CN107693615A - 一种治疗老年痴呆的中药提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及五味子藤茎（rattans of Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.）提取物的制备方法及其治疗老年痴呆的医药用途。本发明从五味子藤茎（rattans of Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.）中制备得到五味子藤茎提取物。经实验研究证明，该提取物具有明显的治疗老年痴呆的作用。

Description

一种治疗老年痴呆的中药提取物及其制备方法

技术领域：

本发明涉及五味子藤茎（rattans of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）提取物的制备方法及其治疗老年痴呆的医药用途。

背景技术：

老年痴呆又名阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD），是发病率最高的中枢神经系统退变性疾病。临床表现为进行性记忆减退、认知障碍、行为情绪失常、生活自理能力丧失，严重痴呆以至植物人状态，最终导致死亡。据统计，目前全球AD患者有2600万人，我国AD患者超过600万，即平均每4位AD患者中就有一位是中国人，而且呈现逐年上升的趋势。我国60岁以上人群AD患病率为6.9%，80岁以上人群AD患病比例超过22%，该病是导致老年人死亡的四大病因之一。AD不仅严重威胁着老年人的身心健康，同样给家庭和社会带来沉重的负担。

目前市场上治疗AD的化学药物只能暂时改善症状，一定程度延缓病程，均不能有效预防和治疗AD，远期疗效差且多有较为严重的毒副作用。与之相比，中草药以其疗效独特、毒副作用小、开发潜能巨大引起人们广泛的关注，中草药的研究将是治疗AD药物开发的有效途径。

五味子是东北地产中药材，木质藤本，果实入药。由于国内外市场的需求量不断增加，野生资源已远不能满足市场需求，现以人工栽培为主，东北三省是国内人工栽培五味子的大省，种植面积达2000余公顷，且呈逐年扩大的趋势。为了提高五味子果实的产量，植株落叶后2-3周至翌年树液流动开始前一个月需进行冬剪，5月上中旬至8月上中旬还需进行夏剪，以每公顷（株行距0.5m×2m）栽培植株10000株，每株每年剪枝0.25公斤计算，每年被剪掉的藤茎重达5000吨以上！这些大量剪掉的藤茎至今未被开发利用，造成了严重的药材资源浪费。本发明人发现五味子藤茎提取物具有较好的治疗AD作用，在对抗Aβ引起的神经和胶质细胞损伤方面作用尤为突出，并确定了该提取物的制备方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种治疗老年痴呆的中药，治疗方案是基于中医药理论，针对类老年痴呆发病机理的认识而确定的治疗原则，并通过大量的试验研究，从五味子藤茎中合理提取获得用于治疗老年痴呆的提取物。

本发明五味子藤茎提取物的制备方法，其特征在于：

（1）将五味子藤茎药材加10倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，得到乙醇提取液，过滤合并提取液，减压回收至无醇味，冷冻干燥后即得五味子藤茎乙醇提取物。

（2）将步骤（1）制备的五味子藤茎乙醇提取物，采用大鼠海马区注射Aβ的方法建立AD模型，以Morris水迷宫测试结果（包括定位航行、空间探索实验）和神经因子（GDNF、BDNF、NGF）、炎性因子（TNF-α、IL-1β）以及氧化应激相关因子（SOD、GSH-P_X、MDA）的水平为指标，考察五味子藤茎提取物对AD大鼠的学习记忆能力、神经细胞损伤程度、自由基代谢水平的影响，探讨其治疗老年痴呆的药理作用。

本发明相对于现有技术的优势在于：

在临床上用于老年痴呆的治疗和预防；

利用本发明生产的药物制剂的药理、药效学研究，证实其具有治疗老年痴呆的作用；

本发明涉及的具有治疗老年痴呆作用的五味子藤茎提取物的制备方法，工艺简便，易于操作，重现性良好，成本低，易于大规模生产。

具体实施方式

本发明采用大鼠海马区注射Aβ的方法建立AD模型进行体内药效学实验，评价五味子藤茎提取物治疗老年痴呆的药效作用，说明五味子藤茎提取物在治疗老年痴呆方面的药物用途。

下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

1 实验样品

将五味子藤茎药材加10倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，得到乙醇提取液，过滤合并提取液，减压回收至无醇味，冷冻干燥后即得五味子藤茎乙醇提取物。

