CN102078507B - 一种含钩藤具有抗衰老作用的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药材药物活性成分提取与临床应用的领域，尤其是使用特定提取剂从中药材钩藤、茯苓、陈皮、麦冬、人参、防风、甘草中提取具有抗衰老提高智力的组合物。采用乙醇、蒸馏水作为提取剂，提取液经浓缩后得含药物活性成分的组合物浸膏。动物试验表明该提取组合物对小鼠记忆获得障碍模型有明显的益智作用、促进小鼠记忆功能的改善及延缓衰老。在该组合物中通过加入不同的剂型辅料，即可制成片剂、胶囊剂、滴丸剂、溶液剂、缓控释剂和注射剂等常见药物剂型。同时，该种组合物还具有服用安全的突出优点。

Description

一种含钩藤具有抗衰老作用的组合物

【技术领域】

本发明属于治疗老年痴呆等衰老性疾病的药物组合物及其制备方法，尤其是治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s diseaseAD)的中药提取组合物及其制备方法。

【背景技术】

随着社会的发展，人类寿命普遍延长，高龄老人明显增多，人口老龄化问题日益严重，已经成为当今世界普遍关注的焦点。而现在广泛使用的抗衰老的西药，例如治疗阿尔茨海默氏病的改善胆碱能神经传递类、促代谢类、激素类、影响自由基代谢类、钙离子拮抗剂类等普遍具有各种各样的副作用。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是根据祖国医学的理论指导，结合数千年传统医药的经验积累，以及对钩藤、茯苓、陈皮、麦冬、人参、防风、甘草在药学、药理学等方面的研究，从中药复方入手，科学组方，并探讨其作用机理，将其制成现代中药制剂。

为解决以上问题，本发明采取如下的技术方案。

称取钩藤1000g，加6倍量70％乙醇回流提取2次，每次1.5h，合并提液，浓缩得浸膏1。陈皮1000g、防风667g混合，8倍量水煮5h，先提挥发油，母液收集，药渣6倍水量再提一次，1.5h水提液合并浓缩，得稀浓缩液1。茯苓1000g、麦冬1000g、甘草334g混合，8倍量水提取2次，每次1.5h，合并水提液，浓缩得稀浓缩液2。稀浓缩液1和2合并，继续浓缩至8000ml左右，70％乙醇醇沉过夜，取醇液浓缩得浸膏2。人参667g加8倍量水提取3次，每次1.5h，合并提液，浓缩得浸膏3。浸膏1、2、3合并，加挥发油混匀，共得1800ml浸膏，留样5ml，其余分装，压盖，灭菌。本浸膏含生药3.15g/ml。

将浸膏干燥、混合成型，辅以药学上可接受的剂型辅料得到片剂、胶囊剂、滴丸剂、溶液剂、缓控释剂和注射剂等常见药物剂型。

本发明中钩藤、防风清热平肝，熄风止痉；茯苓、陈皮、甘草化痰安神，降逆止呕；人参、麦冬清热养阴，益气生津。全方共奏平肝熄风，清热化痰，益气养阴，降逆止呕之功。

【具体实施方式】

实施例1

含钩藤抗衰老组合物的急毒实验研究：

每种抗衰老药物或方剂不仅要求确实有效，而且要求无明显的毒副作用。所以一般情况下须对这些药物或方剂进行急毒、亚急毒甚至慢性毒性试验。通常用测定其半数致死量(LD50)进行急毒试验，因传统中药一般毒性很低，不易求得LD50，可观察最大耐受量。本实验用此法对小鼠进行了急性毒性实验，以对安全毒性进行初探。

1、材料

1.1实验动物

清洁级健康KM小鼠，18-22g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.2药物制备

含钩藤抗衰老组合物：由本院中药制剂室按传统方法水提、浓缩、消毒等制成浸膏，本浸膏含生药3.15g/ml，临用前置冰箱中4℃保存。

1.3实验环境

清洁级，合格证号：SYXK(苏)2007-0026。

2、方法

2.1预试验

取禁食16h以上的KM小鼠20只，♀♂各半，用含量为3.15g生药/ml的含钩藤抗衰老组合物按0.5ml/10g体重的给药量(最大给药量)灌胃给药，此浓度为12号灌胃器能抽吸的最大浓度。给药剂量为157.5g/kg，观察一周，结果无动物死亡，若有死亡，则需降低剂量再试。因无法按常规测定LD50，故进行最大给药量测定。

2.2正式试验

选取健康KM小鼠30只，♀♂各半，平均体重：♀为18.5±0.5g；♂为19.6±1.1g。小鼠禁食(不禁水)约16h后，用含生药3.15g/ml的含钩藤抗衰老组合物(预先温热至20℃左右)按0.5ml/10g体重的最大给药量灌胃给药，剂量为157.5g/kg。给药后小鼠正常饲养于清洁级饲养室(室温21±0.5℃；相对湿度45～60％)，观察动物的活动、皮毛、饮食、粪便有无异常改变，并观察有无中毒症状及死亡(若有死亡，则进行解剖及病理学检验)，连续观察一周。一周后复称体重，处死动物进行解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑、甲状腺、胃、肠、膀胱、性腺(子宫、卵巢或睾丸和附睾)等主要脏器有无异常变化。

