct 6

< 210 > 21 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 21 gtgctc 6

<210> 22 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 122 <4 Ο Ο > 22 atgctc 6

<210> 23 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 23 gcgctc 6

<210> 24 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 24 acgctc 6

<210> 25 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 25 ggggtt 6

<210> 26 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 123 < 4 Ο Ο > 26 agggtt 6

<210> 27 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 27 gaggtt 6

<210> 28 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 28 aaggtt 6

<210> 29 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 29 ggggct 6

<210> 30 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 124 < 4 Ο Ο > 30 agggct 6

< 210 > 31 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 31 gaggct 6

<210> 32 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 32 aaggct 6

<210> 33 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 33 ggggtc 6

<210> 34 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 125 < 4 Ο Ο > 34 6 agggtc 6

<210> 35 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 35 gaggtc 6

<210> 36 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 36 aaggtc 6

<210> 37 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 37 gggctt 6

<210> 38 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 126 < 4 Ο Ο > 38 aggctt 6

<210> 39 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 39 gagctt 6

<210> 40 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 40 aagctt 6

< 210 > 41 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 41 gggcct 6

<210> 42 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 127 <4 Ο Ο > 42 aggcct 6

<210> 43 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 43 gagcct 6

<210> 44 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 44 aagcct 6

<210> 45 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 45 gggctc 6

<210> 46 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 128 < 4 Ο Ο > 46 aggctc 6

<210> 47 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 47 gagctc 6

<210> 48 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 48 aagctc 6

<210> 49 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 49 aacgtt 6

<210> 50 <211> 6 <212> ADN <213> oligonucleótido 129 < 4 Ο Ο > 50 aaggtt 6

< 210 > 51 <211> 14 <212> PRT <213> antigénio peptídico < 4 0 0 > 51

Gly Asp Leu Leu Ala Glu Ile Glu Thr Asp Leu Ala Thr Ile 15 10

<210> 52 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 52 tgactgtgaa ggttagagat ga 22

<210> 53 <211> 24 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (13)..(14) <223> nn é GpG ou não GpG 130 <4 Ο Ο > 53 tgactgtgtg rrnnyyagag atga 24

<210> 54 <211> 24 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (13)..(14)

<223> nn é GpG ou não GpG <400> 54 tgactgtgtg rynnyyagag atga 24

<210> 55 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (1)..(10) <223> n é gualguer nucleótido <220> <221> característica_misc <222> (13)..(14)

<223> nn é GpG ou não GpG 131 <220> <221> característica_misc <222> (17)..(26) <223> η é qualquer nucleótido <400> 55 ηηηηηηηηηη rynnyynnnn ηηηηηη 26

<210> 56 <211> 26 <212> ADN <213> oliqonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (1)..(10) <223> η é qualquer nucleótido <220> <221> característica_misc <222> (13)..(14)

<223> ηη é GpG ou não GpG <220> <221> característica_misc <222> (17)..(26) <223> n é qualquer nucleótido <400> 56 ηηηηηηηηηη rrnnyynnnn nnnnnn 26 132 <210> 57

<211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 57 gggggggggg aaggttgggg gggggg 26

<210> 58 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 58 gggggggggg atggttgggg gggggg 26

<210> 59 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 59 gggggggggg acggttgggg gggggg 26

<210> 60 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 60 gggggggggg aagcttgggg gggggg 26 133 < 210 > 61

<211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 61 gggggggggg atgcttgggg gggggg 26

<210> 62 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 62 gggggggggg acgcttgggg gggggg 26

<210> 63 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 63 cccccccccc aaggttcccc cccccc 26

<210> 64 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 64 cccccccccc atggttcccc cccccc 26 134 26 <210> 65 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 65 cccccccccc acggttcccc cccccc <210> 66 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 66 cccccccccc aagcttcccc cccccc 26 <210> 67 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 67 cccccccccc atgcttcccc cccccc 26 <210> 68 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 68 cccccccccc acgcttcccc cccccc 26 135 22

<210> 69 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 69 tgactgtgaa gcttagagat ga

<210> 70 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 70 22 tgactgtgaa gctcagagat ga

<210> 71 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 71 22 tgactgtgaa gcctagagat ga

<210> 72 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 72 22 tgactgtgaa gcccagagat ga 136 22

<210> 73 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 73 tgactgtgag gcttagagat ga

<210> 74 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 74 22 tgactgtgag gctcagagat ga

<210> 75 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 75 22 tgactgtgag gcctagagat ga

<210> 76 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 76 22 tgactgtgag gcccagagat ga 137 22

<210> 77 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 77 tgactgtgga gcttagagat ga

