CN1927212B - 白藜芦醇苷用于制备治疗帕金森病药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白藜芦醇苷在制药领域中的新用途，即在制备治疗帕金森病药物中的应用。该物质具有抑制脂质过氧化及自由基清除作用，使氧自由基产生和清除处于动态平衡中，从而延缓PD的病情进展。

Description

白藜芦醇苷用于制备治疗帕金森病药物的用途

技术领域

本发明涉及白藜芦醇苷的用途，尤其涉及在制药领域中的用途。

背景技术

帕金森病(PD)是一种以黑质多巴胺能神经元(NDN)特征性缺失为主要病理改变的神经系统变性性疾病，临床上以静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势调节障碍为主要特征，其发病率可随年龄的增加而提高。50岁以上为500人/10万，60岁以上则达每年1000人/10万，患病率之高，使之成为仅次于脑血管病的神经系统常见病。

虽然PD的发病机制已逐渐被人们所认识，与遗传、环境因素、感染、衰老、氧化应激、过多的自由基形成及神经生长因子缺乏等有关，是多种机制协同作用的结果。但关于黑质部位的多巴胺能神经元发生特异性退行性病变的原因，至今仍未得到明确的阐述。但有足够的证据表明PD患者黑质多巴胺神经元受到氧化应激损害。在PD患者死后尸检中发现，黑质中一些氧化损害的标志物明显增加，包括脂质过氧化物丙二醛及过氧化氢(H₂O₂)，蛋白质和DNA的氧化产物碳酰化蛋白及8-羟基鸟苷酸，铁聚集而铁蛋白没有变化，还原型谷胱甘肽(GSH)水平下降而氧化型谷胱甘肽(GSSG)无变化，γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTT)活性增加，据认为是对GSH降低的代偿性反应。在PD残余多巴胺神经元中还发现另一脂质过氧化产物4-hydroxynonenal增多，该物质能改变蛋白质结构并增加对细胞的毒性。PD患者黑质区Lewy小体中硝基酪氨酸免疫染色增强，提示一氧化氮(nitric oxide，NO)自由基和过氧化亚硝酸盐阳离子(ONOO-)也参与了细胞的氧化损害。也有实验表明突变的α-SN过度表达增加了神经细胞对氧化应激的易感性。无疑，这些发现证实PD的确存在广泛的氧化损害。

正常情况下，细胞代谢过程中不断产生有害的自由基，但机体的防御体系限制了自由基的水平及其对细胞的损害。机体对抗自由基的物质包括各种自由基清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)，超氧化物歧化酶为自由基清除的第一道防线，其主要功能是清除超氧阴离子(·O₂ ⁺)；谷胱苷肽过氧物(glutathione peroxidase，GPx)及过氧化氢酶则主要清除H₂O₂；此外还有一些小分子在对抗氧化损害中也起重要作用，如GSH、β-胡萝卜素、泛醇、维生素E及维生素C等。生理条件下，自由基的产生与清除相互平衡。任何原因引起的机体某一个或多个抗氧化物缺陷或者自由基产生过多都可能会导致对自由基清除不足，过多的自由基则产生氧化应激。

正常大脑黑质特别容易受到氧化损害，其原因包括：①.脑组织含高浓度的不饱和脂肪酸。②.大脑接受了与其重量不成比例的氧耗。③.自身保护机制相对薄弱，如与肝脏相比，大脑几乎无过氧化氢酶，而GSH、GSH-Px及维生素E等明显减少。④.多巴胺神经元中的神经黑素对Fe³⁺的高亲和力使黑质中聚集高浓度的Fe³⁺，并可随时转为活化的Fe²⁺。因此推测PD的发生正是由于自由基的产生与清除之间正常的平衡受到了严重的破坏，最终导致了多巴胺神经元死亡。

近年来对PD的治疗研究已取得了新的进展，研发出不少新药，归纳目前临床上常用的药物主要有以下几类：1.拟多巴胺药：左旋多巴、卡比多巴、司立吉兰；2.中枢抗胆碱药：苯海索、苯扎托品。还有其他的金刚烷胺、溴隐亭、培高利特。这些药物的治疗目标都在于恢复DA能和Ach能神经系统功能的平衡状态。但多存在疗效不确切或毒副作用大等缺点，并且它们是依据相应发病机理中的某一环节而进行的尝试，都是一些“治标”的方法，不能有效防治PD的迅速发展。

