JP2009159869A - 癌細胞増殖阻害方法、増殖阻害剤及びスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ZNF143の機能を抑制することから成る、癌細胞の増殖阻害方法、ZNF143に特異的なsiRNAのようなZNF143の機能を阻害し得る物質を活性成分として含有する癌細胞増殖阻害剤、癌の予防および/または治療薬、癌細胞を検出する方法、癌の診断剤、ベクターおよび該ベクターを導入した形質転換細胞、ならびにZNF143蛋白の結合阻害量を基準とした癌細胞増殖阻害活性を有する物質のスクリーニング方法。
【選択図】なし
Description
Schuster C. et al. EMBO J. 1995, 14, p3777〜3787 Ishiguchi H. et al. Int. J. Cancer 2004, 111, 900〜909 Wakasugi T. et al. Oncogene 2007 26, p5194〜5203 Myslinski M. et al. J. Biol Chem 2006 Nov.
〔1〕 ZNF143の機能を抑制することを含む、癌細胞の増殖阻害方法。
〔2〕 機能の抑制が、ZNF143をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は15塩基以上の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを用いて行われる、〔1〕記載の方法。
〔3〕 該ポリヌクレオチドが、配列番号6又は8で表されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は21塩基以上の連続するその部分配列を含む二本鎖RNAである、〔2〕記載の方法。
〔4〕 該ポリヌクレオチドが、配列番号1〜3で表されるいずれかのヌクレオチド配列又は21〜24塩基の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む二本鎖RNAである、〔2〕記載の方法。
〔5〕 機能の抑制が、下記のヌクレオチド配列から選択されるいずれかのZNF143結合ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを用いて行われる、〔1〕記載の方法:
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、且つ13番目のヌクレオチドがシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。
〔6〕 癌が、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、胆嚢癌、前立腺癌および子宮頸癌からなる群から選択されるいずれかである、〔1〕記載の方法。
〔7〕 ZNF143の機能を抑制する物質を含有する、癌細胞増殖阻害剤。
〔8〕 該物質が、ZNF143をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は15塩基以上の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターである、〔7〕記載の阻害剤。
〔9〕 該ヌクレオチドが、配列番号6又は8で表されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は21塩基以上の連続するその部分配列を含む二本鎖RNAである、〔8〕記載の阻害剤。
〔10〕 該ヌクレオチドが、配列番号1〜3で表されるいずれかのヌクレオチド配列又は21〜24塩基の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む二本鎖RNAである、〔8〕記載の阻害剤。
〔11〕 該物質が、下記のヌクレオチド配列から選択されるいずれかのZNF143結合ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、〔7〕記載の剤:
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、かつ13番目のヌクレオチドがシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。
〔12〕 癌が、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、胆嚢癌、前立腺癌および子宮頸癌からなる群から選択されるいずれかである、〔7〕記載の阻害剤。
〔13〕 ZNF143の機能を抑制する物質を活性成分として含有する、癌の予防および/または治療薬。
〔14〕 該物質が、ZNF143をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は15塩基以上の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターである、〔13〕記載の予防および/または治療薬。
〔15〕 該ポリヌクレオチドが、配列番号6又は8で表されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は21塩基以上の連続するその部分配列を含む二本鎖RNAである、〔14〕記載の予防および/または治療薬。
〔16〕 該ポリヌクレオチドが、配列番号1〜3で表されるいずれかのヌクレオチド配列又は21〜24塩基の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む二本鎖RNAである、〔14〕記載の予防および/または治療薬。
〔17〕 該物質が、下記のヌクレオチド配列から選択されるいずれかのZNF143結合ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、〔13〕記載の予防および/または治療薬:
