JP2002536420A - Ｒａｄ５１の新規のアンチセンス阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｒａｄ５１阻害剤を含有する組成物を個体に投与することを含む細胞増殖を阻害する方法を提供する。Ｒａｄ５１阻害剤を含有する組成物を細胞に投与することを含む細胞増殖を阻害する方法も提供する。該方法は、該Ｒａｄ５１阻害剤の投与後に放射線照射またはＤＮＡ障害物質を提供する工程もさらに含み得る。インビボおよび/または癌性細胞で行う方法についても記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、アンチセンス分子を含むＲａｄ５１阻害剤を投与することによる細
胞増殖を阻害する方法、および放射線照射およびＤＮＡ障害化学療法剤に対する
感受性を細胞に与える方法に関する。特に、内科的処置を含みインビボで癌細胞
および個体を処置する。

【０００２】 細胞増殖の制御には高い関心がある。例えば、細胞増殖の阻害は数多くの疾患
、例えば、癌、自己免疫疾患、関節炎、炎症性腹部疾患、医学処置の後の増殖な
どの処置に有用である。したがって、細胞増殖を阻害するために多くの手段がな
されてきた。例えば、化学療法剤が増殖を阻害するため、癌性細胞を殺すために
試みられている。しかし、細胞増殖の阻害を要する疾患を処置するための多くの
手段があるが、さらに効率的な処置、特に、感受性が高く、副作用の少ない処置
を解明する必要がなお存在している。

【０００３】 ひとつの手段で、放射線照射は高度のグリオーマのある小児および成人の両方
について主要な処置法である。低い線状エネルギー移行照射は星状腫瘍の処置に
対していくつかの有益な作用を有することが知られているが、大部分の悪性グリ
オーマは放射線耐性であって、処置における治療率を改善する種々の方法が試み
られている。実際の臨床で通常行なわれる分画的照射の効率は、次の４事項に依
存する。細胞周期における腫瘍細胞の再分配、再集団化、再酸化、致死以下の障
害の修復である。これらの因子は、臨床の実際で適用されているいくつかの手段
をつくる。それには、腫瘍の再集団化を減じるための分画の増進、高圧性酸素や
ニトロイミダゾールによる低酸素性細胞の放射線感作、ＢＣＮＵおよびビンクリ
スチン^{（９−１１）}などの化学療法剤の併用がある。

【０００４】 ある研究によると、Ｒａｄ５１アンチセンス阻害はインビロで正常細胞におけ
る放射線感作を高める（Taki, et al., Biochemical and Biophysical Res. Com
m., 223: 434-438 (1996)）。しかし、この研究は、腫瘍細胞などの異常な細胞
におけるＲａｄ５１アンチセンス阻害の作用について報告していないし、またＲ
ａｄ５１アンチセンス阻害のインビボでの作用についても何ら言及していない。

【０００５】 Ｒａｄ５１は、すべての増殖細胞に検出されるので、興味深い。Ｒａｄ５１は
ＤＮＡ障害の修復に関与するタンパク質のファミリーに属すると思われる。この
ＤＮＡ障害には、例えば、電離性放射線やある種のアルキル化剤によるＤＮＡの
２本鎖の開裂がある。これは修復しないと細胞死につながる。２本鎖開裂修復に
関連する遺伝子いくつかが E. coli および S. cerevisia から単離されている
（Rosa and Cox (1990); Shinohara (1992)）。E. coli を含む大部分の原核細
胞において、ＲｅｃＡタンパク質またはＲｅｃＡ様タンパク質は相同的組換えお
よびＤＮＡ障害に対する種々のＳＯＳ応答で基本的な役割を演じる（Kowalczkow
ski (1987)）。低級の真核細胞である酵母において、ＲＡＤ５２上位性群（ＲＡ
Ｄ５０―ＲＡＤ５７）の遺伝子は、電離性放射線によるＤＮＡ障害修復の能力を
欠くだけでなく、有糸分裂および減数分裂の組換えについての能力の損傷をも有
する変異体でもって解明されている（Resnick(1987); Friedberg(1988)。Ｒａｄ
５１遺伝子はクローン化され、その産物はＡＴＰ依存性ＤＮＡ結合活性を有する
E. coli ＲｅｃＡタンパク質に構造的に類似であると報告されている（Abousse
khara(1992); Basile(1992)）。ある研究によると、酵母Ｒａｄ５１遺伝子のマ
ウス相同体は、２本鎖開裂剤であるメチルメタンスルホネートに対する感受性を
有する S. cerevisia のＲａｄ５１変異を相補する（Morita (1993)）。

【０００６】 本発明は、最初に、Ｒａｄ５１阻害剤を投与することを含む細胞増殖を阻害す
る方法を提供する。本発明はさらに、哺乳動物の２本鎖開裂修復を破壊するＲａ
ｄ５１阻害分子を提供する。さらに、本発明は、Ｒａｄ５１阻害剤を含有する組
成物を投与することによる病気の細胞または個体を処置する方法も提供する。さ
らに、本発明は、Ｒａｄ５１阻害剤を用いてインビボでのＲａｄ５１発現を阻害
する方法を提供する。加えて、本発明は、Ｒａｄ５１阻害剤を用いてインビボで
放射線照射またはアルキル化剤あるいは他のＤＮＡ障害化学療法剤に対する感受
性を誘発する方法を提供する。また、本発明は、アンチセンス分子であるＲａｄ
５１阻害剤を提供する。本発明の他の態様は下記する。

【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、Ｒａｄ５１阻害剤を含有する組成物を個体に投与することを含む細
胞増殖を阻害する方法を提供する。Ｒａｄ５１阻害剤を含有する組成物を細胞に
投与することを含む細胞増殖を阻害する方法も提供する。該方法は、該Ｒａｄ５
１阻害剤の投与後に放射線照射またはアルキル化剤を提供する工程もさらに含み
得る。好ましい実施態様において、この方法は、インビボおよび/または癌性細
胞で行い、内科的処置とともに使用できる。

【０００８】 別の態様において、本発明は、インビボで個体における細胞増殖を阻害する方
法を提供する。この方法は個体にＲａｄ５１アンチセンス分子を含有する組成物
を投与することを含む。本発明はまた、癌性細胞の成長を阻害する方法を提供す
る。この方法は該細胞にＲａｄ５１アンチセンス分子を含有する組成物を投与す
ることを含む。 別の態様において、該本発明は、放射線照射およびＤＮＡ障害化学療法剤に対
する個体におけるインビボ感受性を誘発する方法を提供する。この方法は、個体
にＲａｄ５１アンチセンス分子を含有する組成物を投与することを含む。本発明
はまた、放射線照射およびアルキル化化学療法剤に対する癌性細胞における感受
性を誘発する方法を提供する。この方法は、該細胞にＲａｄ５１アンチセンス分
子を含有する組成物を投与することを含む。ひとつの実施態様において、この方
法は、放射線照射またはアルキル化化学療法剤を投与する工程も提供する。

【０００９】 ひとつの態様において、放射線照射およびＤＮＡ障害物質に対する感受性を増
す方法は、細胞にＡＳ４、ＡＳ５、ＡＳ７、ＡＳ８、ＡＳ９よりなる群から選ば
れる配列を有する少なくとも１つのアンチセンス分子を投与することを含む。本
発明は、癌を有する個体での生存を延長する方法を提供する。この方法は、該個
体にＡＳ４、ＡＳ５、ＡＳ７、ＡＳ８、ＡＳ９よりなる群から選ばれる配列を有
する少なくとも１つのアンチセンス分子を投与することを含む。

【００１０】 本発明のさらなる態様において、本発明の組成物の投与は、該Ｒａｄ５１アン
チセンス分子の局所的配送を含む。さらに、該方法は、該患者の放射線照射処置
および/または化学療法剤処置を含む。

【００１１】 さらに、本発明は、Ｒａｄ５１アンチセンス分子を含み、癌を診断および/ま
たは処置するためのキットを提供する。ひとつの態様においてキットは癌の補助
的療法のためのものである。好ましい実施態様において、キットは、少なくとも
１つの包装物、指示書、適当な緩衝液、調節物、薬学的に許容される担体を含む
。

【００１２】 （図面の簡単な説明） 図１は、Ｒａｄ５１アンチセンス・オリゴヌクレオチドのマップを示す。Ｒａ
ｄ５１アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ＡＳ１からＡＳ３は、Ｒａｄ５１の
コード領域を図示し、ヒトとマウスの両方の配列に相同性である。ＡＳ４および
ＡＳ５は５'非翻訳領域を、ＡＳ６からＡＳ９は３'非翻訳領域を図示する。