<210> 78 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 78 22 tgactgtgga gctcagagat ga

<210> 79 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 79 22 tgactgtgga gcctagagat ga

<210> 80 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 80 22 tgactgtgga gcccagagat ga 138 22

< 210 > 81 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 81 tgactgtggg gcttagagat ga

<210> 82 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 82 22 tgactgtggg gctcagagat ga

<210> 83 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 83 22 tgactgtggg gcctagagat ga

<210> 84 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 84 22 tgactgtggg gcccagagat ga 139 22

<210> 85 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 85 tgactgtgaa ggttagagat ga

<210> 86 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 86 22 tgactgtgaa ggtcagagat ga

<210> 87 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 87 22 tgactgtgaa ggctagagat ga

<210> 88 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 88 22 tgactgtgaa ggccagagat ga 140 22

<210> 89 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 89 tgactgtgag ggttagagat ga

<210> 90 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 90 22 tgactgtgag ggtcagagat ga

<210> 91 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 91 22 tgactgtgag ggctagagat ga

<210> 92 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 92 22 tgactgtgag ggccagagat ga 141 22

<210> 93 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 93 tgactgtgga ggttagagat ga

<210> 94 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 94 22 tgactgtgga ggtcagagat ga

<210> 95 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 95 22 tgactgtgga ggctagagat ga

<210> 96 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 96 22 tgactgtgga ggccagagat ga 142 22

<210> 97 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 97 tgactgtggg ggttagagat ga

<210> 98 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 98 22 tgactgtggg ggtcagagat ga

<210> 99 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 99 22 tgactgtggg ggctagagat ga

<210> 100 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 100 22 tgactgtggg ggccagagat ga 143 22

< 210 > 101 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 101 tgactgtgaa agttagagat ga

<210> 102 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 102 22 tgactgtgaa agtcagagat ga

<210> 103 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 103 22 tgactgtgaa agctagagat ga

<210> 104 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 104 22 tgactgtgaa agccagagat ga 144 22

< 210 > 105 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 105 tgactgtgag agttagagat ga

<210> 106 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 106 22 tgactgtgag agtcagagat ga

<210> 107 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 107 22 tgactgtgag agctagagat ga

<210> 108 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 108 22 tgactgtgag agccagagat ga 145 22

< 210 > 109 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 109 tgactgtgga agttagagat ga

<210> 110 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 110 22 tgactgtgga agtcagagat ga

<210> 111 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 111 22 tgactgtgga agctagagat ga

<210> 112 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 112 22 tgactgtgga agccagagat ga 146 22

< 210 > 113 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 113 tgactgtggg agttagagat ga

<210> 114 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 114 22 tgactgtggg agtcagagat ga

<210> 115 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 115 22 tgactgtggg agctagagat ga

<210> 116 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 116 22 tgactgtggg agccagagat ga 147 < 210 > 117

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 117 tgactgtgaa ngttagagat ga 22 <210> 118 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 118 tgactgtgaa ngtcagagat ga 22 <210> 119 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 148 <220> <221> característica_misc <222> (11) . dl) <223> n é Inosina <400> 119 tgactgtgaa ngctagagat ga <210> 120 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 120 tgactgtgaa ngccagagat ga 22

<210> 121 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina 149 < 4 Ο Ο > 121 tgactgtgag ngttagagat ga 22 <210> 122 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) · · dl) <223> n é Inosina <400> 122 tgactgtgag ngtcagagat ga <210> 123 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 123 tgactgtgag ngctagagat ga 22 150 < 210 > 124

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 124 tgactgtgag ngccagagat ga 22 <210> 125 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 125 tgactgtgga ngttagagat ga 22 <210> 126 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 151 <220> <221> característica_misc <222> (11) . dl) <223> n é Inosina <400> 126 tgactgtgga ngtcagagat ga <210> 127 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 127 tgactgtgga ngctagagat ga 22

<210> 128 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina 152 < 4 Ο Ο > 128 tgactgtgga ngccagagat ga 22 <210> 129 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) · · dl) <223> n é Inosina <400> 129 tgactgtggg ngttagagat ga <210> 130 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 130 tgactgtggg ngtcagagat ga 22 153

< 210 > 131 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11).. (11) <223> η é Inosina < 4 0 0 > 131 tgactgtggg ngctagagat ga 22

<210> 132 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina <400> 132 tgactgtggg ngccagagat ga 22

<210> 133 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 154 <220> <221> característica_misc <222> (11) . dl) <223> n é Inosina <400> 133 tgactgtgaa ncttagagat ga <210> 134 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 134 tgactgtgaa nctcagagat ga 22