发明内容

本发明的目的在于提供白藜芦醇苷的新用途，即在制药中的新应用。实际上本发明涉及白藜芦醇苷在治疗帕金森病的药中的应用。

目前发现的白藜芦醇苷(trans-Resveratrol-3-O-D-glycoside，piceid)是自虎杖中提取的一种单体，是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，其结构式：

它们均属于虎杖成分中的芪类化合物，即羟基二苯乙烯类化合物，为白色粉末；结构有顺反式两种，Mr390。

白藜芦醇苷现已证明主要存在于种子植物中，迄今至少在21个科、31个属的72种植物中被发现，许多含有白藜芦醇苷的植物是常见的药用植物，如决明、藜芦、虎杖等，有的甚至是常用食物，如葡萄、桑子、凤梨和花生，其中含白藜芦醇苷最多的药用植物是虎杖，而含量最高的食物则是葡萄。此外，红葡萄酒中含有较多量的白藜芦醇苷。

本发明主要通过建立6-羟多巴(6-OHDA)毁损的PD大鼠模型和MPTP诱导C57BL小鼠PD模型，确定白藜芦醇苷对PD动物模型鼠运动共济失调、运动障碍和脑组织氧化应激水平的改善作用；并围绕6-OHDA如何损害整个SN和VTA区域的DA神经元，进而影响到健侧的中脑组织及MPTP如何经单胺氧化酶-B(monoamine oxidase-B，MAO-B)转化成M PP⁺才对神经元起损伤作用，得到白藜芦醇苷抗6-OHDA，M PTP毒性的的作用机制。还通过离体的细胞培养，观察白藜芦醇苷浓度依赖性的拮抗MPTP的毒性作用以及白藜芦醇苷促进海马神经前体细胞增殖的机制。

实验结果发现：白藜芦醇苷(Piceid)具有抑制脂质过氧化及自由基清除作用，对人血PMNs呼吸爆发产生的自由基、黄嘌呤-黄嘌呤体系产生的超氧阴离子自由基、VitC-Cu²⁺体系产生的一氧化碳自由基具有抑制或清除作用，其IC₅₀为14～29μmol/L；抑制酵母多糖诱导的巨嗜细胞脂质过氧化；对Fe²⁺所致人工细胞脂质过氧化也具有很强的抑制作用。白藜芦醇苷能够抑制氧化玉米油喂饲大鼠肝脏过氧化类脂堆积，降低血清游离脂肪酸和脂质过氧化产物含量。而给予白藜芦醇苷则能明显改善或阻止上述指标的变化。这些发现和结果提示白藜芦醇苷的作用机制就是清除自由基、抑制脂质过氧化，使氧自由基产生和清除处于动态平衡中，从而延缓PD的病情进展。

附图说明

图1是本发明中白藜芦醇苷对6-羟多巴制备的PD大鼠模型的保护作用；

图2是白藜芦醇苷对6-羟多巴损毁大鼠脑组织MDA水平和SOD活力的影响；

图3是PD模型大鼠海马齿状回有较少的神经前体细胞；

图4是PD模型大鼠经白藜芦醇苷治疗后海马齿状回有较多的神经前体细胞；

图5是白藜芦醇苷对MPTP诱导的PD小鼠转杆活动能力的影响；

图6是白藜芦醇苷对MPTP诱导的PD小鼠自发活动的影响；

图7是白藜芦醇苷对MPTP诱导的PD模型小鼠脑组织MDA水平和SOD活力影响；

图8是MPTP对PC12细胞增殖的影响；

图9是白藜芦醇苷对MPTP诱导PC12细胞增值降低的拮抗作用。

具体实施方式

下面描述本发明的具体实施方式，但是本发明的内容完全不局限于此。

1.实验动物

SD大鼠，雄性，SPF级，体重：200-250g，合格证号：粤检证字第2004A067号；8w龄雄性C57BL小鼠，体量25-27g，合格证编号：粤检证字第2004A065号；所有动物安静环境饲养，自由取食饮水，人工昼夜节律(12h-12h)。