【００１３】 図２は、原始の乳房上皮細胞と乳癌細胞系とにおけるＲａｄ５１についての比
較を示す。ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）の抽出物と乳癌細胞系（Ｌ３１、ＭＣ
Ｆ７、ＢＴ２０、ＢＴ５４９、ＢＴ４７４、ＢＴ４６８）からのウエステンブロ
ットを示す。右側に示すように、Ｒａｄ５１Ａおよび対照ｃ−Ｒａｆタンパク質
はポリクローナル抗体プローブで検出される。２つのバンドはＨＭＥＣ抽出物に
おけるＲａｄ５１Ａ抗体でのみ検出される。

【００１４】 図３Ａおよび３Ｂは、Ｒａｄ５１アンチセンスによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒ
ト乳房腫瘍細胞におけるＲａｄ５１阻害を示す。図３Ｂは、アンチセンス・オリ
ゴヌクレオチドによるＲａｄ５１の特異的阻害を示す。Ｒａｄ５１はウエステン
ブロットで監視した。ｃ−Ｒａｆを内部負荷対照として使用した。Ｒａｄ５１発
現の９０％以上が、単一アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたは組み合せアン
チセンス・オリゴヌクレオチドのいずれかの濃度２００ｎＭの使用で阻害される
(図３Ａ)。

【００１５】 図４は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞におけるＲａｄ５１アンチセ
ンスの滴定を示す。種々の濃度のＡＳ６／ＡＳ７アンチセンス・オリゴヌクレオ
チドを用いて、細胞毒性作用なしでＲａｄ５１を阻害するアンチセンス最小量を
決定した。低い２５ｎＭで各ＡＳ６／ＡＳ７アンチセンス・オリゴヌクレオチド
はＲａｄ５１発現を５０％以上阻害するのに充分であった。アンチセンス・オリ
ゴヌクレオチドは濃度１００ｎＭ以上でＲａｄ５１発現をほとんど完全に阻害し
た。

【００１６】 図５は、Ｒａｄ５１アンチセンスによるＵ２５１ヒト脳腫瘍細胞におけるＲａ
ｄ５１阻害を示す。アンチセンス・オリゴヌクレオチドＡＳ１〜ＡＳ９を濃度２
００ｎＭで用いて、脳腫瘍細胞におけるＲａｄ５１発現を阻害した。Ｒａｄ５１
タンパク質はウエステンブロットで監視した。ｃ−Ｒａｆを内部負荷対照として
使用した。Ｒａｄ５１発現の８０％以上の阻害がＡＳ６、ＡＳ８、ＡＳ３で得ら
れた。

【００１７】 図６は、Ｒａｄ５１アンチセンスによるＬＮＣａＰヒト前立腺腫瘍細胞におけ
るＲａｄ５１阻害を示す。アンチセンス・オリゴヌクレオチドＡＳ１〜ＡＳ９を
濃度２００ｎＭで用いて、前立腺腫瘍細胞におけるＲａｄ５１発現を阻害せしめ
た。Ｒａｄ５１タンパク質はウエステンブロットで監視した。ｃ−Ｒａｆを内部
負荷対照として使用した。Ｒａｄ５１発現の８０％以上の阻害がＡＳ６およびＡ
Ｓ８で得られたが、その他のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは種々の程度で
Ｒａｄ５１を阻害した。

【００１８】 図７は、Ｒａｄ５１ＡアンチセンスＯＤＮの細胞増殖に対する作用を示す。Ｒ
ａｄ５１アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房
腫瘍細胞において２５ｎＭから２００ｎＭの範囲の濃度で使用し、細胞の成長お
よび生存能を監視した。対照センス・オリゴヌクレオチドを対照として使用した
。Ｒａｄ５１アンチセンスＯＤＮの単独または組み合わせ（ＡＳ６／ＡＳ７）処
置は増殖を８０％阻害した。Ｒａｄ５１ＡアンチセンスＯＤＮでの処置後４８時
間での細胞の生存能を示す。

【００１９】 図８は、Ｒａｄ５１阻害がシスプラチンでの処置に対し腫瘍細胞に感受性を与
えることを示す。アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＡＳ６）を濃度２５ｎＭ
で用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞におけるＲａｄ５１発現を阻
害せしめた。細胞を２０μＭのシスプラチンで様々な期間で処置した。Ｒａｄ５
１アンチセンスで処置した細胞はシスプラチンに対し、Ｒａｄ５１センス・オリ
ゴヌクレオチドとシスプラチンで処置した対照またはシスプラチンのみで処置し
た細胞のいずれに比しても、より感受性であった。アンチセンスまたはシスプラ
チンのいずれでも処置しなかった細胞も対照として用いた。

【００２０】 図９Ａおよび９Ｂは、ヒトＲａｄ５１ｍＲＮＡ配列を示す。アンチセンス分子
に相補的領域に下線を引いてある。

【００２１】 （発明の詳細な説明）

【００２２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、Ｒａｄ５１が疾患状態に関連し得る多くの細胞機能について果たす
中心的役割に関する発見に基づいている。特に、本発明はＲａｄ５１を阻害する
ことに部分的に基づいている。

【００２３】 本発明でのＲａｄ５１阻害剤は、Ｒａｄ５１核酸の発現または翻訳またはＲａ
ｄ５１ペプチドの生物活性を、少なくとも３０％、好ましくは４０％、より好ま
しくは５０％、さらに好ましくは７０％、さらに好ましくは９０％、最も好まし
くは９５％、阻害する。本発明の一つの実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は
、Ｒａｄ５１核酸の発現または翻訳、またはＲａｄ５１タンパク質の発現または
活性１００％阻害する。

【００２４】 本明細書におけるＲａｄ５１の“生物活性”とは、Ｒａｄ５１の生物活性の中
の１つ意味し、限定するものではないが、これには、既知のＲａｄ５１ＤＮＡ依
存ＡＴＰアーゼ活性、核酸鎖交換活性、Foci形成、単鎖および２本鎖結合活性、
フィラメント形成（酵母のrecＡフィラメントに類似する）、共役活性（Ｄルー
プ形成）などを含む。一つの実施態様において、Ｒａｄ５１の生物活性を阻害す
ることによって細胞増殖は阻害される。別の態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は
、哺乳類の２本鎖損傷修復を妨害する分子として定義される。さらなる態様にお
いて、Ｒａｄ５１阻害剤は、Ｒａｄ５１を含む細胞を放射線照射および／または
化学療法剤に対してより敏感にさせる。

【００２５】 本発明の一つの実施態様において、Ｒａｄ５１の阻害剤は、Ｒａｄ５１の生物
活性、発現または翻訳おける変化を同定するような方法によって同定された物質
、さらに上記に定義したようなＲａｄ５１の調節抑制的物質または阻害剤を含む
。別の態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、既知のＲｅｃＡの阻害剤、および／
または放射線照射に対して細胞を感作しインビボでの組換えに関する態様にも影
響する既知の阻害剤を含み得る。また、注目すべき阻害剤には、限定するもので
はないが、Ｒａｄ５１のペプチド阻害剤（これは、限定するものではないが、ｐ
５３のアミノ酸９４−１６０および２６４−３１５、限定するものではないが単
鎖抗体を含むＲａｄ５１抗体（さらに下記に記載する）のペプチド阻害剤を含む
）、小分子、ヌクレオチド類似体（ＡＤＰ類似体に制限しないがＡＴＰγＳを含
む）、Ｒａｄ５１阻害剤として小さな溝のＤＮＡ結合薬（限定するものではない
が、ジスタマイシンおよびその誘導体を含む）、Ｒａｄ５１の生物活性に対する
既知の放射線感作剤（例えば、キサンチンおよびカフェインを含むキサンチン誘
導体）、Ｒａｄ５１に対する抗原、特にハイブリッドを止めることによって転写
を阻害する物質およびアンチセンス分子を含む。上記阻害剤は、Ｒａｄ５１を直
接的または間接的に阻害し得るが、少なくともＲａｄ５１核酸またはタンパク質
の一部分と相互作用することにより直接的に阻害するのが好ましい。さらに、こ
れらの阻害剤は、個々にまたは互いに組合せて使用することが可能である。