<210> 135 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina 155 <4 Ο Ο > 135 tgactgtgaa ncctagagat ga 22

<210> 136 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina <400> 136 tgactgtgaa ncccagagat ga 22

<210> 137 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11).. (11) <223> n é Inosina <400> 137 tgactgtgag ncttagagat ga 22

<210> 138 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 156 <220> <221> característica_misc <222> (11) . dl) <223> n é Inosina <400> 138 tgactgtgag nctcagagat ga <210> 139 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) .. dl) <223> n é Inosina <400> 139 tgactgtgag ncctagagat ga 22

<210> 140 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina 157 < 4 Ο Ο > 140 tgactgtgag ncccagagat ga 22

<210> 141 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) . . dl) <223> n é Inosina <400> 141 tgactgtgga ncttagagat ga 22 <210> 142 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) .. dl) <223> n é Inosina <400> 142 tgactgtgga nctcagagat ga 22 158 < 210 > 143

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 143 tgactgtgga ncctagagat ga 22 <210> 144 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 144 tgactgtgga ncccagagat ga 22 <210> 145 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 159 22 <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 145 tgactgtggg ncttagagat ga <210> 146 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> caracterí stica_i ui SC <222> (11).. dl) <223> n é Inosina <400> 146 tgactgtggg nctcagagat ga <210> 147 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> caracterí stica_: mi sc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 147 tgactgtggg ncctagagat ga 22 22 160 < 210 > 148

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> η é Inosina < 4 0 0 > 148 tgactgtggg ncccagagat ga 22

<210> 149 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 149 tgactgtgaa tgttagagat ga 22

<210> 150 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 150 tgactgtgaa tgtcagagat ga 22 161 22

< 210 > 151 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 151 tgactgtgaa tgctagagat ga

<210> 152 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 152 22 tgactgtgaa tgccagagat ga

<210> 153 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 153 22 tgactgtgag tgttagagat ga

<210> 154 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 154 22 tgactgtgag tgtcagagat ga 162 22

< 210 > 155 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 155 tgactgtgag tgctagagat ga

<210> 156 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 156 22 tgactgtgag tgccagagat ga

<210> 157 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 157 22 tgactgtgga tgttagagat ga

<210> 158 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 158 22 tgactgtgga tgtcagagat ga 163 22

< 210 > 159 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 159 tgactgtgga tgctagagat ga

<210> 160 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 160 22 tgactgtgga tgccagagat ga

<210> 161 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 161 22 tgactgtggg tgttagagat ga

<210> 162 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 162 22 tgactgtggg tgtcagagat ga 164 22

< 210 > 163 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 163 tgactgtggg tgctagagat ga

<210> 164 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 164 22 tgactgtggg tgccagagat ga

<210> 165 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 165 22 tgactgtgaa tattagagat ga

<210> 166 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 166 22 tgactgtgaa tatcagagat ga 165 22

< 210 > 167 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 167 tgactgtgaa tactagagat ga

<210> 168 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 168 22 tgactgtgaa taccagagat ga

<210> 169 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 169 22 tgactgtgag tattagagat ga

<210> 170 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 170 22 tgactgtgag tatcagagat ga 166 22

< 210 > 171 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 171 tgactgtgag tactagagat ga

<210> 172 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 172 22 tgactgtgag taccagagat ga

<210> 173 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 173 22 tgactgtgga tattagagat ga

<210> 174 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 174 22 tgactgtgga tatcagagat ga 167 22

< 210 > 175 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 175 tgactgtgga tactagagat ga

<210> 176 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 176 22 tgactgtgga taccagagat ga

<210> 177 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 177 22 tgactgtggg tattagagat ga

<210> 178 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 178 22 tgactgtggg tatcagagat ga 168 22

< 210 > 179 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 179 tgactgtggg tactagagat ga

<210> 180 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 180 22 tgactgtggg taccagagat ga

<210> 181 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 181 22 tgactgtgaa cgttagagat ga

<210> 182 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 182 22 tgactgtgaa ccttagagat ga 169 22

< 210 > 183 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 183 tgactgtgat gcttagagat ga

<210> 184 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 184 22 tgactgtgat gctcagagat ga

<210> 185 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 185 22 tgactgtgat gcctagagat ga

<210> 186 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 186 22 tgactgtgat gcccagagat ga 170 22

< 210 > 187 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 187 tgactgtgac gcttagagat ga

<210> 188 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 188 22 tgactgtgac gctcagagat ga

<210> 189 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 189 22 tgactgtgac gcctagagat ga