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、且つ13番目のヌクレオチドがシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。
〔18〕 癌が、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、胆嚢癌、前立腺癌および子宮頸癌からなる群から選択されるいずれかである、〔13〕記載の予防および/または治療薬。
〔19〕 組織における、ZNF143の発現レベルを測定すること、及び該発現レベルに基づき、該組織中に癌細胞が含まれるか否かを判定することを含む、組織における癌細胞を検出する方法。
〔20〕 ZNF143をコードするポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー、或いはZNF143を特異的に認識する抗体を含む、癌の診断剤。
〔21〕 下記のヌクレオチド配列から選択されるいずれかのZNF143結合ヌクレオチド配列の下流にモニタリング遺伝子をコードするヌクレオチド配列が機能的に連結されたヌクレオチド配列を有するベクター:
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、且つ13番目のヌクレオチドがシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。
〔22〕 〔21〕記載のベクターで形質転換した細胞。
〔23〕 ZNF143の機能を抑制し得る物質を癌細胞の増殖を阻害し得る物質として選択することを含む、癌細胞増殖阻害活性を有する物質のスクリーニング方法。
〔24〕 以下の工程を含む、〔23〕記載の方法:
(a)ZNF143結合ヌクレオチド配列の下流にモニタリング遺伝子をコードするヌクレオチド配列が機能的に連結されたヌクレオチド配列を有するベクターで形質転換した細胞を、被検物質の存在下に培養すること、
(b)被検物質の存在下に培養した細胞におけるモニタリング遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被検物質の非存在下に培養した対照細胞における発現量と比較すること、及び
(c) (b)の比較結果に基づいて、モニタリング遺伝子の発現量を抑制する被検物質を癌細胞の増殖を阻害し得る物質として選択すること。
〔25〕 (a)で培養される細胞が癌細胞である、〔24〕記載の方法。
本発明は、ZNF143の機能を抑制する物質を含む剤を提供する。該物質を哺乳動物に投与し、ZNF143の機能を抑制することにより、該哺乳動物における癌細胞の増殖を阻害し、癌を予防または治療することができる。したがって、本発明の剤は、癌細胞増殖阻害剤として、または癌の予防および/または治療薬として有用である。
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、且つ13番目のヌクレオチドがシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。従って、上記デコイポリヌクレオチド及び該デコイポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターも、本発明の剤に含まれ得るZNF143の機能を抑制する物質として好ましい。ZNF143結合ヌクレオチド配列の好適な例としては配列番号10〜44のいずれかで表されるヌクレオチド配列を挙げることができる。
本発明は、組織における、ZNF143の発現レベルを測定すること、及び該発現レベルに基づき、該組織中に癌細胞が含まれるか否かを判定することを含む、組織における癌細胞を検出する方法(本発明の検出方法)を提供するものである。
(i)配列番号6又は8で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー、或いは
(ii)配列番号7又は9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー
を用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、RT-PCR、ノザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、cDNAアレイ等を挙げることができる。
本発明は、上述のZNF143結合ヌクレオチド配列の下流にモニタリング遺伝子をコードするヌクレオチド配列が機能的に連結されたヌクレオチド配列を有するベクターを提供する。本発明のベクターは、下記の本発明のスクリーニング方法において有用である。
「機能的に連結」とは、細胞内においてZNF143結合ヌクレオチド配列がモニタリング遺伝子のプロモーターとして作用し、ZNF143のZNF143結合ヌクレオチド配列への結合によりモニタリング遺伝子の発現が誘導されるような連結の態様をいう。通常、ZNF143結合ヌクレオチド配列はモニタリング遺伝子の5’に配置される。ZNF143結合ヌクレオチド配列とモニタリング遺伝子の開始コドンとの間の距離は、通常20〜150bpであるが、「機能的に連結」が達成される限り特に限定されない。ZNF143結合ヌクレオチド配列とモニタリング遺伝子の転写開始部位との間に介在するヌクレオチド配列も、「機能的に連結」が達成される限り特に限定されない。
上述の様に、ZNF143の機能を抑制する物質は、癌細胞の増殖を阻害し、癌を予防・治療し得る。従って、ZNF143の機能を抑制する物質を選択することにより、癌細胞の増殖を阻害する物質、あるいは癌の予防および/または治療用物質を獲得することができる。
(a)ZNF143結合ヌクレオチド配列の下流にモニタリング遺伝子をコードするヌクレオチド配列が機能的に連結されたヌクレオチド配列を有するベクターで形質転換した細胞を、被検物質の存在下に培養すること、