【００２６】 一般的に、Ｒａｄ５１アンチセンス分子は、少なくとも約１０個のヌクレオチ
ド長、より好ましくは少なくとも１２個、最も好ましくは１５個のヌクレオチド
長である。当業者には、該ヌクレオチド長は１０個以上ヌクレオチドからＲａｄ
５１核酸に結合し得る任意の長さに伸長し得ることが解される。本発明の好まし
い実施態様において、該長さは、約３０個のヌクレオチド、より好ましくは約２
５個のヌクレオチドであって、最も好ましいのは１２個〜２５個のヌクレオチド
長である。

【００２７】 本明細書における“核酸”または“オリゴヌクレオチド”または文法的等価
語は、少なくとも２つの互いに共有結合したヌクレオチドを意味する。本発明の
核酸は、ホスホジエステル結合を一般的に含有しているが、以下に示すような、
ある場合には核酸類似体も含み、それは別の骨格、例えば、ホスホラミド（Beau
cage et al., Tetrahedron 49(10): 1925 (1993)およびその引用; Letsinger. J
. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (
1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986); Sawai et al.,
Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J, Am, Chem. Soc. 110: 4470 (
1988): and Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 141 (1986)）、ホスホロチ
オエート(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991);米国特許No. 5,64
4,048), ホスホロジチオエート（Briu et al., J. Am. Chem. Soc.111:2321(198
9)、Ｏ−メチルホスホロアミジット結合（参照、Eckstein, Oligonucleotides a
nd Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press）、ペプチド
核酸の骨格および結合（参照、Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992);
Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365
: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380: 207 (1996)、すべてを出典明示
により本明細書の一部とする）を含んでいてもよい。他の類似体核酸は、陽性骨
格（Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995)）；非イオ
ン骨格（米国特許Nos. 5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141および4,4
69,863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991)
; Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al.
, Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposi
um Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y
. S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal C
hem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994)
; Tetrahedron Lett.37: 743 (1996)）および非リボース骨格（米国特許 No. 5,
235,033 および 5,034,506 and Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580,
"Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui an
d P. Dan Cookに記載されたもの）を包含する。また、１以上の炭素環式糖を含
む核酸（参照、Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) ppl69-176)も核酸の
定義に含まれる。 幾つかの核酸類似体は、Rawls, C & E News June 2,1997 35
頁に記載されている。上記全ての引用は、出典明示により本明細書の一部とする
。リボース−リン酸骨格についてこれらの修飾を行うと、標識などの追加成分の
付加を容易にし、または生理的環境においてこのような分子の安定性および半減
期を増加する。さらに、自然に存在する核酸と類似体の混合物を生成し得る。一
方、異なる核酸類似体の混合物および天然核酸と核酸類似体との混合物を生成し
得る。核酸は、明記したように単鎖または２本鎖であってもよく、または２本鎖
または単鎖配列の一部を含んでもよい。該核酸は、ＤＮＡであってもよく、ゲノ
ムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリドであり得る。ハイブリドおいて、核
酸は、デオキシリボおよびリボヌクレオチドの組み合せ、および塩基のいかなる
組み合せをも含有する。塩基には、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グ
アニン、イノシン、キサタニン、ハイポキサタニンなどがある。

【００２８】 明細書における“核酸”とは、アンチセンス核酸さらに上記記載のものを含み
、組換え核酸である。組換え核酸は、少なくとも１以上の特徴によって天然核酸
と区別される。例えば、核酸は、幾つかまたは全ての核酸と野生型の宿主で普通
に会合する化合物から単離または精製することができ、そのため実質的には純粋
である。例えば、単離された核酸は、自然状態で普通に会合するいくつかの物質
を伴なわない。これは、少なくとも０.５％、より好ましくは試料中の全核酸の
約５％重量を構成する。実質的に純粋な核酸は、全核酸の少なくとも約７５重量
％であり、好ましくは少なくとも約８０％であり、約９０％が特に好ましい。一
方、組換え分子は、合成的に、すなわちポリメラーゼ鎖反応によってつくること
ができるが、形成のために発現される必要がない。該定義は、異なる生物体また
は宿主細胞において一生物体由来の核酸の産生を含む。

【００２９】 アンチセンス分子は、Ｒａｄ５１の発現または翻訳を阻害する普通の細胞内条
件下で標的核酸にハイブリダイズする。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどち
らでもよい。一つの実施態様において、アンチセンス分子は、コード領域に直接
近接する５’または３’の非翻訳領域に結合する。好ましくは、アンチセンス分
子は、開始コドンからの上流または停止コドンからの下流いずれかのコード領域
の１０００個のヌクレオチド以下の核酸に結合する。好ましい実施態様において
、アンチセンス分子は、Ｒａｄ５１分子のコード領域に内で結合する。より好ま
しくは、該アンチセンス分子は、図１および表１以下に示したＡＳ４、ＡＳ５、
ＡＳ６、ＡＳ７、ＡＳ８およびＡＳ９よりなる群から選択される。表１は、同様
に対応するアンチセンスの前の“Ｒ５１”の詳説を含むが、 例えば“ＡＳ４”
“Ｒ５１ＡＳ５”は、本明細書中では相互置換的に使用する。一つの実施態様に
おいて、アンチセンス分子は、構造遺伝子を指向するものではない；この態様は
、アンチセンス分子が別のアンチセンス分子と結合しない場合に、特に好ましい
。どのようなアンチセンス分子も組合せることができると解される。

【００３０】 一つの実施態様において、アンチセンス分子の組合せは利用できる。一つの態
様において、少なくとも１つのアンチセンス分子は、３’の非翻訳領域から選択
される。

【００３１】 “抗体”なる用語は、最も広義に使用され、特に１つの抗Ｒａｄ５１モノクロ
ーナル抗体（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む）およびポリエ
ピトープ特異性を有する抗Ｒａｄ５１抗体組成物を含む。本明細書中で使用され
る“モノクローナル抗体”なる用語は、実質的に相同性のある抗体の集団（すな
わち、該集団からなる個々の抗体が、少量で存在し得る自然に起こり得る突然変
異を除いて同一である）から得られた抗体を示す。

【００３２】 抗Ｒａｄ５１抗体は、ポリクローナル抗体を包含し得る。ポリクローナル抗体
の調製方法は、熟練した当業者には既知である。ポリクロ−ナル抗体は、哺乳動
物で、例えば１以上の免疫化剤、所望によりアジュバンドを接種することによっ
て生じ得る。一般的に、免疫化剤および／またはアジュバンドは、複数の皮下注
射または静脈注射によって哺乳動物において接種される。該免疫化剤は、Ｒａｄ
５１ポリペプチドまたはその融合タンパク質を包含し得る。これは、免疫化され
た哺乳動物において免疫原性であると知られるタンパク質と免疫化剤を結合する
のに有用である。そのような免疫原性タンパク質の例には、限定するものではな
いが、スカシガイ科ヘモシアニン、血清アルブミン、子ウシチログロブリンおよ
びダイズトリプシン阻害剤が含まれる。用い得るアジュバンドの例は、フレッド
・コンプリート・アジュバンド（Freund's complete adjuvant)およびＭＰＬ−
ＴＤＭアジュバンド（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコ
レート(dicorynomycolate)を包含する。免疫化プロトコールは、過度の実験をせ
ずに熟練した当業者によって選択され得る。

【００３３】 抗Ｒａｄ５１抗体は、単クローン抗体であってもよい。単クローン抗体は、ハ
イブリドーマ法、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記
載されている方法により調製することができる。ハイブリドーマ法において、マ
ウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を典型的には免疫剤で免疫して、
免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を惹起す
る。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することができる。

【００３４】 免疫剤は典型的にはＲａｄ５１ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む
。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球（“ＰＢＬ”）を
用い、ヒト以外の哺乳動物源が望ましい場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞を
用いる。リンパ球を次に適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて
細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Ant ibodies: Principles and Practice , Academic Press, (1986) pp.59-103］。不
死化された細胞系は通常形質転換された哺乳動物細胞、特に齧歯類、ウシおよび
ヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞系が用い
られる。ハイブリドーマ細胞を好ましくは、未融合、不死化細胞の成長または生
存を阻害する１以上の物質を含む適当な培地中で培養することができる。例えば
、親細胞に酵素ハイポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラ
ーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠失している場合、ハイブリドーマの培地
は典型的にはハイポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（“ＨＡＴ培地”）
を含み、該物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の成長を防止する。

【００３５】 好ましい不死化細胞系は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞により抗
体の安定な高レベルの発現を維持し、培地、例えばＨＡＴ培地に対して感受性の
ものである。より好ましい不死化細胞系は、ネズミ骨髄腫系であり、これは Sal
k Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe Ame
rican Type Culture Collection, Rockville, Marylandから入手することができ
る。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系も、ヒト単クローン抗体の
産生について記載されている［Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur
et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Mar
cel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63］。