<210> 190 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 190 22 tgactgtgac gcccagagat ga 171 22

< 210 > 191 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 191 tgactgtggt gcttagagat ga

<210> 192 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 192 22 tgactgtggt gctcagagat ga

<210> 193 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 193 22 tgactgtggt gcctagagat ga

<210> 194 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 194 22 tgactgtggt gcccagagat ga 172 22

< 210 > 195 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 195 tgactgtggc gcttagagat ga

<210> 196 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 196 22 tgactgtggc gctcagagat ga

<210> 197 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 197 22 tgactgtggc gcctagagat ga

<210> 198 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 198 22 tgactgtggc gcccagagat ga 173 22

< 210 > 199 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 199 tgactgtgat ggttagagat ga

<210> 200 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 200 22 tgactgtgat ggtcagagat ga

<210> 201 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 201 22 tgactgtgat ggctagagat ga

<210> 202 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 202 22 tgactgtgat ggccagagat ga 174 22

<210> 203 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 203 tgactgtgac ggttagagat ga

<210> 204 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 204 22 tgactgtgac ggtcagagat ga

<210> 205 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 205 22 tgactgtgac ggctagagat ga

<210> 206 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 206 22 tgactgtgac ggccagagat ga 175 22

<210> 207 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 207 tgactgtggt ggttagagat ga

<210> 208 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 208 22 tgactgtggt ggtcagagat ga

<210> 209 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 209 22 tgactgtggt ggctagagat ga

<210> 210 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 210 22 tgactgtggt ggccagagat ga 176 22

< 210 > 211 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 211 tgactgtggc ggttagagat ga

<210> 212 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 212 22 tgactgtggc ggtcagagat ga

<210> 213 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 213 22 tgactgtggc ggctagagat ga

<210> 214 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 214 22 tgactgtggc ggccagagat ga 177 22

< 210 > 215 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 215 tgactgtgat agttagagat ga

<210> 216 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 216 22 tgactgtgat agtcagagat ga

<210> 217 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 217 22 tgactgtgat agctagagat ga

<210> 218 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 218 22 tgactgtgat agccagagat ga 178 22

< 210 > 219 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido < 4 0 0 > 219 tgactgtgac agttagagat ga

<210> 220 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 220 22 tgactgtgac agtcagagat ga

<210> 221 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 221 22 tgactgtgac agctagagat ga

<210> 222 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 222 22 tgactgtgac agccagagat ga 179 22

<210> 223 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 223 tgactgtggt agttagagat ga

<210> 224 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 224 22 tgactgtggt agtcagagat ga

<210> 225 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 225 22 tgactgtggt agctagagat ga

<210> 226 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 226 22 tgactgtggt agccagagat ga 180 22

<210> 227 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 227 tgactgtggc agttagagat ga

<210> 228 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 228 22 tgactgtggc agtcagagat ga

<210> 229 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 229 22 tgactgtggc agctagagat ga

<210> 230 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 230 22 tgactgtggc agccagagat ga 181

<210> 231 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> <220> Inosina <221> característica_misc <222> (11).. dl) <223> n é Inosina <400> 231 tgactgtgat ngttagagat ga 22 <210> 232 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina <400> 232 tgactgtgat ngtcagagat ga 22 182 <210> 233 < 211 > 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)(11) <223> η é Inosina <400> 233 tgactgtgat ngctagagat ga <210> 234 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> caracteristica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina <400> 234 tgactgtgat ngccagagat ga <210> 235 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 22 22 183 <220> <221> característica_misc <222> (11) .. dl) <223> n é Inosina <400> 235 tgactgtgac ngttagagat ga <210> 236 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 236 tgactgtgac ngtcagagat ga 22

<210> 237 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina 184 < 4 Ο Ο > 237 22 tgactgtgac ngctagagat ga <210> 238 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11).. dl) <223> n é Inosina <400> 238 tgactgtgac ngccagagat ga <210> 239 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) . . dl) <223> n é Inosina <400> 239 tgactgtggt ngttagagat ga <210> 240

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 185 <220> <221> característica_misc <222> (11) . dl) <223> n é Inosina <400> 240 tgactgtggt ngtcagagat ga <210> 241 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina <400> 241 tgactgtggt ngctagagat ga 22

<210> 242 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)..(11) <223> n é Inosina 186 < 4 Ο Ο > 242 22 tgactgtggt ngccagagat ga <210> 243 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) . · dl) <223> n é Inosina <400> 243 tgactgtggc ngttagagat ga <210> 244 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> caracterí stica_i ui SC <222> (11) . . dl) <223> n é Inosina <400> 244 tgactgtggc ngtcagagat ga <210> 245