2.试剂

6-羟基多巴(6-OHDA)，纯度为99％，购自Sigma公司。维生素C注射液，产地批号0501101。

阿朴吗啡，购自Sigma公司。

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)，Sigma公司产品，

SOD、MDA测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

培养基：DMEM培养基(高糖)，Hyclone产品；20％小牛血清，杭州四季青公司产品，购自威佳生物工程公司。置56℃水浴中30min以灭活补体。注射用青霉素，硫酸链霉素，石家庄石药集团产品。

3.药物

白藜芦醇苷注射液(Piceid；深圳海王药业股份有限公司提供，批号：03030301)，黄色澄清液体。

左旋多巴，购自Sigma公司。

4.溶液配制

多聚赖氨酸氢溴化物溶解于150mmol/L硼酸钠缓冲液中，(pH8.4)，终浓度为1mg/ml，抽滤灭菌。

神经生长因子(NGF)配制：用pH5.0的醋酸钠缓冲液(0.1mol/L)配制NGF(2.5S)250μg/ml贮存液，使用前再用培养液稀释，贮存液的浓度太低，活性容易丧失，贮存液应冻存于-80℃，一旦冻融后不宜再冻存，所以应将其分装成小份冻存，冻融后的NGF贮存液可分装于EP管中，置于4℃贮存，其活性可保存数月。

5.仪器

超净工作台，苏州净化设备厂生产；NU2600E型二氧化碳培养箱，美国Precision公司生产；TGL-166A型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂生产；LD5-2A型台式高速离心机，北京医用离心机厂；匀浆器，上海实验仪器厂生产；∑960型酶标仪，Metertech公司生产；XDS-1B型倒置相差显微镜，日本Olyplus公司生产；722型光栅分光光度计，山东高密分析仪器厂；LBY-NJ2血液凝聚仪，北京普利生仪器中心；MFV-1100/1200型电磁流量计，日本Nihon Kohden公司；江湾I-C型立体定位仪，上海第二军医大学仪器厂生产。

实施例一：白藜芦醇苷对6-OHDA制备的PD大鼠模型的保护作用

(一)6-OHDA损毁大鼠黑质制作帕金森病(PD)模型

SD雄性大鼠随机分成2组，分别为假手术组和模型组。10％的水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于立体定向仪，齿棒低于耳间线水平，使前后囟位于同一水平上，剪去颅顶的鼠毛，碘酒擦拭后，正中切开皮肤，暴露前后囟，纯双氧水擦拭颅骨表面，使前后囟充分显示，用牙科钻在颅骨表面注药点处钻1个约2mm的小孔。调整微量注射器针尖的位置，参照包新民等的《大鼠脑立体定向图谱》在前囟4.4mm，矢状缝(右)1.3mm，颅骨下8.5mm点注射8μg/4μl含0.2％抗坏血酸的6-OHDA盐溶液。注射速度为0.5μL/min，术毕留针10min后以1mm/min的速度退针，磺胺粉封闭颅孔，缝合头皮，碘酒擦拭缝合处，置笼喂养。假手术组用同样方法向坐标点注射4μl的生理盐水。毁损术后7天，腹腔注射阿朴吗啡0.5mg/kg诱发大鼠稳定的向毁损对侧作旋转运动，给药10min后观察其行为，记录30min的旋转情况，每分钟旋转次数至少7次以上，被视为达到PD模型要求。

(二)BrdU给药和组织取材方法

选取PD模型大鼠4只，各组大鼠于第13天腹腔注射BrdU(50mg/kg，BoehringerMannheim)2次，间隔12hr，最后一次腹腔注射BrdU后12hr即第14天处死取材、切片。使用免疫组织化学方法标记比较海马齿状回BrdU阳性细胞数量。

组织取材方法：戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，4％多聚甲醛室温下经左心室灌注固定，断头取海马组织。经后固定、脱水处理后，选择海马部位应用恒冷箱切片机冠状位连续切片，每隔150μm取脑片1张，片厚30μm，收集于0.01mol/LKPBS中待用。