(b)被検物質の存在下に培養した細胞におけるモニタリング遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被検物質の非存在下に培養した対照細胞における発現量と比較すること、及び
(c) (b)の比較結果に基づいて、モニタリング遺伝子の発現量を抑制する被検物質を癌細胞の増殖を阻害し得る物質として選択すること。
肺癌細胞株を用いて、RNA干渉法による発現プロファイル解析を行った。すなわち本文記載の配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるsiRNAをインビトロゲン社のリポフェクトアミン2000とOpti−MEM培地を用いて肺癌細胞株にトランスフェクトし、3日間培養した後、DNAアレイにより発現解析した。その結果、ZNF143遺伝子は細胞周期を正に制御する分子群の少なくとも20以上の分子について転写調節を司ることが判った。このことから、ZNF143遺伝子はマスター遺伝子の性格を持っていると推測される。
ゲルシフト法では、上記のZNF143結合ヌクレオチド配列(配列番号10〜44)からなるDNAおよびリコンビナント法で製造したZNF143タンパクを精製したものを用いた。これにより、試験管内実験でZNF143が上記ZNF143結合ヌクレオチド配列に結合することが明らかになった。
クロマチン免疫沈降法では、実際に細胞内にZNF143ポリペプチド/ZNF143結合ヌクレオチド配列の結合体の存在が確認された。具体的な手順は以下の通りである。
1)細胞はZNF143ポリペプチドを産生しているので、細胞内でZNF143ポリペプチド/遺伝子結合体が存在している。
2)ホルムアルデヒドを用いて蛋白とDNAを共有結合させる。
3)細胞を破壊して、核(クロマチン)画分を採取する。
4)超音波を用いてDNAを粉砕する。
5)抗ZNF143抗体で免疫沈降させる。
6)DNAを抽出する。
7)別途、標的遺伝子についてのゲノム情報から確認したプロモーター部の結合ヌクレオチド配列を挟むプライマーを設計しておく。
8)当該プライマーを用いてPCR法でヌクレオチド配列を増幅する。
9)アガロースゲル電気泳動により、PCR産物の存在を確認する。
ZNF143特異的siRNA(配列番号1)を前立腺癌細胞株PC3に導入後72時間での細胞周期をFACS解析した。結果を表2に示す。表中の数値は全細胞数に対する各期の細胞数を百分率で表したものである。この解析により、G2/M期への細胞集積が観察され、subG1分画の出現が認められた。従って、ZNF143に対するsiRNAの細胞内導入で癌細胞の増殖は完全に抑制され、G2/M期で細胞周期の停止を起こすことが分かった。
代表的な癌組織のホルマリン固定パラフィン切片を用いた免疫染色を、ポリクローナル抗体、デキストランポリマー法およびジアミノベンチジン(DAB)を用いて行った(Kohno Y. et al. Brit.J.Cancer 2006,94, p710〜716)。
配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるsiRNAおよび非特異的siRNA(インビトロゲン社のコントロールsiRNA)を、インビトロゲン社のリポフェクトアミン2000とOpti−MEM培地とを用いて肺癌細胞株A549と前立腺癌細胞株PC3とに導入した。肺癌細胞株A549の結果を図5に、前立腺癌細胞株PC3の結果を図6に示す。培養の結果、特異的siRNA導入細胞は非特異的siRNA導入細胞に比べ、細胞増殖が抑制された。
配列番号16に示したZNF143結合塩基配列を2つタンデムに連結した合成DNAを、pGL3(発光遺伝子ルシフェラーゼを持つベクター)の発光遺伝子の上流に挿入した。このプラスミドを前立腺癌PC3細胞に導入し、ルシフェラーゼを恒常的に発現する細胞を樹立した。樹立された細胞は、ZNF143遺伝子依存的にルシフェラーゼを発現する。この培養系に配列番号3で表されるヌクレオチド配列からなるsiRNAと非特異的siRNA(インビトロゲン社のコントロールsiRNA)とを、それぞれ別個に適用したところ、siRNA(配列番号3)の場合はルシフェラーゼの発現が抑制されて発光が低下したが、非特異的siRNAの場合は変化が認められなかった。
Claims (25)
- ZNF143の機能を抑制することを含む、癌細胞の増殖阻害方法。
- 機能の抑制が、ZNF143をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は15塩基以上の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを用いて行われる、請求項1記載の方法。
- 該ポリヌクレオチドが、配列番号6又は8で表されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は21塩基以上の連続するその部分配列を含む二本鎖RNAである、請求項2記載の方法。
- 該ポリヌクレオチドが、配列番号1〜3で表されるいずれかのヌクレオチド配列又は21〜24塩基の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む二本鎖RNAである、請求項2記載の方法。
- 機能の抑制が、下記のヌクレオチド配列から選択されるいずれかのZNF143結合ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを用いて行われる、請求項1記載の方法:
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、且つ13番目のヌクレオチドがシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。 - 癌が、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、胆嚢癌、前立腺癌および子宮頸癌からなる群から選択されるいずれかである、請求項1記載の方法。
