CN101548987B - 一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物及其制备方法、以及所述细胞培养提取物在制备治疗阿尔茨海默氏病的药物的应用。具体讲，所述细胞培养提取物既可以减少脑中淀粉样蛋白沉积和神经突触的丢失以及神经胶质细胞增生等神经毒性反应，又可以显著提高阿尔茨海默氏病模型动物的认知能力。
Description
技术领域
本发明属于生物药物领域，特别是涉及治疗阿尔茨海默氏病的药物的领域。具体地，本发明涉及一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物及其制备方法、以及所述细胞培养提取物作为制备治疗阿尔茨海默氏病药物的应用。
背景技术
阿尔茨海默氏病是一个发病机制复杂且目前仍无法治愈的神经退行性疾病。在众多关于发病机制的假说中，淀粉样蛋白假说目前是最为公认的。根据这个假说，最有潜在价值的治疗方法是通过对抗淀粉样蛋白疗法来预防和治疗阿尔茨海默氏病的发病过程。事实上，已经有一些对抗淀粉样蛋白的药物被提议甚至用于了临床治疗中，如生成淀粉样蛋白过程中的关键蛋白——分泌酶的抑制剂。
阿尔茨海默氏病以淀粉样蛋白在特定脑区的选择性沉积和神经毒性为主要特征，其中受主要损害的脑区有海马和基底前脑。然而，尽管淀粉样蛋白存在于整个脑部，而有些脑区却没有明显的淀粉样蛋白沉积以及后者所引起的神经毒性。在脑组织中，神经元所处的液态环境存在很多神经细胞的代谢产物，它们对于神经元的正常生理功能有着至关重要的作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供所述细胞培养提取物的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物。
本发明的还一个目的是提供所述细胞培养提取物作为制备治疗阿尔茨海默氏病药物的应用。
为实现上述目的，本发明的一个技术方案是提供一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)将哺乳动物的非阿尔茨海默氏病病变区的神经细胞以1×105细胞/cm2至1×108细胞/cm2的密度接种至第一培养基，培养18-30小时；
2)将第一培养基全量换成新鲜的第二培养基；
3)培养7-21天，培养期间进行每周两次半量培养基的更换，每次将其中一半的培养基换成新鲜的第二培养基；
4)在最后一次培养基的半量更换后经过至少一天，将第二培养基全部更换成新鲜的第二培养基并继续培养24至48小时；
5)在0-4℃下以1000至5000rpm转速离心1-30分钟，收集上清液；
其中，所述非阿尔茨海默氏病病变区选自脑干、脑桥、基底节、皮质下白质、小脑、脊髓和延髓中的一种或多种，所述第一培养基和第二培养基不同，并且均为选自Neurobasal Medium、199细胞培养基、BME细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、IMEM细胞培养基、RPMI-1640细胞培养基、Fischer’s细胞培养基、HamF10、F12细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、以及McCoy5A培养基中的一种。
优选地，所述非阿尔茨海默氏病病变区选自基底节、小脑、脊髓和延髓中的一种或多种，更优选地选自小脑或脊髓，进一步优选地，选自小脑。
优选地，所述细胞培养提取物对对可溶Aβ1-40的清除效率高于10％并且对不可溶Aβ1-40的清除效率高于10％。
优选地，所述细胞培养提取物对对可溶Aβ1-40的清除效率高于20％并且对不可溶Aβ1-40的清除效率高于20％。
优选地，所述细胞培养提取物对对可溶Aβ1-40的清除效率高于30％并且对不可溶Aβ1-40的清除效率高于30％。
优选地，所述细胞培养提取物对对可溶Aβ1-40的清除效率高于50％并且对不可溶Aβ1-40的清除效率高于50％。
优选地，所述细胞培养提取物对对可溶Aβ1-40的清除效率高于60％并且对不可溶Aβ1-40的清除效率高于60％。
优选地，所述细胞培养提取物对对可溶Aβ1-40的清除效率高于70％并且对不可溶Aβ1-40的清除效率高于70％。
优选地，将所述步骤5)中的上清液进行浓缩，其中所述浓缩可以用本领域任何已知的手段，例如可以用浓缩仪在0-25℃下，优选在0-4℃进行低温浓缩，浓缩倍数为1-300倍，优选30倍。
优选地，将步骤5)中的上清液制成冻干粉。
优选地，将步骤5)中的上清液在低于-80℃下冻存。
其中优选地，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、家兔、牛。
优选地，所述哺乳动物为小鼠或大鼠。
优选地，所述哺乳动物为小鼠的胎鼠或大鼠的胎鼠，或者小鼠的新生鼠或大鼠的新生鼠。
优选地，所述哺乳动物为大鼠。
优选地，所述大鼠为SD大鼠。
优选地，所述SD大鼠为胎鼠或新生鼠。
进一步优选地，所述胎鼠取自10-30天孕龄的SD大鼠。
更进一步优选地，所述胎鼠取自18天孕龄的SD大鼠。
优选地，所述哺乳动物为小鼠。
优选地，所述小鼠为C57小鼠。
优选地，所述C57小鼠为胎鼠或新生鼠。
进一步优选地，所述胎鼠取自10-30天孕龄的C57小鼠。