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 187 <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> η é Inosina < 4 0 0 > 245 tgactgtggc ngctagagat ga < 210 > 246 <211 > 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina < 4 0 0 > 246 tgactgtggc ngccagagat ga < 210 > 247 <211 > 22 <212> ADN < 213 > oligonucleótido <220> <221> caracterí stica_: mi sc <222> (11).. dl) <223> n é Inosina 188 < 4 Ο Ο > 247 22 tgactgtgat ncttagagat ga <210> 248 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11).. dl) <223> n é Inosina <400> 248 tgactgtgat nctcagagat ga <210> 249 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) . . dl) <223> n é Inosina <400> 249 tgactgtgat ncctagagat ga <210> 250

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 189 <220> <221> característica_misc <222> (11)(11) <223> η é Inosina < 4 0 0 > 250 tgactgtgat ncccagagat ga < 210 > 251 <211 > 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11)(11) <223> n é Inosina < 4 0 0 > 251 tgactgtgac ncttagagat ga < 210 > 252 <211 > 22 <212> ADN < 213 > oligonucleótido <220> <221> caracterí stica_: mi sc <222> (11)(11) <223> n é Inosina 190 <4 Ο Ο > 252 22 tgactgtgac nctcagagat ga <210> 253 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> caracteristica_misc <222> (11) . . dl) <223> n é Inosina <400> 253 tgactgtgac ncctagagat ga <210> 254 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> caracterí stica_i Hl SC <222> (11) . . dl) <223> n é Inosina <400> 254 tgactgtgac ncccagagat ga <210> 255

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 191 < 2 2 Ο > <221> característica_misc <222> (11) (11) <223> η é Inosina < 4 0 0 > 255 tgactgtggt ncttagagat ga < 210 > 256 <211 > 22 <212> ADN < 213 > oligonucleótido < 2 2 0 > <221> característica_misc <222> (11) (11) <223> n é Inosina < 4 0 0 > 256 tgactgtggt nctcagagat ga < 210 > 257 <211 > 22 <212> ADN < 213 > oligonucleótido < 2 2 0 > <221> caracteristica_i mi sc <222> (11) (11) <223> n é Inosina 192 < 4 Ο Ο > 257 22 tgactgtggt ncctagagat ga <210> 258 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) . . dl) <223> n é Inosina <400> 258 tgactgtggt ncccagagat ga <210> 259 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) . . dl) <223> n é Inosina <400> 259 tgactgtggc ncttagagat ga <210> 260

<211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 193 <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> η é Inosina < 4 0 0 > 260 tgactgtggc nctcagagat ga < 210 > 261 <211 > 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (11) dl) <223> n é Inosina < 4 0 0 > 261 tgactgtggc ncctagagat ga < 210 > 262 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <220> <221> caracterí stica_: mi sc <222> (11) dl) <223> n é Inosina 194 < 4 Ο Ο > 262 22 tgactgtggc ncccagagat ga

<210> 263 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 263 22 tgactgtgat tgttagagat ga

<210> 264 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 264 22 tgactgtgat tgtcagagat ga

<210> 265 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 265 22 tgactgtgat tgctagagat ga

<210> 266 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 195 < 4 Ο Ο > 266 22 tgactgtgat tgccagagat ga

<210> 267 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 267 22 tgactgtgac tgttagagat ga

<210> 268 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 268 22 tgactgtgac tgtcagagat ga

<210> 269 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 269 22 tgactgtgac tgctagagat ga

<210> 270 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 196 < 4 Ο Ο > 270 22 tgactgtgac tgccagagat ga

<210> 271 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 271 22 tgactgtggt tgttagagat ga

<210> 272 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 272 22 tgactgtggt tgtcagagat ga

<210> 273 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 273 22 tgactgtggt tgctagagat ga

<210> 274 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 197 < 4 Ο Ο > 274 22 tgactgtggt tgccagagat ga

<210> 275 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 275 22 tgactgtggc tgttagagat ga

<210> 276 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 276 22 tgactgtggc tgtcagagat ga

<210> 277 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 277 22 tgactgtggc tgctagagat ga

<210> 278 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 198 < 4 Ο Ο > 278 22 tgactgtggc tgccagagat ga

<210> 279 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 279 22 tgactgtgat tattagagat ga

<210> 280 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 280 22 tgactgtgat tatcagagat ga

<210> 281 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 281 22 tgactgtgat tactagagat ga

<210> 282 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 199 < 4 Ο Ο > 282 22 tgactgtgat taccagagat ga