【００３６】 ハイブリドーマ細胞が培養される培地を次にＲａｄ５１に対する単クローン抗
体の存在について分析することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によ
り産生される単クローン抗体の結合特異性を、免疫沈降またはインビトロ結合検
定、例えば放射線免疫検定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩ
ＳＡ）により測定する。このような技術は当分野で公知である。単クローン抗体
の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980
)の Scatchard 分析により測定できる。

【００３７】 望ましいハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサ
ブクローンし、常法により増殖させる［Goding、上記参照］。この目的に関して
適当な培地としては、例えば、ダルベッコの修飾イーグル培地（Dulbecco's Mod
ified Eagle's Media）およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。別法とし
て、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物における腹水などのインビボで増殖させるこ
とができる。

【００３８】 サブクローンにより分泌される単クローン抗体を、通常の免疫グロブリン精製
法、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによ
り培地または腹水から単離し、精製することができる。

【００３９】 単クローン抗体は、組み換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に
記載された方法などによっても調製することができる。本発明の単クローン抗体
をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖を
コードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いるこ
とにより）容易に単離でき、配列決定することができる。本発明のハイブリドー
マ細胞はＤＮＡなどの好ましい供給源の役目をする。単離後、ＤＮＡを発現ベク
ター中に挿入し、これを次に宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法では免疫グロブリンタンパク質を
産生しない骨髄腫細胞中にトランスフェクションして、組み換え宿主細胞におい
て単クローン抗体を合成する。例えばヒト重鎖および軽鎖定常領域を相同性のネ
ズミ配列の代わりに置換するか［米国特許第４８１６５６７号；Morrsion et al
., 上記参照］または免疫グロブリンコーディング配列にすべてまたは一部の非
免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列を共有結合させることによりＤ
ＮＡを修飾することもできる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは本発
明の抗体の定常領域と置換することができるか、または本発明の抗体の抗原結合
部位の可変領域と置換することができ、キメラ二価抗体が形成される。

【００４０】 抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製法は当分野で周知である。例
えば、一方法は免疫グロブリン軽鎖および修飾された重鎖の組み換え発現を含む
。重鎖の架橋を防ぐために、重鎖はＦｃ領域の任意の点で一般に切断されている
。別法として、関連するシステイン残基は架橋を防ぐために、別のアミノ酸残基
で置換するかまたは除去する。

【００４１】 インビトロ法もまた一価抗体を調製するのに適している。断片、特にＦａｂ断
片を産生するための抗体の消化は、当分野で公知の慣例的技術を用いて行うこと
ができる。

【００４２】 本発明の抗Ｒａｄ５１抗体はさらにヒト化抗体またはヒト抗体を含む。非ヒト
（例えばネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列
を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えばＦｖ、
Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または抗体の他の抗原結合サブ配列）である
。ヒト化抗体は、レシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の
特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどのヒト以外
の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換されているヒト免疫グロブリン（
レシピエント抗体）を含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレー
ムワーク残基は対応する非ヒト残基により置換されている。ヒト化抗体はさらに
レシピエント抗体にも、移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られな
い残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は実質的に少なくとも１、典型
的には２の可変領域のすべてを含み、ここにすべてまたは実質的にすべてのＣＤ
Ｒ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべてまたは実質的にす
べてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン共通配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体
は、最適には免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的にはヒ
ト免疫グロブリンの一部を含む［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);
Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. , 2:593-596 (1992)］。

【００４３】 非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野で周知である。一般に、ヒト化抗体はヒ
ト以外である供給源からこれに導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有
する。これらの非ヒトアミノ酸残基は“移入”残基と称することが多く、典型的
には“移入”可変領域から得る。ヒト化は本質的にWinterおよび共同研究者の方
法［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)］
にしたがって、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置
換することにより行うことができる。したがって、このような“ヒト化”抗体は
キメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、実質的に完全でないヒト可
変領域がヒト以外の種からの対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化
抗体は、典型的にはＣＤＲ残基のいくつかと、おそらくはＦＲ残基のいくつかが
齧歯類抗体における類似した部位からの残基により置換されているヒト抗体であ
る。

【００４４】 ヒト抗体はまた、ファージ・ディスプレー・ライブラリー［Hoogenboom and W
inter, J.Mol.Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581
(1991)］を含む当分野で公知のさまざまな技術を用いて産生することができる
。ColeらおよびBoernerらの技術もヒト単クローン抗体を調製するのに利用でき
る（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)）。同様
に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的
にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物、例えばマウス中に導
入することにより調製できる。抗原投与すると、ヒト抗体の産生が観察され、こ
れは遺伝子組換え、会合および抗体レパートリーを含むあらゆる点においてヒト
においてみられるものとよく類似している。この方法は、例えば米国特許第５５
４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号
；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、および以下の科学刊行物に記載さ
れている［Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al
., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishw
ild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Bi otechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)］。

【００４５】 二重特異性抗体は単クローン性であり、好ましくは少なくとも２つの異なる抗
原についての結合特異性を有するヒトまたはヒト化抗体である。本発明の場合、
結合特異性のひとつはＲａｄ５１についてであり、もうひとつは任意の他の抗原
についてのものであり、好ましくは細胞表面タンパク質または受容体または受容
体サブユニットについてのものである。

【００４６】 二重特異性抗体の調製法は当分野で公知である。伝統的には、二重特異性抗体
の組み換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重
鎖／軽鎖対の同時発現に基づく[Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (
1983)]。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな集合のために、これらのハ
イブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ））は１０の異なる抗体分子
の可能性のある混合物を産生し、このうちの１つだけが正しい二重特異性構造を
有している。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によ
り通常行われる。同様の方法は、ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日
公開）、およびTraunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)に開示され
ている。

【００４７】 所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域は免疫グロブ
リン定常領域配列と融合させることができる。融合は、好ましくは少なくともヒ
ンジの一部、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常領域との
融合である。少なくとも融合物の一つにおいて存在する軽鎖結合に必要な部位を
含む第一重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融
合、および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベク
ター中に挿入し、適当な宿主生物中にコトランスフェクションする。二重特異性
抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymolo gy , 121:210 (1986)参照。

【００４８】 異種複合抗体も本発明の範囲に含まれる。異種複合抗体は２つの共有結合した
抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞に望まない細胞を標的と
させるため［米国特許第４６７６９８０号］、またＨＩＶ感染を治療するために
［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］提案され
ている。抗体は、架橋剤を用いる方法を含む合成タンパク質化学の分野において
公知の方法を用いてインビトロで調製することができる。例えば、ジスルフィド
交換反応を用いるか、またはチオエーテル結合を形成することにより、抗毒素を
構築することができる。この目的に適した試薬の例としては、メチル−４−メル
カプトブチルイミデートおよび例えば米国特許第４６７６９８０号において開示
されているものが挙げられる。

【００４９】 一実施態様において、Ｒａｄ５１はＲａｄ５１の相同体を包含する。一態様に
おいて、Ｒａｄ５１相同体は組換え修復におけるＲａｄ５１の役割によって定義
することができる。他の態様において、Ｒａｄ５１遺伝子は、文献上相同性コア
領域として同定されている大腸菌ＲｅｃＡタンパク質の３３〜２４０残基と有意
な配列同一性を共有するタンパク質をエンコードする。Ｒａｄ５１相同体はＲｅ
ｃＡおよび酵母および哺乳動物のＲａｄ５１相同体を包含する。ＲｅｃＡおよび
酵母Ｒａｄ５１はクローン化されており、技術上既知である。Radding, Genetic
Recom. 193-230 (1988); Radding, J. Biol. Chem. 266: 5355-5358 (1991); K
owalczykoswski, et al., Annu. Rev. Biochem., 63: 991-1043 (1994); Basile
, et al., Mol. Cell. Biol., 12: 3235-3246 (1992); Aboussekhara, et al.,
Mol. Cell Biol., 12: 3224-3234 (1992)。大腸菌ＲｅｃＡと酵母Ｒａｄ５１に
対する遺伝子相同体は哺乳動物を含む真核生物のすべての群から単離されている
。Morita, et al., PNAS USA, 90: 6577-6580 (1993); Shinohara, et al., Nat
ure Genet., 4: 239-243 (1993); Heyer, Experentia, 50: 223-233 (1994); Ma
eshima, et al., Gene, 160: 195-200 (1995)。Ｒａｄ５１はヒト、マウス、ニ
ワトリ、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）、シゾサッカロミセ
ス・ポンベ（S. pombe）およびニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa
）のＭｅｉ３に同定されている。ヒトＲａｄ５１相同体はＲａｄ５１、Ｒａｄ５
１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、ＸＲＣＣ２およびＸＲＣＣ３を包含する。
Albala, et al., Genomics, 46: 476-479 (1997); Dosanjh, et al., Nucleic A
cids Res., 26: 1179 (1998); Pittman, et al., Genomics, 49: 103-11 (1998)
; Cartwright, et al., Nucleic acids Res., 26: 3084-3089 (1998); Liu, et
al., Mol. Cell, 1: 783-793 (1998)。