更进一步优选地，所述胎鼠取自18天孕龄的C57小鼠。
以及根据上述方案制备的细胞培养提取物。
本发明的还一个技术方案是所述细胞培养提取物在制备治疗阿尔茨海默氏病的药物的应用。所述药物可以为注射剂、粉剂、片剂、胶囊剂、溶液、悬浮液、乳液。所述药物的给药途径可以为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
所述细胞培养提取物及其药物组合物可以减少哺乳动物脑中阿尔茨海默氏病病变部位淀粉样蛋白沉积以及神经突触的丢失和神经胶质细胞增生等神经毒性反应，并可以显著提高阿尔茨海默氏病小鼠等哺乳动物的认知能力。
关于本发明中的术语“SD大鼠”，最初源于1925年美国Spraguedawley农场用Wistar培育而成的大鼠。其特点为头部狭长，尾长接近身长，产仔多，生长发育较快，抗病能力尤以对呼吸系统疾病的抵抗力强；自发肿瘤率低，对性激素感受性高；10周龄雄鼠体重可达300-400g，雌鼠可达180-270g。SD大鼠常用作营养学、内分泌学和毒理学研究。生长快，繁育性能好，大多用于安全性试验及营养与生长发育有关的研究。该品系对性激素敏感，对呼吸道疾病有较强的抵抗力。广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。
关于本发明中的术语“C57小鼠”，是一种近交系小鼠，特点是实验结果精度高，可比性好，应激反应均一。
关于本发明中的术语“APP/PS1双转基因小鼠”，是研究痴呆症的疾病模型，在6月龄出现老年斑，12月龄有大量老年斑形成。在3月龄出现认知行为学变化。本发明中不给药时称为wild-type或WT(野生型)。
关于本发明中术语“新生鼠”为出生一周以内的鼠。
关于本发明中的术语“H-CM”，为海马神经元条件培养基。
关于本发明中的术语“N-CM”，为新鲜培养基。
关于本发明中的术语“C-CM”，为非阿尔茨海默氏病病变区神经细胞制备的细胞培养提取物。
关于本发明中的术语“条件培养基”，为培养过细胞的培养基。
关于本发明中的术语“阿尔茨海默氏病病变区”或“阿尔茨海默氏病病变部位”或“病患部位”，均指哺乳动物的脑组织阿尔茨海默氏病病变区域，包括双侧额叶、顶叶、枕叶和颞叶为主的大脑皮质、纹状体、海马及边缘系统和基底前脑。
关于本发明中的术语“非阿尔茨海默氏病病变区”，指哺乳动物的脑组织非阿尔茨海默氏病病变区域，包括脑干、脑桥、基底节、皮质下白质、小脑、脊髓和延髓。
关于本发明中的术语“对可溶Aβ1-40的清除效率”，在本发明中定义为：(M-N)/M×100％，其中按照实施例1中的“脑中淀粉样蛋白含量的检测”的方法，M表示加入新鲜培养基的可溶Aβ1-40的含量，N表示加入所制备的细胞培养提取物的可溶Aβ1-40的含量。
关于本发明中的术语“对不可溶Aβ1-40的清除效率”，在本发明中定义为：(M-N)/M×100％，其中按照实施例1中的“脑中淀粉样蛋白含量的检测”的方法，M表示加入新鲜培养基的不可溶Aβ1-40的含量，N表示加入所制备的细胞培养提取物的不可溶Aβ1-40的含量。
附图说明
图1A是将海马细胞培养基换为实施例1的细胞培养提取物，并同时外源性加入人Aβ1-40(2mg/ml)，于不同孵育时间分别收集培养基并通过ELISA检测其中人Aβ1-40的含量(levels of Aβ，P＜0.01)。
图1B是MTT方法检测实施例1的细胞培养提取物对Aβ1-40所引起的神经毒性(细胞存活率cell viability)的影响(***P＜0.005)。
图1C是Thioflavin-S荧光染色检测实施例1的细胞培养提取物对阿尔茨海默氏病模型鼠大脑内Aβ斑块的影响(WT：野生型小鼠；N：注射空白新鲜培养基组；H：注射海马神经细胞培养提取物组；C：注射细胞培养提取物组)。
图1D是免疫组织化学染色检测实施例1的细胞培养提取物对阿尔茨海默氏病模型鼠大脑内Aβ沉积的影响(WT：野生型小鼠；N：注射空白新鲜培养基组；C：注射细胞培养提取物组)。每组动物数n＝6-10，年龄为12个月龄)。
图2A是Morris水迷宫实验检测实施例1的细胞培养提取物对阿尔茨海默氏病小鼠空间认知能力的影响。曲线表示随着训练天数的增加小鼠寻找平台的潜伏期(latent period)的变化情况(P＜0.01)。
图2B是Morris水迷宫实验中，经过4天训练后不同实验组小鼠游泳轨迹图。
图2C是Morris水迷宫实验中，经过4天训练后撤去平台后不同实验组小鼠穿越原来平台所在位置和其他象限同等位置的次数(platform crossings)。
图2D是避暗实验中，不同实验组小鼠在训练时和考试时分别进入暗室受到电击的潜伏期(step-through latency)。
图2E是免疫组织化学方法检测实施例1的细胞培养提取物对阿尔茨海默氏病模型鼠大脑内星形神经胶质细胞和小胶质细胞增生的影响(*P＜0.05，**P＜0.01)。
图2F是免疫组织化学方法检测实施例1的细胞培养提取物对阿尔茨海默氏病模型鼠大脑内突触丢失的影响(***P＜0.005。每组动物数n＝6到10，年龄为12个月龄)。
图3A是Real-time PCR检测实施例1的细胞培养提取物对原代培养的大脑神经元中淀粉样蛋白降解酶IDE和NEP表达水平的影响(*P＜0.05)。