3、结果

在给药后5min后，动物活动明显减少，约15min后大多数小鼠伏下少动，少数静卧不动，呈昏睡状(雌性有2只，雄性3只)，但轻敲笼具有抬头或躲避等反应。4小时内动物极少进食，大便呈黄褐色。6小时后多数动物的活动、饮食、大便等逐渐恢复正常，仍有2只动物(雌性1只，雄性1只)伏下少动。未见其它异常或不良反应，也无动物死亡。一周后复称体重，♀为29.3±1.6g，♂为32.9±1.0g。处死解剖动物后，其主要脏器均未见明显的异常病变。小鼠灌胃给药的最大给药量为157.5g/kg体重，未见明显的毒性反应。

结论

含钩藤抗衰老组合物的小鼠灌胃最大给药量约为157.5g生药/kg体重，除给药后因给药量过大动物有短时间的不适外，未见明显的毒性反应。人的剂量为0.85g生药/kg体重，给小鼠的剂量是人的185.3倍。由此可见，在按人的常规剂量服用时是安全的。

实施例2

含钩藤抗衰老组合物的益智作用实验研究：

1、材料

1.1药品与试剂

含钩藤抗衰老组合物：由本院中药制剂室按传统方法水提、浓缩、消毒等制成浸膏。临用将含钩藤抗衰老组合物加蒸馏水配至100ml，变成0.85g生药/ml浸膏溶液，实验中所用剂量均以生药量计。

茴拉西坦胶囊(三乐喜)：无锡凯西药业有限公司产品，批号：20081023，0.1g/粒。用前将三乐喜研成粉末，用蒸馏水按10粒/100ml蒸馏水配成0.01g/ml溶液。

氢溴酸东莨菪碱：上海禾丰制药有限公司产品，批号：080201，0.3mg/ml。

亚硝酸钠：南京化学试剂厂产品，批号：20080506

乙二醇：上海久億化学试剂有限公司，批号：20080403。使用前用蒸馏水配成40％的乙醇。

1.2实验动物

清洁级KM小鼠，18-22g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.3仪器

MG-2迷宫，张家港市生物医学仪器厂生产。

1.4动物实验环境：

清洁级，合格证号：SYXK(苏)2007-0026。

2、方法

2.1记忆获得障碍实验

2.1.1预选

将小鼠放入Y迷路箱内适应环境5-8分钟，然后驱赶至I臂(起步区)停留2min后给予电击(35V)，小鼠受电击后逃至II臂安全区(有光亮)为正确反应，否则为错误反应。待小鼠逃入安全区后，使停留30秒，将小鼠取出放回I臂，停留1分钟后再予第二次电击，依次重复训练。选取达到连续2次直接逃至安全区前的电击训练次数≤3次，且自由活动较敏捷的小鼠，供试验用。

2.1.2分组给药

将小鼠分为实验高、中、低剂量、阳性对照、模型对照、正常对照共6组，每组20只，雌雄各半。实验组高剂量每天灌胃以17g生药/kg体重(20倍人的等效量)，中剂量8.5g/kg体重，低剂量4.25g/kg体重，阳性对照组每天给茴拉西坦溶液(三乐喜)0.2g生药/kg体重(20倍人的等效量)，模型对照组与正常组每天给0.2ml/10g体重的蒸馏水，每天灌胃一次，连续给药3周。

2.1.3学习训练

最后一天给药后50min用氢溴酸东莨菪碱造模，尔后进行学习训练，除正常组外，各组小鼠每只腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(5mg/kg体重)。

训练时，将小鼠放入I臂起步区停留3min后给予电击(35V)，按I→II→III→I或I→III→II→I连续试验：a项：小鼠到达安全区停留0.5min，然后取出放回原臂，1min后给予下次电击，达到连续2次直接逃至安全区后，以逃入的安全区作为起步区进行电击训练。当小鼠在三臂均达到连续2次直接逃至安全区后，进行b项试验：小鼠在I臂起步区停留1min后给予电击，逃至安全区停留0.5min，再以此区作为起步区予以电击，连续循环电击训练(每两次电击之间休息1min)，以小鼠连续10次(或9/10)正确反应(直接逃入安全区)作为空间辨别记忆指标，每回连续学习的电击总次数一般不超过30次。最后将a项和b项相加作为训练成绩，统计学习成绩。