【００５０】 本発明にて提供される一態様において、本発明は細胞増殖の阻害を必要とする
病気の治療法を提供する。好適な態様において、該病気は本明細書記載のＲａｄ
５１の発現、翻訳またはＲａｄ５１生物活性の少なくとも一つの阻害を必要とす
る。当業者も認めるように、病気とは個体が疾患をもつか、または疾患の発症す
る危険性のあることを意味する。

【００５１】 本発明にて提供される方法と組成物により治療し得る病気とは、過剰増殖の疾
病を包含するが、これらに限定されるものではない。より詳しくは、本方法は、
これらに限定されるものではないが、癌（さらに以下で検討）、自己免疫疾患、
関節炎、組織片移植拒絶反応、炎症性腸疾患、医療処置（外科手術、血管形成術
などを含むが、これらに限定されるものではない）後に誘発される増殖などの治
療に使用し得る。このように、一態様において、本明細書記載の発明はこれら疾
病のいずれか一つに罹患しているか、または罹患しそうな細胞または個体に適用
することを包含する。

【００５２】 本発明にて提供される組成物と方法は、特に、癌、例えば、皮膚、乳房、脳な
どの充実性腫瘍、子宮頚部癌、睾丸癌などの治療に有用と思われる。より詳しく
は、本発明の組成物と方法により治療し得る癌は以下のとおりであるが、これら
に限定されるものではない： 心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋
腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫； 肺臓：気管支原性癌（偏平上皮細胞、未分化小細胞、未分化巨細胞、腺癌）、
肺胞（気管支原性）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫
； 胃腸：食道（偏平上皮細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リン
パ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管腺癌、膵島細胞腫、グルカゴノーマ、ガストリノ
ーマ、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ腺腫）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド
腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、線維腫）、大腸（
腺癌、管状腺癌、絨毛腺癌、過誤腫、平滑筋腫）； 生殖泌尿器：腎臓（腺癌、ウイルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病
）、膀胱および尿道（偏平上皮細胞癌、移行型白血球癌、腺癌）、前立腺（腺癌
、肉腫）、睾丸（精上皮腫、奇形腫、胚癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、腸細胞癌、
線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；

【００５３】 肝臓：肝臓癌（肝細胞癌）、肝内胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血
管腫； 骨：骨原発性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユ
ーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊
索腫、骨軟骨腫（骨軟骨外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽腫、軟骨粘液線維腫、類
骨骨腫および巨細胞腫瘍； 神経系：頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫
、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、グリオーマ、脳室上衣芽
細胞腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性グリア芽細胞腫、希突起グリオーマ、神
経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、グリオーマ、肉腫
）； 婦人科：子宮（子宮内膜癌）、頚管（子宮頚管癌、前腫瘍頚管形成異常）、卵
巣（卵巣癌［漿液嚢胞癌、ムチン嚢胞癌、未分類癌］、顆粒膜−卵胞膜細胞腫瘍
、セルトリ−ライジッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（偏平
上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、メラノーマ）、膣（澄明細胞癌、偏平
上皮細胞癌、ブドウ状肉腫［胚横紋筋肉腫］、ファロピオ管（癌）； 血液系：血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球白血病、慢
性リンパ球白血病、骨髄増殖疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］； 皮膚：悪性メラノーマ、基底細胞癌、偏平上皮細胞癌、カポジ肉腫、奇胎形成
異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；および 副腎：神経芽細胞腫。 このように、本明細書に示す用語“癌細胞”は上記に確認した症状のいずれか
に罹患した細胞を包含する。

【００５４】 個体または患者は、一般にヒトを対象とするが、当業者も認めるように、患者
は同様に動物であってもよい。従って、他の動物とは哺乳動物、例えば、げっ歯
類（マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットを包含する）、ネコ、イヌ、
ウサギ、畜産動物としてのウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなど、また霊長類（
サル、チンパンジー、オランウータンおよびゴリラを包含する）などであって、
これらも患者の定義内に包含される。好適な態様において、個体は細胞増殖の阻
害を必要としている。より好ましくは、個体は癌に罹患しているか、または細胞
過剰増殖の症状にある。

【００５５】 本発明により提供される組成物は、前記のように、生理学的に許容し得る担体
と共に宿主に投与することができる。好適な投与方法は全身投与するか、または
腫瘍空洞または脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接投与する。

【００５６】 好適な実施態様において、これらの組成物は、上記概説のように、また遺伝子
療法の適用で技術上一般に知られているように、細胞または患者に投与すること
ができる。遺伝子療法の適用では、Ｒａｄ５１の阻害を達成するために、アンチ
センス分子を細胞内に導入する。“遺伝子療法”は持続効果が単回治療で達成さ
れる場合の通常の遺伝子療法と、治療上有効なＤＮＡまたはＲＮＡを一回または
反復投与する遺伝子治療剤投与との両方である。すでに示されていることである
が、細胞膜により取込みが制限されるために細胞内濃度が低い場合であっても、
短鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチドは阻害剤として作用する細胞に送り込む
ことができる。（Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-414
6 (1986))。該オリゴヌクレオチドはその取込みを上げるために修飾することが
可能であり、例えば、負に荷電したホスホジエステル基を非電荷基に置き換えた
りする。

【００５７】 核酸を生きた細胞に導入するには、利用可能な様々な技法がある。その技法は
核酸をインビトロで培養細胞に移入するのか、または企図する宿主の細胞にイン
ビボで移入するのかにより、変わる。インビトロで哺乳動物細胞に核酸を移入す
るのに適した技法は、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロイ
ンジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法
などである。現在好適なインビボ遺伝子移入技法は、ウイルス（典型的にはレト
ロウイルス）ベクターによるトランスフェクションとウイルス・コートタンパク
質−リポソーム介在トランスフェクションである（Dazau et al., Trends in Bi
otechnology 11, 205-210 (1993))。

【００５８】 場合によっては、標的細胞を標的とする作用因子、例えば、細胞表面膜タンパ
ク質または標的細胞に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体のリガンドなど
をもつ核酸供給源を提供するのが望ましい。リポソームを採用する場合、エンド
サイトーシスと関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を目標用と
して、および／または取込みを容易にするために使用することができるが、それ
らは例えば、特定細胞型に向性なカプシッドタンパク質またはその断片、環化に
際してインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化
を目標とし、細胞内半減期を高めるタンパク質などである。受容体介在エンドサ
イトーシスの技法は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (19
87);および Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Scil USA 87, 3410-3414 (1990
)に記載されている。遺伝子の調製および遺伝子療法プロトコールの総説につい
ては、Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)を参照されたい。

【００５９】 本発明の一態様において、該方法は動物モデルまたは細胞のＲａｄ５１をノッ
クアウトし、さらなる研究のモデルを形成するのに使用する。ノックアウト動物
は次いで対照動物として、またはＲａｄ５１活性のレギュレーターをスクリーニ
ングするために使用することができる。

【００６０】 アンチセンス分子は医薬的に許容し得る担体媒質と混合し併用することができ
る。医療製剤は保存のために、所望等級の純度を有する活性成分を任意の生理的
に許容し得る担体、賦形剤または安定化剤と混合し（レミントン（Remington）
の製剤学、16th edition, Osol, A. Ed. (1989))、凍結乾燥製剤または水溶液の
形状に調製する。許容し得る担体、賦形剤または安定化剤とは、採用した投与用
量と濃度において受容者に非毒性であって、例えば、リン酸、クエン酸および他
の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０
残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免役グロブリンな
どのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グル
タミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖
類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン
など；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖
アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはトゥイーン、プ
ルロニックまたはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤などである。

【００６１】 本発明の医薬組成物の投与用量と所望薬物濃度は企図した特定の用途により変
わり得る。適切な投与用量と投与経路の決定は通常の医師の技量内で十分である
。動物実験はヒト治療用の有効投与量決定に信頼性の高い指標を提供する。有効
投与量の種間計量はモアデンティとチャペルが定めた原理に従い実施し得る（Mo
rdenti, J. and Chappell, W. "トキシコキネティクスにおける種間計量の使用"
Toxicokinetics and New Drug Development (トキシコキネティクスと新薬開発
）, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96)。

