CN106535926B - 用于基于抗原的疗法的新型组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，包括给予组合物至受试者，所述组合物包含至少一种β细胞自身抗原。该受试者可以具有50纳摩尔/升以上的血清维生素‑D水平，或可以通过淋巴管内注射或直接注射至淋巴结中，或在几周、几个月或几年的期间内给予该组合物。本发明还涉及一种组合物，包含多个颗粒，各自具有固定在其表面上的至少一种第一和至少一种第二抗原，其中第一抗原是β细胞自身抗原，以及第二抗原是耐受原或β细胞自身抗原，以及涉及包含以下的组合物：i)至少一种β细胞自身抗原，以及以下至少一种：iia)选自由维生素‑D、维生素‑D类似物、酪氨酸激酶抑制剂、γ‑氨基丁酸和γ‑氨基丁酸类似物组成的组的IL‑10诱导化合物；和iib)减少树突状细胞活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如环氧酶抑制剂、CTLA‑4化合物或TNFα抑制剂。本发明还涉及药物试剂盒及β细胞自身抗原的医疗用途。

Description

用于基于抗原的疗法的新型组合物
相关申请的引证
本国际申请要求于2014年6月4日提交的瑞典专利申请1450678-6 和2014年11月4日提交的瑞典专利申请1451315-4的优先权，通过引证将其全部内容明确合并于此。
技术领域
本发明总体上涉及免疫学领域并且具体地免疫疗法领域。更具体地，本发明涉及如1型糖尿病或自身免疫糖尿病的自身免疫性疾病的预防和/ 或治疗。本发明提供了在这种疾病的预防和/或治疗中特别有用的组合物和组合。还提供了用于自身免疫性疾病的治疗和/或预防的联合治疗的方法。
背景技术
免疫防御系统与许多防御系统一样由许多和大部分相互作用的部分组成。存在基本上认为通过如Toll样受体的模式识别受体对众所周知且常见的微生物抗原(ag)反应的先天系统；以及存在可以适应于对各种各样的外来入侵者的响应并生成和保持在与相同ag的新的遭遇发生的情况下快速反应的记忆细胞的获得性系统。
在自身免疫性疾病中，适应性免疫系统常对至少一种本身的抗原(自身抗原，aag)反应。尽管没有完全理解，但是自身免疫可以由若干方式引发。讨论的可能的引发的实例包括但不限于对病毒、饮食、维生素、压力、微生物、疫苗、抗生素和其他药物的先天响应。遗传倾向是另外的重要因素。
在内源产生的自身抗原的情况下，这些在细胞内被加工且其肽被运输至与MHC-I分子关联的细胞表面并呈递至多种细胞，包括幼稚CD8+T 细胞；已经成熟的细胞毒性CD8+T细胞；和/或CD8+记忆效应T细胞。为了活化幼稚CD8+T细胞以成熟为细胞毒性T细胞，需要与CD28有关的二次共刺激信号。
不在细胞内的自身抗原一般被如树突状细胞(DC)或巨噬细胞的抗原呈递细胞(APC)吸收，且加工的肽将与MHC-II分子关联运输并呈递至幼稚的、成熟的或记忆CD4+T细胞。此处也存在活化幼稚CD4+T细胞至辅助型T(Th)细胞形式所需的包括CD28的第二共刺激信号。通常讨论Th细胞的两种形式：Thl；Th2。
在APC-MHCII-aag复合体和CD4+T细胞受体(TC)相遇时生成什么类型的Th细胞取决于若干因素，包括呈递时DC的成熟度和周围环境，包括但不限于IL-10的可用性。而Thl细胞分泌包括IFNg的炎性细胞因子，并刺激炎性细胞介导的响应，Th2细胞一般分泌IL4并刺激其中BC产生非溶胞性和中和抗体的体液响应。用于“包覆”和补体结合(抗体依赖的细胞毒性)的抗体通常是由先天系统刺激的。
每种B淋巴细胞(BC)以固定的抗体分子的形式表达其独特的和特异性的B细胞受体(BC)。而TC识别同源ag-作为MHC分子背景下的加工的肽，B细胞识别处于它们的天然形式的抗原(如不正常地与T细胞活化相互作用的未加工的抗原)，并且以大部分来自Th2信号的帮助，它们分化为产生浆细胞的短寿命抗体，认为其10％变为长寿命的抗原特异性记忆BC。
通常认为在该领域中，胰岛素和胰岛素相关分子是在导致包括成人中的1型糖尿病和隐性自身免疫糖尿病的自身免疫糖尿病的过程中涉及的早期分子。已经进行了，且目前使用不同的源自胰岛素的制剂进行大规模的临床试验以诱导耐受且停止或防止疾病进展。对相同目的，尝试了包括但不限于GAD65的许多其他β细胞抗原分子及其肽，以及正在制备其他，不限于胰岛素B-链和胰岛素原及其变体，用于临床开发。
在人的免疫系统发展期间，认为自体抗原反应性淋巴细胞被克隆删除以区分自体和非自体。非自体反应性T淋巴细胞被保留并继续分化为在与它们的特异性抗原相遇时可以活化的幼稚CD4+或CD8+T细胞。然而，某些自体反应性的淋巴细胞逃离该删除过程。如果自体抗原是隐蔽的，例如在细胞内，更加如此。然而，在胰岛素的情况下，作为大量分子的实例，相对较少的胰岛素反应性淋巴细胞逃离删除过程因而存在相对较少的幼稚胰岛素反应性CD4+或CD8+T细胞。
天然存在的大量分子，如例如胰岛素，通常不被DC吸附和呈递，除非该过程是由活化的CD8+T细胞和/或TLR信号引发的。因此，以及本领域可能没有注意到的，导致糖尿病的自身免疫过程在许多情况下可能是由识别与靶器官的细胞上的1类MHC直接相关的aag的逃逸的CD8+幼稚胰岛素反应性淋巴细胞引发的。在遗传倾向的情况下，胰岛素反应性的“逃逸的”幼稚CD8+胸腺细胞因此可以触发包括生成CD8+细胞毒性细胞的炎性过程，这进而可以诱导使先天系统警觉，包括导致BC产生胰岛素抗体的细胞因子。一些β细胞将死亡并释放隐蔽抗原，如例如GAD65，为此存在大量的幼稚的CD4+和CD8+TC。GAD65可以另外具有与进一步刺激TLR类信号的某些病毒结构的共同性。
在自身免疫反应进行的同时，反炎性机制发展，如例如CTLA4分子和IL-10分泌物的表达。由于在胰岛素的情况下，对出现的自身免疫性疾病的ADC-MHCII贡献较弱，这种补偿机制以自身抗原特异性的方式诱导对胰岛素的耐受。然而GAD分子被吸收，处理的DC和GAD肽呈递至幼稚的CD4+TC，将它们活化为辅助T细胞。因此对胰岛素的暂时免疫反应被更稳固的对GAD的反应代替。这解释了为什么在许多遗传倾向的小儿中第一种自身抗体经常针对胰岛素，以及为什么这种抗体经常随疾病进展消失。
Mocellin,Cytokine Growth Factor Rev.2004，The multifacetedrelationship between IL-10and adaptive immunity:putting together the piecesof a puzzle，描述了白细胞介素-10(IL-10)如何调制若干适应性免疫相关的细胞的功能的多效性细胞因子。尽管通常考虑为免疫抑制分子，但是 IL-10在体内模型中拥有免疫刺激性质。作为实例，由胰岛细胞局部产生的IL-10在NOD小鼠中刺激自身免疫的进展，而全身给予可以具有β细胞保留和抗炎效果。提供了IL-10和涉及适应性免疫的传染性疾病、自身免疫、过敏症、癌症和移植之间的关系的概括。
Russel et al,Islets.2014，The impact of anti-inflammatory cytokines onthe pancreaticβ-cell，近来呈现了如白细胞介素(IL)-4、IL-10和IL-13 的抗炎分子可以施加β-细胞功能和活性的直接影响，以及这些细胞因子的循环水平可以在1型糖尿病中降低的证据，并提出抗炎路径的靶向可以在 1型糖尿病中提供治疗潜能。
Calcinaro et al,Diabetologia.2005，Oral probiotic administrationinduces interleukin-10production and prevents spontaneous autoimmune diabetesin the non-obese diabetic mouse，总结了早期口腔给予益生菌预防NOD小鼠中的糖尿病发展并与胰腺中增加的IL-10表达相关，其中检测到IL-10-阳性的胰岛浸润单核细胞。
Van Dongen et al,Int J Cancer.2010Aug 15；127(4):899-909.doi: 10.1002/ijc.25113.Anti inflammatory M2type macrophages characterize metastasized andtyrosine kinase inhibitor-treated gastrointestinal stromal tumors(GIST).报告了用酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼和舒尼替尼处理的肿瘤在巨噬细胞培养物中诱导抗炎IL-10的分泌，指出用这些抑制剂处理可能有助于GIST中的免疫抑制微环境。总体上，数据显示出GIST作为肿瘤免疫相互作用的活性位点，其中抑制机制压制了潜在的抗癌响应。酪氨酸激酶抑制剂可能促进该负平衡。
Louvet et al,Proc Natl Acad Sci U S A.2008，Tyrosine kinase inhibitorsreverse type 1diabetes in nonobese diabetic mice，报告了酪氨酸激酶(TK) 抑制剂如何提供治疗自身免疫性疾病的机会。使用伊马替尼(Gleevec)的治疗预防并逆转了NOD小鼠中的T1D。用舒尼替尼(Sutent)观察到类似的结果。另一种TK抑制剂PLX647仅示出了较小的疗效，而源自血小板的生长因子受体(PDGFR)的可溶形式PDGFRbetalg快速地逆转了糖尿病。伊马替尼治疗导致持久的缓解和长期的疗效，且耐受可能取决于抑制酪氨酸激酶的组合，支持了选择性激酶抑制剂治疗用于T1D的的用途。
Agostinoet et al,J Oncol Pharm Pract.Epub 2010，Effect of the tyrosinekinase inhibitors(sunitinib,sorafenib,dasatinib,and imatinib)on blood glucoselevels in diabetic and nondiabetic patients in general clinical practice,，描述了酪氨酸激酶抑制剂(TKI)如何影响用达沙替尼、伊马替尼、索拉非尼和舒尼替尼治疗的患者的血糖(BG)浓度。全部示出BG的显著下降。尽管不清楚这些药物的降血糖效果的机理，但是c试剂盒和PDGFRβ是常用的靶激酶。
Adorini,Ann N Y Acad Sci.2003，Tolerogenic dendritic cells induced byvitamin D receptor ligands enhance regulatory T cells inhibiting autoimmunediabetes，报告了1,25-二羟基维生素D(3)诱导具有耐受原表型的DC，其特征在于CD40、CD80、和CD86共刺激分子的表达降低、低IL-12和增强的IL-10分泌。使用1,25-(OH)(2)D(3)的治疗诱导对与1型CD4(+)和 CD8(+)细胞的发育受阻有关的小鼠胰岛异源移植的耐受度和增加百分比的CD4(+)CD25(+)调控细胞，以及以非高钙学剂量抑制糖尿病发展，表明维生素D是用于治疗1型糖尿病的一个方式。
Heine et al,Eur J Immunol.2008，1,25-dihydroxyvitamin D(3)promotes IL-10production in human B cells，报告了1,25-二羟基维生素D(3)(骨化三醇)抑制由B细胞的IgE的表达并增强由树突状细胞和T细胞的IL-10 的表达。活化的B细胞中维生素D信号、IL-10的表达和它们由其前体产生骨化三醇的能力之间的分子联系表明可以将25-羟基维生素D(3)用作免疫响应的调制剂。
Niiro et al,Biochem Biophys Res Commun.1998，MAP kinase pathways as aroute for regulatory mechanisms of IL-10and IL-4which inhibit COX-2expression in human monocytes，描述了促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK) 如何被活化以及在调节单核细胞/巨噬细胞中的促炎性分子的表达中起重要作用。脂多糖(LPS)刺激的人单核细胞诱导COX-2蛋白质和COX-2 mRNA表达以及单核细胞中的信号调节的蛋白激酶(ERK)2和p38MAPK。 COX-2mRNA、COX-2蛋白质和前列腺素(PG)E2由LPS的诱导受ERK 和p38MAPK的特异性抑制剂的抑制。白细胞介素(IL)-10类似地抑制 COX-2表达。LPS诱导的磷酯化以及ERK2和p38MAPK的活化显著受 IL-10的抑制，表明IL-10对LPS诱导的促炎性分子的表达的抑制可以归因于两种细胞因子对MAPK活化的调节效果。
Obermajer et al,Blood.2011，Positive feedback between PGE2andCOX2redirects the differentiation of human dendritic cells toward stablemyeloid-derived suppressor cells，描述了树突状细胞(DC)和源自骨髓的抑制细胞(MDSC)是如何在免疫系统中显示出相反作用的。
环氧酶2(COX2)是PGE(2)合成的关键调节子和重新定向CDla(+)DC 至CD14(+)CD33(+)CD34(+)单核细胞MDSC的发展的决定因素。
外源PGE(2)以及如脂多糖、IL-Ιβ和IFNy的各种COX2活化剂都诱导COX2的表达，阻碍它们分化为CDla(+)DC并诱导内源PGE(2)、IDOl、 IL-4Ra、NOS2和IL-10、典型的MDSC有关的抑制剂。使用COX2抑制剂或EP2和EP4拮抗剂破坏COX2-PGE(2)的反馈抑制了MDSC有关的抑制剂的产生和来自癌症患者的充分发展的MDSC的CTL抑制功能。 COX2-PGE(2)反馈在MDSC的诱导和持续中的中心作用突出了其增强或抑制癌症、自身免疫或移植中的免疫响应的操作的潜力。
Lieb,Med Hypotheses.2007，Antidepressants,prostaglandins and theprevention and treatment of cancer，报告了假设的致癌机制为环氧酶的上调、致癌基因的合成和表达、病毒活化、信号破坏、失效的细胞凋亡、肿瘤起始和扩散、血管生成、转移、免疫抑制、端粒酶活性和自身免疫。所有均由前列腺素调节。在服用如茚甲新和布洛芬的非甾体的、抗前列腺素药物的患者中已经记录了癌症的可观察的和射线照相的衰退。
Kim,et al,Immune Netw.2010，Cyclooxygenase Inhibitors,Aspirin andIbuprofen,Inhibit MHC-restricted Antigen Presentation in Dendritic Cells呈递，报告了NSAID对T和B细胞具有免疫调节效果以及布洛芬抑制树突状细胞(DC)中的抗原的I类和II类MHC限制的呈递。布洛芬不抑制DC的吞噬活性、总的MHC分子和共刺激分子在DC上的表达水平。布洛芬相反地增加总的MHC分子和共刺激分子在DX上的表达水平。结果证明布洛芬抑制吞噬的抗原的细胞内加工，并表明延长的高剂量的NSAID的给予可以削弱DC呈递与MHC分子有关的抗原的能力。
Gribben et al,Immunology 1994，CTLA4mediates antigen-specificapoptosis of human T cells，描述了CTLA4分子如何是通过TC或CD28活化诱导的T细胞限制分子。在正在进行的免疫响应中，促炎性和非促炎性信号之间存在平衡。CD28或CD28/CTLA4的共用结合区域通过单抗或天然配体B7-1和2的交联提供了导致促炎性IL-2上调的积极共刺激信号。事实上，CTLA4的交联可以向CD28提供弱的共刺激信号。在T细胞活化之后，CD28表达下调且CTLA4上调。这时，在不存在CD28共刺激的情况下CTLA4的交联可以诱导删除之前活化的T细胞，这表示CTLA4 可以根据T细胞的活化状态共刺激和诱导删除。
Posadas et al,Clinical Immunology 2009，Abatacept in the treatment ofrheumatoid arthritis，描述了在类风湿性关节炎(RA)中，T细胞和包括树突状细胞DC、巨噬细胞和成纤维细胞的若干其他细胞表达活化标记物如 CD28和细胞毒性T细胞抗原4(CTLA4)。在周围血液中幼稚T细胞需要两种信号来活化它们的全部功能潜能：i)在MHC分子的环境下的呈递至 T细胞上的对应的抗原特异性T细胞受体(TCR)的抗原呈递细胞(APC)上的抗原；和ii)T细胞上的CD28与APC上的CD80/86的配位。在没有共刺激的情况下通过同源抗原的幼稚T细胞的刺激导致T细胞无免疫性，而在不存在同源抗原的情况下T细胞上的共刺激分子的配位对T细胞没有影响。
用两种信号成功刺激之后在活化的T细胞上上调的表面分子中的一种是CTLA4。其以比CD28高的亲和力结合至CD80/80。这不仅阻碍CD28 结合而且CTLA4还诱导抑制信号至新活化的T细胞中。
阿巴西普(Fc修饰的CTLA4免疫球蛋白)是由人CTLA4的细胞外部分和人IgGl的重链组成的T细胞去除、免疫调制的融合蛋白。其阻碍幼稚T细胞活化中涉及的共刺激信号。其与APC上的CD80/86的配位还干扰和减少CD80/86诱导的IL-6，这可以下调炎性细胞因子如IL-lβ、IFNγ和IL-17。阿巴西普与CD80/86的进一步的配位可以诱导APC中的吲哚胺双加氧酶(IDO)，其进而可以诱导T细胞中的无免疫性，以及下调幼稚T 细胞的通过活化的T细胞的旁分泌活化。
关于阿巴西普影响记忆CD4+T细胞的回忆、重新刺激的能力已经呈现了矛盾的看法。在B细胞上表达的CD80/86仍可以是其中阿巴西普可以进行免疫调制功能的进一步的路径。
Patakas et al,abstract#723AC/A HP,2013,Abatacept is Highly EffectiveAt Inhibiting T cell Priming and Induces a Unique Transcriptional Profile InCD4+T Cells，示出了在阿巴西普存在下使用卵清蛋白的sc激活如何产生大量的IL-2，从而类似于首次暴露于抗原的幼稚T细胞。这些T 细胞包含比其他(未激活的或幼稚的)T细胞群体少的调节T细胞和CD4+ T细胞，并且它们的状态伴随着树突状细胞在转录水平的活化的抑制。 Patakas得出结论虽然阿巴西普显著调制T-DC通信，导致有缺陷的细胞激活，但这是不同于无免疫性耐受的。
Orban et al,Lancet 2011,Co-stimulation modulation with abatacept inpatients with recent-onset type 1diabetes:a randomised,double-blind, placebo-controlled trial报告了如通过刺激的C-肽测量的阿巴西普与安慰剂相比在开始的6个月内显著保持内源胰岛素分泌，然后下降至与安慰剂组平行。认为早期有利的效果是由于阿巴西普阻碍防止活化幼稚T细胞的共刺激B80/86-CD28信号。推测之后的6个月β细胞功能的连续下降是由于随疾病进展连续的T细胞活化减少。
尽管Orban提到幼稚T细胞的活化需要两种信号，而一种由APC上的MHC分子环境下呈递的抗原包含；以及另一种是涉及T细胞上的CD28 分子的共刺激信号，在该试验中没有使用特异性抗原。这可能是以下根据的理由，虽然阿巴西普最初且成功地防止幼稚T细胞活化为细胞毒性T细胞，但是这可以最终被免疫系统的其他部分(如例如增加的IL-2的分泌)抵消和/或补偿，并且当这发生时，诱导对特异性抗原的耐受的窗口丢失。
Orban et al,Diabetes Care 2013,Costimulation Modulation WithAbatacept in Patients With Recent-Onset Type 1Diabetes:Follow-up 1Year AfterCessation of Treatment，随后报告了停止药物给予之后的一年有利的效果继续，尽管活性臂和空白对照之间的差异减少。因此，在开始治疗之后36个月，与空白对照受试者的30％相比，活性臂中的患者的35％具有峰值刺激的C-肽>0.2nmol/l。指出在DR3阴性患者中用阿巴西普治疗缺少效果。
上述的两个Orban研究表示在近来发作的1型糖尿病患者中阿巴西普作为单独的疗法的免疫调节不足以具有持续的β细胞功能保持效果。
Verhagen et al,PLOS 2014,CTLA-4Modulates the Differentiation ofInducible Foxp3+ Treg Cells but IL-10 Mediates Their Function in ExperimentalAutoimmune Encephalomyelitis，得出结论IL-10的存在是用于增强调节T细胞的抑制效果的一个重要因素。
GAD65(谷氨酸脱羧酶的65kd同种型)是主要的β细胞自身抗原，因为其在小岛中产生并作为对β细胞刺激的响应而释放增加。已经示出该蛋白质深入地影响自身免疫的免疫过程。大量的研究示出GAD可以预防实验动物的糖尿病。GAD与病毒蛋白质的类似性对治疗行为可以是重要的。即使在免疫过程开始之后，观察的效果也表明可以在人类中预期相同的效果。在氢氧化铝(alum)中配置重组GAD并且在LADA患者的II 期研究中，一次低剂量的Diamyd 20μg的给予导致与安慰剂治疗的组相比持续高达2年的改善的β细胞功能，而没有副作用。还尝试了其他剂量： 4μg示出无效果，100μg示出与20μg类似的效果，同时500μg示出无效果。发现了与CD4+CD25+/CD4-CD25-细胞的比值的变化的关联，表明了作用机制。在该背景下，进行了10-18岁近期发作的1型糖尿病患者的II期研究。在第1和30天随机给予患者20μg GAD-alum(Diamyd) sc或安慰剂。30个月之后效果仍是明显的并且明显地是在统计学和临床意义上显著的，其中与安慰剂组相比在GAD治疗的组中约一半的C-肽下降。糖尿病持续时间<3个月的患者具有明显良好的效果，其中在后续的前15个月没有或有最少的β细胞功能的下降。48个月之后，治疗<6个月持续时间的患者仍具有显著保持的C-肽且没有不利现象。