<210> 283 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 283 22 tgactgtgac tattagagat ga

<210> 284 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 284 22 tgactgtgac tatcagagat ga

<210> 285 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 285 22 tgactgtgac tactagagat ga

<210> 286 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 200 < 4 Ο Ο > 286 22 tgactgtgac taccagagat ga

<210> 287 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 287 22 tgactgtggt tattagagat ga

<210> 288 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 288 22 tgactgtggt tatcagagat ga

<210> 289 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 289 22 tgactgtggt tactagagat ga

<210> 290 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 201 < 4 Ο Ο > 290 22 tgactgtggt taccagagat ga

<210> 291 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 291 22 tgactgtggc tattagagat ga

<210> 292 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 292 22 tgactgtggc tatcagagat ga

<210> 293 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 293 22 tgactgtggc tactagagat ga

<210> 294 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido 202 < 4 Ο Ο > 294 tgactgtggc taccagagat ga <210> 295 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 295 tgactgtgat cgttagagat ga <210> 296 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 296 tgactgtgac cgttagagat ga 22 22 22

Lisboa, 4 de Novembro de 2010 203

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de um vector plasmídico, cujo método compreende a modificação de um vector que contém um motivo CpG de fórmula 5'-purina-pirimidina-C-G-pirimidina-pirimidina-3', de modo a efectuar uma substituição de citosina por não citosina dentro do dinucleótido CpG, em que o vector compreende, adicionalmente, um polinucleótido codificando uma proteína de mielina ou uma proteína de insulina.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a substituição de citosina por não citosina é de citosina por guanina.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que é efectuada uma pluralidade de substituições de citosina por não citosina.
4. 4. Método da reivindicação 1, em que o vector que é modificado é o vector pVAXl™.
5. 5. Método da reivindicação 4, em que o vector pVAXl™ é modificado de modo a compreender as seguintes substituições de citosina por não citosina: C por G nos nucleótidos 784, 1161, 1218 e 1966; C por A nos nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 e 1997; e C por T nos nucleótidos 1963 e 1987 e C por G nos nucleótidos 1831, 1876, 1942 e 1999. 1
6. 6. Método de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o vector plasmidico é para utilização no tratamento de diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) e em que o referido polinucleótido codifica uma proteína de insulina.
7. 7. Método da reivindicação 6, em que a proteína de insulina é seleccionada de insulina, proinsulina ou pré-proinsulina.
8. 8. Método de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o vector plasmidico é para utilização no tratamento de esclerose múltipla e em que o referido polinucleótido codifica uma proteína de mielina.
9. 9/23

   mlL-10

   -«-pVAX1 ··· pBHÍ1 -A—CpG -X··· GpG -Meios mlFN-gama

   ♦ - -pVAXl pBHT1 -A— -CpG - --X-- GpG -*— - Meios FIGURA 9 10/23 FIGURA 10A

   FIGURA 10B

   9. Método da reivindicação 8, em que a proteína de mielina é proteína básica de mielina.
10. 10. Vector pVAXl™ modificado, compreendendo os seguintes nucleótidos na estrutura do vector: G nos nucleótidos 784, 1161, 1218 e 1966; A nos nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 e 1997; e T nos nucleótidos 1963 e 1987 e G nos nucleótidos 1831, 1876, 1942 e 1999.
11. 11/23

    FIGURA 10C 12/23 Grau Médio de Doença

    Dia após Imunização FIGURA. 11 pg/ml 13/23 IFN-gama 5000

    IL-4 B pg/ml í'-·’ · 1 118¾ 1 /:,¾ 1 λ r..,\r. Não tratado IMS CocktaB+tU Cocktail »114 + MS

    FIGURA 12 14/23 aasãsaaaaa sssgsssas mi nmm hmri* mUú immiii mm%

    A124 H3· VTl£'SteP AL27 PLΓ 235-151 A141 r-LP 335-52 ...... A15 ΚΞΡΒ9Ί01 91Ala 1^¾¾¾ « n»P 239-L51 A302 Pliã? 210-223 A32d HD3 35-S& A3X9 Eilaggria iud A326 PLP 135-151 A343- Cirace 356-3B-& DJT1 LtMOQ 25-67 Μ72 hMSP 6-14 A3T4 hMBP 13-21 AU06 rat KCO 61-78 Ai 15 rat KS-C 72-34 ABO N3P 24-37 A£03· CJPafic 256-273 AS06 CMfaeo 2 74-2B5 AÊ07 TLÍ 33 5- 251 BCOTIM AS2 K3P S7-55 AE36 31 Γ1Ρ 135-151 GIOTUr As54 KM 33-55 7 AS57 abcrva 16-3S AS70 abCrys 122-140 A76 ηΤΦΓ 71-B9 A9I8 rcOSP 151-287 AS2 hKB? 311-123· AB2Q 10’.« 1-9 A928 15-29 576 A83 at«P 221-233· AB35 SD-G4 £77 AB3B 70-84 AB44 120-124 276 A9& hl£BP 1C1-253 AB59 ffoga 1-22 A06O K&ga p472 AB-7 ÍSP as-55 AB& Culn^a Oig PSP protaio A910 02? cyc 0112-25 A527 CS? cvc Ala-12 A919 CCV ave Ala-S A53 tOP 1-11 A54 fteliCô KBP 2-22 FIGURA 13 15/23 FIGURA 14A