【００６２】 一態様において、本発明のＲａｄ５１阻害剤はアルキル化剤と放射線に対する
感受性を誘発する。誘発された感受性（増感または過敏性）は放射線またはアル
キル化剤に対する細胞の耐容性により測定することができる。例えば、測定し得
る感受性すなわち毒性による感受性は、それが少なくとも２０％上昇したとき、
より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ま
しくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは１００％ないし２００％または
それ以上、上昇したときに生じる。

【００６３】 本発明の実施態様において、本発明により提供されるＲａｄ５１阻害剤を投与
することを含む方法は、さらにアルキル化剤の投与または放射線の照射を含む。
本適用の目的において、電離性放射線という用語は、放射線のすべての形状を意
味するものとし、これらに限定されるものではないが、アルファ、ベータおよび
ガンマ線および紫外線を包含し、細胞またはウイルスの遺伝子物質を直接または
間接的に損傷し得るものである。照射処置という用語は対象のサンプルを電離性
放射線に暴露することを意味するものとし、放射線感受性という用語は、細胞ま
たは個体が緩和なまたは医学的に受容可能な（すなわち、非致死性の診断または
治療線量）電離性放射線に暴露された後に、異常な不利な結果を示すものをいう
ものとする。アルキル化剤とはＢＣＮＵ、ＣＣＮＵおよびＭＭＳを包含する。他
の好適な薬剤はシスプラチンおよびカルボプラビム（carboplabim）などの架橋
化剤である。

【００６４】 本発明の一実施態様において、本発明により提供されるＲａｄ５１阻害剤は、
細胞の増殖阻害を必要とする病気の個体の生存時間を延長するために投与する。
好適な態様において、個体はさらに放射線照射またはアルキル化剤の投与を受け
る。

【００６５】 以下の実施例により、上記発明の使用方法をより詳細に説明し、同時に、本発
明の様々な局面を実施するために企図される最良の形態を明らかにする。理解す
べきことは、これらの実施例が本発明の真の範囲を決して限定するものではなく
、むしろ説明を目的として提供されるということである。本明細書に引用した文
献はすべてその全文を出典明示により本明細書の一部とする。

【００６６】 実施例 実施例１ ヒト乳房、脳および前立腺細胞におけるアンチセンス・オリゴデオキシヌクレ
オチドによるヒトＲａｄ５１タンパク質の抑制的調節 本発明では種々のヒト腫瘍細胞系において特異的ヒトＲａｄ５１アンチセンス
・オリゴデオキシヌクレオチドを使用することにより、実質的に完全なＲａｄ５
１タンパク質の低減が達成された。ヒトＲａｄ５１ｍＲＮＡ配列を図９Ａおよび
９Ｂに示すが、アンチセンス分子に相補的な領域には下線を引いてある。

【００６７】 材料と方法 大腸菌におけるＨｓＲａｄ５１遺伝子のクローニングと発現の方法、アミノ末
端に６個のヒスチジン残基をもつ組換えＨｓＲａｄ５１タンパク質の精製、およ
びＨｓＲａｄ５１タンパク質に対するポリクローナル抗体の調製は、技術上既知
の標準的方法により実施した。

【００６８】 ウエスタン・ブロッティングによる抗Ｒａｄ５１抗体でのＲａｄ５１タンパク質
の検出 ウエスタン・ブロットによるタンパク質レベルの定量のために、以下のように
細胞抽出物を調製した。細胞を掻爬して取得し、ＰＢＳで洗浄、遠心分離により
ペレット化した。細胞ペレット（１００ｍｍ平板から）をプロテアーゼ阻害剤含
有のＢ３バッファー２００μｌで再懸濁し、４℃で１０分間振盪した後、トミイ
（Tomy）ミクロ遠心機にて１２,０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心した。Ｂ
３バッファー１リットルを調製するために、１ｍｌのＮＰ−４０、５０ｍｌの５
Ｍ−ＮａＣｌ、１０ｍｌの０.５ｍｌ−ＥＤＴＡ、および５０ｍｌの１Ｍ−トリ
スＨＣｌ（ｐＨ７.５）を８８９ｍｌのｄＨ_２Ｏに加えた。細胞取得の日に、プ
ロテアーゼ阻害剤をＢ３バッファーに加えた（アプロチニン、ロイペプチンおよ
びペプスタチンをそれぞれ最終濃度２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび０.７μ
ｇ／ｍｌとする）。上清はウエスタン・ブロット分析用にとっておいた。サンプ
ルのタンパク質濃度をブラッドフォード・アッセイにより定量した（バイオラッ
ド（BioRad）；リッチモンド、カナダ）。典型的には、タンパク質５０μｇを１
０％ＳＤＳポリアクリルアミド・ミニゲル（ミニプロテアン（Mini Protean）II
、バイオラッド、リッチモンド、カナダ）上、１２０Ｖ、１５０ｍＡｍｐ、１.
５時間の電気泳動により分離した。タンパク質は、トランス−ブロットＳＤセミ
ドライ・トランスファーセル（バイオラッド、リッチモンド、カナダ）を用い、
１５Ｖ、４０ｍＡｍｐで１５分間、移行することによりニトロセルロース（プロ
トラン（Protran）ニトロセルロース、シュライヒャー・アンド・シュエル（Sch
leicher and Schuell）；キーン（Keene)、ニューハンプシャー）に移した。ニ
トロセルロースフィルターのブロッキングは５％ミルク／ＰＢＳ／０.２％トリ
トンＸ−１００中、４℃で一夜実施した。最短ブロッキング時間は１０分である
。液体部分を棄て、Ｒａｄ５１ポリクローナル抗体５ｍｌを加えた（Ａｂ１、オ
ンコジーン・リサーチ・プロダクツ（Oncogene Research Products）、カルビオ
ケム（Caliochem）；ケンブリッジ、マサチューセッツ；１：５００に希釈）。
遠心分離に際し、我々はＲａｆ抗体を使用した（ｃ−Ｒａｆ−１；トランスダク
ション・ラボラトリーズ（Transduction Laboratories）；レキシントン、ケン
タッキー；１：１００に希釈）。ニトロセルロース膜を室温で１時間振盪して、
０.２％トリトンＸ−１００含有トリスバッファー塩溶液（ＴＢＳ）により５分
間３回洗浄し、再度、０.２％トリトンＸ−１００含有ＴＢＳ中の５％ミルクに
より１０分間ブロックした。第二抗体（Ｒａｄ５１用１：１０００希釈のヒツジ
抗ウサギ抗体とＲａｆ抗体用１：２０００希釈の抗マウス抗体）を０.２％トリ
トンＸ−１００およびミルク含有新鮮ＴＢＳに加え、２０〜４０分間振盪し、０
.２％トリトンＸ−１００含有ＴＢＳで１０分間３回洗浄した。ウエスタン・ブ
ロットはスーパーシグナル（Super Signal）（ピアース（Pierce）；ロックフォ
ード、イリノイ）を用い、キットのプロトコールに従い発色した。コダックＸ−
ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに１０秒ないし１分間露出する。

【００６９】 アンチセンス・オリゴヌクレオチドによるＲａｄ５１の抑制的調節 細胞を１×１０^６細胞量で１００ｍｍ組織培養プレート上に塗布し（翌日に約
５０％の集密度を達成するため）、３７℃、５％ＣＯ_２下で一夜インキュベート
した。翌日、細胞にアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレ
オチドを移入するか、またはオリゴヌクレオチドを移入しなかった。トランスフ
ェクション混合物は以下のように設定した：４μｌのサイトフェクチン（Cytofe
ctin）ＧＳＶ試薬（グレン・リサーチ（Glen Research）；スターリング、バー
ジニア）を最終濃度２μｇ／ｍｌ；１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１
ｍＭ−ＥＤＴＡ中オリゴヌクレオチド８μｌ、最終濃度２０〜２００ｎＭ；７８
８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、室温で１５分間インキュベートする。３.
２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジー・インク）を加え、総ト
ランスフェクション容量４ｍｌ用によく攪拌する。培養プレートを約１ｍｌのＯ
ｐｔｉ−ＭＥＭ培地で洗浄し、トランスフェクション混合物４ｍｌを１００ｍｍ
組織培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２下に４時間インキュベートした。
トランスフェクション混合物は同じ最終濃度のオリゴ体（脂質なし）を含む正常
培地と置換え、３７℃で一夜インキュベートした。トランスフェクション操作は
２４時間目で反復した。４８時間目に細胞を取得し、ウエスタン・ブロッティン
グによりタンパク質レベルを分析した。