随后，在欧洲在美国开始了III期试验。在欧洲，将334个患者招募至三臂，一个臂在第1、30、90和270天使用GAD-alum(Diamyd)20μ g，另一臂在第1和30天使用GAD-alum 20μg且第90天和270天使用安慰剂，以及第三臂在第1、30、90和270天使用安慰剂。尽管看到积极的趋势(16％疗效，p＝0.1)，但是在第15个月没有满足在混合膳食耐受测试(Mixed MealTolerance Test，MMTT)之后的主要终点，血清C-肽 AUC。这促使早期终止了III期试验。然而，欧洲III期在某些预先指定的亚组中确实示出了统计学上显著的疗效。而且，当停止研究时，45个瑞典患者已经通过了30个月的探视，并且接受了两次剂量的GAD-alum (Diamyd)20μg那15位患者在30个月之后与安慰剂相比示出C-肽的显著保持。注意到这些瑞典患者是在第15个月没有疗效的，而在非北欧患者中在第15个月发现了疗效。得出结论虽然部分有效，可能需要将 GAD-alum与其他化合物组合以成为用于1型糖尿病的临床有效的治疗方案的一部分。
Denes et al,Diabetes Technol Ther.2010,Autoantigens plus interleukin-10suppress diabetes autoimmunity，报告了尽管表达融合至自身抗原谷氨酸脱羧酶(GAD65)的免疫调制霍乱毒素B亚单位(CTB)或免疫抑制细胞因子白细胞介素-10(IL-10)的重组牛痘病毒(rVV)菌株能够在NOD小鼠中独立地仅生成低水平的1型糖尿病(TIDM)的免疫抑制，但是牛痘病毒(VV)介导的CTB::GAD融合蛋白和IL-10蛋白质的组合示出是用于TIDM的更有效的和持久的免疫治疗策略。
Robert et al,Diabetes.2014,Oral delivery of glutamic aciddecarboxylase(GAD)-65and IL10 by Lactococcus lactis reverses diabetes inrecent-onset NOD mice，最近示出了与短疗程的低剂量抗-CD3组合的口腔递送用于T1D自身抗原GAD65370-575肽和抗炎性细胞因子白细胞介素 -10的受控分泌的活的乳酸乳球菌(LL)细菌保持了近期发作的NOD小鼠中的功能性β-细胞群。
Skyler et al,Diabetes 2011,Stopping Type 1Diabetes,Attempts toPrevent or Cure Type 1Diabetes in Man(其包括的参考文献全部结合于此)，涉及免疫调制剂和抗原特异性治疗的组合方案提供了持续更久的T1D治疗的合理性。Staeva et al,DIABETES,VOL.62,JANUARY 2013，Recent Lessons Learned from Prevention andRecent-Onset Type 1 Diabetes Immunotherapy Trials(其包括的参考文献全部结合于此)，报告了目前的思考的现状并推荐评估包括自体抗原和抗炎化合物的组合治疗。
Skyler,DIABETES TECHNOLOGY&THERAPEUTICS,Volume 16, Supplement 1,2014,Immune Intervention for Type 1 Diabetes,2012-2013(将其全部内容结合于此)，回顾了本领域近期的试验。
Rigby et al,Current Opinion Endocrinol Diabetes Obes 2014, 21:271-278,Targeted immune interventions for type 1diabetes:not as easy as it looks(其包括的参考文献全部结合于此)描述了对抗自身免疫糖尿病的许多努力并得出结论尽管接近数百位参与者的十二次试验，但是没有发现单药治疗并且：a)不同亚群的T1D患者似乎对免疫干涉响应不同，表明显著的多样性；b)有效的疗法必须组合Teff细胞的抑制(通过去除、增强抑制能力或两者)与Treg的刺激(通过增加频率或功能，包括促炎性环境的消除)；且这可能需要包含Teff去除试剂、Treg提高药剂和抗原的组合。
如以上参考的，若干单药治疗和包含多种化合物的组合方案在小鼠模型中示出自身免疫糖尿病的预防和治疗中的有希望的效果。然而，将这种方案转移至人都未能示出临床上有意义的效果。因此，仍存在减轻社会和患者的破坏性疾病自身免疫糖尿病及其长期的并发症的难以克服的需要。本发明的主题是公开用于预防和治疗T1D和LADA的自身免疫成分，为用于内源或通过其他实现的方法增加功能性β细胞群做准备的方法和组合物。
发明内容
在一方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，包括将组合物给予至具有50纳摩尔/升以上的血清维生素-D水平的受试者，所述组合物包含至少一种β细胞自身抗原。
本发明公开了与方法组合使用抗炎性化合物和自身抗原以使树突状抗原呈递细胞(APC)在呈递所述自身抗原至免疫系统时更“耐受”的方法。
本发明公开了其中可以将包含抗炎性化合物、自身抗原和维生素D的组合方案有效用作用于T1D和其他自身免疫性疾病的预防和治疗方法的方法。
在进一步的方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，包括通过淋巴管内注射或直接注射至淋巴结中来将组合物给予至受试者，所述组合物包含至少一种β细胞自身抗原。
在进一步的方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，包括以在数周、数月或数年的周期内增加的剂量将至少一种β细胞自身抗原给予至受试者。
在进一步的方面中，本发明涉及包含多个颗粒的组合物，该颗粒各自具有固定在其表面上的至少一种第一和至少一种第二抗原，其中，第一抗原是β细胞自身抗原，且第二抗原是耐受原或β细胞自身抗原，该组合物进一步可选地包含药用的佐剂、赋形剂、溶剂和/或缓冲剂。
在进一步的方面中，本发明涉及包含以下的组合物
i)至少一种β细胞自身抗原，和以下各项中的至少一种：
iia)选自由维生素-D、维生素-D类似物、酪氨酸激酶抑制剂、γ-氨基丁酸和γ-氨基丁酸类似物组成的组的IL-10诱导化合物；和
iib)降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如环氧酶抑制剂、CTLA-4化合物或TNFα抑制剂；
以及可选地药用的佐剂、赋形剂、溶剂和/或缓冲剂。
在进一步的方面中，本发明涉及包含以下的药物试剂盒：
i)包含β细胞自身抗原的组合物，和以下各项中的至少一种：
iia)包含选自由维生素-D、维生素-D类似物、酪氨酸激酶抑制剂、γ-氨基丁酸、和γ-氨基丁酸类似物组成的组的IL-10诱导化合物；和
iib)包含降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如环氧酶抑制剂、CTLA-4化合物或TNFα抑制剂的组合物。
在进一步的方面中，本发明涉及β细胞自身抗原用于根据本发明的方法的用途。
在从属权利要求中阐述了本发明的优选实施方式。
定义
除非任何其他表达由本公开的上下文是明显的，否则本文使用的所有术语和表达旨在具有本申请提交日时本领域技术人员给定它们的含义。然而，为了清楚，在以下明确定义了某些术语和表达。
“自身抗原”或“自体抗原”是具有与自身抗体相互作用并引起免疫响应的内源组织成分。“β细胞自身抗原”是来源于胰腺β细胞的自身抗原。
“自身抗体”是与产生它们的有机体的自身抗原反应的抗体。
术语“维生素D生包括维生素D2和维生素D3。“维生素D类似物”无偏见地包括钙化醇、二氢速甾醇、阿法骨化醇、骨化三醇、胆骨化醇、和骨化二醇、和它们的组合、以及分类在解剖学治疗学及化学分类系统 (Anatomical Therapeutic Chemical ClassificationSystem)的组A11CC中的任何其他的维生素D。
术语“环氧酶抑制剂”或“抑制剂”涉及与环氧酶组合且从而防止其与花生四烯酸的底物-酶组合并形成类花生酸、前列腺素和促血栓素的化合物。环氧酶抑制剂的亚组是环氧酶-2抑制剂，其具有对环氧酶-2特异性。
术语“TNFα抑制剂”涉及抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)的作用的化合物，并包括阿达木单抗、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英利西单抗、以及分类在解剖学治疗学及化学分类系统的组L04AB中的任何其他化合物。
“表位”是能够引起免疫响应和能够与产生的对抗该响应的抗体或T 细胞受体结合的抗原的表面部分。
术语“γ-氨基丁酸类似物”包括氮己烯酸和巴氯芬。
使用单数“一个”“一种”等的表达应解释为包括复数。
如本文所使用的，“共给予”是指给予本发明的方案的化合物使得它们的给药方案重叠。不需要同时给予它们。
缩写“写“叠。代表“表型糖尿病”。
具体实施方式
在当对胰岛素的第一自身抗体出现在遗传倾向的个体，如例如但不限于DR3-单体型个体中且没有检测到其他自身抗体时，这可能意味着GAD- 反应性CD8+和CD4+TC还没有被活化，其提供了在不使用β细胞抗原的情况下用单独的抗炎性和/或淋巴细胞分化抑制剂完全终止疾病的机会窗口，因为对胰岛素的自身免疫可能通过抵消机制被自身消除。在该情形下，仍产生很少的(如果有的话)GAD-反应性活化的CD4+T辅助细胞，重要的是引导活化远离促炎性Thl。在GAD抗体阳性个体和/或糖尿病患者中，可以添加配制在，通常认为是Th2驱动佐剂的alum中的GAD和其他β细胞抗原，用于抗原特异性耐受的目的。虽然这可能产生比促炎性细胞更多的Th2-细胞和调节T细胞，但是包括内部环境因素的若干因素可能使耐受效果无效。因此，将自身抗原的Th2驱动制剂用作单一疗法可能是不够的，且本发明公开了增强β细胞耐受化流程的组合物和组合方案。
先前通过给予单一疗法如GAD和胰岛素抗原；抗炎性化合物如对 CD3、CD20的抗体；胸腺球蛋白(Thymoglobulin)、阿巴西普、阿法西普、或TNFα抑制剂如依那西普在自身免疫疾病中诱导免疫调节的尝试已经示出了一些疗效，但是这些效果的持续时间或它们在疾病显现之后的疗效限制了将这些途径带至临床。本发明公开了用于治疗和预防自身免疫性疾病的新策略，在维生素D强化的DC中与自身抗原和抗炎剂协同作用以提供多种程度的效果。
本发明因此提供了用于预防和/或治疗如自身免疫糖尿病的自身免疫性疾病的方式(例如方法，组合物和组合)。
本发明利用维生素D(Vit D)强化不成熟的树突状细胞(DC)为更致耐受性的知识，其迄今为止没有被证明充分地改变任何自身免疫性疾病的情况，和及时的组合Vit D的给予和与所述自身免疫性疾病相关的自体抗原的给予，因此强化给予的自体抗原的致耐受性免疫调节。
为了进一步增强其中在具有适当的Vit D血清浓度的受试者中DC呈递自体抗原至免疫系统的耐受环境，本发明公开了共同使用常用的抗炎化合物与自身抗原的组合方案适用于治疗和预防T1D的发现。
超出其潜在的协同效应，共同给予本发明的化合物的另一优势涉及自身免疫疾病经常包括针对多种自体抗原的自身免疫响应的问题。可能难以使用直接的抗原特异性耐受化用它们所有的同源抗原尝试无免疫性化或消除所有自身攻击性的淋巴细胞，因为可能不是所有同源抗原是已知的。例如，认为I型糖尿病(T1D)是由进入胰岛的自身攻击性淋巴细胞引起的，它们在胰岛中破坏β细胞。这种细胞的活化可能是多因素的，包括遗传倾向、环境触发如病毒，以及可能胰腺(胰岛)的损伤，例如由局部促炎症反应导致。
由于在通过筛选胰岛细胞抗体确定前期糖尿病人类个体时，自身攻击性过程通常有相当的进展，所以可以假设在该疾病阶段将正在进行对多于一种胰岛抗原的攻击响应。此外，不将慢性的非特异性全身免疫抑制考虑为选择，因为糖尿病常常影响年幼的个体，且终生的免疫抑制关系到副作用，其即使与单独的胰岛素疗法相比也是不可接受的。
因此，具有特异性和低全身副作用的有疗效的免疫类干涉是非常期望的。本方法解决了多种自体抗原靶的问题，因为本发明的化合物的共同给予可以足以重建对为自身免疫性疾病的靶的多种自体抗原的耐受。
本方法还解决了慢性非特异性全身免疫抑制的问题，因为共同给予本发明的化合物可以在不需要连续的终生给药的情况下重建长期的耐受。
在不受理论约束的情况下，本发明提供了共同给予本发明的化合物具有通过诱导调节T细胞(以及调节抗原呈递细胞(APC))的活化/扩增来协同建立部分长期耐受的潜力。
已经描述了调节T细胞的许多不同的表型。它们可以在胸腺切除术之后出现并且可以在全身免疫调制之后被诱导。它们的效应子功能不是完全已知的。它们看起来是免疫系统固有平衡的一部分且它们的损失导致严重的免疫的调节障碍和自身免疫。已经描述了具有定义的抗原特异性的Th2- 样调节子。认为它们起旁观者抑制剂的作用并在抗原特异性免疫之后出现。 Homann et al.,J.Immunol.(1999)163:1833-8.根据它们的效应子功能，已经将它们命名为Th3(TGF-β生产子)。这些细胞是具有特异化的效应子功能的抗原特异性的淋巴细胞且表现与Th2细胞不同。因此施加所谓的 Thl/Th2范式至这些细胞可以是误导性的。
旁观者抑制涉及抗原扩散的现象。认为抗原扩散是局部自身免疫过程的进展期间的主要组成部分。因此可以假设当患者具有若干自身抗体时，自身攻击性响应可以涉及许多自体抗体(或“自身抗原”)。由于对于特定的自身免疫异常，可能不能识别大部分的自身抗原，所以不可以用涉及对相应的MHC限制元素和肽的认识耐受各种自身攻击性特异性。通过本方法诱导调节细胞在这种情形下具有若干优点。例如已知T1D中的调节T 细胞可以作为旁观者抑制剂在淋巴结和胰岛中局部作用，这意味着它们可以以其他的自身抗原特异性抑制攻击性的淋巴细胞。这可以通过例如具有免疫调制功能的细胞因子的分泌，通过调制抗原呈递细胞(APC)发生。因此，这种旁观者抑制剂T调节细胞可以在不知道它们的明确特异性的情况下抑制对若干其他自身抗原的自身攻击性。
在没有检测到对于至少再一种隐蔽的(较少量的)第二自体抗原的自身抗体的同时，对于大量的如例如遗传倾向个体中的胰岛素的第一抗原或自体抗原的第一抗体的存在可以在其仅使用抗炎手段和/或淋巴细胞分化抑制剂的追踪中提供终止可能出现的疾病过程的机会窗口。事实上，由于相对少的来自胸腺逃逸的胰岛素特异性自身反应性CD8+和CD4+T细胞 (TC)中的克隆删除过程可以刺激对这种弱的第一自体抗原的炎性响应，所以炎症可以减弱且在一些实施方式中可以将所述第一抗原用作诱导对其他(或许更隐蔽或不常见的自身抗原)的耐受度的耐受原，对于其更多逃逸的幼稚自身反应性CD8+和CD4+T细胞可用于活化。
在自身免疫被触发至更有效的自身抗原，如例如在自身免疫糖尿病的情况下的GAD65，且其能够驱动疾病进程的情形下，在不使用上述有效的自身抗原用于诱导活性耐受化的情况下，单独使用抗炎手段和/或淋巴细胞分化抑制剂是不够的。另一方面，仅使用配制在如氢氧化铝(此处物“处巴细胞分)的佐剂(往往考虑Th2驱动的佐剂)中的例如GAD65的一种有效的自身抗原可能不仅导致调节成分的活化，而且导致促炎性和/或细胞毒性分子和细胞的活化，不限于属于天生免疫系统、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞(BC)、T细胞(TC)的分子或其他因素，包括可以贡献抵消耐受的环境因素。此外，可以使用其他较少的Th2驱动的佐剂制剂，如盐水或人血清白蛋白。因此，使用单种自身抗原作为单药治疗可能是不够的，且本发明公开了使用两种自身抗原来增强配制在alum、盐水或人血清白蛋白中的给予的自身抗原的特异性耐受作用的组合物和方法。
本发明在一个方面提供了包含至少一种抗原的至少一种药物组合物。根据本发明的至少一种药物组合物因此在一些实施方式中可以包含至少两种抗原。根据某些其他的实施方式，至少一种组合物包含至少三种自身抗原。根据某些其他的实施方式，至少一种组合物包含至少四种自身抗原。根据某些其他的实施方式，可以将抗原配制在单独的组合物中。最优选的是将根据本发明的所有抗原配制在相同的组合物中。在一些实施方式中，所有抗原是自身抗原，在一些其他的实施方式中，一些或所有抗原是免疫系统已经对其发展了调节响应从而能够以耐受方式影响对其他自身抗原的反应的抗原(耐受原)。
本发明的主题是公开使得能够诱导对在自身免疫性疾病中被攻击的自体结构的耐受的组合物、方案和方法。在一个具体的实施方式中，至少两种抗原关联至一种载体颗粒，因此将来自适应性免疫系统的免疫细胞暴露于对所述免疫细胞具有多种影响的至少两种抗原，导致对经受自身免疫攻击的自体结构的改变的响应。
通过将蛋白质或肽抗原吸附、结合或装入免疫系统与其反应的载体颗粒，并通过例如皮下注射将颗粒插入人组织中，可以靶向蛋白质或肽用于被免疫系统摄取。类似地，通过树突状细胞或巨噬细胞(抗原呈递细胞， APC)进行摄取。在该过程中摄取的蛋白质或肽中的一些将通过HLA (MHC)蛋白质被呈递至适应性免疫系统，并且适应性免疫反应将随之发生。适应性响应会受天生免疫系统的活性水平和受针对通过过程中HLA 蛋白质呈递的任何抗原存在的免疫响应的影响。这些影响蛋白质可以是在相同过程中摄取和呈递的颗粒结合肽或蛋白质、或天然蛋白质、自身抗原或耐受原(免疫系统以耐受方式与其反应的抗原)。如果这些蛋白质被相同的免疫细胞摄取，则它们将由细胞表面上的HLA蛋白质一起呈递。
非天然肽向免疫系统的呈递可以是受在对组织破坏的响应中来自天生免疫系统的信号的影响，具有Th2特征。包含自身抗体和RNA-核苷酸等的内源抗原可以是相同的。天然蛋白质或对其已经存在响应的蛋白质将通过适应性免疫细胞开始发信，这将影响总的免疫响应，并可以活化耐受原信号或先前存在的Thl反应。如果由注射过程且由幼稚免疫细胞和抗原呈递免疫细胞的相互相用诱导的信号强于之前存在的响应，则将形成包含记忆细胞的新的免疫响应。
如果注射和摄取并相同的APC呈递置于相同的颗粒载体上的蛋白质的组合物，则通过扩大可能的相互作用的适应性免疫细胞的数目，效果将是增加的，导致尽管与蛋白质中的一种的可能的之前存在的反应，但是形成新型免疫反应的几率增加。
如果将蛋白质自身抗原与对其已经存在免疫响应的相同颗粒载体上的另一种蛋白质(天生的或外来的)一起注射，则对抗原的免疫响应将在很大程度上受免疫系统已经对伴随抗原建立的响应的影响。如果伴随的抗原是对其存在中心调节T细胞的天然蛋白质(如例如IL10、胰岛素、人血清清蛋白、血红蛋白)，则将向耐受性驱动响应。如果这些蛋白质是个人已经具有免疫的抗原，如白喉或破伤风菌疫苗经常是这种情况，免疫响应将受这些现有的反应(大部分是炎症反应)的影响。
本发明包括用于通过共同给予本发明的化合物治疗自身免疫性和/或建立或诱导耐受的方法。除自身免疫性疾病之外，本方法还可以用于建立对过敏原的耐受，其中共同给予过敏原肽或蛋白质与本发明的化合物，其中抗原而非自体抗原是对过敏性疾病特异性的过敏原(抗原)。
应理解本文中相对于一个方面给出的细节、具体地关于自身抗原、影响抗原、IL-10诱导化合物、和降低免疫系统活化幼稚TC和BC并由活化的和记忆淋巴细胞回忆响应的能力的化合物、给予的时间和模式加以必要的变更适用于本发明的所有其他方面。
方法
在一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，包括将组合物给予至具有50纳摩尔/升以上的血清维生素-D水平的受试者，所述组合物包含至少一种β细胞自身抗原。因此至少两种分子各自可以影响向其呈递抗原的适应性免疫细胞的反应。
受试者可以具有50-150纳摩尔/升、如60-100纳摩尔/升、75-100纳摩尔/升或100-150纳摩尔/升的血清D-维生素水平。
该方法可以包括预治疗受试者以调节血清维生素-D水平，并且这种预治疗可以包括在将包含至少一种β细胞自身抗原的组合物给予至所述受试者之前给予维生素-D和/或维生素-D类似物、和/或暴露于UVB-辐射优选地7至90天。
该方法可以进一步包括以7000-70000lU/周的量给予维生素-D和/或维生素-D类似物3-48个月。
β细胞自身抗原可以是如以下在标题“自身抗原”下讨论的β细胞自身抗原。
该方法可以进一步包括给予如以下在标题“环氧酶抑制剂”下讨论的环氧酶抑制剂。
该方法可以进一步包括给予如以下在标题“CTLA4化合物”下讨论的CTLA4化合物。
该方法可以进一步包括给予如以下在标题“TNFα抑制剂”下讨论的 TNFα抑制剂。
本发明提供了用于在需要其的个体中预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括给予所述个体以下各项：
a)出于特异性的抗原耐受的目的，至少一种自身抗原或它们的片段；或涉及以上所列的自身免疫和炎性疾病中的至少一种编码这些分子的核酸、质粒或载体。在一个实施方式中，当血清维生素D水平在50和150nM/l 之间、更优选地在75和100nM/l之间以及最优选地在100-150nM/l之间时给予自身抗原；以及
b)出于干扰APC成熟的能力的目的，给予所述个体选自由如以上所列的维生素-D、维生素-D类似物、γ-氨基丁酸、γ-氨基丁酸类似物和酪氨酸激酶抑制剂组成的组中的至少一种IL-10诱导化合物。在一个实施方式中，通过使用UVB曝光增强或实现IL-10诱导；以及
c)出于干扰免疫系统的活化幼稚TC和BC以及由活化的和记忆淋巴细胞回忆响应的能力的目的，给予如以上所列的化合物，如NSAID化合物； CTLA-4化合物；或TNFα抑制剂。
本发明在一些方面涉及用于预防和/或治疗如1型糖尿病(T1D)和自身免疫糖尿病的自身免疫性疾病的方法。