(三)免疫组织化学方法

取所得切片依次入50％甲酰胺(Sigma)/2×SSC(65℃ 2hr)、2N HCL(37℃ 30min)、0.01mol/L硼酸液(室温下10min)、含0.03％Triton X-100的0.01mol/L KPBS(室温下30min)。之后入小鼠抗BrdU抗体(1∶1000，Sigma)4℃孵育36h；再续入生物素化的羊抗小鼠IgG(1∶500，Sigma)，室温2h；生物素-卵白素-HRP复合物(1∶500，Sigma)，室温2h；葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法呈色后常规封片，光镜观察。上述各步骤间均以0.01MPBS洗涤。空白对照染色以血清稀释液替代一抗。

每只大鼠各随机选取4张不连续脑片光镜下(OlympusBX60显微镜，400倍)观察海马齿状回(包括颗粒细胞层、亚颗粒增生带和门区)，计数BrdU标记阳性细胞数量，以单个齿状回平均BrdU标记阳性细胞数(均数±标准差)表示大鼠齿状回BrdU标记阳性细胞数量水平。使用Olympus FV-300激光共聚焦显微镜观察PD模型组大鼠脑片。

(四)成年大鼠海马神经前体细胞培养

无菌条件下取成年SD大鼠全脑，分离出海马组织，以HBSS液清洗后，剪碎，收集组织糜液加入0.25％胰酶入37℃、95％CO₂培养箱中消化30min，200目筛网过滤，滤液经800rpm×5min离心，弃上清液，转移至DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基，吸管吹打制成单细胞悬液，离心后台盼蓝染色计数，每培养瓶中接种5×10⁵个细胞，同时加用bFGF(20μg/L)进行培养，每3-4天换液一次，换液同时加入新的bFGF。待原代培养细胞形成克隆后，机械分离制作单细胞悬液，继续分瓶培养，仍采用相同的培养基加bFGF。此后每8-10d按前法连续传代，待传代培养细胞(实验采用4～6代细胞)形成克隆后制作单细胞悬液，计数、调整细胞浓度为1×10⁴/ml，接种于至预先放置有涂布多聚赖氨酸盖玻片的培养孔中，每孔100μl，按前述方法进行培养，待用。

取第4代培养细胞克隆制成单细胞悬液，按前述方法进行培养，于培养第4天时，弃去培养液，仅以DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基继续培养24h后，调整细胞密度为1×10⁴/ml，转种于经多聚赖氨酸处理的96孔板，每孔100μl。将各培养孔分为对照组和实验组。实验组分别加入含bFGF(20ng/ml)，bFGF(20ng/ml)+测试药物的培养液，对照组仅加入培养液，继续孵育48h后终止培养。每孔加入0.5％的MTT 10μl继续培养4小时，吸弃培养液，加入二甲亚砜(DMSO)200μl/孔，待颗粒溶解后置于酶标仪上，在570nm的波长值下检测各孔的吸光度(A值)，每个浓度测定6孔。以只加培养液不加细胞的空白孔调零。

(五)抗氧化指标检测——SOD活性和MDA含量测定

鼠断头开颅，取脑组织标本，以滤纸吸干表面残血，去除嗅脑、脑干、小脑。脑组织标本分别置于玻璃匀浆器，用冰生理盐水按质量与体积比为1∶9的比例冰浴下制备成10％的脑组织匀浆，立即放入-30℃冰箱中保存，待测。试验前以考马斯亮蓝法测定脑组织蛋白定量。按试剂盒说明书要求，自复融后脑组织匀浆中取样品采用722型光栅分光光度计分别测定脑组织中SOD活性、MDA含量。

(六)PC12细胞的培养

将多聚-L-赖氨酸氢溴化物(终浓度1mg/ml)，经过滤除菌后用于包被96孔板，在室温作用6-7小时后，吸去包被溶液，并用双蒸水洗两三次96孔板，置超净工作台里晾干，再予紫外线照射5-6h灭菌。将PC12细胞(2×10⁴或2×10⁵/ml)接种于含10％胎牛血清、5％马血清，100U/ml青霉素、100mg/l链霉素的DMEM完全培养液(pH7.2)的96孔板中，每孔体积200ul。培养板移入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂及湿度条件下培养(培养时间取决于实验目的和其要求)。上述细胞培养24小时后，换入含2.5S NGF(50ng/ml)的DMEM完全培养液，以后隔天换液(含NGF)。NGF诱导10-14天时，可使PC12细胞长出神经纤维，并形成致密的网络。在倒置显微镜下观察PC12细胞是否贴壁。然后用贴壁生长良好的细胞进行后续实验。