2 实验方法

2.1 AD大鼠分组与造模

清洁级SD大鼠（180±20 g，雌雄各半）适应饲养一周后，将40只大鼠随机分为5组，8只/组，依次为：空白组，模型组，阳性药组（20 mg/kg），五味子藤茎提取物高剂量组（SCS-H，200mg/kg），五味子藤茎提取物低剂量组（SCS-L，67 mg/kg），每天灌胃1次，连续给药14 d，阳性药为盐酸多奈哌齐，空白组和模型组给予同等剂量生理盐水。

老年SD（380±20 g）大鼠腹腔注射3.6 mL/kg 10%水合氯醛麻醉，待大鼠麻醉后，用脑立体定位仪固定头部。然后用酒精对大鼠颅顶消毒，清理大鼠颅顶毛发，在头背中部纵向切口，暴露颅骨。参照《大鼠脑立体定位图谱》定位坐标，分离骨膜使头骨暴露，于前囟向后2.8 mm，分别向中线的左右各旁开1.9 mm处，用牙科钻将颅骨钻孔，用微量进样针垂直进样4.2 mm，将5 µL Aβ _1-42在5 min内分别缓慢注入两侧海马区，并留针5 min使溶液充分弥散，最后将微量进样针缓慢移除，缝合切口皮肤。造模后连续注射青霉素3 d进行消毒。

2.2 定位航行实验

实验各组灌胃第10 d进行Morris水迷宫行为学测试，每天1次，共5次，每次实验前动物自由游泳2 min。水迷宫为一不锈钢圆形水池，直径150 cm，高60 cm，内置不锈钢圆柱平台，平台高40 cm，底面为6 cm×10 cm，开始前在水池壁东、西、南、北四个方位分别表明入水点。Morris水迷宫测试的前1 d让大鼠自由游泳，随后5 d对各组大鼠进行Morris水迷宫测试，将Morris水迷宫中安全平台放置在第Ⅳ象限距池壁22 cm处。在测试前，将水迷宫水池中加入4瓶盖墨汁，再加入自来水至水面高出安全平台1 cm，使墨汁均匀分布在池水中且为不透明黑色，并保证安全平台不能明显的看出，水温保持在(22±1)℃。实验室保持安静，室内以亮度均匀的恒定日光灯照明，窗户遮以不透光窗帘，在进行水迷宫实验的几天时间内水池周围参照物位置保持不变。Morris水迷宫实验前4 d为定位航行实验，每天从第Ⅰ象限同一入水点面沿池壁将大鼠缓慢放入水池，使其自由游泳，大鼠游泳时实验者位置始终保持不变，每天训练1次，每次每只训练1 min，连续4 d。摄像系统将自动记录动物寻找并登上第Ⅳ象限平台的轨迹及所需时间，即为逃避潜伏期。若大鼠在60 s之内尚未找到平台，将其引导至平台，使其在平台上停留20 s，若大鼠在60 s之内找到平台，也将其引导至平台，停留15 s，结束一次训练并将逃避潜伏期记为60 s。

2.3 空间探索实验

在训练第5 d（定位航行实验结束），移走安全平台，将大鼠从第Ⅰ象限入水点面向池壁放入水池，使大鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台。测试1 min内大鼠在水池中的行动轨迹并记录大鼠游泳运动的相关数据。

2.4 样品的处理

Morris水迷宫测试实验结束后，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉。血样从肝门静脉收集，并通过离心（4℃，3500 rpm/ 20 min）收集血液血清并储存在-80℃冰箱。然后，用0.9%的生理盐水溶液进行心脏灌注，经左心室向主动脉插管，固定插管并剪开右心耳至大鼠血管内血液全部流出，即生理盐水充满血管。随后用4%多聚甲醛（含0.1 M磷酸盐缓冲液PBS，pH 7.2）进行心脏灌注，至肢体变硬，从而达到固定的效果，并将大鼠的脑组织取出。解剖出的脑组织一部分在液氮中快速冷冻，然后储存在-80℃冰箱。而另一部分脑组织用10 %的福尔马林固定，储存在4℃冰箱。