【００７０】 Ｒａｄ５１アンチセンスとシスプラチンの併用による腫瘍細胞の処理 細胞は、上記操作を以下のように改変して、アンチセンス・オリゴヌクレオチ
ド、センス・オリゴヌクレオチドにより、またはオリゴヌクレオチドなしで処理
した。二度目のトランスフェクション後の２日目に、細胞を種々濃度のシスプラ
チン（０、２０、５０、１００μＭ）により１時間処理し、次いで洗浄し、１０
％ＦＣＳを含む通常の増殖培地中、５％ＣＯ_２下に３７℃で一夜培養した。生存
細胞をオリゴヌクレオチド処理後の適当な時間（２４、４８、７２時間目）に、
血球計を用いる直接計数により測定した。各実験条件は３回測定した。細胞生存
度はトリパンブルー染色により定量した。

【００７１】 結 果 ヒト乳房腫瘍細胞に比較した一次ヒト乳房上皮細胞におけるＲａｄ５１の発現 Ｒａｄ５１タンパク質の発現を数種の異なる乳房腫瘍細胞系および対照として
の一次乳房上皮細胞にて比較した。Ｒａｄ５１タンパク質はＲａｄ５１およびｃ
−Ｒａｆ特異抗体によるウエスタンブロッティングによりモニターした。ｃ−Ｒ
ａｆは内部ローディング対照として使用した。２本のＲａｄ５１のバンドが一次
乳房上皮細胞に検出されたが、一方のバンドは完全長のＲａｄ５１に対応し、他
方は低分子量の産物であった（図２、レーン１）。恐らく、低分子量のバンドは
Ｒａｄ５１タンパク質の分解産物である。乳房腫瘍細胞系はすべて完全長のＲａ
ｄ５１に対応する１本のバンドを優位に示した（図２、レーン２〜７）。乳房腫
瘍細胞系の１つ（ＢＴ５４９）では、Ｒａｄ５１が残りのサンプルよりもゆっく
りと移動した。可能性として、このＲａｄ５１はこの特定の細胞系において修飾
されている（リン酸化またはグリコシル化）。

【００７２】 ヒト乳房、脳および前立腺細胞におけるＲａｄ５１アンチセンス・オリゴデオキ
シヌクレオチドによるヒトＲａｄ５１タンパク質の特異的効率的な抑制的調節 我々は、５’非翻訳領域（ＡＳ４、ＡＳ５）、３’非翻訳領域（ＡＳ６〜ＡＳ
９）およびコーディング領域（Ｒａｄ５１ｍＲＮＡのＡＳ１〜ＡＳ３）を標的と
する潜在的に特異的なアンチセンスＯＤＮ９種類を設計した。本研究に使用した
センス、混交およびアンチセンスＯＤＮすべての配列を表１に示し、Ｒａｄ５１
配列におけるアンチセンスＯＤＮそれぞれの位置を図１に示す。これらのアンチ
センスＯＤＮについて、ヒト乳房、脳および前立腺腫瘍由来のヒト細胞系に対し
て試験した。略完全なＲａｄ５１タンパク質の発現減少を観察したが、ここでは
種々のヒト腫瘍細胞系において、これらの特異ヒトＲａｄ５１アンチセンス・オ
リゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いた（図３〜６）。アンチセンス・オ
リゴヌクレオチドの併用はＲａｄ５１をダウンレギュレーションする際に付加的
であった。さらに、非翻訳領域を標的としたアンチセンス・オリゴヌクレオチド
はＲａｄ５１遺伝子のコーディング領域を標的としたアンチセンスＯＤＮよりも
有意により有効であった。 表１：本研究に使用したアンチセンス・オリゴヌクレオチド配列

【表１】

【００７３】 細胞増殖に対するアンチセンスＯＤＮの効果 ＭＤＭ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞をアンチセンスＯＤＮで処理すると有意に
細胞増殖を阻害した（図７）。センスまたは混交ＯＤＮとのインキュベーション
では細胞増殖に対する効果が僅かであるか、または認められなかった。アンチセ
ンスＯＤＮ ＡＳ３、またはＡＳ３／ＡＳ６またはＡＳ６／ＡＳ７を併用して、
１００ｎＭの濃度で細胞を処理すると、８０％を超えて細胞増殖を阻害するに至
った。この結果は、公表されているデータでの、Ｒａｄ５１はＤＮＡ代謝におい
て必須であり、Ｒａｄ５１のノックアウトまたは阻害は致死的表現型に至らしめ
る、という結果と矛盾しない。

【００７４】 Ｒａｄ５１の抑制的調節は乳房腫瘍細胞をシスプラチンに対し感受性とする。 Ｒａｄ５１を抑制的調節するが、細胞増殖には影響しない濃度のアンチセンス
ＯＤＮを使用した。同様に、非細胞毒性濃度（２０μＭ）のシスプラチンを使用
した。シスプラチンとＲａｄ５１アンチセンス阻害剤両方で処理したＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−２３１細胞は、シスプラチンまたはＲａｄ５１アンチセンスＯＤＮのいずれ
かのみで処理した細胞よりもより効率的に死に至った（図８）。この結果はＲａ
ｄ５１の抑制的調節がシスプラチン処理に対し細胞を感受性化することを示して
いる。

【００７５】 Ｒａｄ５１タンパク質は、ＤＮＡの２本鎖開裂の組換えと修復に重要な原核Ｒ
ｅｃＡタンパク質の高度に保存された真核相同体である。理論に拘束されるもの
でないが、腫瘍細胞におけるＲａｄ５１ｆｏｃ量の増大は、以下３つの理由のい
ずれか１つで起こり得る：１）Ｒａｄ５１における突然変異の存在；２）半減期
上昇によるＲａｄ５１の安定性増大；または３）Ｒａｄ５１の再形成。Ｒａｄ５
１タンパク質が、腫瘍細胞に比較して、最初の細胞において安定化されるか、ま
たは処理されると思われる様式に差のあることを示す。最初の乳房細胞と乳房腫
瘍細胞におけるＲａｄ５１タンパク質を比較すると、Ｒａｄ５１のバンドが２本
存在することが明らかとなった。最初の乳房細胞では、完全長Ｒａｄ５１に相当
する１本のバンドとＲａｄ５１の恐らく分解形状である低分子量のもう１本のバ
ンドが観察され、一方、試験した多くの乳房腫瘍細胞系では、Ｒａｄ５１の単一
バンドが観察される。

【００７６】 Ｒａｄ５１の異なる２本のバンドは恐らく完全長Ｒａｄ５１タンパク質の分解
産物である。最初の細胞において、Ｒａｄ５１は半減期が短く、急速に分解して
低分子量産物となり、それらは多分殆どが不活性な形状である。このように、Ｒ
ａｄ５１タンパク質は、正常細胞に比べて腫瘍細胞においてより安定であり、か
つ多分より活性であると思われる。腫瘍細胞におけるＲａｄ５１の異常発現は、
組換えの上昇とゲノム不安定性、および腫瘍細胞においてＤＮＡの放射線照射が
化学的抵抗性を損なうという観察と矛盾しない。

【００７７】 さらに、理論に拘束されるものでないが、可能性として、Ｒａｄ５１の過剰発
現がＤＮＡ損傷を修復して腫瘍細胞にその他の利点を付与し得ることである。Ｒ
ａｄ５１タンパク質は１本鎖および２本鎖ＤＮＡに結合して、核タンパク質フィ
ラメントを形成する。フィラメント内部のＤＮＡはヌクレアーゼから保護されて
いることが知られている。Ｒａｄ５１の発現は急速に分裂する細胞と腫瘍細胞に
おいて高いことが知られている。これらの観察は重要な診断および治療への応用
性をもつ。

【００７８】 参考文献 １. Roca, A. T., and Cox, M. M. (1990) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25
: 415-456/ 2. Shinohara, A., Ogawa, H., and Ogawa, T. (1992) Cell 69: 457-470. 3. Kowalczykowski, S. C. (1991) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20: 5
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223: 434-438. 13. Muller, P. J., Shin, K. H., and Shin, D. H. (1983) Can. J. Neurol. S
ci. 10: 105-109.