(七)实验结果：白藜芦醇苷对PD模型的治疗作用

1.大鼠脑室内微量注射6-OHDA前，开始按(表4-6)所示剂量灌服给药，白藜芦醇苷(50mg/kg，100mg/kg)，L-Dopa(25mg/kg)，L-dopa(12.5mg/kg)+piceid(50mg/kg)。分别在给药的7d，14d，21d，28d分别腹腔注射0.5mg/kg阿朴吗啡，观察大鼠向毁损对侧的旋转运动，结果显示白藜芦醇苷和L-dopa一样能明显减少PD模型大鼠的旋转次数，并随给药时间的延长，有一定效果增强的趋势，且小剂量的白藜芦醇苷和L-dopa联合用药能达到同样的效果，表明两者可能存在协同作用(表1、图1)。

表1白藜芦醇苷对6-羟多巴(6-OHDA)制备的PD大鼠模型的保护作用

组别

例数

转数(单位：次/分)

F

P

7d

14d

21d

28d

模型组Picied50mg/kgPiceid100mg/kgL-Dopa25mg/kgL-dopa12.5+Picied50

99988

10.33±2.91511.11±3.55111.44±3.20611.75±4.09711.38±2.825

10.78±3.7347.78±1.986*5.89±2.028*7.00±3.625*5.88±2.588*

10.67±3.2406.44±1.944*5.00±2.000*6.38±2.446*5.38±1.923*

11.56±3.5755.44±1.590*4.44±2.068*6.38±1.598*4.25±1.389*

0.2119.60916.4895.62415.915

0.8880.0000.0000.0040.000

FP

0.6380.782

2.0420.058

1.5250.173

1.7410.110

FP

(8.6620.000)#

#交互效应的F统计量和P值。

^*P＜0.05，^**P＜0.01，参照模型组

2.在白藜芦醇苷给药14d后，处死3组大鼠，取脑皮层，测定SOD活力和MDA含量，图2、表2显示白藜芦醇苷能明显降低6-OHDA毁损大鼠脑组织的氧化应激水平，白藜芦醇苷使PD模型大鼠脑组织MDA含量显著降低，明显提高SOD的活力，表现出抗氧化活性。

表2白藜芦醇苷对6-OHDA损毁大鼠脑组织MDA水平和SOD活力的影响

组别	例数	SOD	MDA
				模型组Piceid50mg/kgPiceid100mg/kg	999	89.28±12.79109.34±15.54**149.06±15.07**	10.88±2.378.71±1.58*6.56+1.48**
FP		39.5130.000	12.2420.000

^*P＜0.05，^**P＜0.01，参照模型组

3.如图3所示的是6-多羟巴损毁大鼠黑质后，大鼠脑组织海马区域神经前体细胞增殖的增强，这是脑组织损伤后自发性修复，但是这种作用是十分微弱的，可通过外来药物的干预增强这种作用，达到一定的恢复损伤作用。图4所示的则是白藜芦醇苷连续给药28天后，PD模型大鼠脑组织神经前体细胞增殖数目明显多于未治疗组。

实施例二：白藜芦醇苷(Piceid)对MPTP诱导的PD小鼠模型的保护作用

(一)皮下注射MPTP诱导C57/BL小鼠PD模型

C57/BL小鼠随机分为3组，分别为对照组、模型组和给药组(白藜芦醇苷100mg/kg，白藜芦醇苷200mg/kg，L-Dopa 50mg/kg，(L-dopa 25mg/kg+白藜芦醇苷100mg/kg)。对照组和模型组预先给予灌胃生理盐水，给药组给予上述剂量的药物，第8d模型组和各给药组皮下注射MPTP 40mg/kg，给药容量0.1ml/10g，一天一次，连续7天，第15d观察小鼠的行为学指标和进行生化指标检测。

(二)行为学检测

1.自主活动计数参照Kawai H^[22]测试方法，自制30cm×30cm×15cm的有机玻璃盒，底部刻出6cm×6cm的格子，在安静、光线较暗的环境中检测。小鼠适应环境10min后，计数5min内小鼠移动的格子数，连续测5次取平均值。