本发明公开了用于治疗如T1D和自身免疫糖尿病的自身免疫性疾病的方法，该方法包括给予患所述疾病的受试者：
(a)一疗程Vit D，用于增强抗原呈递树突状细胞以耐受化方式将抗原肽呈递至免疫系统的能力；
b)自身抗原，如GAD65，配制在以有效地恢复或诱导对自身抗原的耐受的量给予的药物载体中；以及可选地
c)治疗剂量的抗炎化合物，例如环氧酶抑制剂如布洛芬、或更明确的cox-2或cox-1抑制剂。
Vit D的疗程优选地在给予自身抗原之前15至90天或在给予自身抗原之前7至90天开始，并以对应于7000至70000iu/周的剂量的液体或片剂形式给予3至48个月的周期。
用维生素D的预治疗旨在将治疗的受试者的血清维生素D水平升高至50纳摩尔/升以上、或60、75或100纳摩尔/升以上。如果受试者已经具有这些水平的血清维生素D水平，则可以省去预治疗。
在本发明的另一个实施方式中，可以通过光疗增强Vit D的血清浓度。在这种情况下，在给予自身抗原之前，受试者将暴露于每天10-120分钟之间的紫外线B辐射15至90天。光疗应持续3至48个月的周期。
自身抗原的优选的剂量在两次和四次给予之间，至少间隔两周、更优选地间隔一个月，如果通过注射给予各次在10和200μg抗原之间。如果口腔给予，优选的剂量在每天500mg和5g之间，持续三个月和48个月之间的周期。优选地以100至800mg的日剂量给予布洛芬，持续60至150 天的周期，在该周期期间进行自身抗原的给予。
可以通过淋巴管内注射、直接注射至淋巴结中、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、皮下注射、鼻内、跨粘膜或舌下施加；或口腔，包括作为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、锭剂、水溶液或油溶液、悬浮液、乳液、喷雾或作为用液体介质重组的干燥粉末形式给予自身抗原。可以在药用的载体、赋形剂或稀释剂中/伴随药用的载体、赋形剂或稀释剂给予抗炎化合物和自身抗原。
在本发明的一个实施方式中以及在T1D的治疗或预防的情况下，在腹部的单侧或两侧区域进行皮下注射自身抗原以使得能够增加呈递自身抗原肽的APC细胞至胰腺淋巴结的运输量。
根据某些其他的实施方式，皮下(如在接近胰腺引流淋巴结的腹部) 给予至少一种自身抗原。在一些实施方式中，用于皮下注射的抗原的体积在0.2和2ml之间、更优选地在0.4和0.6ml之间。
根据某些其他的实施方式，经由皮内注射给予至少一种自身抗原。
根据某些实施方式，其中以“类疫苗”方式经由皮下注射给予至少一种抗原，每次治疗时机各自给予至少4-250ug、更优选地10-l00ug、最优选地10-50ug剂量的至少一种抗原。
根据某些实施方式，其中以“类过敏”方式经由皮下注射给予至少一种抗原，其中，可以使用每种使用的自身抗原的多种逐增的剂量的计划。这种方法可以包括在几周、几个月或几年的周期内以增加的剂量给予β细胞自身抗原。
在一个实施方式中，在3至4个月的初始治疗周期内间隔1-4周、如间隔2-4周或间隔2周以及可选地在6-9个月的继续治疗周期内间隔2-3 个月给予含有β细胞自身抗原的组合物。
在一个实施方式中，将β细胞自身抗原的量从治疗周期开始时的每次给予1-5μg增加至最后给予的每次给予约40-100μg。
在一个实施方式中，该方法包括在基准线(第1月)开始皮下注射增加剂量的β细胞自身抗原(例如GAD65)如下：每周0.4；0.8；2；3.2； 4；6.4；8；12；16；20；24、32、40μg自身抗原，之后将从第15周至第27周以2、4和8周的间隔给予40μg自身抗原。此后将每8-12周给予40μg自身抗原持续1年。可以如上所述的给予维生素D(从第1天)。
优选的给药方案包括1ug、5ug、20ug、50ug的逐增的自身抗原剂量，每剂量的两次注射间隔4周，这将是28周的GAD-alum治疗。可替换地，优选的给药计划包括在第0、15、30、45、60天如4ug、8ug、16ug、 20ug、40ug和随后的第120、180、270天40ug的的渐增的剂量。
在本发明的一个实施方式中，将自身抗原直接给予至淋巴结或淋巴系统中以使驻留的APC将抗原肽呈递至免疫系统。如果将自身抗原直接给予至淋巴结或淋巴系统中，则剂量优选地在每次给予1和15μg之间、更优选地在每次给予2和10μg之间或每次给予2至5μg之间。在alum中配制是优选的。
根据某些实施方式，腹股沟内、淋巴结内或淋巴管内给予至少一种自身抗原。在一些实施方式中，用于腹股沟内注射的抗原的体积在0.05和 0.2ml之间、更优选地在0.05和0.15ml之间。
根据某些实施方式，在通过淋巴结内或淋巴管内注射给予至少一种抗原的情况下，优选的剂量在每次注射和使用的自身抗原l-15ug之间、更优选地在2-10之间、以及最优选地在2-5ug之间，这种给予进行至少2次、更优选地至少3次以及最优选地至少4次，至少14间隔14天、更优选地间隔至少30天。
根据某些实施方式，在静脉内给予至少一种抗原的情况下，每次治疗时机给予至少100-10000ug的每种抗原至少两次，间隔至少一周。
根据某些实施方式，在口腔给予至少一种抗原的情况下，每次治疗时机给予至少0.5-5g的每种抗原，至少每周一次。
根据某些实施方式，单独地或与其他抗原一起配制至少一种抗原(视情况可以是在alum、盐水或人血清白蛋白中)。
根据某些实施方式，至少一种药物组合物包含相同载体颗粒上的至少两种抗原。根据某些其他的实施方式，至少一种药物组合物包含不同载体颗粒上的至少两种抗原。根据某些实施方式，单独地且以适用于特定的抗原的不同的时间和频率、方案和配方给予至少两种抗原。更优选地，将至少两种抗原配制在相同的药物组合物中并因此同时给予。
在一些实施方式中，将至少一种抗原配制在如alum的佐剂中。在更具体的实施方式中，将至少一种抗原配制在盐水或人血清白蛋白中。
根据某些实施方式，同时给予至少一种抗原和至少一种IL-10诱导化合物。根据某些实施方式，单独给予至少一种抗原和至少一种IL-10诱导化合物。
根据某些实施方式，同时给予至少一种IL-10诱导化合物与至少一种抗原。根据某些实施方式，在第一次给予至少一种抗原之前的1-14天之间开始给予至少一种IL-10诱导化合物。根据某些实施方式，在第一次给予至少一种自身抗原之前至少2周、优选地至少10周开始给予至少一种 IL-10诱导化合物。
根据包括使用维生素D的治疗周期的某些实施方式，每天给予500 和10000IU之间、更优选地1000和3000IU之间的维生素，如维生素D3。
根据包括使用维生素D的治疗周期的某些实施方式，在第一次给予至少一种抗原之前每周给予7,000-100,000IU之间的维生素D，如维生素D3，且此后给予每天500-2000IU作为维持剂量。
在一些实施方式中，维生素D的治疗周期在第一次给予抗原之后的 60和420天之间。
可以与至少一种抗原和/或至少一种IL-10诱导化合物同时或单独给予降低免疫系统的活化幼稚TC和BC以及由活化的和记忆淋巴细胞回忆响应的能力的化合物，如NSAID化合物；CTLA-4化合物；或TNFα抑制剂。
在一些实施方式中，降低免疫系统的活化幼稚TC和BC以及由活化的和记忆淋巴细胞回忆响应的能力的化合物是NSAID化合物，如COX- 抑制剂。
根据某些实施方式，用NSAID的治疗周期在第一次给予至少一种抗原之前的至少2周开始。
根据某些实施方式，当COX抑制剂是布洛芬时，在NSAID治疗周期期间每天给予至少一次400至1000mg剂量。
NSAID治疗周期至少在4和14周之间、更优选地在4和8周之间。
在本方法中，应口腔或通过注射给予抗炎化合物。
在一些实施方式中，降低免疫系统的活化幼稚TC和BC以及由活化的和记忆淋巴细胞回忆响应的能力的化合物是TNFα抑制剂。
阻碍TNFα降低免疫响应的活化状态并降低DC和其他免疫活性细胞的活性。另外，因为TNFα破坏淋巴组织中的FSC和GC结构并削弱B细胞功能，所以抗原特异性效应T细胞的活化和自身抗体生产下降。近来的糖尿病临床前数据示出通过静止的DC递送的β细胞抗原可以诱导外周T 细胞无响应性，下调正在进行的β细胞破坏和延迟β细胞破坏。因此，在组合的自身抗原-TNFα抑制剂治疗下，自身抗体水平以及效应T细胞活性和数量将相对下降，同时自身抗原特异性Treg数和功能将至少保持。花费数月以修改这些免疫过程和记录这些效果，但是在该时间期间，由于其急性的β-细胞保护和代谢效应，TNFα抑制还将直接保持β细胞。因为已知GAD65是T1DM中的初级自身抗原中的一种，所以该途径产生糖尿病自身免疫响应向充分的临界量的调节表型的偏移，导致对β细胞保持显著和延长的影响。
因此，在本发明的一个方面，将不限于例如英利西单抗、阿达木单抗、戈利木单抗和依那西普的TNF-α抑制剂用作抗炎化合物。当使用依那西普时，优选的剂量在0.2和lmg/kg SQ之间，每周一次或两次持续2至9个月之间的周期。
根据某些实施方式，当TNFα抑制剂是依那西普时，FDA批准的在第 0、2和6周的5mg/kg的剂量是优选的。在另一个实施方式中，剂量与在 I期TNFα抑制剂单药治疗试验(0.4mg/kg(最大25mg)SQ两次每周x26 周)使用的相同。在最优选的另一个实施方式中，仅使用两种剂量，与包含维生素D和自身抗原的治疗方案组合最多25mg/剂量。
根据某些实施方式，在第一次给予至少一种抗原之前给予TNFα抑制剂。
在一些实施方式中，降低免疫系统的活化幼稚TC和BC以及由活化的和记忆淋巴细胞回忆响应的能力的化合物是CTLA-4化合物，如阿巴西普。根据具体的实施方式，当化合物是阿巴西普时，每治疗时机给予至少 2-20mg/kg剂量的阿巴西普，从第一次给予至少一种抗原时左右+/-7天开始。
根据某些实施方式，与至少一种抗原的第一次给予同时给予CTLA-4 化合物。
根据某些实施方式，视情况在第14、28和45天+/-一周重复至少一种抗原和降低免疫系统的活化幼稚TC和BC以及由活化的和记忆淋巴细胞回忆响应的能力的化合物的给予以确保阻碍TC上的CD28，且其中第一天标记至少一种IL-10诱导化合物的第一次给予。
在一方面，本发明提供了治疗与T1D有关的一种或多种症状的方法。与T1D有关的症状包括但不限于胰岛素产生减少、胰岛素敏感度降低、高血液葡萄糖水平、胰岛素产生细胞破坏和C肽水平异常。
本发明的方法可以致力于不仅T1D而且通常的自身免疫性疾病和异常的治疗和预防。例如，受试者患有格雷夫氏病(Grave's disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、低血糖、多发性硬化、混合性冷球蛋白血症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、乳糜泻、T1D或它们的组合。在这些情况下，要将疾病相关的自身抗原作为自身抗原包含在治疗方法中。在本发明的一个方面，受试者患有自身免疫响应，其涉及具有抗原特异性的T细胞或B细胞、或具有对自身抗原的T细胞受体(TCR) 或B细胞受体(BCR)特异性的T细胞受体(TCR)和/或B细胞。
根据某些实施方式，根据本发明的待治疗的个体是哺乳动物。根据具体的实施方式，根据本发明的待治疗的个体是人类。根据某些实施方式，根据本发明的待治疗的个体是婴儿。根据具体的实施方式，根据本发明的待治疗的个体是青少年人类。根据具体的实施方式，根据本发明的待治疗的个体是成年人类。
在一些实施方式中，治疗的人类受试者的年龄在4岁以上。
在其他实施方式中，治疗的人类受试者是8岁或更大。
在其他实施方式中，治疗的人类受试者是10岁或更大。
在一些实施方式中，治疗的人类受试者是18岁或更小。
在一些实施方式中，治疗的人类受试者的年龄是4-10、或4-18、或 8-18、或10-18岁。
在其他实施方式中，治疗的人类受试者是18岁或更大。
在一些实施方式中，治疗的人类受试者的年龄是18-30岁。
组合物
本发明还公开了包含多个颗粒的组合物，各自具有固定在其表面上的至少一种第一和至少一种第二抗原，其中，第一抗原是β细胞自身抗原，以及第二抗原是耐受原或β细胞自身抗原，该组合物进一步可选地包含药用的佐剂、赋形剂、溶剂和/或缓冲液。
根据某些实施方式，将至少一种自身抗原配制在佐剂中。根据具体的实施方式，佐剂是alum。在其他具体的实施方式中，将至少一种抗原配制在盐水或人血清白蛋白中。在更具体的实施方式中，自身抗原可以作为质粒给予或由如腺相关病毒载体或单纯疱疹病毒载体的病毒载体编码。
根据某些实施方式，至少一种自身抗原是如以下所讨论的。
根据本发明的组合物可以包含多于一种自身抗原。因此，根据某些实施方式，组合物包含至少两种自身抗原。根据某些其他的实施方式，组合物包含至少三种自身抗原。根据某些其他的实施方式，组合物包含至少四种自身抗原。
因此，根据具体的实施方式，组合物包含至少如GAD-65的GAD和胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少胰岛瘤抗原-2和胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少ZnT8和胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少IGRP和胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少嗜铬粒蛋白A和胰岛素。
根据其他具体的实施方式，组合物包含至少如GAD-65的GAD和B 链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少胰岛瘤抗原-2和B 链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少ZnT8和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少IGRP和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少嗜铬粒蛋白A和B链胰岛素。
根据其他具体的实施方式，组合物包含至少如GAD-65的GAD和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少胰岛瘤抗原-2和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少ZnT8和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少IGRP和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少嗜铬粒蛋白A和胰岛素原。
根据其他具体的实施方式，组合物包含至少胰岛素和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少胰岛素和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少B链胰岛素和胰岛素原。
根据具体的实施方式，组合物包含至少如GAD-65的GAD、胰岛素和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少如GAD-65的 GAD、胰岛素和胰岛素原。根据又其他具体的实施方式，组合物包含至少如GAD-65的GAD、B链胰岛素和胰岛素原。根据又其他具体的实施方式，组合物包含至少胰岛素、B链胰岛素和胰岛素原。
根据其他具体的实施方式，组合物包含至少如GAD-65的GAD、胰岛素、B链胰岛素和B链胰岛素。
根据某些实施方式，将至少一种自身抗原，如至少两种自身抗原或至少三种自身抗原配制在佐剂中。
可以将自身抗原配制在如氢氧化铝、MAS-1、人血清白蛋白、脂质- 乳液的佐剂中。
根据具体的实施方式，佐剂是alum。
在一个实施方式中，本发明涉及包含以下的组合物：
i)至少一种β细胞自身抗原，和以下各项中的至少一种：
iia)选自由维生素-D、维生素-D类似物、酪氨酸激酶抑制剂、γ-氨基丁酸和γ-氨基丁酸类似物组成的组的IL-10诱导化合物；和
iib)降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如环氧酶抑制剂、CTLA-4化合物或TNFα抑制剂；
以及可选地药用的佐剂、赋形剂、溶剂和/或缓冲剂。
本发明还提供了包含i)至少一种自身抗原和ii)至少一种IL-10诱导化合物的组合物(例如药物组合物)。
更具体地，本发明提供了包含以下的组合物(例如药物组合物)：i) 选自由胰岛素、B链胰岛素、胰岛素原和β细胞自身抗原组成的组的至少一种自身抗原，和ii)选自由维生素-D、维生素-D类似物和酪氨酸激酶抑制剂组成的组的至少一种IL-10诱导化合物。
根据本发明的组合物可以包含多于一种IL-10诱导化合物。因此，根据某些实施方式，该组合物包含至少两种IL-10诱导化合物。根据某些其他的实施方式，该组合物包含至少三种IL-10诱导化合物。根据某些其他的实施方式，该组合物包含至少四种IL-10诱导化合物。
因此，根据具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D和酪氨酸激酶抑制剂。根据其他具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D类似物和酪氨酸激酶抑制剂。
根据更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D和达沙替尼。根据其他更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D和博舒替尼。根据其他更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D和塞卡替尼。根据其他更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D和伊马替尼。根据其他更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D和舒尼替尼。
根据更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D类似物和达沙替尼。根据其他更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D类似物和博舒替尼。根据其他更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D类似物和塞卡替尼。根据其他更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D类似物和伊马替尼。根据其他更具体的实施方式，组合物包含至少维生素-D 类似物和舒尼替尼。
根据某些实施方式，组合物进一步包含iii)降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如环氧酶抑制剂、CTLA-4化合物或TNF α抑制剂。
根据具体的实施方式，这种化合物是环氧酶抑制剂，如非甾体抗炎药物(NSAID)。根据更具体的实施方式，NSAID选自由以下组成的组：布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪、洛索洛芬、茚甲新、拖美汀、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸、萘丁美酮、阿斯匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳(Diflunisal， Dolobid)、水杨酸、双水杨酸(Salsalate，Disalcid)、吡罗昔康(Piroxicam)、美洛昔康(Meloxicam)、替诺昔康(Tenoxicam)、屈昔康(Droxicam)、氯诺昔康(Lornoxicam)、伊索昔康(Isoxicam)、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布(Celecoxib)、罗非昔布(Rofecoxib)、伐地考昔(Valdecoxib)、帕瑞考昔(Parecoxib)、罗美昔布(Lumiracoxib)、依托考昔(Etoricoxib)和尼美舒利(Nimesulide)。
在本发明的一个实施方式中，将通过将个体GMP产生的蛋白质/肽溶液一起混合在配制缓冲液中来配制包含蛋白质/肽抗原或蛋白质/肽抗原的组合的至少一种组合物。然后将组合的蛋白质溶液伴随恒定混合无菌过滤到密闭的配制容器中，之后将佐剂的无菌溶液添加到配制容器中。然后将含有颗粒的蛋白质无菌添加到无菌的和去热原的玻璃注射小瓶中或预填充的注射器中并密封。可以从各个小瓶无菌取出吸附蛋白质的制品，用于注射至患者或受试者的组织。
制剂中组合的蛋白质的比例可以改变，尽管最优选的是按克重量计相等的比例。如果使用，有影响的抗原的比例应该至少等于其他抗原蛋白质或肽的合并的质量。有影响的抗原的比例可以大于其他抗原的合并的质量。配制缓冲液可以是等渗的磷酸盐缓冲的甘露醇缓冲液。佐剂可以是氢氧化铝(alum)、脂质体、聚(丙交脂-共聚-乙交酯)微粒或盐水。
根据本发明的药剂、药物组合物或治疗剂组合可以是适用于施加至人类和/或动物、优选地包括婴儿、儿童和成人的人类的任何形式，并可以通过本领域技术人员已知的标准流程生产。可以通过本领域技术人员已知的，例如来自以下目录的标准流程生产药剂、(药物)组合物或治疗剂组合： "Pharmaceutics:The Science of Dosage Forms",SecondEdition,Aulton,M.E. (ED.Churchill Livingstone,Edinburgh(2002)；"Encyclopediaof Pharmaceutical Technology",Second Edition,Swarbrick,J.and Boylan 15J.C.(Eds.),Marcel Dekker,Inc.New York(2002)；"Modern Pharmaceutics", FourthEdition,Banker G.S.and Rhodes C.T.(Eds.)Marcel Dekker,Inc.New York 2002y"TheTheory and Practice of Industrial Pharmacy",Lachman L, Lieberman H.And KanigJ.(Eds.),Lea&Febiger,Philadelphia(1986)。各自的描述通过引证结合于此并形成本公开的一部分。术语“药剂”、“药物组合物”和“药物制剂”可以互换使用。