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、Ｒａｄ５１アンチセンス・オリゴヌクレオチドのマップ
を示す。Ｒａｄ５１アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ＡＳ１からＡＳ３は、
Ｒａｄ５１のコード領域を図示し、ヒトとマウスの両方の配列に相同性である。
ＡＳ４およびＡＳ５は５'非翻訳領域を、ＡＳ６からＡＳ９は３'非翻訳領域を図
示する。

【図２】 図２は、原始の乳房上皮細胞と乳癌細胞系とにおけるＲａｄ５１
についての比較を示す。ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）の抽出物と乳癌細胞系（
Ｌ３１、ＭＣＦ７、ＢＴ２０、ＢＴ５４９、ＢＴ４７４、ＢＴ４６８）からのウ
エステンブロットを示す。右側に示すように、Ｒａｄ５１Ａおよび対照ｃ−Ｒａ
ｆタンパク質はポリクローナル抗体プローブで検出される。２つのバンドはＨＭ
ＥＣ抽出物におけるＲａｄ５１Ａ抗体でのみ検出される。

【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、Ｒａｄ５１アンチセンスによるＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞におけるＲａｄ５１阻害を示す。図３Ｂは、アンチ
センス・オリゴヌクレオチドによるＲａｄ５１の特異的阻害を示す。Ｒａｄ５１
はウエステンブロットで監視した。ｃ−Ｒａｆを内部負荷対照として使用した。
Ｒａｄ５１発現の９０％以上が、単一アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたは
組み合せアンチセンス・オリゴヌクレオチドのいずれかの濃度２００ｎＭの使用
で阻害される(図３Ａ)。

【図４】 図４は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞におけるＲａｄ
５１アンチセンスの滴定を示す。種々の濃度のＡＳ６／ＡＳ７アンチセンス・オ
リゴヌクレオチドを用いて、細胞毒性作用なしでＲａｄ５１を阻害するアンチセ
ンス最小量を決定した。低い２５ｎＭで各ＡＳ６／ＡＳ７アンチセンス・オリゴ
ヌクレオチドはＲａｄ５１発現を５０％以上阻害するのに充分であった。アンチ
センス・オリゴヌクレオチドは濃度１００ｎＭ以上でＲａｄ５１発現をほとんど
完全に阻害した。

【図５】 図５は、Ｒａｄ５１アンチセンスによるＵ２５１ヒト脳腫瘍細胞
におけるＲａｄ５１阻害を示す。アンチセンス・オリゴヌクレオチドＡＳ１〜Ａ
Ｓ９を濃度２００ｎＭで用いて、脳腫瘍細胞におけるＲａｄ５１発現を阻害した
。Ｒａｄ５１タンパク質はウエステンブロットで監視した。ｃ−Ｒａｆを内部負
荷対照として使用した。Ｒａｄ５１発現の８０％以上の阻害がＡＳ６、ＡＳ８、
ＡＳ３で得られた。

【図６】 図６は、Ｒａｄ５１アンチセンスによるＬＮＣａＰヒト前立腺腫
瘍細胞におけるＲａｄ５１阻害を示す。アンチセンス・オリゴヌクレオチドＡＳ
１〜ＡＳ９を濃度２００ｎＭで用いて、前立腺腫瘍細胞におけるＲａｄ５１発現
を阻害せしめた。Ｒａｄ５１タンパク質はウエステンブロットで監視した。ｃ−
Ｒａｆを内部負荷対照として使用した。Ｒａｄ５１発現の８０％以上の阻害がＡ
Ｓ６およびＡＳ８で得られたが、その他のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは
種々の程度でＲａｄ５１を阻害した。

【図７】 図７は、Ｒａｄ５１ＡアンチセンスＯＤＮの細胞増殖に対する作
用を示す。Ｒａｄ５１アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＭＤＡ−ＭＢ−２
３１ヒト乳房腫瘍細胞において２５ｎＭから２００ｎＭの範囲の濃度で使用し、
細胞の成長および生存能を監視した。対照センス・オリゴヌクレオチドを対照と
して使用した。Ｒａｄ５１アンチセンスＯＤＮの単独または組み合わせ（ＡＳ６
／ＡＳ７）処置は増殖を８０％阻害した。Ｒａｄ５１ＡアンチセンスＯＤＮでの
処置後４８時間での細胞の生存能を示す。

【図８】 図８は、Ｒａｄ５１阻害がシスプラチンでの処置に対し腫瘍細胞
に感受性を与えることを示す。アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＡＳ６）を
濃度２５ｎＭで用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞におけるＲａｄ
５１発現を阻害せしめた。細胞を２０μＭのシスプラチンで様々な期間で処置し
た。Ｒａｄ５１アンチセンスで処置した細胞はシスプラチンに対し、Ｒａｄ５１
センス・オリゴヌクレオチドとシスプラチンで処置した対照またはシスプラチン
のみで処置した細胞のいずれに比しても、より感受性であった。アンチセンスま
たはシスプラチンのいずれでも処置しなかった細胞も対照として用いた。

【図９】 図９Ａおよび９Ｂは、ヒトＲａｄ５１ｍＲＮＡ配列を示す。アン
チセンス分子に相補的領域に下線を引いてある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アン・バラーガ アメリカ合衆国94025カリフォルニア州メ ンロ・パーク、コルビー・アベニュー1095 番 (72)発明者 デイビッド・エイ・ザーリング アメリカ合衆国94025カリフォルニア州メ ンロ・パーク、コルビー・アベニュー1095 番 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 BB20 CB02 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 JA20 4C084 AA13 ZB212 ZB262 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 ZB21 ZB26

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞増殖を阻害する方法であって、Ｒａｄ５１阻害剤をイン
   ビボ投与することを含む方法。
2. 【請求項２】 癌性細胞増殖を阻害する方法であって、Ｒａｄ５１阻害剤を
   癌性細胞に投与することを含む方法。
3. 【請求項３】 細胞増殖を阻害する方法であって、小分子およびペプチドよ
   りなる群から選ばれるＲａｄ５１阻害剤を投与することを含む方法。
4. 【請求項４】 放射線照射およびＤＮＡ障害化学療法剤に対する個体におけ
   るインビボ感受性を誘発する方法であって、該個体にＲａｄ５１阻害剤を含有す
   る組成物を投与することを含む方法。
5. 【請求項５】 放射線照射およびＤＮＡ障害化学療法剤に対する個体におけ
   るインビボ感受性を誘発する方法であって、該個体に小分子およびペプチドより
   なる群から選ばれるＲａｄ５１阻害剤を含有する組成物を投与することを含む方
   法。
6. 【請求項６】 Ｒａｄ５１アンチセンス分子および修飾ヌクレオチドまたは
   ヌクレオチド相同体を含む組成物。
7. 【請求項７】 Ｒａｄ５１のコード領域の上流または下流の配列を有するＲ
   ａｄ５１アンチセンス分子。
8. 【請求項８】 細胞増殖を阻害する方法であって、細胞にＡＳ４、ＡＳ５、
   ＡＳ７、ＡＳ８、ＡＳ９よりなる群から選ばれる配列を有する少なくとも１つの
   アンチセンス分子を投与することを含む方法。
9. 【請求項９】 放射線照射およびＤＮＡ障害物質に対する感受性を細胞に与
   える方法であって、細胞にＡＳ４、ＡＳ５、ＡＳ７、ＡＳ８、ＡＳ９よりなる群
   から選ばれる配列を有する少なくとも１つのアンチセンス分子を投与することを
   含む方法。
10. 【請求項１０】 癌を有する個体での生存を延長する方法であって、該個体
    にＡＳ４、ＡＳ５、ＡＳ７、ＡＳ８、ＡＳ９よりなる群から選ばれる配列を有す
    る少なくとも１つのアンチセンス分子を投与することを含む方法。
11. 【請求項１１】 該投与が該Ｒａｄ５１アンチセンス分子の局所的配送を含
    む、請求項１０の方法。
12. 【請求項１２】 該投与が該Ｒａｄ５１アンチセンス分子の局所的配送を含
    み、該方法がさらに該患者の放射線照射処置を含む、請求項１０の方法。
13. 【請求項１３】 該投与が該Ｒａｄ５１アンチセンス分子の局所的配送を含
    み、該方法がさらに該患者の化学療法剤処置を含む、請求項１０の方法。
14. 【請求項１４】 癌を診断および/または処置するためのキットであって、
    Ｒａｄ５１アンチセンス分子を含むキット。
15. 【請求項１５】 癌の補助的療法のためのキットであって、Ｒａｄ５１アン
    チセンス分子を含むキット。