2.1.4记忆测试

训练后24h测试，测试方法同训练，测试后处死。统计学习成绩，作为测试成绩。

2.2记忆巩固障碍实验

2.2.1预选

同记忆获得障碍实验。

2.2.2分组给药

同记忆获得障碍实验。

2.2.3学习训练

最后一次给药后一小时进行学习训练，训练方法同前。

2.2.4记忆测试

训练后除正常组外，其余各组立即用亚硝酸钠按100mg/kg体重进行腹腔注射，24h后进行测试，测试方法同前，测试后处死。统计学习成绩。

2.3记忆再现障碍实验

2.3.1预选

同记忆获得障碍实验。

2.3.2分组给药

同记忆获得障碍实验。

2.3.3学习训练

最后一次给药后一小时进行学习训练，训练方法同记忆获得障碍实验。

2.3.4记忆测试

训练后24h进行测试，测试前30分钟用40％的乙醇灌胃0.1ml/10g，正常对照组灌以等体积的生理盐水。测试方法同记忆获得障碍实验，测试后处死。统计学习成绩。

2.4统计

全部数据用

表示，进行组间t检验统计。

3、结果

3.1对记忆获得障碍的影响

实验组的训练成绩与测试成绩皆显著好于模型组(P＜0.01)，而和正常组相比则比较接近，无明显差异；模型组无论训练成绩还是测试成绩都正常组显著地差(P＜0.01)。因此模型的制作是成功的，含钩藤抗衰老组合物对小鼠记忆获得障碍模型有明显的益智作用，见表2-1。

表2-1含钩藤抗衰老组合物对小鼠记忆获得障碍的影响(

n＝20)

注：与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01；

与正常组比，△P＜0.05，△△P＜0.01；

与训练相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；

“/”灌以等量的蒸馏水，下同。

3.2对记忆巩固障碍的影响

在未造模时，实验组训练成绩明显好于模型组及正常组(P＜0.01)；造模后，实验组的测试成绩显著好于模型组(P＜0.01)，并且同一组造模前后成绩亦有较大差异，高、中剂量组测试成绩明显好于训练成绩(P＜0.05)；模型组测试成绩比正常组显著地差(P＜0.05)。因此，造模比较成功，含钩藤抗衰老组合物能显著促进小鼠记忆功能的改善，抑制亚硝酸钠所造成的记忆障碍，见表2-2。

表2-2含钩藤抗衰老组合物对小鼠记忆巩固障碍的影响(

n＝20)

3.3对记忆再现障碍的影响

表2-3含钩藤抗衰老组合物对小鼠记忆再现障碍的影响(

n＝20)

从表2-3可知，造模前，实验组成绩(训练成绩)明显好于模型组及正常组(P＜0.05)；造模后，实验组明显好于模型及正常组(P＜0.01)；同组比较，除模型组外，各组测试成绩皆明显好于训练成绩(实验组P＜0.01)。因此，造模后，模型组小鼠记忆再现发生了障碍，说明模型是成功的，实验组成绩显著地好，说明含钩藤抗衰老组合物对记帐再现障碍有显著的抑制作用。

4、结论

学习和记忆是脑的最高级机能——智能的重要组成部分。认知障碍是老年痴呆的重要指标之一。

记忆缺失的动物模型要比正常动物更能反映药物的作用，有利于提高筛选命中率，因此采用不同的记忆障碍模型观察药物对学习效应、记忆获得、记忆巩固、记忆再现的影响，能比较全面地反映药物的作用及其作用机理。

东莨菪碱是M-受体阻断剂，而M-受体参与大脑的唤醒、选择性注意力、情绪和运动协调等功能的调节，特别在学习、记忆和认知等方面被认为是关键环节之一，M-受体的亚型主要是位于突触后的M1型，它接受突触前末梢乙酰胆碱的刺激，直接参与学习记忆的信息传递。本次实验证明：含钩藤抗衰老组合物能对抗东莨菪碱所致记忆获得障碍，提示含钩藤抗衰老组合物能拮抗东莨菪碱造成的M-受体的阻断作用，保持M-受体一定的浓度，从而提高神经递质的含量，促进记忆的改善。

亚硝酸钠是致缺氧剂，大量进入机体后，可使正常的血红蛋白变为高铁血红蛋白，失去携带氧的功能，引起组织缺氧，导致大脑意识和行为上出现障碍，造成记忆巩固障碍；乙醇是中枢神经抑制剂，能造成记忆再现障碍，而结果证明：含钩藤抗衰老组合物能显著地对抗这两种障碍，提示含钩藤抗衰老组合物能提高或促进脑部氧的供给，对抗乙醇所造成的中枢神经抑制。

由此可看出，含钩藤抗衰老组合物对东莨菪碱所致记忆获得障碍模型、亚硝酸钠所致记忆巩固障碍模型、乙醇所致记忆再现障碍模型皆有比较理想的益智效果。

实施例3

含钩藤抗衰老组合物对老龄大鼠衰老相关指标的影响研究：

抗衰老、防老年痴呆是人类关注的永恒话题。含钩藤抗衰老组合物由钩藤、茯苓、陈皮、麦冬、人参、防风、甘草等7味中药组成。本实验以老龄大鼠为研究对象，以衰老相关指标为标准，观察含钩藤抗衰老组合物的抗衰老作用。