2.5 指标检测

取大鼠血清，按ELISA试剂盒方法测定神经胶质细胞衍化营养因子（GDNF）、脑衍化神经营养因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）和白介素-1β （IL-1β）的含量，取组织匀浆液，按试剂盒方法测定脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-P_X）活性和丙二醛（MDA）的含量。

2.6 HE染色

将脑组织固定，然后依次采用85%、90%、95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，60℃浸蜡包埋，4 µm厚度切片，脱蜡复水，苏木精液染色5 min，1%盐酸3-5s，0.5%伊红液染色2 min，切片脱水透明，中性树胶封片。

2.7 免疫组织化学染色

将脑组织固定，然后依次采用85%、90%、95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，60℃浸蜡包埋，4 µm厚度切片，脱蜡复水，3% H₂O₂ 室温避光10 min，枸橼酸缓冲盐溶液内用微波炉微波炉加热至沸10 min，共3次，PBS3 min，清洗3次，山羊血清37℃、20 min，甩干；滴加一抗（GFAP、CD11b） 4℃过夜，二抗37℃、30 min，DAB室温染色，苏木素复染2 min，脱水固定封片。

2.8 统计方法

各组别的数据结果以±s表示，运用SPSS 18.0软件，采用One-Way ANOVA检验进行组间比较，P<0.05有统计学意义。

3 实验结果

3.1 定位航行实验结果

与空白组相比，模型组逃避潜伏期明显延长，且具有显著性差异（P<0.05）；与模型组相比，阳性药组、SCS(H)组能够明显缩短AD大鼠潜伏期（P<0.05），如表1。

表1 五味子藤茎对AD大鼠潜伏期的影响 (n=10 ±s)

*P<0.05, **P<0.01(as compared with the Model) ^#P<0.05, ^##P<0.01(ascompared with the Control)

3.2 空间探索实验结果

空间探索实验结果表明，与空白组相比，模型组大鼠空间探索时间较长；与模型组相比，阳性药组、SCS(L)组和SCS(H)组大鼠寻找平台的路程明显减短。

3.3 对BDNF、GDNF、NGF神经因子的影响

由表2可以看出，与空白组相比，模型组大鼠血清中的神经因子BDNF、GDNF、NGF含量明显降低（P<0.05）；与模型组相比，阳性药组、SCS(L)组和SCS(H)组神经因子BDNF、GDNF、NGF的表达均能升高（P<0.05），并且具有剂量依赖性。

表2 五味子藤茎对AD大鼠血清中BDNF、 GDNF and NGF等水平的影响 (n=10 ±s)

Group	BDNF (ng/L)	GDNF (ng/L)	NGF (ng/L)
				Control	22.26±4.54	7.73±1.89	35.59±5.27
Model	15.30±3.71#	3.88±0.68#	16.34±3.26##
				Positive	22.13±2.06*	7.23±1.08*	33.28±4.72*
SCS(H)	21.39±3.82*	7.09±2.04*	32.63±4.25*
				SCS(L)	18.50±2.32	6.58±1.36	30.47±4.40*

*P<0.05, **P<0.01(as compared with the Model) ^#P<0.05, ^##P<0.01(ascompared with the Control)

3.4 对TNF-α、IL-1β炎性因子的影响

由表3可以看出，通过向大鼠海马区注射Aβ的实验，与空白组相比，模型组大鼠血清中的炎性因子TNF-α，IL-1β含量明显增加（P<0.05）。与模型组相比，阳性药组与SCS(H)组炎性因子含量显著降低（P<0.05），并恢复到与正常大鼠相近水平。

表3 五味子藤茎对AD大鼠血清中TNF-α和IL-1β等水平的影响 (n=10 ±s)

Group	TNF-α	IL-1β
			Control	32.26±4.43	2.43±0.35
Model	54.47±7.03##	3.86±0.42#
			Positive	33.66±4.57**	2.42±0.22*
SCS(H)	33.15±3.75*	2.48±0.19*
			SCS(L)	36.09±3.02*	2.67±0.28*

*P<0.05, **P<0.01(as compared with the Model) ^#P<0.05, ^##P<0.01(ascompared with the Control)