根据本发明的药剂、药物组合物或治疗剂组合可以进一步包含一种或多种药用的赋形剂。适用于制备根据本发明的药剂、药物组合物或治疗剂组合的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员例如由"Handbook of Pharmaceutical Excipients"Sixth Edition,Raymond C.Rowe,Paul J.Sheskey and Marian E Quinn(Eds.),AmericanPharmaceutical Association(July 2009) 众所周知的，将其通过引证结合于此并形成本公开的一部分。
自身抗原
适合用于根据本发明的方法、组合物和试剂盒的自身抗原是β细胞自身抗原。
这些包括：谷氨酸脱羧酶(GAD65或GAD67或GAD32)(Baekkeskov et al.,Nature(1990)347:151)；胰岛素(Palmer et al.,Science(1983)222: 1337)：包括包含胰岛素B链的氨基酸9-23的B9-23肽(Daniel et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA(1995)93:956-960；Wong et al.,Nat.Med.(1999)5: 1026-1031)胰岛素原；包括包含横跨胰岛素原B-链C-肽结点的氨基酸 24-36的B24-C36肽(Chen et al.,J.Immunol.(2001)167:4926-4935；Rudyet al.,Mol.Med.,(1995)1:625-633)；HSP60(热休克蛋白60,Raz et al., Lancet(2001),358:1749-53)；ICA512/IA-2(胰岛细胞抗原512；Rabin et al.,J. Immunol.(1994)152:3183)、胰岛瘤抗原-2、ZnT8、胰岛特异性葡萄糖-6- 磷酸催化亚基相关蛋白(IGRP)、嗜铬粒蛋白A、B链胰岛素、前胰岛素原、胰岛素原II、不含细胞毒性T-淋巴细胞表位的胰岛素原肽、胰岛素 C13-A5肽、胰岛细胞抗原p69、或包含瓜氨酸化形式iDS的任何肽、衍生物以及对应以上的核苷酸。
对于物种之间的胰岛素序列的排列，参见Homann et al.,J.Immunol. (1999)63:1833-1838中的表I。
根据具体的实施方式，β细胞自身抗原是GAD，如GAD-65或GAD-67，包括它们的片段、它们的衍生物或编码它们的核酸。
根据更具体的实施方式，β细胞自身抗原是GAD-65、其片段、其衍生物或编码其的核酸。根据更具体的实施方式，β细胞自身抗原是GAD-65。根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是源自GAD-65的片段(即 GAD65片段。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是胰岛瘤抗原-2。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是ZnT8。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸催化亚单位相关蛋白质(IGRP)。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是嗜铬粒蛋白A。
根据某些其他的实施方式，β细胞自身抗原是胰岛素。
根据某些其他的实施方式，β细胞自身抗原是B链胰岛素。
根据某些其他的实施方式，β细胞自身抗原是胰岛素原。
根据某些其他的实施方式，β细胞自身抗原是前胰岛素原。
在本发明的某些方面，将耐受原给予至治疗的受试者。耐受原是诱导对随后攻击剂量(challenging dose)的抗原的特异性免疫学无响应的状态的抗原。用于本发明的合适的耐受原是可大量获得并暴露于免疫系统以及通常识别为自身的天生的内源人蛋白质和其他分子。耐受原的实例包括 IL-10、人血清白蛋白或血红蛋白或γ-氨基丁酸。
可以作为全长蛋白质给予用于本发明的自身抗原或耐受原，或可以可替换地作为这种全长蛋白质的片段或变体给予它们，条件是自身抗原的片段或变体具有相对于原始自身抗原保守的至少一种表位并且在根据本发明的方法中是有效的。
蛋白质自身抗原或耐受原的片段具有与原始的自身抗原或耐受原相同的序列，但是缺少至少一个N-端或C-端氨基酸残基。自身抗原的片段应该包含原始的自身抗原的至少一种有关的表位。自身抗原和耐受原优选地具有至少8个氨基酸、如至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、 90或100个氨基酸的长度。
蛋白质自身抗原或耐受原的变体可以具有与原始的自身抗原或耐受原小于100％一致、如99％、95％、90％、85％、80％、70％、60％或50％一致的氨基酸序列(如由蛋白质序列排列工具、例如由European Bioinformatics Institute,Hinxton,GB可获得的ClustalOmega比较的)，而对于自身抗原，同时具有相对于原始的自身抗原保守的至少一种有关表位。变体也可以具有与原始的抗原或耐受原相比更短(即片段)或更长的氨基酸序列。
在本发明中，自身抗原或耐受原的给予可以包括包含蛋白质或原始的蛋白质的肽片段的自身抗原或耐受原。还可以包括给予自身抗原或耐受原的变体。
进一步地，可以作为药用的载体中的蛋白质或肽将蛋白质或肽引入到受试者中，或蛋白质或肽可以由表达载体编码，其中引入表达载体(例如参见自体抗原在受试者中通过pCMV-表达载体表达的实施例)。这种表达载体可以是核酸，如DNA或RNA，并可以通过针头注射、基因枪、射流注射或借助于本领域已知的细胞转染剂递送。可以将核酸配制在盐水中、金珠上、脂质体中或脂质制剂中。关于经由它们的表达载体给予的自体抗原(以及可以给予的特定抗原)的进一步描述，参见美国专利公开US 2002/0107210，通过引证将其结合于此。
IL-10诱导化合物
在一些方面中，本发明的方法、组合物和试剂盒使用IL-10诱导化合物。
根据某些实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是维生素-D，如1,25- 二羟基维生素D。
根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是维生素-D类似物，如TX527。
根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物包括借助于 UVB辐射增加血清维生素D。
根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是酪氨酸激酶抑制剂，如达沙替尼、博舒体尼、塞卡替尼、伊马替尼、舒尼替尼或它们的组合。
根据具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是塞卡替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼、博舒替尼、塞卡替尼、伊马替尼和舒尼替尼中的至少两种的组合。例如，酪氨酸激酶抑制剂可以是达沙替尼和博舒替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和塞卡替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和伊马替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和塞卡替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和伊马替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼、博舒替尼和塞卡替尼的组合。
根据本发明的组合物可以包含多于一种IL-10诱导化合物。因此，根据某些实施方式，组合物包含至少两种IL-10诱导化合物。根据某些其他的实施方式，组合物包含至少三种IL-10诱导化合物。根据某些其他的实施方式，组合物包含至少四种IL-10诱导化合物。
环氧酶抑制剂
在一些方面，本发明的方法、组合物和试剂盒使用一种或多种环氧酶抑制剂。
这些环氧酶抑制剂可以是非甾体抗炎药物(NSAID)。根据更具体的实施方式，NSAID选自由以下组成的组：布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪、洛索洛芬、茚甲新、拖美汀、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸、萘丁美酮、阿斯匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳(Diflunisal，Dolobid)、水杨酸、双水杨酸(Salsalate，Disalcid)、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康、伊索昔康、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、罗美昔布、依托考昔和尼美舒利。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是丙酸衍生物，如布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪或洛索洛芬。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是乙酸衍生物，如茚甲新、拖美汀、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸或萘丁美酮。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是水杨酸化合物，如阿斯匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳(Diflunisal，Dolobid)、水杨酸或双水杨酸(Salsalate)。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是烯醇酸(昔康)衍生物，如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康或伊索昔康。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是邻氨基苯甲酸衍生物，如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸或托芬那酸。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是选择性的COX-2抑制剂，如塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、罗美昔布或依托考昔。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是布洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是右旋布洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是萘普生。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是非诺洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是酮洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是右旋酮洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是氟比洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是奥沙普嗪。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是洛索洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是茚甲新。
布洛芬主要阻碍cox-2但是在一定程度上也阻碍cox-1。布洛芬具有比较窄的IL-1阻碍剂稍微广泛的对免疫系统的影响，并具有非常明确的抗炎效果而没有没有严重风险。使用布洛芬减少β细胞炎症并使得能够增加 Vit D增强的DC以诱导对来自T-细胞呈递的自身抗原的肽的耐受度，从而保护受试者的β细胞。
CTLA4化合物
在一些方面中，本发明的组合物和试剂盒使用CTLA-4化合物，如细胞毒性T-淋巴细胞相关的抗原4免疫球蛋白。
根据更具体的实施方式，CTLA-4化合物是阿巴西普。
阿巴西普(Fc修饰的CTLA4免疫球蛋白)是由人CTLA4的细胞外部分和人IgGl的重链组成的去除T细胞的、免疫调制的融合蛋白。其阻碍幼稚T细胞的活化中涉及的共刺激信号。其与APC上的CD80/86的连接还干扰和减少CD80/86诱导的IL-6，这可以下调炎性细胞因子如IL-lβ、 IFNγ和IL-17。阿巴西普与CD80/86的进一步的连接可以诱导APC中的吲哚胺双加氧酶(IDO)，其进而可以诱导T细胞中的无免疫性，以及通过活化的T细胞下调幼稚T细胞的旁分泌活化。在B细胞上表达的 CD80/86也可以是另外的路径，其中阿巴西普可以执行免疫调制功能。
TNFα抑制剂
在一些方面，本发明的方法、组合物和试剂盒使用TNFα抑制剂，如阿达木单抗、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗或英利西单抗。根据更具体的实施方式，TNFα抑制剂是阿达木单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是赛妥珠单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是依那西普。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是戈利木单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是英利西单抗。
试剂盒
本发明还提供了涉及本发明的方法的试剂盒。例如，在一方面，试剂盒可以包含：(a)抗炎化合物；(b)自身抗原；和(c)维生素D以及可选地d)本发明的方案的说明书。
本发明还公开了包含以下的药物试剂盒：
i)包含β细胞自身抗原的组合物，和以下各项中的至少一种：
iia)包含选自由维生素-D、维生素-D类似物、酪氨酸激酶抑制剂、γ- 氨基丁酸和γ-氨基丁酸类似物组成的组的IL-10诱导化合物的组合物；和
iib)包含降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如环氧酶抑制剂、CTLA-4化合物或TNFα抑制剂的组合物。
本发明还公开了包含以下的药物试剂盒：
i)包含β细胞自身抗原的组合物，和以下各项中的至少一种：
iia)包含选自由维生素-D、维生素-D类似物、酪氨酸激酶抑制剂、γ- 氨基丁酸、和γ-氨基丁酸类似物组成的组的IL-10诱导化合物的组合物；和
iib)包含降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如环氧酶抑制剂、CTLA-4化合物或TNFα抑制剂的组合物。
本发明还公开了包含以下各项中的至少两种的组合物：
i)至少一种抗原或其片段；或编码与本文所列的组中的自身免疫和炎性疾病中的至少一种有关的这种分子的核酸；以及
ii)选自组：如1,25-二羟基维生素D的维生素-D的至少一种IL-10 诱导化合物。根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是维生素-D类似物，如TX527。根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是酪氨酸激酶抑制剂，如达沙替尼、博舒体尼、塞卡替尼、伊马替尼、舒尼替尼或它们的组合；以及
iii)降低免疫系统的活化幼稚TC和BC以及由活化的和记忆淋巴细胞回忆响应的能力的至少一种化合物，如本文所列的COX-抑制剂； CTLA-4化合物；或TNFα抑制剂)；
在制造包含至少两种药物组合物(即药剂)的试剂盒的制造中的用途。
至少两种药物组合物中的一种可以包含作为血管注射剂配制在预填充的小瓶或注射器中的alum、盐水或人血清白蛋白中至少一种抗原，并且至少两种药物组合物中的另一种可以包含以用于口腔给予的片剂形式的 IL-10诱导化合物。
本发明的一些实施方式提供了包含至少两种药物组合物的试剂盒，包含：i)选自本文所列的组的至少一种抗原，和ii)降低树突状细胞的活化幼稚淋巴细胞或回忆活化的或记忆淋巴细胞的能力的选自以下组的至少一种化合物：COX-抑制剂；CTLA-4化合物；和TNFα抑制剂。作为实例，至少两种药物组合物中的一种可以包含作为血管注射剂配制在预填充的小瓶或注射器中的alum、盐水或人血清白蛋白中的至少一种抗原，并且至少两种药物组合物中的另一种可以包含选自组COX抑制剂；CTLA-4 化合物；和TNFα抑制剂的一种化合物。
本发明的一些实施方式提供了包含至少三种药物组合物的试剂盒，包含：i)选自本文所列的组的至少一种抗原；ii)选自由维生素-D、维生素 -D类似物和酪氨酸激酶抑制剂组成的组的至少一种IL-10诱导化合物，和 iii)降低树突状细胞的活化幼稚淋巴细胞或回忆活化的或记忆淋巴细胞的能力的选自以下组的至少一种化合物：COX-抑制剂；CTLA-4化合物；和 TNFα抑制剂。作为实例，至少三种药物组合物中的一种可以包含作为血管注射剂配制在预填充的小瓶或注射器中的alum、盐水或人血清白蛋白中的至少一种抗原，并且至少三种药物组合物中的另一种可以包含选自由维生素-D、维生素-D类似物、γ-氨基丁酸、γ-氨基丁酸类似物和酪氨酸激酶抑制剂组成的组的至少一种IL-10诱导化合物，并且至少三种药物组合物中的第三种可以包含选自组COX-抑制剂；CTLA-4化合物；和TNFα抑制剂的一种化合物。
医疗用途
本发明的组合物可以用于治疗，特别是预防和/或治疗自身免疫性疾病。因此，本发明的组合物可以是药物组合物。
根据某些实施方式，该组合物用于用作药剂，如用于预防和/或治疗自身免疫性疾病。
根据具体的实施方式，该组合物用于预防和/或治疗1型糖尿病，如1 型。
根据其他具体的实施方式，该组合物用于预防和/或治疗自身免疫糖尿病。
根据其他具体的实施方式，该组合物用于预防和/或治疗隐性自身免疫糖尿病。
根据又其他的具体的实施方式，该组合物用于预防和/或治疗自身免疫糖尿病的复发，如已经经受胰岛细胞移植或包括干细胞治疗的其他细胞治疗的自身免疫糖尿病个体(例如人类)中的自身免疫糖尿病的复发。
本发明在进一步的方面提供了与至少一种IL-10诱导化合物组合的自身抗原用于预防和/或治疗自身免疫性疾病。
更具体地，本发明提供了选自由胰岛素、B链胰岛素、胰岛素原和β细胞自身抗原组成的组的自身抗原，结合至少一种IL-10诱导化合物、如选自由维生素-D、维生素-D类似物和酪氨酸激酶抑制剂组成的组的至少一种IL-10诱导化合物用于预防和/或治疗自身免疫性疾病。
根据某些实施方式，自身抗原是β细胞自身抗原，如谷氨酸脱羧酶 (GAD)、胰岛瘤抗原-2、ZnT8、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸催化亚单位相关蛋白质(IGRP)或嗜铬粒蛋白A。
根据具体的实施方式，β细胞自身抗原是GAD，如GAD-65，包括其片段、其衍生物或编码其的核酸。
根据更具体的实施方式，β细胞自身抗原是GAD-65、其片段、其衍生物或编码其的核苷酸。根据更具体的实施方式，β细胞自身抗原是 GAD-65。根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是源自GAD-65的片段(即GAD65片段。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是胰岛瘤抗原-2。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是ZnT8。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸催化亚单位相关蛋白质(IGRP)。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是嗜铬粒蛋白A。
根据某些实施方式，自身抗原是胰岛素。
根据某些其他的实施方式，β细胞自身抗原是B链胰岛素。
根据某些其他的实施方式，自身抗原是胰岛素原。
根据某些实施方式，将自身抗原配制在佐剂中。
根据具体的实施方式，佐剂是alum。
根据某些实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是维生素-D，如1,25- 二羟基维生素D。
根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是维生素-D类似物，如TX527。
根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是酪氨酸激酶抑制剂，如达沙替尼、博舒体尼、塞卡替尼、伊马替尼、舒尼替尼或它们的组合。