1、材料

1.1药品与试剂

含钩藤抗衰老组合物：由本院中药制剂室按传统方法水提、浓缩、消毒等制成浸膏。临用前将含钩藤抗衰老组合物加蒸馏水配至100ml，变成0.85g生药/ml浸膏溶液，实验中所用剂量均以生药量计。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20071001

丙二醛(MDA)活性测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20080820。

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20080806。

单胺氧化酶(MAO-B)活性测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20080724。

乙酰胆碱酯酶(ACHE)活性测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20080912。

1.2实验动物

清洁级SD老龄大鼠(16月龄)：380±20g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.3仪器

高速冷冻离心机：贝克曼

721分光光度计：上海第三分析仪器厂

高速分散器XHF-1：上海金达生化仪器厂；

1.4实验环境：

清洁级，合格证号：SYXK(苏)2007-0026。

2、方法

2.1分组、给药

将大鼠分为4组，每组20只，雌雄各半，实验高剂量组每天灌胃给8.5g生药/kg体重(人的10倍等效量)，中剂量组4.25g/kg，低剂量组2.125g/kg，正常对照组喂以等量蒸馏水，连续50天。结束后采血、取脑，血浆离心得血清和脑一起放低温冰箱保存。待测相关指标。

2.2血中SOD、ACHE测定

测试后眼眶取血，3000r/min离心，取上清液按试剂盒说明书所述步骤操作，测定SOD、ACHE活力。

2.3脑中MDA、MAO-B、GSH-PX的测定

大鼠取血后处死取脑，置匀浆器中，加入预冷生理盐水制成10％(g/ml)的脑匀浆，按试剂盒说明书所述步骤操作，测定SOD活力和MDA、MAO-B、GSH-PX含量。

2.4数据统计

数据用

表示，组间用t检验进行统计。

3、实验结果

3.1对血中SOD活力的影响

实验组血中SOD活力明显高于正常对照组(P＜0.05)，并随着剂量的增大而活力越高，呈一定的量效关系。说明含钩藤抗衰老组合物能显著提高SOD的活力，增强抗氧化能力，见表3-1。

表3-1含钩藤抗衰老组合物对老龄大鼠血中SOD活力的影响(

n＝10)

注：与正常组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；

“/”灌以等量的蒸馏水，下同。

3.2对血清中ACHE活力的影响

表3-2含钩藤抗衰老组合物对老龄大鼠血清ACHE活力的影响(

n＝10)

从表3-2可知，实验组血清中ACHE含量显著高于正常对照组(P＜0.05)，并呈明显的量效关系。由此说明含钩藤抗衰老组合物有助于维持ACHE含量，确保神经递质处于正常水平，从而保证大脑的正常神经功能。

3.3对脑中MDA含量的影响

实验组MDA含量显著小于正常对照组(P＜0.05)。说明含钩藤抗衰老组合物有助于降低自由基MDA的含量，从而延缓衰老，见表3-3。

表3-3含钩藤抗衰老组合物对老龄大鼠脑中MDA含量的影响(n＝10)

3.4对脑中MAO-B的影响

表3-4含钩藤抗衰老组合物对老龄大鼠脑中MAO-B含量的影响(

n＝10)

从表3-4可知，高、中剂量组脑中MAO-B的含量明显较正常对照组低(P＜0.01)，低剂量组P＜0.05。由此可见，含钩藤抗衰老组合物能明显降低单胺氧化酶的含量。

3.5对脑中GSH-PX的影响

从表3-5可以看出，与正常对照组比，高、中、低剂量组的GSH-PX含量明显高(P＜0.01)。因此，含钩藤抗衰老组合物能提高大鼠脑组织的GSH-PX的含量，从而加强清除过氧化物的能力，保护大脑功能。

表3-5含钩藤抗衰老组合物对老龄大鼠脑中GSH-PX含量的影响(

n＝10)

4、结论

乙酰胆碱(Ach)是进行及维持中枢胆碱能神经系统功能的一种重要介质，AchE含量不足会导致中枢神经系统功能障碍；SOD是机体内清除自由基的重要抗氧化酶之一，其活力和含量反映了机体清除氧自由基的能力；MDA是对机体有害的物质；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶，对保护细胞代谢的正常进行起重要作用；单胺氧化酶(MAO-B)能催化各种单胺类化合物的氧化脱氢作用，与衰老密切相关，因此以上指标被认为是与衰老相关的重要指标。

本实验用老龄大鼠作为抗衰老的研究对象，用衰老相关指标为检测手段，结果显示：实验组ACHE活力显著高于对照组(P＜0.05)，说明含钩藤抗衰老组合物使胆碱能神经系统功能有了很大改善；实验组SOD、GSH-Px含量显著高于对照组(P＜0.01)，MAO-B、MDA含量显著低于对照组(P＜0.01)，并呈明显的量效关系，说明给予含钩藤抗衰老组合物后，老龄鼠机体的抗氧化、清除自由基能力有了显著提高。因此含钩藤抗衰老组合物有明显的抗衰老作用。