图3B是Western blot检测实施例1的细胞培养提取物对原代培养的大脑神经元中淀粉样蛋白降解酶IDE和NEP蛋白水平的影响(*P＜0.05)。
图3C是向体外培养的海马神经元中加入实施例1的细胞培养提取物或者同批次的新鲜空白培养基，并同时外源性加入Aβ1-40(2mg/ml)以及NEP和IDE的抑制剂Thiorphan(Th)和Bacitracin(Ba)，于不同孵育时间分别收集培养基并通过ELISA检测其中Aβ1-40的含量(显著性差异分别为P＝0.001，P＜0.0005)。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明进行进一步的详细描述。但是，下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
所有实施例中对APP/PS1双转基因小鼠注射的细胞培养提取物均为未浓缩的细胞培养提取物。
实施例1
1)实验动物
遗传背景是C57BL/6J的APP/PS1转基因小鼠和野生型的同窝小鼠以及C57小鼠均购自中国医学科学院。
2)小鼠非阿尔茨海默氏病病变区原代神经细胞的分离和培养以及细胞培养提取物的制备
提前一天用500μg/ml的多聚D型赖氨酸(Sigma-Aldrich)铺底。紫外灭菌20min以上的超净台中，准备种植液(80％DMEM+10％胎牛血清+10％马血清+谷氨酰胺500μM)、消化液(0.25％胰酶)，并准备5盘解剖液(葡萄糖0.3％，蔗糖0.75％，Hepes 0.23％，NaCl0.9％，KCl 0.04％，Na2HPO4.7H2O 0.018％，KH2PO4 0.003％，酚红0.12‰)，共6个培养皿。用颈部关节脱臼法处死18天孕龄的C57小鼠，在解剖镜下从胎鼠脑中取出脑干、脑桥、基底节、皮质下白质、小脑、脊髓和延髓，分别去除血管和脑膜，并用解剖液洗两次。将取出的这些脑组织剪碎。将消化液倒入尖头的离心管中，用吸管将剪碎的脑干、脑桥、基底节、皮质下白质、小脑、脊髓和延髓组织转入消化液中，消化15分钟。用种植液洗3次，终止胰酶。每次加入种植液后要静置5分钟，使胰酶渗出。加入2～3ml种植液，吹打6～8次，静置5分钟、吸取上清液。再加入2～3ml种植液，吹打6～8次，然后用过滤网除去大的组织块。对滤液进行细胞计数，以1×105细胞/cm2的密度接种(种植液)，24小时后将全部培养基换成Neurobasal(Invitrogen公司)，然后培养一周，期间半量换液两次，每次将其中一半的培养基换成新鲜培养基(在第3天进行第一次半量换液，在第6天进行第二次换液)。当细胞培养到一周后，将细胞培养基全部换为新鲜培养基，继续培养24小时后，收集上清液并4℃，2500rpm，离心10分钟去除细胞，将上清分装(可任选地)储存于-80℃备用，由此制得细胞培养提取物，以六孔板为例，得到约12ml。
按照上述方法，从10只小鼠，共制得细胞培养提取物约120ml。
3)实验动物病患部位的脑脊液提取物注射
细胞培养提取物的注射是通过脑立体定位仪(NARISHIGE，Scientific Instrument Lab，Tokyo，Japan)参照标准图谱(AcademicPublish)进行(前囟后0.8mm，硬膜下2.5mm，旁开0.8mm)。每只动物注射时间5分钟，留针10分钟。注射7天以后，小鼠开始进行水迷宫和避暗实验等行为学检测实验，之后则处死提取脑组织进行组织、形态和生化学检测。
4)行为学实验及数据分析
在所有行为学检测实验中均采取随机双盲的方式。小鼠进行Morris水迷宫训练5到7天。实验前将水缸灌以清水并加入适量新鲜牛奶。平台放入第一象限中部，其顶端平面低于水缸液面2cm。每只小鼠每天训练4到6次。每天将小鼠按东、西、南、北各入水点头朝池壁轻轻放入水中，让其在水缸中游泳60秒钟，期间记录器轨迹以及从入水到找到平台后四肢爬上平台所需的时间，即潜伏期。如果小鼠在60秒内找到平台则让其在平台上待20秒。如果小鼠在60秒内始终没有找到平台，则在60秒后由实验员引导其上平台三次。在距最后一次训练的24小时后，水迷宫中的平台被撤掉，小鼠仍进行一次游泳(考试)，同时记录其轨迹。在避暗实验中，小鼠被背对洞口放入明室内，同时启动计时器。当它进入暗室则会受到一个中等强度的电刺激，同时计时器自动停止。取出小鼠，记录每只鼠从放入明室之进入暗室受到电刺激所需要的时间，也即潜伏期。如果此次潜伏期长于300秒则将该小鼠剔除。在24小时后，重新进行测验并记录进入暗室的动物数，每只动物的潜伏期和300秒内的点击次数。如果潜伏期大于300秒的则记作300秒。
5)脑中淀粉样蛋白斑块的测定
将细胞培养提取物(作为给药组，8只)和新鲜培养基(作为空白对照，8只)按照每只小鼠8μl的剂量分别注射入阿尔茨海默氏病模型小鼠的病患部位，经两周后处死并检测海马和其他病患部位中Aβ的含量。