    FIGURA 14B grau médio de doença

    11. Vector da reivindicação 10 que compreende, adicionalmente, um polinucleótido codificando uma proteína de mielina ou uma proteína de insulina.
12. 12. Vector da reivindicação 11, em que a proteína de mielina é proteína básica de mielina (MBP). 2
13. 13. Vector da reivindicação 11, em que a proteína de insulina é insulina, proinsulina ou pré-proinsulina.
14. 14. Composição farmacêutica, compreendendo o vector de qualquer uma das reivindicações 10 a 13 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. 15. Utilização de uma composição, compreendendo: a) um vector plasmídico, compreendendo um ácido nucleico imunomodulador, compreendendo uma região hexamérica de fórmula 5'-purina-pirimidina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3', na qual X e Y são quaisquer nucleótidos de ocorrência natural ou sintéticos, excepto que X e Y não podem ser citosina-guanina, e uma região polinucleotidica codificando uma proteína de mielina ou uma proteína de insulina; e b) um veículo farmaceuticamente aceitável; na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença auto-imune, seleccionada de esclerose múltipla e diabetes mellitus dependente de insulina.

    16. Composição, compreendendo: a) um vector plasmídico, compreendendo um ácido nucleico imunomodulador, compreendendo uma região hexamérica de fórmula 5'-purina-pirimidina-[X]-[Y]-pirimidina-pirimidina-3', na qual X e Y são quaisquer nucleótidos de ocorrência natural ou sintéticos, excepto que X e Y não podem ser citosina-guanina, e uma região polinucleotidica codificando uma proteína de mielina ou uma proteína de insulina; e 3 b) um veículo farmaceuticamente aceitável para utilização num método de tratamento de uma doença auto-imune, seleccionada de esclerose múltipla e diabetes mellitus dependente de insulina.

    17. Utilização da reivindicação 15 ou da composição como reivindicada na reivindicação 16, em que o vector plasmidico é um vector pVAXl™ modificado.

    18. Utilização ou composição como reivindicadas na reivindicação 17, em que o vector pVAXl™ modificado compreende os seguintes nucleótidos na estrutura do vector: G nos nucleótidos 784, 1161, 1218 e 1966; A nos nucleótidos 1264, 1337, 1829, 1874, 1940 e 1997; e T nos nucleótidos 1963 e 1987 e G nos nucleótidos 1831, 1876, 1942 e 1999.

    19. Utilização da reivindicação 15 ou da composição como reivindicada na reivindicação 16, em que a doença auto-imune é diabetes mellitus dependente de insulina (iddm) e a autoproteína é uma proteína de insulina.

    20. Utilização ou composição como reivindicadas na reivindicação 19, em que a proteína de insulina é seleccionada de insulina, proinsulina e pré-proinsulina.

    21. Utilização da reivindicação 15 ou da composição como reivindicada na reivindicação 16, em que a doença auto-imune é esclerose múltipla e a autoproteína é uma proteína de mielina. 4

    22. Utilização ou composição como reivindicadas na reivindicação 21, em que a proteína de mielina é proteína básica de mielina. 23 . Utilização da reivindicação 15 ou da composição reivindicação 16, em que X e Y são ambos quanina. da Lisboa, 4 de Novembro de 2010 5 Β ο Η Ό H Íυ 1/23

    250000 η 200000 -1

    0 (Λ £0 OT α> (0 Μ OT Ή 0) £0 2 2 0. _ι <0 § 1 Ê + + + + W <0 C0 (0 W 0_ 0. (0 -1 + wα. C 1 2 3 4 5 6 — - -—* Oligo GpG inibitório + + Oligo GpG estimulador + + + Oligo de controlo +· + FIGURA 1 2/23 A B 25

    oligo (ug/m)) Classe II de MHC (% de positivos)