实施例4

含钩藤抗衰老组合物对衰老细胞(2BS)增殖的影响研究：

本实验以人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)为模型，观察含钩藤抗衰老组合物含药血清对2BS细胞细胞群体倍数、细胞代谢活力、衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活力的影响，探讨含钩藤抗衰老组合物对2BS细胞增殖的影响。

1、材料、方法

1.1药品与试剂：

含钩藤抗衰老组合物：由本院中药制剂室按传统方法水提、浓缩、消毒等制成浸膏。临用前将含钩藤抗衰老组合物加蒸馏水配至100ml，变成0.85g生药/ml浸膏溶液，实验中所用剂量均以生药量计；

DMEM培养基，Gibco公司；

胰蛋白酶，华美生物工程公司进口分装；

新生牛血清购于杭州四季青生物材料公司；

MTT，Sigma公司产品。

1.2实验动物：

清洁级SD大鼠：180±10g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.3实验环境：

清洁级，合格证号：SYXK(苏)2007-0026。

1.4仪器：SW-CJ-2FD医用型净化工作台，苏净集团安泰公司生产；三气培养箱，Heraeus公司生产；酶标仪，芬兰产。

1.5衰老细胞：

北京生物制品研究所。

1.6细胞培养液：DMEM培养液，内含10％新生牛血清，100kU/L的青/链霉素，pH7.2。

1.7含药血清的制备：将大鼠随机分为5组：人的20倍等效剂量组(17g生药/kg体重)、10倍等效剂量组、5倍等效剂量组、2.5倍等效剂量组及空白对照组，每组10只。各剂量组每天灌胃2次，间隔12h，连续给药3d，于末次灌胃1h后麻醉腹主动脉采血，4℃过夜，3000转/min离心10分钟，小心分离血清，于56℃下30min灭活，经0.22μm滤膜滤过除菌，-20℃保存。同等条件下，以等体积的蒸馏水灌胃，制备空白对照血清。

1.8细胞寿命实验细胞群体倍数测定：细胞用10％新生牛血清、100kU/L的青链霉、100kU/L链霉素的高糖DMEM培养基调整细胞密度为1.5×10⁵/ml，接种在96孔培养板中，每孔100ul，于37℃50ml/LCO₂条件下恒温培养24h。各给药组在培送养基中补充10％的含药血清。细胞长满面时，以1∶2的比例进行传代，并记为一代。随着细胞代龄的增高，传代间隔时间延长，当细胞传代后连续四周不能融合，则认为细胞已达寿限。

1.9细胞代谢活力实验：MTT法：取42代细胞接种到96孔板中，各组药物处理48h的细胞，每孔加入5mg/ml MTT 10μl/孔，37℃孵育4-6h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，后每孔加入150μlDMSO，室温震荡15min，待蓝紫色甲臢颗粒充分溶解后，酶联检测仪492nm波长下测定OD值。

1.10衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活力测定：按Dimiri GP方法：细胞接种在小盖玻片上，药物处理48h后取出，PBS冲洗2次，室温2％甲醛固定3-5Min，PBS洗涤2次，37℃无CO₂条件下用新配制的SA-β-Gal染色液孵育。2-4h后，出现明显染色，16h后取出盖玻片，PBS冲洗，苏木精复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，图象分析系统分析。

1.11统计学处理

数据以

表示，组间数据进行t检验。

2、结果

2.1含钩藤抗衰老组合物对细胞传代次数的影响

结果显示，含钩藤抗衰老组合物10、5倍剂量组传代次数与空白组比有明显增加(P＜0.05)，而20、5倍剂量组虽有增加，但无明显差异，说明含钩藤抗衰老组合物能延长衰老细胞的寿限，并且10倍剂量组效果最佳，见表4-1。

表4-1含钩藤抗衰老组合物对细胞传代次数的影响(

n＝8)

注：与空白对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；

“/”灌以等量的蒸馏水，下同。

2.2含钩藤抗衰老组合物对细胞活力的影响

结果表明，含钩藤抗衰老组合物10、5倍剂量组与空白组比MTT还原值有明显增加(P＜0.05)，并呈一定的量效关系，20、25倍剂量组虽有增加，但无明显差异。说明含钩藤抗衰老组合物能显著提高衰老细胞的活力。见表4-2。

表4-2含钩藤抗衰老组合物对细胞活力的影响(

n＝8)

2.3含钩藤抗衰老组合物对衰老相关半乳糖苷酶活力的影响

结果表明，含钩藤抗衰老组合物10、5倍剂量组与空白组比衰老相关半乳糖苷酶活力有明显下降(P＜0.05)，20、5倍剂量组虽有下降，但无明显差异。说明含钩藤抗衰老组合物能显著降低半乳糖苷酶活力，延缓衰老。见表4-3。

表4-3含钩藤抗衰老组合物对衰老相关半乳糖苷酶活力的影响(

n＝8)