大脑半球从小鼠脑中取出在冰冻切片机上切成15μm厚的冠状切片，并在4℃丙酮中固定30分钟，固定后的切片储存于-20℃。淀粉样蛋白斑块用荧光染料染色(Thioflavine S)或者通过免疫组织化学检测。Thioflavine S染色步骤是首先将脑切片用去离子水冲洗后放入苏木精染色缸中染色5分钟。之后用流水冲洗5分钟，去离子水漂洗后放入Thioflavine S染色缸中染色5分钟。再用70％乙醇浸泡5分钟，经去离子水漂洗后，晾干，中性树胶封片后于荧光显微镜下观察拍照。电子图像用ImageJ software(NIH)分析。免疫组织化学步骤是丙酮固定后用PBS洗三次，每次5分钟。再用过3％氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS浸泡两次，每次5分钟。5-10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液(兔抗小鼠Aβ抗体，1∶1000，Sigmaaldrich)，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。PBS冲洗三次，每次5分钟。滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30分钟。PBS冲洗三次，每次5分钟。滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分钟。PBS冲洗三次，每次5分钟。显色剂显色3-15分钟(DAB或NBT/BCIP)自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。结果如表1所示。
6)脑中淀粉样蛋白含量的检测
将细胞培养提取物(作为给药组)和新鲜培养基(作为空白对照)按照每只小鼠8μl的剂量分别注射入阿尔茨海默氏病模型小鼠的病患部位，经两周后处死并检测海马和其他病患部位中Aβ的含量。
脑组织在含有蛋白酶抑制剂(AEBSF，1∶1000)的TBS缓冲液中研磨后，4℃离心15000g，60分钟，上清为可溶性的淀粉样蛋白。沉淀再用5mol/Lguanidine HCl和50mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬后即为不可溶性的淀粉样蛋白。蛋白样品分装并冻存于-80℃，其中Aβ40 and Aβ42的含量通过ELISA试剂盒(Invitrogen)检测。具体方法为，将样品和标准品加入酶标板底部，每孔100μl，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板覆膜，37℃反应120分钟。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加一抗工作液100μl，37℃反应60分钟。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，甩干。每孔加二抗工作液100μl，37℃反应60分钟。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，甩干。依序每孔加底物溶液
37℃避光显色适当时间后依序每孔加终止溶液
终止反应，此时孔内液体有蓝色立转为黄色。用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)，参照波长为650nm。结果如表1所示。
7)神经胶质细胞增生的检测
随机等距间隔留取的脑部切片经4℃丙酮固定30分钟后分别用胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein；GFAP)抗体(1∶100，Santa Cruz Biotechnology)和CD68抗体(1∶100，Santa CruzBiotechnology)免疫组织化学检测(具体方法参见产品说明书)星型胶质细胞和小胶质细胞所占的面积比率。
8)突触素(Synaptophysin)含量的检测
随机等距间隔留取的脑部切片经4℃丙酮固定30分钟后用突触素蛋白抗体(1∶100，Santa Cruz Biotechnology)进行免疫组织化学检测(具体方法参见产品说明书)突触素的含量。
9)实时定量PCR
脑组织经匀浆后，用Trizol提取总RNA。1×106细胞加入1ml的Trizol，混匀，室温放置10分钟.加入200μl氯仿/ml Trizol，剧烈振荡15秒或更长时间，室温放置2分钟，4℃，15000g，10分钟。上清转移至另一管中，加Trizol 0.5倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟，4℃，15000g，10分钟。去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤，4℃，6700g，5分钟。小心吸去乙醇，室温晾干。沉淀溶于10μl DEPC水中。去1μl/样品进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，并用GoldView(Beijing SBS Genetech Co.，Ltd)染色，于凝胶成像系统中显色并拍照。灰度分析利用Quality One软件(Bio-Rad公司)。分析表明28S条带是18S亮度的两倍，表明RNA没有降解，可以进行反转录。取各样品的1～5μg总RNA模板，以oligo-p(dT)18为引物，利用M-MuLV反转录酶(Invitrogen)按照厂家提供的说明书反转录成cDNA后，分装于-80℃保存备用。用于检测各基因表达量的引物购自Invitrogen公司。IDE Fw：5’-AAAGAAACTCTCTGCAGA-3’；