3.5 对SOD、GSH-P_X、MDA水平的影响

由表4可以看出，与空白组相比，AD模型组大鼠的脑组织中SOD与GSH-P_X水平明显降低（P<0.05）；与模型组相比，阳性药组、SCS(H)和SCS(L)组的SOD与GSH-P_X活力水平明显增加，且具有显著意义，并且呈现一定的剂量依赖性（P<0.05）。

同时，与空白组相比，模型组AD大鼠血清中MDA水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，阳性药组、SCS(H)和SCS(L)组大鼠血清中MDA水平明显减少（P<0.05），且具有一定的剂量依赖性。

表4 五味子藤茎对AD大鼠血清中MDA, SOD和GSH-P_X水平的影响(n=10 ±SD)

*P<0.05, **P<0.01(as compared with the Model) ^#P<0.05, ^##P<0.01(ascompared with the Control)

3.6 HE染色结果

通过对AD大鼠海马区的HE染色，观察其病理学变化与神经元存活情况。空白组海马CA1区神经元结构完整，细胞排列整齐，分布均匀，细胞膜清晰，无变性，形态正常。模型组较空白组相比，大鼠海马区细胞排列疏松紊乱，细胞外空隙增大，多数神经细胞形态改变，包浆深染，细胞膜、核界限不清晰，可见坏死的神经元。与模型组相比，阳性药组、SCS(H)和SCS(L)组的细胞形态、排列、数目均有所改善，神经元受损不明显，表明五味子藤皮提取物对大鼠海马神经元损伤细胞具有一定的改善作用。

3.7 脑组织CD11b的表达

CD11b作为小胶质细胞的特异性标志物，主要表达在活化的小胶质细胞胞浆，CD11b阳性表达为细胞浆内出现棕黄色颗粒，包绕在神经元周围。空白组大鼠CD11b阳性细胞即小胶质细胞分布稀疏，胞体小；与空白组相比，模型组CD11b阳性细胞密集，胞体肥大，染色加深；与模型组相比，阳性药组、SCS(H)和SCS(L)组的小胶质细胞分布紧密，胞体较小，染色较轻，CD11b阳性细胞形态趋于正常状态。

3.8 脑组织GFAP的表达

GFAP表达的强弱可以反映星形胶质细胞的功能状态，其阳性表达为细胞浆内出现棕黄色颗粒。空白组大鼠GFAP阳性细胞分布稀疏，胞体小，突起短细。而模型组GFAP阳性细胞胞体肥大，形态各异，突起增长、增粗，不规则，染色加深。与模型组相比，阳性药组、SCS(H)和SCS(L)组GFAP阳性细胞胞体较小，染色较轻，突起短细。

实施例1

（1）将五味子藤茎药材加10倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，得到乙醇提取液，过滤合并提取液，减压回收至无醇味，冷冻干燥后，即得五味子藤茎乙醇提取物。

（2）将步骤（1）制备的五味子藤茎提取物，按照药剂学的制剂方法，加入辅料适量制粒，总混，灌入胶囊，制成胶囊剂。

实施例2

（1）将五味子藤茎药材加10倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，得到乙醇提取液，过滤合并提取液，减压回收至无醇味，冷冻干燥后，即得五味子藤茎乙醇提取物。

（2）将步骤（1）制备的五味子藤茎提取物，按照药剂学的制剂方法，加入辅料适量制粒，总混，压片，包衣，制成片型。

实施例3

（1）将五味子藤茎药材加10倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，得到乙醇提取液，过滤合并提取液，减压回收至无醇味，冷冻干燥后，即得五味子藤茎乙醇提取物。

（2）将步骤（1）制备的五味子藤茎提取物，按照药剂学的制剂方法，加入辅料+适量，混合均匀，灌装，制成口服液。

Claims (2)

1.一种五味子藤茎提取物，其特征在于该提取物为五味子藤茎加乙醇提取获得的，具体操作按下列步骤进行：

将五味子藤茎药材加10倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，得到乙醇提取液，过滤合并提取液，减压回收至无醇味，冷冻干燥后即得五味子藤茎乙醇提取物。

2.如权利要求1所述五味子藤茎提取物的用途，其特征在于所述的五味子藤茎提取物具有治疗老年痴呆的作用。