- ZNF143の機能を抑制する物質を含有する、癌細胞増殖阻害剤。
- 該物質が、ZNF143をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は15塩基以上の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターである、請求項7記載の阻害剤。
- 該ヌクレオチドが、配列番号6又は8で表されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は21塩基以上の連続するその部分配列を含む二本鎖RNAである、請求項8記載の阻害剤。
- 該ヌクレオチドが、配列番号1〜3で表されるいずれかのヌクレオチド配列又は21〜24塩基の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む二本鎖RNAである、請求項8記載の阻害剤。
- 該物質が、下記のヌクレオチド配列から選択されるいずれかのZNF143結合ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、請求項7記載の剤:
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、且つ13番目のヌクレオチドがシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。 - 癌が、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、胆嚢癌、前立腺癌および子宮頸癌からなる群から選択されるいずれかである、請求項7記載の阻害剤。
- ZNF143の機能を抑制する物質を活性成分として含有する、癌の予防および/または治療薬。
- 該物質が、ZNF143をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は15塩基以上の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターである、請求項13記載の予防および/または治療薬。
- 該ポリヌクレオチドが、配列番号6又は8で表されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は21塩基以上の連続するその部分配列を含む二本鎖RNAである、請求項14記載の予防および/または治療薬。
- 該ポリヌクレオチドが、配列番号1〜3で表されるいずれかのヌクレオチド配列又は21〜24塩基の連続するその部分配列を含むポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む二本鎖RNAである、請求項14記載の予防および/または治療薬。
- 該物質が、下記のヌクレオチド配列から選択されるいずれかのZNF143結合ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、請求項13記載の予防および/または治療薬:
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、かつ13番目のヌクレオチド配列がシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。 - 癌が、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、胆嚢癌、前立腺癌および子宮頸癌からなる群から選択されるいずれかである、請求項13記載の予防および/または治療薬。
- 組織における、ZNF143の発現レベルを測定すること、及び該発現レベルに基づき、該組織中に癌細胞が含まれるか否かを判定することを含む、組織における癌細胞を検出する方法。
- ZNF143をコードするポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー、或いはZNF143を特異的に認識する抗体を含む、癌の診断剤。
- 下記のヌクレオチド配列から選択されるいずれかのZNF143結合ヌクレオチド配列の下流にモニタリング遺伝子をコードするヌクレオチド配列が機能的に連結されたヌクレオチド配列を有するベクター:
(1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列;及び
(2)配列番号4で表されるヌクレオチド配列に60%以上の同一性を有し、配列番号4で表されるヌクレオチド配列の4、5、6番目のシトシンが保存され、且つ13番目のヌクレオチドがシトシンまたはグアニンであるヌクレオチド配列。 - 請求項21記載のベクターで形質転換した細胞。
- ZNF143の機能を抑制し得る物質を癌細胞の増殖を阻害し得る物質として選択することを含む、癌細胞増殖阻害活性を有する物質のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含む、請求項23記載の方法:
(a)ZNF143結合ヌクレオチド配列の下流にモニタリング遺伝子をコードするヌクレオチド配列が機能的に連結されたヌクレオチド配列を有するベクターで形質転換した細胞を、被検物質の存在下に培養すること、
(b)被検物質の存在下に培養した細胞におけるモニタリング遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被検物質の非存在下に培養した対照細胞における発現量と比較すること、及び
(c) (b)の比較結果に基づいて、モニタリング遺伝子の発現量を抑制する被検物質を癌細胞の増殖を阻害し得る物質として選択すること。 - (a)で培養される細胞が癌細胞である、請求項24記載の方法。
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