Rv：5’-TTATGAATCACCTCAGGT-3’；
β-actin Fw：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’；
Rv：5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3’；
NEP Fw：5’-ATCGG CATGGTCATCG-3’。
实时定量PCR仪器为MX3000P(Stratagene)，加样方式按照RealtimePCR Master Mix(SYBR Green；Toyobo)说明书进行。结果见表2。
10)蛋白质免疫印迹实验
收集细胞或组织，并在同样条件下用冰PBS洗涤两次，用TEN-T溶液或RIPA 4℃裂解1小时或10分钟，4℃，12,000g，15分钟离心得上清，其总蛋白水平用Bicinchoninic Acid法测定后，取每个泳道30μg的上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。向蛋白溶液中加入6×上样缓冲液(1/5样品体积)，煮沸4分钟。电泳胶采用7.5％至10％的分离胶和4％的浓缩胶，电泳条件为210V、10mA 2～2.5小时。接着转移到PVDF膜上。经过含5％(w/v)脱脂奶粉的TTBS(50mM Tris/HCl pH7.4，0.5M NaCl，0.05％Tween 20)室温封闭2小时后，将膜和相应一抗于4℃孵育过夜。一抗的浓度分别为：IDE(1∶4000，abcam)；NEP(1∶500，SantaCruz Biotechnology)；b-actin(1∶500，SantaCruz Biotechnology)。TTBS洗三次，每次15分钟。然后用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育2小时。TTBS洗三次，每次15分钟。在膜上加免疫印迹化学发光试剂，反应1分钟，然后暗室显影，曝光于胶片上(Kodak X-Omatradiograph film)。胶片用扫描仪扫描，并用Quantity One软件进行灰度分析。
11)MTT方法
i.MTT溶液的配制：5mg MTT溶于1ml PBS中，用0.2μM针头除菌滤器过滤除菌后，4℃避光保存；ii.待测细胞以1×104密度，接种到96孔培养板上，每孔200μl；iii.37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养12小时；iv.终止培养前4-6小时，每孔加
MTT，继续培养4小时；v.2000rpm离心5分钟，在吸水纸上扣除上清；vi.每孔加150μl DMSO，震荡15分钟(200转/分钟)溶解沉淀；vii.酶标仪检测490nm吸光度值。
12)数据分析方法
所有数据均表示为(至少三次独立试验)平均值+标准误差(means±SEM)。ANOVA(One-way analysis of variance)方差分析被用来分析各组样品间的显著性差异。最小显著性差异水平被定为p＜0.05。
实验结果与分析：
1)体外培养的非阿尔茨海默氏病病变区神经细胞的细胞培养提取物促进淀粉样蛋白的清除并减少其所引起的神经毒性。
向体外培养的海马神经元中加入原浓度(即未经浓缩)的脑神经细胞培养提取物(给药组)或者同批次的新鲜空白培养基(对照组)。随即向培养基中外源性地加入淀粉样蛋白(βamyloid1-40，Aβ1-40)进行孵育。在不同的孵育时间点取培养基并检测其中Aβ1-40含量。结果显示，给药组的脑神经元能够迅速地清除Aβ1-40，而新鲜培养基孵育的脑神经元则不能有效地清除Aβ1-40(表1，图1A)。
另外，细胞培养提取物还可以保护Aβ引起的神经毒性，提高神经元的存活率(图1B)。
2)该细胞培养提取物减低阿尔茨海默氏病小鼠(APP/PS1转基因小鼠)脑中Aβ的含量。
将细胞培养提取物(作为给药组)和新鲜培养基(作为空白对照)按照每只小鼠8μl的剂量分别注射入阿尔茨海默氏病模型小鼠的病患部位，经两周后处死并检测海马和其他病患部位中Aβ的含量。结果显示，细胞培养提取物显著降低了阿尔茨海默氏病小鼠脑中的可溶性及不可溶性Aβ的含量，并且明显减少了阿尔茨海默氏病病变部位的老年斑(表1，图1C，D)。
3)该细胞培养提取物逆转阿尔茨海默氏病小鼠的病理表型。
首先，细胞培养提取物可以显著改善阿尔茨海默氏病小鼠受损的认知能力(图2A-D)。另外，阿尔茨海默氏病的病理表型还包括胶质细胞增生以及突触损伤。细胞培养提取物减低了阿尔茨海默氏病小鼠脑中由于Aβ毒性所导致的星型胶质细胞和小胶质细胞增生以及突触丢失等病理状况(图2E，F)。
4)该细胞培养提取物上调淀粉样蛋白降解酶的表达。
用细胞培养提取物处理体外培养的脑神经元可以上调淀粉样蛋白降解酶，尤其是胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)和脑啡肽酶(Neprilysin，NEP)的表达水平(表2，图3A-3B)。并且，IDE和NEP的抑制剂则可以抑制细胞培养提取物对Aβ清除的促进作用(图3C)。