根据具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是塞卡替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼、博舒替尼、塞卡替尼、伊马替尼和舒尼替尼中的至少两种的组合。例如，酪氨酸激酶抑制剂可以是达沙替尼和博舒替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和塞卡替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和伊马替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和塞卡替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和伊马替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼、博舒替尼和塞卡替尼的组合。
根据某些实施方式，将自身抗原进一步与降低树突状细胞的活化幼稚 CD4+T细胞的能力的化合物如环氧酶抑制剂、CTLA-4化合物或TNFα抑制剂组合使用。
根据具体的实施方式，这种化合物是环氧酶抑制剂，如非类固醇抗炎药物(NSAID)。根据更具体的实施方式，NSAID选自由以下组成的组：布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪、洛索洛芬、茚甲新、拖美汀、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸、萘丁美酮、阿斯匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳(Diflunisal，Dolobid)、水杨酸、双水杨酸(Salsalate，Disalcid)、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康、异恶噻酰胺、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、罗美昔布、依托考昔和尼美舒利。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是丙酸衍生物，如布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪或洛索洛芬。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是乙酸衍生物，如茚甲新、拖美汀、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸或萘丁美酮。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是水杨酸化合物，如阿斯匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳(Diflunisal，Dolobid)、水杨酸或双水杨酸(Salsalate)。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是烯醇酸(昔康)衍生物，如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康或依索昔康。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是邻氨基苯甲酸衍生物，如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸或托芬那酸。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是选择性的COX-2抑制剂，如塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、罗美昔布或依托考昔。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是布洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是右旋布洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是萘普生。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是非诺洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是酮洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是右旋酮洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是氟比洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是奥沙普嗪。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是洛索洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是茚甲新。
根据其他具体的实施方式，这种化合物是CTLA-4化合物，如细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白。
根据更具体的实施方式，CTLA-4化合物是阿巴西普。
根据其他具体的实施方式，这种化合物是TNFα抑制剂，如阿达木单抗、赛妥珠单抗、依那单抗、戈利木单抗或英利西单抗。根据更具体的实施方式，TNFα抑制剂是阿达木单抗。根据其他更具体的实施方式，TNF α抑制剂是赛妥珠单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是依那单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是戈利木单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是英利西单抗。
根据其他具体的实施方式，自身抗原用于预防和/或治疗隐性自身免疫糖尿病，如GAD-抗体阳性个体中的隐性自身免疫糖尿病。
根据具体的实施方式，自身免疫性疾病是1型糖尿病。
根据其他具体的实施方式，自身免疫性疾病是自身免疫糖尿病。
根据其他具体的实施方式，自身免疫性疾病是隐性自身免疫糖尿病。
根据其他具体的实施方式，自身免疫性疾病是自身免疫糖尿病的复发，如已经经受胰岛细胞移植或包括干细胞治疗的其他细胞治疗的患有自身免疫糖尿病的个体(例如人类)中的自身免疫糖尿病的复发。
因此，本发明提供了包含至少一种自身抗原和至少一种IL-10诱导化合物的组合(例如治疗剂组合)。
更具体地，本发明提供了包含以下的组合(例如治疗剂组合)：i)选自由胰岛素、B链胰岛素、胰岛素原和β细胞自身抗原组成的组的至少一种自身抗原，和ii)选自由维生素-D、维生素-D类似物和酪氨酸激酶抑制剂组成的组的至少一种IL-10诱导化合物。
根据某些实施方式，至少一种自身抗原是β细胞自身抗原，如谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛瘤抗原-2、ZnT8、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸催化亚单位相关蛋白质(IGRP)或嗜铬粒蛋白A。
根据具体的实施方式，β细胞自身抗原是GAD，如GAD-65，包括其片段、其衍生物或编码其的核酸。
根据更具体的实施方式，β细胞自身抗原是GAD-65、其片段、其衍生物或编码其的核苷酸。根据更具体的实施方式，β细胞自身抗原是 GAD-65。根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是源自GAD-65的片段(即GAD65片段。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是胰岛瘤抗原-2。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是ZnT8。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸催化亚单位相关蛋白质(IGRP)。
根据其他具体的实施方式，β细胞自身抗原是嗜铬粒蛋白A。
根据某些其他的实施方式，至少一种自身抗原是胰岛素。
根据某些其他的实施方式，至少一种自身抗原是B链胰岛素。
根据某些其他的实施方式，至少一种自身抗原是胰岛素原。
根据本发明的组合物可以包含多于一种自身抗原。因此，根据某些实施方式，组合包含至少两种自身抗原。根据某些其他的实施方式，组合包含至少三种自身抗原。根据某些其他的实施方式，组合包含至少四种自身抗原。
因此，根据具体的实施方式，组合包含至少如GAD-65的GAD和胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少胰岛瘤抗原-2和胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少ZnT8和胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少IGRP和胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少嗜铬粒蛋白A和胰岛素。
根据其他具体的实施方式，组合包含至少如GAD-65的GAD和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少胰岛瘤抗原-2和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少ZnT8和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少IGRP和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少嗜铬粒蛋白A和B链胰岛素。
根据其他具体的实施方式，组合包含至少如GAD-65的GAD和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合包含至少胰岛瘤抗原-2和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合包含至少ZnT8和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合包含至少IGRP和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合包含至少嗜铬粒蛋白A和胰岛素原。
根据其他具体的实施方式，组合包含至少胰岛素和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少胰岛素和胰岛素原。根据其他具体的实施方式，组合包含至少B链胰岛素和胰岛素原。
根据具体的实施方式，组合包含至少如GAD-65的GAD和B链胰岛素。根据其他具体的实施方式，组合包含至少如GAD-65的GAD、胰岛素和胰岛素原。根据又其他具体的实施方式，组合包含至少如GAD-65的 GAD、B链胰岛素和胰岛素原。根据又其他具体的实施方式，组合包含至少胰岛素、B链胰岛素和胰岛素原。
根据其他具体的实施方式，组合包含如GAD-65的GAD、胰岛素、B 链胰岛素和B链胰岛素。
根据某些实施方式，将至少一种自身抗原，如至少两种自身抗原或至少三种自身抗原配制在佐剂中。
根据具体的实施方式，佐剂是alum。
根据某些实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是维生素-D或维生素 -D类似物。根据具体的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是维生素-D。
根据更具体的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是1,25-二羟基维生素D。
根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是维生素-D类似物，如TX527。
根据某些其他的实施方式，至少一种IL-10诱导化合物是酪氨酸激酶抑制剂，如达沙替尼、博舒体尼、塞卡替尼、伊马替尼、舒尼替尼或它们的组合。
根据具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是塞卡替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。
根据其他具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼、博舒替尼、塞卡替尼、伊马替尼和舒尼替尼中的至少两种的组合。例如，酪氨酸激酶抑制剂可以是达沙替尼和博舒替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和塞卡替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和伊马替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和塞卡替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和伊马替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼和舒尼替尼的组合。根据其他更具体的实施方式，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼、博舒替尼和塞卡替尼的组合。
根据本发明的组合可以包含多于一种IL-10诱导化合物。因此，根据某些实施方式，组合包含至少两种IL-10诱导化合物。根据某些其他的实施方式，组合包含至少三种IL-10诱导化合物。根据某些其他的实施方式，组合包含至少四种IL-10诱导化合物。
因此，根据具体的实施方式，组合包含至少维生素-D和酪氨酸激酶抑制剂。根据其他具体的实施方式，组合包含至少维生素-D类似物和酪氨酸激酶抑制剂。
根据更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D和达沙替尼。根据其他更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D和博舒体尼。根据其他更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D和塞卡替尼。根据其他更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D和伊马替尼。根据其他更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D和舒尼替尼。
根据更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D类似物和达沙替尼。根据其他更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D类似物和博舒替尼。根据其他更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D类似物和塞卡替尼。根据其他更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D类似物和伊马替尼。根据其他更具体的实施方式，组合包含至少维生素-D类似物和舒尼替尼。
根据某些实施方式，组合进一步包含iii)降低树突状细胞的活化幼稚 CD4+T细胞的能力的化合物，如环氧酶抑制剂、CTLA-4化合物或TNFα抑制剂。
根据具体的实施方式，这种化合物是环氧酶抑制剂，如非甾体抗炎药物(NSAID)。根据更具体的实施方式，NSAID选自由以下组成的组：布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪、洛索洛芬、茚甲新、拖美汀、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸、萘丁美酮、阿斯匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳(Diflunisal， Dolobid)、水杨酸、双水杨酸(Salsalate，Disalcid)、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康、异恶噻酰胺、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、罗美昔布、依托考昔和尼美舒利。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是丙酸衍生物，如布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪或洛索洛芬。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是乙酸衍生物，如茚甲新、拖美汀、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸或萘丁美酮。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是水杨酸酯，如阿斯匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳(Diflunisal，Dolobid)、水杨酸或双水杨酸(Salsalate)。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是烯醇酸(昔康)衍生物，如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康或依索昔康。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是邻氨基苯甲酸衍生物，如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸或托芬那酸。
根据某些实施方式，环氧酶抑制剂是选择性的COX-2抑制剂，如塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、罗美昔布或依托考昔。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是布洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是右旋布洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是萘普生。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是非诺洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是酮洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是右旋酮洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是氟比洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是奥沙普嗪。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是洛索洛芬。
根据更具体的实施方式，环氧酶抑制剂是茚甲新。
根据其他具体的实施方式，这种化合物是CTLA-4化合物，如细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白。
根据更具体的实施方式，CTLA-4化合物是阿巴西普。
根据其他具体的实施方式，这种化合物是TNFα抑制剂，如阿达木单抗、赛妥珠单抗、依那单抗、戈利木单抗或英利西单抗。根据更具体的实施方式，TNFα抑制剂是阿达木单抗。根据其他更具体的实施方式，TNF α抑制剂是赛妥珠单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是依那单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是戈利木单抗。根据其他更具体的实施方式，TNFα抑制剂是英利西单抗。
本发明的组合可以用于治疗，特别是预防和/或治疗自身免疫性疾病。因此，本发明的组合可以是治疗剂组合。
根据某些实施方式，该组合用于用作药剂，如用于预防和/或治疗自身免疫性疾病。
根据具体的实施方式，该组合用于预防和/或治疗1型糖尿病。
根据其他具体的实施方式，该组合用于预防和/或治疗自身免疫糖尿病。
根据其他具体的实施方式，该组合用于预防和/或治疗隐性自身免疫糖尿病。
根据又其他的具体的实施方式，该组合用于预防和/或治疗自身免疫糖尿病的复发，如已经经受胰岛细胞移植或包括干细胞治疗的其他细胞治疗的自身免疫糖尿病个体(例如人类)中的自身免疫糖尿病的复发。
本发明在进一步的方面中提供了包含以下的组合物或组合在药剂的制造中的用途：i)至少一种自身抗原，如以上详细描述的至少一种自身抗原，ii)至少一种IL-10诱导化合物，如以上详细描述的至少一种IL-10，和可选地iii)降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如以上详细描述的降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物。