3.结论

人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)是国际上普遍使用的复制衰老的细胞模型。成纤维细胞的增殖能力可作为判断细胞衰老程度的指标之一。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。β-半乳糖苷酶是一种溶酶体酶，存在于成纤维细胞和其它大部分细胞内，并随代龄增加而累积因此被称为衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)，其阳性率反映了体外培养细胞的群体衰老水平，也可作为判断衰老的生物学指标之一。

本实验以衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)为模型，观察含钩藤抗衰老组合物对2BS细胞寿命、代谢活力、以及衰老细胞生物学标志半乳糖苷酶活力的影响，结果表明：含钩藤抗衰老组合物能明显延长传代次数、促进细胞增殖，提示含钩藤抗衰老组合物能延长细胞的传代次数，即细胞寿限；含钩藤抗衰老组合物能显著抑制细胞衰老相关半乳糖苷酶活力，从而延缓衰老。其中以人10倍等效剂量组效果最好，5倍组次之，20倍、2.5倍组效果不明显。

实施例5

H₂O₂诱导的NIH-3T3细胞衰老模型的建立研究：

复制衰老是指体外连续培养的细胞在完成有限次数的细胞分裂后，丧失合成DNA及分裂的能力，最后导致细胞不能进行增殖，但仍能维持细胞的基本代谢程的一种现象。小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)细胞株是目前国际上公认于体外研究细胞复制衰老的模型，本实验采用过氧化氢通过氧化应激的方法来诱导细胞衰老，建立NIH-3T3细胞衰老模型。

1、材料与方法

1.1空白血清制备：取清洁级SD大鼠(240g左右)10只，麻醉腹主动脉采血，4℃过夜，3000转/min离心10分钟，小心分离血清，于56℃下30min灭活，经0.22μm滤膜滤过除菌，-20℃保存。

1.2细胞培养及分组：NIH-3T3细胞由美国ATCC细胞库提供。细胞接种在含10％胎牛血清(美国Invitrogen公司)的MEM(美国Invitrogen)培养，在温度37℃、饱和湿度的培养箱中培养。从20代开始，细胞随机分成3组：年轻组(20代细胞)、空白对照组(空白血清+H₂O₂处理)、模型组(H₂O₂处理)。然后细胞培养，3-4天换液1次，细胞达到融合时，用0.025％胰酶后1∶4传代，细胞至30代时随机收获部分细胞作各项实验。

1.3H₂O₂刺激细胞：将H₂O₂用DMEM完全培养液按不同浓度梯度稀释后，加入细胞中，形成0，300，600，1000，1500，2000μM浓度梯度，培养2小时后，弃去。用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培养液继续培养。

1.4在连续培养到第十天，用胰酶消化6孔板中细胞，取其中5000个细胞接种到24孔板中培养24小时，用碧云天公司的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒染色细胞。

1.5在高倍显微镜下观察染色细胞，染上蓝色的细胞即是衰老细胞。

1.6计数：数出400个细胞及其中含有的衰老细胞，即可得出该H₂O₂浓度作用下的细胞衰老比例。

2、结果

2.1细胞的形态变化：年轻组细胞的细胞体呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，中央有卵圆形核，核仁清晰可见。空白对照组细胞体呈长梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，细胞体积较年轻组增大，部分细胞胞浆内的颗粒增多。模型组的细胞形态不规则，绝大多数的细胞体积明显增大，胞体变平，核浆比例缩小，胞浆内的颗粒丰富。

2.2β-半乳糖苷酶细胞化学染色：β-半乳糖苷酶染色阴性细胞的细胞核复染为红色，而阳性细胞的胞浆染为青绿色。年轻组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数的百分比为2.00±1.00％，空白对照组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数的百分比为2.624±0.208％，模型组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数最多，其百分比为75.00±2.64％。模型组的β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数比年轻组、空白对照组高(P＜0.01)。

从表5-1可以看出，不同浓度H₂O₂刺激下，细胞增殖随浓度递增而呈梯度抑制。

表5-1：NIH-3T3细胞受不同浓度H₂O₂刺激下细胞增殖情况

由此可以看出，用H₂O₂处理NI H-3T 3细胞而制成的细胞衰老模型是成功的。

3、讨论

小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)是目前国际上公认的用于体外研究细胞复制衰老的模型，体外培养时，在经历一段快速增殖期和一定次数的群体倍增后，会进入增殖活力下降期，最后成为一个不能对生长因子作出增殖反应的衰老细胞群。过氧化氢是一种氧化剂，它作用后的细胞群与衰老对照组的细胞有相似的形态学改变，细胞体积增大、胞体变平，次级溶酶体增多，同时伴有Gl期细胞比例增加和β-半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比增加，提示H₂O₂能在相对较短的时间内有效地诱导细胞衰老。赵朝晖等人已成功建立了H₂O₂诱导NIH-3T3细胞衰老的模型，并证实H₂O₂作用所诱导的细胞衰老与NIH-3T3细胞正常复制衰老间没有存在明显差别。