表2是实时(Real-time)PCR检测实施例1的细胞培养提取物对SD大鼠大脑内淀粉样蛋白生成和降解相关蛋白表达水平的影响(*P＜0.05)。
以上结果都证明小鼠的非阿尔茨海默氏病病变区的细胞培养提取物可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例2
1)实验动物
SD种系大鼠购自于北京大学医学部实验动物中心。遗传背景是C57BL/6J的APP/PS1转基因小鼠以及野生型的同窝小鼠购自中国医学科学院。
2)大鼠非阿尔茨海默氏病病变区原代神经细胞的分离和培养以及细胞培养提取物的制备
提前一天用500μg/ml的多聚D型赖氨酸(Sigma-Aldrich)铺底。紫外灭菌20min以上的超净台中，准备种植液(80％DMEM+10％胎牛血清+10％马血清+谷氨酰胺500μM)、消化液(0.25％胰酶)，并准备5盘解剖液(葡萄糖0.3％，蔗糖0.75％，Hepes 0.23％，NaCl0.9％，KCl 0.04％，Na2HPO4.7H2O 0.018％，KH2PO4 0.003％，酚红0.12‰)，共6个培养皿。用颈部关节脱臼法处死18天孕龄的SD大鼠，在解剖镜下从胎鼠脑中取出脑干、脑桥、基底节、皮质下白质、小脑、脊髓和延髓，分别去除血管和脑膜，并用解剖液洗两次。将取出的脑组织剪碎。将消化液倒入尖头的离心管中，用吸管将剪碎的脑干、脑桥、基底节、皮质下白质、小脑、脊髓和延髓组织转入消化液中，消化15分钟。用种植液洗3次，终止胰酶。每次加入种植液后要静置5分钟，使胰酶渗出。加入2～3ml种植液，吹打6～8次，静置5分钟、吸取上清液。再加入2～3ml种植液，吹打6～8次，用过滤网除去大的组织块。对滤液进行细胞计数，1×108细胞/cm2的密度接种(种植液)，24小时后将全部培养基换成Neurobasal(Invitrogen公司)，然后培养一周，期间半量换液两次，每次将其中一半的培养基换成新鲜培养基(在第3天进行第一次半量换液，在第6天进行第二次换液)。当细胞培养到一周后，将细胞培养基全部换为新鲜培养基，继续培养48小时后，收集上清液并4℃，5000rpm，离心10分钟去除细胞，，将上清分装(可任选地)储存于-80℃备用，由此制得细胞培养提取物，以六孔板为例，可以得到约共计12ml。
按照上述方法，从10只大鼠，共制得细胞培养提取物约120ml。
可选地，进一步用浓缩仪(Christal)在4℃下旋转浓缩30倍，得到浓缩物约4ml。
可选地，进一步将细胞培养提取物进行冻干制得冻干粉，得到约4mg。
3)实验动物病患部位的脑脊液提取物注射
细胞培养提取物注射是通过脑立体定位仪(NARISHIGE，Scientific Instrument Lab，Tokyo，Japan)参照标准图谱(AcademicPublish)进行(前囟后0.8mm，硬膜下2.5mm，旁开0.8mm)。每只动物注射时间5分钟，留针10分钟。注射7天以后，进行行为学实验，之后处死提取脑组织进行组织、形态和生化学检测。
除了原代神经细胞的分离和培养以及细胞培养提取物的制备中，所用组织或细胞为大鼠的组织或细胞，其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及数据分析方法与实施例1中相同。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果与分析：
1)体外培养的大鼠脑神经细胞的细胞培养提取物促进淀粉样蛋白的清除并减少其所引起的神经毒性。
结果显示，大鼠细胞培养提取物孵育的脑神经元能够迅速地清除Aβ1-40，而新鲜培养基孵育的脑神经元则不能有效地清除Aβ1-40。
另外，大鼠细胞培养提取物还可以保护Aβ引起的神经毒性，提高神经元的存活率。
2)大鼠细胞培养提取物减低阿尔茨海默氏病小鼠(APP/PS1转基因小鼠)以及正常SD大鼠脑中Aβ的含量。
结果显示，大鼠细胞培养提取物显著降低了阿尔茨海默氏病小鼠以及正常SD大鼠脑中的可溶性及不可溶性Aβ的含量，并且明显减少了阿尔茨海默氏病病变部位的老年斑。
3)大鼠细胞培养提取物逆转阿尔茨海默氏病小鼠的病理表型。
大鼠细胞培养提取物可以显著改善阿尔茨海默氏病小鼠受损的认知能力并且减低了由于Aβ毒性所导致的星型胶质细胞和小胶质细胞增生以及突触丢失等病理状况。
以上结果都证明大鼠的非阿尔茨海默氏病病变区的细胞培养提取物可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例3
实验动物以及实验动物病患部位的脑脊液提取物注射
家兔购自于首都医科大学动物中心。遗传背景是C57BL/6J的APP/PS1转基因小鼠以及野生型的同窝小鼠购自中国医学科学院。细胞培养提取物的注射是通过脑立体定位仪(NARISHIGE，ScientificInstrument Lab，Tokyo，Japan)参照标准图谱(Academic Publish)进行(前囟后0.8mm，硬膜下2.5mm，旁开0.8mm)。每只动物注射时间5分钟，留针10分钟。注射7天以后，进行行为学实验，之后处死提取脑组织进行组织、形态和生化学检测。
除了原代神经细胞的分离和培养以及细胞培养提取物的制备中，所用组织或细胞为家兔的组织或细胞，其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及数据分析方法与实施例1中相同。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果与分析