本发明在进一步的方面提供了用于在需要其的个体中预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括将至少一种自身抗原，如以上详细描述的至少一种自身抗原给予至所述个体；以及将至少一种IL-10诱导化合物，如以上详细描述的至少一种IL-10给予至所述个体。
根据某些实施方式，该方法进一步包括给予所述个体降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如以上详细描述的降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物。
根据某些实施方式，根据本发明的待治疗的个体是哺乳动物。
根据具体的实施方式，根据本发明的待治疗的个体是人类。
根据某些实施方式，根据本发明的待治疗的个体是成人。
根据具体的实施方式，根据本发明的待治疗的个体是成年人类。
根据本发明的药剂、药物组合物或治疗剂组合可以是适合施加至人类和/或动物、优选地包括婴儿、儿童和成人的人类的任何形式，并且可以通过本领域技术人员已知的标准流程来生产。可以通过本领域技术人员已知的，例如来自以下的目录的标准流程生产药剂、(药物)组合物或治疗剂组合："Pharmaceutics:The Science of Dosage Forms",Second Edition,Aulton, M.E.(ED.Churchill Livingstone,Edinburgh(2002)；"Encyclopedia of Pharmaceutical Technology",Second Edition,Swarbrick,J.andBoylan J.C. (Eds.),Marcel Dekker,Inc.New York(2002)；"Modern Pharmaceutics",Fourth Edition,Banker G.S.and Rhodes C.T.(Eds.)Marcel Dekker,Inc.New York2002y"The Theory and Practice of Industrial Pharmacy",Lachman L., LiebermanH.And Kanig J.(Eds.),Lea&Febiger,Philadelphia(1986)。各自的描述通过引证结合于此并形成本公开的一部分。术语“药剂”、“药物组合物”和“药物制剂”可以互换使用。
本发明的药物组合物可以是例如非肠道给予的，包括肌内、腹膜内、或静脉内注射、跨粘膜或舌下施加；或口腔，包括作为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、锭剂、水溶液或油溶液、悬浮液、乳液、喷雾或作为用液体介质重组的干燥粉末形式给予。
同样，根据本发明使用的至少一种自身抗原可以是例如非肠道给予的，包括肌内、腹膜内、或静脉内注射、跨粘膜或舌下应用；或口腔，包括作为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、锭剂、水溶液或油溶液、悬浮液、乳液、喷雾或作为用液体介质重组的干燥粉末形式给予。
同样，根据本发明使用的至少一种IL-10诱导化合物可以是例如非肠道给予的，包括肌内、腹膜内、或静脉内注射、跨粘膜或舌下应用；或口腔，包括作为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、锭剂、水溶液或油溶液、悬浮液、乳液、喷雾或作为用液体介质重组的干燥粉末形式给予。
同样，本发明的治疗剂组合可以是例如非肠道给予的，包括肌内、腹膜内、或静脉内注射、跨粘膜或舌下应用；或口腔，包括作为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、锭剂、水溶液或油溶液、悬浮液、乳液、喷雾或作为用液体介质重组的干燥粉末形式给予。
根据某些实施方式，腹股沟内给予至少一种自身抗原。
根据某些其他的实施方式，皮内或皮下(如接近胰腺引流淋巴结的腹部)给予至少一种自身抗原。根据具体的实施方式，皮内给予至少一种自身抗原。根据其他具体的实施方式，皮下给予至少一种自身抗原。
根据本发明的药剂、药物组合物或治疗剂组合可以进一步包含一种或多种药用的赋形剂。
适用于制备根据本发明的药剂、药物组合物或治疗剂组合的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员由例如"Handbook of Pharmaceutical Excipients"Sixth Edition,Raymond C.Rowe,Paul J.Sheskey and Marian E Quinn(Eds.),AmericanPharmaceutical Association(July 2009)众所周知的，通过引证将其结合于此并形成本公开的一部分。
可以同时或单独地给予至少一种自身抗原和至少一种IL-10诱导化合物。根据某些实施方式，同时给予至少一种自身抗原和至少一种IL-10诱导化合物。根据某些实施方式，单独给予至少一种自身抗原和至少一种 IL-10诱导化合物。
根据某些实施方式，在给予至少一种自身抗原之前给予至少一种 IL-10诱导化合物。根据具体的实施方式，在第一次给予至少一种自身抗原之前至少一天、如至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天或至少一周，给予至少一种IL-10诱导化合物。因此，根据这样的实施方式，在第一次给予至少一种自身抗原之前至少一天、如至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天或至少一周开始IL-10诱导化合物的疗程。
根据更具体的实施方式，在第一次给予至少一种自身抗原之前至少一周、如至少两周给予至少一种IL-10诱导化合物。因此，根据这样的实施方式，在第一次给予至少一种自身抗原之前至少一周、如至少两周开始 IL-10诱导化合物的疗程。
可以与至少一种自身抗原和/或至少一种IL-10诱导化合物同时或单独地给予降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物。根据某些实施方式，同时给予CTLA-4化合物与至少一种自身抗原。根据某些其他的实施方式，单独地给予降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物与至少一种自身抗原。
根据某些实施方式，同时给予至少一种IL-10诱导化合物和降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物。根据某些实施方式，单独给予至少一种IL-10诱导化合物和降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T 细胞的能力的化合物。
根据具体的实施方式，在至少一种自身抗原的第一次给予的时间左右 +/-7天给予降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物，如例如10mg/kg阿巴西普。
根据某些实施方式，视情况在第14、28和45天+/-一周重复至少一种自身抗原的给予和降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T细胞的能力的化合物的给予以确保阻碍T细胞上的CD28。
根据某些实施方式，每治疗时机给予至少一次可选地配制在alum中的2-20ug剂量的GAD，如GAD-65。
根据某些实施方式，每治疗时机给予至少一次1000-2000IU维生素D，如维生素D3。
根据某些实施方式，通过在第一次给予至少一种自身抗原之前每周给予7,000-70,000IU之间的维生素D(如维生素D3)持续1-10周之间以及在最后一次给予至少一种自身抗原之后持续4周使APC更耐受。
根据某些实施方式，在每次给予降低树突状细胞的活化幼稚CD4+T 细胞的能力的化合物之后的大约一周进行可选地配制在alum中的GAD (如GAD-65)的给予。
根据某些实施方式，每治疗时机给予至少一次400mg剂量的NSAID，如布洛芬。
本发明假设分子生物学领域的普通技术人员众所周知的包括用于操作多核苷酸的技术的常规分子生物学方法的理解。在Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2ndEdition,Sambrook et al.,Cold Spring Harbor,N.Y. (1989)中可以找到这种众所周知的技术的实例。常规的分子生物学技术的实例包括但不限于体外连接、限制性核酸内切酶酶切、PCR、细胞转化、杂交、电泳、DNA测序等。
本发明还假设免疫学领域的普通技术人员众所周知的常规的免疫生物学方法的理解。在Current Protocols in Immunology,editors Bierer et al.,4 volumes,JohnWiley&Sons,Inc.中可以找到基本的信息和方法，其包括关于以下的教导：实验室动物的护理和处理、免疫响应的诱导、淋巴细胞功能的体外试验、淋巴细胞功能的体内试验、免疫荧光和细胞分选、细胞因子和它们的细胞受体、人类中的免疫学研究、蛋白质、肽的分离和分析、分子生物学、细胞活化、互补的生物化学、先天免疫、自身免疫和炎性疾病的动物模型(其包括关于NOD小鼠模型、SLE小鼠模型(针对狼疮) 以及通过调节T细胞的消除的自身免疫疾病的诱导的章节)、抗原加工和呈递、工程免疫分子和受体、免疫系统中的配体-受体相互相用、显微术、以及常用的免疫系统基因和蛋白质的缩写和专业词汇，包括白细胞表面分子的CD系统。
实施例
以下实施例公开了可以进行以建立本发明的各个方面的安全性和疗效的研究。用于实施例的β细胞自身抗原是谷氨酸脱羧酶(GAD)，且其可以被本文所描述的任何其他的β细胞自身抗原替换。
实施例1
患有近期发作的1型糖尿病的患者的临床试验，研究设计：
该研究是4臂、随机、双盲、安慰剂对照、多中心的临床试验。
臂A中的患者每天早上口腔接受每天400mg布洛芬持续90天。从第 1天，在15个月期间患者还口腔接受每天2000IU维生素D(即每天25 滴)，以及在初免-加强(prime-and-boost)方案的第15和45天在腹部区域接受2次20μg
Figure BDA0001217233570000474
(基于GAD的糖尿病治疗)的皮下注射。
臂B在15个月期间口腔接受每天2000IU维生素D(即每天25滴)，以及在初免-加强方案的第15和45天接受2次20μg Diamyd的皮下注射。
臂C在15个月期间口腔接受每天2000IU维生素D(即每天25滴)，并在初免-加强方案的第15和45天在两个不同的部位接受2次20μg Diamyd皮下注射(每时机总共给予40μgDiamyd)。
臂D接受安慰剂。
将随访患者总共30个月，其中6个月的盲法研究周期。
治疗组的描述：
在开始治疗之前2至4周的筛选探视(第1次探视)中评价患者的资格。在第2次探视(第1天，基准线)时将有资格研究的患者随机分到4 治疗组的一个中：
指定15个患者接受作为口服悬浮液的布洛芬；从第1至90天每天早上400mg，以及从第1至450天还接受每天2000IU(即每天25滴) 维生素D口服滴剂。另外，各自在第15和45天(即初免和加强给药)在腹部区域的两个不同部位用20μg Diamyd且处用安慰剂皮下注射1次(提供总共40μg Diamyd的剂量)。
指定15个患者从第1至90天每天早上接受作为口服悬浮液的安慰剂以及从第1至450天还接受每天2000IU(即每天25滴)维生素D口服滴剂。另外，各自在第15和45天(即初免和加强给药)在腹部区域的两个不同部位用20μg Diamyd且一处用安慰剂皮下注射1次(提供总共40 μg Diamyd的剂量)。
指定15个患者从第1至90天每天早上接受作为口服悬浮液的安慰剂以及从第1至450天还接受每天2000IU(即每天25滴)维生素D口服滴剂。另外，各自在第15和45天(即初免和加强给药)在腹部区域的两个不同部位用20μg Diamyd皮下注射2次(提供总共80μgDiamyd的剂量)。
指定15个患者接受从第1至90天每天早上的作为口服悬浮液的安慰剂以及从第1至450天的安慰剂口服滴剂，且各自在第15和45天的2 次安慰剂注射(在腹部区域的两个不同部位给予)。
疗效变量：
主要和次要疗效终点包括
·效在MMTT期间的C-肽变化(90分钟值和AUC平均值0-120min)。
具有0.2nmol/L以上的刺激的最大C-肽水平的患者的比例
·患生物标记，机械数据。
·机基准线和6个月之间的空腹C-肽变化。
安全性变量：
安全评估包括观察注射部位的反应、GAD65Ab效价、不利现象(AE) 的出现、实验室测量、生命指征、神经学评估和受限的身体检查。
来自完成6个月研究的20个患者的结果示出与安慰剂治疗的组相比，对于接受包括diamyd的治疗的患者组看到改善的β细胞功能。
Figure BDA0001217233570000491
实施例2
通过给予GAD-抗原
Figure BDA0001217233570000492
治疗至淋巴结在近期发作的1型糖尿病成人中保持剩余的胰岛素分泌功能的先导试验。(DIAGNODE)
1.1背景和基本原理
全世界儿童中1型糖尿病(T1D)的发病率在瑞典仅次于最高的芬兰，并且正在迅速升高。T1D到目前为止在我国儿童和青少年中是最常见的慢性、严重的、威胁生命的疾病，并且1型糖尿病的发病率在年轻成人中也较高。该疾病趋向于变为非常严重的全球问题。该疾病的特征在于缺少胰岛素。即使若干患者在诊断时具有相当可观的剩余β细胞功能(1)，但是缺乏很快变得非常明显并最终变得完全缺乏(2,3)。剩余的胰岛素分泌是至关重要的。在很少的情况下，β细胞功能在诊断之后不久改善很多使得葡萄糖代谢正常且暂时不需要胰岛素，即患者得到所谓的完全缓解(4)。只要患者完全缓解，则不需要积极治疗，更可能的是一些关于体育运动和饮食的良好生活方式的叮嘱。没有症状、没有急性并发症且如果该人保持完全缓解，则不太可能这样的个体将再发展晚期并发症。葡萄糖或脂质代谢的轻微异常可能以与对于患有化学性糖尿病或受损的葡萄糖耐受的个体相同的方式增加大血管并发症的风险。完全缓解是罕见的，但是部份缓解不是(4)。在这期间，患者通常具有接近正常的血糖值，甚至没有轻微的低血糖且没有酮酸中毒的事件。因为患者感觉良好，所以生活质量非常好，儿童正常成长，需要很少关于食物的限制(如果有的话)，患者可以在不变得低血糖的情况下多加锻炼，并经受非常好的家庭血糖测试。仅一些剩余的胰岛素分泌功能即足以减少酮酸中毒的风险(5)。此外，在DCCT 试验中已经示出即使非常少的剩余胰岛素分泌功能(对β细胞刺激的响应，其中血清C肽>0.20pmol/ml)在并发症的预防中也起到重要作用(6)。该效果可能是由于剩余的胰岛素分泌使得更容易达到良好的血糖平衡的事实，但是还可能的是C肽本身具有生理功能。事实上已经报告了C肽影响血管通透性，减少视网膜血管渗漏，以及尤其对神经功能具有积极影响 (7)，尽管C-肽本身的效果仍受到争论。
1.1.1影响自然进程的因素
在T1D的诊断时，已经声称胰腺中β细胞的80-90％已经破坏。然而，对于其的证据不足，并且完全可能的是主要问题是功能退化。此外，患者之间存在很大差异，因为一些具有非常良好的剩余胰岛素分泌功能，而其他人没有。诊断之后不久，尤其当给予积极的胰岛素治疗时，存在C-肽产生的增加以及同时胰岛素敏感度的改善。良好的代谢控制似乎改善β细胞的环境和代谢并保持β细胞功能，这进而有利于更好的代谢控制，反之亦然。自身免疫过程的强度起到作用，并且看起来明显的是儿童具有比1型糖尿病的成人更具攻击性的免疫过程，但是仍难以预测该进程。一些研究提出高浓度的自身抗体伴随着胰岛素分泌功能的更迅速的损失，而其他的研究没有发现这种关系，或甚至相反。迄今为止没有证明细胞介导的免疫的特殊标志来预测β细胞损失，但是我们自己的研究示出该疾病过程与免疫系统的T-辅助细胞-1(Th-1)的偏差与某些细胞因子如IFNg的增加和 IL-10、IL-13的减少有关。
胰岛素治疗对β细胞功能的影响。
疾病的第一周期过程中的活性胰岛素治疗延长了长时间以前的部分缓解，且通过改善的剩余胰岛素分泌功能(2)可以确认和验证该发现。强化的治疗似乎将剩余的β细胞功能改善至少一段时间(8)，但是其还可以具有长期的积极效果(9)。已经示出积极治疗不仅预防或推迟实验动物的糖尿病，而且研究指出这种治疗可以预防高风险个体中的糖尿病(10)。然而，当在糖尿病预防试验中以较大规模尝试时，非肠道的胰岛素治疗没有预防糖尿病(11)。胰岛素的口腔治疗可能具有效果(12)，因此需要进一步研究。
1.1.2干预
在1970年代，变得清楚的是T1D是自身免疫性疾病，并因此尝试了免疫干预。我们进行了全世界的第一次对糖尿病儿童的免疫干预研究，此时我们在30年前已经在新诊断的儿童和青少年中使用了血浆置换法，具有一些积极效果(13)。治疗的副作用是在血浆中发现了具有64kD重量的新蛋白质(14)，之后示出其是谷氨酸脱羧酶(GAD)。被当做是免疫干预的构思的证据的突破是环孢菌素，其毫无疑问地减缓自身免疫破坏过程和给出改善的剩余的胰岛素分泌功能，而其他使用免疫抑制的试验具有很少的效果，尤其在儿童中(15,16,17)或示出过于严重的不利现象或风险 (18,19)。在调制免疫系统的努力中，我们使用了光分离置换法 (photopheresis)。尽管在双盲安慰剂对照试验中表明了对免疫系统的明显效果(20)，但是临床效果很小且几乎观察不到剩余的β细胞功能的改善 (21)。因此，在免疫干预没有成功的情况下，我们的兴趣指向了没有或具有瞬时效果的保护试剂如烟酰胺和二氮嗪(22,23,24)。
随着对导致β细胞破坏的免疫过程的越来越多的认识，变得可以更精确地引导免疫干涉来靶向重要的T细胞。在阻碍破坏性免疫过程的尝试中已经进行了使用抗-CD3抗体的有希望的研究。来自北美和法国的使用抗 -CD3的试验的结果示出可以阻碍破坏性自身免疫过程且从而至少推迟β细胞功能的下降(25,26)。剩余的胰岛素分泌功能的下降显著减缓，但是不幸地，看起来好像下降仅推迟一年，而此后下降的C-肽曲线与安慰剂组的下降曲线平行。此外，大部分的患者经历了一些细胞因子释放综合症 (CRS)，这可能是十分严重的，并且另外，在大部分的患者中看到了许多副作用。我们参与了两个近期的III期试验(Protegé试验)中的一个，尽管具有最强治疗的臂确实示出剩余的胰岛素分泌功能的一些保持且降低胰岛素需求以达到良好的HbAlc，但是其没有成功达到主要终点(27； Sherry,Hagopian,Ludvigsson et al Lancet 2011)。需要新的研究，但是难以相信仅这类治疗将是用于通常的临床用途的可接受的解决方案。作为从未发展过糖尿病的其他健康个体的预防治疗来接受这种治疗甚至是不太可能的。
1.1.3使用自身抗原的免疫疗法
在过敏性疾病的治疗中，在许多年期间已经有效地使用了具有少量疾病特异性抗原的免疫治疗。尽管已经提出了免疫响应的免疫调制和调节细胞的诱导，但是这种治疗的机制仍是不清楚的。在自身免疫性疾病中，这种治疗还没有成功，但是应该尝试(28)。糖尿病倾向动物中的实验示出通过热休克蛋白质的治疗可以延迟或推迟糖尿病的发展。在成人的研究中使用Diapep277肽示出在几乎没有任何不良事件的情况下胰岛素分泌功能的显著保持(29)。然而，之后在患T1D儿童和青少年中的试验(30)没有示出效果。在所谓的LADA(成人中的隐性自身免疫糖尿病)中使用 Diapep277治疗的研究正在进行，且初步结果(IDF,Dubai Dec 2011报告的和ADA June 2012报告的)指出用Diapep277治疗可以保持患轻度1型糖尿病成人中的β细胞功能。然而，结果略微不清楚，因为仅在胰高血糖素刺激之后看到较弱的C-肽保持，但是在混合饮食耐受测试之后完全没有效果，并且在积极治疗组和安慰剂组之间的免疫标记物上不存在差异。已经示出用胰岛素的积极治疗不仅预防或推迟实验动物的糖尿病，而且初步的开放研究指出这种治疗可以预防高风险个体中的糖尿病(10)。肠胃外给予(DPT)胰岛素(其明显是β细胞特异性自身抗原)来预防高风险个体中的糖尿病没有效果，同时出于相同的目的口腔给予胰岛素可以具有轻微效果(12)。
1.1.4之前用GAD-Alum的临床研究
1.1.4.1GAD-接种
可以将GAD(谷氨酸脱羧酶)视为自身抗原，因为其在胰岛中产生，其中释放随着对β细胞刺激的响应增加。已经示出该蛋白质深入地影响自身免疫的免疫过程(31,32,33,34)。若干研究示出GAD确实可以预防实验动物中的糖尿病(35-42)。GAD与病毒蛋白质的类似性对治疗行为可能是重要的。即使在免疫过程开始之后，观察的效果表明在开始免疫过程之后可以在人类中预期相同的效果。在LADA患者的II期研究中，给予一次低剂量的Diamyd 20μg导致与安慰剂治疗的组相比在没有副作用的情况下高达2年的β细胞功能的改善。还尝试了其他剂量：4μg示出无效果， 100μg示出与20μg类似的效果，同时500μg示出无效果。没有剂量示出任何不良事件，在若干年的随访后仍如此(43)。发现了与 CD4+CD25+/CD4-CD25-细胞的比率的变化的关联，这表示该效果的机制。在该有希望的背景下，我们开始了在近期发作的10-18岁1型糖尿病患者中的II期研究。基于之前的治疗对缓进型LADA患者具有效果的想法，我们在干预时包括了T1D糖尿病持续高达18个月的患者。在第1和30 天随机给予患者20μg GAD-alum(Diamyd)sc或安慰剂。30个月之后效果仍是显著的且明显在统计学和临床意义上是有意义的(44)，其中与安慰剂组相比在GAD治疗的组中C-肽下降约一半。糖尿病持续时间<3 个月的患者具有明显良好的效果，其中在随访的前15个月没有或很少的β细胞功能的下降。在接种持续时间<6个月的患者中看到几乎全部的效果。另外，与其他干预治疗不同，在完全没有不良事件的情况下得到该效果，使治疗非常鼓舞人心。 48个月之后，治疗<6个月持续时间的患者仍具有显著保持的C-肽且仍不具有不良事件(45)。目前为止，GAD治疗看起来非常有希望。进行了两个III期试验，一个在欧洲，JohnnyLudvigsson(JL) 作为PI，以及一个在美国，Jerry Palmer作为PI以及JL作为共同研究者。在欧洲试验中，将334个患者招募至三个臂，一个臂在第1、30、90和270 天使用GAD-alum(Diamyd)20μg，另一臂在第1和30天使用GADalum 20μg且第90和270天安慰剂，以及第三组在第1、30、90和270天使用安慰剂。在15个月混合饮食耐受测试(MMTT)之后的主要终点血清C-肽AUC没有满足。 (C-肽AUC p＝0.1；空腹C-肽p＝0.07)(46)。这促使公司(DiamydMedical+Johnson&Johnson)较早地终止了III期试验。然而，III期试验确实示出了若干积极效果。即在若干预指定的亚组中看到了统计学上显著的疗效。此外，当停止研究时，45个瑞典患者已经通过了 30个月的探视，以及接受了两次剂量的GAD-alum(Diamyd)20μg的那15位患者在30个月之后与安慰剂相比示出C-肽的显著保持。 这是特别值得注意的，因为瑞典患者在15个月之后没有疗效，而在非北欧国家中15 个月之后发现了疗效。