本实施例研究结果显示H₂O₂作用3次后NIH-3T3细胞体积增大、形态不规则，胞体变平，细胞颗粒明显增加；电镜下次级溶酶体增多，线粒体肿胀，部分细胞出现异染色质增多；GI期细胞比例增加和β-半乳糖苷酶染色阳性细胞的百分比增加。由此可见，通过H₂O₂诱导的细胞氧化应激损伤可以成功地建立体外细胞衰老模型。有研究表明H₂O₂诱导细胞衰老的机制是通过氧化应激作用使端粒长度加速缩短，从而使端粒长度更快达到一定临界长度，细胞不可逆地阻滞于Gl期，从而失去增殖活力导致衰老。

4、小结

本实验用H₂O₂作用3次后观察到NIH-3T3细胞体积增大、形态不规则，胞体变平，细胞颗粒明显增加；β-半乳糖苷酶染色阳性细胞的百分比增加。因此，用H₂O₂可以可靠、便捷地建立体外细胞衰老模型。

含钩藤抗衰老组合物含药血清对双氧水诱导的NIH-3T3衰老模型增殖与凋亡的影响研究：

以H₂O₂诱导NIH-3T3细胞衰老，成功建立了体外细胞衰老的模型。本实验我们用含钩藤抗衰老组合物含药血清处理NIH-3T3细胞，然后用H₂O₂诱导细胞衰老，通过光镜观察细胞形态及细胞超微结构和半乳糖苷酶细胞化学染色，计算阳性细胞数，来观察含钩藤抗衰老组合物含药血清对H₂O₂诱导的细胞衰老模型增殖与凋亡的影响。

1、材料和方法

1.1含药血清的制备：将大鼠随机分为5组：人的20倍等效剂量组(17g生药/kg体重)、10倍等效剂量组、5倍等效剂量组、2.5倍等效剂量组及空白对照组，每组10只。各剂量组每天灌胃2次，间隔12h，连续给药3d，于末次灌胃1h后麻醉腹主动脉采血，4℃过夜，3000转/min离心10分钟，小心分离血清，于56℃下30min灭活，经0.22μm滤膜滤过除菌，-20℃保存。同等条件下，以等体积的蒸馏水灌胃，制备空白对照血清。

1.2细胞培养及分组：NIH-3T3细胞由美国ATCC细胞库提供。细胞接种在含10％胎牛血清(美国Invitrogen公司)的MEM(美国Invitrogen)培养，在温度37℃、饱和湿度的培养箱中培养。从20代开始，细胞随机分成3组：年轻组(20代细胞)、空白对照组(空白血清+H₂O₂处理)、模型组(H₂O₂处理)。然后开始培养，3-4天换液1次，细胞达到融合时，用0.025％胰酶后1∶4传代，细胞至30代时随机收获部分细胞作各项实验。

1.3H₂O₂刺激细胞：将H₂O₂用DMEM完全培养液按不同浓度梯度稀释后，加入细胞中，形成0，300，600，1000，1500，2000μM浓度梯度，培养2小时后，弃去。用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培养液继续培养。

1.4在连续培养到第十天，用胰酶消化6孔板中细胞，取其中5000个细胞接种到24孔板中培养24小时，用碧云天公司的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒染色细胞。

1.5在高倍显微镜下观察染色细胞，染上蓝色的细胞即是衰老细胞。

1.6计数：数出400个细胞及其中含有的衰老细胞，即可得出该H₂O₂浓度作用下的细胞衰老比例。

1.7实验分组和处理：NIH-3T3细胞从第24代开始与含钩藤抗衰老组合物含药血清共同培养，按含钩藤抗衰老组合物含药血清不同的作用浓度将细胞分为4组。

(1)模型组(即0.6M H₂O₂作用组)：MEM培养液；

(2)含钩藤抗衰老组合物含药血清处理组：MEM培养液+2.5倍剂量含钩藤抗衰老组合物含药血清共同培养细胞；

(3)含钩藤抗衰老组合物含药血清处理组：MEM培养液+5倍剂量含钩藤抗衰老组合物含药血清共同培养细胞；

(4)含钩藤抗衰老组合物含药血清处理组：MEM培养液+10倍剂量含钩藤抗衰老组合物含药血清共同培养细胞；

(5)含钩藤抗衰老组合物含药血清处理组：MEM培养液+20倍剂量含钩藤抗衰老组合物含药血清共同培养细胞。

各组设3个平行对照组。

1.8倒置显微镜下观察NIH-3T3细胞的形态：见体外细胞衰老模型建立部分。

1.9β-半乳糖苷酶的细胞化学染色：见体外细胞衰老模型建立部分。

1.10流式细胞仪检测凋亡：按照试剂盒说明，胰酶消化收集10⁶个细胞，PBS清洗后弃去上清。再用100μl结合缓冲液重悬，每管加入2μl Annexin V-FITC，2μl PI双染。避光孵育15min后流式细胞仪检测。以上实验重复3次。