2.Rotarod检测Rotarod实验需要动物在滚轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的检测运动协调性的实验。C57/BL小鼠末次给药1小时后把小鼠置于旋转的转棒仪上(滚轴直径6cm，转速为13r/min)，使之不断地调整四肢，以保持身体平衡，若从转杆跌落下来即自动记录在转杆的时间(最长检测时间180s，超过者仍记为180s)。

(三)黑质及纹状体免疫组织化学检测

C57/BLPD模型小鼠行为学检测后，每组取5只小鼠行黑质及纹状体免疫组织化学检测。5g/L戊巴比妥钠1mL腹腔麻醉后，开胸经主动脉先以生理盐水15ml冲洗血液，再用含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液(PB，pH 7.2)100mL先快后慢灌注固定1h。灌毕立即取脑，在含300g/L蔗糖的PB溶液内过夜(4℃)至组织沉底。参考小鼠脑图谱，在恒冷箱(-22℃)行中脑黑质和纹状体冠状切片，片厚30um，收集于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)内。免疫组织化学染色步骤如下：3g/L过氧化氢甲醇溶液(300g/L过氧化氢1mL+甲醇80mL+PBS 19mL)30min，3g/L TritonX-100的PBS30 min，浸入小鼠抗TH单克隆抗体(1∶3000)孵育48h(4℃)，浸入生物素化兔抗小鼠二抗(1∶500)孵育2h(室温)，浸入ABC复合物(1∶500)孵育2h(室温)，在DAB-H₂O₂溶液中进行呈色反应20-30min，当阳性产物呈棕褐色而背底清晰时中止显色。以上步骤每步后均需0.01mol/L PBS清洗3次，每次10min。其中一抗用含体积分数为0.01牛血清和3g/L TritonX-100的PBS稀释，二抗和ABC复合物用PBS稀释。贴片，脱水，透明，中性树胶封固。每只小鼠黑质取头端、中部、尾端切片3张，取大脑脚中点上方区域，在200×高倍镜下计数TH免疫反应阳性(tyrosinehydroxylase-immunoreactive，TH-ir)神经元个数，取平均数。

(四)抗氧化指标检测——SOD活性和MDA含量测定

鼠断头开颅，取脑组织标本，以滤纸吸干表面残血，去除嗅脑、脑干、小脑。脑组织标本分别置于玻璃匀浆器，用冰生理盐水按质量与体积比为1∶9的比例冰浴下制备成10％的脑组织匀浆，立即放入-30℃冰箱中保存，待测。试验前以考马斯亮蓝法测定脑组织蛋白定量。按试剂盒说明书要求，自复融后脑组织匀浆中取样品采用722型光栅分光光度计分别测定脑组织中SOD活性、MDA含量。

(五)PC12细胞的培养

将多聚-L-赖氨酸氢溴化物(终浓度1mg/ml)，经过滤除菌后用于包被96孔板，在室温作用6-7小时后，吸去包被溶液，并用双蒸水洗两三次96孔板，置超净工作台里晾干，再予紫外线照射5-6h灭菌。将PC12细胞(2×10⁴或2×10⁵/ml)接种于含10％胎牛血清、5％马血清，100U/ml青霉素、100mg/l链霉素的DMEM完全培养液(pH7.2)的96孔板中，每孔体积200ul。培养板移入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂及湿度条件下培养(培养时间取决于实验目的和其要求)。上述细胞培养24小时后，换入含2.5S NGF(50ng/ml)的DMEM完全培养液，以后隔天换液(含NGF)。NGF诱导10-14天时，可使PC12细胞长出神经纤维，并形成致密的网络。在倒置显微镜下观察PC12细胞是否贴壁。然后用贴壁生长良好的细胞进行后续实验。

(六)白藜芦醇苷(Piceid)对MPTP诱导的PD小鼠模型的保护作用

1 MPTP使小鼠的转杆时间明显缩短和自发活动时间缩短，而白藜芦醇苷(100mg/kg，200mg/kg)，L-Dopa(50mg/kg)，L-dopa(25mg/kg)+piceid(100mg/kg)在给药14d后均能延长小鼠的转杆时间，并增加小鼠的自发活动次数，显示白藜芦醇苷和L-dopa一样能明显改善PD模型小鼠的转杆活动能力，并增加小鼠的运动；且小剂量的白藜芦醇苷和L-dopa联合用药能达到同样的效果，也表明两者对MPTP诱导的小鼠PD模型可能存在协同的治疗作用(表3、4；图5、6)。