1.1.4.2II期和III期的不同结果的可能原因
在III期随机化中，患者在10-11岁的组中比在16-18岁的组中更经常接受活性药物，而安慰剂在更高年龄的组中比活性药物更频繁。这对结果可能具有影响。II期患者在三月-四月治疗，其III期的在三月-四月治疗的那些患者也具有GAD治疗的显著效果。在II期试验中，没有接受接种，但是在III期中，允许流感接种。不幸地，HINl流感的流行导致几乎所有的患者接种，他们中的许多也接种了GAD。
在瑞典和芬兰，怀疑包含鲨烯的疫苗影响免疫系统的自身免疫，并且在这两个国家，不存在GAD治疗的疗效，而在其他欧洲国家疗效是显著的。接近GAD治疗没有进行流感接种的瑞典的患者具有更好的GAD治疗的疗效(46)。
1.1.4.3正在进行的DIABGAD-1试验
从2013年1月开始，瑞典正在进行II期DIABGAD-1试验。这是在 60个患有近期发作1型糖尿病的10-18岁患者中的试验，在双盲安慰剂对照的随机化研究中治疗该患者，其中结合每天2000单位的维生素D450 天，以30天间隔分别给予两次GAD-alum 20μg和40μg，以及每天400 mg布洛芬90天。完成征募并且现在停止。随机分配60个患者并筛选另4 个患者，等待筛选结果。迄今为止没有判断为与研究药物有关的严重不良事件和与治疗无关的非常轻微的不良事件，除了在GAD-alum的注射部位轻微的瞬时反应。已经计划了在6个月随访之后对所有患者的中间分析，而更扩展的分析将在15和30个月之后进行。
1.1.5.淋巴结内免疫治疗
抗原治疗旨在呈递抗原至淋巴结内的T-细胞以得到免疫系统的新平衡和针对抗原的耐受度。在迄今为止的自身免疫疾病的治疗中，口腔、鼻内或皮下给予抗原以将抗原呈递至抗原呈递/树突状细胞，进而预期其将抗原呈递至免疫系统的T细胞。然而，动物研究示出淋巴管内注射诱导强烈的和相关的T-细胞响应(47,48)，并且在过敏领域，临床研究示出将抗原 /过敏原直接呈递至淋巴结似乎比传统的给予更有效(49)。可以使用较低剂量的过敏原，治疗次数可以自由减少，且不存在与治疗有关的不良事件。在患者中易达到腹股沟淋巴结，且与注射相关的疼痛被评定为低于静脉穿刺的疼痛(50)。在该背景下，我们的目的是研究相同的途径是否可以用于1型糖尿病的自身免疫形式的患者。出于伦理原因，我们将在成人中进行第一次先导试验。
1.2假说
II期GAD试验的鼓舞人心的结果和III期欧洲试验的部分积极的结果支持了给予GAD-alum(Diamyd)可以减少自身免疫过程并有助于剩余的胰岛素分泌功能的保持的构思。因为之前的研究已经指出剂量应该在20 和100μg Diamyd之间的某处，所以当直接给予至淋巴结时，给予三次3 μg的较低剂量应该是适当的。将GAD-alum(Diamyd)直接注射至淋巴结将不会产生严重不利的现象，具有期望的免疫效果以及将(在未来的研究中示出)改善疗效。
2.风险-益处分析
1型糖尿病的发病率在瑞典(仅次于芬兰)比世界上的任何其他国家要高。十年来发病率连续升高。该疾病不能治愈且不能预防。尽管非常重负担的、强烈的、昂贵的治疗，但是许多患者患有威胁生命的严重的急性且晚期的并发症，且死亡率升高很多。在诊断时，许多患者具有轻微的剩余胰岛素分泌。只要是这种情况，保持血糖稳定容易得多，低血糖的发病率降低且酮酸中毒的风险降低。只要存在一些剩余的胰岛素分泌，则患者以及患有糖尿病的儿童的父母的生活质量更好。
成人中的1型糖尿病与儿童和青少年中的疾病不同，因为疾病过程经常是较轻，剩余的胰岛素分泌的下降缓慢，且更容易控制血糖。然而，仍存在很大的类似性，类似的治疗和并发症，且β细胞功能的保持在成人中也是非常重要的。
明显的是保持剩余的胰岛素功能具有很大的益处，因而旨在保持该功能的疗法证明治疗是十分重负担、甚至危险和昂贵的。因此，认为用如针对CD3-受体的单克隆抗体的药物在发作时治疗1型糖尿病是合理的，该药物导致大部分患者中的不良事件，一些甚至是十分严重的现象和风险。即使使用了纯的细胞抑制剂。
在我们提出的研究中，我们使用GAD-alum(Diamyd)4μg x 3，已经以给予儿童和成人的大得多的剂量使用的治疗，在数千患者的多年随访期间几乎没有看到不良事件。在我们的研究中，我们计划使用非常低的剂量，这意味着可以预期通常的风险甚至更低，但是将直接给予至淋巴结中，这可能产生局部反应。对免疫系统的影响可以变得更明显，但是不应导致任何不利的影响。之前对过敏的研究(其中共同研究者中的一个Helene Zachrisson已经给予了alum配制的过敏原的淋巴结内注射)没有示出全身或局部的任何不利影响。出于安全原因，由于这是使用这类至淋巴结的自身抗原治疗的首次先导试验，所以我们在可以给出他们自由的知情的同意的成人中尝试。即使成人中的1型糖尿病比更年轻患者中的略轻，但是保持β细胞功能是很有价值的，并因此提出的治疗对于成人患者也可以具有大的治疗价值。
当汇总优点与缺点时，对于参与患者，对于未来研究中的患者两者而言，存在极为重要的治疗益处的明显的可能性，而风险非常小。如果这些研究有助于良好的治疗的发展，则对于多数患者将具有巨大的价值。
3.本研究的目的
本初步研究的我们的目的是获得关于是否可以在没有治疗有关的严重不良事件的情况下将GAD-alum给予至淋巴结的信息，以使未来用相同技术的II期研究能够改善在1型糖尿病中保持剩余的胰岛素分泌的疗效。因此，我们想要看到该治疗是否产生任何不良事件，以及治疗方案如何影响免疫系统，导致期望的Th-2偏差、T-调节细胞增加、以及希望保持剩余的β细胞功能的指示。基于该先导研究的短期结果(随访第6个月)，我们然后可能想要设计更大的II期试验以包括更年轻的患者并获得更稳固的信息。主要的长期的目的则是寻找发作1型糖尿病的年轻患者的治疗，其对于患者来说是可耐受的、安全的，且其可以保持剩余的胰岛素分泌并给与患者更好的生活质量，具有较少的急性并发症和长远来说较少的晚期并发症的风险。
4.目标
目标：
为评估直接给予Diamyd至淋巴腺中的安全性以及评估免疫响应 (51-54)和对保持内源胰岛素分泌功能的影响，在基准线以及6、15和 30个月之后测量。
5.群体
给予林雪平大学医院的患有近期发作1型糖尿病的成人患者关于研究的信息并请求他们参与试验。
5.1入选标准
1.患者和监护人/父母给出的知情同意
2.根据ADA分类具有<6个月糖尿病持续时间的1型糖尿病
3.在诊断1型糖尿病时年龄18.00-29.99岁
4.空腹C-肽≥0.12nmol/ml
5.阳性GADA但是<50 000随机单位
6.女性必须同意避免妊娠并具有阴性的尿妊娠测试
7.患者必须同意使用适当的避孕措施，直到最后一次给予 GAD-Alum/安慰剂1年之后
5.2排除标准
1.之前或目前通过免疫抑制疗法治疗(尽管局部或吸入类固醇是接受的)
2.用任何炎性药物连续治疗(例如因为头痛或与发烧相关的几天的偶然治疗是可接受的)
3.用除胰岛素之外的任何口服或注射的抗糖尿病药物治疗
4.筛选时贫血史或显著异常的血液学结果
5.癫痫症、头部创伤或脑血管突发情况，或近端肌肉中的连续的运动单位活性的临床表现史
6.过去对疫苗或其他药物的临床显著的急性反应史
7.在计划的首次研究药物给药之前4个月内用包括流感疫苗的任何疫苗治疗，或最后一次注射研究药物之后长达4个月内用任何疫苗的计划治疗。
8.之前3个月内参与新化学个体的其他临床试验
9.没有能力或不愿意遵守该流程的规定
10.酒精或药物滥用史
11.第一次给药之前2周内除糖尿病之外的显著疾病
12.已知的人类免疫缺陷性病毒(HIV)或肝炎
13.哺乳或怀孕的女性(在GAD-alum治疗之前24小时内，通过现场尿βHCG必须排除妊娠的可能性)。
14.男性或女性不愿意使用适当的避孕措施直到最后一次GAD-alum 治疗1年之后
15.存在相关的严重疾病或病症，包括妨碍皮下注射的活动性外皮感染，研究者认为这使患者不适于该研究。
16.研究者认为不能遵守说明书和/或遵守研究流程
5.3招募和筛选
符合条件的受试者将得到研究的解释，并将接收书面的患者信息。在具有回顾研究的性质的时间之后，他们将有机会向研究团队询问问题。这之后如果受试者同意参与，那么他们将个人签署书面知情同意表并注明日期。患者然后将接收签署和注明日期的信息/知情同意表的副本。
5.4患者退出
根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)，研究者必须向患者解释他们具有在任何时间退出该研究的权利，而且这将绝不损害他们未来的治疗。然而，除非出现安全问题，我们计划在整个研究期间跟进患者以也对于退出研究的那些患者分析疗效和安全性变量。任何种类的退出原因必须被记录在适当的CRF上。
将存在从研究中退出的不同的类别：完全退出(例如停止研究产物以及继续疗效和安全评估)
从进一步参与研究和随访探视(和<例如血液测试>)退出的标准原因可以是：
·患者的决定(取消对参与的同意)
·随访丢失患者
从进一步采用研究产物退出但是继续随访探视和安全评估的标准原因可以是：
·不可接受的不良事件
·患者要求
·研究者的判断
·随访丢失患者/不参与
·中间发生的疾病
·患者怀孕
因此，如果包括在研究中之后患者患以下各项则不应该淋巴结内给予患者GAD-alum：
-大脑损伤、癫痫、头部创伤、神经疾病
-除1型糖尿病之外任何活动性的、严重的激素疾病
-其他严重的自身免疫性疾病(除了乳糜泄是可接受入选的)
-免疫抑制治疗
-癌症、癌症治疗
-除胰岛素之外的任何其他糖尿病药物
-任何接种
-药物/酒精滥用
或如果患者
-怀孕或不再愿意在研究期间使用安全避孕措施。
然而，无论何时患者退出研究或无论什么原因不前去任何进一步的探视，必须对该患者完成最终的研究评估(探视<>)-陈述患者退出研究的原因。涉及患者的所有文档必须尽可能的完整。由于不参加的退出必须由研究者随访以得到不参加的原因。由于中间发生的疾病或不良事件的退出必须完全记录在记录表格下，如果可获得和/或适当的话添加补充信息。
6.治疗流程
6.1研究设计和治疗
试验是在任一性别、18.00至29.99岁、筛选(第1次探视)时诊断出 6个月内的TID并且空腹血糖C-肽水平等于或大于0.12nmol/L的GADA 阳性TID患者中的单中心、开放标签的先导研究。总计将在瑞典林雪平的一个地点招募约5个患者。在开始治疗之前，将在10至21天的筛选探视 (第1次探视)中评定患者的资格。将为筛选的患者分配顺序筛选号以及该筛选号将用于整个研究中识别患者。
有资格包括在研究中的患者然后将参加研究来接受根据以下表1的随后探视时的调查研究药物。患者将接受总计30个月的研究周期，其包括至该地点的8次探视。
参见以下用于研究探视的总览的表1。
表1患者探视、探视窗口和研究药物给予的计划
Figure BDA0001217233570000601
6.2评估和流程
1.用于新诊断的1型糖尿病患者的标准胰岛素治疗、教育和心理学支持。
2.流体、电解质和酸-碱平衡的标准化。
3.其后关于研究的信息
4.当患者给出他们的知情同意书时，诊断之后最晚120天，通过来自患者的空腹静脉样品进行筛选，该患者是根据除C-肽和GADA浓度之外的标准符合条件的(第1次探视)。
5.在基准线(第2次探视)、6、15和30个月，通过MMTT评估剩余的内源胰岛素分泌。每次研究探视时通过血样关注HbAlc、安全性(血液学和化学)、自身抗体效价(GAD65，IA-2)、免疫学。在每次研究探视时登记外源胰岛素剂量/24小时、Ae和伴随的药物。
6.在每次研究探视时登记自己报告的低血糖(定义为需要来自其他人的帮助和/或癫痫发作和/或失去意识)。
7.应该以临床医生的意见治疗其他医疗问题的任何症状或迹象。
将根据以下章节7的表2和病历报告表(CRF)下阐述的顺序进行检查。
6.2.1所有探视，第1至7次探视
应注意患者应该在空腹(>10小时，允许喝水)整夜之后在早晨参加所有研究探视。对于具有感染迹象(包括发烧)的患者，完整的探视应该推迟5天或直到患者恢复。
6.2.2给予GAD-Alum，第2、3和4次探视
给予之后，接下来的一小时患者应保持在研究点附近，且研究者/护士将在注射1小时之后检查给予部位。
6.2.3混合饮食耐受测试(MMTT)，第2、5、6和7次探视
·MMTT必须根据CRF的指导进行。患者应该：
·空腹整夜(>10hr)之后到达研究地点，即患者不能吃东西但是可以喝水。
·MMTT之前6小时内不能接受短期作用的/直接作用的胰岛素。允许患者在前一天/晚而不是在MMTT之前的早晨接受基础胰岛素。
·具有CSII(胰岛素泵)的患者必须继续他们的基础剂量的胰岛素，但是在MMTT之前的最后6小时不能添加大丸剂给药。
·在测试的早晨具有在患者的家庭血糖计上限定在4-12mmol/L范围内的空腹血糖水平。如果患者不能实现以上全部标准，则应该重新计划 MMTT且如果可以的话患者应在5天内返回研究地点。
如果出于安全原因，受试者需要进食或采用胰岛素，则也应该重新安排探视。
6.3实验室测试和检查：
1.免疫测试：
a.自身抗体(抗-GAD65、抗-胰岛素、抗-IA-2、ZnT8)
b.确定有关的细胞因子和趋化因子(参见以下)
c.分类和研究T-细胞(参见以下)
2.遗传学：
a.完成HLA确定以及与糖尿病发展有关的基因
b.安排研究以说明糖尿病相关基因的重要性
3.病毒试验：
a.可以使用遗传学、免疫学和微生物学测试。
4.糖尿病状况：
a.HbAlc
b.空腹葡萄糖和空腹C-肽
c.饮食刺激的葡萄糖和C-肽
5.用于安全性的血液采样：
a.血液学
b.化学
6.4病史
研究者将着手受试者过去的病史的回顾并记录在病史CRF上。
将在筛选探视(第1次探视)时在病史CRF页报告所有之前存在的病症/疾病。
还将记录受试者的1型糖尿病诊断日期和1型糖尿病的家族史。
6.5包括神经学检查的身体检查
在筛选探视(第1次探视)时，患者将经受全身的检查和神经学检查，以及将任何发现作为之前存在的病症报告在病史CRF页。
在随后的研究探视期间，将针对任何新的医疗状况或之前存在的状况的恶化检查患者。必须将之前存在的状况的任何变化或新的状况输入CRF 的AE页，以及将给予的任何药物治疗输入伴随药物页。
除由医师的有限的身体检查之外，患者将在筛选、0、6、15和30个月时经受标准化的的临床神经学检查。进行神经学测试以检测神经与肌肉疾病的可能的轻度迹象，如力量、平衡和协调的扰乱。
神经学检查包括：
·经肢端反射
·龙贝格(Romberg)(平衡和协调)
·在直线上行走，2米(平衡和协调)
·1条腿站立，左腿和右腿每条腿15秒(平衡和协调)
·指鼻(协调)
·模仿(脑神经)
·巴宾斯基反射(中枢功能)
·肌力(握手)二头肌、三头肌、远端伸肌和屈肌
也可以按照研究者的意见在计划的探视期间重复这些检查。由于灵敏度和特异性低，所以不包括用脑动电流图(EEG)的神经疾病的筛选。然而，如果检测到任何神经学上机能障碍的迹象，则患者需要联系神经专家作进一步评估。
6.7伴随用药
研究期间任何伴随用药，无论研究者认为是否与研究有关，都必须报告在CRF的伴随药物治疗记录上。仍请参见以下章节8.5。
7.流程的规划
表2 先导DIAGNOPE-1研究，研究事件的计划，T1D患者
Figure BDA0001217233570000641
a注射之前和60分钟之后由研究者或护士检验注射部位；
b低血糖定义为需要其他人的帮助和/或癫痫发作和/或失去意识
7.1探视
应在计划的第2次探视(基准线)之前10至21天进行第一次探视，筛选探视(第1次探视)。然后应该将第3和4次探视安排为±3天的探视窗口(第二和第三次给予GAD-Alum)，且对于第5、6次探视±14天，且对于第7次探视±30天。请注意必须根据探视计划由基准线探视(第2 次探视)计算所有探视。还请注意必须在探视窗口内进行探视以遵守研究流程。
对于患者探视的方案、探视窗口和研究药物给予，请参见以上表1和 2。
8.研究药物
8.1研究药物
将以下药物供应用于研究：
研究药物：GAD-Alum(Diamyd)，4μg x 3(给予三次，一个月间隔)， IMP供应商：Diamyd Medical AB,Stockholm,Sweden。
8.2供应
由Diamyd Medical供应GAD-alum(Diamyd)制剂。将作为预包装的药物由DiamydMedical供应给当地药房。所有给药将在医院进行，并仅由受过训练和授权的研究人员处理。将根据当地规范将研究药物标记信息。 GAD-alum将存放在安全区域(例如锁住的橱柜或药物贮存室)中的2-8℃的冰箱中，防止被无意使用。将根据当地规范向所有研究药物标记信息。
8.3剂量和给予
GAD-Alum：给予至腹股沟区域的淋巴结(借助于超声技术)4μg，三次，一个月间隔
8.4治疗持续时间
参见8.3
8.5伴随用药
除胰岛素之外，不允许全身的免疫调制药物以及其他的糖尿病药物 (无论是否市售)。
9.响应变量和结果
9.1疗效的考察评价
9.1.1.疗效变量
由于这是先导I期研究，所以不存在主要疗效终点，但是我们将遵循以下
·MMTT期间从基准线分别至第6、15个月，至第30个月的空腹C- 肽和C-肽的变化(90分钟值和AUC平均值0-120min)。
例如看做与IFN-γ、TNF-α、IL-lβ、IL-17相比的IL-5、10、13的增加比率的细胞介导的免疫响应的Th2-偏差和T-调节细胞的增加。基准线和随后的探视之间的变化。
·基炎性标记物，例如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-17。基准线和随后的探视之间的变化。
·基血红蛋白A1c(HbAlc)，基准线和随后的探视之间的变化。
每kg体重和24小时的外源胰岛素剂量，基准线和随后的探视之间的变化。
10.统计方法和数据管理
10.1研究设计
DIAGNODE-1研究是开放标签的先导I期干预研究
研究参与者：新诊断的1型糖尿病患者：N＝5。年龄18-29.99岁。从瑞典的一个内分泌诊所招募
10.2样本大小的估计
功效分析：对于该先导研究没有进行正式的功效分析。
10.3统计分析计划
简单来说，计划了以下分析：
所有连续变量将由以下描述性统计显示：观察次数(n)、平均值、标准偏差、最小值、中值和最大值。将用频率和百分比显示范畴性质的所有变量。由探视划分描述性统计的列表。适当时，还将包括基准线(筛选) 描述性统计。
人口统计和其他基准线特征
将使用描述性统计(汇总表)呈现人口统计和基准线特征。
安全性变量和疗效数据
将使用所有观察的AE/SAE的频率和发病率的标准化列表呈现 AE/SAE。基于每个患者计算频率和发病率。将通过身体系统、因果关系和严重性汇总不良事件。将通过描述性统计呈现其他安全性数据。
将描述性地汇总关于C-肽和免疫系统的疗效数据以及不良事件和其他安全性数据。
6个月之后，分析安全性数据。(结果将用于II期DIAGNODE试验的设计)。
10.4研究群体
意向治疗的群体
如果他们接受该臂中至少1剂量的所有研究药物并在之后的探视中被评估，则患者将包括在初次意向治疗的群体中用于疗效分析。
符合方案人群
为了取得严格的符合方案人群资格，受试者必须遵守研究流程，没有任何较大的违背。遗漏的任何检查将由进行的上次观察取代，但是可以失去不多于1次探视的检查。
总人群
在已经接受了至少一次治疗(第2次探视)后退出的任何患者将包括在安全性分析(不良事件和安全参数)中。将列出所有患者的数据，以及将给出以所有原因退出的退出患者的列表。
10.5数据收集/病例报告形式
将提供病例报告表(CRF)用于记录每个患者的数据。由于以及时的方式收集适当的数据是重要的，所以研究者或分配的被指定人应该准时完成CRF。当检测者要求另外的数据或用于CRF的数据的澄清时，必须在时限内符合要求地回应该要求。
研究者的责任是确保这些病例报告形式适当地完成。研究者将在指定的签名页签字以确认病例报告形式是准确的和完整的。
为了确保可读性，应该用黑色或蓝色圆珠笔(非铅笔、毡尖笔或钢笔) 以大写印刷体完成CRF。必须由研究者或其指定人进行CRF的任何校正。必须在原始记录上画上单划线。校正必须标记日期且首字母签名。不正确的记录不能被修正液覆盖、或清除、或以任何方式使得难辨认。即使与之前的检查没有变化，为了获取数据的完整性，在CRF的各个章节重复的该问题需要被完全回答。研究者必须给出所有遗漏数据的合理解释。
10.6数据管理
将数据编码并将其输入计算机数据库。数据处理，包括数据质量控制将遵守规章指南(例如国际协调会议[ICH]和药物临床试验管理规范(Good Clinical Practice)[GCP])。
11.规章和管理程序
开始研究之前必须满足任何规章要求。主办者将请求有关当局的规章批准。研究地点、设施、实验室和所有数据(包括来源数据)以及文档必须可用于当局检验。
11.2患者信息/知情同意书
研究者负责给予患者关于研究的性质、目的、可能风险和益处的全部和适当的口头和书面信息。还必须通知患者他们在任何时间可自由退出该研究。患者应该在签字之前具有阅读和理解信息的合理时间。研究者负责在将患者包括在任何研究相关流程中之前，获得所有患者的签字的告知同意书。患者信息和知情同意书的副本将给予患者。
11.4患者治疗计划