2、结果

2.1倒置显微镜下NIH-3T3细胞的形态观察：

H₂O₂作用3次后的细胞形态不规则，绝大多数的细胞体积明显增大，胞体变平，核浆比例缩小，胞浆内的颗粒丰富。含钩藤抗衰老组合物10倍剂量组含药血清处理后与模型组比较大体积的细胞数明显减少，细胞形态较规则，胞体不如模型组扁平，但胞浆内的颗粒仍然很丰富。含钩藤抗衰老组合物20倍剂量组含药血清处理组细胞体积明显比模型组小，细胞体呈梭形或不规则三角形，胞浆内见少量的颗粒分布。含钩藤抗衰老组合物5倍剂量组含药血清处理组细胞形态与含钩藤抗衰老组合物2.5倍剂量组含药血清处理组细胞无明显区别。

2.2不同浓度的含钩藤抗衰老组合物含药血清对NIH-3T3细胞在0.6M H₂O₂作用下细胞增殖的影响

表5-2：NIH-3T3细胞在0.6M H₂O₂+不同浓度含药鼠血清同时作用下增殖情况

注：与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

由表5-2可知，不同浓度的含钩藤抗衰老组合物含药血清对0.6M H₂O₂作用下的NIH-3T3细胞增殖均有较好的效果，增殖平均值显著高于模型组，特别是10倍剂量组效果最佳。

2.3细胞衰老指征的影响

本研究发现NIH-3T3细胞经过H₂O₂作用3次后的细胞(即模型组细胞)在光镜下可见形态不规则，绝大多数的细胞体积明显增大，胞体变平，核浆比例缩小，胞浆内的颗粒丰富。β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数最多。不同浓度的含钩藤抗衰老组合物含药血清处理后，细胞的上述衰老指征得到不同程度的改善：光镜下可见细胞体积减小，细胞颗粒减少；β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数减少。尤其以10倍剂量含钩藤抗衰老组合物含药血清处理组的细胞衰老指征改善最明显。

2.4不同时间检测点细胞凋亡率

我们采用流式细胞术分析了不同时间检测点细胞凋亡率，结果如表6-2，含钩藤抗衰老组合物含药血清对双氧水诱导的NIH-3T3细胞凋亡在24h、36h、48h、72h具有梯度依赖性的抑制，差异有非常显著性意义(P＜0.01)，以10倍剂量组细胞凋亡率最低，见表5-3。

表5-3含钩藤抗衰老组合物含药血清组对双氧水诱导的NIH-3T3细胞凋亡率的影响

注：与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

3结论

H₂O₂是和氧化应激反应密切相关的活性氧之一，它易穿过细胞膜与细胞内的金属离子产生羟基，攻击细胞内的成分如脂质蛋白及DNA等，引起广泛的氧化损伤，而紫外照射具有诱导多种基因表达的能力可造成细胞核和线粒体DNA损伤并可在体外实验中诱导多种细胞发生凋亡通过活性氧(ROS)的介导间接在老化中起着重要作用。因此，在对氧化，衰老和凋亡的研究过程中，H₂O₂和紫外照射诱导是经常使用的氧化诱导因素。

细胞凋亡(apoptosis)是在基因控制下的自我消亡过程，虽然在正常生理及发育过程中，细胞凋亡是必需的，但过度的细胞凋亡则可造成病理过程，如PD、Alzheimer’Sdisease(AD)和Huntington舞蹈病。PD病理表现为黑质DA能神经元进行性脱失，一系列的研究提示可能与细胞凋亡有关。Mochiluki等首先报道采用TUNEL染色法对PD病人脑组织尸解发现有凋亡现象。以上研究所用的方法均为检测细胞凋亡最灵敏的TUNEL染色法和流式细胞仪技术。有学者认为研究PD与凋亡关系应该采用动物模型或细胞培养模型。

本实验结果显示：在倒置显微镜下观察细胞，含钩藤抗衰老组合物10倍剂量组含药血清处理后与模型组比较大体积的细胞数明显减少，细胞形态较规则，胞体不如模型组扁平，但胞浆内的颗粒仍然很丰富。

不同浓度的含钩藤抗衰老组合物含药血清处理后，细胞的衰老指征得到不同程度的改善：细胞体积及细胞颗粒减少；β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数减少。尤其以10倍剂量含钩藤抗衰老组合物含药血清处理组的细胞衰老指征改善最明显。

流式细胞分析结果表明，含钩藤抗衰老组合物含药血清对双氧水诱导的NIH-3T3细胞凋亡在24h、36h、48h、72h具有梯度依赖性的抑制，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。并且10倍剂量含钩藤抗衰老组合物含药血清组效果最为明显。

Claims (1)

1.一种含钩藤具有抗衰老作用的组合物，其特征为该组合物原料药组成按重量比为钩藤1000份、茯苓1000份、陈皮1000份、麦冬1000份，人参667份、防风667份、甘草334份。