实验结果得到了与之前所述的大鼠，小鼠类似的结果。即家兔来源的非阿尔茨海默氏病病变区的细胞培养提取物可逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例4
实验动物以及实验动物病患部位的脑脊液提取物注射
实验用牛购自于安徽科技学院实验动物房。遗传背景是C57BL/6J的APP/PS1转基因小鼠以及野生型的同窝小鼠购自中国医学科学院。细胞培养提取物的注射是通过脑立体定位仪(NARISHIGE，Scientific Instrument Lab，Tokyo，Japan)参照标准图谱(Academic Publish)进行(前囟后0.8mm，硬膜下2.5mm，旁开0.8mm)。每只动物注射时间5分钟，留针10分钟。注射7天以后，进行行为学实验，之后处死提取脑组织进行组织、形态和生化学检测。
除了原代神经细胞的分离和培养以及细胞培养提取物的制备中，所用组织或细胞为牛的组织或细胞，其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及数据分析方法与实施例1中相同。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果与分析
实验结果得到了与之前所述的小鼠、大鼠、家兔类似的结果。即牛来源的非阿尔茨海默氏病病变区的细胞培养提取物可逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例5～8
以与前述同样的方法分别从小鼠、大鼠、家兔、牛的脑干分离并培养细胞，制备细胞培养提取物，并以同样的方法进行其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及采用相同的数据分析方法。所用动物及试剂来源同上。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果得到了与前述源自小鼠、大鼠、家兔、牛的非阿尔茨海默氏病病变区细胞培养提取物类似的结果。即分别源自小鼠、大鼠、家兔、牛的脑干的神经元细胞培养提取物均可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例9～12
以与前述同样的方法分别从小鼠、大鼠、家兔、牛的脑桥分离并培养细胞，制备细胞培养提取物，并以同样的方法进行其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及采用相同的数据分析方法。所用动物及试剂来源同上。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果得到了与前述源自小鼠、大鼠、家兔、牛的非阿尔茨海默氏病病变区细胞培养提取物类似的结果。即分别源自小鼠、大鼠、家兔、牛的脑桥的神经元细胞培养提取物均可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例13～16
以与前述同样的方法分别从小鼠、大鼠、家兔、牛的基底节分离并培养细胞，制备细胞培养提取物，并以同样的方法进行其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及采用相同的数据分析方法。所用动物及试剂来源同上。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果得到了与前述源自小鼠、大鼠、家兔、牛的非阿尔茨海默氏病病变区细胞培养提取物相比较好的结果。即分别源自小鼠、大鼠、家兔、牛的基底节细胞培养提取物均可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例17～20
以与前述同样的方法分别从小鼠、大鼠、家兔、牛的皮质下白质分离并培养细胞，制备细胞培养提取物，并以同样的方法进行其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及采用相同的数据分析方法。所用动物及试剂来源同上。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果得到了与前述源自小鼠、大鼠、家兔、牛的非阿尔茨海默氏病病变区细胞培养提取物类似的结果。即分别源自小鼠、大鼠、家兔、牛的皮质下白质细胞培养提取物均可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例21～24
以与前述同样的方法分别从小鼠、大鼠、家兔、牛的小脑分离并培养细胞，制备细胞培养提取物，并以同样的方法进行其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及采用相同的数据分析方法。所用动物及试剂来源同上。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果得到了与前述源自小鼠、大鼠、家兔、牛的非阿尔茨海默氏病病变区细胞培养提取物相比较好的结果。即分别源自小鼠、大鼠、家兔、牛的小脑细胞培养提取物均可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例25～28