所有患者在研究期间将继续接受对于1型糖尿病的标准护理。在单独完成研究之后，患者将回到参与研究之前接受的标准治疗。
实施例3
该实施例中的治疗方案具有“正交”作用并在长期缓解T1D自身免疫。免疫系统由依那西普下调，其进而下调β细胞周围的炎症，同时由树突状细胞呈递β细胞自身抗原(GAD)的同时通过用维生素D治疗树突状细胞的诱导耐受度能力增强。
研究：开放标签试验来评估由GAD-alum
Figure BDA0001217233570000681
依那西普和维生素D组成的联合治疗在新诊断有1型糖尿病的儿童和青少年中的耐受性。
活性成分：重组人谷氨酸脱羧酶(rhGAD65)、钙化醇(维生素D)、依那西普。
发展阶段：阶段IIa
目标：
·评估rhGAD65、维生素D和依那西普的联合治疗的耐受度
·评估上述治疗如何影响免疫系统和内源胰岛素分泌功能
研究设计：
研究是多中心的、开放标签的、先导临床试验。所有患者将在15个月期间从第1天每天接受2 000IU维生素D，并从第1-90天每周接受一次皮下注射的0.8mg/kg体重(最大50mg)的依那西普(Enbrel)，以及在第30和60天以初免-加强方案接受20μg Diamyd的2次皮下注射。将评估患者的耐受性6个月(主要研究周期，6次探视)，并跟进另外的 24个月(延长研究周期，3次探视)。总的研究周期是30个月。
受试者的选择：患者的年龄必须是8.00至17.99岁，且在筛选时的前 100天内诊断出1型糖尿病(T1D)。如果空腹C-肽>0.12nmol/L(0.36ng/mL) 且存在升高水平的GAD65抗体，患者将有资格加入。
计划的受试者的数量：大约20个患者将加入。
治疗组的描述：
存在单个治疗组。将在开始治疗之前2至4周的筛选探视(第1次探视)中评定患者的资格。在第2次探视(第1天)时，符合研究条件的患者将开始上述的治疗。
终点
主要终点：
在第6(主要研究周期)、9、15和30个月(延长研究周期)评估Diamyd、维生素D和依那西普的联合治疗的耐受性。
评估耐受性的变量：
·注射部位的反应
·感染
·不良事件(AE)的出现
·严重的不良事件的出现
·生理学和神经学评价
·实验室测量(生物化学和血液学)，包括血清中的钙和维生素D
·GAD65AB效价(GADA)
次要终点：
在第6(主要研究周期)、9、15和30个月(延长研究周期)评估上述治疗如何影响免疫系统和内源胰岛素分泌
评估对免疫系统的影响的变量：
·炎性标记物，尤其是TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-17
·例如作为与IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-17相比的IL-5、10、13的增加的比率看出的细胞介导的免疫响应的Th2-偏差
·T-调节细胞的增加
评估内源胰岛素分泌的影响的变量
·MMTT期间的C-肽(90分钟值和AUC平均值0-120min)
·具有0.2nmol/L以上的刺激的最大C-肽水平的患者的比例
·空腹C-肽
·血红蛋白Alc(HbAlc)
·每kg体重和24小时的外源胰岛素剂量
样本大小：
由于这是开放标签的先导研究，仅看治疗是否是可耐受的以及是否不会对β细胞功能和/或免疫系统导致消极效果，所以没有进行实际的样本大小计算。
将描述性汇总所有的变量
实施例4
研究标题：GABA或组合GABA/GAD对儿童中的1型糖尿病的进展的影响
发展阶段：人类中的先导研究
目标：
·评估用GABA的治疗对近期发作1型糖尿病的剩余胰岛素分泌的安全性和影响。
·评估用两剂量的GAD-alum
Figure BDA0001217233570000701
加GABA对近期发作的1 型糖尿病的剩余胰岛素分泌的保持的安全性和影响。
研究设计：该研究是3臂、随机化、双盲、安慰剂对照的临床试验。患者将接受以下任一种
i)口服GABA，每kg给药，每天两次持续12个月加在30天期间以初免-加强方案2次皮下注射20μg Diamyd
ii)口服GABA，每kg给药，每天两次持续12个月
iii)安慰剂。
将跟进患者总共12个月。
受试者的选择：患者必须是4至17岁，并在随机化之前4周内诊断为1型糖尿病(T1D)。如果呈现升高水平的GAD65抗体，则患者将有资格加入。
计划的受试者的数量：大约75个患者将加入。
治疗组的描述：
在随机化之前将评定患者的资格。在第1次探视(第1天，基准线)，将适于研究的患者随机到3治疗组的一个中：
·25个患者将分配为从第1天至第12个月接受每天两次口服GABA，每kg给药。另外，将在第1天和第1个月给予20μg Diamyd(GAD-alum) 的2次皮下注射，即1次初免和1次加强给药(提供总共40μg Diamyd)。
·25个患者将分配为从第1天至第12个月接受每天两次口服GABA，每kg给药。另外，将在第1天和第1个月给予安慰剂Diamyd的2次皮下注射。
·25个患者将分配为从第1天至第12个月接受每天两次口服安慰剂 GABA，每kg给药。另外，将在第1天和第1个月给予安慰剂Diamyd的 2次皮下注射。
主要终点：
·评估GABA和GABA+GAD-alum组合对胰腺β细胞功能的影响，如由1年的治疗前后与年龄相符的安慰剂对照比较饮食刺激的C-肽分泌水平测量的。
次要终点：
·评估从基准线至随后的探视GABA和GABA+GAD-alum组合对自身免疫糖尿病自身抗体：GAD-65、ICA512和锌传输子8(ZnT8A)的影响以及对HbAlc、空腹和刺激的葡萄糖和胰高血糖素水平、空腹C-肽和参与者每天使用的胰岛素量的影响
·评估GABA和GABA/GAD-alum组合的安全性
安全性
安全评估包括观察注射部位的反应、不良事件(AE)的出现、实验室测量、神经学评价和有限的身体检查。
样本大小：
提出的研究的样本大小是75个儿童；治疗组中50人以及安慰剂组中 25人。对于基准线后第12个月的这些组之间的C-肽测量值的初次比较，假设0.05的α和1.0(0.4)的平均(SD)C-肽AUC，该样本大小产生～40％功效来检测25％差值以及～97％功效来检测50％差值。将描述性汇总不良事件和其他数据。
实施例5
活性成分的名称：重组人谷氨酸脱羧酶(rhGAD65)
研究标题：双盲、随机化的研究者发起的研究来确定
Figure BDA0001217233570000721
对具有多种胰岛细胞自身抗体的儿童的1型糖尿病的进展的安全性和影响。
目标：
·主要目标是证明
Figure BDA0001217233570000722
在处于1型糖尿病风险下的儿童中是安全的。将跟进受试者5年。
·第二目标是评估
Figure BDA0001217233570000723
是否可以延迟或终止导致具有如由多种阳性胰岛细胞自身抗体指示的正在进行的持久性β-细胞自身免疫的儿童中的临床1型糖尿病的自身免疫过程。
研究设计：
该研究是两臂、随机化、双盲、安慰剂对照、单中心的临床试验。研究参与者将在30天周期内以初免-加强方案接受
Figure BDA0001217233570000724
20μg或安慰剂的2次皮下注射。将跟进研究参与者5年。
诊断后干预流程(PDIP)
直到研究药物保存期限，可以提供在研究周期内诊断为临床1型糖尿病的儿童继续诊断后干预流程(PDIP)中的试验以接受另外的2次
Figure BDA0001217233570000725
注射，不论在研究的预防部分他们随机到哪个治疗组。
受试者的选择：
受试者必须在4.00岁以上且对于GADA和至少一种另外的1型糖尿病相关自身抗体是阳性的(IA-2Ab>5，ZnT8/W/Q/A Ab>72或IAA>0.8)。
计划的受试者的数量：大约50个患者将加入。
治疗组的描述：
将在第一次注射之前的大约30天的筛选探视(第0次探视)时评定患者的资格。在第1次探视(第1天)，将符合研究条件的患者随机到2 治疗组的1个中：
·25个患者将分配为在第1和30天接受20μg
Figure BDA0001217233570000731
的2次皮下注射，即1次初免和1次加强给药。
·25个患者将分配为各自在第1和30天接受安慰剂的2次皮下注射。
诊断后干预流程(PDIP)
从诊断糖尿病开始的4个月内，参与者将在诊断后随访中以初免和加强方式在第1天接受
Figure BDA0001217233570000732
20μg的一次注射，随后在第30天接受
Figure BDA0001217233570000733
的第二次注射(对于诊断前随机接受安慰剂的参与者总接受剂量是40μg
Figure BDA0001217233570000734
且对于诊断前随机接受
Figure BDA0001217233570000735
的参与者总接受剂量是80μg
Figure BDA0001217233570000736
)。
一般大小：
将要求高达50个儿童参与DIAPREV-IT 2。预期具有多于一种阳性胰岛细胞自身抗体的儿童的50％将在5年内发展1型糖尿病。
分析：
研究数据的分析将旨在解决治疗的安全性和疗效两者。
实施例6
研究标题：双盲、随机化的研究者发起的研究来确定与维生素D组合的
Figure BDA0001217233570000737
对具有多种胰岛细胞自身抗体的儿童的1型糖尿病的进展的安全性和影响
活性成分名称：重组人谷氨酸脱羧酶(rhGAD65)、钙化醇(维生素 D3)
目标：
·标主要目标是评估
Figure BDA0001217233570000738
在用相对高剂量的维生素D治疗的儿童中是否可以延迟或终止导致具有如由多种阳性胰岛细胞自身抗体指示的正在进行的持久性的β细胞自身免疫的儿童的临床1型糖尿病的自身免疫过程。
·次要目标是证明
Figure BDA0001217233570000741
在处于1型糖尿病风险下的儿童中的安全性。
研究设计：
该研究是两臂、随机化、双盲、安慰剂对照、单中心的临床试验。
研究参与者将在30天周期内以初免-加强方案接受
Figure BDA0001217233570000742
20μg 或安慰剂的2次皮下注射。在总的研究期间将以2000IE的日剂量向所有研究参与者补充维生素D(不论他们随机到哪个治疗组)。将跟进研究参与者5年。
诊断后干预流程(PDIP)
直到研究药物保存期限，可以提供在研究周期内诊断为临床1型糖尿病的儿童继续诊断后干预流程(PDIP)中的试验以接受另外的2次
Figure BDA0001217233570000743
注射，不论他们在研究的预防部分中随机到哪个治疗组。加入 PDIP的所有儿童将中断原来的预防流程以为了安全性和根据PDIP的疗效彻底跟进或在PDIP中的第一次注射之后的15个月跟进。
受试者的选择：
受试者必须是4.00至17.99岁并且对GADA和至少一种另外的1型糖尿病相关的自身抗体(IA-2A、ZnT8R/W/QA或IAA)是阳性的。
计划的受试者的数量：大约80个患者将加入。
治疗组的描述：
将在第一次注射之前的大约30天的筛选探视(第0次探视)时评定患者的资格。在第1次探视(第1天)，将符合研究条件的患者随机到2 治疗组的1个中：
·约40个患者将分配为在第1和30天接受20μg
Figure BDA0001217233570000745
的2次皮下注射，即1次初免和1次加强给药。
·约40个患者将分配为各自在第1和30天接受安慰剂的2次皮下注射。
在总共5年的研究期间，将以2000IE的日剂量向两个治疗组补充维生素D3。
诊断后干预流程(PDIP)
·从临床1型糖尿病诊断开始的4个月内，参与者将在PDIP中以初免和加强方式在第1天接受一次
Figure BDA0001217233570000744
20μg注射，随后在第30天接受第二次
Figure BDA0001217233570000751
注射，不论他们随机到研究预防部分的哪个治疗组(诊断之前)。
终点：
主要终点：
第一次注射之后5年，与安慰剂治疗组相比，在
Figure BDA0001217233570000752
治疗组中诊断为临床1型糖尿病的受试者的比例。
次要终点：
评估安全性和在具有基准线的正常葡萄糖代谢的儿童的组中从正常至削弱的葡萄糖代谢的代谢状况的变化，以及与用安慰剂治疗的那些相比，在基准线筛选中具有削弱的葡萄糖代谢的儿童中、在用
Figure BDA0001217233570000753
治疗的具有多种胰岛自身抗体的非糖尿病儿童中的代谢状况的进展。
评估安全性的变量：
·注射部位反应
·不良事件(AE)的出现
·实验室测量(生物化学和血液学，包括全血细胞计数(CBC))，包括血清中的钙和维生素D3
·尿分析
·身体检查，包括神经学评价
·表位特异性GADA效价、同位型和亚型以及对GADA的抗个体基因型自身抗体
代谢状况：
·从正常至削弱的葡萄糖代谢的变化，定义为以下中的任一种：
a)F-葡萄糖>6.1mmol/L
b)OGTT中的在30、60、90分钟的最大p-葡萄糖>11.1mmol/L
c)在OGTT上的120min p-葡萄糖>7.8mmol/L
d)HbAlcol/L/L：包括全血细胞
必须在第二次探视时确认削弱的葡萄糖代谢。该终点将用于基准线筛选时具有正常葡萄糖代谢作用的儿童组。
·在第二次探视时确认的从上述变量中的一个或多个至降低的葡萄糖代谢作用的另外迹象的削弱的葡萄糖代谢作用的进展。该终点将用于基准线筛选时具有削弱的葡萄糖代谢作用的儿童组。
考察终点：
·在随访的1、2、3和4年诊断为临床1型糖尿病的受试者的比例
·基准线探视至诊断临床1型糖尿病的时间
·在多个时间点以下关键代谢变量从基准线的变化：HbAlc、第一时相胰岛素响应和来自IvGTT的K值、来自OGTT的p-葡萄糖和C-肽、OGTT 之后120分钟的葡萄糖和C-肽、空腹C-肽、胰岛素和葡萄糖
·从基准线的其他代谢变量的变化：AUC C-肽、来自IvGTT的葡萄糖和胰岛素、来自OGTT的AUC胰岛素、OGTT上的最大值p-葡萄糖变化。
样本大小：
将要求多达80个儿童参与DIAPREV-IT 2。预期具有多种自身抗体的未治疗儿童的50％将在5年内发展1型糖尿病。在糖尿病患者的亲属和总的人群中之前已经报告了该频率相等。如果治疗的儿童的20％将在相同时间段内发展1型糖尿病，对40+40＝80儿童的组我们将具有82％的功效，其中α＝5％。P值<0.05将被用作显著水平。
分析：
研究数据的分析将旨在解决治疗的安全性和疗效两者。在统计学分析之前将制订统计学分析计划(SAP)。
将通过使用参数统计进行分析。如果不满足变量的正规性定则(例如Kolmogorov-Smirnov测试)，则将使用Wilcoxon型的非参数性统计。将使用Fisher精确测试分析四区域的表格。将使用寿命表分析如Kaplan-Meier 和Cox退化来分析糖尿病的时间。也将在每个流程(PP)以及意图治疗(ITT) 基础上进行疗效的分析。在ITT中，将应用上次向前进行的观察。
将描述性汇总不良事件和其他安全性数据。
实施例7
研究标题：与维生素D组合的
Figure BDA0001217233570000761
的多重增加剂量的II期、2臂、随机化、双盲、安慰剂对照的多中心研究，评估在新诊断为1型糖尿病的年轻成人中的安全性、免疫响应和糖尿病状况。
活性成分名称：重组人谷氨酸脱羧酶(rhGAD65)、钙化醇(维生素 D3)
目标：
主要目标：
·评估与维生素D组合给予多重增加剂量的
Figure BDA0001217233570000771
的安全性
次要目标
·评估与维生素D组合给予多重增加剂量的
Figure BDA0001217233570000772
对免疫系统的影响
·比较与维生素D组合给予多重增加剂量的
Figure BDA0001217233570000773
前后的Diamyd 和安慰剂组之间的糖尿病状况变量
研究设计：
该研究是2臂的、随机、双盲、安慰剂对照、多中心的临床试验。符合条件的患者将在第一次注射
Figure BDA0001217233570000774
之前的1个月期间每天接受口服维生素D。从第1个月(基准线)，所有患者将在另外5个月期间接受维持剂量的维生素D。
将在13周期间从第1个月(基准线)每周给予皮下注射的增加剂量的
Figure BDA0001217233570000775
(或安慰剂)(剂量增加)，之后将以2、4和8周间隔(从第 15周至第27周)给予最大剂量(维持剂量)。然后将每8-12周给予维持剂量1年。将在第6个月评估患者的安全性和免疫参数，然后将在第15 和30个月评估糖尿病状况参数。总的研究周期是30个月。
受试者的选择：患者必须是18至30岁，并在筛选时间之前的6个月内诊断为1型糖尿病(T1D)。如果空腹C-肽>0.12nmol/L(0.36ng/mL) 且存在升高水平的GAD65抗体，患者将有资格加入。
计划的受试者的数量：大约40个患者将加入。
治疗组的描述：
将在随机化之前的2至4周的筛选探视(第-14-28天)时评价患者的资格。符合条件的患者将在1个月期间从第1天每天口服接受7000IU维生素D，以确保在第一次
Figure BDA0001217233570000776
安慰剂注射之前维生素D水平>70nM/L。从第1个月(基准线)，所有患者将在另外5个月期间接受每天2000IU 的维生素D。
在第1天，将符合研究条件的患者随机到2治疗组的1个中：
·约20个患者将分配为从基准线(第1个月)开始接受如下增加剂量的
Figure BDA0001217233570000781
的皮下注射：每周0.4；0.8；2；3.2；4；6.4；8；12；16； 20；24、32、40μg的
Figure BDA0001217233570000782
之后将从15至27周以2、4和8周间隔给予40μg
Figure BDA0001217233570000783
此后将每8-12周给予40μg的
Figure BDA0001217233570000784
持续1 年。如上所述的给予维生素D(从第1天)。
·约20个患者将分配为以与以上相同的时间表接受安慰剂的皮下注射。如上所述的给予维生素D(没有用于维生素D的安慰剂)。
患者将在第6个月、15个月和30个月进行三次随访探视。
终点：
主要终点：
在第6、15和30个月评估与维生素D治疗结合给予多重增加剂量的
Figure BDA0001217233570000785
的安全性。
评估安全性的变量：
·注射部位的反应
·不良事件(AE)的出现
·实验室测量(生物化学和血液学)
·尿分析(微白蛋白尿，肌酸酐)
·身体检查，包括神经学评价
·GAD65AB效价(GADA)
次要终点：
评估第15和30个月在与维生素D治疗结合给予多重增加剂量的
Figure BDA0001217233570000786
前后的Diamyd和安慰剂之间的免疫系统和糖尿病状况变量的影响。
评估对免疫系统的影响的变量：
·炎性标记物(TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-17)
·细胞介导的免疫响应的Th2-偏差(作为与IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-17相比的IL-5、10、13的增加比看出)
·T-调节细胞增加
评估对内源胰岛素分泌的影响的变量
·血红蛋白Alc(HbAlc)，基准线和随后的探视之间的变化
·每kg体重和24小时的外源胰岛素剂量，基准线和随后的探视之间的变化
·自己报告的低血糖发作的次数
·基准线和随后的探视之间的空腹C-肽变化
·MMTT期间C-肽AUC平均值0-120min，基准线和随后的探视之间的变化
·MMTT期间在第30、60、90和120分钟测量的C-肽
·MMTT期间的最大值C-肽，基准线和随后的探视之间的变化
·具有0.2nmol/L以上的刺激的最大C-肽水平的患者的比例
样本大小：
由于这是仅看不同的治疗是否是安全的研究且不会对β细胞功能和/ 或免疫系统导致消极效果，所以没有进行实际的样本大小的计算。将描述性汇总不良事件和其他安全性数据。将描述性汇总免疫参数和糖尿病状况变量。

Claims (12)

1.包含至少谷氨酸脱羧酶GAD的组合物在制备用于预防和/或治疗自身免疫糖尿病的药物中的用途，包括通过淋巴管内注射或直接注射至淋巴结中来给予受试者所述组合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述自身免疫糖尿病是隐性自身免疫糖尿病。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述谷氨酸脱羧酶GAD配制在氢氧化铝中。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，包括将包含多个颗粒的组合物给予所述受试者，所述颗粒各自具有固定在其表面上的至少一种第一抗原和至少一种第二抗原，其中，所述第一抗原是β细胞自身抗原谷氨酸脱羧酶GAD，并且所述第二抗原是耐受原或β细胞自身抗原，所述组合物进一步可选地包含药用的佐剂、赋形剂、溶剂和/或缓冲剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述第二抗原的β细胞自身抗原选自由谷氨酸脱羧酶GAD、胰岛瘤抗原-2、ZnT8、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白IGRP、嗜铬粒蛋白A、胰岛素、B链胰岛素、前胰岛素原或胰岛素原组成的组。
7.根据权利要求5所述的用途，其中，至少一种β细胞自身抗原是GAD-65。
8.根据权利要求5所述的用途，其中，第二抗原是耐受原。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述耐受原是天然的人类蛋白质。
10.根据权利要求8所述的用途，其中，所述耐受原是IL-10、人血清白蛋白或血红蛋白、或γ-氨基丁酸。
11.根据权利要求5所述的用途，其中，所述颗粒是氢氧化铝颗粒、脂质体、纳米颗粒、金颗粒、或可生物降解的颗粒。
12.根据权利要求5所述的用途，其中，每个颗粒具有固定在其表面上的选自由耐受原和β细胞自身抗原组成的组的2、3、4、5、6、7、8、9、或10种不同的抗原。
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