    C D oligo (pg/ml) 0 0 0 0 0 0 0 1 5 10 25 5 8· 1 o o 5 0 5 1 S 5 510 5 25 0 5 5 0 5 0 5 0 5 0 0 0 CD40 (% de positivos) 30 40 50 60 70

    τ

    80 oligo (|ig/ml) CD80 (% de positivos)

    50 1 IO E F oligo (ng/ml) oligo (ng/ml)

    CD86 (% de positivos) 30 40 50 60 -l-1-1-Γ 70 ΟΟ 0 0 5 0 0 5 1 0 5 5 0 5 10 0 5 25 0 0 5 1 5 0 5 5 0 10 5 0 25 5 0 5 0 0

    CDld (% de positivos)

    FIGURA 2 3/23 A B oligo (pg/mO oligo (Mg/ml)

    IL12p40 (pg/ml) 0 0 0 0 5 0 0 5 1 0 5 5 0 510 0 525 0 0 5 1 5 0 5 5 0 10 5 0 25 5 0 5 0 0

    3000 —I >';···Ώ·ίνΐ^ν;ι:ί i ·νΧ-~·.·"Γ·<Ι T làríiiSSSíS ZL ,τά#*·» ν^Λ.!·/·: 1 —Γ* - FIGURA 3 4/23 grau médio de doença

    τ—r—i—i—i—i—i—i—i—i—r—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—r—i—i—i—i—i—i 101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839 dia após imunização FIGURA 4 5/23 Proliferação celular Thl (cpm médio) 0 3000 6000 ISS + IMS + PLP139-151 IMS + PLP139-151 ISS + PLP139-151 meio + PLP139-151 meio

    FIGURA 5 6/23

    FIGURA 6 7/23 FIGURA 7A Cê&Wm fifrf CpG GpG FIGURA 7B es

    200 100 50 Concentração de ADN (microgramas/mL) 8/23 Contagens
16. 16/23 FIGURA 15A

    Período de Tratamento Ranana FIGURA 15B % de Diabéticos na Semana 29 % Diabetic

    Controlo IMS Voctor n~>1 irTr^1(=rj-i<4ira P->1 irTr^1(=rj-i<4ira cfeHN+ TLA cfeí£N + Hd + BE N = l» N = 10 N = ll N = 11 N = 11 /> = 1.0 /> = 0.635 /> = 0.1486 p = 0.0075 17/23 —Ccntrolo Progressão de Diabetes —H-Vector Percentagem de Sobrevivência (Abaixo de 250 mg/cLL)

    —ώ-ms Vector + IMS —3K- Terapia Polinucleotídica de AEN ♦ Terapia Polinucleotídica de ACN + IMS —|— Terapia Polinucleotídica de AEN + IL4 - Terapia Polinucleotídica de AEN + IL4 + IMS (i.m.) — Terapia Polinucleotídica de ACN + IL4 + IMS (i.p.) Semana Após Tratamento FIGURA 16 18/23 FIGURA 17A

    FIGURA 17B Incidência de Doença 27 Dias Após Reforço

    PBS Vector + IL4 Vector + IL4 + Terapia de Terapia de IMS ADN + IL4 ADN + IL4 + IMS 19/23 cpm médio

    PBS + IL4 Terapia de ADN + IL4 + IMS Vector + Vector + Terapia IL4 IL4+IMS de FIGURA. 18 A Produção de IL-6 20/23 B Produção de IFN-gama pg/ml Ρβ'"»'

    c D Produção de IL-4

    PBS Vectof ♦ IL4 VôCter ♦ IL4 Terapia + IMS de ADN + IL4 Terapia de ADN + IL4 + IMS Produção de TOF-alfa

    + IL4 IL4 + IMS FIGURA 19 21/23 percentagem pontuação clínica

    PBS IMS Terapia de ADN + IMS FIGURA 20A FIGURA 20B 100%·, 80%· 60%-40% 20% 0%· 22/23 cpm médio

    ox<xrq.uoo FIGURA 21 ELISA, de IL-6 800-, 7D0-«00-500 400 300 200-100-0- C 450-j 400-350· 300-g 250- 0)200· (1 1S0- 100 50 0« nenhum 23/23 B ELISA de IFN-gama

    nenhum Qp(3 IMS Controlo CpG ♦ (MS CpG + Controlo

    nenhum CpG [MB Controlo CpG+IMS CpG + Controlo ELISA de IL-10 D ELISA de IL-12p40

    3a>i

    IMS Controlo CpG+Ββ CPG + nenhum Controlo

    (MS Controlo CfcG+IM$ CpG + Controlo qpe FIGURA 22