以与前述同样的方法分别从小鼠、大鼠、家兔、牛的脊髓分离并培养细胞，制备细胞培养提取物，并以同样的方法进行其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及采用相同的数据分析方法。所用动物及试剂来源同上。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果得到了与前述源自小鼠、大鼠、家兔、牛的非阿尔茨海默氏病病变区细胞培养提取物相比较好的结果。即分别源自小鼠、大鼠、家兔、牛的脊髓细胞培养提取物均可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
实施例29～32
以与前述同样的方法分别从小鼠、大鼠、家兔、牛的延髓分离并培养细胞，制备细胞培养提取物，并以同样的方法进行其余试验(例如实时定量PCR、行为学实验及数据分析、脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测、神经胶质细胞增生的检测、突触素含量的检测、蛋白质免疫印迹实验、MTT方法等)以及采用相同的数据分析方法。所用动物及试剂来源同上。其中脑中淀粉样蛋白斑块的测定、脑中淀粉样蛋白含量的检测的结果如表1所示。
实验结果得到了与前述源自小鼠、大鼠、家兔、牛的非阿尔茨海默氏病病变区细胞培养提取物相比较好的结果。即分别源自小鼠、大鼠、家兔、牛的延髓细胞培养提取物均可以逆转阿尔茨海默氏病的发病过程和病理表型。
表1：实施例1-32的细胞培养提取物对阿尔茨海默病模型鼠大脑内Aβ水平的影响(#表示P＜0.001，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05；S.E.M.：standard error of mean，平均标准误差)
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。
Claims (11)
1.一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)将哺乳动物的非阿尔茨海默氏病病变区的神经细胞以1×105细胞/cm2至1×108细胞/cm2的密度接种至第一培养基，培养18-30小时；
2)将第一培养基全量换成新鲜的第二培养基；
3)培养7-21天，培养期间进行每周两次半量培养基的更换，每次将其中一半的培养基换成新鲜的第二培养基；
4)在最后一次培养基的半量更换后经过至少一天，将第二培养基全部更换成新鲜的第二培养基并继续培养24至48小时；
5)在0-4℃下以1000至5000rpm转速离心1-30分钟，收集上清液；
其中，所述非阿尔茨海默氏病病变区选自脑干、脑桥、基底节、皮质下白质、小脑、脊髓和延髓中的一种或多种，所述第一培养基和第二培养基不同，并且均为选自Neurobasal Medium、199细胞培养基、BME细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、IMEM细胞培养基、RPMI-1640细胞培养基、Fischer’s细胞培养基、Ham F10细胞培养基、Ham F12细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、以及McCoy5A培养基中的一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将步骤5)中的上清液在0-25℃下进行浓缩，浓缩倍数为1-300倍。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述浓缩倍数为30倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其中将步骤5)中的上清液制成冻干粉。
5.根据权利要求1所述的方法，其中将步骤5)中的所述上清液在低于-80℃下冻存。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、家兔、牛中的一种。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述小鼠为小鼠的胎鼠或新生鼠，所述大鼠为大鼠的胎鼠或新生鼠。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述小鼠的胎鼠为C57小鼠的胎鼠，所述大鼠的胎鼠为SD大鼠的胎鼠。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述C57小鼠的胎鼠为孕龄18天的C57小鼠的胎鼠，所述SD大鼠的胎鼠为孕龄18天的SD大鼠的胎鼠。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法制备的细胞培养提取物。
11.根据权利要求10所述的细胞培养提取物作为制备治疗阿尔茨海默氏病药物的应用。
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