表3白藜芦醇苷对MPTP诱导的PD小鼠转杆活动能力的影响

组别	例数	转杆时间(单位：分)
			模型组Piceid100mg/kgPiceid200mg/kgL-Dopa50mg/kgL-doda25+Piceid100	1110101010	13.0±3.1917.1±3.76*21.9±4.20**20.7±5.58**23.7±6.98**
FP		5.6700.000

^*P＜0.05，^**P＜0.0 1，参照模型组

注：所用的多重比较方法(LSD，SNK)

表4白藜芦醇苷对MPTP诱导的PD小鼠自发活动的影响

组别	例数	时间(单位：分)
			模型组Piceid100mg/kgPiceid200mg/kgL-Doda50mg/kgL-doda25+Piceid100	1110101010	72.4±15.6488.9±11.72112.1±17.92**110.2±12.09**127.9±15.50**
FP		21.7320.000

注：所用多重比较法(LSD，SNK)

^*P＜0.05，^**P＜0.01，参照模型组

2在白藜芦醇苷给药14d后，处死3组小鼠，取脑皮层，测定SOD活力和MDA含量，图7、表5显示白藜芦醇苷能明显降低MPTP诱导小鼠脑组织的氧化应激水平，白藜芦醇苷使PD模型小鼠脑组织MDA含量显著降低，明显提高SOD的活力，表现出明显的抗氧化活性。

表5白藜芦醇苷对MPTP诱导的PD模型小鼠脑组织MDA水平和SOD活力的影响

组别	动物数	SOD	MDA
				模型组	10	71.62±19.40	7.878±0.897

Piceid 100mg/kgPicied 200mg/kg	1010	96.97±14.90**128.65±20.99**	5.899±1.040**4.297±1.189**
				FP		23.5720.000	29.2560.000

^*P＜0.05，^**P＜0.01，参照模型组

3 PC12是常用的模型细胞，利用其增殖分化的特性，可模拟研究药物对神经元的作用，MPTP对培养的PC12细胞具有明显的毒性，抑制其生长，并使细胞裂解死亡，此作用具显著的浓度依赖性(表6、图8)。根据实验的结果和文献报道，选用0.5mM MPTP作为后续实验的使用浓度。

表6 MPTP对PC12细胞增值的影响

组别	例数	吸光度(A值)
			正常组0.125mMMPTP0.25mMMPTP0.5mMMPTP1mMMPTP	66666	1.270±0.1900.775±0.124**0.522±0.044**0.410±0.014**0.352±0.029**
FP		92.0380.000

注：所用多重比较法(LSD，SNK)；

^**P＜0.01，参照模型组。

预先用白藜芦醇苷保护PC12细胞，可以浓度依赖性的拮抗MPTP的毒性作用，PC12细胞的生长明显多于MPTP组，因此，在离体细胞培养试验进一步证实白藜芦醇苷对MPTP诱导的细胞毒性具有一定的保护作用(表7、图9)。

表7白藜芦醇苷对MPTP诱导PC12细胞增值降低的拮抗作用

组别	例数	吸光度(A值)
			0.5mMMPTPPiceid0.5μM+MPTPPiceid2.0μM+MPTPPiceid5.0μM+MPTPPiceid10.0μM+MPTP	66666	0.359±0.0240.427±0.019**0.580±0.030**0.713±0.015**0.781±0.026**

FP

409.2780.000

注：所用的多重比较方法(LSD，SNK)； ^**P＜0.01，参照模型组。

Claims (1)

1.白藜芦醇苷用于制备治疗由MPTP诱导引发的帕金森病的药物中的用途，其特征是：单独以白藜芦醇苷为活性成分，其中所述的白藜芦醇苷结构式为

白藜芦醇苷的作用机制为清除自由基、抑制脂质过氧化，使氧自由基产生和清除处于动态平衡中，从而延缓PD的病情进展。

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